JPH04502861A - 植物および植物細胞中での非相同タンパク類の生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １６、デン粉の製造に適した植物種からなる群から選ばれる請求の範囲第１３〜 １５項のいずれかに記載の植物、植物の部分および植物細胞。

１７、ジャガイモ、トウモロコシおよびキャラサバからなる植物種の群から選ば れる請求の範囲第１６項記載の植物、植物部分および植物細胞。

１８、デン粉を工業的に生産するのに適したジャガイモ品種からなる群から選ば れる請求の範囲第１７項記載の植物、植物部分および植物細胞。

１９、懸濁状態で培養するのに適した種である請求の範囲第１３〜１５項のいず れかに記載の植物、植物部分および植物細胞。

２０、ニコチアナ種からなる群から選ばれる請求の範囲第１９項記載の植物、植 物部分および植物細胞。

２１、該非相同タンパク物質が、１以上の翻訳後プロセッシング工程を必要とす る動物またはヒトタンパクであり、該プロセッシング工程が、特に少な（とも、 該成熟タンパクに先行するシグナルペプチドを含む先駆体として該タンパクを生 成する該細胞からの排出および該シグナルペプチドの開裂を含む請求の範囲第１ ３〜２０項のいずれかに記載の植物、植物部分および植物細胞。

２２、該非相同タンパク物質がヒト血清アルブミンである請求の範囲第２１項記 載の植物、植物部分および植物細胞。

２３、ヒト血清アルブミンの製造に適したジャガイモ植物並びにその部分および 細胞であって、これらは、組換えポリヌクレオチドを用いた遺伝子操作、場合に よっては原種により、これらが該ヒト血清アルブミンを表現しかつこれを正しく プロセッシングすることを可能ならしめるに必要な遺伝情報を有しており、該ジ ャガイモに導入される該遺伝情報は表現カセットを含み、該カセットは少なくと も一つの成熟ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を含み、該遺伝子は直接、 該ジャガイモ内で機能性であり、かつ病理−関連タンパクＰＲＯＢ１２由来の植 物シグナルペプチドをコードする遺伝情報により先行されていることを特徴とす る上記ジャガイモ植物およびその部分並びに細胞。

２４、ヒト血清アルブミンの製造に適したタバコ植物およびその部分並びに細胞 であって、これらは組換えポリヌクレオチドを用いた遺伝子操作、場合によって は原種によって、該植物、その部分または植物細胞が該ヒト血清アルブミンを表 現し、かつこれを正確に翻訳後プロセッシングすることを可能とするのに必要な 遺伝情報を与えられており、該タバコに導入される、該遺伝情報は表現カセット を含み、該カセットは該タバコに適しており、かつ少なくとも一つの成熟ヒト血 清アルブミンをコードする遺伝子を含み、該遺伝子は直接、該宿主内で機能性で しかも病理−関連タンパクＰＲＯＢ１２由来の植物シグナルペプチドをコードす る遺伝情報で先行されていることを特徴とする上記タバコ植物およびその部分並 びにその細胞。

２、特許請求の範囲第１−１２項のいずれかに記載の方法により得られるおよび ／または上記請求の範囲第１３項〜２４項のいずれかに記載の植物、植物の部分 または植物細胞から得られるタンパク物質。

２、特許請求の範囲第１−１２項のいずれかに記載の方法により得られるおよび ／または上記請求の範囲第１３〜２４項のいずれかに記載の植物、植物の部分ま たは植物細胞から得られるヒト血清アルブミン。

２７、動物またはヒトタンパクをその成熟形状でコードする遺伝子並びに該遺伝 子に直接先行する、植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報を含む組換えポ リヌクレオチド。

２８、該植物シグナルペプチドをコードする該遺伝情報が病理−関連タンパクＰ ＲＯＢ１２由来の植物シグナルペプチドである請求の範囲第２７項記載の組換え ポリヌクレオチド。

２９、動物またはヒトのタンパクをその成熟形状でコードする該遺伝子が、成熟 ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子である請求の範囲第２７項または第２８ 項記載の組換えポリヌクレオチド。

３０、動物またはヒトのタンパクを成熟形状でコードする該遺伝子および該遺伝 子に直接先行し、かつ植物シグナルペプチドをコードする該遺伝情報が、該宿主 に適した表現カセット中に組込まれている°請求の範囲第２７〜２９項のいずれ かに記載の組換えポリヌクレオチド。

３１、該宿主に適した該表現カセットが、ジャガイモ、トウモロコシ、キャラサ バまたはタバコに適した表現カセットである請求の範囲第３０項記載の組換えポ リヌクレオチド。

３２、該ポリヌクレオチドがＤＮＡからなる請求の範囲第２７〜３１項のいずれ かに記載の組換えポリヌクレオチド。

３３、ベクタプラスミドとそこに挿入された表現カセットとを含み、該表現カセ ットが動物またはヒトタンパクをその成熟形状でコードする遺伝子と、これに直 接先行する、植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報とを含む請求の範囲第 ３２項記載の組換えＤＮＡ。

３４、該ベクタープラスミドがバクテリア宿主内でクローニングするのに適した ベクタである請求の範囲第３３項記載の組換えＤＮＡ。

３５、該ベクタプラスミドが該宿主に適したベクタである請求の範囲第３３項記 載の組換えＤＮＡ０ 浄書（内容に変更なし） 明　細　書 植物および植物細胞中での非相同タンパク類の生産発明の分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術、より詳しくは植物の遺伝子操作に係る組換えＤＮ Ａ技術の分野に属し、遺伝的に操作された植物または植物細胞を用いたタンパク 類またはポリペプチド類の製法、並びに遺伝的に操作された植物および植物細胞 自体（遺伝的に操作された植物の部分を含む）、これらの遺伝的に操作された植 物または植物細胞によって産生される非相同タンパク物質（例えば、タンパク、 ポリペプチドなど）および該遺伝子操作に用いられる組換えＤＮＡポリヌクレオ チド類（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する。

従来の技術 生命工学の成果の一つはタンパク類の新規製法の開発である。

このため、予備的尺度で組換えＤＮＡ含有微生物が、自然界では合成せずあるい は自然界ではこのような量では合成しないタンパク類を生産することが可能とな る。最近の実験は、とりわけバクテリアおよび酵母細胞によって工業的量で生産 される、特にインシュリン、様々な型のインターフェロンおよびヒト生長ホルモ ンに関する。

これらの実験は、しばしば、最終的な形状および生物学的機能を得るために、該 細胞内での翻訳と同時のあるいは翻訳後プロセッシングを必要としない比較的簡 単なポリペプチド類に関連するという事実を特徴としている。より高等な生物の 多数のより複雑なタンパク類に対しては、このようなプロセッシングはこれらタ ンパク類の機能発現に関する。例えば、これらタンパクでは正確にグリコジル化 するかあるいは膜透過させて先駆体（“先駆体−タンパク″）からシグナルペプ チドを分離する必要がある。原核微生物では、これは不可能であり、そのため高 等生物、例えば真菌を使用する必要があった。

粗面小胞体（ＥＲ）で合成されたタンパク類は真核細胞によって排出されるかあ るいは該ＥＲ、ゴルジ複合体、原形質膜または液胞／リソソームのように排出経 路内に貯蔵される（プフエツファー＆ロスマン（Ｐｆｅｆｆｅｒ　＆　Ｒｏｔｈ ｍａｎ）、　１９８７）。　この排出経路の選択は、先駆体タンパクから分離さ れる疎水性のアミノ−末端シグナルペプチドの存在によって決まる。その例はイ ンベルターゼ（カールストン＆ボッシュタイン（Ｃａｒｌｓｔｏｎ　＆　Ｂｏｔ ｓｔｅｉｎ）、　１９８２）またはα−因子（ヘルスコヴイッツ＆オーシマ（Ｈ ｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　＆Ｏｓｈｉｍａ）、　１９８２）に対するシグナルペプチ ドであり、これらは各成熟タンパク生成物を細胞周辺腔に到達せしめる。最近、 シグナルペプチドが酵母細胞によるヒトタンパクの排出を実現するのにも利用で きるが、この場合プロセッシングは完全でないことが示された（シュテラトラ− （Ｓｔｅｔｌｅｒ）等、１９８９）。

真菌内で動物タンパクを合成する実験から、真菌のシグナルペプチドの使用によ り、動物のシグナルペプチドよりも一層効果的なプロセッシングおよび排出が達 成されることが明らかとなったが、このことは宿主として機能する真菌由来のシ グナルペプチドがより有利に機能することを意味する（キングズマン（Ｋ　ｉｎ ｇｓｍａｎ　）等、１９８７　；　ハルキ（Ｈａｒｋｋｉ　）等、１９８９）。

哺乳類のリゾソーム（コーンフェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ）、　１９８７）また は酵母中の液胞（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ）等、１９８７）および植物細 胞（ドーレル（Ｄｏｒｅｌ）等、１９８９）への輸送のためには、付随的な情報 が必要であり、それは該成熟タンパク自体の配列の部分に局在している。

植物細胞による該排出用のシグナルペプチドに関する知見は依然として極めて制 限されている（デラチョッパ（Ｄｅｌｔａ−Ｃｉｏｐｐａ）等、１９８７）。こ のようなシグナルペプチドは、僅かにニンジン（チェン＆バーナー（Ｃｈｅｎ　 ＆　Ｖａｒｎｅｒ）、　１９８５）およびタバコ（メーメリンク（ｍｅｍｅｌｉ ｎｋ）、　１９８８）からの２種のエクステンシン並びにタバコからの３種の病 理−関連（ＰＲ７タンパク〔フーフトファンヒュイスデュイネン（Ｈｏｏｆｔ　 ｖａｎ　Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ）等、１９８５　；コルネリセン（Ｃｏｒｎ ｅｌｉｓｓｅｎ）等、１９８６　、デウルース（Ｄｅ　Ｌｏｏｓｅ）等、１９８ ８）について知られているに過ぎない。このように僅かな数のシグナルペプチド からは、開裂−または認識サイトの特徴に関する何等のコンセンサスも得られて いない。植物にとって異種のタンパクが植物細胞により排出され得るか否かも、 シグナルペプチドのプロセッシングが、植物シグナルペプチドと非相同タンパク との間の融合構築体を使用した場合に、正確に起こるか否かも明らかになってい ない。

それにも拘ず、植物が非相同タンパク類の生産系としての一つの候補であること が認められている。しかし、現在まで、植物中の非複合タンパクの生産のみが報 告されているにすぎない（グツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）、　１９８７　；　ミ スラ（Ｍｉｓｒａ）、　１９８９）。

ＥＰＯ−Ａ−０２５５１５３号は、グア一種子から、α−ガラクトシダーゼのプ レープロ型をコードする遺伝子の単離および同定について開示している。この遺 伝子は他の植物、例えばタバコにより表現し得る。ウェスタンプロット法の結果 、即ち培養上澄中のα−ガラクトシダーゼ活性の観察および移動度の決定から、 伝達された遺伝子によりコードされるようなプレープロ型のα−ガラクトシダー ゼが、タバコカルスにより表現させた場合には排出されかつその成熟型に正しく プロセッシングされることが結論付けられる。

この参考文献は、自身のブレープロ配列を含む全体としての遺伝子が他の植物種 に転移された場合、該植物遺伝子はそこで表現され、分泌されかつ正しくプロセ ッシングされることを教示している。しかし、この文献は殆ど関連性のない遺伝 子、例えば動物またはヒト起源の遺伝子が植物中で表現され、分泌されかつ正し くプロセッシングされるか否かについては何等教示していない。

植物細胞中での非相同遺伝子の表現はＢＰ−Ａ−０２７０２４８号に記載されて おり、この文献は上流側の塩基配列により先行された下流側コード配列を含むＤ ＮＡ構築体を開示している。この下流側コード配列は植物細胞壁に輸送されるこ とが望まれるタンパクをコードする。バクテリアのβ−グルクロニダーゼ遺伝子 はモデル遺伝子として利用される。というのは、その表現が直接検出できるから である。該上流側塩基配列はポリガラクツロカーゼ先駆体のリーダー配列（また はその一部）からなる細胞壁標的タンパクをコードする。このポリガラクツロカ ーゼ（Ｐ　Ｇ）は植物起源の酵素であり、クリマクテリツク果実の成熟に関与す る。この文献には２種のＤＮＡ構築体が記載されており、その一つは上流塩基配 列として、ＰＧの完全リーダー配列および成熟ＰＧタンパクの初めの６個のアミ ノ酸をコードするＤＮＡフラグメントを含み、もう一つの構築体は上流塩基配列 として、僅かに一部のＰＧプリーダ−列のみを含み、該ＰＧプリーダ−列の最後 の２２個のコドンは欠落している。

この文献は、融合タンパクが分泌され、かつ正しくプロセッシングされる、即ち 正しい配列位置で配列されるか否かを示していない。排出およびある型のプロセ ッシングが起こることは想像できるが、このプロセッシングが十分に正確に生じ ているとは思えない。

形質転換した植物細胞によるバクテリアタンパクの排出を実現するために、植物 由来のシグナルペプチドをコードする上流側塩基配列を使用することも、パッシ アトーア（Ｐａｓｓｉａｔｏｒｅ）等（Ｊ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５ｕｐｐ１．、ＢＤ　１９８９年３月２７〜４ 月７日、９．２６７゜アブストラクトＭｌ　４５）により示唆されているが、こ こでも融合タンパクが分泌され、かつ正しくプロセッシングされでいるか否かに ついて開示していない。エクステンシンにより先行されたバクテリアキチナーゼ 遺伝子および植物起源のプロテイカーゼインヒビタエリーダー配列を含む該ＤＮ Ａ構築体の正確な構造も同様に示されていない。

ＥＰ−Ａ−０３０７８４１号はＰＲ−１群の病理学−関連（ＰＲ）タンパク遺伝 子の調節配列に関連し、かつ誘導性ＰＲ−１プロモータおよびＰＲ−１分泌シグ ナル配列を開示している。この文献は、このＰＲ−１シグナル配列が植物中で、 非相同タンパクの分泌を調節するのに利用できることを示唆している。しかし、 このような融合が実際に機能性であることを示していない。この時点では、極め てかけ離れた系（例えば植物とヒト）からの成熟配列とシグナル配列との組合せ が、実際に野性型のタンパクと全く同一のＮ−末端をもつ成熟非相同タンパクを 与える、該シグナルペプチドの正確な配列を生ずるか否かを予測することは不可 能である。正確な配列は該配列サイトを側部にもつ（ｔｌａｕｋｉｎｇ）アミノ 酸配列に依存するものと思われる。従って、この文献は、動物またはヒトのタン パク、例えばＨＳＡの正しいプロセッシングが植物内で実現し得ることおよびそ の方法論を何等明らかにしていない。

ＥＰ−Ａ−００９１５２７号は宿主としてのＥ、コリ内でのＨＳＡ一様ペプチド の製造を開示している。他の宿主生物（他のバクテリア、酵母、真菌、動物およ び植物宿主を含む）も利用し得ることを示唆しているが、ここには更に“宿主の 生成するポリペプチドを該構造に形質転換し、かつ天然のＨＳＡの置換に必要と される適当な酵素を欠いている”ことを明確に述べている。この文献は、また全 （当然のこととして、このＩＳＡ遺伝子が原核および真核生物両者の様々なシグ ナル配列と結合して、該形質転換された宿主細胞からこのＨＳＡを分泌させるこ とを可能とすることも示唆している。しかし、その詳細および実験的証拠を与え る代りに、この文献はビラーコマロフ（Ｖｉ　ｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆ　ｆ　） 等の“バクテリアクローン合成プロインシュリン（Ａ　ＢａｃｔｅｒｆａｌＣｌ ｏｎｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ　Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ）”、　Ｐ、Ｎ、Ａ 、Ｓ、　ＵＳＡ、　１９７８゜７５、ｐｐ、３７２７−３７３１およびタル？− ／ジ（Ｔａｌｍａｄｇｅ）等の“真核生物シグナル配列のＥ、コリ中でのインシ ュリン抗原の輸送（Ｅｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔ ｒａｎｏｐｏｒｔｓ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　Ａｎｔｉｇｏｎｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ　ｃｏｌｉ　）”　、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ、　１９８０．７７、 ｐｐ。

３３６９−３３７３を引用している。これらの文献は、しかし、植物宿主中での 排出されたおよび／または正しくプロセッシングされた動物タンパクの製法を何 等開示していない。

従って、植物あるいは植物細胞が、翻訳と同時のあるいは翻訳後のプロセッシン グを必要とする非相同タンパクの表現に適しているか否かは依然として明白では ない。

発明の開示 本発明によれば、非相同、例えば非植物タンパクが、植物のシグナルペプチドを 利用して、トランスジェニック植物細胞により排出し得ることがわかった。タン パク、ヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）が、排出中に複雑なインビボプロセッシ ングを必要とするタンパクの例として選ばれた。ＨＳＡは血液血漿の主成分であ る。これは十分なプロセッシングに付された場合、５８５個のアミノ酸を含むタ ンパクであり、かつ１７個のジスルフィド架橋を含んでいる〔ベーシング（Ｂｈ ｃｒｅｎｓ）等、１９７５）。プロセッシング達成のためには、細胞膜を横切る 通過が起こらなければならず、その際シグナルペプチドは分離され、またこのタ ンパクはその適当な折りたたみを起こす可能性がある。天然宿主から排出される タンパクは折りたたまれず、これらが細胞内で合成される場合には不正確に折畳 まれるものと推定される。排出は該ジスルフィド架橋の正確な折畳みを確立する ための前提条件である。

現在まで、ＨＳＡは公知法で血液−血漿から精製されている。

このタンパクは外傷を受けた場合およびいくつかの臨床的状況における血液の交 換のためにはダラムのオーダの量で使用される。

−組の理由のために、組換え宿主中でのＨＳＡの生産は極めて魅力あるものであ る。第１にはＨＳＡ−療法中の感染性疾病（ＡＩＤＳおよび肝炎など）の蔓延の 危険性を除くためであり、および第２には入手可能な血液への依存性を減するた めである。このＨ８ＡタンパクはＥ、コリ中で細胞内合成され（ラック（Ｌａｔ ｔａ）等、１９８７）またバチルス　ズブチリス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ）中で表現かつ排出されている（サンダースおよびギエー（Ｓａｕｎ ｄｅｒｓａｎｄ　Ｇｕｙｅｒ）、　１９８７）。ＩＳＡの排出はサツカロマイセ ス　セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のト ランスジェニック酵母細胞について立証されている〔エツシエベリ（Ｂｔｃｈｅ ｖｅｒｒｙ）等、１９８６）。

本発明によれば、植物シグナルペプチド、特にＰＲ−タンパクから得たものを、 植物または植物細胞培養物中で細胞外タンパクを生産するための、とりわけ非植 物タンパクをもつ融合構築体において使用する。有用な植物シグナルペプチドの 例として、タバコからのＰＲＯＢ１２（コルネリセン（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｏｎ ）、　１９８６）によりコードされ、２４個のアミノ酸をもつ疎水性Ｎ−末端ペ プチドをコードするタウマチン一様ＰＲ−タンパク由来のシグナルペプチドを使 用した。

本発明によれば、以下の目的で植物シグナルペプチドを使用できる。

ａ）植物または植物細胞中でのタンパクの製造。該タンパクはその生理作用のた めにはプロセッシングを必要とする（例えば、ヒト血清アルブミン）。

ｂ）経済的または工程技術上の理由（例えば、懸濁細胞の培地からの安価での単 離）から排出が必要とされるタンパクの、植物または植物細胞中での製造。

Ｃ）細胞外空間で機能発揮が必要とされる（例えば、該細胞外空間を通して侵入 する、あるいは該空間でコロニー形成する病原体に対する耐性を該植物に付与す るタンパクをコードする遺伝子を導入するために）タンパクの製造。

組換えタンパクの製造のための、産生生物の最終的な選択は、経済的な因子、例 えば培養、育成および精製コストに依存するであろう。現在まで、植物はバイオ マスの安価な源ではあるが、タンパク製造のためには利用されていない。植物中 での非相同タンパクの製造は、とりわけ該タンパクの抽出が既存の工業的工程に 適合し得る場合における微生物利用に代る安価な代替物であり得る。変更された 植物の育生コストは、該植物が既に大量の植物性物質の生産のために利用されて いる場合には、微生物の発酵または動物細胞培養のコストと比較して低く、無視 し得る程でさえある。デン粉工業（トウモロコシ、タピオカ、ポテト、キャラサ バ）が、非相同タンパクの同時生産にとって特に適している。というのは、該デ ン粉抽出の既存の方法の第１工程は変性条件を含まないからである。タンパク画 分は低温の抽出細胞片の溶液として維持されている。このタンパクに富む汁の流 れは該デン粉工業の廃物であり、かつ特に環境上の理由のために、動物用の飼料 に加工されているにすぎない。タンパク−精製工程を導入するためには、このデ ン粉抽出工程は殆んどあるいは全く変更を必要としない。

結局、この汁の流れに工業的に興味ある非相同タンパクを導入すれば、このよう なタンパクの極めて安い起源が得られることになる。加えて、この好ましい本発 明の態様はこの廃物流の経済的価値を増大する。明らかに、高い経済的価値をも つタンパクに対しては、同様な製法が小規模で適用でき、かっデン粉製造は二次 的重要性をもつにすぎなくなる。

広い意味で、本発明は従って植物宿主中での非相同タンパク物質の製法を提供す ることを目的とし、該タンパクはこれを生産する細胞から、植物または植物細胞 を育生することにより排出され、該植物または植物細胞は場合によっては原種に より、組換えポリヌクレオチドを用いて遺伝的に操作することにより該遺伝情報 が与えられており、該遺伝情報は該植物宿主が該非相同タンパク物質を表現する のに、かつ該タンパクを形成する該細胞から該タンパクを排出するのに必要とさ れるものであり、該宿主に導入された該遺伝情報は、該宿主細胞中で機能性でか つ直前に該宿主内で機能性の植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報を有す る、該成熟タンパク物質をコードする少なくとも一種の遺伝子を含む表現カセッ トを含んでいる。

本発明によれば、好ましいタンパク物質の製法は、天然の環境においては、該細 胞からの排出をもたらすためのシグナルペプチドを含む（但しそれ自体は開裂除 去される）先駆体由来のタンパクの製造であり、該植物宿主に導入される遺伝情 報は表現カセットを含み、該カセットは宿主中で機能性であり、かつ該成熟タン パク物質をコードする遺伝子を含み、しかもその直前に宿主中で機能性の植物シ グナルペプチドをコードする遺伝情報を、該非相同タンパク物質の自然のシグナ ルペプチドをコードする遺伝子情報の代りにもつ遺伝子構築物を含んでいる。

表現“タンパク物質（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｔｅｒｉａｌ）”とは、グリコジル 化されていようといまいと、ポリペプチドおよびタンパクなどの物質を意味する 。表現“非相同タンパク物質（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａ ｔｅｒｉａｌ）″とは選ばれた植物宿主にとっては異種の、例えば自然状態では この宿主中では生成しないタンパク物質を意味する。生成すべき非相同タンパク 物質は原理的には植物起源のものあるいは酵母由来のであってもよいが、本発明 では特に動物またはヒトタンパク物質、特に１または複数の翻訳後プロセッシン グ工程を必要とするより複雑なタンパクの製造のために植物宿主を用いることに 注目する。即ち、本発明によれば、生成すべきタンパク物質は動物またはヒトの タンパクであり、これは該タンパクを該成熟タンパクに先行するシグナルペプチ ドを含む先駆体として生成する細胞からの排出と、該シグナルペプチドの開裂と を少なくとも含む、−以上の翻訳後プロセッシング段階を必要とする。本発明の 特に好ましい態様では、生成される該タンパク物質はヒト血清アルブミンである 。

用語“場合によっては原種の（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ　ｏｆ　ａｎ　ａｎｃｅｓ ｔｏｒ）”とは植物が生体であるという事実を意味し、このことは、第１のトラ ンスジェニック植物または植物細胞、例えば該操作された植物の第１世代に導入 された、該非相同タンパク物質の生産に必要とされる遺伝情報が子孫にも存在し 得ることを意味する。明らかにこれらのトランスジェニック植物および植物細胞 およびその後の世代を非相同タンパク物質の製造に使用することもできる。

用語“組換えポリヌクレオチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｏ）”とは、組換えＤＮＡ技術で公知の技術の結果としてのＤＮＡおよ びＲＮＡ構築体を意味する。現時点では多くの形質転換法が、例えばプラスミド としての組換えＤＮＡの使用に基いており、従って使用上好ましい該組換えポリ ヌクレオチドは組換えＤＮＡからなるが、本発明ではこれに制限せず、結果とし て組換えＲＮＡを利用する遺伝子操作法をも包含する。

“表現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ）”なる表現は公知 であり、宿主が該表現カセット中に含まれる遺伝情報を正確に転写しかつ翻訳（ 表現）するのに必要とされる調節要素の組合せをいう。

これらの調節要素は適当な（即ち、選ばれた宿主中で機能性の）転写プロモータ および適当な転写終止配列を含む。

前に述べたように、本発明によれば、該植物宿主に導入すべき遺伝情報は表現カ セットを含み、該カセットは該宿主内で機能性であり、かつ遺伝子構築体を含み 、該構築体は成熟タンパク物質をコードする遺伝子と、その直前における該宿主 内で機能性でかつ病理−関連タンパクＰＲＯＢ　１２由来の植物シグナルペプチ ドをコードする遺伝子情報を含むことが好ましい。この植物シグナルペプチドは 様々な種の植物において、該細胞からの正確な排出、正確な該シグナルペプチド の開裂および正しい該成熟タンパク物質の折畳みを達成することが立証された。

宿主の性質に関連して、原理的には本発明は、ある植物種の形質転換用の方法が 未だに開発されていないという事実に関る一時的な特徴の実際上の制限を除き、 何等制限はない。本発明の特別に好ましい態様においては、デン粉の製造に適し た植物を宿主として利用する。この点に関連して、ジャガイモ、トウモロコシお よびキャラサバからなる群から選ばれる植物を想定するであろう。

本発明によれば、使用する植物宿主は、工業的にデン粉を製造するのに適した様 々なジャガイモであり、またその塊茎をデン粉の排出および非相同タンパク物質 の生産両者のために使用することが特に好ましい。

本発明によれば、植物宿主として懸濁培養中の植物細胞を用いることもできる。

植物細胞の懸濁培養はそれ自体公知である。本発明によれば、該植物宿主として 植物種タバコの植物細胞の懸濁培養を用いることが極めて有利である。

実験部分においては、本発明の特定のいくつかの実施例が与えられる。これらの 実施例は１）植物のジャガイモを育生することによりヒト血清アルブミンの製法 が与えられ、このジャガイモは組換えポリヌクレオチドを用いた遺伝子操作、場 合によっては原種により、該植物のジャガイモによるヒト血清アルブミンの表現 並びに正確な翻訳後プロセッシングを可能とするのに必要とされる遺伝情報を備 えており、該ジャガイモに導入すべき該遺伝情報は一つの表現カセットを含み、 該カセットはジャガイモ中で機能性であり、しかも直前に植物シグナルペプチド をコードする遺伝情報を含む、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を少なく とも含み、該シグナルペプチドはジャガイモ中で機能性であり、かつ病理−関連 タンパクＰＲＯＢｌ　２由来のものである。該方法では次に生成したヒト血清ア ルブミンを遺伝子操作したジャガイモ塊茎から抽出する。また、実施例は２）植 物種タバコを懸濁細胞中で育生し、遺伝的に操作された懸濁タバコ細胞によって 生成されたヒト血清アルブミンを培地から抽出することからなるヒト血清アルブ ミンの製法を例示し、ここで該タバコは組換えポリヌクレオチドを用いて遺伝的 に操作することにより、また場合によっては原種によって、該懸濁タバコ細胞が ヒト血清アルブミンを表現しかつ正しく翻訳後プロセッシングするのに必要な遺 伝情報を備え、該遺伝情報は一つの表現カセットを含み、該カセットはタバコ内 での表現に適しておりかつ直前に植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報を もつ、成熟ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を少なくとも含み、該シグナ ルペプチドはタバコ中で機能性であり、しかも上記の病理−関連タンパクＰＲＯ Ｂ１２由来のものである。

より詳しくは、実験部分ではジャガイモまたはタバコ植物由来の細胞は、カナマ イシン選別用のマーカー遺伝子並びに天然のＩＳＡシグナル配列（比較用）また は植物の病理−関連タンパクのシグナル配列のいずれかが先行する、ヒト血清ア ルブミン（ＩＳＡ）をコードする遺伝子を含むブクタを用いて形質転換すること を示す。また、タバコ植物のプロトプラストについてエレクトロポーレーション 実験を行った。これらの実験は、該トランスジェニック植物細胞の原形質膜を横 切ってのＩＳＡの排出を達成することを目的とする。この排出過程中、このＨＳ Ａタンパクは修飾されて、該タンパクがその生理的機能を獲得した形状のものと なる。

形質転換後、表現は調べたすべての植物の部分（ジャガイモ：葉、茎、柄および 塊茎、ここで後の２つはいずれも新鮮なものでしかも工業的なジャガイモに一般 的な４℃での２週間の貯蔵後のものであった；タバコ二重、カルスおよび懸濁細 胞）において立証された。トランスジェニックな細胞によるＩＳＡの排出は以下 の３つの方法により証明された。

ａ）キメラＨ８Ａ−遺伝子構築体を含むタバコプロトプラストのエレクトロポー レーション後、ウェスタンプロット法を用いて該培地中のＩＳＡを特異的に検出 できた。このトランスジェニックタバコプロトプラストの抽出液には何等Ｈ８Ａ が検出できなかった。

ｂ）カルス（未分化細胞物質）をｌ５Ａ−１ランスジエニツクタバコ植物から誘 導した。このカルスを用いて、懸濁培養を行った。タバコ懸濁細胞の抽出物中に はＨ８Ａタンパクは検出できなかった。

Ｃ）ジャガイモを上述の構築体で形質転換し、かつ成熟タバコ植物を再生した後 、ＩＳＡがトランスジェニックな葉から単離した細胞外液中に高い特異的な濃度 で検出できた。葉からの細胞外液の抽出は細胞性および細胞外マーカー酵素を用 いて監視した。

上述の３種すべてのテスト法（ａ、ｂおよびＣ）によって、ヒトおよび植物の両 シグナルペプチドがＩＳＡの排出に導き得ることを示した。しかし、トランスジ ェニック植物から単離したＩＳＡのアミノ酸分析から、植物シグナルペプチドの みが正確はプロセッシング（即ち、正しい開裂サイトでの該シグナルペプチドの 除去）を与えることが示された。

実験部分に記載したように、非相同構築体の機能発現は、ＰＲ−タンパクのシグ ナルペプチドが細胞外空間への非相同タンパクの排出およびその正確なプロセッ シングを確立し得ることを立証する。

図の説明 第１図は、キメラＨ８Ａ−遺伝子に対して使用した構築体の概観マツプである。

この模式的な制限マツプには、左から右に、エンハ、ンサーおよびプロモータ（ ２個の白抜き四角部分）、ＡＬＭＶリーダー（実線部）、シグナル配列（点状四 角部分）、構造Ｈ８Ａ遺伝子（黒い四角部分）およびノス（ｎｏｓ）ターミネー タ（細い実線）が示されている。この制限サイトは一文字コード表示で示されて いる。

第２図はプラスミドｐＭＯＧ１　Ｂの構築の模式的な概要を示す。

違うプラスミドはこれに合せて描写されない。

第３図はプラスミドｐＭＯＧａ６の構築の模式的概要を示す。

異るプラスミドはこれに合せて描写されない。

第４図はプラスミドｐＭＯＧ４９およびｐＭＯＧ５０の構築の模式的概要を示す 。異るプラスミドはこれに合せて描写されない。

ボックス中の配列はアラニン残基をコードするもので、ｐＭＯＧ４８の構築のた めに使用されている。

第５図はプラスミドｐＭＯＧ８５の構築の模式的概要を示す。

異るプラスミドはこれに合せて描写されない。

実験 ■　植物中での表現のためのキメラ−ＩＳＡ−遺伝子の構築血清アルブミン（Ｈ Ｓ　Ａ）用のヒト遺伝子の表現用に、以下の調節配列を用いた。

ｌ）最適遺伝子表現のために二重エンハンサを備えたカリフラワモザイクウイル ス由来の構成３５Ｓプロモータ［ＣａＭＶ、ギレー（Ｇｕｉｌｌｅｙ）等、１９ ８２）。

２）アグロバクテリウム　ツメファシェンス（ベバン（Ｂｅｖａｎ）。

１９８４）からのｐＴｉＣ５８プラスミドのツバリン（ｌｏｐａｌｉｎｅ）シン ターゼ（ｎｏｓ）をコードする遺伝子由来の転写終止配列。

３）キメラメツセンジャーＲＮＡの安定化のためのアルファルファモザイクウィ ルス（ＡＬＭＶ、プレドロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ）等、１９８０）の５′リ 一ダ配列。該リーダー配列とＩＳＡをコードする配列とを融合した（第１図）。

使用した４種の構築体の概観マップを第１図に与える。

標準的な組換えＤＮＡ技術〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８２　 ）による様々なプラスミドの構築をプラスミドｐＭＯＧ１８から開始した。この プラスミドはＥ、コリ　ベクタｐＵｃ］８［ヤニッシューペロン（Ｙａｎｉｓｃ ｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ）等、１９８５）由来のもので、これはそのポリリンカー中 にＣａＭＶ　３５　Ｓプロモータ／エンハンサ、それに続＜ＡＭＶリーダー配列 、β−グルクロニダーゼ〔スレート（Ｓｌｅａｔ）等、＋９８７）用の遺伝子お よびノスーターミネータ〔ベバン（Ｂｅｖａｎ）、１９８４）を含む。このプラ スミドは第２図に示したようにして得た。ＣａＭＶ　３５　Ｓプロモータおよび ノスーターミネータからなる表現カセットを、ＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラ グメントとして、プラスミドｐＵｃ１８　（＝ｐＭＯＧ３）中に入れた（該フラ グメントはプラスミドｐＲＯＫｌ由来のものであった〔ポールコーム（Ｂａｕｌ ｃｏｍｂｅ）等、１９８６）　’）　、次いで、該３５Ｓプロモータの５′先端 領域を、クレノーポリメラーゼを用いて該プロモーカーを挿入し、プラスミドｐ ＭＯＧ４とする。このプラスミドｐＭＯＧ４からのＢａｍＨＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍ フラグメントを、アルファルファモザイクウィルス（ＡＬＭＶ）のリーダー配列 を含む合成フラグメントで置換した。この合成フラグメント中の図示したＮｃｏ ＩサイトはＡＬＭＶ−リーダーの直ぐ下流側に位置し、ＡＴＧ翻訳開始コドンを 含む。こうして得たプラスミドｐＭＯＧ　１１において、ノスーターミネータを もつＢａｍ　ＨＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントが再度挿入されて、プラスミド ｐＭＯＧｌ　２を与えた。

β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（プラスミドｐＲＡＪ２７５由来のも の；ジェファージン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　１９８７））をＮｅ。

１−ＢａｍＨＩフラグメントとしてプラスミドｐＭＯＧ１２に入れてプラスミド ｐＭＯＧＬ　４を得た。最後に、ｐＭＯＧＩ４からのＡｃｃｌ−ＥｃｏＲＶフラ グメント上にある３５Ｓプロモータのエンハンサ配列を単離し、タレノーポリメ ラーゼで平滑末端とし、ｐＭＯＧ１４の平滑末端化したＥｃｏＲＩ−サイトに入 れて、二重エンハンサ配列を含むプラスミドｐＭＯＧ１８（第２図）を得た。

このＨＳＡ−タンパクは先駆体として天然に合成され〔ユダＵｕｄａｈ）等、１ ９７３）　、そこでは５８５個のアミノ酸の成熟タンパクに先行する２４個アミ ノ酸の“プレプロ”−ペプチドが存在する。このクローン化プレプロＨ５ＡｃＤ ＮＡ　（ローン（Ｌａｕｎ）等、１９８１）がｐＭＯＧ３６の構築用の出発物質 として使用され、そこでは該Ｈ８Ａ−タンパクをコードする配列に先行してヒト Ｈ８Ａ−プレプローペプチド（ローン等、１９８１）がある。また、成熟ＨＳＡ Ｓターパクをコードする配列は植物起源（プラスミドｐＭＯＧ４９およびｐＭＯ Ｇ５０）のシグナルペプチドと、２種の異なる方法で融合された。最後に、ＨＳ Ａ−遺伝子が作られ、これはシグナルペプチドをコードする配列を含まなかった （プラスミドりＭＯＧ８５）。

ａ）プレプロＨ３Ａを含むプラスミドｐＭＯＧ３６の構築第３図に示したように 、プレプロＨ８Ａをコードする配列をＢｓｔＥＩＩ−Ｃ１ａＩ−フラグメントと してクローン化した。ＢＳｔＥＩＩに対する制限サイト（ＧＧＴＡＡＣＣ）は、 該ＩＳＡ遺伝子の出発コドンの９ヌクレオチド分後方に位置する（ローン等、１ ９８１）。標準的な方法を用いて、（、ｊ）ａ　Ｉに対する制限サイトを、Ｍ１ ３−ベクター（ヤニッシューペロン等、１９８５）を用いた配列ＴＡＣＣＡＴ〜 ＡＴＣＧＡＴの変異により、該Ｈ８Ａ−遺伝子のＴＡＡ停止コドンの２７ｂｐ後 方に生成した。このために、該ＢＳｔＥＩＩ−Ｃｊｉ！ａ　Ｉフラグメントはｔ ｓｓｏｂｐなるサイズをもっていた。２９ｂｐの合成■些■一旦堕Ｈｌフラグメ ントをｐＭＯＧ１８中に入れた。得られたプラスミドｐＭＯＧ３３では、ＡＴＧ 出発コドンの直後にあり、ＣＩ！ａ　Ｉ−サイトを伴う、ＢｓｔＥＩＩ−サイト までの欠損９ヌクレオチドが存在した。プラスミドｐＭＯＧ３３において、該プ レプロＩＳＡ遺伝子は第３図に示したように配置され、プラスミドｐＭＯＧ３６ を与えた。

ｂ）　ＰＲＯＢ！２シグナルペプチドの成熟Ｈ８Ａ−タンパクへの融合を含む、 プラスミドｐＭＯＧ４９およびｐＭＯＧ５０の構築 成熟ＨＳＡＳターパクをコードする配列は、２通りの方法で、サムサン（Ｓａｍ ｓｕｎ）　ＮＮタバコ（コルネリセン（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ）等、１９８６ ）からのＰＲ−タンパクＰＲＯＢ　１２のシグナルペプチドに融合された。この 植物シグナルペプチドは２５個のアミノ酸に対応する長さを有し、かつＡｌａ− Ａｌａペプチド結合は該シグナルペプチドの開裂サイトおよび成熟ｐＲＯＢ　１ ２タンパクを構成する。

成熟Ｈ８ＡおよびＨＳＡのプレプロ−配列の開裂サイトはＡｒｇ　−Ａｓｐであ る（ローン等、１９８１）。ここに示した構築において、２種の異る融合をｐＲ ＯＢ１２シグナルペプチドと成熟Ｈ８Ａとの間で行った。即ちＰＲＯＢ　１２シ グナルペプチドの最後のアミノ酸と成熟Ｈ８Ａの開始点との間の融合（Ａｌａ− Ａｓｐ）および該成熟Ｈ５ＡがＰＲ−タンパクの開裂配列によって先行される融 合（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ　；第４図）。

プラスミドＩ）ＭＯＧ４９およびｐＭＯＧ５０の構築のために、該成熟Ｈ８Ｒの ９および１０番目のコドン上の配列ＣＡＴ　ＣＧＧＴを、Ｍ１３−ベクタ（ヤニ ッシューペロン等、１９８５）ヲ用いた標準的な手順（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ ）、　１９８５）でＣＡＴ　ＣＧＡＴに変異誘発した。付随的にＣ１ａＩ制限サ イトを、コードされたタンパクを変えることなしに生成しく第４図）、変異誘発 が正しいか否かを配列解析により確認した。植物調節シグナルの融合はプラスミ ドｐＭＯＧ１８から開始し、該プラスミドには５ｏｂｐの合成Ｎｅｏ　ｒ　−Ｂ ａｍＨｒフラグメントが入れられており、このフラグメントは、ＰＲＯＢ　１２ のシグナルペプチドのＡＴＧ開始ゴドンからＳ　ｐｈ　Ｉ制限サイトまでをコー ドし、該制限サイトは含開裂サイトの最初のＡｌａ−残基の直前に位置する（コ ルネリセン等、１９８６）。最後に、得られたプラスミドｐＭＯＧ４２において は、２種の異る合成リンカ−が配置され、これは一方では成熟Ｈ８Ａ−遺伝子（ 成熟タンパクの９および１０番目のコドンにおける生成Ｃ１ａｒ制限サイトまで ）のＡｌａ　−Ａｌａ　−ＡｓＤ融合をコードし、他方では対応するＡｌａ−Ａ ｓｐ融合をコードする。得られたプラスミドｐＭＯＧ４８およびｐＭＯＧ４３に おいては、後に、変異誘発されたＨＳＡ−遺伝子がＣ１ａＩフラグメントとして 配置されて、夫々プラスミドｐＭＯＧ４９およびｐＭＯＧ５０を与えた。

Ｃ）成熟ＩＳＡを含むプラスミドＩ）ＭＯＧ８５の構築標準的方法（クンケル、 １９８５）を利用・して、コード配列において該成熟タンパクの第１アミノ酸（ Ａｓｐ）が正確な読取り枠（第５図）中のＡＴＧ翻訳開始コドンを含むＮｃｏＩ 制限サイトによって先行されるように、該Ｈ３Ａ−遺伝子をＭ１３−由来のベク タ中で変異誘発した。かくして誘導されたＮｃｏＩ制限サイトを含む該Ｈ５Ａ− 遺伝子はＤＮＡ配列につき検査され、次いでプラスミドｐＭＯＧ１８内でサブク ローニングした（第５図）。このｌ５Ａ−遺伝子のＣ−末端領域を含むＮｃｏＩ −ＢａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＭＯＧ５０から単離し、ベクタｐＭＯ Ｇ１８中に配置して、プラスミドｐＭＯＧ４Ｈ３Ａを得た。生成ＡＴＧ開始コド ンを含むＨＳＡ−遺伝子の初めの７４２ｂｐをＮｃｏＩ−フラグメントとしてプ ラスミドｐＭＯＧＡＨ３Ａ中に配置した。かくして得たプラスミドｐＭＯＧ８５ は、表現ベクタ中にシグナルペプチド配列を含むことなく、成熟Ｈ３Ａ−遺伝子 を含んでいた。プラスミドｐＭＯＧ３６、ｐＭＯＧ４９、ｐＭＯＧ５０およびｐ ＭＯＧ８５は今や３．　ＯｋｂＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍ制限フラグメントと して導入すべきｌ５Ａ−遺伝子を含んでいた。

■　タバコプロトプラストのエレクトロボーレーションタバコブロトブラスト〔 ニコチアナ　タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）　ｃｖ、　５ＲＩ ）の単離およびエレクトロポーレーションをローデンバーグ（Ｒｏｄｅｎｂｕｒ ｇ）等（１９８９）の方法に従って行った。このエレクトロポーレーションのた めに、５Ｘ１０’個のプロトプラストを、プラスミドｐＭＯＧ３６、ｐＭＯＧ４ ９およびｐＭ。

Ｇ５０のいずれかの超コイルＤＮＡ４０μｇ／ｍＡ’の存在下でＩＯ分間θ℃に て予備インキュベーションした０、５−のバッファー中に懸濁した。次いで、こ れを３００Ｖ／ｃｍおよび３８ｎｓｅｃの１パルスでエレクトロボーレーション に付した。再度０℃にて１０分間インキュベートした後、細胞をに３Ｇ培地で５ 倍容に希釈し、更に暗所にて２０℃で育成した。ｌ５Ａ−タンパクの存在を■に 記載の如くテストした。

■　タバコの形質転換および懸濁細胞の誘発植物中に遺伝子構築体を導入するた めに、様々な技術、例えば子衝撃、プロトプラスト中へのＤＮＡの取込みなどが 利用できる。

実際のＤＮＡの導入法は本発明に関しては臨界的ではない。タノくコの形質転換 のために、葉−盤（ｌｅａｆ−ｄｉｓｋｓ）とアグロバクテリウム　ツメファシ ェンスとの共存培養を、ホルシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、（１９８５）の手順に従 って利用した。この方法はバイナリ−ベクター系の原理に基（もので（ヘケ７　 （Ｈｏｅｋｅｍａ）等、１９８３）　、そこではアグロバクテリウム株が使用さ れ、この株は一方ではビルレンス（ｖｉｒ）遺伝子をもつプラスミドを含み、ま た一方で導入すべき遺伝子を含む該プラスミドと相容性のプラスミドを含む。プ ラスミドｐＭＯＧ３６、ｐＭＯＧ４９、ｐＭＯＧ５０およびｐＭＯＧ８５に存在 するような４種の関連遺伝子−構築体を該バイナリーベクタｐＭＢＶ４中でクロ ーニングした。このベクターはＥ、：ＩＩＪ−およびアグロバクテリウム両者に おいて複製でき、バイナリ−ベクタＢ１ｎ１９（ベバン、１９８４）から誘導で き、かつ本発明において本質的である点において該ベクタと変るところはない。

ベクターｐＭＢＶ４とＢ１ｎ１９とはＴ−ＤＮＡの左右の周辺配列間に同等のキ メラＮＰＴＩＩ−遺伝子（カナマイシン耐性をコードする；ベバン、１９８４） 並びに組込むべき構築体のクローニングのためのいわゆるポリリンカーを含んで いる。プラスミドｐＭＯＧ３６、ｐＭＯＧ４９、ｐＭＯＧ５０およびｐＭＯＧ８ ５上に位置する該キメラＨ８Ａ−遺伝子は、該ベクターをＥｃｏＲＩおよびＨｉ ｎｄｌＩＩで線状化した後に、３．　ＯｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラ グメントとして該ベクタｐＭＢＶ４のポリリンカー内に配置された。かくして得 たバイナリ−プラスミド、夫々ｐＭＯＧ２３６、ｐＭＯＧ２４９、ｐＭＯＧ２５ ０およびｐＭＯＧ２８５を、プラスミドｐＲＫ２０１３（ディツタ（Ｄｉｔｔａ ）等、１９８０）を使用した可動化により、アグロバクテリウム株に転移された 。該株は該Ｔ−ＤＮＡを該植物に伝達するためのｖｉｒ−遺伝子を担持するプラ スミドを含む。

かくして得たアグロバクテリウム株を用いて、タバコの形質転換を行った。トラ ンスジェニック植物は選択培地（１００ｍｇ／Ｉ２カナマイシン）上で発生する 苗条から再生した。ｌ５Ａ−タンパクの存在は以下の■で記載するようにしてテ ストした。懸濁培養を、最大の表現水準を示したトランスジェニック植物（クロ ーンｐＭＯＧ２４９＃１）から開始した。このため、カルスを、ＭＳ培地（３％ スクロース（ＭＳ３０）　、２．０ｍｇ／ｆＮＡＡ、０．１　ｍｇ／ｌカイネチ ンおよび５０ｍｇ／ｊ７カナマイシン）上で育生することでトランスジェニック 葉盤上に誘発させ、その後、該カルスを同じ組成の液体培地に移した。懸濁状態 で１週間後、培地を新たなＭＳ３０（今度は０．５　ｍｇ／　ｌの２．４−Ｄを 含む）で置換した。

この培地は毎週置換し、この操作を均一な培養物が得られるまで続けた。第７週 日以後、カナマイシン選別を段階的に２５ｍｇ／ｉから］００ｍｇ／ｆまで高め た。

■　ジャガイモの形質転換 ジャガイモを形質転換するために、上記■で述べたようなアグロバクテリウム　 ツメファシェンスについて開発したバイナリ−ベクター系を用いた。品種デジリ ー（Ｄｅｓｉｒｅｅ）の塊茎盤を、ヘケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）等（１９８９）の 方法に従って、プラスミドｐＭＯＧ２３６、ｐＭＯＧ２４９、ｐ　ＭＯＧ　２５ ０またはｐＭＯＧ２５０を含むヱグロバクテリウム株と共に共存培養した。全体 で７５のトランスジェニック植物を選択培地（ｌｏＯｍｇ／ｆのカナマイシン） 上で発育した苗条から再生した。即ち、ｐＭＯＧ２３６構築体を含む５１植物、 ｐＭＯＧ２４９を含む１２植物およびｐＭＯＧ２５０を含む１２植物を再生した 。このトランスジェニック植物をインビトロで増殖させ、その後分析のために鉢 内の土壌で成長させて成熟植物とした。

Ｖ　ＨＳＡ−ｍＲＮＡおよびＨＳＡ−タンパクの検出すべてのトランスジェニッ クジャガイモ植物をノーサンプロット法でＨＳＡ−ｍＲＮＡ　（ベルウアード（ Ｖｅｒｗｏｅｒｄ）等、１９８９）の存在につきテストした。５１種のｐＭＯＧ ２３６含有植物中４６種、１２種のｐＭＯＧ２５０含有植物中１０種および全ｐ ＭＯＧ２４９含有植物において、ＩＳＡ−ｍＲＮＡが検出された。

ＨＳＡ−タンパクの存在は、７．５〜１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲ ル上での可溶性タンパク画分を分離し、次いでニトロセルロース上でのウェスタ ンプロット法および山羊−抗ＨＳＡ（Ｓｅｒａ−Ｌａｂ、　ＵＳＡ）次いで兎− 抗一山羊パーオキシダーゼによる免疫検出（ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ） によりテストした。ニトロセルロースと抗体とのインキュベーション中の結合条 件は、１０　ｍＭ　ＮａＰｉ、ｐＨ７，２，１５０ｍＭ　ＮａＣｊｉ！、１．２ ５％プロット（Ｂｌｏｒｔｔｏ）、０．２％Ｔｗｅｅｎ　２０．０．１％Ｔｒｉ ｔｏｎ　Ｘ　１００．３５℃であった。ＨＳＡをＯ−ジアニシジンによるパーオ キシダーゼ染色法により可視化した。検出可能量のＩＳＡが３Ｉ種のｐＭＯＧ２ ３６含有植物、８種のｐＭＯＧ２４９含有植物および９種のｐＭＯＧ２５０含有 植物、即ち葉、茎および塊茎において見出された。

■　植物細胞によるＨＳＡの排出 形質転換後、トランスジェニック植物によるＨＳＡの合成および排出が示された 。使用したシグナルペプチドの各々が該植物細胞からのＨＳＡの排出を可能とす ることが明らかとなった。排出は以下の３通りの方法で示すことができた。

ａ）上記のベクターによるタバコプロトプラストのエレクトロボーレーションお よび引続いての導入された遺伝子およびシグナル配列の一過性の表現の後、ＨＳ Ａが、ウェスタンプロット法で４８時間培養すると、該培地中に特異的に検出さ れた。このため、該培地はＰＤＩＯ／Ｇ２５カラムで脱塩し、凍結乾燥により濃 縮した。トランスジェニックタバコプロトプラストの抽出物（２×濃縮５ＤＳ− サンプルバッファー中でペレット化したプロトプラストを溶解した後）中のＨＳ Ａは検出限界（＜ＩｎｇＨ８Ａ／２５μｇ可溶性タンパク）以下であった。

ｂ）トランスジェニックタバコの懸濁細胞の培地中には、ＨＳＡがウェスタンプ ロット法で検出できた（２ｎｇ／１０μｇ細胞外タンパク）。ペレット化懸濁細 胞の抽出物中のＨ５Ａ濃度はｌｎｇＨＳＡ／２５μｇ可溶性タンパクなる検出レ ベルであった。

Ｃ）植物ジャガイモのトランスジェニック型部における細胞外液の分析による検 出。５　ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、ｐｉ（６，３，５０ｍＭ　ＮａＣｌ中での 細断した葉の真空抽出後に、緩かな遠心分離（６００ｇ）（ヘンドリックス（Ｈ ｏｎｄｒｉｃｋｓ）等、１９８５）することにより細胞外液を抽出し得ることが わかった。この液は、マーカー酵素グルコース−６Ｐデヒドロゲナーゼ（細胞質 ）およびパーオキシダーゼの特異的活性を決定することによりそのまま同定でき た。ウェスタンプロット分析によれば、この細胞外液は全型部の抽出物よりも約 ２０倍高いＩＳＡ濃度（タンパク１ｍｇ当たり）を示すことがわかった。シグナ ルペプチドを含まず、ＨＳＡ−遺伝子を含む構築体ｐＭＯＧ２８５を有するトラ ンスジェニックタバコ植物の型部から、ジャガイモ植物について上記したように して細胞外液を抽出した。この液にはＨＳＡは検出されなかった。

■　ＩＳＡのインビボプロセッシング Ｈ８Ａが該植物細胞を介して輸送される際に正しくプロセッシングされ、即ちそ の際に対応するシグナルペプチドが成熟Ｈ３ＡのＡｓｐ−コドンの前で（第１図 ）開裂されているか否かを調べるために、様々な実験を行った。ＨＳＡは酵素活 性をもたないので、物性のみが分析できた。か（して、植物のＨＳＡを標準的な ＨＳＡと比較できた（使用した分析手順は■−Ｘに詳述する）。

ａ）分子量をＦＰＬＣ−ゲル濾過法および５ＤＳ−ＰＡＧＥ（７，５〜１５％の 濃度勾配ゲル）法で比較した。

ｂ）モノＱアニオン交換樹脂上での塩濃度勾配（θ〜３５０ｍＭＮａＣｊ？　、 　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ中、ｐＨ８，０）溶出の際の溶出パターン。

Ｃ）精製Ｈ８ＡのＣＮＢｒ消化生成物を、銀染色後２０〜２７％５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ濃度勾配ゲル上で分析した。

ｄ）　）ランスジェニック植物からの精製Ｈ８Ａのアミノ酸配列。

見出された唯一の差異は、使用したシグナルペプチドに依存したＮ−末端アミノ 酸配列（■参照）の差およびＣＮＢｒ−消化パターンにおける差であった。

■　トランスジェニックジャガイモ植物からのＩＳＡの精製各構築物を含むもの からの最大の表現を示すクローン（２３６＃３Ｉ、２４９＃ＩＯおよび２５０＃ ６）を用いて、トランスジェニック植物をＩＳＡの抽出のために十分に生育させ た。このために、５００〜１０００ｇの植物材料を４℃にて、ｌ　ＯｍＭ　Ｎａ Ｐｉ、ｐＨ７，２，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ２　（Ｐ　Ｂ　Ｓ）　（０，６％のＰ ＶＰＰ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む）中でホモジネートし た。可溶性画分は細胞デブリスを含まず、これを１．５−のりアクチゲル（Ｒｅ ａｃｔｉｇｅｌ）　ＨＦ　−６５（ピアースケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ））および０．５％のＴｗｅｅｎ　８０と組合せた抗−ＨＳＡと共に インキュベートした（４時間）。遠心分離によりＨＳＡ−抗−Ｈ３Ａ−リアクチ ゲル錯体を単離し、２１ｎｌのカラムに移し、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０のＰＢＳ 溶液で２度洗浄した。ＨＳＡの脱着を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２，５，１０％ ジオキサンで溶出することにより実施し、その後このバッファーを即座にＰＤＩ Ｏ／Ｇ２５カラム〔ファルマーシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）を用いて５０　 ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐ）１８．０で交換した。溶離液を直接濾過しく０．２２ 　μＭ）　、モノＱ　（ＭｏｎｏＱ）カラムＣＨＲ５１５ファルマーシア（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ））に移した。線形勾配（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１、ｐＨ８ 、θ中でＮａＣＡ　Ｏ〜３５０ｍＭ、　２０分、１ｒｎｌ／分）により、ＩＳＡ の大部分は特異的に結合したタンパク成分から精製された。ウェスタンプロット においてＨＳＡを高濃度で含むと思われる画分を凍結乾燥により濃縮し、ＰＢＳ 中でのＨＲｌ　０／３０スペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　６ゲル濾過カラム（ ファルマーシア）上に載せた。トランスジェニック植物から単離されたＨＳＡの 溶出体積は、いずれのカラムにおいても標準Ｈ８Ａの溶出体積と正しく対応した 。単離したＨＳＡの純度は銀−染色ＳＯ３−ゲルを用いて確認した。

■　トランスジェニック植物からのＨＳＡのＮ−末端アミノ酸配列 スペロース６ゲル濾過カラム（■）のＨＳＡビークを、アプライドバイオシステ ムダ４フフＡプロテインシーケンサ−［ＡＩ）ｌ）ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ　４７７Ａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（−Ｌ−ロシーケンスＢ、 Ｖ。

（Ｂｕｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂ、　Ｖ、　）グロニンゲン］を用いたアミノ酸 配列解析のためにイモピロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）ＰＶＤＦ膜上に直接点着し た。予想外のことに、ｐＭＯＧ２５０含有植物からのＨＳＡのみが、正確にプロ セッシングされていることがわかり、精製ＨＳＡのＮ−末端におけるアミノ酸配 列はＡｓｐ−Ａｌａ　−４（ｉｓ　−Ｌｙｓ　−３ｅｒ　−Ｇｉｎであると確立 された。この配列はまった（ヒト血液血漿中に存在する、正確にプロセッシング されたＨＳＡのＮ−末端配列を表す（ローン等、１９８１）。

ｐＭＯＧ２３６含有植物（即ち、ヒトシグナルペプチドをもつ構築体を含有する 植物）から精製されたＨＳＡのＮ−末端のアミノ酸配列は、排出されたＩＳＡが 依然としてペプチド：　Ａｒｇ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ−Ａ ｒｇを含むことを立証した。１８個のアミノ酸からなるプレペプチドのみが除去 されていた。ヒトにおいては、セリンプロテアーゼにより（ブレナン（Ｂｒｅｎ ｎａｎ　）等、１９８４）　、排出過程の遅い段階中に、プロペプチドが除去さ れる。

この種のプロテアーゼは植物ではまれにしかみられない〔ライアン＆ウォーカー ーシモンズ（Ｒｙａｎ　＆　Ｗａｌｋｅｒ−３ｉｍｍｏｎｓ）、　１９８１）。

トランスジェニック植物ｐＭＯＧ２４９から精製したＩＳＡは、多分Ａｌａ−残 基の存在のために（パーノン（Ｐｅｒｓｓｏｎ）等、１９８５）、そのＮ−末端 においてエドマン−分解に対して化学的に遮蔽されているものと思われた。該Ａ ｌａ−残基は使用したシグナルペプチド構造に由来する（第１図参照）。

Ｘ　トランスジェニック植物からのＨＳＡのＣＮＢｒ消化ＰＶＤＦ膜上で精製し たＨＳＡ　（■）をＣＮＢｒ消化用の出発物質として使用した。膜からの脱着は ５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＡ’　、　ｐＨ９，２％ＳＤＳ、２％Ｔｒｉｔｏｎ 　ｘ　１００で行い、次いで冷アセトンで沈殿させた。乾燥したペレットを２０ ０ｎｍｏｊ７のＣＮＢｒ／８ｇタンパクを含むｌＯμｌの７０％蟻酸中に再懸濁 し、室温にて２４時間インキュベートした。希釈後、この消化物を凍結乾燥し、 ギラン（Ｇｉｕｉｉａｎ）等（１９８３）の方法に従って２０〜２７％５ＤＳ− ＰＡＧＥで解析した。この実験において、トランスジェニックｐＭＯＧ２３６か ら単離したＨ８Ａ由来の消化物のみが、標準　・ＨＳＡの消化物と比較して例外 的なパターンを示した。この結果は、まったくのところ、アミノ酸配列データ（ ■参照）から理解されるように、ＩＳＡに先行するポリペプチドの存在によるも のと考えられる。

参考文献 ０ボールコーム（Ｂａｕ　ｌｃｏｍｂｅ　）等、Ｎａｔｕｒｅ、　１９ｇ６．３ ２１．ｐｐ、４４６−４４９０ベバン（Ｂｅｖａｎ）、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ 　Ｒｅｓ、、　１９８４，１２．　ｐｐ、　８７１１−８７２１０ベーレンス（ Ｂｈｅｒｅｎｓ）等、Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、、　１９７５．３４．　ｐ、５９１ ０ブレドロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ）等、ＭＡＲ，１９８０，８、１）Ｉ）、 　２２１３−２２２３０ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　１９８４．８０２゜ｐｐ、　２４−２８ ０カールソン等、Ｃｅ１ｌ、　１９８２．２８．　ｐｐ、　１４５−１５４０チ エン（ｈｅｎ）等、ＥＭＢＯＪ、、　１９８５．土、　ｐｐ、　２１４５−２１ ５１０コルネリセン等、Ｎａｔｕｒｅ、　１９８６．３２１．　ｐｐ、　５３１ −５３２０デラチＥ　ツバ（Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ）等、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、、　１９８７゜８４、　ｐｌ）、　９６５−９６８ ０デルーズ（Ｄｅ　Ｌｏｏｓｅ）等、Ｇｅｎｅ、　１９８８．７０．　ｐｐ、　 １３−２３０デイツタ（Ｄｉｔｔａ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　１９８０゜７？、　ｐｐ、７３４７−７３５１ ０　ドレル（Ｄｏｒｅｌ）等、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉａｌ、、１９８９．　１０ ８．　ｐｐ、　３２７−３３７Ｑｊｌ−シエベリ−（Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ）等 、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ、、　１９８６．±。

ｐｐ、　７２６−７３０ ０ギラン（Ｇｉｕｉｌａｎ）等、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、、　１９ｇ３ ．１２９．　ｐｐ、　２７７−０グツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）等、ＰＣＴ／Ｗ Ｏ８７１００８６５（１９８７）０ギレー（Ｇｕｉｌｌｅｙ）等、Ｃｅ１ｌ、　 ！９８２．３０．　ｐｐ、　７６３−７７３ｏハルツキ（Ｈａｒｋｋｉ）等、Ｂ ｉｏ／Ｔｅｃｈｎ、、　１９８９．　７．　ｐｐ、　５９６−６０３０ヘントリ クス（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ）等、Ｐｌａｕｔａ、　１９８５．１６４．　ｐｐ、　 ８９−９５０ヘルスコウピツチ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉ　ｔｚ）等、Ｔｈｅ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｏｈａｒｏｍ ｙｃｏｓ、　ｖｏｌ　１．　ｐｐ、　１８１−２１０　（１９８２）Ｏヘケ７　 （Ｈｏｅｋｅｍａ）等、Ｎａｔｕｒｅ、　１９８３．３０３．　ｐｌ）、　１７ ’９−１８００ヘケ７　（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ、、　１９ ８９．　７．　ｐｐ、　２７３−２７８０フーフトフアンヒユイスデユイネン（ Ｈｏｏｆｔ　ｖａｎ　Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ）０ジエフアーソン（Ｊｅｆｆ ｅｒｓｏｎ）、　Ｐｌａｎｔ　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｏｒｔ、　１９８ ７゜０キングズマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）等、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎ、、　１９８７゜５、　ｐｐ、　５３−５６ ０コーンフエルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ）、　Ｆｅｄ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ｂｘ ｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｊ、。

１９８７、１．　ｐｐ、　４６２−４６８０クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、、Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　１９８５．８２゜ｐｐ 、　４８８−４９２ ０ラツタ（Ｌａｔｔａ）等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ、、　１９８７．５．　ｐｐ、 　１３０９−１３１４ｏローン（Ｌａｗｎ　）等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ｓ、、　１９８１，９．　ｐｐ、６１０３−６１１４０マニアテイス（Ｍａｎｉ ａｔｉｓ）等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１９８２．コールドス プリングハーバ−ラボラトリーズＯメメリンク（Ｍｅｍｅｌｊｎｋ）、　Ａｌｔ ｅｒｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｔ−ＤＮＡｔｒａｎｓｆｏ ｒｍｅｄ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｔｉｓｓｕｅｓ、　１９８８．セーシス（Ｔｈｅｓ ｉｓ）リークスユニバーシタイト（Ｒｉ　ｊｋｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ）、 　ライデン０ミスラ（Ｍｉｓｒａ）、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　１９ ８９．８９．５４７０パーソン（Ｐｅｒｓｓｏｎ）等、Ｂｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、、　１９８５．１５２．　ｐｐ。

０プフｘツフ７−（Ｐｆｅｆｆｅｒ）等、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、、　１９８７゜０ローデンバーグ（Ｒｏｄｅｎｂｕｒｇ）等、Ｐｌａｎｔ　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１９８９（投稿中） ０ライアン（Ｒｙａｎ）等、“Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ″、Ｔｈｅ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、　１９８１．　スタン７、コ ン（Ｓｔｕｍｐｆ、　Ｃｏｎｎ）編、アカデミツクプレス、ニューヨーク ０サンダース（５ａｕｎｄｅｒｓ　）等、ＢＰ−Ａ−０２２９７１２（１９８７ ）０スレート（Ｓｌｅａｔ）等、Ｇｅｎｅ、１９８７．２１？、　ｐｐ、　２１ ７−２２５０シユテツトラー（Ｓｔｅｔｌｅｒ）等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ、、１ ９８９．７．　ｐｐ、５５−６００バーウオード（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ　）等、Ｎ ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　、　１９８９．１７．　ｐ、　２３６２０ヤニ ツシユーペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ、　１９８５． ３３゜ｐｐ、　１０３−１１９ 浮遊（内容に変更なし） Ａｒｇ　Ａｓｐ Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ Ａｌａ　Ａｓｐ ＦＩＧ、１ 平成　年　月　日

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．植物または植物細胞を育生することによる、非相同タンパク物質を生成する 細胞から排出される該タンパク物質の植物宿主中での製造方法であって、該植物 または植物細胞が組換えポリヌクレオチドを用いた遺伝子操作、場合によっては 原種によって、遺伝情報を有しており、該遺伝情報は該植物宿主が該非相同タン パク物質を表現し、かつこれを生成する細胞から排出させるのに必要なものであ り、また該宿主に導入すべき該遺伝情報は表現カセットを含み、該表現カセット は該宿主内で機能性であり、かつ該成熟タンパク物質をコードする少なくとも一 つの遺伝子を含み、該遺伝子は該宿主内で機能性の植物シグナルペプチドをコー ドする遺伝情報によって直接先行されていることを特徴とする上記方法。
2. ２．自然環境の下では、該細胞からの排出をもたらし、かつそれ自体は開裂除去 されるシグナルペプチドを含む先駆体由来のタンパク物質が製造され、該植物宿 主中に導入される該遺伝情報は該宿主内で機能性でかつ遺伝子構築体を含む表現 カセットを含み、該構築体は該成熟タンパク物質をコードする遺伝子およびこれ に直接先行する該宿主内で機能性の植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報 を、該非相同タンパク物質の天然のシグナルペプチドをコードする遺伝情報の代 りに含む遺伝子構築体を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該植物宿主に導入すべき該遺伝情報が表現カセットを含み、該カセットは該 宿主内で機能性でありかつ遺伝子構築体を含み、該構築体は該成熟タンパク物質 をコードする遺伝子と、これに対して直接先行する、該宿主内で機能性でかつ病 理一関連タンパクＰＲＯＢ１２由来の植物シグナルペプチドをコードする遺伝情 報とを含むことを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. ４．該植物宿主としてデン粉の生産に適した種の植物を使用することを特徴とす る請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。
5. ５．該植物宿主として、ジャガイモ、トウモロコシおよびキャッサバからなる群 から選ばれる植物種を使用する請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．該植物宿主として、工業的デン粉製造に有用なジャガイモ品種を使用し、か つその塊茎をデン粉の製造および該非相同タンパク物質の製造両方の目的で使用 することを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．該植物宿主として植物細胞の懸濁培養物を使用する請求の範囲第１〜３項の いずれかに記載の方法。
8. ８．該植物宿主として、植物種タバコの植物細胞の懸濁培養物を使用する請求の 範囲第７項記載の方法。
9. ９．生成される該タンパク物質が、１以上の翻訳後プロセッシング工程を必要と する動物またはヒトタンパクであり、該プロセッシング工程が、特に少なくとも 、該成熟タンパクに先行するシグナルペプチドを含む先駆体として該タンパクを 生成する細胞からのその排出および該シグナルペプチドの開裂を含む請求の範囲 第１〜８項のいずれかに記載の方法。
10. １０．生成される該タンパク物質がヒト血清アルブミンである請求の範囲第９項 記載の方法。
11. １１．ジャガイモ植物を育生することによるヒト血清アルブミンの製法であって 、該ジャガイモ植物が組換えポリヌクレオチドを用いた遺伝的操作、場合によっ ては原種によって、該ジャガイモ植物による該ヒト血清アルブミンの表現および 正確な翻訳後プロセッシングを可能ならしめるに必要な遺伝情報を与えられてお り、該ジャガイモに導入すべき該遺伝情報が表現カセットを含み、該カセットが 該ジャガイモ内で適しており、かつ少なくとも成熟ヒト血清アルブミンをコード する遺伝子を含み、該遺伝子が該ジャガイモ内で機能性で病理一関連タンパクＰ ＲＯＢ１２由来の植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報により直接先行さ れており、かくして遺伝的に操作されたジャガイモ植物により生成された該ヒト 血清アルブミンを該ジャガイモの塊茎から単離することを特徴とする上記方法。
12. １２．タバコ植物種の細胞を懸濁状態で育生することによるヒト血清アルブミン の製造方法であって、該タバコは、組換えポリヌクレオチドを用いた遺伝操作、 場合によっては原種によって、該懸濁タバコ細胞によるヒト血清アルブミンの表 現および正しい翻訳後プロセッシングを可能とするのに要する遺伝情報が与えら れており、該タバコに導入すべき該遺伝情報は表現カセットを含み、該カセット はタバコに適したもので、かつ少なくとも一種の成熟ヒト血清アルブミンをコー ドする遺伝子を含み、該遺伝子は直接、植物内で機能性でかつ病理一関連タンパ クＰＲＯＢ１２由来の植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報により先行さ れており、および該遺伝的に操作された懸濁タバコ細胞によって生成されたヒト 血清アルブミンを該培地から単離することを特徴とする上記方法。
13. １３．組換えポリヌクレオチドを用いた遺伝操作、場合によっては原種によって 、植物、植物の部分または植物細胞が非相同タンパク物質を表現し、これを生成 する細胞からこれを排出せしめるのに必要な遺伝情報が与えられており、該遺伝 情報が表現カセットを有し、該カセットが少なくとも一種の該成熟タンパク物質 をコードする遺伝子を含み、該遺伝子が直接、該宿主中で機能性の植物シグナル ペプチドをコードする遺伝情報によって先行されていることを特徴とする植物、 植物の部分および植物細胞。
14. １４．自然環境の下では、該細胞からの排出をもたらし、かつそれ自体は開裂除 去されるシグナルペプチドを含む先躯体由来の非相同タンパク物質を製造するこ とができ、該植物宿主に導入すべき該遺伝情報が表現カセットを含み、該カセッ トは該成熟タンパク物質をコードする遺伝子と、これに直接先行する該宿主内で 機能性の植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報を、該非相同タンパク物質 の天然のシグナルペプチドをコードする遺伝情報に代えて含む遺伝子構築体を含 むことを特徴する請求の範囲第１３項記載の植物、植物の部分および植物細胞。
15. １５．該植物宿主に導入される該遺伝情報が、該成熟タンパク物質をコードする 遺伝子と、これに直接先行する、該宿主内で機能性で、かつ病理−関連タンパク ＰＲＯＢ１２由来の植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報とを含む遺伝子 構築体を含む請求の範囲第１３または１４項記載の植物、植物の部分および植物 細胞。
16. １６．デン粉の製造に適した植物種からなる群から選ばれる請求の範囲第１３〜 １５項のいずれかに記載の植物、植物の部分および植物細胞。
17. １７．ジャガイモ、トウモロコシおよびキャッサバからなる植物種の群から選ば れる請求の範囲第１６項記載の植物、植物部分および植物細胞。
18. １８．デン粉を工業的に生産するのに適したジャガイモ品種からなる群から選ば れる請求の範囲第１７項記載の植物、植物部分および植物細胞。
19. １９．懸濁状態で培養するのに適した種である請求の範囲第１３〜１５項のいず れかに記載の植物、植物部分および植物細胞。
20. ２０．ニコチアナ種からなる群から選ばれる請求の範囲第１９項記載の植物、植 物部分および植物細胞。
21. ２１．該非相同タンパク物質が、１以上の翻訳後プロセッシング工程を必要とす る動物またはヒトタンパクであり、該プロセッシング工程が、特に少なくとも、 該成熟タンパクに先行するシグナルペプチドを含む先駆体として該タンパクを生 成する該細胞からの排出および該シグナルペプチドの開裂を含む請求の範囲第１ ３〜２０項のいずれかに記載の植物、植物部分および植物細胞。
22. ２２．該非相同タンパク物質がヒト血清アルブミンである請求の範囲第２１項記 載の植物、植物部分および植物細胞。
23. ２３．ヒト血清アルブミンの製造に適したジャガイモ植物並びにその部分および 細胞であって、これらは、組換えポリヌクレオチドを用いた遺伝子操作、場合に よっては原種により、これらが該ヒト血清アルブミンを表現しかつこれを正しく プロセッシングすることを可能ならしめるに必要な遺伝情報を有しており、該ジ ャガイモに導入される該遺伝情報は表現カセットを含み、該カセットは少なくと も一つの成熟ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を含み、該遺伝子は直接、 該ジャガイモ内で機能性であり、かつ病理−関連タンパクＰＲＯＢ１２由来の植 物シグナルペプチドをコードする遺伝情報により先行されていることを特徴とす る上記ジャガイモ植物およびその部分並びに細胞。
24. ２４．ヒト血清アルブミンの製造に適したタバコ植物およびその部分並びに細胞 であって、これらは組換えポリヌクレオチドを用いた遺伝子操作、場合によって は原種によって、該植物、その部分または植物細胞が該ヒト血清アルブミンを表 現し、かつこれを正確に翻訳後プロセッシングすることを可能とするのに必要な 遺伝情報を与えられており、該タバコに導入される、該遺伝情報は表現カセット を含み、該カセットは該タバコに適しており、かつ少なくとも一つの成熟ヒト血 清アルブミンをコードする遺伝子を含み、該遺伝子は直接、該宿主内で機能性で しかも病理一関連タンパクＰＲＯＢ１２由来の植物シグナルペプチドをコードす る遺伝情報で先行されていることを特徴とする上記タバコ植物およびその部分並 びにその細胞。
25. ２５．上記請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の方法により得られるおよ び／または上記請求の範囲第１３項〜２４項のいずれかに記載の植物、植物の部 分または植物細胞から得られるタンパク物質。
26. ２６．上記請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の方法により得られるおよ び／または上記請求の範囲第１３〜２４項のいずれかに記載の植物、植物の部分 または植物細胞から得られるヒト血清アルブミン。
27. ２７．動物またはヒトタンパクをその成熟形状でコードする遺伝子並びに該遺伝 子に直接先行する、植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報を含む組換えポ リヌクレオチド。
28. ２８．該植物シグナルペプチドをコードする該遺伝情報が病理一関達タンパクＰ ＲＯＢ１２由来の植物シグナルペプチドである請求の範囲第２７項記載の組換え ポリヌクレオチド。
29. ２９．動物またはヒトのタンパクをその成熟形状でコードする該遺伝子が、成熟 ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子である請求の範囲第２７項または第２８ 項記載の組換えポリヌクレオチド。
30. ３０．動物またはヒトのタンパクを成熟形状でコードする該遺伝子および該遺伝 子に直接先行し、かつ植物シグナルペプチドをコードする該遺伝情報が、該宿主 に適した表現カセット中に組込まれている請求の範囲第２７〜２９項のいずれか に記載の組換えポリヌクレオチド。
31. ３１．該宿主に適した該表現カセットが、ジャガイモ、トウモロコシ、キャッサ バまたはタバコに適した表現カセットである請求の範囲第３０項記載の組換えポ リヌクレオチド。
32. ３２．該ポリヌクレオチドがＤＮＡからなる請求の範囲第２７〜３１項のいずれ かに記載の組換えポリヌクレオチド。
33. ３３．ベクタブラスミドとそこに挿入された表現カセットとを含み、該表現カセ ットが動物またはヒトタンパクをその成熟形状でコードする遺伝子と、これに直 接先行する、植物シグナルペプチドをコードする遺伝情報とを含む請求の範囲第 ３２項記載の組換えＤＮＡ。
34. ３４．該ベクタープラスミドがバクテリア宿主内でクローニングするのに適した ベクタである請求の範囲第３３項記載の組換えＤＮＡ。
35. ３５．該ベクタプラスミドが該宿主に適したベクタである請求の範囲第３３項記 載の組換えＤＮＡ。