JPH07507199A

JPH07507199A - 植物中の高価値ペプチドの担体用の油体タンパク質

Info

Publication number: JPH07507199A
Application number: JP4507924A
Authority: JP
Inventors: モロニー　モーリス　エム
Original assignee: セムバイオシス　ジェネティック　インコーポレイテッド
Priority date: 1992-04-15
Filing date: 1992-04-15
Publication date: 1995-08-10
Anticipated expiration: 2020-04-20
Also published as: CA2118113C; WO1993021320A1; KR950700992A; EP0636179A1; DE69233416T2; AU1583292A; CA2118113A1; FI944841L; NO943914D0; NO323038B1; ES2227511T3; JP3639592B2; EP0636179B1; ATE277180T1; NO943914L; FI944841A0; DE69233416D1; FI120266B; DK0636179T3; AU678136B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】植物中の高価値ペプチドの担体用の油体タンパク質本発明は、宿主細胞成分から容易に精製できる、目的のタンパク質を、組換え手段によって製造する方法に関するものである。植物中、特に種子中の目的とするタンパク質を、油体タンパク質およびこの目的のタンパク質を含有するキメラペプチドとして形質発現することによって、本発明を例示する。

背景植物中で種々のタンパク質が形質発現されてきた。しかし、植物中の外来タンパク質の形質発現を得る方法が一般的に可能なことは示されてきたけれども、この源から精製タンパク質を得ることには、幾つかの制限があった。これらの制限としては、植物に由来する物質を実質的に含まない純粋なタンパク質を得るのに必要な精製工程や、得られた組換えタンパク質が水性緩衝液と接触しているときに、この精製工程の間に製造される抽出物中で生じうる劣化がある。

大豆、なたね、ひまわり、およびコーン、にんじん等の多数の他の植物種のような、脂肪種子を保持する植物は、その種子中にトリグリセライドを貯蔵している。この植物では、これらのトリグリセライドが、種子を発芽させ、続いて実生させるためのエネルギー源として作用する。このトリグリセライドは、食品中で、および食品の製造中に、また幾つかの工業的用途のための植物油として、広く使用されている。

トリグリセライドは、水と混和せず、水溶液の表面上に浮かぶことによって、またはこの水相中に懸濁液として小さい球状体またはリポソームを形成することによって、区分と混和しない。こうした球状体は、もしも修飾された表百層によって安定化されていない場合には、自然に合体するであろう。この合体によって、雑多な１法の球状体の懸濁液がもたらされつる。種子においては、トリグリセライドを貯蔵するときには、この適法状体は実際には、通常は均一な寸法のカプセル化された脂質または油体である。これらの油体の表面に会合するのは、幾つかのタンパク質が散在しているハーフユニット膜であり、一般的には油体タンパク質と呼ばれている。

少なくとも一つの族の油体タンパク質は、種の間で高度に保持されている幾つかの特性を有している。この族の油体タンパク質は、「オレオジン（ｏｌｅｏｓｉｎ　）　Ｊと呼ばれている。これらのタンパク質の親水性のＮ−またはＣ−末端は、まったく分散しているように見えるが、一方この親油性の内部領域（中央コア）は、種の間で高度に保存されているように見える。このオレオシンは、油体と強く会合し、この油体への強い会合は、主要部では、これらの中央コアの親浦性に起因しているようである。従って、植物由来物質から組換えタンパク質を分離する方法を提供することによって、オレオシンのような油体タンパク質が、組換えタンパク質の製造において有用でありうるかどうかを決定することに、興味がもたれる。

関連文献植物中での外来（組換え）ペプチドの生産は、種々のアプローチを利用して実験されてきており、強い構成性植物プロモーター〔例えば、カリフラワーモザイクウィルスからの一一シイモンス（Ｓｉｊｍｏｎｓ　）等、１９９０年、ｒＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ。

ｇｙＪ８　：　２１７〜２２１頁〕および外来タンパク質の暗号化を利用した転写融合：ｎ官特異的配列による転写融合〔ラドケ（Ｒａｄｋｅ　）等、１９８８年、ｒＴｈｅｏｒｅｔ、＾ｐｐ！、　Ｇｅｎｅｔ、、」７５　：　６８５〜６９４頁〕　；および続いて組換えタンパク質の開裂を必要とする転写融合〔ヴアンデル　ケルコープ（Ｖａｎｄｅｒ　Ｋｅｌｃｏｖｅ）等、１９８９年、ｒＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｌ　７　：　９２９〜９３２頁）が挙げられる。植物細胞中で形質発現されてきた外来タンパク質としては、細菌〔フレイリ−（Ｆｒａｌｅｙ）等、１９８３年、ｒＰｒｏｃ、　ＮａＬ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　８０：４８０３〜４８０７頁〕、動物〔ミスタ（Ｍｉｓｒａ　）およびゲダム（Ｇｅｄａｍｕ）　ｌ　’１１８９年、ｒＴｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　ＧｅｎｅＬ、　Ｊ　７８　：　１６１〜１６　Ｂ頁〕、菌類および他の植物種〔フレイリー（Ｆｒａｌｅｙ）等、１９８３年、ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔ”　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　Ｊ　８０　：　４　ｇ　０３〜４８０７頁〕からの活性タンパク質が挙げられる。

幾つかのタンパク質は、通常は組み込みの標識は、組織特異的な方法で形質発現してきており、種子中で幾つか挙げられる〔セン　グプターゴパラン（Ｓｅｎ　Ｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ　）等、１９８５年、ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　Ｊ　８２　：　３３２０〜３３２４頁、ラドケ（Ｒａｄｋｅ　）等、１９８８年、ｒＴｂｅｏｒｅ、Ａｐｐｌ、　ＧｅｎｅＬ、、　Ｊ７５：６Ｂ５〜６９４頁〕。これらの報告文は、種子貯蔵タンパク質プロモーターを、種子特異的形質発現を駆動する手段として使用することに、特に集中している。こうした装置を使用して、ヴアンデルケルコーブ（ＶａｎｄｅｒＫｅｌｃｏｖｅ　）等は、１９８９年ｒ［１ｉｏ／Ｔｅｃｌ＋ｎｏｌｏｇｙＪ　７　：　９２０〜９３２頁において、「＾ｌ’ａｂｉｄｏｐｓｉｓＬｈａｌｉａｎａＪおよびｒ［１ｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ」の種子中に高価値ペプチド（Ｉｅｕ−エンケファリン）を形質発現した。このペプチドの収率は極めて低いが、しかし植物組織内での動物ペプチドホルモンの形質発現の可能性を示している。

トウモロコシオレオジンが、トウモロコシオレオジン遺伝子によって形質転換されたｒＢｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓＪ中の種子油体中で、形質発現した。この遺伝子は、主要な種子貯蔵タンパク質であるナビンを暗号化する［叶ａｓｓｉｃａ」遺伝子からの調節因子の制御下に形質発現した。この形質発現の一時的な調節および組織特異性は、ナピン遺伝子のプロモーター／ターミネータ−に関して正しいことが報告された。リ−（Ｌｅｅ　）等ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｊ　（ＵＳＡ　）　１９９１年：８８：６１８１〜６１８５頁参照。

種子中で生成する浦球状体は、すべてが似た寸法であるようであり、これらが安定化されていることを示している（ファン（Ｉｌｕａｎｇ　）　Ａ、ｔｌ、　Ｃ，１９８５年、「植物分析の現代的方法：　Ｍｏｄｅｒｎ　＋ａｅＬｈｓ、　Ｐｌａｎｔ　ＡｎａｌｙＳｉｓＪ　１巻、１４５〜１５１頁、スブリンガーーベルラグ　ベルリン〕。もっと接近して検査すると、これらか単なる浦球状体ではなく、むしろ膜によって包囲された油体であることが発見された。これらの油体は、オレオソーム、脂質体およびスフエロソームと、顕微鏡学者によって種々に命名されてきた〔ガー（Ｇｕｒｒ）　Ｍｌ、　、　１９８０年、［植物の生化学：　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍｉｓＬｒｙ　ｏｆ　ＰＩａｎＬｓ　Ｊ　４　：　２０５−２４８頁、Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓｓオルランド　Ｆｌａ）。僅かな種の油体か研究されてきており、この一般的結論は、これらが普通ではない「ハーフユニット」膜によってカプセル化されており、「ハーフユニットＪ膜は古典的な脂質二層を備えておらず、むしろその内側上には疎水性基を有し、その外側には親水性基を汀する単一の両親媒性層を備えている〔ファン（ｌｌｕａｎｇ　）　Ａ、比　Ｃ１１９８５年、［植物分析の現代的方法：　Ｍｏｄｅｒｎ　ｉ＋ｅｔｈｓ、　Ｉ’１ａｎＬ＾ｎａｌｙｓｉｓＪ　１巻、１４５〜１５１頁、スプリンガーーベルラグ　ベルリン〕。

脂質体の内容物の分析が示すところでは、トリグリセライドおよび膜材料は別として、この油体の表面または内腔と会合した幾つかのポリペプチドまたはタンパク質もある〔ボウマンーヴ７ンス（Ｂｏｗｍａｎ−Ｖａｎｃｅ）およびファン、１９８７年、ｒＪ、　Ｒｉａｌ、　ＣＩ＋ｅｔＪ　２Ｃｉ２　：　ｌ　Ｉ　２７５〜１１２７９頁、マーフィー等、１９８９年、ｒＢｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、　Ｊ　２５８：Ｈ１５〜２９３頁、ティラー等、１９９０年、ｒＰＩａｎＬａＪ　Ｉ　８１　：　１８〜２６頁〕。油体タンパク質は、広い範囲の分類学的に分散した種の中で同定されてきており〔モロ−等、１９８０年、ｒＰＩａｎＬ　Ｐｈｙｓｉ。

１、Ｊ　６５：　１１７（ｉ　〜１１８０頁、キュー等、１９８６年、ｒＢｉｏｃｂｅｔ　Ｊ、　Ｊ　２３５・５７〜６５頁〕、油体中で独特に局在化していることが見いだされており、野菜組織のオルガホラ中では発見されていない。「叶ａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ」（なたね）においては、成長中の種子の油体と会合している少なくとも三種のポリペプチドがある〔ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）等、１９９０年、ｒｌ”１ａｎＬａＪ　Ｉ　８１　：　Ｉ　８〜２　Ｇ頁〕。

油体か会合したタンパク質の数と寸法とは、種から種へと変化しつる。例えば、コーンにおいては、油体中に二つの免疫学上区別されるポリペプラト族が見いだされる〔ボウマンーヴアンスおよびファン、１９８８年、ｒＪ、　Ｒｉａｌ、　ＣｈｅｔＪ　２６３：１４７Ｇ〜１４８１頁〕。オレオジンは交互に親水性、疎水性および親水性の領域を有していることが発見された〔ボウマンーヴアンスおよびファン、１９８７年、ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、Ｊ　２（ｉ２　：１１２７５〜１１２７９頁〕。コーン、なたねおよびニンジンからのすレオジンのアミノ酸配列か得られた。キューおよびファン、１９９０年、ｒＪ、口ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、Ｊ　２６５　：　２２３８〜２２４３頁、ハツォボウロス（ｌｌａｌｚｏｐｏｕｌｏｓ　）等、１９９０年、「植物細胞：ｐｌａｎＬ　Ｃｅ１ｌＪ　２　：４５７〜４６７頁をそれぞれ参照。なたねのような脂肪種子においては、オレオジンは、全種子タンパク質の８％［ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）等、１９９０年、ｒＰＩａｎＬａＪ　１８１　：１１１−２０頁〕〜２０％〔マーフィー等、１９８９年、ｒｌｌｉｏｃｂｅｍ。

Ｊ、Ｊ２５８：２８５〜２９３頁〕を含有していてよい。この水準は、多数の種子貯蔵植物において見られる水準に匹敵している。

油体タンパク質を暗号化する遺伝子は、トウモロコシ〔トウモロコシ：ボウマンーヴアンスおよびファン、１９８７年、ｒＪ、　［１ｉｏ１．　ＣＩ＋ｅｔＪ　２６２　：　１１２７５〜１１２７９頁；およびキューおよびファン、１９９０年、ｒＪ、　Ｂｌｏｌ、ＣｈｅＬＪ２６５：２２３８〜２２４３頁〕、およびニンジン〔ハツォボウロス等、１９９０年、［植物細胞：　ｐｌａｎＬ　Ｃｅ１ｌＪ　２　：　４５７〜４６７頁］の、二つの種について報告されてきた。

発明の要約宿主タンパク質から容易に精製できるペプチドを製造するための方法および組成物を提供する。この方法は、キメラＤＮＡ構成体を製造し、このキメラＤＮＡ構成体は、種子特異的油体タンパク質遺伝子の暗号配列を有する油体特異的配列を暗号化する配列を含んでおり、または少なくとも油体タンパク質の疎水性コアの部分を暗号化する配列を含んでおり、および目的とするペプチドの暗号配列であって、これからキメラＤＮＡ構成体を含有する形質発現カセットを製造できる暗号配列を含んでおり、ゲノム組み込み条件下でこの形質発現カセットによって宿主細胞を形質転換し；およびこうして得られたトランスジェニック植物を成長させて種子を生産し、この中で目的とするポリペプチドを、オレオジンを有する融合タンパク質として形質転換させる工程を有している。

目的とするポリペプチドは、種子細胞から油体を分離し、この油体を破壊してその融合タンパク質を放出させることによって、精製することができる。次いで、この油体タンパク質は、層分離によって、他のタンパク質および植物由来物質から容易に分離される。必要に応じて、開裂部位を、目的とするポリペプチドのＮ −末端に先立っておよびＣ−末端の後ろの少なくとも−が所に位置させて、この融合ポリペプチドを開裂させて層分離によってその成分ペプチドへと分離することができる。従って、この製造装置は、キメラペプチドの油体タンパク質に対する油体タンパク質機能性によって、このキメラペプチドの標的化をもたらし、これがまた、目的とするポリペプチドの急速な精製を可能とする。この製造装置は、薬剤、酵素、流動特性および接首特性を有するペプチドのような多数のペプチドの製造に、用途を見いだしている。

図面の簡単な説明図ＩＡは、「＾ｒａｂｉｄａｐｓｉｓ　Ｌｌ＋ａｌｉａｎａＪからの面体タンパク質遺伝子、（オレオジン）のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配列（１７ｋＤａのタンパク質）を示す。下線を引いたのは、ダイレクトリピート（Ｒ１およびＲ２）および逆行反ｔｌ　（Ｔ）　、ＣΔＣΔ、Ｔ　Ａ　’ｒΔ、ＴＡΔＴおよびポリアデニル化信号である。イントロン配列を小文字活字で示し、推定したＡＩＩＡ−結合部位を肉太活字で示す。

図ＩＩ３は、にんじんからの１６ｋｔＪの油体タンパク質、トウモロコシからの１８ｋｄおよび１６ｋｄの油体タンパク質およびｒＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｌｔ＋ａｌｉａｎａ」からの１７ｋｄの油体タンパク質の配列の比較を示しており、このタンパク質の保存および分岐領域を示す；このアミノ酸配列は、このタンパク質の中央領域の配列の保存を示すように配列されている。

１２１２は、外来ペプチドを暗号化する遺伝子による油体タンパク質遺伝子の融合のために使用する構成体を示す。ＩＡは、Ｏ［３Ｐに対する所望のペプチドのＣ−末端融合である。ＩＢは、ＯＢＦに対する所望のペプチドのＮ−末端融合である一■目ｔ、ｏｎｐ内での所望のペプチドの内部融合である；およびＩｌｌは、二つの実質的に完全な油体タンパク質標的配列の間に包含された所望のペプチドの二量体間転写融合である。図（Ａ）の上部には、油体タンパク質への所望のペプチドの転写融合のために使用するＤＮＡ構成体を示す。図（Ｂ）の下部には、遺伝子産物の配置を示しており、この油体への翻訳および運搬の上部上に示されている。この図への鍵は、次の通りである。左側か底であって右側が上方であるハンチングが施されたボックスは、ＯＢＰプロモーターまたは他の種子特異的プロモーターを示しており；右側か底であって左側が上方であるハツチングか施されたボックスは、所望のペプチド暗号配列を示し；空白のボックスは、油体タンパク質暗号配列、またはＯＢＰ保仔モチーフに基づいた合成標的配列を示し；！！！直および水平にハツチングされたボックスは、ポリアデニル化信号を含む遺伝子ターミネータ−を示し；ハツチングされた円は、プロテアーゼ認識モチーフを示し、ラセン状の線は、ＯＢＰの天然Ｃ−またはＮ−末端を示す。

図３は、Ｃ−末端融合の構成体についての詳細な配置を示す。示しであるこの配置は、典型的な油体タンパク質遺伝子および融合ペプチドの融合のリンカ−としての、コラゲナーゼ認識モチーフ暗号配列であり、植物中でのクローニングおよび形質転換のために、ここではＮｃｏｌを使用して連鎖されている。

図４は、融合ペプチドベクターの構成、これらの植物中への導入および続く抽出と所望の組換えペプチドの測定の方法を図式的に示している。

図５は、ｐｃＧＯＢＰＩＬＴの構成の概略図を示す。破線のボックスは、オレオノンプロモーターを示し、左側が上方で右側が底のハツチングが施されたボックスは、オレオジン暗号配列を示し；水平および垂直のハツチングが施されたボックスはイントロンを示し；点描されたボックスは３°非非翻訳列を示し；左側が上方で右側が底の、間隔が広いハツチングが施されたボックスは、プロテアーゼ開裂部位を暗号化する配列を備えたインターロイキンｌ−β配列を示す（直接の上流で因子Ｘａまたはトロンビン）。

図６は、オリゴヌクレオチドＧＶＲＩＩのデザインを示す。図３Ａにおいて示されるｒＡ、　Ｌｌ＋ａｌｉａｎａＪオレオジンの３°暗号配列は、因子Ｘａ／ＩＬ−１−β暗号配列に対して翻訳融合され、ＴＡＡ停止コドンが続く。将来のクローニング目的のためには、Ｐｖｕ　Ｉおよび５ａｌｌ制限酵素認識部位が含まれる。ＰｖｕＩ制限部位の生成によって、アラニン（ａ　Ｉ　ａ）のための更なる暗号配列がもたらされる。下線を引いたのは、この制限酵素認識部位である。

上線を引いたのは、このｒ　Ａ、　ＬｈａｌｉａｎａＪオレオジン配列および因子ＸａｔＲ識配列である。この実際の開裂部位は、アスタリスク（★）で示す。

図３Ｂにおいては、ＧＶＲＩＩの配列を示す。ｒＡ、　ｔｈａｌｉａｎａ」オレオジンと融合させるためには、このプライマーＧＶＲＩＩは、このトップ鎖に対して相補的な配列である必要がある。

図７は、０ＢＰＩＬＴのヌクレオチド配列を示す。下線を引いたのは、ＩＬ−１ −βを暗号化する配列である：因子Ｘａ認識部位を暗号化する配列は、肉太文字で示す。ノパリンンンターゼターミネーター配列は、小文字活字で示す。

特定の態様の説明本発明に従って、容易に精製されるペプチドを製造するための方法および組成物を逼供する。本方法は、オレオジンのような油体特異的配列の相当部分を暗号化するＤＮＡ配列を含む形質発現カセットを製造して、油体および目的すとるペプチドへの標的化をもたらし、この形質発現力セントを植物細胞宿主中へと形質転換しニドランスジェニック植物を発生させ、これを成長させて種子を生産させ、これからキメラタンパク質を形質発現させ、油体へと輸送する、各工程を有している。このキメラペプチドは、目的とするペプチドと、オレオジンのような油体タンパク質とを含有している。この目的とするペプチドは、一般的には、通常種子中で形質発現されないかまたは油体上に見いだされない外来ペプチドである。

担体または標的手段として油体タンパク質を使用することによって、この外来タンパク質の精製を得る単純な方法を得ることができる。このキメラタンパク質は、細胞タンパク質のバルクか呟　（遠心分離または浮上法のような）一工程で分離される；また、この分離も、この油体との接触から非特異的プロテアーゼを除去するので、このタンパク質は、抽出の間劣化から保護される。外来ペプチドを暗号化するこの遺伝子は、植物、細菌、菌類または動物源を含むあらゆる源に由来していてよい。望ましくは、このキメラペプチドは、オレオジンからの目的のペプチドの開裂を可能とする配列を含有しているであろう。本方法は、種々のペプチドを形質発現させるのに使用することができ、これは次に容易に精製される。

外来性の組換えタンパク質を油体へと標的化することで、次のものを含んで、幾つかの利益が得られる。このタンパク質は、細胞内容物のノくルクから、遠心分離による細胞溶菌の後に、分離することができる。この油体のフラクションは、この抽出物の表面上に浮上するであろう。このタンパク質には、必要に応じて、プロテアーゼ認識部位を含有するペプチドリンカ−を備えることができる。これによって、この油体からのペプチドの放出が可能となる。このタンパク質は、これが親油性保存領域内にあるようにして、組換えポリペプチド中へと導入することができる。これによって、この組換えペプチドの油体中へのインターナリゼーンジンがもたらされ、従ってこれをプロテアーゼの攻撃から保護する。

この形質発現カセットは、一般的には、その転写の５°−３゛方向中に、油体タンパク質と関連するプロモーターおよび上流領域によって代表されるような、成長中の種子中での形質発現を可能とする転写および翻訳調節領域を含むであろうし、これが、種子中でのキメラタンパク質、油体標的化手段および目的のタンパク質をもたらすアミノ酸配列を含有するキメラタンパク質を暗号化するＤＮＡ配列、および植物中で機能する転写および翻訳終結領域の、形質発現をもたらすであろう。また、一種以上のイントロンも存在していてよい。

この油体特異的抗体には、油体タンパク質、特にオレオジンのフラグメントに、アナロジ−が見いだされる。この油体特異的配列は、油体タンパク質から得ることができる配列のものと同じであってよく、これは目的のタンパク質の油体への所望の標的化をもたらすのに十分な相同性を有している。「得ることができる」によって、意図しているのは、所望の標的化をもたらす天然の油体タンパク質アミノ酸配列に十分に類似したアミノ酸配列であり、天然、合成またはその組み合わせであってよい。特に興味深いのは、異なる植物種の間で高度に保存されているように見える油体タンパク質の中央疎水性領域、その７ラグメントおよびそのアミノ酸レベルでの相同配列である。

ｒＡｒａｂｉｄｏＩ］ｓｉｓ　ＬｈａｌｉａｎａＪの油体タンパク質に対して推定されたアミノ酸配列は、次の通りである。

Ｍ−Ｎ−Ｇ−Ｒ−Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｑ−Ｙ−Ｑ−Ｍ−３−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｄ−Ｙ− ３−に−Ｓ−Ｒ−Ｑ−１−Ａ−に−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−３− Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−Ｌ−５−Ｌ−Ｔ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−１−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ− Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−１−３−３−Ｔ−１−Ｌ−Ｖ−Ｔ−Ａ−Ｌ−１−Ｔ− Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｌ−１−Ｔ−Ｇ−３−Ｄｏ　１００し−５−５−Ｇ−Ｇ−Ｆ−Ｇ−１−Ａ−Ａ−１−Ｔ−Ｖ−Ｆ−５−Ｗ−１−Ｙ− Ｋ　＊−Ｙ−Ｌ−Ｌ−１−Ｅ−トＰ−Ｑ−Ｇ−３−Ｄ−に−Ｌ−Ｄ−３−Ａ−Ｒ −Ｍ−にルー６−Ｓ−に−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｌ−に−Ｄ−Ｒ−＾−Ｑ−Ｙ−Ｙ−Ｇ− Ｑ−Ｑ−１１−Ｔ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−１１−Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｒ−Ｔ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｑ− １１−Ｔ−Ｔ約２５〜１０１までのアミノ酸は、中央疎水性領域を有する。

幾つかの用途のための標的化手段として特に興味深いのは、油体への標的化をもたらす次式の油体特異的配列またはそのフラグメントである：１）Ｉ）’　−ａａ”　’−ａａ’“−Ｖ−Ｖ−Ｔ−Ｌ−ａ　ａ”　−Ｐ　−ＡＡ　Ａ　Ｔａａ’　”　−Ｇ−Ｇ−ａａ”−Ｌ−Ｌ−ａａ”−Ｌ−ａａ”　−Ｇ−１−ａａ ”　’　−Ｌ−ａａ’　”　−ａａ”　’　−Ｔ−Ｌ−１−３Ｌ　５ＶＶａａ”−Ｌ−ａａ５３−Ｖ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−ａａｓＩ−Ｌ−Ｖ　ＶＬ−Ｆ−５−Ｐ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｌ−ａａ”　−＋　１　Ｌ＋ａａ”　−ａａ”−ａａ’“−ａａ”　−ａａ’　”　−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｇ　ＬＳ−３−ａ　ａ”　’　−Ｇ−Ｖ−ａ　ａ”　’　−ａ　ａ’　”　−Ｌ−８− Ｔ　Ｉ　ＩＴａａ’　”　ａａ”　−５−ａａ”　＠−ａａ”　’−ａａ・”−ａａミロ−ａａｌ　０６−ａａｌ　０１　、ｐｌここで：ｐｐｌおよびｐｐｌは、同じであるかまたは異なっており、天然の油体タンパク質とは同じであっても異なっていても良く、通常は異なっており；これらは水素であってよく、表示したポリペプチドの末端部分を示しており、または合計で最大ｌ０００のアミノ酸、もつと通常は最大的５００のアミノ酸を有するポリペプチドであってよく、合計で僅か１個のアミノ酸を有していてよく、または独立してまたは分離して、１−１００のアミノ酸、もつと通常は１〜７５のアミノ酸、更に特定的には５〜５０のアミノ酸からなるポリペプチドであってよい；これらのポリペプチドは、特定目的のために特異的に記述された配列を修飾するという特定の用途を有するであろう：ａ　ａ　Ｒ％は、いかなるアミノ酸であってもよく、一般的には３〜６個の炭素原子を有する中性の脂肪族アミノ酸であってよく、更に特定的にはロイシンまたはアラニンであってよい；ａ　ａ　２　＠は、中性の脂肪族アミノ酸であり、特にはアラニンまたは３〜４個の炭素原子を有する水素置換アミノ酸であり、特にはスレオニンまたは５〜６個の炭素原子ををする塩基性アミノ酸であり、特にはりジンである；ａ　ａ　２１は、３〜６個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり、持にはアラニン、バリン、ロイシンまたは芳香族非置換アミノ酸であり、特にはフェニルアラニンである：ａａ１′は、３〜６個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり、特にはアラニン、バリンまたはロイシンまたは酸素置換脂肪族アミノ酸であり、特にはスレオニンである；ａ　ａ　１　ｍは、３〜５個の炭素原子を有する中性の脂肪族非置換アミノ酸であり、特にはロイシンまたは３〜４個の炭素原子を有する中性の脂肪族酸素置換アミノ酸であり、特にはスレオニンまたはセリンである；ａａｌ７は、中性の非置換アミノ酸であり、特にはロイシンまたは硫黄置換アミノ酸であり、特にはメチオニンである；ａａｓｏは、中性の脂肪族非置換アミノ酸であり、特にはバリンまたは芳香族非置換アミノ酸であり、特にはフェニルアラニンである；ａａ’ は、中性の脂肪族非置換または酸素置換アミノ酸であり、特にはアラニン、ロイシンまたはセリンである；ａａｌ４は、中性の脂肪族非置換または酸素置換アミノ酸であり、特にはアラニン、イソロイシンまたはスレオニンである：ａａ″０は、中性の脂肪族非置換アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり、特にはアラニン、バリンまたはスレオニンである；ａ　ａ　１７は、中性の脂肪族非置換アミノ酸であり、特にはグリシンまたはアラニンである；ａ　ａ　＠　ｌは、中性の脂肪族または芳香族非置換アミノ酸であり、特にはロイシンまたはフェニルアラニンである；ａ　ａ　１　ｍは、中性の脂肪族非置換または硫黄置換アミノ酸であり、特にはアラニン、ロイシンまたはメチオニンである；ａ　ａ　１１は、中性の脂肪族非置換アミノ酸であり、特にはアラニンであり、または中性の硫黄または酸素置換を有する脂肪族アミノ酸であり、特にはメチオニンまたはスレオニンである。

ａ　ａ　ｌ　ｍは、中性の脂肪族の非置換または酸素置換アミノ酸であり、特にはグリシン、セリンまたはスレオニンである。

ａａ１２は、酸素置換を有する中性の脂肪族アミノ酸であり、特にはセリンまたはスレオニンである；ａ　ａ　ｌ　ａは、中性の脂肪族硫黄置換アミノ酸または中性の芳香族複素環アミノ酸であり、特にはトリプトファンである：ａ　ａ　ｌ　７は、中性の脂肪族の非置換または硫黄置換アミノ酸であり、特にはバリン、ロイシン、イソロイシンまたはメチオニンである；ａ　ａ　Ｉ　ｌは、中性の非置換脂肪族アミノ酸または芳香族酸素置換アミノ酸であり、特にはアラニン、ロイシンまたはチロシンである；ａ　ａ　Ｉ　＊は、いかなるアミノ酸であってもよい：ａａＩ＠＠は、酸素置換アミノ酸であり、脂肪族または芳香族であり、特にはチロシンまたはスレオニンである；ａａｌ　＠　ｌは、中性の非置換の脂肪族または芳香族アミノ酸であり、特にはアラニン、ロイシンまたはフェニルアラニンである。

油体タンパク質への標的化をもたらしつる配列を暗号化するＤＮＡの源として特に興味深いのは、「＾ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＪまたはｒＢｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ」から得ることができる油体タンパク質遺伝子であり、これは種子中で目的のタンパク質の形質発現をもたらす〔ティラー等１９９０年ｒＰＩａ＋＋ｔａＪ　１８１　：　１８〜２　Ｇ頁参照〕。

この油体の標的化能力をもたらすのに必要な領域およびアミノ酸配列は、油体タンパク質の高度に疎水性の中央領域であるように見える。

所望の特性を有する他の油体タンパク質を同定するためには、油体タンパク質が分離されたかまたは分離されているときには、このタンパク質は部分的に配列決定されていてよく、これによってｍ　ＲＮ　八を同定するためにプローブをデザインすることができる。こうしたプローブは、植物の異なる種の間で高度に保存されている中央疎水性領域の暗号領域を標的化するようにプローブがデザインされているときには、特に価値がある。この結果、この領域用のＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、他の植物種から油体タンパク質の暗号配列を同定するのに、特に有用でありうる。ｍＲＮＡの１度を更に高めるためには、ｃＤＮＡを生産することかでき、このｃＤＮＡは、非油体生産細胞からｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが差し引かれている。次いで、この残留したｃＤＮＡは、植物細胞から調製した適当なライブラリーを使用して、相補的配列のゲノムをプロービングするのに使用することができる。次いで、緊縮条件下にこのｃＤＮＡとハイブリッド形成する配列を分離することができる。

ある場合には、上記したように、油体タンパク質遺伝子プローブ（保γｒ領域）を使用して、プローブを採用することによって、直接にｃＤＮＡゲノムライブラリーをスクリーニングし、このプローブにハイブリッド形成する配列を同定することができる。また、この分離を、種子特異的ｃＤＮＡ形質発現ライブラリーのｌｆＡ準免疫学的スクリーニング技術によって実施することができる。ティラー等１９９０年ｒＰＩａｎＬａＪｌ　８１　：　１８〜２Ｇ頁に記載された精製手順および抗体調製プロトコルを使用して、油体タンパク質のための抗体を容易に得ることができる。

抗体を使用したｃＤＮＡ形質発現ライブラリースクリーニングを、実質的にヒュン（Ｉｌｕｙｎｂ　）等［１０８５年、ＩＤＮΔクローニング」第１巻、「実際的アプローチ：　ｐｒａｃＬｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｌｕ　Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　、　ＩＲＬプレス、第４９〜７８頁）〕の技術を使用して、実施する。配列の確認は、中央疎水性領域内に見られる高度の保存性によって、容易にすることができる（図１参照）。サンガー等（ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｐ’１、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾Ｊ　１９７７年、７４　：５４６３〜５４ｔ３７頁〕またはマクサムおよびギルバート［１９８０年、ｒＭｅＬＩ＋、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　Ｊ　１９８０年６５：４９７〜５６０頁〕の方法によるＤＮＡ配列決定を、すべての推定されるクローンおよび実施する相同性の調査のために、実施することができる。この中央疎水性領域を暗号化する配列の相同性は、異なる種の間でアミノ酸レベルおよびヌクレオチドレベルの双方で、通常７０％以上である。もし抗体が入手可能であれば、配列の同定の確認も、サムプルツク等［ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　１９９０年、第２版、コールド　スプリング　ハーバ−プレス　第８〜４９から８〜５１頁〕に記載されたように、種子ｍＲＮＡ調製からのハイブリッド選択および開成実験によって実施することができる。

種子から製造したｃＤＮＡクローンは、あらゆる入手可能な油体タンパク質遺伝子の保存された暗号領域から製造したｃＤＮＡプローブを使用して、スクリーニングできる〔例えば、ボウマンーヴアンスおよびファン、ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｃ閣、」１９８７年、２６２：１１２７５〜１１２７９頁〕。幼植物のｃＤＮＡに比較して、種子ＤＮＡと一層強いハイブリッド形成を有するクローンを選択する。このスクリーニングを繰り返して、直接抗体スクリーニングまたはＩ＼イブリッド選択および翻シ＜を使用して、成長中の種子の油体と会合している特定のｃＤＮＡを同定する。この特異的ｃＤＮΔに相補的な＋ｎ　ＲＮ　Ａは、試験する他の組織には存在していない。次いで、このｃＤＮＡを使用して、主題のｃＤＮＡとハイブリッド形成する、選択されたゲノムライブラリーおよびフラグメントをスクリーニングする。

種子中でこのキメラ遺伝子の形質発現を得るためには、種子中で優先的に形質発現したあらゆる遺伝子から得られる翻訳開始およびリポソームに対してｍＲＮＡを結合させることを担っている、非翻訳５°配列の転写開始調節領域および翻訳開始調節領域、［リポソーム結合部位」を、使用することができる。こうした遺伝子の例としては、ナピンからのような種子貯蔵タンパク質が挙げられる〔ジョセフソン等ｒＪ、旧ｏｆ、　Ｃｂｃｔ　Ｊ　１９８７年、２６２：１２１９６〜１２２０１頁；スコーフィールドＳ、Ｒ，およびクローチＭ、Ｌ、ｒＪ、　［１ｉｏ１．　ＣＩ＋ｅｓｉ、」１９８７年２６２　：１２２０２〜１２２０８頁〕。好ましくは、この領域を、油体タンパク質から得ることができる〔「＾ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｊ　、にんじん〔ハツオポウロス等、前出〕またはトウモロコシ〔ファン等、１９８７年および１９９０年、前出〕からの油体タンパク質から得ることができる。この領域は、一般的には、この構造遺伝子暗号配列の５°から翻訳開始まで少なくとも１ｏｏｂｐを有しており、５°からこれと同じ翻訳開始まで最大２．５Ｋｂを有している。この開始調節領域の転写および翻訳機能要素のすべてが、これと同じ遺伝子に由来しているか、またはこれと同じ遺伝子から「得ることができる」ことが好ましい。［得ることができるＪによって、意図しているのは、このキメラタンパク質を暗号化するＤＮＡ配列の転写に所望の特異性をもたらすのに十分に、天然配列のものに類似したＤＮＡ配列である。これは、天然のおよび合成の配列を含んでおり、合成および天然の配列の組み合わせであってよい。

この転写レベルは、修飾された種子をもたらしうるＲＮＡの量を提供するのに十分でなければならない。「修飾された種子Ｊによって意味しているのは、同じ種の形質転換されていない植物の種子から検出可能な異なるフェノタイプを有する種子であり、例えば、問題の形質発現カセットをそのゲノム中に有していないものである。フェノタイプの種々の変更は興味深い。これらの変更としては、油体タンパク質の過形質発現または得られたキメラタンパク質の油体上または細胞質中でのＯＢＰの蓄積が挙げられる。

目的のポリペプチドは、いかなるタンパク質であってもよく、例えば、酵素、抗凝固剤、神経ペプチド、ホルモン、または粘着前駆体が挙げられる。タンパク質の例としては、インターロイキン−１−β、抗凝固剤ヒルジン、酵素β−グルコａニダーゼまたは免疫グロブリンのＶＬＩまたはＶＬＭの転写融合を有する単鎖抗体が挙げられる。目的のポリペプチドを暗号化するこのＤＮＡ配列は、合成、天然に由来するもの、またはこれらの組み合わせであってよい。目的のポリペプチドを暗号化するＤＮＡの性質または源によっては、植物優先コドンによってＤＮＡ配列を合成することが望ましいであろう。この植物優先コドンは、宿主細胞として目的の特定の植物種中で最大の鳳で形質発現したタンパク質中の最も高い頻度のコドンから決定することができる。

採用する終結領域は、多くの場合に終結領域が相対的に交換可能なように見えるので、主として便利なものでありうる。この終結領域は、この転写開始領域と共に天然であってよく、目的のポリペプチドを暗号化するＤＮＡと共に天然であってよく、または他の源に由来していてよい。便利な終結領域は、オクトビンシンターゼまたはツバリンシンターゼ終結領域のような、ｒＡ、　Ｌｕｍｅｒａｃｔｅｎｓ　ＪのＴｉプラスミドから入手することができる。

目的のペプチドを暗号化する遺伝子に対する、標的配列を暗号化するＤＮＡ配列の結合は、末端融合、内部融合、および重合融合を含む種々の方法で生じつる。

すべての場合において、この融合は、油体タンパク質の読み取り枠を阻害しないよう、およびこのジャンクンタンの中または近くでいかなる開成停止信号をも避けるようにして、なされる。異なる種類の末端および内部融合を、これらのインビボの配置の表示と共に、図２に示す。

記載したすべての場合において、このペプチドを暗号化する遺伝子の結合は、好ましくは、プロテアーゼ標的モチーフを暗号化するリンカ−を含むであろう。

これによって、いったんは融合タンパク質として抽出されたペプチドの放出が可能となる。採用しうる可能な開裂部位は、トロンビンの認識モチーフ（Ｉｅｕ− ｖａｌ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｇｌｙ）［フジカワ等、ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙＪ　１９７２年、１１：４８９２−４８９９頁〕、因子Ｘａ　（ｐｈｅ−ｇｌｕ −ｇｌｙ−ａｒｇ−ａａ、）Ｃナガイ等、ｒＰｒｏｃ、　ＮａＬ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　１９８５年、８２ニア２５２−７２５５頁〕またはコラゲナーゼ（ｐｒｏ−１ｅｕ−ｇｌｙ　ｐｒｏ）［ショルティセク（ＳｃｂｏｌＬｉｓｓｅｋ　）およびグロスＣＧｒａｓｓｅ）ｒＧｅｎｅＪ　：　１９８８年、６２　：　５５−６４頁〕のものである。

オーバーハング（張出部）内に制限、チューイングパックまたは充填のような適当な操作によって、太い末端を設けること、リンカ−の結合等することによりて、このフラグメントの相捕的末端を、接合および結合のために設けることができる。これらの種々の工程を実施する際には、クローニングを採用することで、ＤＮＡの量を増幅し、このＤＮＡの分析を可能としてこれらの操作が適当な状態で生じたことを確証することができる。広範なりローニングベクターを採用ずことができ、ここでこのクローニングベクターとしては、ｒＥ、ｃｏｌｉＪ中で作用する復製系と、形質転換細胞の選択を可能とする標識とが挙げられる。ベクターを例示すると、ｐＢＲ３３２、ｐＵｃ系列、Ｍ１３ｍｐ系列、ｐＡＣＹＣｌ　８４等が挙げられる。従って、この配列は、適当な制限部位でベクター中へと挿入することができ、こうして＋１られたプラスミドを使用してｒＥ、ｃｏｌｉＪ宿主を形質転換させ、このｒＥ、ｃｏｌｉＪを適当な栄養培地中で成長させ、この細胞を回収および溶菌し、このプラスミドを回収する。分析としては、配列の分析、制限分析、電気泳動等を挙げることができる。各操作の後に、この最終の構成体中で使用されるＤＮＡ配列を、制限して次の配列に接合させることができ、ここで部分構成体の各々を、同じまたは異なるプラスミド中でクローニングすることができる。

植物宿主細胞中へとＤＮＡを導入するために、種々の技術を採用できる。例えば、キメラＤＮＡ構成体は、タバコのような双子葉植物およびｒＢｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ」のような油性植物から得られた宿主細胞中へと、〔モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ　）等ｒＰｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、　Ｊ　１０００年８二２３Ｂ−２４２頁コまたは〔ヒンチ等Ｉｎｔｏ　／Ｔｅｃｌ＋ｎｏ１．　Ｊ１９８８年、６・９１５−９２２頁〕に記載されたもの、または本分野に習熟した物に既知の他の技術のような、形質転換プロトコルによる標準アグロバクテリウムベクターを使用して、導入することができる。例えば、植物細胞の形質転換に対してＴ−ＤＮＡを使用することは、集中的に研究がなされており、ＥＰＡシリアルナンバー１２０，５１０号；ホエケ？　（ｌＩｏｅｋｃ＋ｉｅ　）　：バイナリー植物ベクター系オフセット−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ　ＫａｎＬｅｒｓ口、ｖ、アルブラツミｌヤーダム（八ｒｂｌａｓｓｅｒｄａＩＩ）　１９８５年、第５章：Ｋｎａｕｆ等、「アグロバクテリウムによる宿主領域形質転換の遺伝的分析：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　１ｌｏｓＬ　ｒａｎｇｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　Ａｇｒｏｌ＋ａｃＬ■窒奄普|Ｊ：　［細菌の分子遺伝学：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　［１ａｃＬｅｒｉａＪ　ｒ植物の相互作用：　Ｐｌａｎｔ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ｊプーラ−（Ｐｕｈｌｅｒ）　Ａ、版、シュブリンガーーバーラグ、ニューヨーク州、１９８３年、第２４５頁およびアン（Ａｎ）等ｒＥＭＢ。

Ｊ、Ｊ１９８５年４　：　２７７〜２８４頁に詳細に記載されている。便宜上は、組織片をＡ、ツメファシェンスまたはＡ、リゾジェネスと共に培養することによって、植物細胞への転写構成体の転移可能とすることができる。アグロバクテリウムを使用した形質転換に続いて、この植物細胞を、選択のために適当な選択培地中で分散させ、カルスへと成長させ、苗条を成長させ、根付き培地中で成長させることによって、カルスから小植物を再生させる。このアグロバクテリウム宿主は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への転移に必要なりｉｒ遺伝子を有するプラスミドを含有することができ、Ｔ−ＤＮＡを有していてもよく、いなくともよい。注入およびエレクトロポレーションのためには、（下記を参照）非武装Ｔｉプラスミド（その腫瘍遺伝子、特にそのＴ−ＤＮＡ領域が欠けている。）をこの植物細胞中へと導入することができる。

非アグロバクテリウム技術を採用することによって、本明細書に記載した構成体を使用して、広範な双子葉および単子葉植物中で形質発現および形質転換させることが可能となる。これらの技術は、アグロバクテリウム形質転換系中では取扱にくい種に対して、特に有用である。遺伝子を転移させるための他の技術としては、バイオリスティクス（ＢｉｏｌｉｓＬｉｃｓ）　（サンフォードｒＴｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｌｔ　Ｊ１９８８年、６：２９９〜３０２頁〕、エレクトロポレーション〔フロム等ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　１９８５年、８２：５８２４−５８２８頁〕　〔リノグスおよびベイツｒＰｒｏｃ、　ＮａＬ’１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　Ｊ　１９８６年、８３：５６０２−５６０６頁〕またはＰＥＧ−媒介ＤＮＡ摂取〔ボトリクス（ＰｏＬｒｙｋｕｓ）等ｒＭｏ１．　［；ｅｎ、　ＧｅｎｅＬ、Ｊ　１９Ｆｉ５年、１９９：　１６９−１７７頁］が挙げられる。

宿主細胞としては、多数の種子保持植物のいずれからの細胞も使用することができ、ここでこの細胞は、茎、葉、根、または種子またはこの種子による再生構造体のような、植物の一部分に由来している。この細胞は、分離された細胞または植物の一部分であってよく、例えば、リーフディスクであってよい。ｒＢｒａｓｓｉＣａ　ｎａ９ｕｓＪに対するような、特定の用途においては、この宿主細胞は、一般的には、〔モロニー等ｒＰｌａｎＬ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、　Ｊ　１９８９年８：２３Ｂ−２４２頁］に記載された子葉柄に由来することができる。商業的な脂肪種子を使用する他の例としては、大豆植物片における子葉形質転換〔ヒンチ等ｒ［ＩｉｏＬｅｃｂｎｏｌｏｇｙ　Ｊ　１９８８年、６：９１５−９２２頁〕および綿の茎の形質転換〔アンベック等ｒＢｉｏＬｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｊ　１９８１年、５：２６３〜２Ｇ６頁〕が挙げられる形質転換に続いて、この細胞を、例えば、リーフディスクとして、選択培地中で成長させる。いったん苗条が現れ始めると、これらを切開して根付き培地上へと配置する。十分な苗条が形成された後、これらの植物を土壌へと移す。次いで、推定された形質転換植物について、標識の存在下に試験する。適当なプローブ、例えばＡ、ｒＬｈａｌｉａｎａＪ遺伝子を使用して、サザンブロツティングをゲノムＤＮＡ上で実施して、宿主細胞ゲノム中への１１望の配列の組み込みが生ずることを示す。

この形質転換カセットは、通常は、植物細胞中で選択用の標識へと接合されるあろう。便宜上は、この標識は、除草剤、カナマインシ、Ｇ４１８、プレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール等のような、特に抗生物質に対して抵抗性であってよい。この採用した特定の標識は、導入されたＤＮＡを欠いた細胞に対して、形質転換された細胞の選択を可能とするであろうものであってよい。

上記したように構成された形質発現カセット中の融合ペプチドは、成長中の種子中で少な（とも優先的に形質発現する。従って、通常の方法に従って成長する形質転換植物は、種子を定着させる。例えば、〔マコーミック等ｒｌ’１ａｎＬ　ｃｅｌｌ　ＲｅｐｏｒｔｓＪ　ｌ　９８６年、５：８１〜８４頁〕参照。種子胚のような、転写が生ずるものと予期される組織から分離されたＲＮＡと共に、適当な遺伝子プローブを使用して、ノザンブロツティングを実施することができる。次いで、この転写産物の寸法を、この融合タンパク質転写産物に対して予期される一１法と比較する。

次いで、ＩｄＪ体タンパク質を、この種子から分離し、分析を実施して、この融合ペプチドが形質転換したことを測定する。分析は、例えば、ＰＡＧＥでありうる。

この融合ペプチドを、この融合ペプチドのオレオジン部分に対する抗体を使用して、検出することができる。次いで、こうして得られた融合ペプチドの寸法を、この融合タンパク質について予期された一ｊ法と、比較することができる。

二世代以上のトランスジェニック植物を成長させ、これと同じ形質発現株で受粉するかまたは異なる株で受粉して、こうして得られた所望のフェノタイプ特性を有するハイブリッドを同定し、この主題のフェノタイプ特性が安定して維持および受継されていることを確証し、次いで種子を収穫して目的のペプチドを分離し、または新しいフェノタイプ特性を存する種子を得るのに使用することができる。

水性の緩衝抽出培地、およびグラインディング、プレイキング、粉砕または種子細胞を粉砕する他の手段を使用することを含む、種々の技術によって、導入された形質に対して同種または異種の種子か呟所望のタンパク質を抽出することができる。次いで、こうして抽出された種子を、（例えば、遠心分離またはプレイの沈降法によって）３つのフラクションへと分離することができるコ沈ｊ１２または不溶性のベレット、水性の上澄み液、および種子貯蔵脂質および油体を含有する浮遊物ｒ浮きかす（ｓｃｕ＋ａ）　Ｊである。これらの油体は、天然の油体タンパク質と、キメラ油体タンパク質との双方を含有しており、この後者は外来性のペプチドを含有している。これらの油体を、水溶性タンパク質から分離し、水性緩衝液中に再懸濁する。

プロテアーゼ認識モチーフを含有しているリンカ−が、この形質発現カセット中に包含されている場合には、この再懸濁緩衝液へと、このリンカ−配列の翻訳によって生産されたこの認識モチーフに対して特異的なプロテアーゼを添加する。

これによって、必要なペプチドが、この水相中へと放出される。二度目の遠心分離工程によって、ここでこの処理された油体が、その付着タンパク質と共に再浮遊し、必要なペプチドの水溶液を残すであろう。この所望のペプチドは、その性質および所望の用途に従って、沈殿させるか、化学的に修飾するか、または凍結乾燥させることができる。

ある種の用途においては、この油体タンパク質からキメラタンパク質を除去することは、不要でありうる。こうした用途としては、この融合ペプチドが、Ｎ　− またはＣ−末端融合に対して寛容であってその活性を保持する酵素を含んでいる場合が挙げられるであろう；こうした酵素は、更なる開裂または精製なしに、使用する事ができる。このキメラ酵素ＯＢＰは、融合タンパク質として基質と接触しつる。もし望むならば、このＯＢＰに対する固定化高力価抗体を含有する免疫アフィニティーカラム（例えば、前出のＣティラー１９９０年〕を参照）を使用して、この酵素−〇ＢＰ融合タンパク質を精製することも可能である。

本発明についての他の用途は、次の通りである。ＯＢＰは高い百分率の全種子タンパク質を含有しており、従って、単に目的のアミノ酸に富んだ融合タンパク質を生産することによって、高リジン、高メチオニン等のように、種子のある所望の特性を富ませることが可能であり、特に有利な用途を見いだせるのは、ウシ、家禽を含む家畜類やヒトに対する食物源として直接にまたはＭｔｔｃ的に使用される穀粒または穀物の変更である。この融合タンパク質として、通常の脂肪種子の粉砕および抽出の際に、油またはあら粉を続いて処理するのを補助できる酵素を挙げることが可能であり、例えば、種子を処理するのに使用する上昇した粉砕温度で活性を保持するであろう、熱安定性の脂質修飾酵素を含有させることがあり、これによって抽出されたトリグリセライドまたはタンパク質製品にたいして価値を付加する。この融合タンパク質の他の用途としては、この作物のＭＭ学上の健全性を促進する用途が含まれる。例えば、殺虫性のタンパク質や、菌細胞壁または膜のような、耕種上の病害虫に対して特異的な免疫グロブリンの部分を、この油体タンパク質に対して結合させ、これによって特定の植物病害虫による種子への攻撃を減少させることができる。

次の例は、例示のために提供するものであり、限定のために提供するものではない。

！駿堡油体タンパク質による外来ペプチドの熱融合の形質発現Ａ、　Ｃ−末端融合５゛から転写開始まで少なくとも１００ｂｐを含有する油体タンパク質遺伝子のゲノムクローンを、適当な細菌宿主（例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ中のｐＵＣまたはｐＨＲ３２２）巾でｖｉ製が＋＋７能なプラスミドビヒクル中へとクローニングする。

制限部位は、遺伝子の親水性Ｃ−末端部分を暗号化する領域内に配置する。１９ｋＤａのＯＢＰにおいては、この領域は、典型的には、コドン１２５からこのクローンの末端へと延びている。この理想＄４１ｍ部位は単一であるが、しかし、これは絶対的には不可欠ではない。もし適当な制限部位がこの領域内に位置していない場合には、〔クンケル（にｕｎｋｅｌ）　ｒＰｒｏｃ、　ＮａＬ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳＡＪ］９Ｂ５年、８１４８８〜４９２頁〕の部位特異的突然変異方法に従って、導入することができる。この部位の導入についての唯一の主要な制限は、このＯＢＰクローンの５“から翻訳停止信号までに配置しなければならないことである。

適当なこの突然変異されたりａ−ンによって、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏまたはその多量体のような、プロテアーゼ認識部位についての暗号配列を含有する、合成オリゴヌクレオチドアダプターを生産することができる。これは、プロテアーゼ　コラゲナーゼに対するｗｍ部位である。このアダプターは；このＯＢＰクローンの３゛末端の制限部位に対して和合性の５′末端での４−塩基オーバーハング、外来ペプチド暗号配列に対する結合を容易にする、このアダプターのこの３゛末端の４−塩基オーバーハング、およびもし必要であれば更に塩基；を与えるような方法で合成でき、このＯｎＰ暗号配列、このプロテアーゼ認識部位および外来ペプチド暗号配列の間での転移にフレームシフトが無いことを確証する。こうした融合のための典型的な配置を、図３に示す。ここで示した例では、にんじんＯＢＰ〔ハツオボウロス等ｒｌ”１ａｎＬ　ｃｅｌｌＪ　Ｉ　９９０年、２：４５７〜４６７頁〕の停止コドンの近くに存在するＸｈｏ１部位を使用する。これを消化し、記載した二つのオリゴヌクレオチドから構成したアダプターと結合させることができる。このアダプターは、末端の完全なＸｈｏｌオーバーハングを形成するであろうし、この翻訳忰を阻害しないであろう。この他端は、任意に選択される（あらゆる六塩基カッターが十分である）が、しかし所望の外来ペプチドがらＡＴＧを包含するＮｃｏｌオーバーハングを形成している。

この最終の結合産物は、はぼ完全な０８Ｐ遺伝子、コラゲナーゼ認識もち−フに対する暗号配列および所望のペプチド暗号領域を、すべて単一の読み取り枠内にＤＨするであろう。この三部からなるフラグメントを、外来ＤＮＡを植物内へと転移させるのに広く使用されているような〔フレイリー等ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｐ ’　ｌ　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　１　’Ｊ　８３年、８０：４８０３〜４８０７頁〕、アグロバクテリウムバイナリ−プラスミド〔ベヴアン（［１ｅｖａｎ　）等ｒＮｕｃ１．＾ｃｉｄｌｌｅｓ、　Ｊ　１９Ｂ４年、１２：、８７１１〜８７２１頁〕中へとクローニングし、これを使用して【モロニー等ｒＰＩａｎｔ　ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ、　Ｊ　Ｉ　９８０年、８：２３８〜２４２頁〕の方法または類似の手順を使用して、なたねのような脂肪種子植物を形質転換する。トランスジェニック植物を、この形質転換実験から回収することができ、これらを成長させて開花させることができる。次いで、この植物は、自己受粉によって種子を結ぶ。

これらの種子を成熟に到達させ（６０〜８０日）、次いで収穫し、水性抽出緩衝液中で粉砕するＣティラー等、ｒＰＩａｎｔａノ１９９０年、１８１７１８〜２６頁〕。

このスラリーを５０００Ｘｇで２０分間遠心分離すると、表面浮きかすが得られるであろう。この浮きかすを再び回収し、コラゲナーゼ測定緩衝液中で激しく娠とうさせることによって懸濁させる〔ショルティセクおよびグロスｒＧｅｎｅＪ・１９８８年、６２：５５−６４頁〕。万単位のコラゲナーゼを添加し、この懸濁液を４時間振とうさせて培養する。この時間の経過後に、この懸濁液を再び５０００Ｘｇで２０分間遠心分離する。この表面浮きかすを除去し、この水相のタンパク質含有量を、５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル　電気泳動法によって分析する。はぼ必要とされるペプチドの寸法のバンドを見いだし、硫酸アンモニウムを使用してこのタンパク質を沈殿させ、限外濾過または凍結乾燥を使用して濃縮することができる。

Ｂ、　Ｎ−末端融合油体タンパク質の親水性のＮ−末端によって、このＮ−末端へのペプチドの融合を可能とする一方、この外来ペプチドが、この油体の外側表面上で保持されるであろうことを引き続いて保証する。この融合体の配置を、図２１Ｂに示す。

この配置は、Ｃ−末端融合に対して使用したのと類似の出発物質から構成することができるが、しかし油体タンパク質遺伝子の翻訳開始に近接した好都合な制限部位の同定が必要である。好都合な部位は、多くの油体タンパク質遺伝子中に、ちょうど５゛からこの最初のＡＴＧへの単一の塩基変化の導入によって、暗号配列のいかなる変化もなしに、生じさせることができる。このようにはるかに研究された油体タンパク質においては、この第二のアミノ酸は、そのコドンが「Ｇ」で始まるアラニンである。この配列の文脈を下に示す。

↓ ３°　・・・ＴＣＴＣＡ　ＡＣＡ　八ＴＧ　ＧＣＡ・・・にんじん０Ｉ３Ｐ３° 　・・・ＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＧＣＧ・・・トウモロコシ１８ｋＤａのＯＢＰこの「ΔＴＧＪに先立つアデニンでの一つの塩基変化は、双方の場合に、Ｎｃｏ１部位である・・・ＣＣＡＴＧＧをもたらすであろう。従って、〔クンケルｒＰｒｏｃ、　Ｎａｐ’　ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　ｌ　９８５年、８２：４８８〜４９２頁〕の部位特異的突然変異プロトコルを使用したこの塩基の変更によって、この配列中の他のＮｃｏ１部位を推定することなく、使用のためにこのクローンを生産することができる。

この外来ペプチド用の暗号配列は、このＮｃｏ１部位中へのその直接の結合を可能とするであろう調製物を必要とじつる。これは、典型的には、部位特異的突然変異によって１つまたは２つの塩基を変更して（クンケル、１９８５年、前出）、ごの外来ペプチドの翻訳開始点の周囲でＮｃｏ　１部位を発生させることを必要とする。次いで、このペプチドを、標的の翻訳停止に近接して切断する第二の酵素とＮｃｏｌとを使用して、そのクローニングビヒクルから切開する。再び、上記した方法を使用して、第二の好都合な部位を、部位特異的突然変異によって導入することができる。キューおよびファン（１９９０年、前出）によって示唆されてきたように、このＮ−末端メチオニンは、インビボでタンパク質の処理の間に除去することができ、この直接の下流のアラニンはアシル化することができる。

この可能性を考慮すると、このタンパク質のＮ−末端にＭｅｔ−Ａ１ｇ配列を保持することが必要でありうる。これは、このへｌａコドンの中または後ろにあるこの暗号配列中へと適当な制限部位を導入するような、種々の戦略を適用することによって、容易に達成できる。例えば、部位特異的突然変異によって、この配列を、次のように修飾することができる。

３゛　・・・ＴＣＴＣＡ　八ＣＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＧΔＡ　ＣＧＡ　ＧＧＣＡＣＴ　ＴＡＴ　・・・がへと突然変異する。

一つのコドンのこの変化によって、この暗号配列中へとＳｐｈ　を部位が導入されるであろう。第二の変化は、突然変異の同じラウンドの間に導入されつるけれども、コドン６の２つの塩基を変換させて、ＧＧＣＧＣＣ，Ｎａ　ｒ　Ｉをもたらすであろう。次いで、この突然変異遺伝子を、ｓｐｈ　１およびＮａｒ１部位を用いて開放させて、３つのコドンを除去しつる方向性のクローニング切断を付与することができる。この部位中へと、配列ＣＡＴＧ・・・（Ｓｐｈｌと和合性）を有する３′オーバーハングと、この反対側の末端にあるＧＣ５’　オーバー／％ングとを含をするアダプターを導入することができる。このアダプターの正確な配列を、下に示ず：５ｐｈｌ　Ｎａｒｌｎ回このアダプターは、５ｐｈｌおよびＮａｒｌ制限部位の双方を再び生じさせ、これらは診断目的のために使用されるであろう。このＳｐｈ１部位は、ここでは、このプラスミドを開放させ、有用なペプチドについての配列を包含するＤＮＡフラグメントをインフレームクローニングするのに、使用することができる。次いで、クローニングの方向性は、このプラスミドのあらゆる非対称的に配置された部位およびＮａｒｌで切断することによって、分析できる。

これらのＮ−末端融合体から得られた構成体は、典型的には図２の例＋１３のものでありうる。これらは、ＯＢＰプロモーター配列、必要であれば、出発信号としてそれ自身のＡＴＧを有する高価値ペプチド暗号配列のＯＢＰ遺伝子の最初の幾つかのコドン内のインフレーム融合体およびこのＯＢＰ遺伝子およびクーミネーターの残部を含有しつる。

この修飾された遺伝子を、バイナリ−アグロバクテリウムプラスミド内へと導入しくベヴアン、１９８４年、前出）、アグロバクテリウム中へと固定化する。

上記したようにして形質転換を実施する。種子からの高価値タンパク質の回収を、［Ｃ−末端融合」について記載したようにして、実施する。

Ｃ１内部翻訳融合第三の型の融合としては、このＯＢＦの暗号配列の内部へと、高価値タンパク質の暗号配列を配置することが挙げられる。この型の融合には、Ｎ−末端融合におけるものと同じ戦略が必要とされるが、しかし低い保存性の領域内の修飾しか機能することはできず、これらのＯＢＰの保存性の高い領域が、成熟タンパク質の標的化に不可欠であると考えられるからである。

この種の融合において鍵となる相違点は、タンパク質の放出部位に対するコラゲナーゼ認識部位を、横に並べる（ｆｌａｎｋｉｎｇ）必要性である。これが意味しているのは、これまで記載してきたような、！ｌｌ準的なリンカ−／アダプター系の代わりに、次の形を有するリンカ−を備えることが必要なことである。

６回　６回付着端ｌおよび２は、このアダプターをＯＢＰクローン中へと、方向性の方法でクローニングするのに、使用することができる。次いで、こうして組み込まれた制限部位を使用して、適当な制限部位またはリンカ−の横に並んだ高価値ペプチド暗号配列を導入する。高価値ペプチド暗号配列中に非対称的に配置された制限部位およびコラゲナーゼ認識モチーフの暗号配列に並んだ二つの制限部位のうちの一つを使用することによって、方向性をヂエソクする。

これらの構成体をアグロバクテリウム　プラスミドへと固定化し、次いで植物へと固定化することは、既に述べた手順と同じである。トランスジェニック植物の種子からの高価値タンパク質の回収は、油体が分離され、洗浄された後のものとは幾分か異なっており、この油体を脱脂して、脂質相内では油体の内側に隠れつるコラゲナーゼ認識部位を評価することが、必要でありうる。この工程によって、担体として油体タンパク質を使用することによる利益が減少するかもしれないが、しかし他方では、水性媒体中または植物細胞質中では不安定なタンパク質配列に対しては、非常に好ましい。

Ｄ、三員体間転写融合ＯＢＰの全暗号配列が反１夏されている構成体を生じさせることが可能である。

この構成体から生産した二量体タンパク質は、油体に対してこのＯＢＰを標的化するために必要なすべての因子をやはり含有しつる。こうした構成体は、プロモーター領域、ＯＢＦの全読み取り枠またはほぼ完全な読み取り枠を含有しつるが、しカル翻訳停止および更には第二のＯＢＰの全読み取り枠をｕ１除しており、今回は翻訳「停止ｊおよびターミネータ−領域を備えている。

このキメラ遺伝子の構成においては、一対の類似していない制限部位が、二つの復製のジャンクション領域で見いだされるかまたは生産される。これらの部位を使用して、内部翻訳融合について上記したようなリンカ−の導入を可能とする。

このリンカ−は、コラゲナーゼ認識モチーフの組を含有しているだけでなく、高価値タンパク質を暗号化する配列が組み込まれた内部開田部位も含有している。

この構成体の形態を、図２１１１に示す。アグロバクテリウムおよび更には植物へのこの構成体の固定化は、上記した通りである。この形質転換植物の種子からの高価値タンパク質の回収は、上のＣ−末端融合について記載したと同じ手順を使用して、実施することができる。

例２植物中のすレオジンとの融合としてのインターロイキン−１−β（ＩＬ−１−β ）のクローニングおよび形質発現についての戦略Ａ、ｒＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｌｈａｌｉａｎａ」オレオジン遺伝子のクローニングおよび配列決定「叶ａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕＳＪオレオジン遺伝子〔マーフィー等、１９９１年、ｒＢｉｏｃｈｅｌ口１ｏｐｈｙｓ　ＡｃＬａＪ　１０８８　：　８６〜９４頁〕を使用して、ＥＭＢＬ３Ａ　（ストラタジーン社）中でｒＡ、　Ｌｌ＋ａｌｉａｎａＪ（コロンビア州）のゲノムライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングによって、ｒ　Ａ、　ｔｂａｌｉａｎａＪからの１５ｋｂのゲノムフラグメントを含有するＥＭＢＬＡ３Δクローン（λ２．ｌ）の分離がもたらされる。このオレオジンを、６．　６ｋｌ）のＫｐｎｌ挿入体中、この１５ｋｂのフラグメント（図５）中にマツピングする。このオレオジン遺伝子を含有する、１．８ｋｂのＮｃｏｌ／Ｋｐｎｌフラグメントを末端充填し、ＲＦＭＩ３ｍｐ　Ｉ　９のＳｍａ　ｒ部位中でサブクローニングする。この１．８ｋｂの挿入体を、適当な制限酵素によって消化し、Ｍ１３ｍｐ１９中で配列決定のためにサブクローニングする。このｒＡ、　ＬｈａｌｉａｎａＪオレオジン遺伝子のｌ　８００　ｂ　ｐの配列を、図１ａに示す。これらすべてのクローニング工程を、〔サムプルツク等〔「分子クローニング　実験の手引き：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　ＩａｂｏｌａＬｒｙ　ｍａｎｕａｌＪ第２版、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−プレス〕に従って実施した。

Ｂ、ＩＬ−１−βを暗号化するオリゴヌクレオチドの設計ＩＬ−１−βは、９つのアミノ酸（ａａ）；ｖａｌ−ｇｌｎ−ｇｌｙ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｓｅｔ−ａｓｎ−ａｓｐ−１ｙｓからなる〔アンド一二等、１９８６年ｒＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｊ　１３７　：　３２０１〜３２０４頁〕。このプロテアーゼ因子Ｘａは、ａａ配列寛１　ｅ−ｇ　Ｉ　ｕ−ｇＩ　ｙ−ａ　ｒｇを含有するタンパク質配列を開裂させることができる。開裂は、ａａ　ａｒｇの後ろで生ずる。これらの配列に基づいて、オリゴヌクレオチドをデザインしくＧＶＲＩＩ、図５）、これは、ＩＬ−１−β暗号配列に加えて、この因子Ｘａ開裂部位の暗号配列、およびｒＡ。

ＬｈａｌｉａｎａＪオレオジン（塩基位１ｉ１７４２〜７５９）の３°暗号領域の１８のヌクレオチドを含有している。このＩＬ−１−β暗号配列は、ｒ　（３、ｎａｐｕｓ」およびｒＡ、　ｔｈａｌｉａｎａＪオレオジン（表１）に対して最適のコドン用法を使用して設計した。

表１Ａ、　ｔｈａｌｉａｎａ’　お上びＢ、　ｎａｐｕｓオレオジン２のコドン用法ＴＴＴ　ｐｈｅ　Ｆ　５　ＴＣＴ　ｓｅｒ　Ｓ　８　ＴＡＴ　Ｌｙｒ　Ｙ　６　ＴＣＴ　ａｙｓ　Ｃ−ＴＴＣｐｈｅ　Ｆ　３　ＴＣＣｓｅｒ　Ｓ　１０　ＴＡＧ　Ｌｙｒ　Ｙ　１１　ＴＧＣＣｙｓ　Ｃ−ＴＴ＾　ｌｅｕ　Ｌ’−ＴＣＣｓｅｒ　Ｓ　２　Ｔ＾八　０ＣＩＩ　Ｚ　−ＴＧＡ　ＯＰＡ　ｚ　−ＴＴＧ　ｌｅｕ　Ｌ　４　ＴＧＡ　ｓｅｒ　Ｓ　−ＴＡＧ　ＡＭ［ｌ　Ｚ　−ＴＧＧ　Ｌｒｐ　ｗ　２ＣＴＴ　Ｉｅｕ　Ｌ　１０　ＣＣＴ　ｐｒｏ　Ｐ　３　ＣＡＴ　ｈｉｓ　ＩＩ　４　ＣＧＴ　ａｒｇ　ＲＧＣＴＣｌｅｑ　Ｌ　１１　ＣＣＣｐｒｏ　Ｐ　Ｉ　ＣＡＣｈｉｓ　ＩＩ　ｔ３　ＣＧＣａｒｇ　Ｒ−ＣＴＡ　ｌｅｕ　Ｌ　−ＣＧＡ　ｐｒｏ　Ｐ　４　Ｃ八八　ｇｌｎ　Ｑ　４　ＣＧＡ　ｅｒｇ　ＲＩＣＴＧ　ｌｅｕ　Ｌ　６　ＣＣＧ　ｐｒｏ　Ｐ　２　ＣＡＧ　ｇｉｎ　Ｑ　１７　ＣＧＧ　ａｒｇ　Ｒ−＾ＴＴ　ｉｌｅ　Ｉ　７　八ＣＴ　ｔｈｒ　Ｔ　１１　ＡＡＴ　ａｓｎ　Ｎ　−ＡＧＴ　ｓｅｒ　Ｓ　５ＡＴＣｉｌｅ　Ｉ　＋３　八ＣＣＬｂｒ　Ｔ　１４　ＡＡＣａｓｎ　Ｎ　Ｉ　ＡＧＣｓｅｒ　Ｓ　３＾ＴＡ　ｉｌｅ　ｌ　３　Ａｃ八　Ｌｂｒ　Ｙ　７　ＡＡ＾　Ｉｙｓ　Ｋ　５　＾ＧＡ　ａｒｇ　Ｒ５＾ＴＧ　ｍｅｔ　Ｍ　１１　八ＣＧ　Ｌｌ＋ｒ　Ｔ　５　八人Ｇ　Ｉｙｓ　Ｋ　１０　ＡＧＣａｒｇ　Ｒ３ＧＴＴ　ｖａｌ　Ｖ　１１　ＧＣＴ　ａｌａ　Ａ　１７　ＧＡＴ　ａｓｐ　Ｄ　８　ＧＧＴ　ｇｌｙ　Ｇ　０ＧＴＣｖａｔ　Ｖ　９　ＧＣＣａｌａ　Ａ　２　ＧＡＣａｓｐ　Ｄ　１９　ＧＧＣｇｌｙ　Ｇ　９ＧＴＡ　ｖａｌ　Ｖ　−ＧＣＡ　ａｌａ　Ａ　１０　ＧＡＡ　ｇｌｕ　Ｅ　２　ＧＧＡ　ｇｌｙ　Ｇ　１４ＧＴＧ　ｖａｔ　Ｖ　−ＧＣＧ　ａｌａ　Ａ　２　ＧＡＧ　ｇｌｙ　Ｅ　２　ＧＧＧ　ｇｌｙ　Ｇ　５１　Ｆｉｇｕｒｅ　１＾、参照２　り一及びファン（１９９１）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　９６　：　１３９５−１３９７゜Ｃ，ｒＡ、　ＬｈａｌｉａｎａＪオレオジン−ＩＬ−１− β融合体の生産配列：５’　ＣＡＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＣ３゜（塩基位置ニー８３８から８１４）、オリゴヌクレオチドＧＶＲＩＯ５° 　ＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＣ３゜を設計した。ＧＶＲＩ　Ｏは、クローニングを容易にするために、Ｐｓｔｌ制限部位（下線）を有している。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＧＶＲＩＯおよびＧＶＲＩＩの間の領域を増幅する。この反応混合物は、１６μｌのｄＮＴＰｓ　（１，２５ｍＭ）　、１０ｕｒのｌ０ＸＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭのトリスＨｃｉ ’ｐＨ８，３，５００ｍＭのＫＣＣ１５ｍＭのＭｇＣｌ１＠　、０．　１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、５μｌのＧＶＲＩ　ｌ　（２０μＭ）　、ｌｕｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１ｕ／μｌ）および６４μｌの１１！０を含有していた。この反応を、３０サイクル実施した。各サイクルは、９２℃での１分間の変性、４５℃での１分間のアニーリングおよび７２℃での３分間の伸長からなっていた。

このＰＣＲ反応によって、１６５２個のヌクレオチドからなる単一のフラグメントが得られた。

Ｄ、ｒＡ、　ＬｂａｌｉａｎａＪオレオジン−ＩＬ−１−β（ＯＢＰＩＬ）融合体のクローニング５°　５ａｉｌ−ツバリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーター−ＥｃｏＲｌ３゜配列を、ｐＢＩ１２１（クローンチック　ラボラトリーズ社）から分離し、ｐＵＣ１９のＳａｌ／ＥｃｏＲ１部位中へとクローニングした。このプラスミドをｐＴｃ　ｒｍと呼ぶ。１（ｉ５２ｂｐのフラグメント（Ｃ，で説明した）を分離し、制限酵素Ｐｓｔｌおよび５ａｉｌによって消化した。このフラグメントを、ｐＴＥＲＭ中でクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＵｃＯＢＲＩ　ＬＴ　（図５）と呼んだ。このプラスミドをＥｃｏＲｌおよびＰｓｔｌで消化し、消化ｐＵｃ１９ベクターおよびＥ　ｃＯＲＩ　−Ａ、　ＬＩ＋ａｌｉａｎａ　オレオジン−ＩＬ−１−β−１１０ｓ　−Ｐｓｔｌ融合体Ｐｓ　ｔ　Ｉ　（ＯＢＰ　Ｉ　ＬＴ）が得られた。０ＢＰＩＬＴの完全な配列を、図７に示す。０Ｉｌｒ ’ｌＬＴを、ｐブルースクリプト０のＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ１部位中でサブクローニングした。このプラスミド（ｐＢＩＯＢＰＩＬＴ）を、ＰｓｔｌおよびＨｉｎｄｌｌ＋によって消化し、このＰｓｔｌ−ＯＢＰｌｌ、Ｔ　−Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　ｒ　Ｉフラグメントを、選択標識（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）およびＰｓｔｌ−Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　ｌ特異的部位を含有する、バイナリ−アグロバクテリウム　プラスミド（Ｂｉｎ　１９）（ベヴアン、Ｍ、ｒＮｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｊ　１９８４年、１２：８７１１〜８７２１頁〕中でサブクローニングした。こうして得られたプラスミドを、ｐｃＧＯＢＰ　Ｉ　ＬＴと呼んだ。このクローニング手順の概略図を、図５に示す。種々のバイナリ−プラスミドの説明については、次を参照する：　ｐＧＡ（ｉ　４２または（ｉ４５；　Ｃアン等、１９８５年、ｒＥＭＩ３０．Ｊ、Ｊ　４．２７７−２８８頁〕またｌ！ｐＣＧＮ　１５５８または１５５９；　〔マクブライドおよびサマーフェルト、１９９０年、ｒＰＩａｎＬ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉ。

１、Ｊ１４：２６９〜２７６頁〕。

Ｆ、アグロバクテリウム株ＥＨＡＩＯＩ中へのｐｃＧＯＩＩＰＩＬＴの形質転換１つのＥＨＡ　１０１　コｏ＝　−（フッド等、１９８６年ｒＪ、　［ＩａｃＬ、Ｊ　ｌ　６８　：　１２９１−１３０１頁〕を使用して、５　ｍ　ｌのＬｌ］＋Ｉ　ＯＯｕｇ／ｍｌカナマイシンを培養した。この培１１菌を４８時間、２８ ℃で成長させた。この５ｍｌの培養菌を使用して、５００ｍ１のＬＩｌ＋１００ μｇ／ｍ！カナマイシンを培養した。

この培養菌を２８℃で、この培養菌が０Ｄ６００＝０．５の密度に到達するまで成長させた（約４時間）。これらの細胞を回転させ（１０分間、５０００Ｘｇ）、５００ｍ１の無菌ＨｔＯ中に再懸濁した（２回繰り返した）。これらの細胞を再び回転させ、１０％のグリセリンを含有する無菌のＨＩ　０３ｍＩ中に再懸濁させた。４０μｌの細胞をエノペンドルフチューブ中に分け、エレクトロボレーンヨンのために直接に使用するか、または将来使用するために一８０℃で貯蔵した。

エレクトロポレーシヨンは、〔ボウアー等、ｒＮｕｃｌ、＾ｃｉｄ、　Ｒｅｓ、Ｊ　１９８８年、１６：６１２７〜６１４５頁〕に従って実施した。パルス発生機を、この試料チャンバーと平行に、２５μＦのギヤパシター、２．５ｋＶおよび２００オームに設定した。

Ｇ、ｐｃＧＯＢＰ［ＬＴによるニコンアナ　タバクム（タバコ）の形質転換ｐｃＧＯＢＰＩＬＴを含有するＥＨＡＩＯＩを使用して、タバコリーフディスクを形質転換した。８〜ｌＯセンチメーターの長さのタバコ葉を、温室で成長させた植物から採取し、７０％エタノール中で２０分間無菌化し、次いで（ｒＪａＶｅＸＪのような）１０％漂白剤中で８分間無菌化した。次いで、これらの葉を無菌水中で６回洗浄した。この葉のエツジおよび主脈を、この葉から切開し、残った葉片を、５％７ｍｍの四角片または直径５ｍｍの円板へと分割した。約３０のリーフディスクを回収し、小さなペトリ皿中へと配置した。次いで、このアグロバクテリウム溶液を、このタバコディスク上へと注ぎ、９分間培養を生じさせた。次いで、これらの葉片を無菌ワットマン濾紙上でブロッティングし、背軸面側を下にして媒体１　（ＭＳ、３％しょ糖および２ｍｇ／ｆ　２．４−Ｄ）上に配置した。共存培養を、続く４８時間の間進行させた。この点で、これらのリーフディスクを、選択培地（Ｍｌ）、３９６　Ｌ　ヨ糖、２．５ｍｇ／ｊ！　Ｂａ、Ｏ，１ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、５００ｍｇ／ｆカルベニンジン、および１００ｍｇ／ｌ　カナマイノン）上へと移し、ここでこれらを次の４週間残留させた。いったん苗条が現れはじめると、これらを切開し、枳付き培地（ＭＳ、３％しょ糖、０．１ｍｇ／ｉ　ＮＡＡ、５００ｍｇ／ｉ’カルベニシリン、および５０μｌｇ／ｊ！　カナマイシン）上へと配置した。十分に根が形成された後に、このタバコ植物を土壌へと移した。

Ｈ，ｐｃＧＯＢＰＩＬＴによるｒＢ、ｎａｌ）ｕｓＪの形質転換ｒＢ、ｎａｐｕｓ」の形質転換を、〔モロニー等ｒＰｌａｎＬ　ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ、　Ｊ　１９８９年、８２３８〜２４２頁〕　（この開示を参照して本明細書中に包含する）に従って実施した。

形質転換手順バイナリ−プラスミドを含有するアグロバクテリウム　ツメファシェンス株Ｅ１１ＡＩＯＩの単一のコロニーを、終夜２８℃でＡｌｌ培地中で成長させた。この懸濁液の５０μｌの試料を、適当な抗生物質を補充したＭＧ／Ｌ培養液培養液５マｌ中２８℃で成長させた。この細菌懸濁液を、遠心分離によって１５分間、１１００００Ｘでペレット化し、次いで３％しょ糖を含有するｐＨ５，８のＭＳ培地中１０ｍ１中に再懸濁させた。この懸濁液の薄膜を使用して、５ｃｍのベトリ皿の底を覆った。切開した各子葉を、上記したプレートから採取し、これらの葉柄の切断面を、この細菌懸濁液中に数秒間浸漬させた。これらを、採取したところから直ちに同じＭＳ培地中へと戻した。この子葉を、アグロバクテリウムによって、７２時間共存培養した。フィーダ一層は使用しなかった。

共存培養の後、これらの子葉を、２０μＭのベンジルアデニン、３％のしよ糖、０７％のｐＨ５，８の生理寒天、５００ｍｇ／ｊ！のカルベニシリン（［ビオペンアイエルスト：　Ｐｙｏｐｅｎ　ＡｙｅｒｓＬ　Ｊおよび１５ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン（ボリンゲル社−マンハイム）を補充したＭＳ培地を含有する再生培地へと移した。

再び、これらの葉柄を、深さ２ｍｍの寒天中に慎重に埋め込んだ。平板密度は、プレート当たり１０個の植物片に維持した。密度が高いと、再生頻度が減少する。

選択および植物の再生この植物片を、光下および特定の温度条件下で２〜３週間以上、再生培地上で保持した。この時間の間、多くの苗条が、この植物片の半分以上の上に、比較的に小さなカルス生成と共に現れた。これらの苗条の幾つかは、４週間の培養で、漂白を受ける。残留する緑苗条を、再生培地と同じものからベンジルアデニンを除いた苗条伸長培地上へと継代培養した。この培地上での１または２週間によって、生成した苗条クラスターからの頂芽の優性の確立が可能となった。ここに由来する苗条は、ＭＳ培地、３％しょ糖、２　ｍ　ｇ　／　ｌのインドールブチル酸、０゜７％の生理寒天および５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含有する「根付き」培地に移した。この段階ではカナマイシンは使用しなかったのは、選択剤なしに一層急速に根付きが生ずる一方、ごく僅かの「逸出植物」が、再生および苗条伸長培地上で２ラウンド目の選択の後に、根付きの際に実際に継代したことを見いだしたからである。

■　タバコおよびｒ［１，ｎａｐｕｓ　Ｊゲノム中の０ＢＰＩＬＴの安定な組み込み推定上の形質発現植物を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性について試験した。この活性を示す植物からのゲノムＤＮＡを分離した。サザンブロソティングを実施することによって、Ｔ−ＤＮＡ周辺の間の配列（ＯＢＰＩＬＴおよび不オマインンホスホトランスフエラーゼ遺伝子）が、タバコおよびｒＢ、　ｎａｐｕＳ」ゲノム中へと、安定に組み込まれたことを示した。このタバコ種子中を、ｒＡ、　ｔｈａｌｉａｎａＪオレオジン遺伝子、およびこのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を用いて試験した。このｒＢ、ｎａｐｕｓ　Ｊサザンを、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を用いて試験した。

Ｊ　タバコ植物中でのオレオジン−ＩＬ−１−β融合体の形質発現形質転換されたおよび形質転換されていない植物から得られた成長中の胚か呟ＲＮＡを分離した。遺伝子プローブとしてｒＡ、　Ｌｌ＋ａｌｉａｎａＪオレオジンを使用して、ノザンブロッティングを実施した。すべての試験した形質転換植物において、８５０ｎＬの転写産物を検出することができた。これらの転写産物の寸法は、オレオジン−ＩＬ−１−βの予期された寸法に対応している。これらの転写産物は、形質転換されていない植物中では検出できなかった。

Ｋ、オレオジン−［Ｌ−１−βタンパク質の蓄積油体タンパク質を、形質転換されたタバコ種子〔ホルブルック等、１９９Ｉ年ｒＰＩａｎｔＰｈｙｓｉｃａｌ」９７　：ｌ０５１〜１０５８頁〕から分離した。ＰＡＧＥを実施し、タンパク質をこのゲルからＰＶＤＦ膜へと移した。ｒＢ、ｎａｐｕｓ　Ｊの２２ｋＤａのオレオジンに対して成長した抗体を使用して、このタバコ種子中のオレオジン−ＩＬ−１−β融合体を検出した。この抗体は、ｒＢ、ｎａｐｕｓ　Ｊおよび「Ａ。

ＩｈａｌｉａｎａＪ中の主要なすべてのオレオジンを認識する。更に、この抗体は、タバコオレオノンを認識する。タバコオレオジンは、ｒＡ、　ＬｈａｌｉａｎａＪおよびｒＢ、ｎａｐｕｓ　Ｊオレオジンとは、異なる寸法を有している。

この形質転換されたタバコ種子中においては、抗−２２ｋＤａ抗体は、形質転換されていないタバコ種子中に存在しない２０ｋＤａのタンパク質を認識した。このオレオジン−ＩＬ−１−β融合体の予期された寸法は、２０．ＩｋＤａである。これらの結果の要約を、表２に示す。

油体タンパク質に接合した目的のペプチド、またはその相当部分を形質発現させて、油体の入手をもたらすことによって、この目的のペプチドを、容易に精製して他の細胞成分か実質的にないようにすることかできる。この融合タンパク質は、精製につづいて開裂させることができ、または開裂なしに使用することができる。この主題の方法および組成物は、目的のポリペプチドを精製するための、早く、簡単な方法をもたらす。

本明細書で引用したすべての出版物および特許出願を、それぞれの各出版物および特許出願が、参照によって包含されるものと特別に各々措定されている場合と同じ程度に、ここで参照として包含する。

ここで、本発明の詳細な説明したが、本分野で通常の知識を有する者であれば明らかであろうように、添付した特許請求の範囲の思想および範囲から離れることなく、本発明に対して多くの変更および修飾を加えることができる。

形質転換されていない　ＮＴ　ＮＴ形質転換されていない　−　＋　＋ ■　安定な組み込み、１中で記載したように測定、前出。前出のＪで記載したようにしてオレオジン−１１−１−ｂ融合体を形質発現。

融合タンパク質を検出。ＮＴ＝試験しない。

１：ｌ＋＋６　％　＋／１ｗ讐　＝二　ス　二　ョ　是　害五ミ　ミ　ミ　５　：ＦＩＧ、ｌＡ。

ＩＩＦＩＧ、２゜Ｘｈｏ　工 τＣＧ　’１°ＧＡ　ＣＧＡＧＣＴ　ＧＧＣにへＧ　ＣＣＡ　ＧＧＣＣＧＧＴＡＣＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

フライ量−ゼ°読濶虻七寺−フＦＩＧ、３゜Ｅ、ｃｏｌｉ和合性プラスミド中のリンカ−クローンをモチーフ暗号化するプロテアーゼ（例えばコラゲナーゼ）標的を使用して融合遺伝子を構成するＴ−ＤＮＡ周辺を含有する広い宿主範囲レプリコン（即ち、アグロバクテリウム　バイナリ−ベクター）中へと構成体を挿入する葉、茎、子葉または葉柄植物片を使用して植物細胞を形質転換するトランスジェニック植物を再生する ■ 種子を結ばせる水性抽出緩衝液中で種子を粉砕する（ティラー等、１９９０年）遠心分離か他で油体を分離するコラゲナーゼ測定緩衝液中で、洗浄された油体を懸濁させ、万単位の精製コラゲナーゼを添加する遠心分離によって残留油体を分離する硫酸アンモニウム沈降法、カラムクロマトグラフィー等によるプロテアーゼ処理から放出タンパク質を分離する放出された組み換え体ペプチド上で生物測定を実施するインター０イ久ソ　ｌ−７！３ｇｖｒｌｌ　（７１−ｍｅｒ）ＦＩＧ　、　６゜ＣλＣ？ＧＣＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＣＴＡＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＣＧＣＣＡＡＡＴＴＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＴ入ＴＣＴＣＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＡＧＴＡＡＡＣへＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＦＩＧ、乙補正書の写しく翻訳文）提出ａ（特許法第１８４条の８）

Claims

【特許請求の範囲】

１．油体を標的化することができ、次式ｐｐ１−ａａ２５−ａａ２■−Ｖ−Ｖ− Ｔ−Ｌ−ａａ２１−ｐ−ＡＡＡＴａａ３４−Ｇ−Ｇ−ａａ３■−Ｌ−Ｌ−ａａ３■−Ｌ−ａａ４１−ＭＧ−Ｉ−ａａ４４−Ｌ−ａａ４■−ａａ４７−Ｔ−Ｌ−Ｉ−ＳＬＳＶＶａａ■１−Ｌ−ａａ■３−Ｖ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−ａａ■■−Ｌ−ＶＶＬ−Ｆ−Ｓ−Ｐ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｌ−ａａ７３−１ＩＬＩａａ７４−ａａ７５−ａａ７６−ａａ７７−ａａ７８−Ｇ−Ｆ−Ｌ−ＧＬＳ−Ｓ−ａａ■７−Ｇ−Ｖ−ａａ■■−ａａ■０−Ｌ−Ｓ−ＴＩＩＴａａ９３ａａ９４−Ｓ−ａａ９６−ａａ９７−ａａ９８−ａａ９９−Ｔａａ１００−ａ１０１−ＰＰ２　を有しているポリペプチドであって、ただしこのペプチドが、にんじんからの１６ｋｄのオレオジンまたはトウモロコシからの１６ｋｄまたは１８ｋｄのオレオジンを自然発生させる全長以外であることを特徴とするポリペプチド。
２．ｐｐ１およびｐｐ２の少なくとも一方が目的のポリペプチドを含有している、請求項１記載のポリペプチド。
３．ｐｐ１およびｐｐ２の少なくとも一方が、免疫源を与える抗原性アミノ酸配列を有している、請求項１記載のポリペプチド。
４．（ａ）次のアミノ酸配列：１０２０Ｍ−Ｎ−Ｇ−Ｒ−Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｑ−Ｙ−Ｑ−Ｍ−Ｓ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｄ−Ｙ− Ｓ−Ｋ−３０４０Ｓ−Ｒ−Ｑ−Ｉ−Ａ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｌ−Ｌ− Ｖ−Ｌ−５０６０Ｌ−Ｓ−Ｌ−Ｔ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｉ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｌ− Ｌ−Ｖ−７０８０Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｔ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ｉ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｔ− Ｇ−Ｓ−９０１００Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｉ−Ｔ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｗ−Ｉ−Ｙ− Ｋ　★−Ｙ−１１０１２０Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｈ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｄ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ｒ−Ｍ−Ｋ− Ｌ−Ｇ−１３０１４０Ｓ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｌ−Ｋ−Ｄ−Ｒ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｙ−Ｇ−Ｑ−Ｑ−Ｈ−Ｔ− Ｇ−Ｗ−１５０Ｅ−Ｈ−Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｒ−Ｔ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｑ−Ｈ−Ｔ−Ｔ；中に含まれる少なくとも８つの連続的なアミノ酸配列を含有するペプチド；および（ｂ）（ａ）における前記アミノ酸配列またはそのフラグメントに基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブによって同定されるＤＮＡ配列で暗号化されたペプチドであって、ただしこのペプチドが、にんじんからの１６ｋｄのオレオジンまたはトウモロコシからの１６ｋｄまたは１８ｋｄのオレオジンを自然発生させる全長以外である；からなる群より選ばれた油体を標的化しうることを特徴とするポリペプチド。
５．（ａ）における前記ポリペプチドが、次のアミノ酸配列：３０４０Ａ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｌ−５０６０Ｌ−Ｓ−Ｌ−Ｔ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｉ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｌ− Ｌ−Ｖ−７０８０Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｔ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ｉ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｔ− Ｇ−Ｓ−９０１００Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｉ−Ｔ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｗ−Ｉ−Ｙ−Ｋ　 ★−Ｙ−１１０１２０１０　１Ｌ− に含まれる少なくとも１２の連続したアミノ酸を含有している、請求項４記載のポリペプチド。
６．（ａ）油体への榛的化をもたらすのに十分なオレオジンまたはその一部と、（ｂ）目的のポリペプチドとを暗号化するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構成体。
７．前記ＤＮＡ配列と操作可能に会合している少なくとも一種の調節配列を含有するベクターＤＮＡであって、このＤＮＡ配列が、宿主細胞中の前記ＤＮＡを複製させることができるベクターＤＮＡ：を更に有する、請求項６記載のＤＮＡ構成体。
８．前記調節配列が、更に宿主細胞中で前記ＤＮＡを形質発現させることができる、請求項７記載のＤＮＡ構成体。
９．前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項６記載のＤＮＡ構成体。
１０．成分として、転写の方向に、種子中で形質発現した遺伝子の領域５′から翻訳開始部位への相当部分を有しており、種子中でのＤＮＡ配列の形質発現をもたらす第一のＤＮＡ配列；油体の標的化をもたらすオレオジンまたはその相当部分を暗号化する第二のＤＮＡ配列であって、この第二のＤＮＡ配列が、少なくとも一種の天然または合成の認識部位を含んでおり；および翻訳および転写停止領域を有しており、ここで前記の成分が操作可能に連鎖しており、前記第二のＤＮＡ配列の形質発現が、前記第一のＤＮＡ配列によって調節されている、形費発現カセット。
１１．前記第一のＤＮＡ配列が、シリアルまたは穀類の種子細胞中で形質発現した遺伝子からである、請求項１０記載の形質発現カセット。
１２．「Ａｒａｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ」のゲノムが、前記第一のＤＮＡ配列および前記第二のＤＮＡ配列の少なくとも一種を含有している、請求項１０記載の形費発現カセット。
１３．前記第二のＤＮＡ配列が、（ａ）次のアミノ酸配列：１０２０Ｍ−Ｎ−Ｇ−Ｒ−Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｑ−Ｙ−Ｑ−Ｍ−Ｓ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｄ−Ｙ− Ｓ−Ｋ−３０４０Ｓ−Ｒ−Ｑ−Ｉ−Ａ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｌ−Ｌ− Ｖ−Ｌ−５０６０Ｌ−Ｓ−Ｌ−Ｔ−Ｌ−Ｖ−Ｃ−Ｔ−Ｖ−Ｉ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｌ− Ｌ−Ｖ−７０８０Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｔ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ｉ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｔ− Ｇ−Ｓ−９０ｉＯＯＬ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｆ−Ｇ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｉ−Ｔ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｗ−Ｉ−Ｙ− Ｋ　★−Ｙ−１１０１２０Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｅ−Ｈ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｄ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ｒ−Ｍ−Ｋ− Ｌ−Ｇ−１３０１４０Ｓ−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｄ−Ｌ−Ｋ−Ｄ−Ｒ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｙ−Ｇ−Ｑ−Ｑ−Ｈ−Ｔ− Ｇ−Ｗ−１５０Ｅ−Ｈ−Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｒ−Ｔ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｑ−Ｈ−Ｔ−Ｔ；のうち少なくとも８つのアミノ酸および最大でその全長を含んでいるペプチドおよび（ｂ）（ａ）における前記アミノ酸配列またはそのフラグメントに基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブによって同定されるＤＮＡ配列で暗号化されたペプチド：からなる群からのペプチドを暗号化している、請求項１０記載の形質発現カセット。
１４．油体タンパク質（ＯＢＰ）遺伝子であって、種子中でこの遺伝子の形質発現をもらたす、領域５′から翻訳開始部位への相当部分を有しており、かつ前記ＯＢＰ遺伝子のちょうど５′からメチオニン開始コドンまでと５′から翻訳停止信号までとの間に、少なくとも１つの制限部位を有している、油体タンパク質遺伝子：を含有している、形質発現カセット。
１５．前記ＯＢＰ遺伝子によって読み取り枠内の前記制限部位中へと挿入された目的のポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列を更に有する、請求項１４記載の形質発現カセット。
１６．前記制限部位が、合成の制限部位である、請求項１４記載の形費発現カセット。
１７．前記制限部位中へと挿入されたプロテアーゼ認識部位のオリゴヌクレオチドアダプター暗号を更に有している、請求項１４記載の形質発現カセット。
１８．前記プロテアーゼがコラゲナーゼである、請求項１７記載の形質発現カセット。
１９．油体タンパク質（ＯＢＰ）遺伝子中への読み取り＝鎖内に挿入された目的のポリペプチドを暗号化し、油体タンパク質遺伝子が種子中でのこの遺伝子の形質発現をもたらすためにこのＯＢＰ遺伝子の調節領域５′から翻訳開始部位への相当部分を存している、第一のＤＮＡ配列を有している形質発現カセットであって、この配列が、前記調節領域中で形質発現されるような前記遺伝子中の部位に挿入されている、形質発現カセット。
２０．プロテアーゼ認識部位５′から前記第一のＤＮＡ配列を暗号化する第二のＤＮＡ配列を更に有しており、この第二のＤＮＡ配列が、前記第一のＤＮＡ配列および前記ＯＢＰ遺伝子と共に読み取り枠内に存在している、請求項１９記載の形質発明カセット。
２１．種子中で目的のポリペプチドを形質発現させる方法であって：ゲノム組み込み条件下で形質発現カセットによって宿主植物細胞を形質転換させ、ここでこの形質発現カセットが、成分として、転写の方向に、種子中で形質発現した遺伝子の領域５′から翻訳開始部位への相当部分を有しており、種子中でのＤＮＡ配列の形質発現をもたらす第一のＤＮＡ配列；油体の標的化をもたらすオレオジンまたはその相当部分を暗号化する第二のＤＮＡ配列であって、この第二のＤＮＡ配列が、少なくとも一種の天然または合成の認識部位を含んでおり、この認識部位の中へと、目的のポリペプチドを暗号化する第三のＤＮＡ配列が読み取り枠内に挿入されており；および翻訳および転写停止領域を有しており；ここで前記の成分が操作可能に連鎖しており、前記第二のＤＮＡ配列の形質発現が、種子中での形質発現のために前記第一のＤＮＡ配列によって調節されている、種子中で目的のポリペプチドを形質発現させる方法。
２２．「Ｔｈａｌｉａｎａａｒｉｄｏｐｓｉｓ７」のゲノムが、前記第一および前記第二のＤＮＡ配列のうち少なくとも一方を有している、請求項２１記載の方法。
２３．種子中で目的のポリペプチドを形質発現させる方法であって；ゲノム組み込み条件下でＤＮＡ構成体によって宿主植物細胞を形質転換させ、ここでこのＤＮＡ構成体が、油体タンパク質（ＯＢＰ）遺伝子中へと読み取り枠内で挿入された目的のポリペプチドを暗号化する第一のＤＮＡ配列を有しており、油体タンパク質遺伝子が、種子中での前記遺伝子の形質発現をもたらす前記ＯＢＰ遺伝子の調節領域５′から翻訳開始部位までの相当部分を有しており、ここで前記配列が、前記調節領域下で形質発現されるような前記遺伝子中の部位に挿入されており、これによって前記ＤＮＡ構成体が前記植物細胞のゲノム中へと組み込まれ始め；および前記植物を成長させて種子を生じさせ、これによって目的のポリペプチドを、前記ＯＢＰ遺伝子の形質発現産物と共に融合タンパク質として形質発現させる種子中で目的のポリペプチドを形質発現させる方法。
２４．前記種子の細胞中で油体から前記融合タンパク質を分離することを更に含む、請求項２３記載の方法。
２５．前記分離が：前記種子の細胞を溶菌させて前記油体を放出させ；および前記油体を破壊することによって前記触合ポリペプチドを放出させることを含む、請求項２４記載の方法。
２６．前記分離が：目的の前記ポリペプチドのＮ−末端の前に位置する前記融合ポリペプチド中のプロテアーゼ認識部位を認識しうるプロテアーゼに対して前記融合ポリペプチドを接触させることを更に含んでいる、請求項２５記載の方法。
２７．前記接触に先立って、前記ＯＢＰ遺伝子の形質発現産物に対して結合しうる抗体を有する固体担体に対して前記融合タンパク質を結合させることを更に含んでいる、請求項２６記載の方法。
２８．目的の精製ポリペプチドを得る方法であって：ゲノム組み込み条件下でＤＮＡ構成体によって宿主植物細胞を形質転換させ、ここでこのＤＮＡ構成体が、油体タンパク質（ＯＢＰ）遺伝子中へと読み取り枠内で挿入された目的のポリペプチドを暗号化する列一のＤＮＡ配列を有しており、油体タンパク質遺伝子が、種子中での前記遺伝子の形質発現をもたらす前記ＯＢＰ遺伝子の調節領域５′から翻訳開始部位までの相当部分を有しており、ここで前記ＤＮＡ配列の形質発現が前記調節領域によって調節されるように、前記配列が前記遺伝子中の部位に挿入されており、これによって前記ＤＮＡ構成体が前記植物細胞のゲノム中へと組み込まれ始め；前記植物を成長させて種子を生じさせ、これによって目的の前記ポリペプチドを、前記ＯＢＰ遺伝子の形質発現産物と共に融合タンパク質として形質発現させ；種子の細胞から油体を分離し；この油体を破壊することによって前記融合タンパク質を放出させ；および目的の前記ポリペプチドを精製することを含んでいる方法。
２９．目的の前記ポリペプチドが、植物ゲノムによって暗号化されたポリペプチド以外である、請求項２８記載の方法。
３０．目的の前記ポリペプチドが、油体中に天然に存在しているポリペプチド以外である、請求項２８記載の方法。
３１．前記分離が：前記種子からの細胞の溶菌に続いて汕体フラクションを回収することを含んでいる、請求項３０記載の方法。
３２．請求項１０、１４または１９のいずれか一つの請求項に記載の形質発現カセットを有する植物細胞。
３３．請求項１０、１４または１９のいずれか一つの請求項に記載の形質発現カセットを含有する細胞を行ずる植物。
３４．請求項２３の方法によって得られた、種子中の目的のポリペプチドを形質発現する植物。
３５．請求項１０、１４または１９のいずれか一つの請求項に記載の形質発現カセットを含有する種子。
３６．請求項２３の方法によって得られた、目的のポリペプチドを形質発現する種子。
３７．油体中の目的のポリペプチドを得る方法であって：種子中の前記ポリペプチドを、融合タンパク質として、前記油体の標的化をもたらすオレオジンまたはその相当部分によって形質発現させることを含んでいる、油体中の目的のポリペプチドを得る方法。