JPH04502902A - 魚の出血性敗血症ウィルスの組換え型ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３３、請求項３０乃至３２の形質転換された宿主細胞により表現された核酸の表 現生成物。

３４、複合体が抗−ＶＨＳ中和抗体の生成を生体内で誘発できるよう充分な分子 量をもつ合成ポリペプチド又は天然タンパク質に対し場合によって結合された形 で、請求項３３の表現生成物を含んでいることを特徴とするワクチン有効成分。

３５、ワクチン接種栄養物１グラムあたり１０ｎｇから１００属の有効成分を含 むことを特徴とする、経口投与可能な請求項３４のワクチンの有効成分。

３６、魚１ｇあたりｌｎｇから１．ＯＯＯｎｇを構成することを特徴とする、腹 腔内投与可能な、請求項３４のワクチン有効成分。

３７、１−あたり１０ｎｇから１００μｇを含む媒質内の溶療法により投与可能 な請求項３４のワクチン有効成分。

３８、請求項１乃至１３のいずれか１項の免疫原性の組換え型ポリペプチドに対 し誘導されていることを特徴とする抗体。

３９、請求項１４乃至２３の核酸のうちいずれか１つと又はその相補的配列と雑 種形成することを特徴とするヌクレオチドプローブ特に、 ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＧＣＣＧＡＣＴＧＧ　ＧＡＣＡＣＴ 　ＣＣＧ　ＣＴＡＣＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧ　ＡＴＧＡＡＧ　ＡＣＴ　Ｇ ＡＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＧＡＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡ　ＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣ ＴＴ　ＣＴＡ　ＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣＴＣというヌクレオチド配列の中から選ばれ たプローブ又はその相補的ヌクレオチド配列。

−適当な培養基内で請求項１４乃至２３のいずれか１項の核酸を含む適当なベク ターによって予め形質転換された宿主細胞を培養すること、及び−前記培養基か ら前記形質転換された宿主細胞により生成されたポリペプチドを回収すること、 を特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項の組換え型ポリペプチドの調製方 法。

４１、請求項３１のＥ、　ｃｏＨの培養・及びこのＥ、　ｃｏｌｉの指数増殖期 の終りでの培養の停止ならび゛に、Ｌｃｏｌｉにより分泌される可能性のあるそ の他の細胞外酵素又はタンパク質の無い培養基からの一定のアミノ酸配列の回収 、を特徴とする、一定の組換え型ポリペプチドの請求項４０の調製方法。

４２、請求項３２の酵母の培養、及びこの酵母の指数増殖期の終りでの培養の停 止、ならびに酵母内のマイクロカプセル封じされたポリペプチドの回収、を特徴 とする、一定のポリペプチドの請求項４１の調製方法。

明　細　書 魚の出血性敗血症ウィルスの組換え型ポリペプチド 本発明は、ウィルス性出血性敗血症（ＶＨ３）ウィルスに対する中和抗体の生産 に対しての利用を可能にする純粋状態にある免疫原性組換え型ポリペプチドに関 する０本発明は同様に、これらのポリペプチドの構成に入るアミノ酸配列の一部 分又は全てに対してコード化する核酸にも関する。さらに、本発明は、魚のウィ ルス性出血性敗血症に対する有効成分として前記免疫原性ポリペプチドを含むワ クチンに関する。

ここで、「組換え型ポリペプチド」というのは、コンピテント宿主細胞の中で適 切な調節要素の制御下にて相応するＤＮＡ配列の転写及び翻訳に際して遺伝子工 学により生成される可能性のある全てのポリペプチド構造の分子のことである。

従って、本記述の文脈内で用いられている「組換え型ポリペプチド」という表現 は、それが例えばグリコジル基といったその他の基を有している可能性を除外す るものではない。

確かに１組換え型」という形容詞は、問題のポリペプチドが遺伝子工学により製 造されたもの、特に一般に遺伝子組換えにより宿主内で用いられた表現ベクター の中に以前に導入された相応する核酸配列の宿主細胞内での表現の結果として得 られるものという考え方を伝達するものである。しかしながら、この表現は、当 該ポリペプチドが異なる方法例えばタンパク質化学において利用される方法に従 って化学合成によって生成される可能性を除外するものではない。

「生物学的純粋状態」又は「生物学的に純粋な」という語は、一方では、ここで 問題となっている種類の免疫原性ポリペプチドがワクチン接種化合物の生成に利 用されつるような純度レベル、また他方では汚染物質さらに限定的に言うとウィ ルス性出血性敗血症ウィルスからの天然の汚染物質が無い状態、を意味している 。

ウィルス性出血性敗血症ウィルス（Ｅｇｔｖｅｄ　ウィルスとも呼ばれる）はサ ケ科の魚例えばマス及びサケなどに感染する。このウィルスは、Ｒｈａｂｄｏｖ ｉｒｉｄａｅ科に属するカプシドで包まれ負の単分離を受けたＲＮＡウィルスで ある。

ウィルス性出血性敗血症（ＶＨ３とも呼ばれる）は、ヨーロッパに典型的な疾病 であるが、これに似た疾病すなわちＶＨＳと同じ科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄｅ ａｅ）のウィルスにより引き起こされる感染性増血壊死（ＩＨＮ）は米国や日本 にも存在する。

これまで、Ｅｇｔｖｅｄウィルス（以下ｒＶＨＳウィルス」という表現でも呼ば れる）について行なわれた研究により、複数の派生型特に３タイプひいては５タ イプの異なる派生型の存在が明らかにされている。しかしながら、これらの異な る派生型はサケ科の魚に対するその病原性又は抗原性において差異を示している ものの、その核酸配列のレベルでは著しい類似点を示し、その核酸の配列の相同 性は９５％或いはそれ以上にまで達しつる。

ウィルスの物理−化学特性のい（つか及びその病原性に関連するいくつかの要素 についてはすでに記述されてきた。例としては、マスのＶＦＨＳウィルスのタン パク質の分割試験を記述しているＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ、１９ ７５年８月号、Ｐ２Ｓ５−２６２中のＬｅｎｏｉｒ及びＫｉｎｋｅｌｉｎの論文 を挙げることができる。この論文では、Ｇタンパク質と呼ばれる糖タンパク質の 存在を含む５つのタンパク質（Ｌ、Ｇ、Ｎ。

Ｍｌ、Ｍ２）の存在について言及されている。この論文ではこのＧタンパク質は 電気泳動ゲルにより検出された場合ピリオン（ウィルス粒子）の表面上に存在す る隆起の構成要素となりつるということが記されている。

ｒＪｏｕｒｎａｌ　Ｖｅｔ、　Ｍｅｄ、　Ｂ、　３３．３６−４６（１９８６年 ）」のもう１つの論文の中で、Ｄｅｕｔｅｒ他は上述のＶＨＳ−Ｖ及び５ｖｃ− ｖウィルスのタンパク質の分子量についての複数の研究所による測定の結果を報 告している。Ｄｅｕｔａｒ他は、観察された結果の不一致を強調し、今後は、前 述の研究所により得られた全てのものとさらに異なるり、Ｇ、Ｍ、及びＭ２タン パク質については６３０００Ｄの分子量を与えている。

ウィルスについてのその他の結果は、Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＦｏｎｄａｔｉｏｎ 　Ｍａｒｃｅｌ　Ｍｅｒｉｅｕｘ　１９８２年、ｒ　Ａｎｔｉｇｅｎｓｏｆ　ｆ ｉｓｈ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　（魚に対する病因抗原）」内で公表されたＫｉｎ ｋｅｌｉｎ　の論文の中に報告されており、ここではＧ、Ｍｌ及びＭ２タンパク 質がウィルスの外膜に属することならびにウィルスの糖タンパク質Ｇが隆起の構 成要素である中和抗原性を有することになること、が明示されている。

今日までに知られている結果の不一致が示す通り、Ｇタンパク質の物理−化学特 性は不正確でその上不十分なものであるため、確実かつあいまいでない形でのそ の識別ならびにその構造的及び機能的要素の特徴づけは不可能である。

ｒ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ（感染と免疫）」（３９， ７−１４）に公表されたＢｅｒｎａｒｄ他の論文は、Ｆ２５と呼ばれその中和抗 原性面でＶＨＳウィルスの野生型菌株と比較したＶＨＳウィルスの非病原性派生 物に関するものである。この論文は、電気泳動ゲルＳＤＳ上で派生物Ｆ２５のポ リペプチドＧを立証できなかったということを示している。同様にこの論文は、 ゲル電気泳動により野生型菌株のポリペプチドＧはその他の帯域と「同時移動す る」と記している。

その上、著者は血清（漿液）中和実験において、各々のウィルスが相同性抗血清 とわずかに交叉しこのことは上述の２つのウィルスの各々のグリコジル化におけ る差異と一致している、ということを示している。

又、今日まで、魚のウィルス性出血性敗血症の予防のために用いられたワクチン は、腹腔的投与可能で、純化、減衰又は死菌されたウィルスの濃度を高めた調製 物からなるものであった。このようなワクチンは次のような欠点をもつ；すなわ ち、特に、減衰されたワクチンは、処理を受けた魚に対する無害性が不充分であ り、これらの魚にはワクチン接種の際に一定のレベルの死亡率が確認されている 。又、ワクチン接種を受けた魚による水質汚染の可能性もあり、結果として生態 学的に懸念される事態も発生しつる。死菌ワクチンは同じ欠点を有しはしないも のの、その原価は高く、そのため養魚場における大規模利用には不利である。

一方、現在マスのような魚において用いられているＶＨ３に対するワクチンの投 与様式は、全く実用的なものではない。つまり腹腔内投与か又は浴療法によるも のなのである。ワクチンの経口投与は、特に胃の酸性度及びタンパク質分解酵素 のため不充分であることがわかった［１９８４年２月２２日パリの国際家畜伝染 病局、魚のワクチン接種に関するシンポジウムの総合的結論参照。］ 現在、当該技術分野においては、経口投与による効果的なワクチンを調整し使用 する可能性は、非常に先の長い不確かな展望でしかないと考えられている。

本発明の目的は、ＶＨＳウィルスに対して誘導された抗体により認識されＶＨＳ ウィルスに対する中和抗体の形成を！体式で誘発する可能性があるため、生物学 的に純粋なワクチンの有効成分として利用できる組換え型ポリペプチドにある。

本発明の目的は、同様に、大規模な調製を可能にするような本発明の生物学的に 純粋な組換え型ポリペプチドのペプチド構造についてコード化する核酸にもある 。

同様に本発明は、低コストでアクセスでき好ましくは投与の容易な、ＶＨＳに対 する効果的なワクチンの生産をもその目的としている。特に、本発明は、浴療法 、シャワー又は特に魚のエサを伴う経口投与によって投与できるワクチン化合物 を得ることをもその目的とする。当然のことながら、その他の投与方法特に注射 による投与も、本発明のワクチン接種化合物力）ら除外されていない。

本発明に基づく組換え型ポリペプチドは、そのボＩ７ペプチド構造の中に、 Ｍａｔ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−＾ｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｐｈａ−Ｌｓｕ−Ｖａｌ− Ｘ１ｍ−Ｌａｕ−Ｘ１ｍ−工１ｅ−１１ｅ−１１ａ−Ｌｙｓ−Ｓ＠ｒ−Ｔｈｒ− Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−工１ａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ− Ｖａ　１−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−１１ａ−５ａｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ　−Ａ　 ｌ　ａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌａｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ− Ｈｌｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−人ｒ９−＾ｓｐ−人５ｐ−５ａｒ− Ｐｈａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉ　１ａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｇｌｎ−Ｉａｕ −Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｌｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈａ−Ｇｌｕ−人５ｐ−１１ａ −＾５ｎ−Ｌｙｓｉ−Ｇｌｙ−Ｌａｕ−Ｖａｌ−５ａｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈ ｒ−Ａｒｇ−工１ｅ−１１ｓ−Ｈ１ｓｉ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−５ａｒ−Ｖ ａｌ−Ｔｈｒ−９ｅｒ−Ｖａｌ−５ａｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−人１ａ−５＠ｒ−Ｇ ｌｙ−Ｈ１ｓ−Ｔｙｒ−Ｌａｕ−Ｈｌｓ−人ｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈ　ｒ−Ｔｙｒ− Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−５ａｒ−Ｔｈｒ−５ａｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈ＠− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−に１ｎ−Ｔｈｒ−■１ａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ− ｘＡｕ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｌｙｓ−ＩＪｕ−５ｅｒ−＾ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ− 人１ａ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−＾１ａ−５ｅｒ−Ｌｙｓ、−人ｓｐ−Ｈ１ｓ −Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈａ−Ｐｈａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−５ａｒ −Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｍ＠ｔ−Ｌｙｓ−人ｓｎ−人ａｎ−Ｖａｌ−Ｈ１ｓ −Ｌｙｓ−八５ｐ−１１＊−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ −Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｖａｌ−人５ｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ −５＠ｒ−人ｒｇ−Ｌｙｍ−Ｐｈａ−ＴＪ＠ｕ−人りｎ−Ｐｒｏ−人ｇｐ−Ｐｈ ｅ−１１＊−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−５ａｒ−Ｐｒ ｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｌｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙ ｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−人１ａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−人１ａ−Ｈｌ ｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−５ａｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌ ｙ−Ｈｉｇ−Ｌａｕ−Ｐｈａ−Ｔｈｒ−人ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｈｉ！！−人ｍｐ−Ｈ Ｌｓ−人ｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｉ　１ｅ−Ｖａ　ｌ　−Ａｌ 　ａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｍ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌａｕ−Ｔｈｒ−Ｍ ｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓｓ−Ｇｌｙ− Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−、Ｔｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−＾ｇｐ−Ｌａｕ−Ｇｌｙ −Ａｓｐ−Ｌｓｕ−工１ａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ＝Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−人ｒｑ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ｐｒＯ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ −ＣＹｓ−Ｖａｌ−Ａｇｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−工１ｅ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−人ｒｇ −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈａ−５ａｒ−’ｒ’ｆｒ−Ｌ ｅｕ−＾５ｎ−Ｈ１ｓ−Ｌａｕ−工１ａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍ＠ｔ−Ａｌａ−Ｇ ｌｎ−Ａｒｑ−という配列の中に含まれた１つのアミノ駿連鎖が存在することを 特徴とする。

本発明の有利なポリペプチドは、それがＶＨＳウィルスに対して予め形成された 中和抗体により認識されさらに場合によってはこの同じウィルスに対する中和抗 体をそれ自体！体力で誘発させることができるということを特徴とする。

本発明のポリペプチドが有する特性全体すなわちＶＨＳウィルスを中和する抗体 により認識されつるという適性及びこのウィルスを中和する抗体の生産を二体力 で誘発する能力は以下用語の便宜上ｒＶＨ３血清中和特性」と呼ぶことにする。

以下では、上述のアミノ酸連鎖全体により特徴づけられるポリペプチドを［ポリ ペプチドＴ」と呼ぶ。

これらの免疫原性ポリペプチドの生産方法は；−前記免疫原住ポリペプチドに対 してコード化するヌクレオチド配列を含む核酸で以前に形質転換されたコンピテ ント宿主細胞の培養（なおここで、このヌクレオチド配列は、このコンピテント 宿主細胞のボリメーラーゼにより認識されるプロモータ、翻訳開始及び終止要素 を特に含む調節要素の制御下にある）、及び −この宿主細胞の表現生成物から生成された免疫原石　性ポリペプチドの回収、 を含む。

本発明に基づく方法において利用すべき好ましい、　ヌクレオチド配列について は、後で記述する。

１　本発明に基づくポリペプチドのもう１つの調整方法日　は、好ましくはＣ末 端アミノ酸から出発して、必要と）　される順に連続したアミノアシルを、又は アミノアシル及び適当な順序で予め形成されすでに複数のアミノアシル残基を含 むフラグメントを或は又このように予め調整された複数のフラグメントを２つず つ連続して次々とＮ末端アミノ酸に至るまで徐今に近づいて濃縮管　すること（ なおここで、ペプチド合成において既知の方法に従って特にカルボキシル官能基 及び活性化後べ１　プチド結合の形成に通常介入しな（ではならない一方のアミ ノ官能基及び他方のカルボキシル官能基又はその逆を除いて、これらのアミノア シル又はフラグメントが有する全ての反応性官能基は予め保護しておく）を特徴 とする。

表現がめられているヌクレオチド配列の性質をその基本的独創性とする以上に簡 単に説明した遺伝子工学の方法には、好ましいいくつかの変形態様が考えられる 。これにより、本発明に基づ＜　ｒＶＨ３血清中和性」組換え型ポリペプチドの 生産が可能となる。

当業者であれば、さらに短い配列のｒＶＨＳ血清中和性」ポリペプチドのうち本 発明の範囲内に入るものを識別しひいては選別することができると思われる。

当業者がこの識別を行なえる一般的な手段の１つとしては、例えば、Ｎ末端領域 又はＣ末端領域内で選ばれたペプチド部位においてポリペプチドＩのみを印割す る特異的タンパク質でポリペプチドエを処理し、それに従いてＮ末端フラグメン ト又はＣ末端フラグメントをポリペプチドエの残りのものから分離し、それから この「残り」をそのＶＨＳ血清中和活性についてテストするという方法がある。

応答が肯定的なものであった場合には、Ｎ末端フラグメント又はＣ末端フラグメ ントがポリペプチドエのＶＨＳ血清中和特性の発現に対し不可欠とはいわないま でも有意な役割を果さなかったということが立証されることになる。場合によっ ては残りのポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に近いもう１つの特定の部位を特異 的かつ排他的に認識する可能性のあるタンパク質分解酵素が利用できるかぎり、 この作業を（り返すことができる。認識されたさらに小さいポリペプチドがその 源であるより長いフラグメントのＶＨＳ血清中和特性を喪失したことにより、こ のとき、分離された最後のフラグメントがポリペプチドＩのＶＨＳ血清中和特性 の発現において有意な役割を果たしたこと、そしてこの点においてこのフラグメ ントは通常少な（とも部分的に、本発明に基づく免疫原住組換え型ポリペプチド のアミノ酸配列に属することといった仮定を導くことができる。

前述のものよりもさらに単純なものであるもう１つの、ＶＨＳ血清中和活性の発 現に対する不可欠ポリペプチドエの領域検出方法の変形態様は、適当な宿主細胞 における、組換え型免疫性ポリペプチドの上述の生産方法の利用のために用いら れた表現ベクター内のなおＶＨＳ血清中和ポリペプチドに対しコード化すると推 測されている核酸の取り組みの前の、ポリペプチドエに対しコード化する核酸の 酵素処理に基づくことができる。このとき、この酵素処理は、初期核酸配列内の それぞれの部位に応じて（場合によっては指向性一時的突然変異生成により作ら れた部位）選ばれた単数又は複数の制限酵素又は例えばＢａ１３１といった工キ ソヌクレアーゼによる、（例えばポリペプチドエ全体に対してコード化する）初 期核酸の端部の削除から成ると考えられる。その後、得られた切形核酸を、選択 されたベクター内への取り組み及び得られた組換え型ベクターとの宿主細胞の形 質転換の後、なおも前述のＶＨＳ血清中和特性をもつ（或いは又逆にこれをもは やもたない）相応する切形ポリペプチドを表現するその能力についてテストする ことができ、こうした、前述の変形態様の場合と同様に、ポリペプチドＩの中で 、そのＶＨ５血清中和特性の発現において不可欠とはいわないまでも重要な役割 を果たす配列を識別することが可能となる。

以下には（当然のことながら制限的な意味をもたない形で）、ポリクローナル抗 体の生産テスト及び形成されたポリクローナル抗体の前記ＶＨＳ血清中和特性の 立証について記す。

このテストは、フロイント完全アジュバントの中で純化された１００μｇのウィ ルスを複数回すなわち５回から１０回皮内注射されたウサギなどの被験動物の免 疫処置を含んでいる。なおこの処理は、１力月の間隔をおいて２回（り返された 。抗ＶＨＳ抗体の出現はＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により追究された。

こうして得られた抗体の血清中和特性は以下の要領で立証される。９６ウエルの 細胞培養平板の中で、各ウェル中に一定数のウィルス粒子（５ｘｌＯ’ｕｆｐ／ ａ＋１）を配置し、抗ＶＨＳ血清の漸増希釈物を付加する。４℃で一装置いた後 、１ｍｌあたり２Ｘ１０’細胞の濃度までウィルスに敏感な細胞（マス細胞系統 ＲＴＧ２）を付加し、３日間１５℃に保温する。ウィルスによる病原効果の抑制 すなわち血清中和化をクリスタル・バイオレットでの固定された細胞の着色によ り測定する。

当然のことながら、このテストは、ポリペプチドエの中に含まれているエピトー プに特異的でかつ前記ＶＨＳ−血清中和特性の発現に必要なモノクローナル抗体 を利用する。さらに感応性の高い単数又は複数のテストにより置き換えることが できる。

従って本発明は、以上に規定したような、ポリベブチドエから直接誘導されたポ リペプチドの識別を可能にする手段を提供する。

本発明は同様に、前述のものとは単数又は複数のアミノ酸によって識別されしか もそのために場合によってはＶＨＳウィルスに対する中和抗体をｍで誘導できる 抗原抗体複合体をこのウィルスの中和抗体と共に形成できる能力が失われること のないような、ポリペプチドにも関する。

前述のことからすでに、本発明の範囲内に入る組換え型ポリペプチドが「ポリペ プチドエ」に制限され得ないことがわかる。

中和抗体−抗原認識又は前述のＶＨＳウィルスに対する中和抗体のＷ誘導に介入 するエピトープ（単数又は複数）を失うことなく、Ｎ末端領域又はＣ末端領域又 はその両方の欠如という点でポリベブチドエと異なる、さらに短いポリペプチド は全て本発明の一部を成す。

同様に、その独自の配列内にポリペプチドＩ又は上述のより短いポリペプチドの うちの１つが部分的にしか入っていないようなポリペプチドも、本発明の一部を 成す、このタイプのポリペプチドの一例としては、前述の免疫原性ポリペプチド がその他のアミノ酸配列特に、その存在が結果としてそれを生産するのに利用さ れる遺伝子工学方法のタイプの結果でありうるような「キャリア」配列と組換え られた形になっている雑種ポリペプチドを挙げることができる。これらの配列は 、非相同であることが最も多（、例えばこれらの免疫原性ポリペプチドが中で表 現されているポリペプチド配列のフラグメントで構成されている；このような非 相同配列の例としては、特にその免疫原性ポリペプチドに相応する核酸が以前に 試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での遺伝子組換えにより中で導入されたＬａｃｚ 配列を含むベクター、プラスミド又はファージでの大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の 形質転換によってこの免疫原性ポリペプチドの生産が行われた場合のＥ、　ｃｏ ｌｉベーターガラクトシダーゼ又はそのフラグメントを挙げることができる。問 題の種類の非相同配列はその他のものであってもよい。これらの配列に課せられ る唯一の条件は、本発明の免疫原住組換え型ポリペプチドの上述の免疫特性に著 しく干渉しないことである。

本発明に従った免疫原性ポリペプチドに結びつけることのできるその他のポリペ プチド配列の例としては、特に以下のものを挙げることができるニー　その合成 がＥ、　ｃｏｌｉにより行なわれる場合、ＴｒｐＥ遺伝子の表現生成物、表面タ ンパク質Ｏｍ　ｐ　Ａ　、　Ｅ、　ｃｏｌｔのリポタンパク質、又は−その合成 が酵母により行なわれる場合、酵母の−ｇａｌ　１又はｇａｌｌｏ遺伝子の表現 生成物（特に、使用されるベクターがこれらの遺伝子により変更されたプラスミ ド２μであり、宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ タイプのものである場合）。

以下に取り上げる「ポリペプチド■及び■ならびに上述のポリペプチドエ」は、 以下の例において示す通リＶＨ５から以前に分離されたウィルスのＧタンパク質 についてコード化するヌクレオチド配列から誘導されたｃＤＮＡの表現生成物か ら誘導されていることに留意されたい。上述のようなポリペプチドは、ウィルス の外膜内のＧタンパク質のアンカー配列又はアンカーペプチドに相応すると思わ れるものに相応するＣ末端ポリペプチドは配列を備えていない。

本発明に基づくポリペプチドは、Ｘを任意のアミノ酸としてＡｓｎ−Ｘ−５ｅｒ 又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒタイプのそのグリコジル化部位のいくつかにおいて、グ リコジル化されていてもいなくてもよい。

前述の本発明の定義の範囲内に入る以下「ポリペプチド■」と呼ぶ特定のポリペ プチドは、以下のアミノ酸連鎖の全部又は一部を含む： Ｇｌｎ−Ｉｌｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−ＰｒｏＧｌｎ−ｌ１ｓ−Ｔｈｒ−Ｇ ｌｎ−Ａｒ　１ａ−５ａｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｈｌｇ−人１ａ−＾ｇＰ−’Ｉ’ ｒＰ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌａｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｒｌｓ−Ｐｒｏ−５ ｅｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−＾ｒ９−人５ｐ−Ａｓｐ−５ａｒ−Ｐｈａ−Ｖａｌ−Ｐ ｒｏ−１１＊−人ｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−人ｒｇ−Ｃｙｇ−Ｐ ｒｏ−Ｈ１ｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈａ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−１１ａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇ ｌｙ−Ｌａｕ−Ｖａｌ−５ａｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−人ｒｇ４１＠−１１ ａ−Ｈ１ｓ−Ｌａｕ−Ｐｒｏ−Ｌａｕ−５ａｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−５ａｒ−Ｖａ ｌ−５ａｒ−人１ａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｌｓ−Ｔｙｒ−Ｌａ ｕ−Ｈｌｍ−人ｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−人ｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙ ｓ−５ｅｒ−丁ｈｒ−５ｓｒ−Ｐｈ＠−ｔｈ＠−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｔｈ ｒ４１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｌａｕ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｌｙｅ −Ｌｅｕ−５ａｒ−人ｒｇ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−人１ａ−Ｔｈｒ−人ｉｐ−Ｇｌｕ −Ｔｈｒ−Ｈｌｓ−Ａｇｐ−Ｈｌｓｉ−人ｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−人１ ａ−工１ａ−Ｖａｌ−人１ａ−Ｇｌｙ−Ｈ１ｓ−Ｈｌｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌ ｙ−Ｌ４！ｕ−Ｔｈｒ−Ｍａｔ−＾１ａ−Ｃｙｓ、−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ− Ｐｈａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｌｙｇ−Ｔｈｒ− 人５ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌａｕ−１１ａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ− Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−人ｒｑ−Ｌｙ１１−’Ｌａｕ−Ｔｈ ｒ−Ｐｒｏ−人５ｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−＾５ｎ−Ｔｈｒ−人ｓｐ−工１ ＊−Ｇｌｎ−Ｍａｔ−人ｒｑ−人１ａ−Ｈ１ｓ−Ｔｙｒ−Ｌａｕ−ＬＪｕ−人ｓ ｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−１１ａ−Ｍｅｔ−人ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒ ｇ−Ｖａｌ−λ！Ｉｐ−人ｓｎ−人５ｎ−Ｔｈｒ−人ｔｘｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ− 人ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｍａｔ−１１ａ−Ｐｈａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌａｕ− １１ａ−工１＊−Ｐｒｏ−Ａｇｐ−工１＠−Ｇｌｕ−Ｌｙｌｌ−’Ｔｙｒ−Ｇｌ ｎ−５ａｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−人ｓｐ−５ａｒ−Ｇｌｙ−Ｍａ’ｔ−Ｌａｕ−Ｖ ａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｇｎ−Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈ ｌｓ−Ｉａｕ−５ａｒ−１１ｍ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−５ａｒ−人５ｎ−Ｔ ｈｒ−５＠ｒ−Ａｓｐ−Ｌａｕ−５＊ｒ−Ｔｈｒ−人５ｎ−Ｈ１＠−工１＊−） １ｉｓ−Ｔｈｒ−＾ｇｎ−ＩＪｕ−１１＠−ＰｒＯ−５ｌｌｒ−人ｓｐこのポリ ペプチドＩｌは、シグナルペプチドが無いという点でポリペプチドＩと異なる。

本発明に基づくもう１つの特定のポリペプチド（ポリペプチドＩＩ＋）は、以下 のアミノ酸連鎖の全部又は一部を含む二 Ｍ＠ｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｃｙｍ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　 Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｓｒ　工１ｍ　ＡｓｎＴｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇ ｉｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｍａｔ　Ａｊｎ　Ａｇｎ　’ｒｈｒ　’ｒｒｐ 　ＬｙｓＳ＠ｒ　Ｔｒｐ　Ｌｙｅ　入ｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｎｎ　 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ＧｌｙＭａｔ　Ｉｌａ　Ｐｈｅ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　ＩＩｓ　Ｉｌａ　Ｐｒｏ　入卯　工１ｅ　Ｇｌ ｕ　ＬｙｓＴｙｒ　Ｇｉｎ　Ｓｓｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＡＩＩＩｐ　Ｓａｒ　Ｇ ｌｙ　Ｍｅｔ　ｔａｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｓｎし川Ｖａｌ　ｃｌｕ　 Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｈ１ｓ１ｍ明は当然のことながら、特に以下のようなアミノ酸 配列を示す「アンカーペプチド」を備え（又はこれにより延長された）ポリペプ チド■、■、及びＨｌ　（又は上述の条件下でこれらから誘導されたポリペプチ ド）にも関する： Ｔｒｐ−５＠ｒ−Ｐｈａ−ＡＩＩｎ−Ｔｒｐ−５＠ｒ−Ｉａｕ−Ｔｒｐ−ＰｒＯ −５＠ｒ−Ｌａｕ−５＠ｒ−ＧＩＹ−Ｍａｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ａｌｙ −Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｐｈｅ−Ｌｓｕ−ＬＩ＠ｕ−シｕ−Ｖａｌ−Ｌａｕ−Ｃｙｔ ｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｍ−ＬＹＩＩ−Ａｌａ−５＠ｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ １ｍ−Ｐｒｏ−＾ｇｎ−Ｔｙｒ−Ｇ１ｙ−Ｘ　ｌｍ−Ｐｒｏ−Ｎｅｔ−Ｇｌｎ− Ｇｌｎ−Ｐｈａ−５＠ｒ−Ａｒｑ−９＠ｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−ｖａ１得られた組 換え型免疫原性ペプチド内のこの「アンカーペプチド」の存在は、特に、この免 疫原性組換え型ポリペプチドの表現を得るために、宿主細胞の表面での免疫原性 配列の露出及びアンカーペプチドを介してのこの細胞の膜内へのその定着を許容 する条件の下での宿主細胞の外側膜の方へのｃＤＮＡの表現生成物の輸送を促進 する形で選ばれた構成要素すなわち一方ではベクター他方では宿主細胞、場合に よっては、さらに免疫原性ポリペプチド及びそれに結びつけられたアンカーペプ チドについてコード化するｃＤＮＡに結びつけられた核酸配列を有する１つのベ クター−宿主細胞系を利用することを考えている場合に、有利である。このよう なベクター宿主細胞系の例としては、宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母で構成され、ベクターは表現プラスミドで構成されて おり、しかも、酵母内の機能的複製起点（２μ又はＡＲＳ）、その選択を可能に する遺伝子（Ｉａｕ２．Ｕｒａ３又はＴｒｐｌ）ならびに酵母のプロモータ（Ｇ ＡＰＤＨ。

ＡＤＨｌ又は２．Ｇａ１ｌ）例えばＰＡＡＨ５が含まれていることを特徴とする システムを挙げることができる。プロモータの下流には、アンカー配列だけ延長 されたポリペプチドＩに相当するヌクレオチド配列を挿入する。シグナル配列が 、細胞内で合成されたポリペプチドを小胞体、ゴルジ体その次に外膜の方へと導 かなくてはならないか、或いはまたアンカー配列がこのポリペプチドを固定状態 に維持しな（ではならないことになる。

同じような考え方で、免疫原性組換え型ペプチドは内因性のシグナルペプチド配 列、特に以下のアミノ酸配列／Ｖからなるものに結びつけられた状態にある可能 性がある。

Ｍａｔ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｐｈｅ−Ｌａｕ−Ｖａｌ− Ｉ　ｌｍ−ｌＡｕ−工１ａ−ｘｌａ−１１＊（ｌｍ−Ｌｙｉ−５ｓｒ−Ｔｈｒ− Ｔｈｒ−Ｐｒ。

本発明は同様に、複合体が　ｉｎ　ｖｉｖｏ　で抗ＶＨ３中和抗体の生成を誘発 できるために充分な分子量を有する１つのキャリア分子（天然のタンパク質又は 合成ポリペプチド）に場合によって結合された形で前記免疫原性組換え型ポリペ プチドを含むワクチン化合物にも関する。

組換え型ポリペプチドが、抗ＶＨＳ中和抗体の生成を！生応ユ誘発するのに充分 な分子量を有する場合、これをキャリア分子に結合させる必要はない。

本発明の特に有利な態様によると、規定されているワクチンの有効成分は、経口 、腹腔内又は浴療法にて投与可能である。

経口投与できる場合、この有効成分は、特にワクチン接種栄養物１ｇあたり１０ ｎｇから１００μｇ、特にｌμｇから５μｇを構成する。

腹腔的投与できる場合、この有効成分は、魚１ｇあたりｌｎｇから１１０００ｎ 、特にＬｏｎｇから５０ｎｇ、有利には７ｎｇから１０ｎｇを構成する。

最後に有効成分は、１ｍｌあたり１０ｎｇから１００μｇを含む媒質内での浴療 法によって又はシャワーにより（この場合溶液は好ましくは１０倍濃い有効成分 濃度を有する）投与可能である。

浴療法による投与のためには、ワクチン化合物には、有利には、ポリペプチドエ が含まれている。

もう１つの実施態様によると、本発明に基づくポリペプチドはそのペプチド構造 の中に、以下の核酸（１）によりコード化されたアミノ酸連鎖の全部又は一部を 含んでいる： ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＡＣＣＴＧＧ　ＡＴｒ　ＣＡＡ　ＧＴＣＣＧＧ　ＴＧＡ　ＣＡ Ｔ　ＣＴＣＧＣＡ　ＴＡＧ　ＡＧＧＣＣＡ　ＡＧＡ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　 ＣＴＣＣＣＡ　Ｔ’ｒＡ　ＧＡＣＡＴＧ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＡ　ＣＴＴＡＣ Ｔ　ＡＴＧ　ＧＴＣＣＧＴ　ＴＣＡ　ＴＡＴ　ＴｒＧ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＣＣ ＡＣＧ　ＴｒＧ　ＧＡＧ　ＧＧＡＡＡＣＧＣＣＡＣＣＧＣＧ　ＡＧＡ　ＡＧＣＴ ＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＣＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＴＣＣＴＣＣＡＧＴ　ＣＴＧ　 ＧＡＣＣＴＴ　ＡＣＧ　ＧＧＣＡＧＧ　ＣＧＡ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣ Ａ　ＡＴＣＧＴＧＣＣＧ　ＴＣＧ　入ＡＧ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＴＡＧ　ＧＣＡ　 Ｔ’ｒＣＣＣＣＣＡＡ　ＧＧＧ　ＡＣＣＣＧＡ　ＡＧＣＧＣＡ　ＧＡ’ｌ”　Ｃ ＴＧ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＴＣＣＧＡＣＣＴｒ　ＧＧＴ＾ＧＡ　 ＣＣＧ　ＡＡＡＧＧＡ　ＣＴＧ　ＡＣＣＣｋＧ　ＧＴｒ　ＴＧＡ　ＧＡＣＣＡＣ ＡＣＴ　ＣＴＣＡＴＴ　ＡＧＡ　ＴＡＧ　入ＡＡＡＡＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡ Ｔ　ＴｒＧ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＡＧＡ　ＣＣＣＡＣＡ 　ＡＴＧＧＡＡ　ＴＧＧ　ＡＡＣＡＣＴ　ＴＴｒ　ＴＴＣＴｒＧ　ＧＴＧ　ＡＴ ＣＴＴＧ　ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＧ　ＡＧＣＡＣＣＡＣＡ　ＣＣＡ　Ｃ ＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　ＣＣＧ　ＧＴＣＧＡＡＡＡＣＡ ＴＣＴＣＧ　ＡＣＧ　ＴＡＣＣＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＴＧＧ　ＧＡＣＡＣＴ　Ｃ ＣＧ　ＣＴＡ　ＴＡＣＡＣＴ　ＣＡＴ　ＣＣＣＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧ　ＧＡ ＣＧＡＴ　ＴＣＣＴＴＴ　ＧＴＣＣＣＧ　ＡＴＴＣＧＡ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＣＡ Ａ　ＣＴＣＡＧＧ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　Ｔ’ＩＴ　ＧＡＡ　ＧＡ ＣＡＴＡＡＡＣ入ＡＧ　ＧＧＡ　ＣＴＣＧＴｒ　ＴＣＣＧＴＣＣＣＡ　ＡＣＣＡ ＧＧ　ＡＴＣＡＴＣＣＡＴ　ＣＴＣＣＣＧ　ＣＴＡ　ＴＣＧ　ＧＴＣＡＣＣＡＧ ＣＧＴＣＴＣＣＧＣＡ　ＧＴｋ　ＧＣＧ　ＡＣＴ　ＧＧＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧ　 ＣＡＣＡＧＡ　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＴｋＴ　ＣＧＡ　ＧＴＣＡＣＣＴＧＴ　ＴＣＧ 　ＡＣＣＡＧＣＴＴＣ’ｆｆｒ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＣＡＡ　ＡＣＣＡＴＣＣＡＡ 　大入Ｇ　ＡＣＣＡＴＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＣＧ入入へ人ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＧ Ｔ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＣＡＣＡ　ＧＡＣＧＡＧ　ＧＣＡ　ＡＧＣ入＾Ｇ　Ｇ ＡＴＣＡＣＧＡＧ　ＴＡＣＣＣＧ　ＴＴＣＴＴＣＣＣＴ　ＧＡＡ　ＣＣＣＴＣＣ ＴＧＣＡＴＣＴＧＧ　ＡＴＧＡＡＡ　入ＡＣ入ＡＴ　ＧＴＣＣＡＴ　ＡＡＧ　Ｇ ＡＣＡＴＡ　ＡＣＴ　ＣＡＣＴＡ’ｒ　ＴＡＣ入ＡＧ　ＡＣＣＣＣＡ　へ人入　 ＡＣＡ　ＧＴ’Ａ　ＴＣＧ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧ　大入 Ａ　Ｔ’ｒＴ　ＣＴＣＴＡＣＣＣＴ　ＧＡ’ｒ　ＴｒＣＡＴＡ　ＧＡＧ　ＧＧＧ 　ＧＴｒ　’ｒＧＣＡＣＡ　ＡＣＣＴＣＧ　ＣＣＣＴＧＴＣＡ入　ＡＣＴ　ＣＡ Ｔ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＧＴＣＴＡＴ　ＴＧＧ　ＧＴＣＧＧＴ　ＧＣＣＡ ＣＡ　ＣＣＴ入入へ人ＧＣＣＣＡ’Ｚ’　ＴＧＣＣＣＣＡＣＧ　ＴＣＧ　ＣＡＡ 　ＡＣＡ　Ｃ’ｒＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＣＡＣＣＴＧＴｒＣＡＣＣＡＧＧ　ＡＣ ＣＣＡＴ　ＧＡＴ　ＣＡＣＡＧＧ　ＧＴＧ　ＧＴＣ入ＡＧ　ＧＣＡ　入ＴＴ　Ｇ ＴＧＧＣＡ　ＧＧＣＣＡＴ　ＣＡＴ　ＣＣＣＴＧＧ　ＣＧＡ　ＣＴＣＡＣＡ　Ａ ＴＧ　ＧＣＡ　ＴＧＣＡＣＡ　ＧＴＧＴＣＡ　ＴＴＣＴＧＣＧＧＧ　ＡＣＡ　Ｇ ＡＡ　ＴＧＧ　ＡＴＣＡＡＧ　ＡＣ’ｒ　ＧＡＣＣＴＧ’　ＧＧＧ　ＧＡＣＣＴ Ｇ　ＡＴＣＣＡＧ　ＧＴＧ　ＡＣＡ　ＧＧＡ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　ＧＧＣＡＣＧ　 ＡＧＧ　ＡＡＡ　Ｃ’ｒＧ　ＡＣＴＣＣＡ　入＾Ｃ入ＡＧ　ＴＧ’ｒ　ＧＴＣＡ ＡＴ　ＡＣＣＧＡＴ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＧ　ＧＣＡＡＣＡ　 ＧＡＣＧＡＣＴＩＴ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＣＴＣＡＡＣＣＡＴ　ＣＴＣＡＴＣＡＣ ＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＣＣＧＡＧ　ＴＧＣＣＴＡ　ＧＡＴ 　ＧＣＣＣＡＴ　ＡＧＴ　ＧＡＴ　ＡＴＣＡＣＣＧＣＴ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＡＡ Ａ　ＧＴＡ　ＴＣＣＴＣＡ　’ＦＩＴ　ＣＴＣＣＴＣＴＣＡ　ＡＡＧ　ＴＴＴ　 ＣＧＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴ　ＧＧＡ　ＣＣＴ　ＧＧＣＡＡＧ　ＧＣＡ　Ｃ ＡＣＴＡＴ　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＣＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　ＣＧＡ　Ｇ ＧＴ　ＧＡＣＴＧＴ　ＧＡＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＴＡ　ＧＴＣＡＧＣＡ ＴＣＡＡＣＴＡＣ入＾Ｔ　ＣＧＣＧＣＴ　ＣＡＡ　ＴＡＣ入ＡＧ　ＡＣＧ　ＡＴ Ｇ　入ＡＣ入ＡＣＡＣＡ　ＴＧＧ　入ＡＡ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　大入Ａ　ＣＧＧ　 ＧＴＡ　ＧＡＣ入λＣ入ＡＣＡＣＡ　ＧＡＣＧＧＧＴＡＣＧＡＴ　ＧＧＧ　ＡＴ Ｇ　ＡＴＡ　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＡＡＡ　ＴＴＧ　ＡＴＣＡＴＣＣＣＧ　Ｇ ＡＣＡＴＣＧＡＡ　ＡＡＧ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＧＴＣＴＡＴ　ＧＡＣＡ ＧＴ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　Ｃ’ｒＣＧＴＴＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＣＣＴＴ　ＧＴＧ 　ＧＡＡ　ＧＴＣα：Ｔ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧＣＡＴＩ’　ＧＴＧ　Ｔｌ’ｒ ＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡ　ＴＣＴ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＣＣＡＣＴ　ＡＡＴ　 ＣＡＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣ入＾ＣＣＴＡ　ＡＴＣＣＣＴ　ＴＣＧ　ＧＡＴ本発明 はさらに上述のポリペプチドについてコード化する核酸、特に上述の核酸（１） の全部又は一部にも関する。

本発明は同様に、上述のポリペプチドについてコード化する核酸、さらに限定的 に言うと以下のヌクレオチド連鎖の全部又は一部を含む核酸（１）；ＴＣＴ　Ｔ ｒＧ　ＧＡＧ　ＡｊＬＡ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＡＣＴ　 ＴＣＧ　ＧＧＡ　ＣＴＣＧＣＡｃＴＡ　ＡＧＡ　ＣＣＣＴＧＡ　Ｔ入入　ＣＡＡ 　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＴＡＧ　ＣＴＧ　入ＡＧ　ＣＡＡ　ＡＧＧＣＣＡ　 ＴＣＴ　ＡＣＣＴＧＧ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　ＧＴＣＣＧＧ　ＴＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴ ＣＧＣＡ　ＴＡＧ　ＡＧＧｃＣ入　ＡＧＡ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＣＴＣＣ ＣＡ　ＴｒＡ　ＧＡＣＡＴＧ　ＧＧＡ　ｃＴｃ　ＴＧＡ　ＣＴＴＡＣＴ　ＡＴＧ 　ＧＴＣＣＧＴ　ＴＣＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＣＣＡＣＧ　Ｔ ＴＧ　ＧＡＧ　ＧＧＡ入＾Ｇ　ＧＣＣＡＣＣＧＣＧ　ＡＧＡ　ＡＧＣＴＡＧ　Ｇ ＧＧ　ＣＡＣＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＴＣＣＴＣＣＡＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＣＣ ＴＴ　ＡＣＧ　ＧＧＣＡＧＧ　ＣＧＡ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＴ ＣＧＴＧＣＣＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＴＡＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＣ ＣＣＣＪＬＡ　ＧＧＧ　ＡＣＣＣＧＡ　ＡＧＣＧＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ 　（１：ｃＴ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＴＣＣＧＡＣＣ’ＩＴ　ＧＧＴ　ＡＧＡ　ＣＣ ’Ｇ　入＾ＡＧＧＡ　ＣＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＴＧＡ　ＣＡＣＣＡＣＡ ＣＴ　ＣＴＣＡＴｒ　ＡＣＡ　ＴＡＣ大入ＡＡＡＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　 ＴｒＧ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＡＧＡ　ＣＣＣＡＣＡ　Ａ ＴＧＧＡＡ　ＴＧＧ　大入ＣＡＣＴ　ＴＩＴ　ＴｒＣＴＴＧ　ＧＴＧ　ＡＴＣＴ ＴＧ　ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＧ　ＡＧＣＡＣＣＡＣＡ　ＣＣＡ　ＣＡＧ 　ＡＴＣＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　ＣＣＧ　ＧＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣ ＴＣＧ　ＡＣＧ　ＴＡＣＣＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＴＧＧ　ＧＡＣＡＣＴ　ＣＣＧ 　ＣＩ’Ａ　ＴＡＣＡＣＴ　ＣＡＴ　ＣＣＣＴＣＣ大入ＣＴＧＣＡ（Ｊ　ＧＡＣ ＣＡＴ　’！’ＣＣＴＴｒ　ＧＴＣＣＣＧ　入ＴＴＣＧＡ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　Ｃ ＡＡ　ＣＴＣＡＧＧ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＴＴｒＧ入Ａ五人ＧＡ ＣＡＴＡＡＡＣ入ＡＧ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＣＴＴ　ＴＣＣＧＴＣＣＣＡ　ＡＣＣ ＡＧＧ　ＡＴＣＡＴＣＣＡＴ　ＣＴＣＣＣＧ　ＣＴＡ　ＴＣＧ　ＧＴＣＡＣＣＡ 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ＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴ　ＧＧＡ　ＣＣＴ　ＧＧＣＡＡＧｒ　ＧＣＡ　ＣＡＣ ＴＡＴ　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＣＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　ＣＧＡ　ＧＧＴ 　ＧＡＣＴＧＴｒ　ＧＡＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＴＡ　ＧＴＣＡＧＣＡＴ ＣＡＡＣＴＡＣ入ＡＴ　ＣＧＣＧＣＴ　ＣＡＡＴＡＣＡＡＧ　ＡＣＧ　ＡＴＧ　 ＡＡＣＡＡＣＡＣＡ　ＴＧＧ　ＡＡＡＴＣＡ　ＴＧＧ　大入Ａ　ＣＧＧ　ＣＴＡ ＧＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡ　ＧＡＣＧＧＧ　ＴＡＣＧＡＴ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　Ａ ＴＡ　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＡＡＡ　ＴＴＧ　Ａ’ｒＣＡＴＣＣＣＧ　ＧＡＣ ＡＴＣＧＡＡ　ＡＡＧ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＡＧ’ｒ　ＧＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧＴ 　ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＣＴＣＣＴＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡＡＡＣＣＴＴ　ＧＴＧ　ＧＡ Ａ　ＧＴＣＣＣＴＣＡＴ’　ＣＴＧ　ＡＧＣＡＴＴ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＧＴＣＴ ＣＣＡＡＣＡＣ入入ＣＴ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＣＣＡＧＴ　ＡＡＴ　ＣＡＣＡＴ ＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＡ　ＡＴＣＣＣＴ　Ｔ’ＣＧ　ＣＡＴ或いは又以下の ヌクレオチド連鎖の全部又は一部を特徴とする核酸（３）； ＣＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　ＣＣＧ　ＧＴＣＧＡＡ　ＡＡ ＣＡＴＣＴＣＧ　ＡＣＧ　ＴＡＣＣＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＴＧＧ　ＧＡＣＡＣＴ 　ＣＣＧ　ＣＴＡ　ＴＡＣＡＣｒ　ＣＡＴ　ＣＣＣＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧ　 ＧＡＣＧＡＴ　ＴＣＣＴＴＴ　ＧＴＣＣＣＧ　ＡＴ’Ｔ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＧＣ Ｔ　ＣＭ　ＣＴＣＡＧＧ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　 ＧＡＣＡＴＡ　ＡＡＣＡＡＧ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＧＴｒＴＣＣＧＴＣＣＣＡ　Ａ ＣＣＡＧＧ　ＡＴＣＡＴＣＣＡＴ　ＣＴＣＣＣＧ　ＣＴＡ　’ｆ’ｃＧ　ＧＴＣ ＡＣＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＧＣＡ　ＧＴＡ　ＧＣＧ　ＡＧＴ　ＧＧＣＣＡＣＴＡ ＣＣＴＧ　ＣＡＣＡＧＡ　ＧＴＧＡＣＴ　ＴｋＴ　ＣＧＡ　ＧＴＣＡｃｅ　ＴＧ Ｔ　ＴＣＧ　ＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡ　ＧＧＧ　ＣＡＡＡＣＣＡＴＣＧ ＡＡ　ＡＡＧ　ＡＣＣＡＴＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　Ｔ’Ｃ Ｔ　ＣＧＴ　ＣＡＧＧＡＧ　ＧＣＣＡＣＡ　ＧＡＣＧＡＧ　ＧＣＡ　ＡＧＣＡＡ Ｇ　ＧＡＴ　（ＪＣＣＡＧ　ＴＡＣＣＣＧ　ＴＴＣＴＴＣＣＣＴ　ＧＡＡ　ＣＣ ＣＴＣＣＴ’ＧＣＡＴＣＴＧＧ　ＡＴＧ　入ＡＡ　ＡＡＣＡＡＴ　ＧＴＣＣＡＴ ＡＡＧ　ＧＡＣＡＴＡ　ＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＴ　ＴＡＣＡＡＧ　ＡＣＣＣＣＡ　 ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＴＣＧＧＴＧ　ＧＡＴ　ＣＴ’ＣＴＡＣＡにＣＡＧＧ 　へ人入　Ｔ’ｒＴ　ＣＴＣ入ＡＣＣＣＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣＡＴＡＧＡＧ　ＧＧ Ｇ　ＧＴＴ　ＴＧＣＡＣＡ　ＡＣＣＴＣＧ　ＣＣＣＴＧＴ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　Ｃ ｋＴ　ＴＧＧ　ＣＡＧＧＧＡ　ＧＴＣＴＡＴ　ＴＧＧ　ＧＴＣＧＧＴ　ＧＣＣＡ ＣＡ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＧＣＣＣＡＴ　ＴＧＣＣＣＣＡＣＧ　ＴＣＧ　ＧＡＡ　 ＡＣＡ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＣＡＣＣＴＧ　ＴＴＣＡＣＣＡＧＧ　Ａｃｅ 　ＣＡＴＧＡＴ　ＣＡＣＡＧＧ　ＧＴＧ　ＧＴＣＡＡＧ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＧＴ Ｇ　ＧＣＡ　ＧＧＣＣＡＴ　ＣＡＴ　ＣＣＣＴＧＧ　ＧＧＡ　ＣＴＣＡＣＡ　Ａ ＴＧ　ＧＣＡ　ＴＧＣＡＣＡ　ＧＴＧ　ＡＣＡ　ＴｒＣＴＧＣＧＧＧ　ＡＣＡＧ ＡＡ　ＴＧＧ　ＡＴＣＡＡＧ　ＡＣＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＧＡＣＣＴＧ　 ＡＴＣＣＡＧ　ＧＴＧ　ＡＣＡＧＧＡ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　ＧＧＣＡＣＧ　ＡＧＧ 　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣＡＡＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣＡＡＴ　Ａ ＣＣＧＡＴ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＧＧＧ　ＧＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＣ ＧＡＣＴＴＴ’　ＴＣ”ｒＴＡＴ　ＣＴＣＡＡＣＣＡＴ　ＣＴＣＡＴＣＡＣＣＡ ＡＣＡＴＧ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＣＣＧＡＧＴＧＣＣＴＡ　ＧＡＴ　Ｇ ＣＣＣＡＴ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＡＴＣＡＣＣＧＣＴ　ＴＣ’ｒ　ＧＧＧ　ＡＡＡ 　ＧＴＡＴＣＣＴＣＡ　ＴＴＴ　ＣＴＣＣＴＣＴＣＡ　ＡＡＧ　ＴｒＴ　ＣＧＴ 　ＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴ　ＧＧＡＣＣＴ　ＧＧＣＡＡＧ　ＧＣＡ　ＣＡＣＴ ＡＴ　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＣＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　ＣＧＡＧＧＴ　Ｇ ＡＣＴＧＴ　ＧＡＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＴＡ　ＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡ ＣＴＡＣＡＡＴＣＧＣＧｃＴＣＡＡ　ＴＡＣＡＡＧ　ＡＣＧ　ＡＴＧ　ＡＡＣＡ ＡＣＡＣＡ　′ｒＧＧ　ＡＡＡ　ＴＣＡ　ＴＧＧＡＡＡ　ＣＧＧ　Ｇ’！’Ａ　 ＧＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡ　ＧＡＣＧＧＧ　ＴＡＣＧＡＴ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　Ａ ＴＡ’ｌ？Ｔ　ＧＧＧ　ＧＡＣＡＡＡ　’ｐｒＧ　ＡＴＣＡＴＣＣＣＧ　ＧＡＣ ＡＴＣＧＡＡ　ＡＡＧ　ＴＡＴ　ＣＡＧＡＧＴ　ＧＴＣＴＡＴ　ＧＡＣＡＧＴ　 ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＣＴＣＧＴ’ｒ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＣＣＴ’ｒ　ＧＴＧＧ 入五人入ＧＴＣＣＣＴ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧｃ　ＡＴ’ｒ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　 ＧＴＣＴＣＣ入ＡＣＡＣＡ　ＴＣＴＧｋＴ　ＣＴＴ　ＴＣＣＡＣＴ　ＡＡＴ　Ｃ ＡＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＡ　ＡＴＣＣｃＴ　ＴＣＣ或いは又以下のヌ クレオチド連鎖の全部又は一部を特徴とする核酸（４）； ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　ＧＡＣＴＧＴ　ＧＡＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＴ Ａ　ＧＴＣＡＧＣＡＴＣ入ＡＣＴＡＣＡＡＴ　ＣＧＣＧＣＴ　ＣＡＡ　ＴＡＣ入 ＡＧ　ＡＣＧ　ＡＴＧ　ＡＡＣ入ＡＣＡＣＡ　ＴＧＧ　ＡＡＡＴＣＡ　ＴにＧ　 ＡＡＡ　ＣＧＧ　ＧＴＡ　ＧＡＣ＾ＡＣ入＾Ｃ＾ＣＡ　ＧＡＣＧＧＧ　ＴＡＣＧ ＡＴ　ＧＧＣＡＴＧ　ｋＴｋ　ｆｆｒ　ＧＧＧ　（：入ＣＡＡＡ　ＴＴＧ　ＡＴ ＣＡＴＣＣＣＧ　ＧＡＣＡＴＣＧＡＡ　入ＡＧへ人丁　ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＧＴＣ ＴＡＴ　ＧＡＣＡＧＴ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＣＴＣＧＴＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡ ＣＣＴｒ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＧＴＣＣＣＴ　ＣＡＴ或いは又以下のヌクレオチド 連鎖の全部又は一部を含む核酸（５）； ＴＣＴ　ＴｒＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＴＩ’Ｇ 　ＡＣＴ　’ｒＣＧ　ＧＧＡ　ＣＴＣＧＣＡＧＴＡ　ＡＧＡ　ＣＣＣＴＧＡ　Ｔ ＡＡ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＴＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＡＡ　Ａ ＧＧＣＣＡ　Ｔｌ？ｒ　ＡＣＣ’ｆ’ＧＧ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　ＧＴＣＣＧＧ　Ｔ ＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＧＣＡ　ＴＡＧ　ＡＧＧＣＣＡ　ＡＧＡ　ＡＧＴ　ＡＣＡ 　ＣＣＡ　ＣＴＣＣＣＡ　′ｒＴＡ　ＧＡＣＡＴＧ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＡ　 ＣＴＴＡＣＴ　ＡＴＧ　ＧＴＣＣＧＴ　ＴＣＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　ＡＴ Ｇ　ＡＣＣＡＣＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＧＡＡＡＧ　ＧＣＣＡｃｅ　ＧＣＧ　Ａ ＧＡ　ＡＧｃ　’ｆ’ＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＣＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＴＣＣＴ ＣＣＡＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＣ（Ｔｒ　ＡＣＧ　ＧＧＣＡＧＧ　ＣＧＡ　ＡＧＧ　 ＡＣＴ　ＡＣ’ｌ’　ＡＣＡ　ＡＴＣＧＴＧＣＣＧ　’！’ＣＧ　ＡＡＧ　ＡＡ Ｇ　ＡＧＡ　ＴＡＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＣｃＣＣＡＡ　ＧＧＧ　ＡＣＣＣＧＡ　ｋ ＧＣＧＣＡ　ＧＡ’ｒ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＴＣＣＧＡ ＣＣＴｒ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＣＣＧ　入ＡＡＧＧＡ　ＣＴＣＡＣＣＣＡＧ　Ｇ’ ｌ’ｒ　ＴＧＡ　ＧＡＣＣＡＣＡＣＴ　ＣＴＣＡＴｒ　ＡＧＡ　ＴＡＧ　ｊＬＡ ＡＡＡＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＴｒＧ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ 　ＧＣＴ　ＡＣＡ　ＣＣＣＡＣＡにも関する。

本発明は同様に、以上に規定したアンカーペプチドについてコード化するヌクレ オチド配列にも関する。

この配列には、以下のヌクレオチド連鎖（６）の全部又は一部が含まれている； ＴＧＧ　ＴＣＡ　Ｔ’ｒＣＡＡＣＴＧＧ　ＡＧＴ　ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＣＣＡ　Ｔ ＣＪ　ＴＴＡ　ＴＣＴＧＧＧ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧ Ｇ　ＧＣＣ’Ｉ’ｒＣＣＴＴ　ＣｒＡ　ＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣＴＣＴＧＣＴＧＴ　 ＴＧＣＴＧＣＡＡＧ　ＧＣＧ　ＴＣＣｅＣＴ　ＣＯＯＡＴＴ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　 ＴＡＣＧＧＧＡＴｒ　ＣＣＧ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴｒＣＴＣＣＡＧＡ　 ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＣＴＧＡ　ＧＣＡ上述のもののようなシグナル配 列又は本発明の免疫原性ポリペプチドに対し非相同のシグナル配列に結びつけら れた状態で本発明の免疫原性ペプチドについてコード化する配列を結びつける１ つの核酸を使用することは、シグナルペプチドに結びつけられた免疫原性ペプチ ドの表現のために利用されるあらゆるベクター−宿主細胞系において考慮でき（ ただしこのシグナルペプチドが適当に選ばれていることを条件とする）、シグナ ルペプチドの開裂の後、周縁細胞質の方への免疫原性ポリペプチドの輸送ひいて は宿主細胞の培養基内でのその排出を行なうために、シグナルＤＮＡ配列により 提供されうる情報を活用するという宿主細胞、好ましくは、真核細胞の（特に酵 母又はホ乳動物の細胞）の能力が有効に利用されることになる。

上述の条件下で共同で作用しうるこのようなベクター−コンピテント宿主細胞系 のその他の例としては、以下のものが挙げられる。

−シグナルペプチドとして、５ｕｃ２のもの（インベルターゼ）、 −　ベクターとして、例えばｐＡＡＨ５のような表現ベクター、 −宿主細胞として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母、 同様に、本発明には、通常ウィルスから分離された遺伝子内でそれに結びつけら れている翻訳の開始及び終始要素の転写を制御するプロモータを含む調節要素を 含むヌクレオチド配列が前にあるような上述の核酸も含まれている。

本発明に基づ（核酸は化学的方法又はその他の方法によって調製されつる。

本発明の（最大２００個のヌクレオチド−又は２鎖形成の核酸の場合にはｐｂ（ 塩基体（ｂｐ））を含む）核酸の化学的方法による適切な調製様式には、以下の 段階が含まれるニ ー　Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４；　２７４−３２５．１９８ ６年に記載のβ−シアノエチルホスフォアミダイトの自動化された方法を用いる ことによるＤＮＡ合成段階；−適当なプラスミドベクター内でのこのようにして 得られたＤＮＡのクローニング及び適当なプローブとの雑種形成によるＤＮＡの 回収段階。

２００個以上のヌクレオチド又はｂｐ　（２鎖形成の核酸の場合）の長さの核酸 の化学的方法による調製様式には、以下の段階が含まれるニ ー　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０；７４６１−７ ４６５．１９８３年の中に記されている原理に従った天然ポリペプチドのアミノ 酸連鎖と相溶性ある配列をもち、異なる制限部位をその端部に備えた、化学的に 合成されたオリゴヌクレオチドの組立て工程； −適当なプラスミドベクター内での、こうして得られたＤＮＡのクローニング、 及び適当なプローブとの雑種形成によるめる核酸の回収工程。

本発明の核酸は同様に、以下の段階を含む方法によってウィルスのゲノミックＲ ＮＡからも調製できるニ ー　タイブエのＶＨＳの分離物の感染を受けた細胞培養の上澄みの遠心分離及び 、遠心分離沈渣の回収工程； −場合によっては、欧州特許ＥＰ−Ａ−０１３８６６７号に記されている方法に よる、ショ糖勾配上での回収された沈渣の遠心分離工程； −ウィルスを含む勾配の一部分の回収及び遠心分離によるウィルスの再沈降、 −ウィルスの沈渣の再懸濁及びＣｈｏｍｚｙｎｓｋｉ他（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　１６２，１５６．１９８７年）により記されている技法に従ったゲノ ミックＲＮＡの抽出工程；−ＤＮＡ　４．４２９−４３８．１９８５年に記され ている技法に従った不確かな配列をもつオリゴマイニジエータが存在する中での 逆転写酵素によるウィルスのゲノミックＲＮＡと接触したｃＤＮＡストランドの 合成工程； −場合によっては、フェノール／クロロホルム混合物による抽出及びエタノール 沈殿による雑種ＲＮＡ／ＣＮＤＡの純化、 −必要とあらば反応媒質内に存在するタンパク質の抽出後の、Ｇｅｎｅ、２５． ２６３−２６９　（１９１１１３年）内に記されている方法に従った、ポリメラ ーゼ −ＤＮＡ１．ＲＮＡ分離酵素Ｈ及び４デオキシヌクレオチドの存在する中でのｃ ＤＮＡの第２のストランドの製造工程、 −適切なプラスミドベクター内でのこうして得られた核酸のクローニング及び適 切なプローブを用いてのめる核酸の回収工程。

ｍＲＮＡからの本発明の核酸のもう１つの調製方法には、以下の工程が含まれる ニ ーＣｈｏｍｚｙｎｓｋｉ他（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１６２，１５６．１ ９８７年）が記している技法に従っての、細胞１つあたり１０ｕｆｐの多重度で 、タイプ１のＶＨＳウィルスにより１６時間乃至２０時間前から感染を受けてい る細胞培養からの、ウィルス性細胞ＲＮＡの調製工程；−不動化されたオリゴ（ ｄＴ）でのクロマトグラフィに全てのウィルス性細胞ＲＮＡを通すことによるウ ィルス性細胞ｍＲＮＡの回収及び純化工程；−Ｇｅｎｅ　２５；　２６３．１９ ８３年に記されている技術に従っての、純化されたｍ　ＲＮ　ＡからのｃＤＮＡ ストランドの合成工程； −適当なプラスミドベクター内でのこうして得られた核酸のクローニング及び適 当な雑種形成プローブを用いてのめる核配列の回収。

上述の核酸（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）を調製するため には、プローブ１　：　ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＧＣＣプロ ーブ２　：　ＴＴＣＴＴＧ　ＧＴＧ　ＡＴＣＴＴＧ　ＡＴＣプローブ３　：　Ａ ＡＧ　ＡＣＣＡＴＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＣＧプローブ４　：　ＧＡＣＧＧＧ　Ｔ ＡＣＧＡＴ　ＧＧＧ　ＡＴＧプローブ５　：　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＧＡ 　ＧＧＧ　Ｇ（：Ｃといった雑種形成プローブを、以下に上記プローブに関して 示されたものに似た雑種形成条件において、利用することができる。

上述のプローブ毎の配列（１）乃至（６）の特徴づけは、以下の表■に示されて いる表示にに従って行なわれる： 表工 °　配列　１２３４５に の表中、「＋」符号は、プローブと特定の配列の間に雑種形成反応が存在するこ とを示し、「−」符号は雑種形成反応が無いことを示す。

ゲノミックＲＮＡからの核酸調製の枠内で、ｃＤＮＡストランドを合成すること から成る段階は以下の要領で行なうことができるニ ゲノミツクＲＮＡから出発し、５ａｉｋｉ他、５ｉｅｎｃｅ２３９、４８７．１ ９８８年により記された方法を用いる。

特定のプライマを用いることにより請求める核酸配列を特異的に合成することが できる。第１段階は、特定のアンブリマが存在する中での逆転写酵素による相補 的ＤＮＡの第１のストランドの合成である。次にこの一本鎖ｃ　ＤＮＡは、米国 特許第４，６８３，２０２号及び４，６８３，１９５号及び欧州特許第２００， ３６２号の中に記されているＰＣＲ（ポリメラーゼ一連鎖反応）技法により、ポ リメラーゼ−ＤＮＡと連続したサイクルによって増幅される。

特定の配列の獲得は以下のアンブリマーの使用によって保証される。アンブリマ ーｒａＪは逆転写酵素に対するプライマとして役立つものである。全ての配列は ５′−一３′の方向に示されている。

配列１： アンブリマーｌａ：　丁ＣＴ丁ＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＡＧＡ アンブリマー１　ｂ　：　ＡＴＣＣＧＡ　ＡＧＧ　ＧＡＴ　ＴＡＧ　ＧＴＴ　Ｇ ＧＴ配列２： アンブリマー２　ａ　：　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＡＡＣＡＣＴ　ＴＴＴ　Ｔ ＴＣアンブリマー１　ｂ　：　ＡＴＣＣＧＡ　ＡＧＧ　ＧＡＴ　ＴＡＧ　ＧＴＴ 　ＧＧＴ配列３： アンブリマー３　ａ　：　ＧＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　Ｃ ＣＧアンブリマー１　ｂ　：　ＡＴＣＣＧＡ　ＡＧＧ　ＧＡＴ　ＴＡＧ　ＧＴＴ 　ＧＧＴ配列４： アンブリマー４　ａ　：　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　ＧＡＣＴＧＴ　ＧＡＣＴＡ Ｔアンブリマー４　ｂ　：　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＧＡＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧ　ＧＴ Ｔ配列５： アンブリマー１　ａ　：　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　 ＡＧＡアンブリマー５　ｂ　：　ＴＧＴ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＡＧＣＴＴＧ　ＴＴ Ｇ　ＴＧＴ配列６： アンブリマー６　ａ　：　ＴＧＧ　ＴＣＡ　ＴＴＣＡＡＣＴＧＧ　ＡＧＴ　ＣＴ Ｔアンブリマー６　ｂ　（ｇ）　：ＴＣＴ　ＡＴＣＴＡＣＣＴＡ　ＡＧＡ　ＧＡ Ｇ　ＧＡＡアンブリマロｂは、ゲノミックＲＮＡがポリアデニル化されていない ため、ｐｏｌｙＴではない。

こうして得られた配列は、それが期待どおりのサイズを有することを確認するべ くアガロースゲル電気泳動で検査される。次に、これらの配列は、適切なプラス ミドベクター内でクローニングされる。

上述の伝令ＲＮＡからの核酸の調製において、ｃＤＮＡ合或は以下の要領で行な われる：すなわち、伝令ＲＮＡから出発し、５ａｉｋｉ他５ｃｉｅｎｃｅ　２３ ９．４８７１９８８年により記述されている方法を用いる。

特定のプライマの利用により、上述の配列を特異的に合成することができる。第 １段階は、特定のアンブリマが存在する中での逆転写酵素による相補的ＤＮＡの 第１のストランドの合成である。次にこの一本鎖ｃＤＮＡは、ＰＣＲ技術により ポリメラーゼＤＮＡで連続サイクルにより増幅される。

特定の１つの配列の獲得は上述のアンブリマの使用によって保証される。上述の アンブリマｒｂＪは、逆転写酵素に対しプライマとして役立つものである。全て の配列は、５′−一３′の方向に示されている。しかし、伝令ＲＮＡはポリアデ ニル化されているため、アンブリマロｂ　（ｇ）をアンブリマロｂ（ｍ）すなわ ちＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴで置換することが できる。

本発明の核酸１乃至６は同様に、決定すべき核酸配列が内部欠失を受けていない ことを条件として（そうでなければ配列づけをしなくてはならず、電気泳動によ るサイズ測定が目安となりつる）、プローブとして用いられる上述のアンブリマ ロ列を利用して、（ゲノミックＲＮＡ又は伝令ＲＮＡからの）核酸調製の枠内で も印づけされつる。

核酸配列ｌ乃至６のうちの１つを認識するため、プローブとして側面にあるアン ブリマを用いて３回又は４回の雑種形成を行なうが、アンブリマにより用いられ ていない限界を網羅するための以下の３つのプローブを定義づけすることも必要 であるニ ブローブ７　：　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＡＧＣＡＣＣＡＣＡ　ＣＣＡプローブ８　： 　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＣＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＴＣプローブ９　：　ＣＴＧ　ＡＧ ＣＡＴＴ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＧＴＣ上述のアンプリマによる配列１乃至６の認識 は、以下の表Ｈに記されている表示に従って行なわれる。

表■ 雑種形成　＋　＋−− 配列 １　１ａ　ｌｂ　６ａ ２　２ａ　ｌｂ　５ｂ　６ａ ３　３ａ　ｌｂ　７　６ａ ４　４ａ　４ｂ　８　９ ５　１ａ　５ｂ　２ａ ６　６ａ　６ｂ　ｌｂ この表において、「＋」符号は、プローブと一定の配列の間に雑種形成反応が存 在することを示し、ｒ−Ｊ符号は雑種形成反応が無いことを示す。

免疫原性ポリペプチド場合によっては同様にシグナルペプチド及び／又はアンカ ーペプチドについてコード化する核酸配列が、通常ウィルス遺伝子の中で自らに 結びついている調節要素に対して非相同である調節要素と、さらに限定的に言う と生産確保のため選ばれた宿主細胞内での表現を調節するよう適合させられた調 節要素と組換えられているような組換え型核酸も、本発明の一部を成す。

特に本発明は、その複製にとって可欠なその部位のうちの１つで組換え型免疫原 住ポリペプチドに対しコード化する核酸によって変更されたこのタイプの組換え 型ベクター、プラスミド、コスミド又はファージに関する。

この組換え型ベクターはこうして、先行する非相同ＤＮＡが複製自律システムを 構成するかぎりにおいて、この先行する非相同ＤＮＡによって形成されつる。

特定の１組換え型ベクターは、それが１７７８番という番号で１９８８年７月８ 日にパリのパスツール研究所国立微生物寄託所（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔ ｉｏｎａｌｅ　ｄｅＣｕｌｔｕｒｅ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ　Ｃ Ｎ　ＣＭ　）に預託されたプラスミド−ＰＳＨＶ−Ｇｌで構成されていることを 特徴とする。

本発明の特定の一実施態様においては、上述の組換え型ベクターは、その複製に とって可欠なその部位のうちの１つにおいて、本発明のアミノ酸配列に対しコー ド化する核酸の宿主細胞内での表現を促進するために必要な要素、この宿主細胞 と相溶性あるプロモータ特に誘発性プロモータ及び場合によっては膜性シグナル 配列及び／又はアンカー配列を含む表現ベクターである。

プロモータ、シグナル配列及びアンカー配列の選択は、選ばれた表現システムの 性質に応じて決定される。Ｅ、　Ｃｏ１１における本発明に基づくアミノ酸配列 の表現に適した特定の１組換え型ベクターは、その複製にとって可欠な一部位に それ自体β−ガラクトシダーゼの全部又は一部についてコード化する遺伝子の部 位内での上述の核酸の挿入の結果として生じた組換え型ＤＮＡを含み、さらに、 Ｅ、　Ｃｏ１１によりベクター内に挿入された核酸の表現を可能にする要素特に β−ガラクトシダーゼの遺伝子の全部又は一部の表現を可能にする要素を含む。

もう１つの組換え型ベクターは、酵母内での上述の核酸の挿入及びこの酵母内で のこの核酸の表現を可能にする要素を含んでいることを特徴とする。

その他の真核細胞を、本発明の核酸を含む組換え型ベクターを挿入する目的で選 択することもでき、この選択は、前記核酸の表現を組織するというこの真核細胞 の能力により方向づけされる。

本発明はさらに、前記微生物内で複製できしかも宿主内での本発明の組換え型免 疫原性ペプチドについてコード化する核酸配列の表現を可能にする調節要素を含 むベクターである上述のような組換え型ベクターによって形質転換された宿主細 胞にも関する。

好ましい第１の宿主細胞は、前述のような組換え型ベクターにより、有利には前 述の融合タンパク質の１つについて、特にβ９−ガラクトシーゼ又は前述のアミ ノ酸配列の１つ又はこれを含む前述の配列の１つに結びつけれられたβ−ガラク トシダーゼの１フラグメントについてコード化するＤＮＡを含む組換え型ベクタ ーによって形質転換されたＥ、　Ｃｏ１ｔからなる。

本発明の枠内に入るその他の宿主細胞は、プラスミド−２μから誘導された組換 え型プラスミドによって形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ又は、２μから誘導された組換え型プラスミドにより形質転換され たＨａｎｓｅｎｎｕｌｌａ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａといった、相応する適切４な 組換え型ベクターにより形質転換された酵母である。

特に２μ、から誘導された組換え型ベクターにより形質転換されたＡｓ　ｅｒ　 １ｌｌｕｓ　Ｎｉ　ｅｒといった線状キノコなどのその他の宿主細胞を利用する ことも可能である。

本発明は同様に、全体的に標識づけされかつ上述のＤＮＡ　（１）乃至（６）の ストランドの１つの中に含まれた核配列をもつ相補的ＤＮＡのストランドとの雑 種形成により、Ｖｆ（Ｓによるウィルス感染をもつ疑いのある面からの腎臓その 他の器官から分離された細胞といった、特に細胞の生物学的標本の中のウィルス 性ＲＮＡを検出するために使用可能なプローブをもその目的としている。

これらのプローブは、それ自体既知のものであるあらゆる方法により標識付けさ れつる（放射線、酵素、蛍光などによる標識付け）。

ウィルス性ＲＮＡを検出するのに利用可能なプローブの例としては、以下の核酸 配列を挙げることができる： 入ＣＧ　’！ＴＧ　ＧＡＣＧＣＡ　へ人Ｇ　ＧＣＣＧＡＣＴＧＧ　ＧＡＣＡＣＴ 　ＣＣＧ　ＣＴへ人ＣＣＴＣＣＴＧＣ入’ｊ’（ｍ　ＴＧＧ　λＴＧ入入へ人Ａ ＣＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＧＧ　Ｇ入ＣＧＡＣλ入Ｃへ人ＣＡＣ入　Ｇ入ＣＧＧＧ ＴＴＣｅｒｒ　ＣＴＡ　ＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣＴＣ本発明に基づ（プローブは、最 大２００ｂｐを含む本発明の核酸の調製に関して示されたように、化学的方法で 調整可能である。

ウィルス性ＲＮＡを検出するためのこれらのプローブは、特に次のように用いる ことができる。

場合によって感染を受けた面からの腎臓その他の器官の細胞又は疑わしい水から のポリエチレングリコールで沈殿させたウィルスを、例えば以下の例Ｉに示され ているように、ウィルス性ＲＮＡに使用中のプローブがアクセス可能となるよう に予め処理する。

こうして放出された標的ＲＮＡを含む調製物を、２ＸＳＳＣの内で例えばニトロ セルロース膜上に置き真空下８０℃で２時間の加熱により膜上に固定させる。

次の条件下で予備雑種形成を行なう：即ち、３Ｍの塩化テトラメチルアンモニウ ム、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＡ、ｐＨ８，０，２ｍＭのＥＤＴＡ、１１００ｕ ／−の子牛の胸腺の超音波処理及び変性を受けたＤＮＡ、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒ ｄｔの緩衝液を含む予備雑種形成媒質内での５６℃、１６時間の処理。

−いわゆる雑種形成は以下の条件下で、同じ緩衝液内で行なう： 約１１００ｐの１つのプローブ又は上述プローブの混合物を用いて、同じ温度で １時間の処理。

次に以下の条件下で洗浄を行なう： ・室温で２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ内で５分、・５９℃で５ＸＳＳＣ，０，１ ％ＳＤＳ内で５分、・５９℃で１時間、Ｄｅｎｈａｒｄｔも子牛のＤＮＡも無し で、上述の雑種形成緩衝液内で２回。

同様に、ウィルス性ＲＮＡを検出するため、最近著された増幅方法（５ａｉｋｉ 他、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．４８７．１９８８年）を用いることができる。こ の場合、一本鎖ＤＮＡのプライマ（２０−ｍａｒ）は異なる２つの符号のもので ある。第１のものは、逆転写酵素によるＤＮＡの相補的ストランドの合成を始動 するような形でウィルス性ＲＮＡに対し相補的である。第２のプライマはウィル ス性ＲＮＡと同じ符号をもち、従って、合成されたＤＮＡに相補的である。理想 的には２つのプローブは、約１００の塩基対だけ離れている。これらの必要条件 を満たす２つのプライマ対は以下のとおりである： Ｉ　、５　”　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＡＴＣＴＴＧ　ＡＴＣＡＴＣＡ３　′５　′Ａ 　ＧＧＡ　ＡＴＣＧＴＣＣＣＴ　ＧＣＡ　ＧＴＴ　３　′ｎ　、　５　′ＧＡＣ ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＴＡ　ＧＴＣＡ３　′５　′Ｇ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　 ＣＡＡ　ＴＴＴ　ＧＴＣＣＣＣ３′上述の配列の各々のそれぞれの相補的核酸配 列は、生物学的標本内のｍＲＮＡの検出のためのプローブとして用いることがで きる。

同様に、疑いのある水の中のウィルスの存在を追究することもできる。例えば１ ０リツトルの水を、限外ろ過により１００ｍ１’にまで濃縮し、その後ポリエチ レングリコールでウィルスを沈殿させる。

プローブ自体は当然、点とはいわないまでも局所的な突然変異をひき起こすこと ができる。従って、本発明には、特に後でｒ４／ＶＨＳウィルスのｃＤＮＡを保 有する組換え型クローンの識別」という副題で例工において説明する条件の下で 、上述のｃＤＮＡのうちの少なくとも１つと雑種形成するかぎりにおいて、この ように変更されたプローブも含まれる。

本発明は同様に、免疫原性組換え型ポリペプチドに対して導かれた抗体特にモノ クローナル抗体にも関する。

抗体の調製方法には、以下の段階が含まれるニー　上述のポリペプチドを用いた 被験動物の免疫処置段階、及び −従来の技術に従って形成された抗体の回収段階。

ハイブリドーマが分泌したモノクローナル抗体は古典的なものとなった技術によ り得られ、ポリペプチドＩのＶＨＳ血清中和特性が発現するために必要であるそ の存在が前述のように認識されることになるエピトープを認識するという生成さ れたモノクローナル抗体の適性に応じて選択される。

本発明のその他の特徴及び利点は、以下の例及びこれらの例を示す図の中で明ら かとなるだろう。

例工：ウ　ルス　ウ　ルスの ＤＮＡ　ｃＤＮＡ　、ＡＲＮＡ　ｍＲＮＡとも　げ江盈ＬΩ】１ １）細胞培養： Ｅ　Ｐ　Ｃ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ　ｐａｐｕｌｏｓｕｍ　ｃｙｐｎｉｎｉ　 ）系統（Ｆｉｊａｎ、　Ｎ、他、Ａｎｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　１３４Ｅ、　２０７ ．１９８３年に記されているもの）を、３００，０００／ｃｍ”の細胞密度にな るまでアミノ酸、ビタミン及びリン酸トリプトースで補完したＭＥＭ　（最小必 須培養液）　（Ｇｉｂｃ。

０７２１５００）の中で、Ｋｉｎｋｅｌｉｎ、　Ｐ、他（Ｄｅｖｅｌｏｐ。

Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄ　４２．９９．１９７８内で報告されている）の方法に 従って３０℃で培養する。この培養は、細胞あたり１０ピリオンの割合でタイプ ■のＶＨＳウィルス粒子（Ｌｅ　Ｂｅｒｒｅ、　Ｍ、他、Ｂｕｌｌ、　Ｏｆｆ、 　Ｉｎｔ、　Ｅｐｉｚ、　８７３９１、１９７５年）の感染を受けている。この ような条件の下で、ウィルス感染の通常の経過は、４８時間後の細胞の溶解なら びにウィルス粒子の塩析により特徴づけされる。ＶＨＳウィルスの特徴的な伝令 ＲＮＡを大量に得るため、感染を２０時間後に中断する。

ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ、他の方法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ。

庄、　１５６．１９８７年）により１３５，０００，０００個の細胞から調製す る。

２）二二笠へ二１１ 細胞培養によって形成された薄層をＰＢＳ１５ｉｄを用いて洗い流し、浮遊分を 吸い上げ、その後変性溶液（溶液Ｄ、チオシアン酸グアニジウム４Ｍ、クエン酸 ナトリウム２５ｍＭ、サルコシル０，５％、β−メルカプトエタノール０．１Ｍ ）１５１Ｒ１を用いて細胞を溶解させる。この混合物を滅菌した管に移す、それ から、各試薬を付加した後逸さにしゆっくりと撹拌しながら連続的にこれに対し て１．５−の酢酸ナトリウム２Ｍ、１５−のフェノール、３−のイソアミルアル コール／クロロホルムを加える。ここで混合物を氷上で１５分分間中し、次に４ ℃、１０，０００ｇで２０分間遠心器の中に置く。

水相（上部相）を、ＤＮＡ及びタンパク質がある上部相及び中間相から分離させ る。次に１体積のインプロパツールを加え、１時間以上−２０℃に放置する。

その後４℃、１０，０００ｇで２０分間遠心分離させる。それから浮遊分を除去 し、ＲＮＡの沈渣を溶液Ｄ０．７−の中で再度懸濁させ、その後滅菌したＥｐｐ ｅｎｄｏｒｆ管の中に移しここで一２０℃で１時間１休積のインプロパツールを 用いて沈殿させる。

遠心分離の後、ＲＮＡを最小量の水の中で溶解させる。

ｍＲＮＡオリゴ−ｄＴセルロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰＬ７　）上で 純化させた。全細胞ＲＮＡ溶液を、０．５ＭのＮａＣｊ２．２０ｍＭのＴｒｉｓ −ＨＣｆｆ（ｐＨ８）及び１０ｍＭのＥＤＴＡという緩衝液の中に通す。次にカ ラムを同じ緩衝液で洗い、その後、０．１Ｍ　ＮａＣρ、２０ｍＭのＴｒｉｓ− ＨＣρ　（ｐＨ８）及び１０ｍＭのＥＤＴＡの混合物で洗う。最後に、ポリアデ ニル化されたＲＮＡを純水内で切り離す。感染した細胞１３５，０００，０００ 個からのウィルス性細胞ｍＲＮＡの純化の収量は３５μｇである。

３）二二笠へ二塗羞： ｃＤＮＡはＢｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　ｍａｎｎｈｅｉｍキットを用いて　（ｃＤＮ Ａ　合　成　キ　ッ　ト　ｃａｔ、ｎ’１０１３８８３）　、　Ｇｕｂｌｅｒ　 Ｕ、他（Ｇｅｎｅ　２５．２６３゜１９８３年）の方法により純化されたｍＲＮ Ａ８ｕ４から合成した。

得たｃＤＮＡをセファロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）上でクロマト グラフに付し、ｌｋｂ以上の長さの分子を含む分画を、１４℃で１６時間Ｔ４の リガーゼ一単位が存在する中で結紮緩衝液（Ｔｒ　ｉ　ｓ−ＨＣｕ２０ｍＭ、ｐ Ｈ７，６、Ｍ　ｇ　Ｃ４２ｚｌｏｍＭ、ジチオスレイトール１０ｍＭ、、　ＡＴ Ｐ　１ｍＭ）１０μ中で、プラスミドｐ　Ｕ　Ｃ１３（ＰｈａｒｍａｃｉａｐＵ ｃ１３　Ｓｍａｌ　Ｂａｐ）のＳｍａ１部位に挿入した。プラスミドｐＵｃ１３ はアンピシリン抵抗性の決定因子を有していることからＡｐＲ（アンピシリン抵 抗性）クローンを得る目的で、プラスミドを形質転換により他、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　Ｐ、　２５０．１９８２年）。

ウィルスのｃＤＮＡを保有する組換え型クローンを、ニトロセルロースフィルタ ー上で複製されたＡｐＲコロニー上での雑種形成によって追求した（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ　ｏｐ、　ｃｉｔ、　３１３．３１５．３２６．３２８）。

３２Ｐで標識づけされたＶＨＳウィルスの感染を受けた細胞のＲＮＡから作られ たＤＮＡプローブとレプリカを雑種成形させる。８μの水に入った１〜２、悶の ＲＮＡを１００℃で３分間加熱し次に氷上で冷やす。

この段階に関係する雑種形成条件は、以下のとおりであるニ ー　まず最初に、５ＸＳＳＣ１５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％ＳＤＳ、１０ ０μｇ／−のサケ精液ＤＮＡから成る緩衝液の中で３７℃と６８℃の間で４時間 乃至２４時間予備雑種形成を行なう。なお、ｌＸ５ＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ ２．０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐ）１７．０）を含んでいる。

Ｉ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔは、Ｆｉｃｏｌｌ　（１°１００）、ポリビニルピロ リドン（１°１０Ｏ）及びウシ血清アルブミン（１’１００）を含む。

予備雑種形成の後、放射線標識づけしたゾンデを付加しながら同じ媒質内で雑種 形成を行なう。雑種形成は３０分乃至２４時間行なう。

次に、２ｘＳＳＣ，Ｏ，１％ＳＤＳの中で室温にて１５分の洗浄を２回行ない、 次にｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ内で６５℃で１時間の洗浄を行なう。

その後、−７０℃で２時間から１５日間増幅スクリーンを伴うカセット内でフィ ルタの露出を行なう。

プローブの標識付けは、２０４のＴｒｉｓ−ＨＣｊ２５０　ｍＭ、　ｐＨ８、Ｍ ｇＣｌ２．６ｍＭ、ＫＣｊ２４０ｍＭ及びｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰｌｍＭ 、ＲＮａｓｉｎｌｏＵ、、２ｊ４の統計的ヘキサマー及び５０　ｍ１ｃｒｏｃｉ ｅのｄＣＴＰ３２Ｐ　（４００Ｃｉｅ　７ｍＭ）一体積と１０単位の逆転写酵素 の中で４２℃で３０分間行なう。

ＥＤＴＡｏ、２５Ｍ１ｕで反応を停止させる。取り込まれなかったｄＣＰＴ３２ ＰはカラムＧ５０上のクロマトグラフィ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって除去 する。

標識づけされたＤＮＡを含む混合物に対して一定量のＥＤＴＡ（５ｍＭ）及びＮ ａＯＨ（０，１Ｍ）を付加し、次にＲＮＡを除去すべ（６５℃で４０分間加熱す る。その後混合物に対して０．２Ｍのトリスを加え、ＨＣＪ２１Ｍで中和する。

雑種形成は、細胞ＲＮＡからのｃＤＮＡとの雑種形成を制限する形で細胞のＲＮ Ａが７０１４／−存在する中で５０．０００〜１．０００．ＯＯＯｄｐｍ／−の プローブで行なわれる。

第２のレプリカを、感染していない細胞のＲＮＡから作られたプローブと同じ要 領で雑種形成させる。ウィルス起源のｃＤＮＡを含む組換え型クローンは、感染 した細胞のＲＮＡ由来のプローブによってのみ標識付けされることになる。反対 に、細胞起源のｃＤＮＡを含むクローンは、２つのレプリカについて標識付けさ れる０合計して１，６３２のクローンをこのような方法で検査し、ウィルス起源 のものである疑いのある１６４のクローンを識別することができた。

５）ＶＨＳウ　ルスのＧタンパク　のｃＤＮＡをる　え　の−１ ３２Ｐで標識づけされたいくつかの組換え型クローンのインサートをその地金て の組換え体の間の雑種形成を行なうことによって、ならびに感染した細胞又は対 照のＲＮＡのノーザンプロットにより、ｃＤＮＡの下位個体群を識別した。

第１の個体群は、感染した細胞の中にのみ存在する１、６ｋｂの長さの伝令・Ｒ ＮＡを認識する組換え型Ｎ１５４によって特徴づけされる。第１の個体群より量 の少ない第２の個体群は、同様に感染した細胞内に存在する２ｋｂのメツセンジ ャを認識する組換え体に隘７７（プラスミドｐｓＨＶＧ１を特徴とする）により 特徴づけられる。

次の段階では、１６４個の組換え型クローンのプラスミドを純化しくＭａｎｉａ ｔｉｓ　ｏｐ、　ｃｉｔ、　３６８）、プラスミドｐＵｃ１３のクローニング部 位Ｓｍａβの両側に部位がある２つの制限酵素によってインサートを解放させた 。５単位のＨｉ　ｎｄＩＩＩ及び５単位のＥｃｏＲｌを用いて緩衝液Ｍｅｄ　（ Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　１０ｍＭ、ｐＨ７，５ＭｇＣｌ２ｘ　１０ｍＭ、ＮａＣ ＮａＣ１２５Ｏ内で３７℃にて２時間、１０ｄ（０，１〜２悶）を消化させた。

次にフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離させた。サイズが１．５ ｋｂ以上であるいくつかの組換え体のインサートをアガロースから切り取り、Ｚ ｈｕ、　Ｊ、他（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３．１０１４．１９８５年）が 記しているようにＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ膜（ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ）を通して溶 離させ、Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒキット（無作為ブライミングＤＮＡｍｍ付はキッ ト１００４７６０）のプロトコルに従って３２Ｐで標識づけした。

組換え型プラスミド１６４個の各々を２０〜５００ｎｇずつ、ＮａＯＨ０，４Ｍ ％ＮａＣｎ０．６Ｍ内でＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ膜（ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ）上に 置いた。

Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ２ｐＨ７０，５Ｍ％ＮａＣＡ０．６Ｍの混合物の中で膜を 中和し、室温で１時間乾燥させ、次に上述のごとく雑種形成させた。

これと並行して、感染細胞又は対照のＲＮＡ　１０ｕｔを、グリオキサルでの変 性の後にアガロースゲル上で分離させ、ニトロセルロース膜上に移した（Ｍａｎ ｉａｔｉｓ他、ｏｐ、　ｃｉｔ、　２００−２０１）　。

組換え型ＤＮＡインサートから作られたプローブとこれらの膜を雑種形成させた 。

図Ｉは、クローン５４（第１の囲み）、クローン７７（第２の囲み）及びクロー ン５４及び７７（第３の囲み）のインサートで得られた雑種形成を示している。

一方では感染細胞（ｉ）他方では対照細胞（ｃ）に由来するＲＮＡの存在する中 での雑種形成は、感染細胞でしか起こらない。クローン５４は１．６ｋｂの帯を 示し、クローン７７（プラスミドｐＳＨＶＧＩに相応する）は２ｋｂの帯を示す 。

ＩＩ：　５ＨＶＧＩのｃＤＮＡの　１ Ｍ１３ｍｐ１８及びＰＪｉ　１３　ｍ　ｐ　１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒ ｏｎ他「遺伝子」旦、１０３．１９８５年）内でのサブクローニングの後、Ｓａ ｎｇｅｒ他の方法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　？４．５４６３．１９７７年）によ りＤＮＡの２本のストランドについて配列決定を行なった（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ 　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎでのＤＮＡ配列決定のための段階的プロトコル）、配列決定の原理は図■に示 されており、ここで星印付きの矢印はＭ２Ｓの万能プライマを表わし、単なる矢 印はプライマとして用いられた合成オリゴマを表わしている。第１の配列はＭ２ Ｓの万能プライマから得られ、その後、配列中で徐々に近く進捗すべく（１８の 残基から成る）特異的プライマを合成した（ホスホアミジット法、サイクロンＤ ＮＡ合成装置）。

得られたヌクレオチド配列は表■に示されており、ここでは核酸はアミノ酸と対 応させられている。この配列は、残基４２６でＡＴＧコドンで始まる１、５５６ ｐｂのオーブンリーディングフレームを示す。残基４６０にある同相の第２のＡ ＴＧは、その環境ＡＣＡＡＴＧＧが理論上の理想ＡＣＣＡＴＧＧにより近いこと から、生体内で機能的開始コドンでありうる。一方、疎水性プロフィルを研究す ると（図■）、この第２のＡＴＧの後直接開始し５２０の位置で残基Ｐｒｏの後 で印割されるシグナル配列が存在することがわかる。より厳密に言うと、図■は 、前記ヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列の疎水−親水性プロ フィルを表わしている。疎水性部分は第４図に表わされている水平線の上にあり 、親水性部分はこの線の下にある。特に疎水性の高い２つの領域が存在すること がわかる。第１の領域は、タンパク質の成熟時点で印割されるシグナルペプチド に相応する。同様に、親水性領域が存在することも観察できる。

矢印で表わしたのは、シグナル配列の近くにあるもの１つとカルボキシ末端側に ある４つの合計５つの潜在的グリコジル化部位である。

グリコジル化部位は、Ｘを任意のアミノ酸としてＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ −Ｘ−３ｅｒであることを喚起しておく。

ｍ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　の　Ａ　ンバク　の７でのＲｕｔｈｅｒ及びＭｕｌｌ ｅｒ−Ｈｉｌｌ　（ＥＭＢＯｊｏｕｒ、２．　１７９１゜１９８３年）のｐＵＲ ２９０−２９１（一般にｐＵＲｎと呼ばれる）シリーズのプラスミドを用いた。

これにより、多重制限部位（図５）のおかげでＥ、　ｃｏｌｉのβ−ガラクトシ ダーゼの遺伝子の端末部分の中に表現すべきＤＮＡを挿入することが可能となる 。

ｐｓＨＶＧｌのオーブンリーディングフレームは、位置６０４つまり確率ある開 始コドンからアミノ酸４８個分後にＰｓｔ１部位を含んでいる。ｐＵＲ２９０内 への挿入は同相で１つの融合タンパク質を提供し、一方ｐＵＲ２９１では、終止 コドンがアミノ酸１７個分だけ離れて現われる。

５単位のＳａｃ　Ｉ及び５単位のＨｉｎｄ３によりｌｏｗ緩衝液（Ｔｒ　ｉ　５ −ＨＣＩ；ｌ　１０＋Ｍ％ｐＨ７，５、ＭｇＣ１２ｇ１０ｍＭ及びジチオスレイ トール１ｍＭ）２０４中で３７℃にて２時間、ｐｓＨＶＧｌを２μｇ消化させる 。フラグメントを上述のとおりアガロースゲル上で分離させ溶離させる。これと 並行して、ｐＵＲ２９０及びｐＵＲ２９１のそれぞれをｌＩ４ずつ、５単位のＰ ｓｔｌ及び５単位のＨｉｎｄ３によりＭｅｄ緩衝液２０４の中にて３７℃で２時 間消化させる。この反応は、クロロホルム抽出により停止させる。

Ｐｓｔｌ及びＨｉｎｄ３により切断されたｐＵＲ２０ｎｇ、　ｐ　Ｓ　ＨＶ　Ｇ 　１のフラグメントＰｓｔｌＳａｃｌ　Ｌｏｎｇ及び以下のオリゴヌクレオチド ｌｎｇＳａｃｌ　Ｈｉｎｄ ５　′ＧＡＧＣＴ　ＡＧＣＴＴ３　′ ＣＡ ３’ＴＣＧＡ　ＴＣＧＡ５”オリゴヌクレオチドを、１本位のＴ４リガーゼ及び ５単位のポリヌクレオチドキナーゼの存在する中で結紮緩衝液１０μ内で室温に て２時間保温する。これらのプラスミドｐＵＲｎ−ＳＨＶＧＩの構成は図Ｖに報 告されている。

ＡｐＲカラムを得るためＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ８３を形質転換するのに、そのま まの２つの結紮混合物を用いる。

ｐＵＲ２９０−ＳＨＶＧＩ及びｐＵＲ２９１−３ＨＶＧＩの構造は、酵素Ｈｉ　 ｎｄ３、Ｐｓｔｌ、ＥｃｏＲｌ及びｓｐｈ　１による消化によって純化されたク ローンからのミニ調製及びアガロースゲルでの電気泳動の後に、認証される。

０．６〜６５０ｎｍの光学密度になるまで、３７℃で撹拌しながら、ｐＵＲ２９ ０−５ＨＶＧＩを含むクローンを５−の媒質ＬＢ５ｍｌ’内に入れる。このとき 培養（物）をイソプロピン−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１ｍ Ｍまでにし同様の要領で２０時間培養する。その後、細菌を遠心分離し１０分間 １００℃で負荷緩衝液（Ｔｒ　ｉ　ｓＨｃｇ６０ｍＭ、ｐＨ６，８，５ＤＳ２％ グリセロール１０％２−メルカプト−エタノール３％）の中で溶菌させ、ポリア クリルアミドＳＤＳのゲル電気泳動（Ｌａｅｍｌｉ　Ｎａｔｕｒｅ　２２７゜６ ８０、１９７０）に付す。次にタンパク質をニトロセルロース膜上に移す。それ ぞれその天然のコンフォメーション（立体配座）（ＣＩＯ）及びその−次構造（ ＩＩＯ）でＧタンパク質を認識するＥｇｔｖｅｄウィルスの抗Ｇタンパク質モノ クローナル抗体２つによって、又その後ペルオキシダーゼに結合された抗マウス 抗体によって、連続的に、これらの膜を処理する。Ｃ１０及びＩＩＯと呼ばれる 抗Ｇタンパク質モノクローナル抗体は、１９８７年８月のＢｅｒｇｅｎ　（ノル ウニ）大会に続く第３回国際会議抄録「欧州魚病理学者連合」の中で１９８７年 にＢｅａｒｚｏｔｔｉ−ＬｅＢａｒｒｅ及びＫｉｎｄｅｌｉｎにより記述されて いる。形成された抗原−抗体複合体は、着色反応により発見される（Ｔｏｗｂｉ ｎ　Ｈ。

他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６、４３５０． １９７９年）（ＢｉｏＲａｄ　Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋ ｉｔ　ｔｅｃｈｎｉｃａｌｌｉｔｔｅｒａｔｕｒｅ　Ｎｏ、　１２１６）。

同じ手順は、プラスミドｐＵＲ２９１−３Ｉ（ＶＧＩを含むクローンにも適用さ れる。

りｏ−ンｐＵＲ２９０−５ＨＶＧＩ　（図ＶＴ）ニＪ：す作られたタンパク質を 含むチャネル内でのみ２本の着色帯が存在していることは、このプラスミドが、 ＶＨＳのウィルスのＧタンパク質に対し導かれたモノクローナル抗体によって認 識されるアミノ酸配列に対しコード化するｃＤＮＡを含んでいることを立証して いる。

ＩＶ：ＶＨＳウ　ルスのＧタンパク　に・して゛かれたモノクローナル　によっ て８、−されるアミノ１についてコード　る　え斧プラスミドＹＳＨＶＧＩ（７ ） 酵母内のＤＮＡのベクターとしては、含まれているＤＮＡが酵母内で表現される かぎり、いかなるシャトルプラスミド（酵母のＥ、　ｃｏｌｔから得られる）で も使用できる。このベクターは、プラスミド２μの複製起点として酵母内でそれ を維持することのできる要素、又はＴｒｐｌ遺伝子の複製起点としてのＡｒｓを 含むことになる。その上このベクターは、受容菌株内での突然変異を補完しかつ 例えばＬｅｕ２又はＴｒｐｌといった形質転換プラスミドの陽性選択を確実に行 なうことのできるアミノ酸の生合成の遺伝子を有することになる。最後にこのベ クターは、表現すべき遺伝子がその下流に挿入されることになるような誘発性プ ロモータ、たとえばガラクトキナーゼのプロモータ（ｐＧｌ）、アルコールデヒ ドロゲナーゼのプロモータ（ｐ　Ａ　１　）　（Ｍｉｙａｊｉｍａ　Ａ、他、Ｎ ｕｃ、　Ａｃ、　Ｒｅｓ、　１２゜６３９７（１９８４年）又は酸性ホスファタ ーゼのプロモータＥ　ｐＰｈｏ５．　Ｒｉｃｈａｒｄ、　Ａ、その他、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｈ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１．３６７　（１９８４年）］を有すること になる。

５単位のＰｓｔｌと５単位のＨｇ１Ａｌを用いてｈｉｇｈ緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ２．５０ｍＭ、ｐ）＋７．５、ＭｇＣＱ、１０ｍＭ、ＮａＣｇ、１００ｍＭ 、ジチオスレイトール１ｍＭ）２０ｇ７の中で３７℃で２時間、１　Ｍｇのプラ スミドｐＳＨｖＧ１を消化させる。フラグメントをアガロースゲル上で分離し、 約１．５ｋｂのフラグメントＰｓｔｌ−ＨｇｉＡ１を、上述のようにＧｅｎｅｓ ｃｒｅｅｎ上で溶離することによって回収する。

ｌｕ４のベクターｐＳＰ７３プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、５単位のＰｓｔ ｌ及び５単位のＢａｍＨｌで３７℃２時間、上述のｈｉｇｈ緩衝液２０μの中で 消化させる。反応は、クロロホルム抽出により停止させる。

フラグメントＰｓｔｌ−ＨｇｉＡ１　１１００ｎを、白側部位Ｈｇ１Ａ１及びＢ ａｍＨｌを結ぶ目的をもつ以下のオリゴヌクレオチドの存在する中で室温にて２ 時間、１単位のりガーゼと６単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて、１０ｐ Ｊ！の結紮緩衝液内で、ＢａｍＨｌ及びＰｓｔｌにより開放されたプラスミドｐ ＳＰ７３　２００ｎｇと結紮させる：３′ＴＣＧＴ　ＣＴＡＧ５′オリゴヌクレ オチドＣＧ ５′ＧＡＧＣＡ　ＧＡＴＣＣ３’ Ｈｇ１ＡＩ　ＢａｍＨｌ プラスミドｐＳＨＶＧ２をＥ、組旦ＨＢＩＯＩ（Ｊ。

Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　４１４５９１９６９年）内に形質転換によって導入 しコロニーＡｐＲを得る。

プラスミドｐＳＨＶＧ２はコロニーの１つから生成されており、その構造は、酵 素ＥｃｏＲ１，５ｐｈｌ、Ｈｉ　ｎｄ３及びＰｓｔｌによる消化によって確認さ れた。

５単位の５ｐｈｔ及び５単位のＰｓｔｌが存在する中でＭ　ｅ　ｄ緩衝液２０４ 内で３７℃にて２時間、１属のプラスミドｐＳＨＶＧ２を消化させる。フラグメ ントをアガロースゲル上で分離させ、３．２ｋｂのフラグメントを上述のように 回収する。

５単位の５ｐｈｘ及び５単位のＨｇ　ｉ　Ａ　１を用いてｈｉｇｈ緩衝液１００ μの中で３７℃にて２時間、１０μｇのプラスミドｐＳＨｖＧ１を消化させる。

フラグメントをアガロースゲル上で分離し、７００ｂｌ）のフラグメントＳｐｈ ｌ−ＨｇｉＡ１を回収する。

このフラグメントｌ　ｕｇを以下のリンカ−０，１νｇと共に保温する： ＰｓｔＩ　Ｈｉｎｄ３　Ｎｃｏ１ 人人ＡＧＡＧＣＡ　３゜ ＨｇｌＡｌ これは、ＨｇｌＡｌ部位から開始ＡＴＧに至るまでのＥｇｔＶｅｄウィルスのＧ タンパク質の遺伝子の天然の配列を（り返したものである。３つの制限部位が付 加された。すなわち、第１のＡＴＧをカバーするＮｃｏ４２部位、ＨＬ　ｎ　ｄ 　１１１部位そしてＰｓｔｌの粘着末端（コヒーシブエンド）である。

１単位のりガーゼと６単位のポリヌクレオチドキナーゼが存在する中で室温で２ 時間、このフラグメントとリンカ−を保温する。

結紮生成物を、５単位のＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ及び５単位のｓｐｈ　１によりｍ ｅｄ緩衝液中で３７℃にて消化させ、アガロースゲル電気泳動に付し、７６０ｐ ｂの帯を回収する。ｌｏＯｎｇのこのフラグメント５ｐｈｌ−Ｐｓｔｌを、室温 で２時間１単位のりガーゼを用いて１０４の結紮緩衝液中でｐＳＨＶＧｌの３． ２ｋｂのフラグメントＨｉｎｄＩ［［−５ｐｈｌ　２００ｎｇと共に保温する。

次に、コロニーＡｐＲを得るべく　Ｅ、　ｃａｌｆ　ＨＢ１０１を形質転換する ために結紮混合物を用いる。このようなコロニーのプラスミドｐＳＨＶＧ３を抽 出しＥｃｏＲｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｃｏｌ、Ｈｇ１Ａ１．５ｐｈｌ及びＰｓｔ ｌで消化して、構成の正確さを確認する。リンカ−を含む領域を配列決定する。

５単位のＫｐｎ　１及び５単位のＨｉｎｄｍによりＬｏｗ緩衝液中で２Ｊ４のプ ラスミドｐＳＨＶＧ３を消化させる。

この消化の生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、約１．５ｋｂのフラ グメントを回収する。

５単位のＫｐｎｌ及び５単位のＢａｍＨｌによりｌｏｗ緩衝液内で３７℃にて２ 時間、２馬のプラスミドｐ　Ｔ　ＲＰ　５６　（Ｍｉｙａｊｉｍａ、　Ａ、　ｏ ｐ、　ｃｉｔ、）を消化させる。４．５ｋｂのフラグメントをアガロースゲルか ら回収する。

５単位のＢａｍＨｌ及び５単位のＨｉｎｄ３によりｌｏｗ緩衝液内で２１４のプ ラスミドｐ　Ｇ　１　（ＭｉｙａｊｉｍａＡ、　ｏｐ、　ｃｉｔ）を消化させる 。８００ｐｂのフラグメントをアガロースゲルから回収する。

上述の３つのフラグメントをそれぞれ１１００ｎずつ、１単位のりガーゼを用い て結紮緩衝液内で室温にて２時間保温する。この結紮の生成物は、形質転換によ りＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１内に導入する。結果として得られたプラスミド ５ＨＶＧＩの構成の正確さを、Ｋｐｎ　１．５ｐｈｌ、Ｐｓｔｌ、Ｈｉｎｄｍ及 びＢａｍＨｌによる消化及び配列決定により検査した。

プラスミドｐＹＳＨＶＧ１の構成は、図■上に報告されている。

酵母Ｗ３０３−ＩＢの細胞は、ＬｉＣ１での方法［Ｉｔｏ。

Ｈ９他、Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１５３．１６３（１９８３年）］により形質転換さ れ、この菌株の突然変異ＴＲＰ　１のプラスミドｐＹ−ＳＨＶＧ　１による補完 のために選択されたものである。形質転換された酵母は、ウラシル、ロイシン、 ウリジン及びアデニルで２０属／−まで補完されたアミノ酸を含まない最小培養 液ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎｅｂａｓｅ　（Ｄ　Ｉ　ＦＣＯより市販されて いる）上で生育できるものであることがわかった。

プラスミドｐＹ−ＳＨＶＧＩを保有する酵母のクローンを、撹拌しながら３０℃ にて２４時間グルコース２０　ｇ／βを付加した最小培養液２０１１１中で培養 した０次に培養（物）を無菌状態で遠心分離し、Ｇａ１ｌオペレータを誘発する ため、ガラクトース２０ｇ／１２を加えた最小培養液２〇−中で再度懸濁させた 。３０℃で撹拌しながら６時間培養した後、酵母を遠心分離し、４０　ｍＭ、　 ｐＨ７のリン酸塩緩衝液２−中で再度懸濁させた。酵母を５分間ガラス球式分断 器で砕いた。このとき、負荷緩衝液内で細胞のアリコート部分を再懸濁させ、ポ リアクリルアミド−３ＤＳゲルでの電気泳動に付した。ニトロセルロース膜へ移 した後、前述のものと同じモノクローナル抗体により認識されるアミノ酸配列の 存在が立証された。

同様に、Ｇタンパク質の安定性に有利に作用するなめ０℃と３０℃の間有利には １４℃から１７℃までの低い温度で酵母を培養することもできる。又、バイオマ スを容易に累積し誘導に際して温度を低下させるように、導入に至るまで酵母を ３０℃で培養することもできる。

Ｖ　：　ＶＨＳウ　ルスのＧタンパク　に・し゛かれたモノクローナル　によ　 籾・されるアミノを　む　Ａ　ンバク　５ＨＶＧ２７　についてコード　るプラ スミド　Ａ　Ｔ　ＨＤｉｅｃｋｍａｎ　びＴｚａ　ａｚｌｏｆｆ　１９８５　、 　Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｗ、　２６０　１５１３−１５２０　か　の　え斧ブ ラスミ゛　５ＨＶＧ２７（７）笛 レプリコン（複製単位）二ＣＯβＥｌ、マルチコビー抵抗性：アンビシリン ブロモータ：　ｔｒｐ 誘導体：ＡＩＡ（インドールアクリル酸）又はトリプトファン欠乏。

培養基＝１リットルあたり以下の組成をもつＭ９Ｎａｇ　ＨＰＯ４−Ｈｚ　Ｏ６ ｇ ＫＨ２ＰＯ２３ｇ ＮａＣβ　０．５ｇ ＮＨ４Ｃｆ１　１ｇ カザミノ酸　５ｇ １ＭのＭｇＳＯ４１Ｎ１ ０．５ＭのＣａＣｌ２ｔ　０．２Ｊ ４０％のグルコース　５ｍｌ’ １ｍｇ／ｍｌ’のチアミンＢｌ　１０ｍ１’トリプトフアンを含む又は含まない ：割合１０ｍｇ／ｗ１のトリプトファン２− アントラニル酸塩シンセターゼ（ＴＲＰＥ）との融合タンパク質。

プラスミドｐＳＨＶＧ２７の構成は図■に表わされている。

この場合、ＶＨＳウィルスのＧタンパク質に対して導かれたモノクローナル抗体 により認識されるアミノ酸配列が、Ｅ、　ｃｏｌｉのアントラニル酸塩シンセタ ーゼ３７ＫＤと融合させられる。上述のアミノ酸配列のリーディングフレームの 最後にある１つのの配列は、アントラニル酸塩シンセターゼとの融合タンパク質 の形で、表現すべきＤＮＡ配列を挿入できるようにする多くの制限部位を含んで いる。異なる３つのプラスミドｐＡＴ）（１，２及び３が、可能性ある３つのリ ーディング相の間での選択を可能にしている。当該例においては、挿入されるＧ タンパク質のドメインには、シグナルペプチドも膜内外領域も含まれない。この 領域は、配列１のアミノ酸１１１からアミノ酸３０２まで広がっている。実際に は、残基１１１と３０２の間に含まれるタンパク質の１部分についてコード化す る、制限酵素Ｂａ１ｌ及びＥｃｏＲＶの作用によりプラスミドｐＳＨＶＧＳ上で コード化する配列から切りとられたＤＮＡフラグメントは、結紮によってプラス ミドｐ　Ｓ　Ｐ　７３　（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳｍａ　１部位に挿入された。こ れら３つの制限酵素は、互いに相溶性ある自由末端を生成する。組換え型プラス ミドは形質転換によりＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１内に導入された。組換え型 ｐＳＨＶＧ２６は、プラスミドｐＳＰ７３内に存在したこれらの部位との関係に おいてＢａｍＨ１→Ｃ１ａｌの方向性でインサートを有していたため、この形質 転換から発生した組換え型プラスミドの中から選択された。酵素ｓｐｈ　１によ るこのプラスミドの切断により、インサートを方向づけすることができる。実際 には、ｓｐｈ　ｉ部位は２つあり、最初のものはＢａｍＨ１部位の近くにてプラ スミドｐＳＰ７３内にあり、第２のものは、インサートの初めにあるＢａ１１部 位から塩基対約２２０個分のところにおいてインサート内にある。

ｐＳＨＶＧ２６はｓｐｈ　１による消化の時点で、約２００ｐｂのフラグメント の出現によって特徴づけられる。逆の方向性は、３ｓｏｐｂのフラグメントによ り特徴づけられることになるだろう。ｐＳＨＶＧ２６のインサートは、酵素Ｂａ ｍＨ１及びＣａ１ｌで切断し、アントラニル酸塩シンセターゼの遺伝子とインサ ートを同相にするべく同じ酵素によって解放されたプラスミドｐＡＴＨ３内に挿 入した。タンパク質の停止シグナルは、アントラニル酸塩シンセターゼの末端配 列によって提供される。このように特徴づけされた組換え型プラスミドｐＳＨＶ Ｇ２７を形質転換によりＥ、　ｃｏｌｉの中に導入し、酵素ＢａｍＨ１及びＣ１ ａｌでの消化によりこのプラスミドを確認した。５ＨＶＧ２７と呼ばれこのプラ スミドによりコード化される融合タンパク質は理論上５９ｋＤＯものである。

生成は、カシミノ酸（０，５％）（トリプトファンを除くすべてのアミノ酸を含 むカゼインの酸性加水分解産物）及び、プロモータを抑える目的をもつトリプト ファンで補完された最小培養液Ｍ９の中での一晩の培養の後に行なわれる。次に この培養（物）を、トリプトファンの欠如した新鮮媒質内で２０倍に希釈する。

１時間の培養後、５ｍｇ／ｌのＡＩＡでプロモータを誘導する。２時間後、生成 量は最大となる。融合タンパク質５ＨＶＧ２７は、不溶性封入体の形を呈する。

ポリアクリルアミドゲルの電気泳動で、誘導されたタンパク質は見かけ上５８ｋ Ｄのサイズをも生成収量は充分なものであり、融合タンパク質は、全タンパク質 の１０％以上を占める。封入体を純化するのは比較的容易である。フレンチプレ スで細胞を壊した後、封入体を低速（３，０００ｇ、１０分）で遠心分離し、Ｐ ＢＳ内で再懸濁させる。こうして６回の洗浄を行ない、次に尿素６Ｍの中で封入 体を可溶化する。タンパク質を、減少する濃度の尿素に対し、次にＰＢＳに対し 、透析する。この変性−復元プロセスの終りに、タンパク質５ＨＶＧ２７は、溶 解したタンパク質の３５％を占める。最適化されていない１図の発酵についての 収量は２０ｍｇ／９である。

復元されたタンパク質５ＨＶＧ２７は、ＶＨＳウィルスのＧタンパク質の天然の コンフォメーションを認識するモノクローナル抗体Ｃｌ０（図ＩＸｂ）により、 及び−次構造を認識するモノクローナル抗体１１０（図ＩＸ　ａ　）により、Ｅ ＬＩＳＡにて認識される。対照タンパク質は、融合タンパク質の細菌性パートナ であるアントラニル酸塩シンセターゼである。ＥＬ　Ｉ　ＳＡのために用いられ る技術は、従来通りのものである：すなわち、 １）モノクローナル抗体を、１リツトルに対し１．５６ｇのＮａｇ　ＣＯｓ　、 ２．９３ｇのＮａＨＣＯ３及び０．２ｇのＮ　ａ　Ｎ　ｓを含む緩衝液中でｌ晩 １／２００の希釈でＥＬＩＳＡ滴定プレート上に吸着させる： ２）ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０　＋　２％のウマ血清内に溶解した 形で融合タンパク質（２００ｍｉｃｒｏｇ／　ｄ　）又はアントラニル酸塩シン セターゼ（２００ｍｉｃｒｏｇ／　ｄ　）又はウィルス（つまり６００ｎｇ／ｄ のＧタンパク質）を含む溶液の２対２の希釈液をプレート内に置き、室温で２時 間保温する。ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を用いて５回洗う。

３）ＶＨＳウィルスに対し導かれたウサギのポリクローナル抗体を次に、ＰＢＳ ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０＋２％のウマ血清の中で１／２，０００の希釈で プレートの各ウェル内に置き、２時間後、上述のとおり洗う。

４）ペルオキシダーゼに結合されたウサギの免疫グロブリンに対して導かれた市 販の抗体を次に１１５００の希釈で上述の緩衝液の中に付加する；１時間後、洗 い流す。

５）リン酸塩−クエン酸塩緩衝液ｐＨ５中の０．０１２％のＨ２０□、０．４％ のジヒドロ塩化〇−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ　８７８７）　５０マイク ロリツトルの中でペルオキシダーゼの活性の着色反応を行なわせ、１５分後１５ ０マイクロリットルのＨａ　Ｓｏ、２Ｍでこの反応を停止させ、４０２　ｎｍで の光学密度を測定する。

図ＩＸａ及び図■ｂにおいて、横座標の軸は希釈倍数の２０ｇ２に相応し、縦座 標の軸は光学密度（ＯＤ）に相当する。十で表わされた曲線は本発明の融合タン パク質（ＳＨＶＧ２７）で得られた応答に相応する。

星印（☆）で表わされた曲線は、ＶＨＳウィルス（６００ｍｇ／−のＧタンパク 質）で得られた応答に相当する。

点（・）で表わされた曲線は、対照（アントラニル酸塩シンテターゼ）で得られ た応答に相当する。

さらに、結果を見ると、モノクローナル中和抗体ＣＩＯにより認識されることか らウィルスの中和にとって重要なエピトープが残基１１１と３０２の間に含まれ たペプチド配列に含まれていること、及びこのエピトープにとってグリコジル化 は不可欠なものでないことがわかる。

■：タンパク　の５ＨＶＧ２７を　いたワクチン１１星１ タンパク質５ＨＶＧ２７を用いてワクチン接種試験を行なった。虹マスの稚魚４ ５匹（体重的１ｇ）のロフトに、以下の溶液２０マイクロリツトルを腹腔的注射 した： １）ＰＢＳ＋フロイント完全ア完全アジドバントＡ）１０％ ２）１．６μｇ／ｙｄすなわちＧタンパク＋１０％のＦＣＡｌｏｎｇの割合の、 プロピオノラクトンにより不活性化されたＶＨＳウィルス、 ３　）　１０　Ｂｔｕ／ｄ、すなわち稚魚１匹あたり７．６５％ｇと評価された ＥＬＩＳＡでモノクローナル抗体Ｃ１０により認識されたタンパク質の量の割合 での、タンパク質５ＨＶＧ２７゜ 水槽の水１−あたり５０，０００のタイプエのＶＨＳウィルスの斑を形成する単 位を付加しながら、３週後に試験を実施する。感染を可能にするため１時間新鮮 水の補給を断った。次に、補給を再開し、吸着しなかったウィルス粒子を徐々に 希釈する。続く３週間、死亡率を記録する。

ＰＢＳの注射を受けた対照の魚が達した死亡率レベルは、異なる稚魚ロットの感 受性に応じて実験毎に異なる。この実験においては、現在利用可能な最良のワク チンである死菌ウィルスはわずか３２％の死亡率で保護するのに対して（つまり 保護率４３％）、対照の死亡率は５６％に達している。５ＨＶＧ２７タンパク質 の注射を受けた稚魚はわずか２７％の死亡率つまり５２％の保護率を記録してい る。同様に、対照ロットに対してワクチン接種を受けた２つのロットにおいて死 亡率の遅延が記録されたことも記しておかなくてはならない。

図Ｘは、 −死菌ＶＨＳウィルス（菱形（◇）で表わされた曲線）、 −ＰＢＳ（正方形（ロ）で表わされた曲線）、−本発明のタンパク質（ＳＨＶＧ ２７）；　（十字形（×）により表わされた曲線） を注射してから３週間後に、ＶＨＳウィルスと溶療法により接触させられた生き 残った魚の百分率を表わしている。

この百分率は、第Ｏ８目とみなす溶療法以降の経過日数に従って表わされている 。

■：　、での 酵母に対して誘発可能な表現ベクターを選んだ。このベクタの特徴は以下のとお りであるニー　細菌内での複製及び維持は、ｐＢＲ３２２により確保されている （アンピシリン抵抗性）、−酵母内での複製は２μの官能基により確保されてい る。

−酵母内での選択は遺伝子Ｕｒａ３又は１ｅｕ２ｄ（ｄは欠失を表わす）により 宿主菌株の栄養素要求株の補足により行なわれる；Ｕｒａ３は突然変異した遺伝 子の野生型対立遺伝子であり、補足は効果的で、ベクタのコピー数は最少であり 、ｆｆｅｕ２ｄ遺伝子はほとんど翻訳されておらず、その増殖にとって不可欠な ロイシンの生合成を確実にするためには細胞は１ｅｕ２ｄ遺伝子のコピー数ひい てはベクターのコピー数を増大させるという可能性しかないことから、これら２ つの遺伝子により、当該タンパク質の生成に対するコピー数の影響を調べること ができる。

−プロモータは、アルコールにより誘導されつるアルコールデヒドロゲナーゼ２ の遺伝子であるＡＤＨ２の調節配列（ＵＲ３、上流調節配列）及び酵母の最も強 力な構成性プロモータの１つであるＧＡＰＤＨプロモータすなわちリン酸グリセ ルアルデヒドデヒドロゲナーゼの融合の結果得られたものであり、この雑種プロ モータはＧＡＰＤＨの力をＡＤＨ２の誘発可能性と結びつけている。

−遺伝子ＧＡＰＤＨのターミネータ。

ｐＳＨＶＧ３プラスミド上に存在するＶＨＳウィルスのＧタンパク質に対して導 かれたモノクローナル抗体により認識されるアミノ酸配列の修正されたｃＤＮＡ を、イニシェークＡＴＧ上に置かれたＮｃｏ１部位のおかげのプロモータＡＤＨ ２−ＧＡＰＤＨと終止コドン後にあるＫｐｎ１部位の右かげの中間プラスミドｐ ＥＧＴ１０１のターミネータの間に挿入し、形質転換によりＥ、　ｃｏｌｉ内に 導入した。得られたプラスミドｐＥＧＴ　１０１−ＶＨ５の特性を、ｉ、５ｋｂ の帯の形で前記アミノ酸配列のｃＤＮＡを解放する制限酵素Ｎｃｏ　１及びＫｐ ｎｌによる消化によって、確認した。プロモータ、Ｇタンパク質及びターミネー タを含むカセットＢａｍＨ１を今度はＥ、　ｃｏｌｉ−酵母のシャトルベクター ｐＥＧＴ１１０の唯一の部位ＢａｍＨ１で導入し、プラスミドを形質転換により 導入し、シャトルベクター内のカセットの存在を、３．７ｋｂの帯を出現させる ＢａｍＨ１消化によって確認する。こうして得られたプラスミドｐＹＳＨＶＧ３ をＰＥＧでの形質転換により、酵母の従来の菌株ＤＣＯ４（ａａｄｅ１１ｅｕ２ −０４　ｃｉｒ’）の中に導入する。

ベクターｐＹＳＨＶＧ３の構成は図刀に示されている。発酵及び誘導（発）のプ ロトコルは、ＡＤＨ２の誘導が異化退縮に敏感であることから、特殊である。発 酵の第１段階はプラスミドを維持しながらバイオマスを得ることを目的としてい る。選択は突然変異１ｅｕ２の補完により行なわれ、従って、媒質は３％のグル コースを伴うＹＮＢ　（アミノ酸無しの酵母窒素原基礎培地、Ｄｉｆｃｏ　０９ １９−１５）である。この媒質は、ロイシンを除（すべてのアミノ酸及び含窒素 塩基を付加することによりできるかぎり濃厚にされている。この媒質内での菌株 の生殖時間は、自然培地ではわずか２時間であるのに対して、４時間近（かかる 。達成された光学密度は２．５である。次に細胞を一晩、異化退縮を起こすべく グルコースをグリセロールで置き換えた同じ媒質の中に移す。誘導は３％のエタ ノールが存在する中で、濃厚な媒質ＹＭ（酵母肉汁Ｄｉｆｃ。

０７１１−Ｏｆ）の中で行なわれる。

この媒質は酵母にとって必要なすべての栄養素を含んでいるものの、２４時間の 保温の後でさえ低い成長しかみられない。５時間の保温の後、遠心分離により細 胞を収穫し、緩衝液Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２２０ｍＭ、ＥＤＴＡｌｏｍＭ、ＰＭＳＦ 　（フッ化メチル−フェニル−スルフォニル）１ｍＭ、ｐＨ８，０の中で再懸濁 させた。その後フレンチプレスに３回通して、細胞を壊す。３０分１５，０００ ｇでの遠心分離により、浮遊分はアミノ酸配列の粗抽出物を構成し、これに対し て、融合タンパク質５ＨＶＧ２７について用いられたものと同じ要領でＥＬＩＳ Ａを実施する。ウィルス濃度は２対２の希釈の後、第１のウェル内で６００ｎｇ ／−である。酵母タンパク質の初期濃度は５００ｕｇ　／　ｗｄ！である。酵母 タンパク質の対照は、形質転換されていない菌株である。

酵母内での表現により得られたタンパク質は、ＶＨＳウィルスのＧタンパク質に 対して導かれたモノクローナル抗体特に前述のモノクローナル抗体ＣＩＯ及びＩ ＩＯによって認識されるということがわかる。

図ＸＩＩａ及びｘｎｂは、それぞれ −対照酵母（点（・）を含む曲線） −ＶＨＳウィルス（星印（☆）を含む曲線）−酵母により表現された本発明のタ ンパク質（十字形（＋）を含み図Ｘｌ１ａ及びＸ［Ｉｂの凡例に「組換え型酵母 」と配されている曲線） によってＥＬＳＡ試験結果（それぞれ、モノクローナル抗体１１０及びＣＩＯに よる）を示すものである。

縦座標の軸は光学密度を、横座標の軸は希釈倍数の１ｏｇ２を表わす。

ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ＶＨＳウィルスによる試験 生 存６０ 率 ％ 試験後の経過日数 −Ｅ３−ＰＢＳ　−→÷−５ＨＶＧ２７　−ｅ−死滅ウィルス魚に腹腔内注入し た溶液 ＦＩＧ、和 平成３年ζ月１２日

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．そのポリペプチド構造の中に、 【配列があります】 という配列内に含まれたアミノ酸連鎖（Ｉ）のポリペプチド構造が存在すること を特徴とする組換え型ポリペプチド。
2. ２．ＶＨＳウィルスに対して予め形成された中和抗体によって認識されることを 特徴とする請求項１の組換え型ポリペプチド。
3. ３．ＶＨＳウィルスに対する中和抗体を生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で誘導する可 能性があることを特徴とする、請求項２の組換え型ポリペプチド。
4. ４． 【配列があります】 というアミノ酸連鎖（ＩＩ）のペプチド構造が存在することを特徴とする、請求 項１乃至３のいずれか１項の組換えポリペプチド。
5. ５． 【配列があります】 というアミノ酸連鎖（ＩＩＩ）の全部又は一部を含むことを特徴とする、請求項 １乃至３のいずれか１項のポリペプチド。
6. ６． 【配列があります】 というアミノ酸連鎖の全部又は一部で構成されていることを特徴とする、請求項 １乃至３のいずれか１項のポリペプチド。
7. ７． 【配列があります】 というアミノ酸連鎖（Ｉ）により構成されていることを特徴とする、請求項１乃 至３のいずれか１項のポリペプチド。
8. ８． 【配列があります】 というアミノ酸連鎖（ＩＩ）で構成されていることを特徴とする、請求項１乃至 ３のいずれか１項のポリペプチド。
9. ９． 【配列があります】 というアミノ酸連鎖（ＩＩＩ）で構成されていることを特徴とする、請求項１乃 至３のいずれか１項のポリペプチド。
10. １０． 【配列があります】 というアミノ酸配列ＩＶで構成されていることを特徴とする、請求項１乃至３の いずれか１項のポリペプチド。
11. １１．請求項１乃至９のアミノ酸連鎖のいずれか１つ及び、約８個乃至８００個 のアミノ酸を有しかつこの連鎖との関係において非相同なタンパク質又はアミノ 酸配列により構成されていることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか１項 のアミノ酸配列。
12. １２．外来性アミノ酸配列が、β−ガラクトシダーゼであることを特徴とする、 請求項１０のアミノ酸配列。
13. １３． 【配列があります】 という核酸（１）によりコード化されたアミノ酸連鎖の全部又は一部を含むペプ チド構造が存在することを特徴とするポリペプチド。
14. １４．請求項１乃至１３のポリペプチドに対してコード化するヌクレオチド連鎖 が含まれていることを特徴とする核酸。
15. １５． 【配列があります】 というヌクレオチド連鎖（２）の全部又は一部を含んでいることを特徴とする請 求項１４の核酸。
16. １６． 【配列があります】 というヌクレオチド連鎖（３）の全部又は一部を含んでいることを特徴とする核 酸。
17. １７． 【配列があります】 というヌクレオチド連鎖（４）の全部又は一部を含んでいることを特徴とする核 酸。
18. １８． 【配列があります】 というヌクレオチド連鎖（５）の全部又は一部を含んでいることを特徴とする核 酸。
19. １９． 【配列があります】 というヌクレオチド連鎖（６）の全部又は一部を含んでいることを特徴とする核 酸。
20. ２０．表現調節要素を含むヌクレオチド配列が前にあることを特徴とする、請求 項１５の核酸。
21. ２１．転写終止要素が含まれていることを特徴とする、請求項１５及び２０の核 酸。
22. ２２． 【配列があります】 というヌクレオチド連鎖（１）の全部又は一部を含んでいることを特徴とする核 酸。
23. ２３． 【配列があります】 というヌクレオチド連鎖（１）で構成されていることを特徴とする請求項２２の 核酸。
24. ２４．請求項１４乃至２３のいずれか１項の核酸を、前記フラグメントに対し非 相同の核酸内に挿入された形で含んでいることを特徴とする組換え型核酸。
25. ２５．その複製にとって可決の部位の１つに、請求項１４乃至２３のいずれか１ 項の組換え型核酸を含んでいることを特徴とする、特にプラスミド、コスミド又 はファージタイプのクローニング及び／又は表現のための組換え型ベクター。
26. ２６．Ｉ７７８という番号でＣＮＣＭに寄託されているＰＳＨＶ−Ｇ１プラスミ ドであることを特徴とする、請求項２５の組換え型ベクター。
27. ２７．宿主細胞内での請求項１乃至１３のアミノ酸配列の表現を促進するために 必要な要素、場合によってはこの宿主細胞のポリメラーゼにより認識されるプロ モータ特に誘導性プロモータ及び場合によってはシグナル配列及び／又はアンカ ー配列を、その複製にとって可決な部位の１つに含んでいることを特徴とする、 請求項２５の組換え型ベクター。
28. ２８．大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）によりベクター内に挿入された請求項１１乃至２ ０の核酸を用いて、この核酸の表現を可能にする要素、特に −β−ガラクトシダーゼの遺伝子の全部又は一部の表現を可能にする要素、 を含んでいることを特徴とする、請求項２７の組換え型ベクター。
29. ２９．酵母の中に請求項１４乃至２３の核酸を挿入し酵母内でこの核酸を表現で きるようにする要素が含まれていることを特徴とする、請求項２７の組換え型ベ クター。
30. ３０．請求項１乃至１３のいずれか１項のポリペプチドについてコード化する核 配列の表現を可能にする調節要素を含む、請求項２５乃至２９のいずれか１項に 従った組換え型ベクターにより形質転換された宿主細胞。
31. ３１．請求項２８のベクターにより形質転換された大腸菌であることを特徴とす る、請求項３０の宿主細胞。
32. ３２．請求項２９のベクターにより形質転換された酵母であることを特徴とする 、請求項３０の形質転換された宿主細胞。
33. ３３．請求項３０乃至３２の形質転換された宿主細胞により表現された核酸の表 現生成物。
34. ３４．複合体が抗−ＶＨＳ中和抗体の生成を生体内で誘発できるよう充分な分子 量をもつ合成ポリペプチド又は天然タンパク質に対し場合によって結合された形 で、請求項３３の表現生成物を含んでいることを特徴とするワクチン有効成分。
35. ３５．ワクチン接種栄養物１グラムあたり１０ｎｇから１００μｇの有効成分を 含むことを特徴とする、経口投与可能な請求項３４のワクチンの有効成分。
36. ３６．魚１ｇあたり１ｎｇから１，０００ｎｇを構成することを特徴とする、腹 腔内投与可能な、請求項３４のワクチン有効成分。
37. ３７．１ｍｌあたり１０ｎｇから１００μｇを含む媒質内の溶療法により投与可 能な請求項３４のワクチン有効成分。
38. ３８．請求項１乃至１３のいずれか１項の免疫原性の組換え型ポリペプチドに対 し誘導されていることを特徴とする抗体。
39. ３９．請求項１４乃至２３の核酸のうちいずれか１つと又はその相補的配列と雑 種形成することを特徴とするヌクレオチドプローブ特に、 【配列があります】 というヌクレオチド配列の中から選ばれたプローブ又はその相補的ヌクレオチド 配列。
40. ４０． −適当な培養基内で請求項１４乃至２３のいずれか１項の核酸を含む適当なベク ターによって予め形質転換された宿主細胞を培養すること、及び−前記培養基か ら前記形質転換された宿主細胞により生成されたポリペプチドを回収すること、 を特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか１項の組換え型ポリペプチドの調製 方法。
41. ４１．請求項３１のＥ．ｃｏｌｉの培養、及びこのＥ．ｃｏｌｉの指数増殖期の 終りでの培養の停止ならびに、Ｅ．ｃｏｌｉにより分泌される可能性のあるその 他の細胞外酸素又はタンパク質の無い培養基からの一定のアミノ酸配列の回収、 を特徴とする、一定の組換え型ポリペプチドの請求項４０の調製方法。
42. ４２．請求項３２の酵母の培養、及びこの酵母の指数増殖期の終りでの培養の停 止、ならびに酵母内のマイクロカプセル封じされたポリペプチドの回収、を特徴 とする、一定のポリペプチドの請求項４１の調製方法。