JPH07504423A - 熱ショックタンパク質とオリゴ糖または多糖とから形成されるコンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 熱シヨツクタンパク質とオリゴ糖または多糖とから形成されるコンジュゲート 及匪旦旦互 本発明は、熱シヨツクタンパク質と、多糖またはオリゴ糖（特に、病原性微生物 の莢膜由来の多糖またはオリゴ糖）とからなるコンジュゲート化合物に関する。

本化合物は、抗多糖抗体の形成を誘導し得る。そのため、本化合物は、ヒトおよ び動物に使用するワクチンとして有用である。

罠籠太沢 細菌は、広範囲の疾患状態に対する病原物質である。

このような疾患の例には、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによ って引き起こされる髄膜炎、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚ ａｅ　ｂ型（Ｈｉｂ）または５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　（Ｐｎｅｕｍｏｃｏ ｃｃｕｓを含む）によって引き起こされる他の感染症、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　 ｔｙｐｈｉの感染によって引き起こされる腸チフス、非腸チフス原性のＳａｌｍ ｏｎｅｌｌａ菌またはＳｈｉｇｅｌｌａ菌によって起こる腸疾患が含まれる。

莢膜を有する細菌に対する防御免疫は、莢膜中の多糖に対する抗体により介在さ れることが知られている。免疫系を充分に刺激するには、莢膜の多糖を、キャリ アタンパク質に結合させる必要があることも知られている（Ｒｏｂｂｉｎｓら、 Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１９９Ｇ、１６ユ、　８２１−８３２）。

特に、多糖（例えば、０群髄膜炎菌多糖（ＭｅｎＣ）、ＨｌｂおよびＡ群髄膜炎 菌多糖（ＭｅｎＡ））およびＣＲＭ−１９７（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕａ ＋　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ由来のペプチド）のようなタンパク質、ＴＤ（ジフ テリア毒素）またはＴＴ（破傷風毒素−Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｉｎｆ、　Ｉｍ＋ａ ｕｎ、　、　（１９９１年１０月）、３５０４−３５１０　ＨＣ１ａｅｓｓｏｎ ら、Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ　Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ、且■■、６９５−７０２、 （１９８８年５月）を参照のこと）からなるコンジュゲート化合物が文献中に記 載されている。

このようなワクチンのうち数種は、すでに臨床的に実用化されており、良好な結 果が得られている。しかし、従来使用されてきたキャリアで達成されたよりも良 好な免疫原的特性をフンシュゲートに与える新規なタンパク質キャリアを同定す る必要がある。

本発明は、オリゴ糖および多糖の免疫原性応答を高めるタンパク質キャリアとし ての熱シヨツクタンパク質の使用に関する。

熱シトツクタンパク質は、非常に多数のＴエピトープを含有し、そのため細胞の 免疫系を刺激することが知られている。

マラリア性エピトープのキャリアである、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉ ｓの熱シヨツクタンパク質のコンジュゲート化合物（６５ｋＤａ）は、Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕ６ｒｉｎ　（ＢＣＧ）で予め免疫化した動物 に、アジュバントを必要とすることなく、著しい免疫化を誘導することが記載さ れているＣＬｕｓｓｏｗらＥｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１９９１、２１．２２９７−２３０２）。しがし、熱シヨツクタンパク質に結合 した（Ｔ−細胞依存性であることが周知の）ペプチドによって示されるＴ細胞依 存効果に関するＬｕｓｓｏｗらに観察された効果は、注目に値する。

より詳細には、熱シヨツクタン）＜り質は、株および型が異なる細菌間でもよ（ 保存されるので、継続的プロセスである細菌感染により、確実に、免疫系が熱シ コ・ノクタンノくり質に対して感作された状態なる。そのため、最初のワクチン 接種または追加免疫ワクチン接種における投与で、本発明のコンジュゲート化合 物に対する良好な応答が保証される。

本発明により、（アジニノイントの使用も可能だが）アジ３／’ントを用いずに 、莢膜を有する細菌の多糖およびオリゴ糖の使用が可能となる。

大勢の子供たちが、結核予防のためにＢＣＧワクチン（細菌の熱シヨツクタンパ ク質を含む）を接種する。そのため、熱シヨツクタンパク質をキャリアとして含 有する本発明のコンジュゲートは、このＢＣＧワクチン接種の実施の結果、すて （こキナ１ノアで予備免疫化された多くの被検体を見出す。

その上、熱シヨツクタンパク質は非常に保存されて−）るので、ＢＣＧでワクチ ン接種を受けていなｔ）個体群でさえ（他の細菌との相互作用の結果として）容 易に免疫を得られる。そのため、この個体群は、熱シヨ・２クタンノくり質およ びＴ細胞依存抗原（オリゴ糖または多糖）で構成されるコンジュゲートでのワク チン接種の後に良好な免疫応答を発現し得る状態↓こある。

このように、本発明のキャリアは、確実に高力価のワクチン接種をするために、 細菌間の熱シヨツクタンパク質の高い保存性およびＴ細胞記憶を、独自に利用す るものである。

λ方立１且 本発明は、少な（とも１つの熱シヨツクタンパク質または少なくとも１つの免疫 刺激ドメインを含有する熱シラツクタンパク質の一部と、少なくとも１つのオリ ゴ糖または多糖とを含有するコンジュゲート化合物を提供する。

熱シヨツクタンパク質は、動物、好ましくはヒトにおいて、免疫刺激効果を示し 得る如何なる熱シヨツクタンパク質でもよい。

熱シヨツクタンパク質は、細菌、寄生生物および哺乳動物に高度に保存されてい る。重大な悪影響なしに意図する被免疫被検体にポジティブな免疫刺激効果を示 す限り、あらゆる熱シヨツクタンパク質が本発明のコンジ−ゲート中に使用され 得る。個々の例としては、Ｈｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉｓ　Ｐ、　 ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＳＣ，ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＭ、　１ｅｐｒａｅ 由来の熱ショックタンパク賃、特にｈｓｐ６０群の熱シヨツクタンパク質が挙げ られるが、これらに限定されない。

より詳細には、３種の熱シヨツクタンパク質、すなわち、Ｍ、　ｂｏｙｉｓ　Ｂ ＣＧ　ＧｒｏＥＬ型の６５ｋＤａのｈｓｐ（ｈｓｐＲ６５）、組換えＭ、ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＫ型の７０　ｋＤａのｈｓｐ（ｈｓｐＲ７０）およ びＨ，ｐｙｌｏｒｉ由来の新規な熱シヨツクタンパク質の具体例を、本明細書中 に示す。

）１．　ｐｙｌｏｒｉ熱ショックタンパク貫（ｈｓｐ）は、図３に示すヌクレオ チド配列およびアミノ酸配列を有するタンパク質であり、その分子量は５４〜６ ２ｋＤａの範囲にあり、好ましくは約５８〜６０ｋＤａである。このｈｓｐは、 グラム陰性菌熱シヨツクタンパク質の群であるｈｓｐ６０に属する。一般的にｈ ｓｐは全ての生物、つまり原核または真核の動物または植物に、最もよく保存さ れているタンパク質であり、そして、その保存は配列全体にわたっている。

コンジュゲートは、１種またはそれ以上の熱シヨツクタンパク質またはその免疫 刺激ドメインを含み得る。熱シヨツクタンパク質は、同一でも異なっていてもよ い。しかし、１つの熱シヨツクタンパク質、あるいは１つまたはそれ以上の免疫 刺激ドメインを含有する部分が存在することが好ましい。

本明細書中で使用のように、用語「免疫刺激ドメイン」は、哺乳動物被検体のド メインを含有するコンジュゲート化合物の多糖またはオリゴ糖成分に対する、免 疫を増強させ得る熱シヨツクタンパク質のアミノ酸配列の領域を指す。

完全な熱ショックタンパク質由来の特定のドメインのみを使用することの利点は 、ヒト熱シヨツクタン／（り質に共通のドメインを、選択的に含まないようにす ることが可能な点である。ヒトへのワクチン投与に対して、これは有利なことで ある。それは、このような領域が「自己」と認識されるので、熱シヨツクタンパ ク質の免疫刺激効果に影響を与えないからである。さらに、このような「自己」 の領域に対して刺激を受ける全ての免疫は、自己免疫になり得るからである。

熱シヨツクタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーの好適なドメインを同定し、ヒト 熱シヨツクタンパク質と相同性が減少した配列に下線を引いて図２に載せである 。図２に示したドメインのうち、機能的なサブドメインもまた、ドメインおよび サブドメインの組合せとして同様に使用され得る。

当業者は、そのドメインまたはエピトープが免疫刺激反応を起こす所定の熱シヨ ツクタンパク質を容易に確認し得、そしてこれらのドメイン、またはそのサブセ ットのみを含む改変熱シヨツクタンパク質を、容易に調製し得る。

フンシュゲート化合物のオリゴ糖成分または多糖成分は、ワクチン投与しようと する全ての病原性微生物の完全な莢膜の多糖またはオリゴ糖、または防御免疫を 誘導し得るその一部であり得る。オリゴ糖または多糖は、単一の細菌由来、ある いは２種またはそれ以上の細菌由来であり得る。

標的とされ得る細菌の個々の例には：　Ｈａｅ＋ｏｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕ ｅｎｚａｅ　ｂ型（Ｈｉｂ）、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　（ｐｎｅｕｍｏｃ ｏｃｃｕｓを含む）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐ ｈｉ、非タイボイダル（ｔｙｐｏｉｄａｌ）Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ細菌またはＳ ｈｉｇｅｌｌａ細菌によって引き起こされる腸疾患が挙げられるが、これらに限 定されない。

本発明の特定の実施態様によると、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ　Ｃ（ＭｅｎＣ） 群のオリゴ糖およびｈｓｐから成るコンジュゲートが調製された。

本発明のさらに特定の実施態様によると、本発明の目的に使用されたｈｓｐは、 ｈｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７０である。

本発明の第２の局面では、熱シＷ　７クタンパク質または少なくとも１つの免疫 刺激ドメインを含むその一部を、少なくとも１つのオリゴ糖または多糖に共有結 合させることを包含する、本発明のコンジュゲート化合物を生産するプロセスが 提供される。

オリゴ糖または多糖は、好ましくは標的とする細菌から単離されるが、合成によ りても生成され得る。

熱シヨツクタンパク質は、その自然発生源から単離され得、または合成的に生産 される。好ましくは、熱シヨツクタンパク質は、本明細書の記載の一般的な中に 記載された技法を用いる組換えＤＮＡ技術によって生産される。

好ましくは、オリゴ糖または多糖は、結合に対する反応部位を提供するように、 熱シヨツクタンパク質またはその部分と結合する前に改変される。好ましくは、 この改変はオリゴ糖または多糖の末端基へのアミノ基のような活性官能基の導入 を包含する。次いで、このように改変されたオリゴ糖または多糖を、次いでスク シンイミドのような連結基を用いて活性化し、熱シヨツクタンパク質またはそれ らのタンパク質に結合させる。

本発明の第３の局面では、製剤、好ましくはワクチンとして使用する、本発明の 第１の局面に記載のコンジュゲート化合物が提供される。

本発明の第４の局面では、細菌感染に対するワクチン接種用の薬剤の製造におけ る、本発明の第１の局面に記載のコンジュゲート化合物の使用が提供される。

本発明の第５の局面では、本発明の第１の局面に記載のコンジュゲート化合物の 免疫学的に有効な量の投与する工程を包含するワクチン接種の方法が提供される 。

本発明の第６の局面では、本発明の第１の局面に記載の１つ以上のコンジュゲー ト化合物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含むワクチンまたは治療用組成物 が提供される。

好ましくは組成物は、ワクチン組成物であり、そして必要であればアジュバント のような他の賦形剤を含み得る（以下に記載の「ワクチン」と表題された節を参 照せよ）。

本発明の第７の局面では、１つ以上の本発明の第１の局面のコンジュゲート化合 物を、薬学的に受容可能なキャリアおよび任意にアジュバントと組み合わせる工 程を包含する、ワクチンの調製法が提供される。

図面の簡単な説明 図１は、ｈｓｐＲ６５／ＭｅｎＣコンジュゲートでマウスを免疫化した結果を示 し、そして、血中の抗ＭｅｎＣに対するＥＬＩＳＡの結果を含む。図ＩＡには、 ＢＣＧで予め免疫化したマウスを記載し、図ＩＢにはＢＣＧで予め免疫化しなか ったマウスを記載している。図は、ＰＢＳ中のｈｓｐＲ６５−ＭｅｎＣ（○）コ ンジュゲートまたはｈｓｐＲ７０−ＭｅｎＣ（◇）コンジュゲートとでの結果を 示す。コントロール群のマウスは、ＭｅｎＣ多糖のみ（△）または水酸化アルミ ニウム中のＣ１Ｍ１９７−ＭｅｎＣコンジニゲートワクチン（ロ）で免疫化した 。

図２は、Ｈａｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉの熱シｌ　ツクタンパク質 のアミノ酸配列を示し、そして、それとｐ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ％Ｃ，ｔｒａ ｃｈｏ＋ａａｔｉｓ、　Ｍ、　１ｅｐｒａｅおよびＨ，５ａｐｉｅｎｓ由来の関 連する熱シヨツクタンパク質とを比較している。配列の下線は、配列１〜４とヒ ト熱シヨツクタンパク質との間で、相同性が減少したドメインを示す。

図３は、Ｈｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉの熱シヨツクタンパク質の、 ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。

態　の　な１日 １、−　・な　肚 本発明の実施には、他に示されていなければ、当該分野の分子生物学、微生物学 、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の方法を使用する。このような方法は、文 猷に十分に説明されている。例えば、Ｓａａ＋ｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡ ＲＣＬＯＮＩＮＧ；　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第二版（１９ ８９）；　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、　ＶＯＬＵＭＥＳ　ＩおよびＩＩ（Ｄ、Ｎ 　Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）；　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨ ＥＳＩＳ　（Ｍ。

Ｊ、　ｃａｔｔ編１９８４）；　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡ ＴＩＯＮ　（Ｂ、Ｄ、■ａｉ＋ｅｓおよびＳ、　Ｊ、旧ｇｇｉｎｓＪｌ！　１９ ８４）；　ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ　（ Ｂ、Ｄ、ＨａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９１１４）；　ＡＮＩ ＭＡＬ　ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ　（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙｉｉ　１９８ ６）；　ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬＳ　ＡＮＤ　ＥＮＺＹＭＥＳ　（Ｉ ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６）；　Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ、　Ａ　ＰＲＡＣＴＩ ＣＡＬ　ＧＬＩＩＤＥ　Ｔｏ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　（１９８４ ）；　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、）；　ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ　ＣＪ、Ｈ，ＭｉｌｌｅｒおよびＭ、　 Ｐ、Ｃａｌｏｓｇ　１９８７、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、 　１５４およびＶｏｌ、ＩＳＳ　（それぞれに、ＮｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、 およびＮｕ編）　、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、４　（１９８７）、ＩＭＭ ＵＮＯｃＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥ ＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｎ＋１ｃＰｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ） 、５ｃｏｐｅｓ、（１９１１７）、ＰＲＯＴＥｒＮ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ、第二版（Ｓｐｒｉｎｇｅ ｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、）、および、ＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥ ＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ−ＩＶ　（Ｄ 、Ｍ、　ＷｅｉｒおよびＣ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｍａｉ１編１９８６）を参照のこと 。

ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な省略形が、本明細書中で使用されている 。本明細書中に掲載されている、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参考 として援用されている。

ス一　友責 本発明に使用し得る熱シヨツクタンパク質には、上記のポリペプチド、および、 上記タンパク質の天然のアミノ酸配列から少数のアミノ酸が変異したポリペプチ ドがあげられ；特に保存的なアミノ酸置換が予期される。

保存的置換は、関連する側鎖を有するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である 。遺伝子的にコードされたアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分類される ＝（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギ ニン、ヒスチジン；　（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ ン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン：および、（４ ）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システィン、セリン、ト レオニン、チロシン。

フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミ ノ酸として、−緒に分類される。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン の、アスパラギン酸とグルタミン酸の、トレオニンとセリンとの単独の置換、あ るいは、あるアミノ酸と、構造が関連するアミノ酸との同様の保存的置換が、生 物学的活性に大きな影響を与えないことは当然予想し得る。タンパク質として実 質的に同じアミノ酸配列を有するが、機能面に実質的に影響しない少数のアミノ 酸置換を有するポリペプチド分子は、本タンパク質の定義の範囲に含まれる。

天然の供給源からタンパク質を単離精製するよりも、組換えＤＮＡ技術により熱 シコックタンパク質を生産する大きな長所は、天然の供給源からタンパク質を単 離するのに要求されるよりも少ない開始物質を用いて、同量のタンパク質が生産 され得ることである。組換え技術によるタンパク質の生産は、細胞中に通常存在 するいくつかの分子の非存在下でも、タンパク質を単離を可能にする。実際、ヒ トタンパク質混入の痕跡が全くないタンパク質組成物を容易に生産し得る。なぜ なら、組換え非ヒト宿主により生産されるヒトタンパク質は、問題の組換えタン パク質のみだからである。天然の供給源からの潜在的なウィルス性物質およびヒ トに対して発病性のウィルス成分もまた、避けられる。

本明細書中に使用されているように、用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノ ム、ｃＤＮＡｓ半合成または合成起源のポリヌクレチドを示し、その起源または 操作により＝（１）天然では結合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と 結合しない、（２）天然ではそれに結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌ クレオチドに結合する、または（３）天然では存在しない。

本明細書中に使用されているように、用語「ポリヌクレオチド」とは、任意の長 さのヌクレオチド、好ましくはデオキシリボヌクレオチドのポリマー形態のこと であり、本明細書中では、用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」と 相互変換的に使用される。この用語は、分子の一次構造のみを示す。従って、こ の用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびアンチセンスポリヌクレオチドが 包含される。これにはさらに、既知の型の改変、例えば、当該分野で公知の標識 の存在、メチル化、末端１”ｃａｐｓＪ、１つ以上の天然に存在するヌクレオチ ドのアナログとの置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、ある型の非荷電性結合 （例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバ ミン酸エステルなど）、または、荷電性結合（例えば、ホスホロチオエート、ホ スホロジチオエートなど）との置換）、ヘンダント部分の導入（例えば、タンパ ク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリーＬ−リジンなど） 、挿入剤（例えば、アクリジン、ブソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）など）、牛レ ート剤（例えば、金属、放射性物質、ホウ素、酸化成分など）、アルキル化剤（ 例えば、αアノマー性核酸など））が、包含される。

用語「ゲノムの」により、ベクターにクローン化された制限フラグメント由来の ＤＮＡ分子のコレクションまたはライブラリーを意味する。これには、微生物の 遺伝子物質の全てまたは一部が包含され得る。

用ｆＷ　ｒｃＤＮＡＪにより、ｍＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズする相補ｍＲ ＮＡ配列を意味する。

本明細書中で使用されているように、用語「オリゴマー」は、プライマーおよび プローブの両方を意味し、本明細書では用語「ポリヌクレオチド」と相互変換的 に使用される。用語オリゴマーは、分子の大きさを意味しない。しかし、典型的 にオリゴマーは、１０００ヌクレオチド未満、より典型的には５００ヌクレオチ ド未満、さらに典型的には２５０ヌクレオチド未満であり、それらは１００ヌク レオチド未満であり得、７５ヌクレオチド未満、そしてさらに５０ヌクレオチド 未満の長さであり得る。

本明細書中で使用されているように、用語「プライマー」とは、適切な条件下で 使用されるときに、ポリヌクレオチド鎖の合成開始点として作用し得るオリゴマ ーのことである。

プライマーは、コピーされるべきポリヌクレオチド鎖の領域に、完全にまたは実 質的に相捕的である。従って、ハイブリダイゼーションを行う条件下で、プライ マーは、分析物鎖の相補領域にアニールする。適切な反応物（例えば、ポリメラ ーゼ、ヌクレオチドトリホスフェートなど）の添加により、プライマーは、重合 剤により伸長されて分析物鎖のコピーを形成する。プライマーは一本鎖であり得 るか、または、部分的または全体に二本鎖であり得る。

用語「分析物ポリヌクレオチド」および「分析物鎖」とは、標的領域を含有する と思われる、−重鎖または二本鎖核酸分子のことであり、生物学的試料中に存在 し得る。

本明細書中で使用されているように、用語「プローブ」とは、標的領域中の配列 とプローブ中の少なくとも１つの配列との相補性により、標的配列とノーイブ百 ルノド構造を形成するポリヌクレオチドを含有する構造のことである。プローブ のポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ　、および／または合 成ヌクレオチドアナログから構成され得る。「捕獲プローブ」および「標識プロ ーブ」は、プローブ内に包含される。

本明細書中で使用されているように、用語「標的領域」とは、増幅および／また は検出されるべき核酸領域のことである。用語「標的配列」とは、プローブまた はプライマーが、所望の条件下で安定なハイブリ・ノドを形成し得る配列のこと である。

本明細書中で使用されているように、用語「捕獲プローブ」とは、結合パートナ −に結合する一本鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドプローブのこと である。この−重鎖ポリヌクレオチドは、標的するポリヌクレオチド配列に含有 され、これは、分析物ポリヌクレオチド中の検出されるべき標的領域内の標的配 列に相補的である。この相補領域は、二２ｔｄｌｊｌニ、分析物ポリヌクレオチ ドを固体表面に固定する（結合パートナ−を介して）のに十分に安定性を与える ために、十分な長さからなり、標的配列に対して相補的である。結合パートナ− は、第二の結合パートナ−に特異的であり、第二の結合パートナ−は、固体支持 体の表面に結合され得るか、または、その他の構造物または結合パートナ−を介 して間接的に固体支持体に結合され得る。

本明細書中で使用されているように、用語「標的するポリヌクレオチド配列」と は、標的ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチドが含有されるポリヌクレ オド配列のことであり、その配列は、意図される目的に十分な安定性を有する二 本鎖を形成するのに、十分な長さからなり、標的配列に相補的である。

本明細書中で使用されているように、用語「結合ツク−トナー」とは、例えば、 抗原とそれに特異的な抗体のような、高度な特異性を有するリガンド分子を結合 し得る分子のことである。一般的に、特異的結合パートナ−は、単離条件下で、 分析物コピー／相補鎖の二本鎖（捕獲プローブの場合）を固定するのに十分な親 和性で結合しなければならない。特異的結合パートナ−は、当該分野で公知であ り、例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロティ ンＡ、多くの既知のレセプター−リガンド対、および、相補的ポリヌクレオチド 鎖を包含する。相補的ポリヌクレオチド結合パートナ−の場合には、パートナ− は通常、少なくとも約１５塩基の長さであり、少なくとも４０塩基であり得、さ らに、少なくとも約４０％から約６０％のＧ＋Ｃ含有量を有する。ポリヌクレオ チドは、ＤＮＡ、　ＲＮＡまたは合成ヌクレオチドアナログを含み得る。

本明細書中で使用されているように、用語「カップルした（ｃｏｕｐｌｅｄ）　 Ｊとは、共有結合によるまたは非共有結合の強い相互作用（例えば、疎水相互作 用、水素結合など）による付着のことである。共有結合は、例えば、エステル、 エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭 素−リン結合などであり得る。

用語「支持体」とは、所望の結合パートナ−が固定され得る、いずれもの固体ま たは半固体の表面のことである。適切な支持体には、ガラス、プラスチック、金 属、ポリマーゲルなどが含まれ、ビーズ、ウェル、ディツプスティック、膜など の形態にされ得る。

本明細書中で使用されているように、用語「標識」とは、検出し得る（好ましく は定量し得る）シグナルを提供するために使用され得、ポリヌクレオチドまたは ポリペプチドに結合され得る、いずれもの元素または部分のことである。

本明細書中で使用されているように、用語「標識プローブ」とは、分析物ポリヌ クレオチド中の検出されるべき標的配列に相補的である、標的するポリヌクレオ チド配列を含有するポリヌクレオチドプローブのことである。この相補領域は、 「標識プローブ」および「標識配列」を含有する二本鎖が、標識により検出され るように、十分な長さからなり、標的配列に相補的である。標識プローブは、直 接に、または、マルチマーを含む、互いに高度な特異性を有する１組のリガンド 分子を介して間接に、標識とカップルする。

本明細書中で使用されているように、用語「マルチマー」とは、同じ繰り返しの 一重鎖ポリヌクレオチドユニットまたは異なる一重鎖ポリヌクレオチドユニット の、直鎖状または分枝状ポリマーのことである。ユニットの少なくとも１つは、 目的の第一の一重鎖ヌクレオチド配列、典型的には分析物または分析物に結合し たポリヌクレオチドプローブ（例えば、標識プローブ）に特異的にハイブリダイ ズし得る、配列、長さ、および組成を有する。このような特異性および安定性を 得るために、このユニットは、通常は少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであ り、典型的には約５０ヌクレオチド以下の長さ、そして好ましくは約３０ヌクレ オチドの長さであり；さらに、Ｇ＋Ｃ含有量は、通常は少なくとも約４０％、は とんどは約６０％である。このようなユニットに加えて、マルチマーには、目的 の第二の一重鎖ヌクレオチド、典型的には標識ポリヌクレオチドまたはその他の マルチマーに、特異的および安定にハイブリダイズし得る、多くのユニ・２トが 包含される。これらのユニットは、上記に考察されたマルチマーのように、一般 にはほぼ同じ大きさおよび組成である。マルチマーがその他のマルチマーにハイ ブリダイズされるように設計されてｔ）るときには、第一および第二のオリゴヌ クレオチドユニ・ノドは異質（異なる）であり、選択されたアツセイの条件下で （よ、互いにはハイブリダイズしない。従って、マルチマーは、標識プローブで あり得るか、または標識をプローカこ力、、プルするリガンドであり得る。

「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自己複製ユニ、ｙ　＋−ど して挙動する、すなわち、自己制御下に複製し得るいずれもの遺伝子エレメント 、例えば、プラスミド、染色体、ウィルス、コスミドなどである。これには選択 マーカーが含まれ得る。

ｒ　ＰＣＲＪとは、５ａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３　（１９８６ ）；および５ｅｈａｒｆら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８Ｇ）　２３３：１０７６ −１０７８；および米国特許第４、６８３．１９５号；ならびに米国特許第４． ６８３．２０２号番二ｇ己載されているようなポリメラーゼ連鎖反応の技法であ る。

本明細書中で使用されているように、本来Ｘ力（、同じ様式でｙに関連しない場 合に、Ｘはｙに関して「異種」である。

すなわち、天然ではＸが全くｙに関連しなｔ）力）、また＋１、Ｘが天然に実在 して認められるような同じ様式でｙ；こ関連しない。

「相同性」とは、Ｘとｙとの間の類似性の程度のことである。１つの形態の配列 と別の配列との対応１当該分野で公知の方法により決定され得る。例えば、それ らはポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定され得る。または、相同 性は、相同領域（例えば、Ｓ１消化の前に使用される）間で安定な二本鎖を形成 する条件下でポリヌクレオチドをハイブイブリダイズし、その後、−重鎖特異ヌ クレアーゼにより消化し、その後に消化されたフラグメントの大きさを決定する ことにより決定され得る。

「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが接続されて、この接続され たセグメントの複製および／または発現をもたらすレプリコンである。

「制御配列」とは、それらが連結されるコーディング配列の発現をもたらすため に必要であるポリヌクレオチド配列のことである。このような制御配列の性質は 、宿主生物に依存して異なる；原核生物では、このような制御配列は、一般的に プロモーター、リポソーム結合部位、および転写終止配列を含み：真核生物では 、一般的に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終止配列を含む。

用語「制御配列」は、最少限、発現に必要とされる全成分を含み、さらに存在が 有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナ−配列を含 み得ると意図される。

「作動可能に連結された」とは、記載されている成分が、それらの意図する様式 で機能し得る関係にある並列のことである。コーディング配列に「作動可能に連 結された」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列に適合した条件下で 得られるように連結されている。

「オーブンリーディングフレームＪ　（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードする ポリヌクレオチド配列の領域のことである；この領域は、コーディング配列の一 部またはコーディング配列全てを示し得る。

「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下におかれると、通常はｍＲＮ Ａを介してポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディン グ配列の境界は、５°末端の翻訳開始コドンおよび３°末端の翻訳終止コドンに より決定される。コーディング配列には、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチ ド配列が含まれる得るが、これらに限定されない。

本明細書中で使用されているように、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリ マーを指し、特定の長さの産物を指すわけではない；従って、ペプチド、オリゴ ペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に包含される。この用語 にはまた、ポリペプチドの発現後改変（例えば、グリコジル化、アセチル化、リ ン酸化など）を意味せず、あるいは除外しない。定義に包含されるのは、例えば 、アミノ酸の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド（例えば、非天然アミ ノ酸などを含む）、置換結合を有するポリペプチド、および当該分野で公知の天 然に存在するおよび存在しない改変である。

示された核酸配列「由来の」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、配列にコー ドされたポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチ ド、またはそれらの部分、ここで、この部分は、少な（とも３−５アミノ酸、さ らに好ましくは少なくとも８−１０アミノ酸、そしてよりさらに好ましくは少な くと６１１−１５アミノ酸からなる、または配列にコードされたポリペプチドに より免疫学的に同定され得るポリペプチドのことである。この用語にはまた、示 された核酸配列から発現されるポリペプチドも包含される。

「免疫原性の」とは、アジュバントの存在または非存在下で、それのみで、また はキャリアに結合されて、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を引き 起こすポリペプチドの能力のことである。「中和」とは、感染因子の感染力を、 部分的または全体的に抑制する免疫応答のことである。「エピトープ」とは、ペ プチド、ポリペプチド、またはタンパク質の抗原決定基のことである；１つのエ ピトープは、そのエピトープに対して唯一の高次構造（ｓｐａｔｉａ１ｃｏｎｆ ｏｒａ＋ａｔｉｏｎ）で、３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般的には、エピト ープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、さらに通常には少なく とも８−１０のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の高次構造の決定方法は 当該分野では公知であり、例えば、これらには、Ｘ線結晶解析および二次元核磁 気共鳴が含まれる。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が標的抗原に 対するその他の抗原の結合を阻む能力を示す、簡単な免疫アッセイにおいて同定 され得る。

本明細書中で使用されているように、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）　Ｊとは、 予防および／または治療Ｄｈｅｒａｐｙ）　（すなわち、あらゆる疾患症状の調 整）のことである。「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）　Ｊは、抗原性の莢膜多糖 またはオリゴ糖構造を有する細菌の感染が疑われる動物を意味し、これにはヒト を含む霊長類が包含されるが、これらに限定されない。「ワクチン」は、免疫原 性の、または、部分的または完全にこのような細菌に対する保護を誘起し得る、 個体の処置に有用な組成物である。

本発明のフンシュゲート化合物は、このタンパク質に特異的な、モノクローナル またはポリクローナル抗体の産生に使用され得る。これらの抗体を産生ずる方法 は、当該分野で公知である。

「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、およびその他 のこのような用語は、例えば、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡの受容体と して使用され得るかまたは使用されてきた、微生物、昆虫細胞、および哺乳類細 胞を示し、これには、形質転換されたもとの細胞の子孫も包含される。１つの母 細胞の子孫は、自然突然変異、偶発突然変異または意図的突然変異（ｄｅｌｉｂ ｅｒａｔｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）のために、形態学的に、または、ゲノムＤＮＡ または全ＤＮＡ補体が、必ずしも、もとの母細胞と完全に同一ではあり得ないこ とが理解される。

哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびサ ル腎（ＣＯＳ）細胞が含まれる。

詳細には、本明細書中で使用されているように、「細胞系」とは、インビトロに おいて継続してまたは長期間に増殖および分裂し得る細胞群のことである。しば しば、細胞系は１つの幹細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）からのクロー ン群である。さらに、このようなりローン群の貯蔵または転移の間に、核型に自 発変化または誘導変化が起こり得ることが、当該分野では公知である。従って、 いわゆる細胞系由来の細胞は、祖先細胞または培養物に正確には同一ではあり得 す、この細胞系には、このような変異体が包含される。用語「細胞系」はまた、 不死化細胞を包含する。好ましくは、細胞系は、非ハイブリッド細胞系、または 二細胞型のハイブリドーマを包含する。

本明細書中で使用されているように、用語「微生物」には、細菌および真菌のよ うな、原核微生物種および真核微生物種が包含され、後者には、酵母および糸状 菌が含まれる。

本明細書中で使用されているように、「形質転換」とは、挿入に用いられる方法 （例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−交配またはエレクトロボーレーション ）に関係なり、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入のことである。外因 性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（例えばプラスミド）として維持され 得るか、または、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。

ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関するときには、「精製された」および 「単離された」とは、示された分子が、同じ型のその他の生物学的高分子を実質 的に含まずに存在することを意味する。本明細書中で使用されているように、用 語「精製された」は、好ましくは、同じ型の生物学的高分子が、少なくとも７５ 重量％、さらに好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは少なくとも ９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％で存在することを意味 する（しかし、水、緩衝液、およびその他の小分子、特に、１０００未満の分子 量を有する分子は存在し得る）。

二　ＪＪ−五 一旦、適切な熱シヨツクタンパク質のコーディング配列が単離されると、それは 種々の異なる発現系、例えば、哺乳類細胞、バキュロウィルス、細菌、および酵 母により用いられる発現系、で発現され得る。

３．１．１：ＬＡ系 哺乳類発現系は当該分野で公知である。哺乳類プロモーターは、哺乳類ＲＮＡポ リメラーゼを結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）の＋ｕＲＮＡ への下流（３°）転写を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモータ ーは、通常はコーディング配列の５″末端近傍に位置する転写開始領域、および 、通常は転写開始部位の上流２５−３０塩基対（ｂｐ）に位置するＴＡＴＡボッ クスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがＲＮＡ合成を適 切な部位で開始させるのを導くと考えられている。哺乳類プロモーターはさらに 、通常はＴＡ　ＴＡボ・／クスの上流１００から２００　ｂｐ内に位置する上流 プロモーターエレメントを有する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始 される速度を決定し、いずれかの向きに作用し得る（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｒｖａｌ 、第二版（１９８９））。

哺乳類ウィルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、広範囲の宿主を有する；従 って、哺乳類ウィルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列 を提供する。例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウィルスＬＴＲプ ロモーター、アゾ／ウィルス主要後期プロモーター（Ａｄ　ＭＬＰ）　、および 単純ヘルペスウィルスプロモーターが含まれる。さらに、ネズミメタロチオネイ ン遺伝子のような非ウィルス遺伝子由来の配列もまた、有用なプロモーター配列 を提供する。発現は、構成的または調節され得（誘導可能な）、プロモーターニ 依存シて、ホルモン一応答細胞中でグルココルチコイドにより誘導され得る。

上記のプロモーターエレメントに組み合わされたエンハンサ−エレメント（エン ハンサ−）の存在は、通常は発現レベルを増大させる。エンハンサ−は、相同ま たは異種プロモーターに連結されたときに、通常のＲＮＡ開始部位で合成を開始 して、最高１０００倍まで転写を促進し得る調節ＤＮＡ配列である。さらに、エ ンハンサ−は、通常の向きまたは裏返しの向きで転写開始部位から上流または下 流に、または、プロモーターから１０００ヌクレオチドを超える位置に配置され るときに活性である　（Ｍａｎｉａｔｉｓら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２３ ７　（１９８９）；　ＡｌｂｅｒＬｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１１．第二版（１９８９））。ウィルス由来のエンハンサ−エ レメントは、通常は広範囲の宿主を有するので、特に有用であり得る。例には、 ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサ−（Ｄｉｊｋｅｍａら、（１９８５）　ＥＭＢＯ Ｊ、　４ニア６１）　、および、ラウス肉腫ウィルスの長末端反１　（ＬＴＲ） 由来（Ｇｏｒｍａｎら、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　７９：６７７？）およびヒトサイトメガｏ＋フィルス由来（Ｂｏｓｈ ａｒｔら、（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４に５２２１）のエンハンサ−／プロモー ターが含まれる。さらに、い（っかのエンハンサ−は、調節可能であり、ホルモ ンまたは金属イオンのような誘導物質が存在するときのみに活性になる（Ｓａｓ ｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉら、（１９８６）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、２：２Ｌ ５；　Ｍａｎｉａｔｆｓら、（１９８７）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２３フ ）　。

ＤＮＡ分子は、哺乳類細胞において細胞内に発現され得る。プロモータ配列はＤ ＮＡ分子に直接連結され得るが、この場合にはいつも、組換えタンパク質のＮ末 端の最初のアミノ酸がメチオニンであり、ＡＴＧ開始コドンによりコードされる 。所望であれば、Ｎ末端は、インビトロにおける臭化シアンとのインキュベーシ ョンにより、タンパク質から切断され得る。

あるいは、外来タンパク質はまた、哺乳類細胞で外来タンパク質の分泌をなすリ ーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子 をつくることにより、細胞から増殖培地内に分泌され得る。好ましくは、リーダ ーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるブロセ・ノシング部位が存在 し、これは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る。リー ダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を導く、疎水性アミ ノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。アデノウィルス３分節糸リーダーは 、哺乳類細胞内での外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。

一般には、哺乳類細胞により認識される転写終止およびポリアデニル化配列は、 翻訳終止コドンに対し３°側に位置する調節領域であり、従って、プロモーター エレメントとともに、コーディング配列に隣接する。成熟＋ａＲＮＡの３゛末端 は、部位特異的に翻訳後に切断され、ポリアデニル化されて形成される（　Ｂｉ ｒｎｓｔｉｅｌら、（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１：３４９；　Ｐｒｏｕｄｆｏ ｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ　（１９８８）　ｒ真核ＲＮＡの終結および３°末 端プロセツシング」Ｔｒａｎｓｃｒｉ　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓ　１ｉｃｉｎ　（ Ｂ、Ｄ、　Ｈａｍｅｓおよびり、Ｍ、　Ｇｌｏｗｅｒ編）：　Ｐｒｏｕｄｆｏｏ ｔ　（１９８９）’Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１４：１０５ ）。

これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮ Ａの転写を導（。転写ターミネータ−／ポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ ４０由来のものが含まれる（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら　（１９８９）、Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ）　。

い（つかの遺伝子は、イントロン（介在配列とも呼ばれる）が存在するときに、 より効率よく発現され得る。しかし、数個のｃＤＮＡは、スプライシングシグナ ル（スプライス供与部位および受容部位とも呼ばれる）が欠如しているベクター から効率よく発現された（例えば、ＧｅｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ　（ １９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９３：６２０を参照のこと）。イントロンは、ス プライス供与部位および受容部位を有するコーディング配列内の介在非コーディ ング配列である。それらは、−次転写物のポリアデニル化の後に、「スプライシ ング」と呼ばれるプロセスにより除去される（Ｎｅｗｉｎｓ　（１９８３）　Ａ ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５２：４４１；　Ｇｒｅｅｎ　（１９ ８６）　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、２０：６７１；　Ｐａｄｇｅｔｔら、 （１９８６）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５５：１１１９；　 ＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ　（１９８８）　ｒ　ＲＮＡスプライシ ングＪ　、　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｐｌｉｅｉｎｇ　（Ｂ、 Ｄ、　Ｈａｉｅｓおよびり、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒｉｉ））。

通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終止配列を含有する 上記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。エンハンサ−１機能性スプライ ス供与部位および受容部位を有するイントロン、およびリーダー配列もまた、所 望であれば発現構築物中に含まれる。発現構築物は、しばしば、哺乳類細胞また は細菌のような宿主中で安定に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラ スミド）のような、レプリコン中に維持される。哺乳類複製系には、複製にトラ ンス作用因子が必要とされる動物ウィルス由来のものが含まれる。例えば、ＳＶ ４０のようなパポーバウイルス（Ｇｌｕｚｍａｎ　（１９８１）　Ｃｅ１ｌ　２ ３：１７５）またはポリオーマウィルスの複製系を含むプラスミドが、適切なウ ィルスＴ抗原存在下で、非常に多数のコピーを複製する。哺乳類レプリコンのさ らなる例には、ウシパピローマウィルスおよびエプスタイン・バーウィルス由来 のものが含まれる。さらに、レプリコンは２つの複製系を有し得、このため、例 えば、発現のために哺乳類細胞中に、およびクローニングおよび増幅のために原 核生物宿主中に維持される。このような哺乳類−細菌シャトルベクターの例には 、ｐＭＴ２　（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、　９：９４６）　、およびｐＨＥＢｏ　（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）　 Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６：１０７４）が含まれる。

使用される形質転換方法は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌク レオチドの哺乳類細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、デキストラン介 在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン介在トランスフ ェクション、プロトプラスト融合、エレクトロボーレーションボリヌクレオチド のリポソーム内へのカプセル化、および、ＤＮＡの核への直接マイクロインジェ クションを包含する。

発現用の宿主として入手可能な哺乳類細胞系は、当該分野で公知であり、チャイ ニーズハムスター卵巣（Ｃ）１０）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯ３）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅｐ　 Ｇ２）および多くのその他の細胞系を含む、アメリカンタイプカルチャーコレク ション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を包含するが、これらに 限定されない。

ｉｉ、　バキュロウィルス系 タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、適切な昆虫発現ベクターに挿 入され得、ベクター内の制御エレメントに作動可能に連結される。ベクター構築 には、当該分野で公知の方法が用いられる。

一般的に、発現系の成分には転移ベクター、通常は細菌プラスミドが含まれ、こ れは、バキュロウィルスゲノムフラグメントと、発現されるべき異種の遺伝子ま たは遺伝子群挿入のための便宜的な制限部位との両方；転移ベクター内のバキュ ロウィルス特異フラグメントに相同な配列を有する野生型ハ牛ユロウィルス（こ れは、バキュロウィルスゲノム内への異種遺伝子の相同的組換えを考慮する）； および、適切な昆虫宿主細胞および増殖培地を含む。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列を転移ベクター内に挿入した後に、ベクター および野生型ウィルスゲノムが、昆虫宿主細胞内へトランスフェクトされ、そこ でベクターとウィルスゲノムとの組換えが起こる。パッケージングされた組換え ウィルスが発現され、組換えプラークが同定および精製される。

バキュロウィルス／昆虫細胞発現系用の材料および方法は、キット形態で、特に 、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡ　（ｒＭａｘＢａｃＪキ ット）から市販されている。これらの方法は当業者に公知であり、Ｓｕｍｍｅｒ ｓおよびＳｍ１ｔｈ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉ ＋＊ｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５　（１９８ ７）　（以後、ｒ　Ｓｕｍｍｅｒｓおよび５ｎｉｔｈＪ　）に十分に記載されて いる。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウィルスゲノムに挿入する前に、 プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコーディング配列、および転 写終止配列を含む上記の成分が、通常は中間置換構築物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｔｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）　（転移ベクター ）に組み立てられる。この構築物は、１つの遺伝子および作動可能に連結された 調節エレメント；各遺伝子がそれ自身の固有のセットの作動可能に連結された調 節エレメントを有する複数の遺伝子；または、同じセラトノ調節エレメントに調 節される複数の遺伝子を含み得る。中間置換構築物はしばしば、細菌のような宿 主中で安定して維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のよう な、レプリコン中に維持される。レプリコンは１つの複製系を有し、このため、 クローニングおよび増幅のために適切な宿主中に維持される。

現在では、ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するための最も一般的に使用される転 移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知のその他の多くのベクターも また設計されている。これらは、例えば、ｐＶＬ９８５　（ポリヘトリン開始コ ドンをＡＴＧからＡＴＴに変え、ＡＴＴ下流３２塩基対にＢａａ＋旧クローニン グ部位を導入する；ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｍａ＋ｅｒｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 　（１９８９）　１７：３１を参照）。

プラスミドは通常さらに、ポリへドロンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒ ら　（１９１１８）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　４２：１ ７７）、および、選択およびＥ、　ｃｏｌｉ中での増殖のための原核アンピシリ ン耐性（憇ｐ遺伝子および複製起点を含有する。

バキュロウィルス転移ベクターは通常、／イキュロウイルスプロモーターを含有 する。バキニロウイルスプロモーター（よ、バキュロウィルスＲＮＡポリメラー ゼを結合し得、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの 下流（５°力１ら３°）翻訳を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロ モーターは、コーディング配列の５°末端近傍に通常位置する転写開始領域を有 する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポ１７メラーゼ結合部位および転写開始 部位を含有する。バキュロウィス転移ベクターもまた、エンハンサ−と呼ばれる 第ニドメインを有し得、これは存在する場合には、構造遺伝子の遠位に存在する 。発現は調節され得るか、または構成的であり得る。

ウィルス感染サイクルの後期に多量に転写された構造遺伝子は、特に有用なプロ モーター配列を提供する。例には、ウィルスポリヘドロンタンパク質をコードす る遺伝子由来の配列（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）　ｒバキュロウィルス遺 伝子発現の調節Ｊ　、　Ｔｈｅ’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ旦　ｏｆ　Ｂａｃ ｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　（Ｗａｉｔｅｒ　Ｄｏｅｒｆｌｅｒｍ）　：　ＥＰＯ公 開Ｎｏ、１２７８３９およびＮｏ、１５５４７６）　；および、ｐｔｏタンパク 質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、（１９８ｇ）、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏ ｌ、　６９ニア６Ｓ）が含まれる。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、ノクキ二ロウイルスポリヘドリン遺 伝子のような、昆虫またはノイキ二ロウイルスＧｅｎｅ、　７３：４０９）。あ るいは、哺乳類細胞の翻訳後の改変（シグナルペプチド切断、タンパク質分解切 断、およびリン酸化のような）のためのシグナルは、昆虫細胞により認識される と考えられてお、す、そして分泌に必要なシグナルおよび核集積は、無を椎動物 細胞とを椎動物細胞との間で保存されてｔλるとも考えられているので、ヒトα −インターフェロン（Ｍａｅｄａら、（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　３１５： ５９２）　；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ら、（１９８８）、　Ｍｏ１ｅｅ、　Ｃｅ１１．旧ｏ１．８：３１２９）　；　 ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８２：８４０４）　；マウス　ＩＬ−３，（Ｍｉｙａｊｉ ｍａら、（１９８７）Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　５８　：２７３　：および、ヒトグルコ セレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら　（１９８Ｂ）　ＤＮＡ　７：９９）をコー ドする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーもまた、昆虫での分泌を提供 するために使用され得る。

組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内に発現され得るか、または 、適切な調節配列で発現されれば分泌され得る。非融合外来タンパク質の良好な 細胞内発現は通常、ＡＴＧ開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含有す る短いリーダー配列を理想的に有する異種遺伝子を必要とする。

所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのイン キュベーションにより、成熟タンノくり質から切断され得る。

あるいは、組換えポリタンパク質または天然では分泌されないタンパク質は、昆 虫において外来タンノくり質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを有す る融合タンノ寸り質をコードするキメラＤＮＡ分子をつくることにより、昆虫細 胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、小胞体へのタンパク質 の輸送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を導く、疎水性アミノ酸を有するシグナ ルペプチドをコードする。

タンパク質の発現産物の前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の 挿入後に、昆虫細胞宿主を、転移ベクターのＸ　種ＤＮＡと野生型バキュロウィ ルスのゲノムＤＮＡとで共形質転換（通常は共トランスフェクション）する。構 築物のプロモーターおよび転写終止配列は、通常バキュロウィルスゲノムの２− ５　ｋｂ断片を含有する。バキュロウィルスの所望の部位に異種ＤＮＡを導入す る方法は、当該分野で公知である。（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｎ＋１ｔｈＨＪｕ ら（１９８７）；　Ｓｏ＋ｉｔｈら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

（１９８３）　３：２１Ｓ６；および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ　（ １９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、ポリヘトリン遺伝子のような遺伝 子に、相同的二本鎖交差組換えによりなされ得る；挿入はまた、所望のバキュロ ウィルス遺伝子中に設計された制限酵素部位になされ得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（ １９８９）、　Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ　４：９１゜ＤＮＡ配列は、発現ベクターの ポリヘトリン遺伝子の位置にクローニングされたときには、ポリヘトリン特異配 列により、５°および３°両側に隣接され、ポリへドリンプロモーターの下流に 配置される。

新たに形成されたバキュロウィルス発現ベクターは、次に、感染性組換えバキュ ロウィルス中にパフケージングされる。

相同的組換えは低頻度（約１％と約５％との間）で生じるため、共トランスフェ クション後に産生された主要なウィルスは、まだ野生型である。従って、組換え ウィルスを同定する方法が必要である。発現系の利点は、視覚スクリーニングに より、組換えウィルスの区別が可能であることである。天然ウィルスにより産生 されるポリヘトリンタンパク質は、ウィルス感染後、後期に感染細胞の核に非常 に高レベルで産生される。

集積されたポリヘトリンタンパク質は、埋め込まれた粒子をも含む封入体を形成 する。これらの封入体は、１５μｍまでの大きさであり、非常に屈折性であるた めに、光学顕微鏡下で容易に視覚化される光沢のある外観となる。組換えウィル スに感染した細胞には、封入体がない。野生型ウィルスから組換えウィルスを区 別するには、トランスフェクション上清を、当業者に公知の方法により、単層の 昆虫細胞上でプラーク形成させる。すなわち、プラークを光学顕微鏡下で、封入 体の存在（野生型ウィルスの指標）または非存在（組換えウィルスの指標）につ いてスクリーニングする。ｒ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＪ　Ｖｏｌ、２　（Ａｕｓｕｂｅｌら、り　１６．８　 （Ｓｕｐｐ。

１０．１９９０）　；　ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳ＋＋ｉｔｈ；　Ｍｉｌｌｅｒら （１９８９）。

組換えバキニロウイルス発現ベクターは、数種の昆虫細胞への感染のために開発 されている。例えば、組換えバキュロウイルは、とりわけ、Ａｅｄｅｓ　ａｅ　 ｔｔＳＡｕｔｏ　ｒａ　ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎ山、Ｂｏｍｂ　ｘ　ｍｏｒｉ、 Ｄｒｏｓｏ　ｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏ　ａｓｔｅｒ、シＷ止逼佳ｌ臼。

江ユ狂肛■、およびＴｒｉｃｈｏ　１ｕｓｉａ　ｎｉのために開発されている（ ＰＣＴ公開Ｎｏ、ＷＯ８９１０４６６９９；　Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８ ５）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

５６：１５３；　Ｗｒｉｇｈｔ　（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１ニア１８ ；　Ｓｍ１ｔｈら、（１９８３）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３：２１ ５Ｓ；および一般的にはＦｒａｓｅｒら（１９８９）Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１ １．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　２５：２２５を参照のこと）。

細胞および細胞培養培地は、バキュロウィルス／発現系での異種ポリペプチドの 直接発現および融合発現市販されている；細胞培養法は、一般に当業者に公知で ある。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈを参照のこと。

次に、改変昆虫細胞は、適切な栄養培地で増殖され得る。

この栄養培地により、改変昆虫宿主内に存在するプラスミドは安定に維持され得 る。発現産物遺伝子が誘導制御下にある場合には、宿主は高密度に増殖され得、 発現が誘導され得る。

あるいは、発現が構成的である場合には、産物は培地に連続的に発現される。目 的の産物を取り出し、枯渇した栄養分を補給しながら、栄養培地を連続的に取り 替えねばならない。

産物は、例えば、ＨＰＬＣ，アフィニティークロマトクラフィー、イオン交換ク ロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶 媒抽出などの方法で精製され得る。適切には、培地に分泌されるかまたは昆虫細 胞溶解から生じるいずれもの昆虫タンパク質を実質的に除去するために、宿主の 破片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少な（とも実質的に含まない 産物を提供するために、必要であれば産物はさらに精製され得る。

タンパク質発現を得るために、形質転換体由来の組換え宿主細胞は、配列をコー ドする組換えタンパク質の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。こ れらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化する。しかし、条件は、当該 分野で公知のものに基づいて、当業者に容易に確認され得る。

（以下余白） ｉｌｌ、細菌系 細菌発現法は当該分野で公知である。細菌プロモーター（よ、細菌ＲＮＡポリメ ラーゼに結合し得、コーディング配列（例え（ｆ、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの 下流（３°′）転写を開始し得る一＼ずれものＤＮＡ配列である。プロモーター は、通常コーディング配列の５′末端近傍に位置する転写開始領域を有する。こ の転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開女台部位を含 む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼（ｆれる第ニドメインを有し得 、これは、ＲＮＡ合成を開始する位置である隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位に 重複し得る。遺伝子１）ブレノサータンパク質はオペレターに結合し得、そのこ と↓こより特異遺伝子の転写を阻害し２得るので、オペレーター（ま、負の調節 （誘導可能な）転写を行い得る。構成的発現（ま、オペレーターのような負の調 節エレメントの非存在下で起こり得る。

さらに、正の調節は、遺伝子活性化タン、ｆり質結合配Ｖ１ｊ＋こより達成され 得、これは、存在する場合（こ（ま、通常ＲＮＡボ１ツメラーゼ結合配列（５° ）の近くに存在する。遺伝子活性イヒタンノ＜り質の例は、カタボライト活性化 タンノ（り質（ＣＡＰ）であり、これは、Ｅ、　ｃｏｌｉでのｌａｃオペロンの 転写開始を助１する（　Ｒａ１ｂａｕｄら（１９８４）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、 　Ｇｅｎｅｔ、　１８：１７３）　ｏ従って、調節的発現は正または負のいずれ かであり得、そのこと（こより転写を促進または減退する。

代謝経路の酵素をコードする配列（ま、特（こ有用なプロモーター配列を提供す る。例には、力′ラクトース、ラクトース（ｎリ　（Ｃｈａｎｇら（１９７７） 　Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６）　、およびマルトースのような糖代謝酵素 由来のプロモーター配列が含まれる。

さらなる例には、トリプトファン蛛■）のような生合成酵素由来のプロモーター 配列が含まれる（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）　Ｎｕｃ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８：４０５７；　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）　Ｎ ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

９＋７３１；米国特許第４．７３８．９２１号、　ＥＰＯ公開Ｎｏ、　０３６７ ７６およびＮｏ。

ｔ２１７７５）　。ｇ−ラオタマーゼ（ｇ−１ａｏｔａ＋ａａｓｅ）　（ｂｌａ ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ　（１９８１）　ｒインターフェロンノ クローニンクおよびその他の誤り（ｍｉｓｔａｋｅｓ）Ｊ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏ ｎ　３（１，ＧｒｅｓｓｅｒＩｉｉ＞、バクテリオファージλｐｌ　（３１１ｉ ａ＋ａｔａｋｅら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ２９２：１２８）　、およびＴ５ （米国特許第４．６８９．４０６号）プロモーター系もまた、有用なプロモータ ー配列を提供する。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた細菌プロモーターとして機能 する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化 配列は、その他の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列に 接続され得て、合成雑種プロモーターをつくる（米国特許第４．５５１．４３３ 号）。例えば、以にプロモーターは、Ｉ且すプレ、、。

サーにより調節される、月１プロモーターおよびｌａｃオペロン両配列配列有す る雑種ニー助至プロモータ・−である（　Ａｍａｎｎら（１９８３）　Ｇｅｎｅ 　２５：１６７；　ｄｅ　Ｂｏｅｒら（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ。

Ｓｅｔ、　８０：２１）。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラー ゼに結合し、転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモ ーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合する ＲＮＡポリメラーゼと結合して原核生物中である種の遺伝子を高レベルで発現し 得る。バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合 されたプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）　Ｊ、Ｍｏ１ ．　Ｂｉｏｌ、１８９＋１１３；　Ｔａｂｏｒら（１９８５）　Ｐｒｏｃ　Ｎａ ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　８２：１０７４）　。さらに、雑種プロモーターもマタ 、バクテリオファージプロモーターおよびＥ、　ｃｏｌｉオペレーター領域を含 有し得る（ＥＰＯ公開Ｎｏ、　２６７８５１）。

機能プロモーター配列に加えて、能率のよいリポソーム結合部位もまた、原核生 物での外来遺伝子の発現に有用である。

Ｅ、　ｃｏｌｔでは、′リポソーム結合部位はシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配 列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３−１１ヌクレオチド上 流に位置する３−９ヌクレオチドの長さの配列を含む（５ｈｉｎｅら（１９７５ ）　Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４）　、　ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ、　ｃｏｌ ｉ　１６Ｓ　ｒＲＮＡの３°末端（３°ａｎｄ）との間で塩基対合してｍＲＮＡ のリポソームへの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９ ）　ｒメツセンジャーＲＮＡにおける遺伝シグナルおよびヌクレオチド配列Ｊ　 、　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｒｅ　ｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄＤｅｖｅｌｏ　ｍｅ ｎｔ：　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ　（Ｒ，Ｆ、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ ！１ｆ））　ａ弱すポソーム結合部位を有する原核遺伝子および真核遺伝子を発 現するためには、Ｓａａ＋ｂｒｏｏｋら（１９８９）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌを参照のこと０ＤＮＡ 分子は細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、直接ＤＮＡ分子に連結され 得、その場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸はメチオニンであり、これはＡＴＧ開始 コドンによりコードされる。必要であれば、Ｎ末端のメチオニンは、インビトロ における臭化シアンとのインキュベーション、または細菌メチオニンＮ末端ペプ チダーゼとのインビボまたはインビトロインキュベーションにより、タンパク質 から切断され得る（ＥＰＯ公開Ｎｏ、２１９２３７）　。

融合タンパク質は、直接発現の代替を提供する。通常は、内因性細菌タンパク質 またはその他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、異種 コーディング配列の５゛末端に融合される。発現に際し、この構築物は、２つの アミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バタテリオファージλ細胞遺伝子が外 来遺伝子の５゛末端で連結され得、細菌内で発現され得る。得られた融合タンパ ク質は、好ましくは、外来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を切断する ためのプロセッシング酵素（因子Ｘａ）に対する部位を保持している（Ｎａｇａ ｉら（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９：８１０）　。融合タンパク質はまた １ａｃＺ由来の配列を用いて生成され得る（Ｊｉａら（１９Ｂ？）　Ｇｅｎｅ　 ６０：１９７．　シ」ｌ、Ａ１１ｅｎら（１９８７）　Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌ、５：９３；　Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ、　１３５：１１、およびＥＰＯ公開Ｎｏ、３２４５４７、　ｇｅｎｅｓ ）。２つのアミノ酸配列を接続したＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得るか、 またはコードし得ない。その他の例は、ユビ牛チン融合タンパク質である。この ような融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子からユビキチンを切断するた めのプロセッシング酵素（例えば、ユビ牛チン特異的プロセッシングプロテアー ゼ）に対する部位を保持しているユビキチン領域を用いて生成される。この方法 によって、そのままの外来タンパク質が単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８ ９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：６９８）　。

あるいは、外来タンパク質はまた、細菌で外来タンパク質分泌を提供するシグナ ルペプチド配列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードするキメラＤＮ Ａ分子をつくることにより、細胞から分泌され得る（米国特許第４．３３６．３ ３６号）。シグナル配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質分泌を導く 疎水性アミノ酸を含有するシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖 培地（グラム陽性細菌）、または、細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺 腔（グラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。好ましくは、シグナルペプチド フラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存在し、 これはインビボまたはインビトロにおいて切断され得る。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ、　ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝 子Ｑｌ己）　（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａ ｎｉｕｌａ目ｏｎ　ｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎＨＧｈｒａｙｅｂら （１９８４）　ＥＭＢＯＪ、３：２４３７）およびＥ、　ｃｏｌｉアルカリホス ファターゼシグナル配列（劇）　（Ｏｋａら（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８２ニア２１２）のような、分泌される細菌タンパク質の 遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα −アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、旦、　５ｕｂｔｉｌｉｓから異種タンパ ク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９１１２）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７９：５５８２；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、　２４４ ０４２＞。

通常、細菌により認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンに対して３°側に 位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング配列に隣 接する。これらの配列は、ＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る１ ＩＩＲＮＡの転写を導く。転写終止配列はしばしば、転写終止の助けとなるステ ムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例には、 Ｅ−、ｃｏＩｉ、のｍ遺伝子およびその他の生合成遺伝子のような、強プロモー ターを伴った遺伝子由来の転写終止配列が含まれる。

通常、プロモーター、シグナル配列（所望であれば）、目的のコーディング配列 、および転写終止配列を含む上記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。発 現構築物は、細菌のような宿主に安定して維持され得る染色体外エレメント（例 えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レプリコンは、１つ の複製系を有し、このため、発現、またはクローニングおよび増幅のいずれかの ために原核宿主中に維持される。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コ ピー数のプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般的に、約５か ら約２００、そして通常約１０から約１５０、の範囲のコピー数を有する。高コ ピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ま しくは少なくとも約２０のプラスミドを含有する。高コピー数または低コピー数 のいずれかのベクターが、宿主でのベクターの効果および外来タンパク質に依存 して選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて細菌ゲノムに組み込まれ得る 。組込みベクターは通常、ベクターの組込みを可能にする細菌染色体に相同な少 な（とも１つの配列を含有する。組込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色 体との間の組換えによると考えられる。例えば、種々のＢａｃｉｌｌＵＳ株由来 のＤＮＡで構築された組込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込む（ ＥＰＯ公開Ｎｏ、　１２７３２８）。組込みベクターはまた、バクテリオファー ジまたはトランスポゾン配列を含有し得る。

通常、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された細菌株の選択を可能 にする選択マーカーを含有し得る。選択マーカーは、細菌宿主中で発現され得、 アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオ マイシン）およびテトラサイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝 子を含有し得る。（Ｄａｖｉｅｓら、（１９７８）Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、　３２：４６９）　ｏ選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリ プトファン、およびロイシンの生合成経路でのような、生合成遺伝子を含み得る 。

あるいは、上記成分のいくつかは、形質転換ベクター中に組み立てられ得る。形 質転換ベクターは通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクターに組 み込まれる選択マーカーを含有する。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクター は、多（の細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは 、特に以下の細菌のために開発されている：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ ｉｓ、　Ｐａ１ｖら（１９８２）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　７９：５５８２：　ＥＰＯ公開Ｎｏ、　０３６２５９およびＮｏ、 ０６３９５３；　ＰＣＴ公開Ｎｏ、Ｗｏ　８４１０４５４１：　Ｅ、　ｃｏｌｔ 、　Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８：　Ａ ｍａｎｎら（１９８５）　Ｇｅｎｅ　４０：１１１３；Ｓｔ、ｕｄｉｅｒら（１ ９８６）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８９：１１３；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、０ ３６７７６、　Ｎｏ、１３６８２９およびＮｏ、１３６９０７；　５ｔｒｅ　ｔ ｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ、　Ｐｏｖｅｌｌら（１９８８）　Ａｐｐｌ 、Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４：６５５；　■匹旦ｏｃｏｃｃ ｕｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ、　Ｐｏｗｅｌｌら（１９８ｇ）　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉ ｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５４＋６５５；および５ｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅ ｓ二■ｖｉｄａｎｓ、米国特許第４，７４５．０５６号。

外因性ＤＮＡの細菌宿主への導入方法は当該分野で周知であり、ＣａＣｌ２、ま たは、二価カチオンおよびＤＭＳＯのようなその他の試薬で処理された細菌の形 質転換を包含する。ＤＮＡはまた、エレクトロボーレーションにより細菌細胞中 に導入され得る。形質転換の方法は、通常形質転換されるべき細菌種により変化 する。Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ 、６０：２７３；　Ｐａ１ｖａら（１９８２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７９：５５８２；　ＥＰＯ公開Ｎｏ、０３６２５９ およびＮｏ、０６３９５３；　ＰＣＴ公開Ｎｏ、　Ｗｏ　８４１０４５４１、匠 旦旦に関するＨ　Ｍｉｌｌｅｒら（１９８Ｂ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　８５：８５６；　Ｗａｎｇら（１９９０）　Ｊ、Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ、１？２：９４９、Ｃａｎ　１ｏｂａｃｔｅＬに関するＨ　Ｃｏｈｅｎ ら（１９７３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、６９：２１１ ０ＨＤｏｗｅｒら（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｌ６： ６１２７：　Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）　ｒ　Ｃｏ１Ｅ１由来プラスミドによ るＥ、　ｃｏｌｉ形質転換のためｙｅｒおよびＳ、Ｎ１ｃｏｓｉａ！１ｌＷ）　 ；　Ｍａｎｄｅｌら＜１９７０）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

５３：１５９；　Ｔａｋｅｔｏ　（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、　Ａｃｔａ　９４９：３１８、Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉａに関するＨ　 Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ＬｅＬｔ、　４ ４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに関するＨ　Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９ ８８）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　１７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに 関するＨ　Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　Ｌｅｔｔ、６６：２０３、Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓに関する；　Ｂａｒ ａｎｙら（１９８０）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４４：６９８；　Ｈａｒｌ ａｎｄｅｒ　（１９８７）「エレクトロボーレーションによる５ｔｒｅ　ｔｏｅ ｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉΣの形質転換Ｊ　、　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｊ、　ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ，Ｃｕｒｔｉｓｓ　１１１ 編）：　Ｐｅｒｒｙら（１９８１）　１ｎｆｅｃ、Ｉｍｍｕｎ、３２：１２９５ ；　Ｐｏｗｅｌｌら（１９８Ｂ）　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、５４：６５５；　Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）　Ｐｒｏｃ、４ｔｈ　Ｅ ｖｒ、　Ｃｏｎｇ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１：４１２、汁脛担空遼匹 旦に関する、を参照のこと。

ロス　」１１λ里 酵母発現系もまた当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメ ラーゼに結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下 流（３°）転写を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、 コーディング配列の５°末端近傍に通常位置する転写開始領域を有する。この転 写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（ｒＴＡＴＡボックス」）およ び転写開始部位を含む。酵母プロモーターはさらに、上流活性化配列（ＵＡＳ） と呼ばれる第ニドメインを有し得、これは、存在する場合には通常構造遺伝子の 遠位に存在する。ＵＡＳにより、調節（誘導可能な）発現が行われる。構成的発 現は、ＵＡＳの非存在下で起こる。調節的発現は正または負のいずれかであり得 、そのことにより転写を促進または減退する。

酵母は、活性代謝経路を有する発酵微生物であり、従って、代謝経路の酵素をコ ードする配列は特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、アルコールデ ヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）　（ＥＰＯ公開Ｎｏ、２８４０４４）　、エノラーゼ 、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド −３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）　、ヘキソキナーゼ 、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン 酸キナーゼ（ＰｙＫ）　（ＥＰｏ公開Ｎｏ、　３２９２０３）が包含される。酸 性ホスファターゼをコードする酵母二遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を 提供する（　Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：１）。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機 能する。例えば、１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモータ ーの転写活性化領域に接続され得、合成雑種プロモーターがつくられ得る。この ような雑種プロモーターの例には、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤ）Ｉ 調節配列が含まれる（米国特許第４．８７６．１９７号および米国特許第４．８ ８０．７３４号）。雑種プロモーターのその他の例には、ＧＡＰまたはＰＦＫの ような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に組み合わされた、囮、凹、■、または 硼遺伝子にいずれかの調節配列からなるプロモーターが含まれる（ＥＰＯ公開Ｎ ｏ、　１６４５５６）。さらに、酵母プロモーターには、酵母ＲＮＡポリメラー ゼに結合し、転写を開始する能力を有する、非酵母起源の天然に存在するプロモ ーターが含まれ得る。このようなプロモーターの例には、特に、Ｃｏｈｅｎら（ １９８（１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：１０７８；　Ｈｅｎ１ｋｏｆｆら（１９８ １）　Ｎａｔｕｒｅ　２８３：８３５；　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１） 　Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍ＋ｎｕｎｏｌ。

９６：１１９；　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）　ｒ酵母５ａｃｃｈａｒ ｏ＋ａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｆｓｉａｅでの細菌抗生物質耐性遺伝子の発現Ｊ　 ：　Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅ虹組Ｌ」■江坦肱吐肚ユｌユ坦狙匡ｉａｌ　 Ｉｎ胆旦、ヨ（Ｋ−９・１１ｍｍ１ｓおよびＡ、　Ｐｕｈｌｅｒ１２）：　Ｍｅ ｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１１：１６３；　 Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　２：１０９が、 含まれる。

ＤＮＡ分子は酵母において細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ 分子に直接に連結され得、その場合には、組換えタンパク質のＮ末端の最初のア ミノ酸はいつもメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コドンによりコードされる 。所望であれば、Ｎ末端メチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのイン キュベーションにより、タンパク質から切断され得る。

融合タンパク質は、哺乳類、バ牛ユロウィルス、および細菌発現系と同様に、酵 母発現系の代替を提供する。通常、内因性酵母タンパク質またはその他の安定な タンパク質のＭａｉ１部分をコードするＤＮＡ配列が、異種コーディング配列の ５°に融わ　合される。発現に際し、この構築物は、２つアミノ酸配列の合　融 合を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（５Ｏ Ｄ）遺伝子が、外来遺伝子の５°末端で連結され得、酵母で発現され得る。２つ のアミノ酸配列の接続部位ＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得るか、またはコ ードし得ない。例えば、εＰＯ公開Ｎｏ、　１９６０５６を参照のこと。その他 の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ま しくは、外来タンパク質からユとキチンを切断するためのプロセッシング酵素（ 例えば、ユビキチン特異的プロセッシングプロテアーゼ）に対する部位を保持し ているユとキチン領域でつくられる。従って、この方法によってそのままの外来 タンパク質が単離され得る（例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ、　Ｎｏ　８８１０２４０ ６６を参照のこと）。

あるいは、外来タンパク質はまた、酵母での外来タンパク質の分泌を提供するリ ーダー配列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ 分子をつくることにより、細胞から増殖培地に分泌され得る。好ましくは、リー ダーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存在 し、インビボまたはインビトロのいずれがで切断され得る。リーダー配列フラグ メントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を導く疎水性アミノ酸を含有するシ グナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰＯ 公開Ｎｏ、０１．２８７３．　ＪＰＯ公開Ｎｏ、　６２．０９６．０８６）およ びＡ因子遺伝子（米国特許第４．５８８．６８４号）のような、分泌酵母タンパ ク質の遺伝子に由来し得る。あるい、は、インターフェロンリーダーのような、 非酵母起源のリーダーが存在し、これもまた酵母での分泌を提供する（　ＥＰＯ 公開Ｎｏ、　０６００５７）。

分泌リーダーの好ましいクラスには、酵母α因子遺伝子のフラグメントを用いる リーダーがあり、これはｒｐｒｅＪシグナル配列およびｒｐｒｏＪ領域の両方を 含有する。用いられ得るα因子フラグメントの型には、全長ｐｒｅ−ｐｒｏα因 子リーダー（約８３アミノ酸残基）および切断型α因子リーダー（通常約２５か ら約５０アミノ酸残基）が含まれる（米国特許第４．５４６．０８３号および米 国特許第４．８７０．００８号；　ＥＰＯ公開ＮｏＪ２４２７４）　。分泌を提 供するα因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダーには、第一酵母のｐｒ ｅ配列でつくられたハイブリッドα因子リーダーが含まれるが、第二酵母のα因 子のｐｒｏ領域は含まれない。（例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ、　Ｗｏ　８９１０２ ４６３を参照のこと）。

通常、酵母により認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンに対して３°側に 位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング領域に隣 接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得 るｍＲＮＡの転写を導く。転写終止配列およびその他の酵母認識終止配列の例は 、解糖酵素をコードする配列などである。

通常、プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的の発現構築物中に組み立 てられる。発現構築物はしばしば、酵母または細菌のような宿主中に安定して維 持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中 に維持される。レプリコンは２つの複製系を有し得、このため、例えば、発現の ために酵母中に、およびクローニングおよび増幅のために原核宿主中に維持され る。このような酵母−細菌シャトルベクターの例には、ＹＥｐ２４　（Ｂｏｔｓ ｔｅｉｎら（１９７９）　Ｇｅｎｅ　８：１７−２４）　：　ｐｃｉ／１　（Ｂ ｒａｋｅら（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　５ｅｉＵＳＡ　８ １：４６４２−４６４６）　；およびＹＲｐ１７　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏａ＋ｂら （１９８２）　Ｊ、　Ｍｏ１ＸＢｉｏ１．１５８：１５７）が含まれる。さらに 、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のプラスミドであり得る。高コピ ー数のプラスミドは一般に、約５から約２００の範囲のコピー数を有し、通常約 １０から約１５０のコピー数を有する。

高コピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より 好ましくは少なくとも約２０を有する。高コピー数または低コピー数のベクター は、宿主におけるベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して選択され得る 。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて酵母ゲノムに組み込まれ得る 。組込みベクターは通常、ベクターの組込みを可能にする、酵母染色体に相同な 少なくとも１つの配列を含有し、好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同 な配列を含有する。組込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと酵母染色体との間の組 換えによると考えられる（　０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１＋２２８−２４５）　ｏ組込みベクター は、ベクター中への封入に適切な相同配列を選択することにより、酵母の特異的 な座に導かれ得る。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生される 組換えタンパク質レベルに影響し得る（Ｒ４ｎｅら（１９８３）　Ｐｒｏｅ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクター中の１ つのセグメントとして存在して、完全ベクターの組込みになり得るか、または、 染色体中の隣接セグメントに相同で、ベクター中で発現構築物に隣接する２つの セグメントとして存在して、発現構築物のみの安定な組込みになり得る。

通常は、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可 能にする選択マーカーを含有し得る。

選択マーカーは、囮、肛旦、匡、皿、およびＡｌＯ２のような、酵母宿主で発現 され得る生合成遺伝子、および、ツニカマイシンおよびＧ４１８のそれぞれに対 する酵母細胞において耐性を与える０４１８耐性遺伝子を含み得る。さらに、適 切な選択マーカーはまた、金属のような毒素化合物の存在下で増殖する能力を有 する酵母を提供し得る。例えば、Ｃｕｔｌす２の存在は、銅イオンの存在下での 酵母の増殖を可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒ ｅｖ、　５１：３５１）。

あるいは、上記成分のいくつかは、形質転換ベクター中に組み立てれられ得る。

形質転換ベクターは通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクターに 組み込まれる選択マーカーを含有する。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクター は、多くの酵母の形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、 特に以下の酵母のために開発されている：　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ 　（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｂ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、６：１４２）　 ；　Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ　（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、　Ｂ ａ５ｉｃ　Ｍｆｃｒｏｂｉｏｌ、　２５：１４１）　；　）Ｉａｎｓｅｎｕｌａ 　ｏｌ　ｎｏｒ　ｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら＜１９８６）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、１３２：３４５９；　Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）　Ｍｏ １．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０２：３０２）　；　Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｎ　ｃｅ ｓチユ〔上１ｓ（Ｄａｓら（１９８４）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５８：１ １６５）　；　ＵＩＤｌｒｏＩＩｌｃｅｓ　ｌ　ｃｔｉｓ　（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅ ｎｃｏｕｒｔら（Ｌ９８３）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４ニア３７；　 Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８ ：１３５）　；　Ｐｉｃｈｉａ　ｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ　（Ｋｕｎｚｅら （１９８５）　Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

２５：１．４１）　：　Ｐｉｃｈｉａ　ａｓｔｏｒｉｓ　（Ｃｒｅｇｇら（１９ ８５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５＋３３７６；米国特許第４．１ １３７．１４８号および米国特許第４．９２９、５５５号）　：　Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）　Ｐｒ ｏｅ、Ｎａｔｌ’、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　７５：１９２９；　ｌｔｏら（ １９Ｂ３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｔ、１５３：１６３）　；　Ｓｃｈｉｚｏｓ ａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｏｍｂｅ　（Ｂｅａｃｈら（１９８１）　Ｎａｔｕ ｒｅ　３００ニア０６）　；および、Ｙａｒｒｏｗｉａ　Ｉｆ　ｏｆ　ｔｉｃａ 　（Ｄａｖｉｄｏｔら（１９８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、１０：３８０４７ １　Ｇａ１１１ａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　１０：４ ９）　。

外因性ＤＮＡの酵母宿主への導入方法は、当該分野では公知であり、通常は、ス フ二ロプラストまたは完全酵母細胞をアルカリカチオンで処理する形質転換を包 含する。形質転換方法は通常、形質転換される酵母種により変化する。例えば、 Ｋｕｒｔｚら（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、６：１４２；　 Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２５：１ ４１、Ｃａｎｄｉｄａに関するＨ　Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ、Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｙ、１３２：３４５９；　Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６ ）　Ｍａｔ、Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０２：３０２、Ｈａｎｓｅｎｕｌａに 関するＨ　Ｄａｓら（１９８４）　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５８：１１６５；　Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら　 （１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４：１１６５；　Ｖａｎ　ｄｅｎ 　Ｂｅｒｇら（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５、■ｕ 　ｖｅｒｏｍ　ｃｅｓに関するＨ　Ｃｒｅｇｇら（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ １１．　Ｂｉｏｌ、５：３３７６；　Ｋｕｎｚｅら（１９８５）　Ｊ、Ｂａ５ｉ ｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２５：１４１；米国特許第４．８３７．１４８号およ び米国特許第４．９２９．５５５号、囮ｎに関する；　Ｈｉｎｎｅｎら（１９７ ８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７５；１９２９；　 Ｉｔｏら（１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３：１６３、論μホｙ旦 吐ｃｅｓに関する；　Ｂｅａｃｈら（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア０ ６．５ｃｈｉｚｏｓａｃｃ■」」１匣に関する；　Ｄａｖｉｄｏｖら（１９８５ ）　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、１０：３９ＨＧａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５ ）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、１０：４９、Ｙａｒｒｏｗｉ３に関する；参照のこ と。

４　ワクチン 本明細書中で考察されている各コンジュゲート化合物は、単一ワクチン候補物と して、または他の病原由来の１つ以上のその他の抗原との組み合わせで使用され 得る。これらのワクチンは、予防剤（感染を予防するため）または治療剤（感染 後に疾患を治療するため）のいずれかであり得る。

このようなワクチンは、コンジュゲート化合物を、通常は「薬学的に受容可能な キャリア」との組合せで含有し、このキャリアは、この組成物が与えられる個体 に対して有害な抗体の産生をそれ自身が誘導しないいずれものキャリアを含む。

適切なキャリアは、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコー ル酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴また はリポソーム）、および不活性ウィルス粒子のような、大きくて徐々に代謝され る高分子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これら のキャリアは、免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗 原は、ジフテリア、破傷風などのような細菌トキソイドにコンジュゲートされ得 る。

組成物の効果を増強させる好ましいアジユバントには、以下が包含されるが、こ れらに限定されない＝（１）アルミニウム塩（ａｌｕｒＡ）　（水酸化アルミニ ウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジ ョン製剤〔ムラミルペプチド（下記を参照）のようなその他の特異的免疫刺激剤 または細菌細胞壁成分を伴うまたは伴わない〕、例えば、（ａ）ＭＦ５９　（Ｐ ＣＴ公開Ｎｏ、　Ｗｏ　９０／１４８３７）　：　５％スクワレン、０．５％Ｔ ｗｅｅｎ　８０、および０．５％５ｐａｎ　８５　［：必須ではないが必要に応 じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ　（下記を参照）を含有する〕を含有して、１１ ０Ｙ型マイクロフルイダイザ−（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、　Ｎｅｗｔ。

ｎ、　ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用して、サブミクロン粒子に 処方される；　（ｂ）ＳＡＰ：　１０％スクワラン、０．４％Ｔｖｅｅｎ　８０ ．５％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−ブＣ１・７クポリマーＬ１２１、お よびｔｈｒ−ＭＤＰ　（下記を参照）を含有し、マイクロフルイダイザ−にかけ てサブミクロン粒子エマルジョンにされるか、ポルテックスにかけてより大きな 粒子サイズのエマルジョンを生成する；および、（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバン ト系（ＲＡＳ）　（Ｒｉｂｉ　Ｉ＋ｎｕｎｏｃｈｅｍ、　Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　 ＭＴ）　：　２％スクワレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ　８０、および、１つ以上の 細菌細胞壁成分（モノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉ ｄ）　Ａ　（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨 格（ＣＷＳ）よりなる群から、好ましくはＭＰＬ　＋　ＣＷＳ　（ＤｅｔｏｘＴ Ｍ））を含有する；　（３）？ポニンアジーパント（例えばＳＬ＋ｒｇｕＩｏｎ ＴＭ（Ｃａｒａｂｒｉｄｇｅ　Ｂ４ｏｓｃｉｅｎｃｅ。

Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、　ＭＡ）　）が使用され得るか、または、ｌＳＣ０Ｍ　（ 、免疫刺激複合体）のような、それらからつくられた粒子；（４）完全フロイン ドアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）　； （５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（Ｉｔ、−Ｌ　ＩＬ−２など） 、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）　、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ） など）；および、（６）組成物の効果を増強するための免疫刺激剤として作用す るその他の物質。ＡｌｕｍおよびＭＦ５９が好ましい。

上記のように、ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−）レオニ ル−〇−イングルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）　、Ｎ−アセチル−ノルムラミルー Ｌ−アラニルーＤ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル −し−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルーし一アラニンー２−（１−２−ジパル ミトイル−８ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘ ｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）　）−！チルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが含 まれるが、これらに限定されない。

免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバ ント）は典型的に、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどのような希 釈剤を含有する。

さらに、湿潤または乳化剤などのような補助物質、ｐＨ緩衝物質などが、このよ うな賦形剤中に存在し得る。

典型的には、免疫原性組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして注射用に調 製される；注射の前に液体賦形剤に溶解または懸濁するのに適切な固形もまた、 調製され得る。薬学的に受容可能なキャリアについて上記で考察したように、調 製物はまた、アジュバント効果を増強するために、エマルシコンにされるか、ま たはリポソームにカプセル化され得る。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原ポリペ プチド、および必要であれば、上記成分のいかなる他の成分をも含有する。「免 疫学的に有効な量」とは、単回投与でまたは連続投与の一部として個体に投与さ れる量が、治療または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される 個体の健康状態および身体条件、処置される個体の分類学上のグループ（例えば 、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成するための個体の免疫系の能力 、所望の予防程度、ワクチン処方、医療状況での治療医の評価、およびその他の 関連因子に依存して変化する。その量は比較的広範囲にあり、日常の試行により 決定され得ると思われる。

免疫原性組成物は従来より非経口的に、例えば、皮下または筋肉内注射により、 投与される。その他の投与形態に適した処方には、経口および肺への処方、生薬 、および経皮投与が含まれる。投与処置は、単回投与スケジユールまたは複数回 投与スケジ一−ルであり得る。ワクチンは、その他の免疫調節剤と組み合わせて 投与され得る。

ｉ−爽立史上 Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ　Ｃ群の多糖類ならびに熱シコノクタンパク質ｈｓｐ Ｒ７０およびｈｓｐ６５を含有するコンジ二ゲート化合物を構築し、ワクチンの 効力について試験した。

５、１．　Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｅｃｉ　Ｃ（ＭｅｎＣ）群の多糖の精製、および ＭｅｎＣのオリゴ糖の生成 ０群髄膜炎菌の多糖を、Ｐｒａｓｃ　Ｃ，Ｅ、の「バイオテクノロジープロセス の進歩：バクテリアワクチンＪ　（Ａ、　Ｍｉｚｒａｈｊ［）　。

ｖｏｌ、１３．　ｐｐ、１２３−１４５．　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ　Ｉｎｃ、、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９９０）に記載されているように精製した。精製多糖 類（１０＋ｎｇ／ｍｌ）を、ｐＨ５の０．０１Ｍ酢酸緩衝液中で、１００°Ｃで ８時間加水分解して解重合した。得られた生産物を、分析用クロマトグラフィー 　（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　６−５０）で分析し、０．２７のＫｄ　（分布係数）を 示した。

５．２．−級アミン基のオリゴ糖末端基への導入０．５Ｍ＜７）塩化アンモニウ ムおよび０．１５Ｍのシアノボロヒドリドナトリウムを加水分解から得られた溶 液に加えた。ｐＦｆを７に上げて、得られた溶液を３５°Ｃで１週間置いた。次 に、オリゴ糖をクロマトグラフィー（５ｅｐｈａｄｅｘ　６−１５）により、収 集したアミン基およびカルボハイドレート基に関して化学活性を含有するボイド 容量画分を精製した。一方、単糖および過剰の試薬を含有する画分は廃棄した。

得られたＭｅｎＣオリゴ糖は、アミン基、シアル酸基、および０−アセチル基を 測定することによって特徴付けられた。次のモル比が得られたニジアル酸／アミ ン基＝２０．０−アセチル／シアル酸＝０．８４゜５．３．熱シヨツクタンパク 質の調製 Ｍ、　ｂｏｖｔｓ　ＢＣＧ　ＧｒｏＥＬ−型６５ｋＤａ　ｈｓｐ　（ｈｓｐＲ６ ５）をプラスミドりＲＩＢ１３００を宿した組換えＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株から 発現しくＴｈｏｌｅら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、１９８５．　５０．　８０ ０：Ｖａｎ　Ｅｄｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８Ｂ。

庄、１フ１）、そして、Ｔｈｏｌｅら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、１９８７ ．　５５゜１４６６に記述されたように精製した。

組換えＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＫ−型７０ｋＤａ　ｈｓｐ　（ｈ ｓｐＲ７０）を得テ、ＡＴＰ−７ガロースクロマトグラフイーで精製した（　Ｍ ｅｈ　１ｅｒｔら、Ｍａｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１９８９．　ｉ、１２５） 。

５．４．　ＭｅｎＣ多糖とｈｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７０との糖コンジュゲー トの調製 ＭｅｎＣアミノ−オリゴ糖を、Ｈ２Ｏを１０％含むジメチルスルホキシドに溶解 し、それから（アミン基について）１２倍過剰のアジピン酸のＮ−ヒドロキシス クシンイミドエステル［Ｈｉｌｌら、ｒＦＥＢｓ　ＬＥＴＴ、Ｊ　１０２：２８ ２　＜１９７９）に従って調製した］と反応させた。ジオキサン（１〜４倍Ｉｔ ）で沈澱させて精製した後、活性化オリゴ糖を真空中で乾燥し、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステルの含有量について分析した。次いで、ｐＨ７の０゜１Ｍ リン酸緩衝液中で５　Ｂ／ｍｌの量のｈｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７Ｇを、３０ ０倍モル過剰の活性化オリゴ糖と反応させた。それぞれ得られた糖フンシュゲー トは、クロマトグラフィーにより未反応オリゴ糖からＪ離し、濾過し、そし、て ４°Ｃで保存した。開始物質のＭｅｎＣ多糖中のシアル酸の割合に対する糖フン シュゲートのシアル酸含有量の比は、カップリングしたオリゴ糖の量を表す。調 製したタンパク質の含有量は、Ｌｏｖｒｙ　ｒＪ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、Ｊ　１９３：２６５（１９５１）の方法により確認した。特に、ｈｓ ｐＲ７０とのコンジュゲートは、３１０μｇ／ｍｌのタンパク質含有量および７ ６μｇ／＋１の糖含有量を有し、一方、ｈｓｐＲ６５とのコンジュゲートは、１ ８０μｇ／ｒｔｒ　１のタンパク質含有量および９７μｇ／ｍｌの糖含有量を有 する。

５．５．マウスおよび免疫感作 ＢＡＬＢ／ｃ　（Ｈ−２ｄ）、Ｃ５６７ＢＬ／６　（Ｈ−２ｂ）およびＣＢＡ／ Ｊ　（Ｈ−２ｋ）の雌のマウス（８〜１２週齢）を本発明者らの飼育施設で飼育 した。

最初のカップルはＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｂａｒ　Ｈａｒｂ ｏｒ、　ＭＥから供給された。ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ胸腺欠失マウスをＩｆ ｆａ　Ｃｒｅｄｏ。

Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅから得た。

０８目、各々のマウスに１０６ＣＦＵのＢＣＧ　（またはコントロール群の場合 はＰＢＳ）を腹腔内投与し、続いて１４日８と３５日８に２用量のコンジュゲー ト（ＰＢＳ中）を投与した。

コントロール群は、ＭｅｎＣオリゴ糖のみ、または水酸化アルミニウム（１ｍｇ ／用量、０．５ｍｌ中）に吸着したＭｅｎＣオリゴ糖−ＣＲＭ１９７コンジユゲ ートワクチンを接種した。各々の免疫感作において、マウスに２μｇのＭｅｎＣ オリゴ糖を接種し、それは８゜７μｇのＭｅｎＣオリゴ糖−ＣＲＭ１９７）ンジ コゲートワクチン、８．４μｇのＭｅｎＣオリゴ糖−ｈｓｐＲ７０）ンジニゲー ト、または３．７μｇのＭｅｎＣオリゴ糖−ｈｓｐＲ６５コンジュゲートに対応 した。

５．６．　ＥＬＩＳＡ法による抗体の測定毎週、マウスの後眼窩叢から血液を採 取し、抗体はＥＬ　Ｉ　ＳＡで力価測定した。

ＩｇＧ抗ＭｅｎＣ抗体を測定するために、９６ウエル平底プレートをｐＨ７，４ のＰＢＳ中のＭｅｎＣ多糖（５ｔｔ　ｇ／ｍｌ）で３７℃で一晩のインキュヘー ションニより覆った（Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ　Ｉ、　Ｎｕｎｃ、　 Ｒ。

５ｋｉｌｄｅ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）　ｏ　Ｏ，０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む ＰＢＳ　（ｐＢｓ−Ｔ）で繰り返し洗浄し、そして５％のＦＣＳを含有するＰＢ Ｓ−Ｔの２００ｔＬ１で３７℃、１時間インキュベーションした後、ウェルを５ ％ＦＣ３を含むＰＢＳ−Ｔで希釈したマウス血清１００μｌとともに４℃で一晩 インキユベートした。洗浄を繰り返した後、プレートを再び、ペルオキシダーゼ にコンジュゲートしたＩｇＧ抗マウス抗血清を適切に希釈したものの１００μｌ とともに３７°Ｃで３時間インキュベートした。

特ｘ的抗体の存在を、２．２−アジノービス−（３−エチルベンゾチアゾリンス ルホン酸）　（ＡＢＴＳ　；　ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｙ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を基質と して加えることにより明らかにした。結果は、４１４ｎｍでの吸光度について測 定した。試験した最初の希釈（１：５０）で０．２未満の吸光度を有する血清サ ンプルは、陰性と考えた。

５．７．オリゴ糖ヘコンジュゲートしたｈｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７０のキャ リア効果 ＨｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７０−ＭｅｎＣオリゴ糖フンシュゲートを、予めＢ ＣＧで感作したまたは感作していないＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス の免疫に使用した。

コントロールとして、数群のマウスにＭｅｎＣのみまたは水酸化アルミニウム上 のＣＲＭ１９７−ＭｅｎＣコンジュゲートワクチンを感作させた。

図１は、抗ＭｅｎＣ多糖１ｇＧ抗体が、水酸化アルミニウム上のＣＲＭ１９７− ＭｅｎＣコンジュゲートワクチンの場合に測定したのト同等またはそれ以上の量 でｈ　ｓｐ−ＭｅｎＣコンジコゲートの免疫の後産生されたことを示す（図ＩＡ 中のＣ５７ＢＬ／６）。この効果ハ、アジュバントが存在しない場合だけでなく 、ＢＣＧで感作しなかったときのｈｓｐＲ７０−ＭｅｎＣコンジュゲートの場合 にも観察された（図ＩＢ）。これらの結果より、アジュバント非存在下またはＢ ＣＧ感作していないとき、ミコバクテリウムのｈｓｐを用いる免疫が、オリゴ糖 抗原を用いても本当に達成し得ると述べ得る。

従って、ｈｓｐ分子（特にｈｓｐＲ７０）は、ＢＣＧで感作していないマウスで も強力なキャリア効果を及ぼし、アジュバントの非存在下でさえ、移送した多糖 に対して特異的なＩｇＧ抗体を誘導する能力のある分子の有効なキャリアとして 作用することが確認された。

アジュバントおよび前感作の非存在下で及ぼされる、このミコバクテリウムのｈ ｓｐの有効なキャリア効果により、記載されたコンジュゲートが、細菌感染に対 する新規ワクチンの開発に特に有用になる。

辷　爽立皿１ 新規のＨ，ｐｙｌｏｒｉ熱ショックタンパク質が同定され、組換えＤＮＡ法を用 いて産生された。

６．１．１拓鉦区左迭 ６．１．１．　Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ株および増殖条件使用したＨ、ｐｙｌｏｒｉ株 は：　ＣＣＵＧ　１７８７４、Ｇ３９およびＧ３３　（Ｇｒｏｓｓｅｔｏ病院、 　Ｉｔａｌｙ、で胃生検より単離）　、Ｐｙｌｏ　２０＋およびＰｙｌ。

２Ｕ−（Ｆ、　Ｍｅｇｒａｕｄ、　Ｐｅｌｌｅｇｚｉｎ病院、Ｂｏｒｄｅａｕｘ 、　Ｆｒａｎｃｅにより供与）　、ＢＡＧ６　（Ｓｉｅｎａ犬学、Ｉｔａｌｙ、 で胃生検により単離）であった。Ｐｙｌｏ　２Ｕ十株は非細胞毒性であり；　Ｐ ｙｌｏ　２Ｕ−株は非細胞毒性およびウレアーゼ陰性である。全ての株は、０， ２％のシクロデキストリン、５μｇ／ｌのセフスロジン、および５μｇ／ｍｌの アムホテリシンＢを含むコロンビアアガー上で、微好気性の条件下で、３７“” Ｃ５〜６日間通常的に増殖した。細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した。ペレットを Ｌａｅａｕａｌｉサンプル緩衝液に再懸濁して、そして煮沸して細胞を溶解した 。

胃炎および潰瘍に冒されている患者の血清（Ａ、　Ｐｏｎｚｅｔｔｏ。

ｒ　Ｌｅ　Ｍｏ１ｉｎｅｔｔｅＪ病院、　Ｔｏｒｉｎｏ、　Ｉｔａｌｙにより供 与）および胃癌患者の血清（Ｆ、　Ｒｏｖｉｅｌｌｏ、　５ｉｅｎａ大学、　＋ ｔａｔｙにより供与）を使用した。

６、１．２．　ライブラリーの免疫スクリーニングλｇａｌｌ　Ｈ，ｐｙｌｏｒ ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ発現ライブラリーの５０万個のプラークを、０．２％マルトース および１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４を含むＬＢ中で一晩増殖したＥ、　ｃｏｌｔ　Ｙ１ ０９Ｇ株の懸濁液５ｍｌと混和し、そして０．５０Ｄ、になるように１０ｍＭ　 ＭｇＳＯ４に再懸濁した。３７℃で１０分インキュベーションした後、溶かした ７５１のＴｏｐＡｇａｒｏｓｅを、細菌／ファージ混合物に注ぎ、そして全部を ＢＢＬプレート上で平板培養した（　５０．０００プラーク／プレート）。４２ °Ｃで平板培養したライブラリーを３，５時間インキニベーションした後、ｌｏ ｇ＋ＭＩＰＴＧで予め湿らせたニトロセルロース濾紙（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒお よび５ｃｈｕｅ１１．　Ｄａｓｓｅｌ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）をプレート上（こ載 せ、そしてさらに３７°Ｃ３，５時間、次いで４°Ｃで一晩インキニベーション した。λタンパク質を有する濾紙を持ち上げてＰＢＳで洗浄し、そしてＴＢＳＴ 　（１０ｍＭ　ＴＲｌ５　ｐＨ８，１００ｍＭ　ＮａＣ１，５Ｍ　ＭｇＣｈ）に 溶解した５％脱脂乾燥乳で２０分間飽和させた。最初のノ＼イブリダイゼーシ冒 ン工程は、患者血清で行った；陽性プラークを呈色および可視化するために、製 造者の指示に従って、ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ９，５，１００ ５Ｍ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣｈ）中でアルカリホスファターゼをコンジュゲ ートした抗ヒトＩｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ、　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ ）およびＮＢＴ／ＢＣＩＰキット（Ｐｒｏｗｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ ）を用いた。

６、１．３．組換えＤＮＡ手順 使用した試薬および制限酵素は、Ｓｉｇｍａ　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ） およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）から得 た。分子クローニング、−重鎖ＤＮＡ精製、Ｅ、　ｃｏｌｔでの形質転換、プロ ーブの放射標識化、）１．　ｐｙｌｏｒｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子ライブラリーのコ ロニースクリーニング、サザンプロット分析、ＰＡＧＥ、ウェスタンプロット分 析については、標準的技法を用いた。

６．１．４．　ＤＮＡ配列分析 ＤＮＡフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 、　ＳａｎＤｉｅｇｏ、　ＣＡ）でサブクローニングした。−重鎖ＤＮＡ配列決 定を、製造者の指示に従って、［３３Ｐ］　ａｄＡＴＰ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄＮｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）　および５ｅｑｕｅｎａｓｅキ・ノ ド　（Ｕ、　Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ 、　ＯＨ）を用いて行った。配列は両鏡について決定し、モして各鎖は平均２回 配列決定した。コンビーータによる配列分析はＧＣＧパッケージを用いて行った 。

６、１．５．組換えタンパク質 ＭＳ２ポリメラーゼ融合タンパク質をｐＥＸ３４Ａ　（ｐＥＸ３１の誘導体）ベ クターを用いて生成した。挿入Ｈｐ６７　（図５．のヌクレオチド４４５からヌ クレオチド１４０２）およびＥｃｏＲ１リンカ−を、ベクターのＥｃｏＲ１部位 にフレーム内でクローニングした。停止コドンの位置を確認するために、■ｐＧ ３°Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを、ｐＥＸ３４Ａの旧ｎｄ１１１部位にフレー ム内でクローニングした。組換えプラスミドをＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｈ１Δ ｔｒｐに形質転換した。誘導後の両方の場合で、予測した分子量の融合タンプく り質を生成した。ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲｌフラグメントの場合は、誘導後書こ得 られた融合タンパク質をウサギに免疫するために、標準プロトコルを用いて電気 溶出した。

Ｌｕ ６、２．１．発現ライブラリーのスクリーニングおよび１．　ｐｙｌｏｒｉｈｓ ｐのクローニング Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ発現ライブラリーのスクリーニングに適切な血清 を見つけるために、シュ８旦Ｌ１ＣＣＵＧ　１７８７４株の超音波処理抽出物を 、異種の胃炎によって冒された患者の血清１こ文律するウェスタンプロ・ット分 析で試験した。異なった血清（こよる抗原認識パターンは多岐にわたり、おそら く、個体の免疫応答の差異、および感染物に含まれる株により発現する抗原の差 異のためであった。

Ｎ０１９の血清を、細菌の増殖の間にインビボで発現される、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ 特異的抗原を同定するためのλｇｔｌｌ■、ｐｙｌｏｒｉ　Ｄ　ＮＡ発現ライブ ラリーをスクリーニングするために選択した。

この血清でライブラリーをスクリーニングした後、多くの陽性クローンを単離し 、特徴付けた。これらの１つのヌクレオチド配列（いわゆる）Ｉｐ６７）は、熱 シヨツクタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーに高い相同性を有するタンパク質を コードする９８５塩基対のオープンリーディングフレームであることがわかった （Ｅｌｌｉｓ、　Ｎ’ａｔｕｒｅ　３５８：１９１−９２（１９９２））　ａ全 コーディング領域を得るために、本発明者らは、フラグメントＨｐ６？を、異な る制限酵素で切断したＬｌム旦わ、ＤＮＡのサザンプロット分析のプローブとし て用いた。プローブＨｐ６７は、それぞれ、約８００および１０００塩基対の２ つのＨｉｎｄｌｌ＋バンドを認識した。旧ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ切断ＤＮＡのゲノム Ｈ−ｐｙｌｏｒｉライブラリーをプローブ■ｐ６７でスクリーニングし、そして 予測した分子量の２つの陽性クローン（ＨｐＧ５°およびＨｐＧ３°）を得た。

プラスミドｐＨｐ６０Ｇ２（約１から８２９のヌクレオチド）およびｐＨｐ６０ Ｇ５　（約８２４から１８３８のヌクレオチド）を含むＥ、　ｃｏｌｔをアメリ カンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。

６．３．配列分析 ヌクレオチド配列分析で、開始ＡＴＧの６塩基対上流の推定リボゾーム結合部位 を有する１６３８塩基対のオープンリーディングフレームが明らかになった。図 ５に、、　ｌ（、ｐｙｌｏｒｉ　ｈｓｐのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列 を示す。推定リボゾーム結合部位および中間旧ｎｄｌ　ｌ　１部位を下線で示す 。フラグメン）　Ｈｐ６７の４４５位のシトシンおよび１４０２位のグアニンは 、それぞれ最初および最後のヌクレオチドである。チミジン１７７２を、独立因 子ターミネータ−領域の局在化に関する演算法を用いて、転写された最後の推定 のヌクレオチドとして同定した。

オーブンリーディングフレームは、５８．３ＫＤａの予測分子量、および５．３ ７の予測ｐｌを有する５４６アミノ酸のタンパク質をコードしていた。この遺伝 子のコドンの選択は、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉコドンの用法と一致する。

疎水性のプロフィル分析では、予測期されるリーダーペプチドまたは他の貫膜ド メインを除いて、はとんど疎水性タンパク質であることがわかった。アミノ末端 配列は、精製タンパク質について、Ｄｕｎｎら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、 　６０：１９４６−５１（１９９２）により決定された３０アミノ酸の配列に１ ００％の相同性を示し、Ｅｖａｎｓら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　６０：２ １２５−２７（１９９２）によって公表された４４アミノ酸の配列から１残基の み（Ｌｙｓに代わって５ｅｒ４２）異なっていた（　Ｅｖａｎｓら、１９９２） 　ｏ成熟ｈｓｐタンパク質のＮ−末端配列は、開始メチオニンを含まず、このこ とは、翻訳後に除かれたことを示している。

６．４．　ｈｓｐ６０ファミリーとの相同性アミノ酸配列分析で、全ての生物に 存在するメンバーである熱ショックタンパク質ｈｓｐ６０ファミリーと非常に高 い相同性が示された。異種のｈｓｐ６０タンパク質間での相同の程度に基づいて 、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ　ｈｓｐは、グラム陰性細菌のｈｓｐ６０タンパク質のサブ グループに属する；しかじ、ｈｓｐ６０ファミリーの他のタンパク質に対する相 同の程度はかなり高い（少なくとも５４％の一致）。

他の熱シヨツクタンパク質とのｌ（、ｐｙｌｏｒｉ　ｈｓｐの相同性は図３に完 全に例示した。Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ　ｈｓｐまたはその１つ以上の機能的な免疫刺 激ドメインは、本発明に従ってコンジュゲート化合物を生成するために上記実施 例１の手法を用いてオリゴ糖または多糖にコンジユゲートし得る。

６．５０組換えタンパク質の発現およびポリクローナル抗血清の生成 りローンＨｐ６７およびクローンＨｐＧ３°の挿入物を、ＭＳ２ポリメラーゼの アミノ末端に融合したこれらのオーブンリーディングフレームを発現するために 、発現ベクターｐＥＸ３４Ａにサブクローンした。クローンは予測したサイズの 組換えタンパク質を生成し、そして最初のスクリーニングで用いたヒト血清によ り認識された。クローンＨｐ６７由来の融合タンパク質を電気溶出し、そして抗 ｈｓｐ特異的ポリクローナル抗血清を得るためにウサギの免疫に用いた。得られ た抗血清は、融合タンパク質と、ウレアーゼ陰性株および非細胞毒性株を含有す る、試験したいくつかのＨ，ｌｌｌｙｌｏｒｊ株の全細胞抽出物の５８ＸＤａの タンパク質との両方を認識した。

Ｈｓｐは試験した全てのＨ，ｐｙｌｏｒｉ株で発現されること力ｆ示され、そし てその発現はウレアーゼの存在または細胞毒性（こ関係ない。抗ｈｓｐ抗血清に より認識されるタン）＜９質は、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉの水溶性抽出物中に認められ 、そしてウレアーゼサブユニ・ノドと同時に精製された。これは、このタンノで り質が細菌外膜（こ弱い会合をしていることを示す。従って、ｈｓｐはウレアー ゼ（こ会合し、そして表面が露出していると記載し得る。細胞表面の局在化によ り、はとんどのｈｓｐに相同なタン／＜り質力（細胞質中またはミトコンドリア および色素体中（こ局在してｔ）ることは驚くことである。ｈｓｐにリーダーペ プチドカ（欠↓すて−）ることは、これが独特の輸送系により膜に輸送される力 ）、ある（１（よタンパク質が細胞質から放出され、細菌の死後に細菌の膜（こ 以下の材料は、１９９２年１２月１５日および１９９３年１月２２日（こ、本発 明の譲渡人であるＢｉｏｃｉｎｅ　５ｃｌａｖｏ、　Ｓ、ｐ、Ａ、！こより、特 許手続き上の微生物の寄託の国際的承認１こ関するブダペスト条ブ　１２３０１ ．電話（３０１）　２３１−５５１！Ｈこ寄託された。

ＡＴＣＣＮｏ、６９１５５　プラスミドｐＨｐ６０Ｇ２を含むＬ工（社）ユＴＧ ＩＡＴＣＣＮｏ、　６９１５６　プラスミドｐＨ９６０５を含むも３立１ｉ　Ｔ ＧＩこれらの寄託物は、当業者の利便性のために提供され、寄託が、米国特許法 １１２条、または本明細書の任意の指定国のいかなる相当規定のもとで要求され ることを認めるものではない。これらの寄託物の核酸配列、およびそれにコード されるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており 、寄託物の配列と比較して、本明細書に記載の配列中に任意の誤りがある場合に は、参考にされるべきである。寄託物質を製造し、使用し、または売るためには 許諾が必要であり得るが、ここでは、そのような許諾は承認されていない。

ｊＥＦ、ＡＬ１３／ｃ　Ｃ５７ＢＬ／６ＢＣｑ動１縁雇扶−ｒ４ｒ。

ＦＩＧ、　１ Ａ　ＡＧＣＴＴＧＣＴＧＴＣＡＴＧＡ　ＴＣＡ　ＣＡ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｃ Ａ　ＣＴＡＡＡＡ　ＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡ　Ａ回正Ｔ`ＣＡＡＡＡＴＧ 門 ＧＣＡ　Ａ　Ａ　ＡＧＡＡＡＴＣＡＡ　ＡＴＴＴＴＣＡＧＡＴＡ　ＧＴＧＣＧＡ 　ＧＡＡ　ＡＣＣＴＴＴＴＡ　ＴＴｒＧＡ　ＡＧＧＣＧＴＧ`ＧＧＣＡＡ ＡＫＥＩＫＦＳＤＳＡＲＮＬＬＦＥＧＶＲＱＣＴＣＣＡ　ＴＧＡ　ＣＧＣＴＧＴ ＣＡ　ＡＡ　ＧＴＡＡ　ＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＧ　ＣＡＧＧＡ　ＡＴ ＧＴＡＴＴＧＡＴＣＣＡ`ＡＡＡ ＬＨＤＡＶＫＶＴＭＧＰＲＧＲＮＶＬ　ＩＱＫＡＧ　ＣＴＡＴＧＧＣＧＣＴＣＣ Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＡＴＣＡ　ＣＣＡＡＡ　ＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＣＴ Ａ　ＡＡ　ＧＡ　Ｇ　ＡＴsＧＡ　ＡＴＴＡ Ｓ　Ｙ　Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｓ　Ｉ　Ｔ　Ｋ　Ｄ　Ｇ　ｖＳ　Ｖ　Ａ　Ｋ　Ｅ　Ｉ　Ｅ 　ＬＡ　ＧＴＴＧＣＣＣＡＧＴＡＧＣＴＡ　Ａ　ＣＡＴＧＧＧＣＧＣＴＣＡ　Ａ 　ＣＴＣＧＴＴＡＡ　ＡＧＡ　ＡＧＴＡＧ　ＣＧＡＧＣＡＡ　Ａ@Ａ　ＣＣＧ　 ＣＴ Ｓ　ＣＰ　Ｖ　Ａ　Ｎ　Ｍ　Ｇ　Ａ　Ｑ　Ｌ　Ｖ　Ｋ　Ｅ　Ｖ　Ａ　Ｓ　Ｋ　Ｔ 　ＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＣＡ　Ｇ　Ｃ ＧＡ　ＣＣＧＴＧ　ＣＴＡＧ　ＣＴＴＡＴＡ　Ｇ　ＣＡＴＴＴＴsＡ　ＡＡＧＡ Ａ ＤＡＡＧＤＧＴＴＴＡＴＶＬＡＹＳ　ＩＦＫＥＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＡＴＡＴＣ ＡＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＡＡＣＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＧＡＧＧＣ ＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＬＲＮＩＴＡＧＡＮＰＩＥＶＫＲＧＭＤＫＧＣＴＧＣＴＧ ＡＡＧＣＧＡＴＣＡＴＴＡＡＴＧＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＧＡＧＣＡＡＡＡ ＡＡＧＴＡＧＧＣＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＥＡＩＩＮＥＬＫＫＡＳＫＫＶＧＧＫ ＥＩＪ９０　５１０　５３０ ＧＡＡ　ＡＴＣＡ　ＣＣＣＡ　ＡＧＴＧＧ　ＣＧＡ　ＣＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡ 　Ａ　ＣＴＣＣＧＡＴＣＡ　ＣＡ　ＡＴＡＴＣＧＧ　ＧＡ　`Ａ　ＣＴＣＡＴＣ ＥＩＴＱＶＡＴＩＳＡＮＳＤＨＮＩＧＫＬ＋Ｇ　ＣＴＧＡ　ＣＧＣＴＡＴＧＧＡ ＡＡ　Ａ　Ａ　ＧＴＧＧＧＴＡＡ　Ａ　ＧＡ　ＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＡ　ＣＣＧ ＴＴＧＡＧＧＡ　ＡＧＣsＡＡＧＧＧ　Ｃ ＡＤＡＭＥＫＶＧＫＤＧＶＩＴＶＥＥＡＫＧＡＴＴＧＡ　Ａ　ＧＡＴＧＡ　ＡＴ ＴＧ　ＧＡＴＧＴＣＧＴＡ　ＧＡ　Ａ　ＧＧＣＡＴＧＣＡ　ＡＴＴＴＧＡＴＡＧ ＡＧＧ　ＣＴＡ　ＣＣＴbＴＣＣＣＣＴ ＩＥＤＥＬＤＶＶＥＧＭＱＦＤＲＧＹＬＳＰＦＩＧ、　３（ａ） ＴＡＴＴＴＴＧＴＡＡ　ＣＧＡＡ　ＣＧＣＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＧＣＴＣ ＡＡｎＧＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＴＴｒＡＹＦＶＴＮＡＥＫＭＴＡ ＱＬＤＮＡＹＩＬＬ７９０　８］ＯＨｌｎｃＨＩ　１ ＧＴＧＧＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＡ　Ａ　ＧＡ　ＧＧＣＧＴＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣ ＧＣＡＧＣＧＧＴＴＡＡＡＧ　ＣＴＣＣＡＧＧＣｍＧＧＧＶＶＮＫＬＲＧ　ｖ　 ＬＮＩＡＡＶＫＡＰＧＦＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＡ ＧＡＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＴｒＡＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴｒＡＧＣ ＤＲＲＫＥＭＬＫＤＩＡＩＬＴＧＧＱＶＩＳＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＧ　ＣＴＴＧ Ａ　ＧＴＣＴＡＧＡＡ　Ａ　Ａ　ＣＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＴｍＴＡＧＧＣＡ ＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＥＥＬＧＬＳＬＥＮＡＥＶＥＦＬＧＫＡＧＲＡＴＴＧＴ ＧＡＴＴＧＡＣＡ　Ａ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＣＡ　ＣＣＡ　ＣＧＡＴＣＧＴＡ　Ｇ ＡＴＧＧＣＡ　Ａ　ＡＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴfＡＴＧＴＴ ＩＶＩＤＫＤＮＴＴＩＶＤＧＫＧＨＳＤＤＶＡＡＡＧＡ（、Ａ　ＧＡＧＴＣＧＣ ＧＣＡＧＡＴＣＡＡ　ＡＡＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣＡＡＧＴＡ　ＣＧＡ　ＣＡＡＧ ＣＧＡＴＴＡＴＧＡ　Ｃ`ＡＡ ＫＤＲＶＡＱＩＫＴＱＩＡＳＴＴＳＤＹＤＫＧＡ　Ａ　ＡＡＡＴＴＧＣＡ　ＡＧ ＡＡＡ　ＧＡＴＴＧＧＣＴＡＡＡ　ＣＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴ ＧＡｎＡＡＡＧＴＧＧＧb ＥＫＬＱＥＲＬＡＫＬＳＧＧＶＡＶＩＫＶＧＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＡＡＧＴＧＧ ＡＡＡＴＧＡ　ＡＡ　ＧＡＧＡＡＡ　ＡＡＡＧＡＣＣＧＧＧＴＧＧＡＴＧＡＣＧ ＣＧＴＴＧＡＧＣＧＣＧＡＡＳＥＶＥＭＫＥＫＫＤＲＶＤＤＡＬＳＡＡＣＴＡＡ ＡＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＣＧＧ ＴＧＣＧＧＣＴＣＴＣＡｎＣＧＣＧＣＧＴＫＡＡＶＥＥＧＩＶＩＧＧＧＡＡＬＩ ＲＡＦＩＧ、　３（ｂ） ０ＣＴＣＡＡ　ＡＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡ Ａ　ＡＡ　Ａ　ＧＴＧＧＧ　ＣＴＡＴＧＡＡ　ＡＴＣＡＴＣ`ＴＧ ＡＱＫＶＨＬＮＬＨＤＤＥＫＶＧＹＥＩ　ＴＭＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＡ　ＡＧＣ ＣＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＡ　ＡＡＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡ　ＣＧＣＴＧＧＴＴＡＴ ＧＡＴＧＧＣＧＧＴＧＴＧＲＡＩＫＡＰＬＡＱＩＡＩＮＡＧＹＤＧＧＶＧＴＣＧ ＴＧＡＡＴＧＡ　ＡＧＴＡ　ＧＡ　Ａ　Ａ　ＡＡ　ＣＡ　ＣＧＡＡＧＧＧ　ＣＡ ＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＣＧＣＴＡＧＣＡＡＴＧfＣＡ　ＡＧ ＶＶＮＥＶＥＫＨＥＧＨＦＧＦＮＡＳＮＧＫＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＴＡ Ａ　Ａ　ＧＡ　ＡＧ　Ｇ　ＣＡＴＴＡＴＴＧＡ　ＣＣＣＣＴＴＡＡＡＡ　ＧＴＡ ＧＡＡＡＧＧＡＴＣＧ　bＴＣＴＡ ＹＶＤＭＦＫＥＧ　Ｉ　ＩＤＰＬＫＶＥＲＩＡＬＣＡＡＡＡＴＧＣＧＧＴＴＴＣ ＧＧＴＴＴＣＡ　ＡＧ　ＣＣＴＧ　ＣＴＴＴＴＡ　Ａ　ＣＣＡ　ＣＡＧＡＡ　Ｇ 　ＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＴＧ`Ａ　ＡＴＣ ＱＮＡＶＳＶＳＳＬＬＬＴＴＥＡＴＶＨＥ　１Ａ　Ａ　ＡＧＡ　Ａ　ＧＡ　ＡＡ Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＧＡ　ＣＴＣＣＧＧ　ＣＡ　ＡＴＧＣＣＴＧＡＴＡＴＧＧＧＴＧ ＧＣＡＴＧＧＧ　ＣＧＧＴ`ＴＧＧＧＡＧＧ　Ｃ ＫＥＥＫＡＴＰＡＭＰＤＭＧＧＭＧＧＭＧＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＡＴＧＴ Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＣＣＧＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＡ　ＧＴＡＴＡ　ＡＴＣＴＧＣＴＴ ＴＴＡ　ＡＡ　ＡＴＣＣbＴＴＣ ＭＧＧＭＭ” ＴＣＴＡ　ＡＡＴＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＴＡ　ＡＡ　Ａ　ＴＣＴＣＴＴＴＴＴ ＴＧＧＧＧＧ　ＧＧＴＧ　ＣｍＧＡＴＡ　Ａ　ＡＡ　ＣＣＧbＴＣＧ ＣｎＧＴＡＡＡＡＡＣＡＴＧＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＧＣＴ ＴＦＩＧ、　３（ｃ） 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年９月５１

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つの熟ショックタンパク質または少なくとも１つの免疫刺激ド メインを含有する熱ショックタンパク質の一部と、少なくとも１つのオリゴ糖ま たは多糖とを含有する、コンジュゲート化合物。
2. ２．Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ　Ｃ（ＭｅｎＣ）群のオリゴ糖、および熱ショッ クタンパク質を含有する、請求項１に記載のコンジユゲート化合物。
3. ３．前記熱ショックタンパク質が、Ｍ．ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ　ＧｒｏＥＬ型６５ ｋＤａ　ｈｓｐ（ｈｓｐＲ６５）、組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｄｎ ａＫ型７０ｋＤａｈｓｐ（ｈｓｐＲ７０）、およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ由来の熱シ ョックタンパク質から選択される、請求項１または２に記載のコンジュゲート化 合物。
4. ４．熱ショックタンパク質または少なくとも１つの免疫刺激ドメインを含むその 一部を、少なくとも１つのオリゴ糖または多糖に共有結合させる工程を包含する 、請求項１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化合物を生成する方法。
5. ５．製剤として使用する、請求項１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化 合物。
6. ６．細菌感染に対するワクチン接種用の薬剤の製造における、請求項１から３の いずれかに記載のコンジユゲート化合物の使用。
7. ７．免疫学的に有効な量の請求項１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化 合物の投与する工程を包含する、ワクチン接種の方法。
8. ８．請求項１から請求項３のいずれかに記載の１つ以上のコンジュゲート化合物 および薬学的に受容可能なキヤリアを含有する、ワクチンまたは治療用組成物。
9. ９．請求項１から請求項３のいずれかに記載の１つ以上のコンジユゲート化合物 を、薬学的に受容可能なキャリアと結合させる工程を包含する、ワクチンの調製 方法。