JPH04502964A - アミン誘導還元剤を利用する電気化学発光反応 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミン　−　・、 本願はパラエル（Ｐｏｗｅｌｌ）他の米国出［１８５８，３５４号１９８６年４ 月３０日出願、バラエル他のＰＣＴ出願ＵＳ８７１０　Ｏ９８７号１９８７年４ 月３０日出願、国内段階ＰＣＴ出願８５８，３５４号題名「電気化学発光アッセ イＣＥ１ｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）Ｊパラエ ル他１９８７年１２月１８日出願［カーチス、モリス＆サッフｔ−ド（Ｃｕｒｔ ｉｓ、　Ｍｏｒｒｉｓ　＆　５ａｆｆｏｒｄ）Ｐ、　Ｃ，包装番号３７００６８ −２０８８１およびレランド（Ｌｅｌａｎｄ）他の米国出願第１１７．０１７号 １９８７年１１月４日出願の一部継続であり、それら出願は全て、本願明細書中 に組み入れられる。さらに、米国８８１８８．２５８号１９８８年４月２９日出 願、米国出ｊ［７８９，１１３号１９８５年１０月２４日出願、および米国出願 ２６６゜８８２号題名「電気化学発光アッセイＪシャー（Ｓｈａｈ）とホール（ Ｈａｌｌ）とバラエルとマツシイ（Ｍａｓｓｅｙ）同日出願（ＣＭＳ包装番号３ ７００６８−２３９０）は全て本願明細書中に組み入れられる。

ｌユΩ立旦 本願発明は一般的には電気化学発光反応に関する。より詳しくは、検査されるシ ステムによって放出された電磁放射線Ｃｅ１ｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｊｃ　ｒａ ｄｊａｔｉｏｎ）の測定により、関心のある検体（ａｎａｌｙｔｅ）の存在を検 出し、そして必要ならば存在量を定量することに関する。

ｌ肌生！見 Ｊ、　Ｂ、ノフシンガー（Ｎｏｆｆｓｉｎｇｅｒ）他のアナリティカル・ケミス トリー１９８７．Ｊｊｌ、８６５にはアミンと含ルテニウム発光体（Ｉｕ＋ｎｆ ｎｏｐｈｏｒｅ）　Ｅ　Ｒｕ（ｂｐｙ＞ｓ”°］（ｒｂｐｙ」は本願明細書中で は全ての場合において「ビピリジル」を表す）を含む反応シーケンスを利用して 得られた化学発光に関する実験が開示されている。ライトル（Ｌｙｔｌｅ）他の フォトケミストリー・アンド・フォトバイオロジー１９７１．１３，１２３も参 照。この研究では、発光は電気化学エネルギーによる触発（ｔｒｉｇｇｅｒ）を 伴わない化学反応のみを通して達成されている。化学発光法も有効であるが、電 気化学発光（ｒＥｃＬ」）操作は幾つかの点でより好ましい：例えば、（１）推 進力となる電気化学エネルギーは中断させることができ、それは反応の中断を伴 うので、反応シーケンスにわたるコドンロールはより大きくなる：他方、化学発 光系では、反応シーケンスは一度始まったら完了するまで停止しない：（２）発 光体は多数回発光にあずかる二他方、化学発光系では発光体が一回しか発光しな い、（３）使用する装置が異なり、化学発光法に使用するものよりも作動容易で ある。特殊な系での化学発光の発生の成功があっても、それはその反応系が電気 化学発光に対して可能であることを意味するものではなく、従って、ノフシンガ ー他の開示からは、電気化学的に刺激される系における同様の結果の予測を推定 することは当然不可能である。

初期のＥＣＬ反応は、たとえば下記文献に記載されているように、ダブル・ポテ ンシャル・ステップを使用して電極での逐次の酸化と還元によって起こる反対電 荷のラジカルイオンの消滅に関係していた：　Ｌ、　Ｒ，フォーフナ−（Ｆａｕ ｌｋｎｅｒ）他のエレクトロアナリティカル・ケミストリー［Ａ、Ｊ、バード（ Ｂａｒｄ）ｉｉ）］第１０巻「マーセル・デツカ−（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅ ｒ）、ニューヨーク１９７７］第１章、Ｎ、Ｅ、）ッケルータクボルヤン（Ｔｏ ｋｅｌ−Ｔａｋｖｏｒｙａｎ）他のケミカル・フィツクス・レターズ１９７４、 ｌ、２３５；　Ｊ、Ｃ，ベラスコ（Ｖｅｌａｓｃｏ）他のインオーガニック・ケ ミストリー１９８３　、　ｕ。

８２２；　Ｊ、Ｃ，ルーオング（Ｌｕｏｎｇ）他のジャーナル・才ブ・アメリカ ン・ケミカル・ソサイエティ１９７８゜１００．５７９０．　Ｈ，Ｄ、アブルー ナ（Ａｂｒｕｎａ）のジャーナル・オブ・エレクトロケミカル・ソサイエティ１ ９ｇ５，１３２，８４２；およびＨ，Ｄ、アブルーナのジャーナル・オブ・エレ クトロアナリティカル・ケミストリー１９８４．１７５，３２１゜十分なエネル ギーの反対電荷のラジカル間での均質電子伝達により、前駆体の一方の励起状態 を形成することができ、そして続いて、励起状態の種による発光が起こる。更に 、三重項−三重項消滅に関係するエネルギー欠失メカニズムと称するものが報告 されている。Ｄ、フリート（Ｆｒｅｅｄ）他のジャーナル・オブ・アメリカン・ ケミカル・ソサイエティ１９７１，９３，２０９７．　Ｗ、Ｌ、　ウォレス（Ｗ ａｌ　１ａｃｅ）他のジャーナル・オブ・エレクトロケミカル・フサイエティ１ ９フ８．ｌｉｉ、１４３０参照。

他の成るＥＣＬ反応においては、電解化学発光を達成するために、発光体をシュ ウ酸塩やピルビン酸塩のような有機酸と共に使用している。このような酸化還元 メカニズムはＲｕ（ｂｐｙ）ｘ”　（ｒｂｐｙ　Ｊは「ビピリジル」を表す）と 有機酸との酸化を伴う。しかしながら、成る種の状況下では、この特性の系は不 利である。何故なら、この発光を導（反応は不利な酸性のｐＨで行われるからで ある。これら系は融通性に欠けている。何故ならば、それらを多くの生物学的相 互作用の検定に応用することはｐＨのような生理学的溶液条件からの季離を要求 するため、検定される系の免疫化学の破壊につながるからである。例証のために 、Ｄ、イーゲ（Ｅｇｅ）他のジャーナル・才ブ・アナリティカル・ケミストリー １９８４　、　ｎ。

２４１３、１．ルピンシュタイン（Ｒｕｂｊｎｓｔｅｉｎ）他のジャー子ル・オ ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ１９８１、土Ｑ、５１２；　Ｍ、Ｍ、 　チャン（Ｃｈａｎ）他のジューナル・才ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエ ティ１９７９．ＪＪ−，５３９９参照。

ブラーシスト（Ｐｒａｇｓｔ）と共同研究者による成る論文では、発光を達成す るために、蛍光性芳香族炭化水素、オキサゾールまたはオキサジアゾールに、イ ミダゾールまたはピリジン誘導体の存在下で電気化学エネルギーを受けさせてい る。Ｊ、ルドビック（Ｌｕｄｖｉｋ）他のジャーナル・オブ・エレクトロアナリ ティカル・ケミストリー１９８６、　ｉｌｉ、１７９；　Ｆ、ブラーシスト他の ジャ７ナル・オブ・エレクトロアナリティカル・ケミストリー１９８６．エエエ 、２４５．Ｆ、ブラーシスト他のジャーナル・オブ・エレクトロアナリティカル ・ケミストリー１９８１．土上主、３０１；　およびＦ、ブラーシスト他のジャ ーナル・オブ・エレクトロアナリティカル・ケミストリー１９８０．ＪＪｉ、３ ３９参照。しかしながら、これらの場合にはどれも、発光体は金属含有物質では なく、無金属有機化合物であった。金属含有ＥＣＬ部分並びにアミン還元剤を他 の系でそれぞれ使用することに伴う欠点を回避しながら、両者をその組合せの利 点を活用するように利用してＥＣＬ反応を行うための材料及び方法を提供するこ とは有意義な技術的前進である。

１ユ生旦五 本発明の目的は電気化学発光を生じるのに適する材料および方法を提供すること である。

本発明の別の目的はＥＣＬ検定（ａｓｓａｙ）を行うのに適する材料および方法 を提供することである。

さらに、本発明の目的は電気化学発光の、従って、広い濃度範囲にわたって存在 するであろう関心のある広く様々な検体の、検出のために適する方法および材料 を提供することである。

本発明の更に別の目的は関心のある検体の非常に低い濃度の検出および定量のた めに高感度ＥＣＬ検定を行うのに適する方法および材料を提供することである。

本発明の更に別の目的は有機環境ばかりでなく水性環境下における広い濃度範囲 にわたって存在する検体の、精度のある、反復可能な、高感度のＥＣＬ検出及び ／又は定量を行うのに適する材料及び方法の提供にある。

本発明の更に別の目的は金属含有ＥＣＬ部分を検出および／または定量するため のＥＣＬ検定に適する材料および方法の提供にある。

本発明の更に別の目的は関心のある検体のＥＣＬ検出および定量検定を、検定さ れる系の免疫化学を破壊しないｐＨで行うのに適する方法および材料の提供、特 に、生理的ｐＨで、関心のある検体の検出および定量を行うのに適するものの提 供にある。

本発明のこれら及びその他目的は本発明についての以下の記載を考察すれば更に 容易に明かになるであろう。

日の　′）”よび　占 以下の説明から明かになるように、本発明は上記欄に記載した目的の達成を可能 にする有力な手段である。

従って、本発明の一つは組成物によって放出された電磁放射線を検出するＥＣＬ 検定に使用するのに適する前記組成物であり、前記組成物は （ａ）電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に励起ＥＣＬ部分が曝される と励起状態から電磁放射線が放出されるそのような励起状態に変換させられるこ とが可能である金属含有ＥＣＬ部分； （ｂ）酸化されたときに強い還元剤になるアミンまたはアミン部分；および （ｅ）ＥＣＬ部分およびアミンまたはアミン部分が酸化されることがその中でで きるそのような媒体として機能することが可能である電解質 を含む。本願の別の発明は、（ｉ）電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件 に励起ＥＣＬ部分が曝されると励起状態から電磁放射線が放出されるそのような 励起状態に変換させられることが可能である金属含有ＥＣＬ部分、（ｉｉ）酸化 されたときに強い還元剤になるアミンまたはアミン部分、および（ｆｆｉ）　Ｅ ＣＬ部分およびアミンまたはアミン部分が酸化されることがその中でできるその ような媒体として機能することが可能である電解質、からなる群から選択された 成員を含む組成物によって電磁放射線が放出されるＥＣＬ検定を行うための組成 物の提供に使用するのに適する試薬に関し、前記試薬はアミンまたはアミン成分 、および前記群のその他の二成員のうちの一つを含む。

本願の更に別の発明は組成物によって放出される電磁放射線を検出するＥＣＬ検 定を実施するためのキットに関し、そのキットは（ｉ）電磁放射線の放出を誘発 するのに十分な条件に励起ＥＣＬ部分が曝されると励起状態から電磁放射線が放 出されるそのような励起状態に変換させられることが可能である金属含有ＥＣＬ 部分、（ｉｉ　）酸化されたときに強い還元剤になるアミンまたはアミン部分、 および（ｘｉ）ＥＣＬ部分およびアミンまたはアミン部分が酸化されることがそ の中でできるそのような媒体として機能することが可能である電解質を含有し、 前記キットは、前記のＥＣＬ部分（ｉ）、アミンまたはアミン部分（ｉｉ）　、 および電解質（伍）からなる群のうちの一つまたはそれ以上の成員を含有してい る少なくとも一つの独立した構成要素からなる。

本願の更に別の発明は電磁放射線の放出を発生させる方法に関し、前記方法は （ａＸｉ）電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に励起ＥＣＬ部分が曝さ れると励起状態から電磁放射線が放出されるそのような励起状態に変換させられ ることが可能である金属含有ＥＣＬ部分、（ｉｉ）酸化されたときに強い還元剤 になるアミンまたはアミン部分、および（ｎｉ）ＥＣＬ部分およびアミンまたは アミン部分が酸化されることがその中でできるそのような媒体として機能するこ とが可能である電解質を含む組成物を生成し；（ｂ）適切な条件下で組成物を、 組成物が電磁放射線を放出するのを誘発させるのに有効な量の電気化学エネルギ ーに曝し：そして （Ｃ）放出された電気放射線を検出する工程を含む。

本願の更に別の発明は関心ある検体をＥＣＬ検定によって検出または定量する方 法に関し、前記方法は（１）　（ａ）関心ある検体について検査されるべきサン プル、（ｂ）（ｉ）追加の関心ある検ｔシまたは関心ある検体の類似体、 （ｉｉ）関心ある検体またはその前記類似体の、結合パートナ−１および （伍）前記（ｉ）または（ｉｉ）と結合することが可能である反応性成分 からなる群から選択された少なくとも一物質、（ｃ）電磁放射線の放出を誘発す るのに十分な条件に励起ＥＣＬ部分が曝されると励起状態から電磁放射線が放出 されるそのような励起状態に変換させらることか可能である金属含有ＥＣＬ部分 、前記金属含有ＥＣＬ部分は関心ある検体または（ｂＸｉ）、（ｂＸｉｉ）もし くは（ｂ）　（ｉｉ　）に規定されている物質との結合相互作用に参加すること が可能である：（ｄ）酸化されたときに強い還元剤になるアミンまたはアミン部 分、および （ｅ）前記ＥＣＬ部分および前記種が酸化されることがその中でできるそのよう な媒体として機能することが可能である電解質 を含む組成物を生成し； （２）前記組成物を、組成物が電磁放射線を放出するのを誘発させるのに有効な 量の電気化学エネルギーに、曝し：そして （３）放出された電磁放射線を検出することを含む。

本願の更に別の発明はサンプルの中の関心ある検体をＥＣＬ検出または定量する ためのシステムに関し、前記（ｂＸｉ）添加されている関心ある検体または関心 ある検体の類似体、 （ｉｉ）関心ある検体またはその前記類似体の、結合パート−１および （伍）前記（ｉ）または（ｉｉ）と結合することが可能である反応性成分 からなる群から選択された少なくとも一物質、前記物質の一つは、電磁放射線の 放出を誘発するのに十分な条件に励起ＥＣＬ部分が曝されると励起状態から電磁 放射線が放出されるそのような励起状態に変換させられることが可能である金属 含有ＥＣＬ部分に、直接または一つもしくはそれ以上の分子を介して連結されて いる、 （Ｃ）強い還元剤に変換されることが可能であるアミンまたはアミン部分、およ び電解質： （ｄ）ＥＣＬ部分が電磁放射線を放出するのを誘発させる手段：および （ｅ）サンプルの中の関心ある検体の存在または量をるために放出放射線を測定 する手段 を含む。

ｒＥＣＬ部分」または「金属含有ＥＣＬ部分Ｊは時には、「標識」、「標識化合 物」、「標識物質ｊなどとも称される。本発明の範囲には、ｒＥＣＬ部分」、「 金属含有ＥＣＬ部分」、「有機金属」、「金属キレート」、「遷移金属キレート 」および「金金属キレート」の用語で表される種が　−一本発明に従って、成る 、組成物、試薬、キット、方法、またはシステムの態様に利用された場合にｍ− 他の分子、たとえば、検体またはその類似体、検体やその類似体の結合パートナ −１かかる結合パートナ−の更に結合バート−１または検体やその類似体や上記 のような結合パートナ−と結合することが可能な反応性成分、に連結されたもの も包含される。更に、上記種は、結合パートナ−や反応性成分や一つもしくはそ れ以上の結合パートナ−および／または一つもしくはそれ以上の反応性成分の組 合せに結合されている検体またはその類似体に連結されていることも可能である 。また、本発明の範囲には、複数の上記種が検体またはその類似体に直接または 上記のような低分子を介して結合されたものも包含される。

同様に、本発明の範囲には、上記「組成物」以後しばしばｒＥＣＬ組成物」また は「システム」が、ＥＣＬ反応の経路で生成された不安定な、準安定な、および その他の中間種たとえば上記のような励起状態のＥＣＬ部分や上記の強い還元剤 を含有したものも包含される。

また、可視光の放出は本発明の成る態様の有利な特徴ではあるが、本発明の範囲 には、組成物（以後、しばしばｒＥＣＬ組成物」）またはシステムが赤外または 紫外光、Ｘ線、短波などのようなその他のタイプの電磁放射線を放出するものも 包含される。本発明に関連して用語「電気化学発光」、「電気化学発光性」、「 電気化学発光する」、「発光」、「発光性」および「発光する」の使用は放出が 光であることを必要とせず、放出はかかるその他の形態の電磁放射線である余地 をもつ。

本発明の実施者には実質的利益が与えられる。本発明による材料および方法は有 機環境ばかりでなく水性環境下でも、広い濃度範囲にわたって、非常に低い検体 濃度になりも、関心ある検体のＥＣＬ検出および定量を行う洗練された技法を提 供する。優れた精度および再現性の検出および定量測定が得られる。アミン誘導 還元剤との組合せでの金属含有ＥＣＬ部分特に金属キレートの利用は本発明の実 施者をして、これら成分の両方ではなくどちらか一方しか含有しない他のＥＣＬ 技術が普遍的に抱えていた欠点を回避しながら、これら成分の細別の使用によっ て与えられていた利点を獲得することを可能にする。従って、金属含有種の使用 による反応のコントロールおよび作業者の利便性の獲得は生理的ｐＨでの操作能 力を犠牲にすることがなかった。逆に、ＥＣＬ相互作用でのアミン誘導還元剤の 使用は有利でさえあった：検出および定量作用は生理的ｐＨで存在する高度に興 味ある生物学的システムの免疫化学を破壊することな〈実施することができ、そ れら作用は高度に興味ある多くの生物学的システムの水性環境とは適合しない有 機発光体の使用を伴わない。

さらに、本発明は以下の記載に説明されているように多数の非常に多様な関心あ る検体の検出および定量に有効である。

また、本発明の融通性は異質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）検定を行うのに有 効であるのみならず、均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）検定にも有効であるとい う事実から証明される。この点について、異質検定は関心ある検体またはその類 似体に直接または一つもしくはそれ以上の他の分子を介して連結したＥＣＬ部分 を、かかるＥＣＬ部分が電気化学エネルギーに曝される前に、検体またはその類 似体に連結していないＥＣＬ部分から分離する場合である。これと対照的に、均 質検定はかかる分離をしないで材料を一緒に電気化学エネルギーに曝す場合であ る。本発明の均質検定においては、ＥＣＬ部分が検体またはその類似体に連結さ れているときに放出される電磁放射線はＥＣＬ部分が検体またはその類似体に連 結されていないときに放出される電磁放射線と異なっている。これは、たとえば 、検体またはその類似体に連結されたＥＣＬ部分の存在に対応する増大または減 少した発光量を検知することによって達成できる。

の　な−ロ 第１図は本発明による電気化学発光を誘発させるのに適するセルの概略図である 。

第２図は第１図に図解されているセルと共に使用するための電圧コントロール装 置の簡略図式である。

！３図および第４図はルテニウム含有金属キレートの様々な濃度で得たＥＣＬ強 度の平均測定を濃度に対してプロットしたものである。

第５図はルテニウム含有キレートの一定濃度で、トリプロピルアミンの様々な濃 度で得たＥＣＬ強度の平均測定をプロットしたものである。

第６図はルテニウム含有キレートの一定濃度で、変動ｐＨでのＥＣＬ強度の平均 測定のプロットである。

い　の　１ 本発明、その追加の目的、特徴及び利点は下記の成る好ましい態様についての詳 細から更に良く理解できる。

本発明は金属キレートのような金属含有化合物、アミンおよびアミン部分、およ びその他の、結合相互作用に参加可能な関心ある検体を検出および定量すること を可能にするのに有効である。これら反応は、たとえば、抗原−抗体相互作用、 配位子−受容体相互作用、ＤＮＡとＲＮＡの相互作用、およびその他の既知の反 応である。

成る態様では、本発明は多成分サンプル中の関心ある検体の存在を定性的かつ定 量的に検出するための様々な材料および方法に関する。

金属含有ＥＣＬ部分並びにアミンおよびアミン部分そのものに加えて、代表的な 関心ある検体はサンプル中に存在する全細胞又は表面抗原、細胞上粒子（ｓｕｂ ｃｅｌｌｕｌａｒｐａｒｔｉｃｌｅ）　、ウィルス、ブライオン（ｐｒｉｏｎ） 　、パイロイド（ｖｆｒｏｉｄ）、抗体、抗原、ハブテン、脂肪酸、核酸、蛋白 質、リボ蛋白質、多糖、リボ多糖、糖蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、細胞中 間代謝物、ホルモン、薬剤、非生物学的重合体（好ましくは、可溶性）、合成有 機分子、有機金属分子、トランキライザー、　バルビッル酸塩、アルカロイド、 ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、組換え体または誘導蛋白質、 ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたは無機分子である。

−態様においては、試薬はＥＣＬ部分が、抗体、抗原、核酸、ハプテン、小さな ヌクレオチドシーケンス、オリゴマー、配位子、酵素、またはビオチン、アビジ ン、ストレプトアビジン、蛋白質Ａ、蛋白質Ｇ、またはそれらの複合体、または 、蛋白質相互作用を通して主結合パートナ−に結合可能なその他の二次結合パー トナ−にコンジュゲートしているものである。

全細胞は動物、植物、または細菌でもよく、そして生きていてもよいし、または 死んでいてもよい。例は菌類や線虫のような植物病原体などである。用語「細胞 上粒子」は、たとえば、細胞下オルガネラ、破壊細胞からのような膜粒子、細胞 壁の断片、リポソーム、多酵素複合体、および、生きた有機体から誘導できるそ の他の粒子を包含することを意味する。核酸は、たとえば、染色体ＤＮＡ、プラ スミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、および複数源から誘導された組換えＤＮＡであ る。核酸はまた、ＲＮＡ、たとえば、メツセンジャーＲＮＡ、　リポソームＲＮ Ａ、および転移ＲＮＡｔども含む。ポリペプチドはたとえば、酵素、輸送蛋白質 、受容体蛋白質、およびウィルスコート蛋白質のような構造蛋白質である。好ま しいポリペプチドは酵素および抗体である。特に好ましいポリペプチドはモノク ロン抗体である。ホルモンはたとえば、インシュリンおよびＴ４甲状腺ホルモン である。

薬剤はたとえば強心性グリコシドである。勿論、本発明の範囲には、合成ポリペ プチド、合成核酸、および合成膜のような生物学的材料に化学的に似ている合成 物質、小胞、およびリポソームも包含される。これら列挙は本発明に使用するの に適する生物学的物質を＃ＪＦ！ｌするためのものではなく、広範囲の本発明の 単なる例示である。

また、代表的には、関心ある検体は１Ｏ−３モルまたはそれ未満の濃度で、たと えば、少なくとも１Ｏ−１８モルのような低い濃度で存在する。

関心ある検体を含有するサンプルは固体、乳濁物、懸濁物、液体、または気体の 形態であることができ、たとえば、細胞および細胞誘導生成物、水、食物、血液 、血清、毛髪、汗、尿、排泄物、組織、唾液、油、有機溶媒または空気から誘導 されることができる。サンプルはさらに、たとえば、水、アセトニトリル、ジメ チルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチルピロリドンまたはアルコ ールを含むことができる。

本発明の本質的特徴は金属含有ＥＣＬ部分の利用にある。好ましくは、ＥＣＬ部 分は電磁放射線を放出することを繰り返し誘発させられることができるように再 生的である。即ち、それは分子当たり複数の発光事象を経験する。これは分子当 たり一発光事象より多い「標識」が生じない従来態様よりも明かに有利である。

（本発明の範囲には、放射活性イソタイプ、ルミノール様化学発光分子などのよ うな追加の「標識」を利用したものも包含されることに留意されたい。） 本発明に従って利用されるＥＣＬ部分の範囲には、本発明に従う電気化学的刺激 の結果として可視光のような電磁放射線を放出する有機金属化合物も包含される 。たとえば、４．４’、５’、５−テトラメチルビピリジンＲｅ（１）（４−エ チルピリジン）（ＣＯ）＊”　ＣＦｓＳＯｓ　−；およびＰｔ（２−（２−チェ ニル）ピリジン）、である。

金属含有ＥＣＬ部分は金属キレートであると有利である。このキレートの金属は 本発明に従った電気化学的刺激の結果としてキレートが可視光のような電磁放射 線を放出するようなものである。かかる金属キレートの金属は、たとえば、遷移 金属（周期表のｄ−ブロックからの遷移金属のような）、または希土類金属であ る。金属は好ましくは、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジ ウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクニチウム、銅、クロム またはタングステン、またはランタン、ネオジム、プラセオジム、またはサマリ ウムである。特に好ましい金属はルテニウムおよびオスミウムである。

かかるキレートの中の金属に連結している配位子は通常、複素環式または有機の 本性であり、それは金属キレートの発光波長の決定、並びに、水性環境下または 有機すなわち非水性環境下で金属キレートが可溶性であるかどうかの決定に関与 する。配位子は多座であることができ、かつ置換されていることができる。適切 な多座配位子は芳香族および脂肪族配位子である。かかる芳香族多座配位子は芳 香族複素環式配位子を包含する。好ましい芳香族複素環式配位子は含窒素系、た とえば、ビピリジル、ビビラジル、チルピリジル、およびフエナントロリルであ る。適する置換基はたとえば、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリー ル、アラルキル、置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、 カルボキシアミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニ ル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジン、ウレイド、硫黄含有基、燐含有 基、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステルである。

キレートは一つまたはそれ以上の単座配位子を有することができ、広く様々な単 座配位子が知られている。適する単座配位子は、たとえば、−酸化炭素、シアニ ド、イソシアニド、ハライド、および、脂肪族、芳香族および複素環式ホスフィ ン、アミン、スチルベン、およびアルシンである。

適するキレートの例はビス［（４，４’−カルボメトキシ）−２，２’　−ビピ リジン］　−２−［３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４−イル）プロ ピル１−１．３−ジオキソランルテニウム（ＴＩ）　；ビス（２，２’−ビピリ ジン）［４−（ブタン−１−アール）−４′−メチル−２，２′−ビピリジン１ ルテニウム（■）；　ビス（２，２’−ビピリジン）［４−（４′−メチル−２ ，２′−ビピリジン−４′−イル）−酪酸ｊルテニウム（Ｉ［）；　（２，２’ −ビピリジン）［ビス−ビス（１，２−ジフェニル−ホスフィノ）エチレン］　 ２−［３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−プロピル］− １，３−ジオキソランオスミウム（■）：　ビス（２，２’−ビピリジン）〔４ −（４′−メチル−２，２′−ビピリジン）−ブチルアミドルテニウム（■）； 　ビス（２，２’−ビピリジン）［ｌ−ブロモ−４−（４’−メチル−２，２′ −ビピリジン−４−イル）−ブタン］ルテニウム（■）；およ°びビス（２，２ ’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン− ４１−ブチルアミドルテニウム（ＩＩ）である。

本発明における金属含有ＥＣＬ部分の作用は電気化学エネルギーを反応系に導入 した結果として電磁放射線を放出することである。これを行うためるは、金属含 有ＥＣＬ部分は励起されたエネルギー状態に刺激されることが可能でなければな らず、かつ、その励起状態から降下するときに光のフォトンのような電磁放射線 を放出することが可能でなければならない。金属含有ＥＣＬ部分の寄与機構の理 論的解析によって拘束するつもりはないが、本発明者らは反応系への電気化学エ ネルギーの導入によつてＥＣＬ部分が酸化され、それから、その系に存在する還 元剤との相互作用を通してＥＣＬ部分が励起状態へと変換されると考えている。

この状態は比較的不安定であり、そして金属含有ＥＣＬ部分は速やかにより安定 な状態に降下する。そうする際に、ＥＣＬ部分は光のフォトンのような電磁放射 線を放出する。

代表的には、検定操作においては、金属含有ＥＣＬ部分は関心ある検体またはそ の類似体に直接にまたは一つもしくはそれ以上の他の分子を介して連結されてい る。

関心ある検体の類似体（天然でも合成でもよい）は代表的には、検体に匹敵する 結合性質を有する化合物であるが、もっと高いまたは低い結合能力の化合物であ ることも可能である。金属含有ＥＣＬ部分が一つまたはそれ以上の他の分子を介 して検体または前記類似体に連結される場合、それら分子は適切には一つもしく はそれ以上の結合パートナ−及び／又は一つもしくはそれ以上の反応性成分の組 合せである。本発明に使用するのに適する結合パートナ−は周知である。例は抗 体、酵素、核酸、補足因子、受容体である。検体またはその類似体と、及び／又 は結合パートナ−と結合することが可能な反応性成分は適切には第二抗体または 蛋白質たとえば蛋白質Ａや蛋白質Ｇ１またはアビジンやビオチン、または結合反 応に参加することが知られているもう一つの成分である。

本発明に従って組み入れられる金属キレートまたはその他の金属含有ＥＣＬ部分 の量は系によって様々であろう。一般には、かかるＥＣＬ部分の使用量は上記組 成物から電磁放射線の検出可能な及び必要ならば定量可能な量の放出を生じさせ るのに有効な量である。関心ある検体の検出および／または定量は代表的には（ ｉ）ＥＣＬ組成物によって放出されたかかる電磁放射線の量または波長と（ｉｉ ）較正曲線の形態のように関心ある検体の濃度が既知であるときに放出される電 磁放射線量を示すデータの比較によって行われる。これは、勿論、均質ホーマッ トを仮定している。異質形態においては、先に述べたように、ＥＣＬ分析に先立 つて分離が行われる。

当業者には理解できるように、金属含有ＥＣＬ部分の強度および量は、主な条件 に依存して、系によって様々であろう。適切な金属含有ＥＣＬ部分およびその、 所定結果を得るのに十分な量は、本願で教示を受けた当業者にとっては、膨大な 実験を伴うことなく、経験的にめることができる。

より特殊な態様では、本発明に従う組成物は二つまたはそれ以上の異なるＥＣＬ 部分を含有する。ＥＣＬ部分の各々は他方（単数または複数）とは異なる波長の 電磁放射線を放出することを誘発させられることができる。

本発明の別の態様においては、ＥＣＬ部分の各々は他方（単数または複数）が放 射線を放出するところのエネルギー値（単数または複数）とは異なる値のエネル ギーに曝すことによって電磁放射線を放出することを誘発させられるような種で あることができる。この場合、試験下のサンプル中に存在するであろう二つまた はそれ以上の異なる関心の検体を測定することができる。

本発明のもう一つの本質的特徴は高い還元用の種に変換するように酸化されるこ とができるアミンまたは（大きな分子の）アミン部分の利用にある。やはり、反 応機構の理論的解説によって拘束するつもりはないが、アミンまたはアミン部分 もまた、反応系に導入された電気化学エネルギーによって酸化されると考えられ る。アミンまたはアミン部分は電子１伺を失い、それから、脱プロトン化して、 またはそれ自身再構成して、強い還元剤になる。この還元剤は酸化された金属含 有ＥＣＬ部分と相互作用して、前記金属含有部分をして上記の励起状態をとらし める。その役目を果たすためには、アミンまたはアミン部分は好ましくは、電子 を寄付できる炭素をもった炭素中心基と、後の還元剤生成のための脱プロトン化 時にプロトン供与体として作用することができるα−炭素または共役炭素とを有 している。還元剤は酸化された金属含有ＥＣＬ部分を電磁放射線が放出されるそ のようなる励起状態に変換するのに必要な刺激を与える。

一般に、アミンまたはアミン部分から生成された還元剤は次式で定義されるレド ックス電位Ｅａを有する：Ｅａ＜　−ｈｃ／λ　＋　Ｋ　＋　Ｅｍ式中、ｈはブ ランクの定数であり、Ｃは光速であり、λは金属含有発光体の励起状態から放出 される放射線の波長特性であり、Ｋは（ｉ）ＥＣＬ相互作用が遂行される環境の 絶対温度（’　Ｋ）と（ｉｉ）ＥＣＬ反応の結果としてのエントロピーの変化と の積であり、モしてＥｍはＥＣＬ部分のレドックス電位である。通常、温度とエ ントロピー変化の積は約０．１ｅｖである。

酸化され、脱プロトン化されたアミンまたはアミン部Ｅａ＜　−ｈｃ／λ　＋　 Ｋ　＋　Ｅｍ　（１）を使用して、次のように、計算を展開する。

ＥＣＬ部分としてのＲｕ（ｂｐｙ）ｓ　”については、放出波長λは６２０ｎｍ である。Ｎ、Ｅ、）ツケル（Ｔｏｋｅｌ）他のジャーナル・オブ・アメリカン・ ケミカル・ソサイエティエ土、２８６２　（１９７２）参照。ＥｍはＮＨＥ（Ｎ ＨＥは標準水素基準電極である）と比べたときに１．３ｅＶであり、そして ｈ　ｃ　（４，１３ｘｌＯ−”　ｅＶ−ｓｅｅ）　（３ｘｌＯ”Ｃｍ／５ｅｅ） ＝２．０ｅＶ（エレクトロン　ポルト）。

Ｄ、　Ｈ，ウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）他のアナリティカ・ケミ力・アクタ エ、５３８　（１９５３）参照。Ｋは０．　１ｅＶであるとする。Ｌ、　Ｒ，フ ォーフナ−他のジャーナル・才ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ主土。

６９１（１９７２）参照。これら値を式（１）に入れると、次のようになる： Ｅａ−≦−−２，０＋　０．　１　＋１．　３　（３）Ｅａミニ−，６（４） 式（４）はアミン誘導還元剤の還元強度がＮＨＥに比べて−０，６Ｖに等しいか 又はそれより大きい負でなければならないということを示している。（電位差す なわちＥａまたはＥＮＤに言及するとき電位の単位はボルトであり、そして用語 ｈｃ／λおよびＫはｅＶのエネルギー単位を有している；　しかしながら、電位 差からｅＶへの換算は１であるということに留意されたい。）本発明の実施には 広範囲のアミンまたはアミン部分が利用できる。一般に、アミンまたはアミン部 分はＥＣＬ分析されるべき系のｐＨに適するように選択される。もう一つの関連 因子はアミンまたはアミン部分が分析中にその中で機能しなければならない環境 に適合性であるべきだということである。すなわち、そのケースがそうあるよう な水性または非水性環境に適合性であるべきだということである。さらにもう一 つの考慮因子は選択されたアミンまたはアミン部分が系中の酸化された金属含有 ＥＣＬ部分を還元するのに十分な強さの還元剤を、支配的条件下で、生成するべ きであるということである。

本発明に有利に利用されるアミンは各々のアルキル基が炭素原子数１〜３である 第一、第二および第三アルキルアミンのような脂肪族アミン、および、置換脂肪 族アミンである。比較して言えば、トリプロピルアミンは使用される態様での検 出および定量の感度および精度を向上させる特に高強度の電磁放射線の放出につ ながｄ恰、特に好ましいアミンである。また、ヒドラジンのようなジアミンや、 ポリ（エチレンイミン）のようなポリアミンも適する。本発明におけるアミン物 質はアニリンのような芳香族アミンであることも可能である。また、ピリジン、 ピロール、３−ビロリン、ピロリジン、および１．４−ジヒドロピリジンのよう な複素環式アミンも成る態様には適する。

上記アミンは置換されていてもよい。たとえば、−〇Ｈ，アルキル、クロロ、フ ルオロ、ブロモおよびヨード、　ＳＯｓ、アリール、−５Ｈ１−ＣＨ。

−ＣＯＯＨ，エステル基、エーテル基、アルケニル、アルキニル、　−Ｃ−１− Ｎ！”、シアノ、エポキシド基、および複素環式基のような置換基の一つまたは それ以上によって置換されていてもよい。　また、プロトン化された塩、たとえ ば、式Ｒ，Ｎ−Ｈ”　（式中、ＲはＨまたは上記置換基である）のプロトン化さ れた塩も適する。

上記アミン（Ｉｔ換または非置換）に対応するアミン部分も好ましい。

先に言及したように、トリプロピルアミン（またはそれから誘導されたアミン部 分）は特に好ましい。それは非常に高い光強度を生じさせるからである。このア ミンおよび本発明に有効なその他のアミンおよびアミン部分は６〜９のｐＨで適 切に十分に作用する。しかしながらトリプロピルアミンは７〜７．５のｐＨで最 良の結果を与える。本発明を実施するのに適する別のアミンの例はトリエタノー ルアミン、トリエチルアミン、Ｉ、４−ジアザビシクロ（２，２，２）−オクタ ン、１−ピペリジンエタノール、１．４−ピペラジン−ビス−（エタン−スルホ ン酸）およびトリーイソプロピルアミンである。

代表的には、本発明に利用される金属含有ＥＣＬ部分は反応を規制する成分であ る。従って、アミンまたはアミン部分がＥＣＬ部分に比べて化学量論的に過剰に 与えられることも典型的である。例示的には、アミンまたはアミン部分は５０〜 １５０ｍＭの濃度で使用される。約７のｐＨで利用するためには、１００ｍＭの 濃度がしばしば有利である。成る態様においては、アミンまたはアミン部分の濃 度についての上限は使用環境下での、たとえば水中での、アミンまたはアミン部 分（または、それが一部であるところの分子の残余）の最大溶解度によって決ま る。一般に、使用されるアミンまたはアミン部分の量は酸化された金属含有ＥＣ Ｌ部分を、電磁放射線の放出が起こるようにその励起状態に転位させるのに十分 なものである。

本願によって教示された当業者は膨大な実験を行うことなく、分析される具体的 系のために有利に使用されるアミンまたはアミン部分の強度および／または量を 実験的にめることができる。

先に言及したように、本発明に従って組み入れられたＥＣＬ部分はそれを刺激し て励起状態にすることによって電磁放射線の放出を誘発させられる。これはＥＣ Ｌ部分を組み入れられている組成物を電気化学エネルギーに曝すことによって行 われる。ＥＣＬ部分およびアミンまたはアミン部分の酸化が起こる電位（単数ま たは複数）はそれらの化学構造、並びに、系のｐＨや、電気化学エネルギーを導 入するために使用された電極の特性のような因子に依存する。ＥＣＬ系のための 最適電位および溶液条件のめ方は当業者には周知である。

勿論、電気化学エネルギーが電極によって導入される系を操作するには、その中 に電極を浸漬させ、ＥＣＬ部分とアミンまたはアミン部分を含有させるための電 解質を用意する必要がある。電解質はイオンによって電荷を運ぶ相である。

一般に、電解質は液相状態であり、そして水、有機液体もしくは混合有機液体、 または水と一つもしくはそれ以上の有機液体との混合体中の、一つまたはそれ以 上の塩またはその他の種の溶液である。しかしながら、この他の形態の電解質も 本発明の成る態様には有効である。

たとえば、電解質は流体−一たとえば、液体、蒸気、または超臨界流体−一中の 一つまたはそれ以上の物質の分散物であってもよいし、または固体、蒸気、また は超臨界流体中の一つまたはそれ以上の物質の溶液であってもよい。

上記超臨界流体はその臨界温度（即ち、それより上の温度ではどの圧力によって も液化できないような温度）より上に維持された濃密気体である。超臨界流体は 液体よりも粘稠ではないが、より容易に拡散する。本発明を実施するのに有効で あり得る超臨界流体の例は二酸化炭素、および、メタンやエタンやプロパンのよ うな特定のアルカンである。超臨界挙動を示す条件は既知である。

たとえば、１９８６年４月１５日登録のスミス（Ｓｍｉ　ｔｈ）の米国特許第４ ，５８２，７３１号参照。超臨界流体の利用は有利なことがある；たとえば、本 発明の成る態様においては、様々な関心検体の溶解度は超臨界流体中で増大する ことがある。また、ＥＣＬ部分およびアミンまたはアミン部分の溶解度は成る態 様においては超臨界流体中ではより容易に制御できる。さらに、場合によっては 、これら流体中での様々な種のより高い拡散係数のせいで、感度を改善できる。

本発明に従う組成物が水性である場合には、電解質は水性、たとえば、塩の水溶 液である。塩は好ましくはナトリウム塩またはカリウム塩であることができるが 、その他の陽イオンの加入も、陽イオンがＥＣＬ相互作用シーケンスに干渉しな い限り、成る態様に適する。塩の陰イオンはたとえば燐酸塩であってもよいが、 その他の陰イオンの使用も、やはり、選択される陰イオンがＥＣＬ相互作用シー ケンスに干渉しない限り、本発明の成る態様には許される。

組成物は非水性であることも可能である。超臨界流体は場合によっては有利に使 用できるが、非水性組成物中に有機液体を含む電解質を利用する方がはるかに典 型的である。水性電解質同様、非水性電解質もイオンによって電荷が運ばれる相 である。通常、これは塩が有機液状媒体中に溶解されていることを意味する。適 する有機液体の具体例は、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） 　、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、メタノール、エタノール、および、上 記の二つまたはそれ以上の混合物である。例示的には、テトラブチルアンモニウ ムテトラフルオロボレートのようなテトラアルキルアンモニウム塩は有機液体中 に可溶性であり、そしてそれらと−緒に使用して非水性電解質を生成することか できる。

電解質は、本発明の成る態様においては、緩衝された系である。燐酸塩緩衝液は しばしば有利である。例は燐酸ナトリウム／塩化ナトリウムの水溶液、および燐 酸ナトリウム／弗化ナトリウムの水溶液である。

緩衝された系を含めて電解質の配合、および本発明を実施するのに使用するため の電解質の適切な量の決定は本願明細書で教示を受けた実施者には容易である。

本発明では上記材料を使用しているため、本発明の実施者は本発明の方法態様に 従ってＥＣＬ組成物から電磁放射線の放出を誘発することが可能になる。

本発明の方法の広汎な一特徴はここに記載されているようなＥＣＬ組成物からの 電磁放射線の放出にある。

これは一つまたはそれ以上の金属含有ＥＣＬ部分と、一つまたはそれ以上のアミ ンおよび／またはアミン部分と、混和性電解質を組み合わせることで、電磁放射 線の放出という結果を伴う電気化学エネルギーの導入を可能にする組成物を生成 することによって遂行される。組成物は組成物をして電磁放射線を放出するのを 誘発させるのに有効である量の電気化学エネルギーを受ける。

本発明者らは、組成物をして電磁放射線を放出するのを誘発させるということに 、組成物中のＥＣＬ部分の励起状態を生じさせるという意味を持たせており、そ の励起ＥＣＬ部分は電磁放射線を発するｍ−たとえば、周囲温度で約２００ｎｍ 〜約９００ｎｍの波長で発光する。

この励起状態はＥＣＬ部分を酸化することによって達成される。先に述べたよう に、ＥＣＬ部分の酸化が起こる電位はその化学構造ばかりでなく、組成物のｐＨ や使用電極の特性のような因子にも依存する。ＥＣＬ部分が励起されると、それ は先に論じた強い還元剤との相互作用によって電磁放射線を放出する。ＥＣＬ組 成物についての最適電位と発光波長の決定は本願の教示を受けた後の当業者には 容易である。励起状態からの降下時にＥＣＬ部分によって放出される電磁放射線 の量は存在する検体の量の指標として直接測定することができる。代替法として は、ＥＣＬ部分が励起状態から降下するときに放出された電磁放射線は検出可能 な事象（または、段階のシーケンスにおいて検出可能な事象に集結する一段階） を触発するために利用することができるので、ＥＣＬ部分自体によって放出され た放射線ではなく、その検出可能な事象を測定する。

ＥＣＬ組成物によって放出される放射線は関心検体の定性または定量測定を可能 にするためには適切な手段を使用して検出される。

この測定は態様によっては可視的に行うことが可能であるが、有利には、連続レ ート型（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ）測定として、又は長時 間にわたるＥＣＬ信号の累積として行われる。たとえば、レート型測定法は光電 子倍増管、フォトダイオードまたはフォトトランジスターを使用して入射光強度 に比例した大きさの電流を生じさせて、または電荷結合デバイスを使用すること によって行うことができ、他方、累積法の例はレート型データの積分および累積 データを直接与える写真フィルムの使用である。

組成物は所定のＰＨ，ＥＣＬ部分の濃度、アミンまたはアミン部分の濃度、およ び電解質を得るように配合される。この点に関して、金属含有ＥＣＬ部分、アミ ンおよびアミン部分、電解質、および、組成物中でのそれらの適切かつ好ましい 量および濃度は本願のどこかに記載されている。

組成物はその個々の成分を合わせることによって製造できる。しかしながら、組 成物を構成する様々な物質の組合せを含有している一つまたはそれ以上の試薬を 利用する方がしばしば有利である。このやり方は本発明に従って配合される組成 物の均一性の維持を促進し、それは本発明の実施によって達成される信頼性およ び再現性に寄与する。

従って、組成物の配合に適する試薬は組成物中に組み入れられるべき金属含有Ｅ ＣＬ部分とアミンまたはアミン部分を含むことができる。代替として、試薬は金 員含有ＥＣＬ部分と選択された電解質、または、アミンまたはアミン部分と選択 された電解質を含むことができる。

どちらの試薬が採択されても、それを、組成物の配合に必要な残りの成分と合わ せることができる。これら成分のうちの一つまたはそれ以上を別の試薬の中に含 有させることもできる。たとえば、金属含有ＥＣＬ部分／電解質の組合を含む試 薬をアミンまたはアミン部分／電解質の組合せを含む別の試薬と混合して所定の 組成物を得ることができる。

好ましい態様においては、アミンまたはアミン部分と電解質を含む試薬が、ＥＣ Ｌ部分を含む別の試薬と合わされる。

組成物の配合は配合段階に必要な一つまたはそれ以上の試薬成分を含むキットに よって適切に遂行される。従って、キット全体は（ｉ）先に説明したような金属 含有ＥＣＬ部分と、（ｉｉ）先に説明したようなアミンまたはアミン部分と、（ 伍）先に説明したような電解質とを含有する。キットで組成物を配合するのに使 用される包装成分の魅力は便利に一つまたはそれ以上の成分として提供された標 準化された成分が本発明の実施の信頼性および再現性を改善するために使用でき ることである。試薬およびその他の材料をキット形態で使用するということは使 用前の成分の崩壊の恐れを最小にする道を与えるということでも有利である。こ れはかかる崩壊が起こるかも知れない組合せを回避するようにキットのフォーマ ットを構成できる結果である。

従って、組成物は、金属含有ＥＣＬ成分、アミンまたはアミン部分、および電解 質からなる群の中の任意の二成員が第一の独立した構成要素の中に含有されてお り、上記群の中の残りの成員が第二の独立した構成要素の中に含有されているよ うなキットから、配合できる。（キットの構成要素は一般には、合わせる前に交 錯汚染しないように各々専用のビンに入れて分離されている。）代替としては、 上記群の中の任意の二成員を含有する第一の独立した構成要素と、上記群の中の 残りの成員と上記群の他方の成員の中のいずれか一つを含有する第二の独立した 構成要素からなるキットである。更に別の代替はそれぞれが上記群の三成員の中 の異なる一つを含有している三つの独立した構成要素からなるキットである。さ らに別のフォーマットにおけるキットは、上記群の中の三成分全てを含有してい る第一の独立した構成要素と、上記群の成員の中の任意の一つまたは二つを含有 する第二の独立した構成要素からなり；かかるキットは上記群の中の一つまたは 二つの成員を含有する第三の独立した構成要素を更に含むことができる。

より詳しくは、有利な態様においては、キットの第一の独立した構成要素は金属 含有ＥＣＬ部分とアミンまたはアミン部分を含有しており、そして第二の独立し た構成要素は電解質を含有している。代替としては、キットの第一の独立した構 成要素はＥＣＬ部分と電解質を含有しており、そして第二の独立した構成要素は アミンまたはアミン成分を含有している。特に好ましい態様においては、第一の 独立したキット構成要素はアミンまたはアミン部分と電解質を含有しており、そ して第二の独立した構成要素は金属含有ＥＣＬ部分を含有している。

上記のように、本発明を用いると、電磁エネルギーの放出はかかる放出を誘発す るのに有効な量の電気化学エネルギーに上記組成物を曝することによってもたら される。有利なことには、この放出は組成物を、従ってその中の金属含有ＥＣＬ 部分を、ポルタンメトリー作用電極（ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ　ｗｏｒｋｉｎ ｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）に露出させることによって誘発される。ＥＣＬ反応性 混合物は従って、望むような光またはその他形態の電磁放射線の発生を生じさせ るのに有効な特別の時および特別の仕方で作用電極に印加された電圧によって、 光またはその他の電磁放射線を放出することを制御可能に触発される。必要な電 圧は本願で教示された後の当業者には、膨大な実験を伴うことなく、実験で誘導 できる。

本発明の方法をさらに、第１図および第２図に図解されているような本発明の実 施に適する装置についての解説と合わせて、説明する。

第１図は電気化学ルミネセンスを発生させるのに有利な装置を開示している。し かしながら、本発明の方法は装置ｌＯを使用しての応用に限定されるものではな く、電気化学ルミネセンスを触発するための電気化学エネルギーを与えるための 作用電極またはその他の触発表面を包含するその他のタイプの装置を使用して実 行できる。

本発明の方法は静的様式でも、またはフロースル一様式でも行うことができるが 、装置ｌＯはフロースルーセルである。これは多くのタイプのＥＣＬ操作のため に、たとえば、結合検定サンプルを含めて多数のサンプルの取扱のために特別の 利点を与える。

装置ＩＯは次のものを含む：電気化学セル１２゜光検出／測定器１４、これは有 利なことに光電子倍増管（ＰＭＴ）、フォトダイオード、電荷結合デバイス、写 真フィルムや乳剤などであることができる。および、ポンプ１６、これは流体を セル１２に、またはそれを通って、またはそこから輸送するためのものであり、 有利には、螺動ポンプである。代わりに、容量型ポンプが使用されてもよい。シ ャッター機構１８はセル１３とＰＭＴ１４の間に設けられており、電気化学ルミ ネセンスの測定時間中にＰＭＴ１４をセル１２に露出させるためにだけ開くよう に制御されて操作される。シャッター機構１８はたとえば保守中には閉じること ができる。（簡潔かつ明瞭にするために）第１図に示さなかったが、装置ｌＯに は、電気化学ルミネセンスの測定中にＰＭＴ１４をあらゆる外部の光から遮蔽す るために、装置の様々な構成部を内側に配置することができる光遮断ハウジング を設けることが有利である。

セル１２自体は、導入管２２と排出管２４が貫通し有利にはステンレス鋼から構 成された第一の搭載ブロック２０を含んでいる。搭載ブロック２０は第一の外側 表面２６と第二の内側表面２８を有しており、内側表面はセル１２が装置ＩＯの 操作に応じてクリーニング用および／またはコンディショニング用および／また は測定用の溶液を保持するところのサンプル保持容積部３０の一方の側面を規定 している。導入管２２および排出管２４は搭載ブロック２０を外側表面２６から 内側表面２８へと貫通し、そしてサンプル保持容積部３０の中に開口している。

やはりステンレス鋼で構成されていると有利である第二の搭載ブロック３２は第 一の外側表面３４と第二の内側表面３６を存している。第二の搭載ブロック３２ は、テフロンまたはその他の非汚染性材料から構成されていると有利である環状 スペーサー３８によって第一搭載ブロック２０から分離されている。従って、搭 載ブロック３２の外側表面３４はサンプル保持容積部３０の第二の側面の一部を 規定している。スペーサー３８は外側部分４０と中央開口部４２を有しており、 その内側縁部４４はサンプル保持容積部３０の側壁を規定している。

外側部分４０は第一搭載ブロック２０の内側表面２８から第二搭載ブロック３２ の外側表面３４までを密閉して両表面２８と３４の間のサンプル保持容積部３０ から溶液が外に出るのを防いでいる。搭載ブロック３２はさらに、サンプル保持 容積部３０の第二側面の残りを外側表面３４の連続として規定するように窓４８ が密閉装着されているところの中央開口部４６を有している。窓４８はサイプル 保持容積部３０の中のサンプルによって発生されるＥＣＬ先の波長において実質 的に透明である材料から構成されている。従って、窓４８はガラス、プラスチッ ク、石英などから構成されると有利である。

導入管２２はサンプル保持容積部３０とはその、スペーサー３８に隣接した、第 一端部５０で交わり、そして排出管２４はサンプル保持容積部３０とはその、ス ペーサー３８に隣接した、第二端部５２で交わっている。導入管２２とサンプル 保持容積部３０と排出管２４の組合せは従って、溶液が狭くかつ実質的に層状の 流れでセル１２の中へ、そしてセル中を、そしてセルの外へ流れるための、連続 流路を提供している。

第一搭載ブロック２０の内側表面２８には作用電極系５４が搭載さている。図解 の態様では、作用電極系は第一および第二の作用電極５６および５８を含んでい る。

別の態様では、有利に、単一作用電極が与えられてもよい。または、電極５６だ けが作用電極であってもよい。

作用電極５６．５８は関心の的の電気化学反応とＥＣＬ反応を行うことができる 場所である。作用電極５６．５８は固体ポルタンメトリー電極であり、従って、 有利なことには、白金、金、炭素、またはこのために有効であるその他材料から 構成できる。それぞれ、作用電極５６．５８に接続されたコネクター６０．６２ は第一搭載ブロック２０を通って外に出ている。

コネクター６０．６２はどちらも、第２図に図示されている電圧コントロール６ ６の第一の「作用電極Ｊ端子６４に接続している。電圧コントロール６６は作用 電極５６．５８に電圧信号を供給するための、そして任意的には電気化学ルミネ センスの測定中にそこから流れる電流を測定するための、ポテンショスタットの 仕方で操作すると有利である。代わりに、コネクター６０．６２は個別操作のた めに電圧コントロール６６の個別端子に接続してもよい。

電圧コントロール６６のポテンショスタット操作はさらに対極６８および任意的 に有利には基準電極７０を通して行われる。図示した態様では、搭載ブロック３ ２はステンレス鋼からなり、そして対極６８は搭載ブロック３２の露出表面７２ ．７４の中に在る。対極７２．７４と作用電極５６．５８はサンプル中の関心の 的の反応を賦勢し電気化学ルミネセンスを触発しそして／またはセル１２の表面 をクリーニングおよびコンディショニングするためのエネルギーを付与する電位 をサンプル保持容積部３０の中の溶液に印加するための界面を提供している。対 極７２．７４はワイヤコネクター７６によって電圧コントロール６６の第二「対 極」端子７８に接続されている。

基準電極７０は基準電圧を付与し、その基準電圧を基準にして、作用電極５６． ５８に電圧、たとえば、基準電圧に対して＋１．２ボルト、が印加される。基準 電極７０はセル１２から離れた位置８０で排出管２４の中に配置されていると有 利であり、そしてワイヤコネクター８２を介して電圧コントロール６６の第三「 基準電極」端子８４に接続されている。この三電極式では、電流は基準電極７０ の中を流れない。基準電極７０は三電極式操作では、平衡した既知の安定電圧を 与えるために使用されてもよ（、従って、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣＡ’）から 成るか又は飽和せコウ電極（ＳＣＥ）であると有利である。電圧コントロール６ ６は作用電極５６と、対極／基準電極としての電極５８だけを使用する二電極式 で操作することも可能である。この二電極式操作では、対極／基準電極５８は電 圧コントロール６６の電圧コントロール端子７８および８４に電気接続されてい る。この場合、電圧コントロール６６は本質的にバッテリーとして作動する。電 圧コントロール６６は作用電極５６と対極５８に電圧信号を付与し、そして任意 的に、それぞれの電極を通る電流を測定する。代わりに、基準電極７０は白金、 金、ステンレス鋼、またはその他材料から成る「準−基準」電極と呼ばれるもの であってもよ（、それはより安定でない電圧を付与するが、接触している溶液に 対しては測定可能なものである。二電極式でも三電極式でも、基準電極７０また は５８は作用電極に印加される電圧を測定するための基準を付与する目的を果た している。平衡した電圧基準は現在では、より有利であると考えられている。電 圧コントロール６６はそのポテンショスタット操作では、作用電極５６．５８と 対極７２．７４との間の電流を測定しながら、基準電極７０に対して作用電極５ ６．５８に既知電圧を与えることによって様々な電極をコントロールする。この ためのポテンショスタットは周知であり、そして電圧コントロール６６の内部構 造は従って、上記作用を生じる通常の市販のポテンショスタットのどれにでも適 切に対応するので、それ自体は本発明の一部を構成しない。実際、装置１０は内 部電圧コントロール６６なしに構成することも可能であり、そして電極５６．５ ８．７２．７４および７０に必要な電圧信号を付与するために別に制御されてい る外部ポテンショスタットに接続することを採用することができる。後に示すよ うな特定の仕方で印加されたこれら電圧信号は反復可能な初期条件を作用電極５ ６．５８の表面に与え、そして有利なことには、セル１２の表面に全体として、 電気化学ルミネセンス測定のプロセスの改善に有意に寄与する特徴を与える。

ポンプ１６はサンプル容積部からの溶液を矢印Ａの方向で導入管２２に「引き込 む」ために排出管２４に配置されていると有利である。溶液は導入管２２、サン プル保持容積部３０および排出管２４へ流れ、基準電極７０を通過して、矢印Ｂ の方向へと排出する。代わりに、ポンプ１６は溶液を装置１０の中に「押し込む 」ために導入管２２に配置されていてもよい。有利なことには、導入管２２、サ ンプル保持容積部３０および排出管２４を通るこの同じ流路が、セル１２を通る 全ての溶液および流体について使用されるので、各流体はセル１２を通過する流 体に強制力を加えることで流体力学的クリーニング作用を果たす。ポンプ１６は その作用を停止して、成る時間、セル１２に特定溶液を保持させるように、制御 されてもよい。

装置ｌＯのフロースルーの構成は作用電極を一つまたはそれ以上の溶液に連続的 に曝しながら予備操作電位に継続維持するように可変電圧を印加することを、作 用電極５６．５８（または対極および基準電極７２．７４．７０）の空気暴露な しで、可能にする。基準電極７０に回路を開かせる空気暴露は作用電極５６．５ ８の表面状態の再現性を乱す未知の偶発的ゆらぎを許してしまう。

フロー−スルーの構成は電極系５４をクリーニングしコンディショニングする初 期化段階と、一つまたはそれ以上の測定波形または掃引が電気化学ルミネセンス を触発する測定段階との間の迅速な交代を可能にする。

以上から、本発明に従った金属含有ＥＣＬ部分とアミンまたはアミン部分と電解 質を含む組成物はセル１２に導入され、そして、有利には、上記のような系（ま たは本願の教示を与えられた後の当業者には容易に誘導できるようなその他の適 する系）の一つまたはそれ以上の電極に適切な電圧を印加することによって、電 気化学エネルギーに曝されて所定の電気化学ルミネセンスを誘発させることは明 かである。

当該反応系によって放出される光またはその他の電磁放射線の量は検体の存在ま たは欠如の指標であり、そして、存在する場合には、その量の指標である。従っ て、関心検体についてのサンプルの定性的および定量的分析が可能である。この 点に関して、放出された電磁放射線が光である場合、その発光はコンピューター たとえばパーソナルコンピューターに接続した光度計によって検出できる。その コンピューターで、光度計から受けた信号を処理し、そして、たとえば、スクリ ーンに表示するか又は適切なストリップ−チャートまたはその他の記録計にアナ ログ変換のアウトプットを出すことができる。

本発明の主な応用はＥＣＬ検定による所定サンプル中の関心検体の検出または定 量である。先に言及したように、本発明のＥＣＬ反応を包含する結合検定は様々 なフォーマットで行うことができる。第一の態様では、関心検体の存在または欠 如を調べることが要求されるサンプルは電磁放射線の放出が、比較サンプル（こ こでは、存在するＥＣＬ部分は直接にも又は一つもしくはそれ以上の他の分子を 介しても関心検体またはその類似体に連結されてはいない）から得られた放出に 比べて変化したかどうか（減少したか、または増加したか）を調べるために直接 評価される。第二の態様においては、検出およびもし関心検体が存在する場合に はその定量は、サンプルから本発明に従ってＥＣＬ組成物を配合するための必要 な工程を実施し、その組成物を本発明に従って電気化学エネルギーに曝し、それ から、放出された電磁放射線の量を、関心検体の様々な既知量を含有する系から の電磁放射線の放出と比較することによって、行うことができる。検査されたサ ンプルにおける放出の認識できる変化は検体の存在および量を示している。

本発明の方法は様々な検定フォーマットに組み込むことができる。このように、 本発明は均質または異質の検定フォーマットに使用され、そしてフォワードおよ びリバース検定、競合検定、免疫検定、サンドインチ検定、およびハイブリドー マスクリーニング検定を含む、既知の全ての検定法に使用できる。

同日付けで出願された、発明者シャーとホールとバラエルとメッセイの「電気化 学ルミネセンス検定」と題する、普通に譲渡された米国出願第２６６．８８２号 に記載さているように、検定組成物または系に粒子を組み入れることは、本願に 開示された検定を行う場合にも、望ましい。転じてＥＣＬ部分に連結されせるこ とかできるような成分を粒子に結合させると、ＥＣＬ部分によって生じるＥＣＬ 信号の強度が大きく変調され、それによって、検定組成物または系の特異結合反 応を監視する手段が提供される。この特記事項についての更なる情報は上記出願 に記載されており、その内容は本願明細書中に組み入れられる。

たとえば、本発明によって提供される均質な結合検定の有効なりラスは関心検体 を含有するＥＣＬ部分の溶液を電極に曝すことを包含する。電極の表面への接近 を獲得できないＥＣＬ部分は検出されない。このようなことは、たとえば、電極 が配置されている反応容器の表面にＥＣＬ部分が直接または間接に結合した場合 や、ＥＣＬ部分が特殊複合体の内部深くに例えば抗原−抗体の複合体内に埋没し た場合や、ＥＣＬ部分は通過できるが関心検定またはその類似体に（直接または 間接に）連結したＥＣＬ部分は通過できないような層によって電極自体が覆われ た場合に起こることがある。さらに、電極の表面を抗体が覆うこともあり得るは ずである。そうなると、ＥＣＬ部分に直接または一つもしくはそれ以上の他の分 子を介して連結されており、かつ、不動態化した抗体に結合している、抗原だけ が電極への接近を獲得することができ、そして測定されることができる。

競合結合法は関心検体の存在を調べるために、本発明に従って利用できる。代表 的には、検体とＥＣＬ部分とが競合して化学材料に結合する。その材料を、適切 な組成物を生成するような適切な条件下で、ＥＣＬ部分および検体と接触させる 。組成物を電気化学エネルギーに曝すことによってＥＣＬ部分は電磁放射線を放 出するように誘発される。組成物が放出した電磁放射線の量を検出することによ って、関心検体の存在がめられる。

競合結合法では、ＥＣＬ部分に直接または一つもしくはそれ以上の他の分子を介 して連結された関心検体またはその類似体は相補性材料と共に特殊複合体の生成 に寄与することが可能である物質であることができる。たとえば、全細胞、細胞 上粒子、核酸、多糖、蛋白質、糖蛋白質、リボ蛋白質、リボ多糖、ポリペプチド 、細胞中間代謝物、ホルモン、薬剤、トランキライザー、バルビッル酸塩、アル カロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、および非生物学的重合体であ る。特に興味あるものは抗体−抗原をベースにした方法である。この方法は関心 検体が抗体から検体の放射性類似体を追い出すときに検出される周知の放射線免 疫検定法に似ている。既知の放射線免疫検定法に対する多数の変形は大体におい て、放射性標識化合物の代わりに、本発明によるＥＣＬ部分を使用することによ って、有利に使用できる。

本発明はまた、競合フォーマットに用いられる結合検定に使用することも可能で あり、この場合、ＥＣＬ部分は付加された関心検体に直接または一つもしくはそ れ以上の他の分子を介して連結されている。結合ノ々−トナーは関心検体と又は ＥＣＬ部分に連結されている付加された関心検体と特異に結合することができる 。関心検体および付加された関心検体は抗原が適する。

別法として、結合パートナ−は関心検体の主結合パートナ−である。この検定サ ンプルは付加された関心検体に直接または一つもしくはそれ以上の他の分子を介 して連結されたＥＣＬ部分を含有している。

結合パートナ−はサンプル中の適切な粒子に結合されており、従って、粒子は関 心検体またはＥＣＬ部分に連結されている付加された関心検体と特異に結合する ことができる。ここでも、関心検体および付加された関心検体は代表的には抗原 である。

本発明は免疫フォーマットにも使用できる。ＥＣＬ部分は関心検体の結合パート ナ−に連結されている。検体またはその類似体は表面に結合されており、従って 、表面は結合パートナ−と特異に結合可能である。表面は、粒子、膜、片、管な どの表面であることができる。関心検体は抗原であることができる。

別法として、結合パートナ−は関心検体の主結合パートナ−である。主結合パー トナ−の結合パートナ−はＥＣＬ部分に連結された物質である。検体またはその 類似体は表面に結合されており、従って表面は主結合パートナ−と特異に結合す ることが可能である。ＥＣＬ部分に連結された二次結合パートナ−は主結合パー トナ−を特異に結合させる。関心検体は代表的には抗原である。

本発明はたとえばサンドイッチ検定にも使用できる。

関心検体は抗原であることができる。ＥＣＬ部分に連結された物質は関心検体の 結合パートナ−である。ＥＣＬ部分に連結されていない結合パートナ−は表面に 結合されており、従って、表面は関心検体に結合することができる。

別法として、結合パートナ−は関心検体の主結合パートナ−（ＢＰ−１）であっ てもよい。この主結合パートナ−の二次結合パートナ−はＥＣＬ部分に連結され ている。関心検体は抗原であることができる。二次結合パートナ−によって認識 されない別の主結合パートナ−（ＢＰ−２）が表面に結合されており、従って表 面は関心検体に結合することができる。表面および主結合パートナ−（ＢＰ−１ ）は抗原を特異に結合させることができ、そして、ＥＣＬ部分に連結されている 二次結合パートナ−は主結合パートナ−（ＢＰ−１）を特異に結合させることか できる。また、結合パートナ−は関心検体の主結合パートナ−（ＢＰ−１）であ ることもできる。

ＢＰ−１はＥＣＬ部分に連結されている。ＢＰ−１とは興なり、そして関心検体 を結合させる別の主結合パートナ−（ＢＰ−１’）が使用される。主結合パート ナ−ＢＰ−１’の二次結合パートナ−は表面に結合されており、従って、表面は 検体ＢＰ−１とＢＰ−１’の複合体を結合させることができる。

本発明の方法はハイブリドーマ・スクリーニング検定フォーマットに使用するた めの非分離結合検定に有利に使用される。関心検体は特定抗原に対して向けられ たモノクロン抗体である。

関心検体の結合パートナ−はＥＣＬ部分に連結されている。抗原は表面に結合さ れており、従って、表面は検体と特異に結合することができる。モノクロン抗体 は表面を特異に結合させ、そして、ＥＣＬ部分の一部である結合パートナ−はモ ノクロン抗体を特異に結合させる。

有利には、モノクロン抗体を特異に結合させることができるＥＣＬ部分部分語合 パートナ−は、ポリクロン抗体、モノクロン抗体、蛋白質Ａまたは蛋白質Ｇであ る。

また、その結合パートナ−はアビジンであってもよく、それはビオタミンで改質 された検体に結合することができる。

別法として、結合パートナ−は関心検体の主結合パートナ−である。主結合パー トナ−の結合パートナ−はＥＣＬ部分に連結されている。関心検体は抗原に対し て向けられたモノクロン抗体である。抗原は表面に結合されており、従って、表 面はモノクロン抗体と特異に結合することができる。モノクロン抗体は表面を特 異に結合させ、主結合パートナ−はモノクロン抗体を特異に結合させ、モしてＥ ＣＬ部分部分語次結合パートナ−は主結合パートナ−を特異に結合させる。

次に実施例によって、本発明をさらに説明する。

遺」Ｉ脛 電気化学ルミネセンスの測定は第１図に示されている機器を用いて遂行した。実 験では、光度計、ポテンショスタット、電気化学セル、および流体コントロール 手段を一体化した装置を使用した。セルは通常の三電極機構を利用しており、そ してフロースルーシステムとして配置された。機器操作のシーケンスはＩＢＭ　 ＰＳ／２モデル２５パーソナルコンピューターによって制御した。

データはスクリーン上に表示するか又はアナログ変換によってＸ−Ｙ−Ｙ’記録 計にアウトプットした。作用電極と対極は金製盤であった。基準電極Ａ　ｇ／Ａ 　ｇ　Ｃｆは検出装置の下流に配置した。光度計は赤感性光電子倍増管（ハママ ツ社、ミドルセックス、ニューシャーシー）を使用した。低レベルの光の測定に は、フォトン計数法を使用した。

林且 次の材料を調製したニ トリプロピルアミンも含有し、かつ、０．１５モル濃度の燐酸塩、０．０５モル 濃度のトリプロピルアミン（ｒＴＰＡ」）および０．０５％のトウィーン（Ｔｗ ｅｅｎ）２０という分析結果を有した緩衝液は、１０．２１ｇのＫＨ，ＰＯ，（ 分子量＝１３６．０９）と２０．１１ｇのＮａ＝ＰＯ４−７ＨＩＯ（分子量＝２ ６８．０７）から攪拌しながら水で９９０−に希釈して配合された。攪拌しなが ら９．　５ｒＸｌのＴＰＡを添加した。濃Ｈ，ＰＯ，でｐＨを７．５に調節した 。攪拌しながら０．５−のトウィーン２０を添加した。　トリス（２，２’−ビ ピリジル）ルテニウムクロリド六水和物（ｒＲｕ（ｂｐｙ）ｓＣｊ’ｔ・６Ｈ， ＯＪ）のストック溶液は７．４９■を１０−の緩衝液に希釈することによって調 製された。最終濃度は０．００１モル濃度であった。ストックのｌ／１０希釈を 緩衝液によって行った。

１４１例」− ゛よびσ　クロン　ル 機器および電気化学セルの中に１．０艷のサンプル［緩衝液中の１０−”ＭのＲ ｕ（ｂｐｙ）ｓ　Ｃｆ　ｔ　・６　Ｈ！○］を吸い込んだ。ポンプを停止して、 溶液を静止させた。

ポテンショスタットおよびセルに入力した。速度０．２Ｖ／ｓでの電圧走査を、 Ａｇ／ＡｇＣＡ’基準電極に対して０．０ボルトで開始した。上限電圧は１．６ ボルトであり；下限電圧は−１，０ボルトであり：終了電圧は０．０ボルトであ った。０．０から１．６ボルトまでの走査部分の間で、約１．４ボルトで発光が 検出された。

Ｒｕ（ｂＰｙ）ｓＣｌｘ　・６　Ｈ２Ｏからの電気化学ルミネセンスのピーク強 度は約１０００カウントであった。ＴＰＡの酸化のための刺激電流は約０．１５ ｍａであった。走査後、緩衝液で電気化学セルを完全にフラッシュした。

遺ｍ Ｒｕｂ　ｌ　・　６Ｈ の　１ ＴＰＡを含有する緩衝液は、ｐＨを７．　０に調節し、そして１９．０−のＴＰ Ａ　（０，１０Ｍ）を使用したこと以外は、実施例１と同じようにして配合した 。様々な濃度のＲｕ（ｂｐｙ）　ｓ　Ｃ１＊　・６Ｈ１０は単純希釈によって調 製した。サンプルに対する測定は実施例１に記載されているのと同じ手順を使用 して行った。各濃度のＲｕ（ｂｐＹ）ｓＣｉｔ　−６ＨＩＯについて、電気化学 ルミネセンス強度はかかる各濃度での読みを３回行うことによって測定した。か かる各濃度についての平均結果が第３図と第４図に提示されている。第４図は「 ブランク」、すなわち、ルテニウム含有キレートを使用しないサンプル、を使用 して観察された背景部強度も示している。

ヌ」１例」− ヒ　ルミネセンス に　Ｐ　の　１ ＴＰＡを含有する緩衝液は、様々な量のＴＰＡを添加し、そして１０−’ＭのＲ ｕ（ｂｐｙ）ｚ　ＣＡ’　！　”　６　ＨｔＯを使用したこと以外は、実施例１ と同じようにして、配合した。測定は実施例１に記載されているのと同じ手順を 使用して行った。ＴＰＡの各濃度について、電気化学ルミネセンス強度はＲｕ（ ｂｐｙ）ｓＣＡ’　ｔ　・６　ＨｔＯの濃度を一定に保ちながら、かかる各濃度 での読みを３回行うことによって測定した。かかる各濃度についての平均結果が 第５図に提示されている。読みは背景部カウントについて補整するためにブラン クに対して標準化しであることに留意されたい。

犬蓋五土 ルミネセンス に　Ｈの ＴＰＡを含有する緩衝液はｐＨを変動させ、０．１０モル濃度のＴＰＡを用い、 １０−’ＭのＲｕ（ｂｐｙ）ｓＣｌ　ｘ・６Ｈ！０を使用したこと以外は、実施 例１と同じようにして配合した。測定は実施例１に記載されているのと同じ手順 を使用して行った。電気化学ルミネセンス強度は一定のＲｕ（ｂｐｙ）ｓ　Ｃｌ 　ｘ　・６　ＨｔＯ濃度で異なるｐＨについて、かかる各ｐＨでの読みを３回行 うことによって測定した。異なる各ｐＨについての平均結果が第６図に提示され ている。

ヌ」１伝」− アミンを含有する緩衝液は、ｐＨを７に調節し、導入される具体的アミンを第１ 表に従って変え、そしてアミン濃度が１００ｍＭであったこと以外は、実施例１ と同じようにして配合した。濃度ｌＸｌ０−”ＭのＲｕ（ｂｐｙ）ｓＣｊ’　ｔ 　’　６　ＨｚＯの溶液を調製した。測定は実施例１に記載されているのと同じ ようにして、異なる各アミンについてのサンプルに対して行った。電気化学ルミ ネセンス強度は各アミンについて、３回の読みの結果を平均化することによりめ た。得られたデータはブランクによって得られた背景部カウントに対して標準化 した。第１表には各アミンについて電気化学ルミネセンスの相対強度が表示され ているが、相対強度の値は各アミンで測定された強度をブランクで測定された強 度で割った商である。

１土糞 電気化学ルミネ アミン　１乙１団１１ トリプロピル　アミン　７５．１ トリエタノール　アミン　４０．０ １．４−ピペラジン　ビス （エタン−スルホン酸）　２３．０ １−ピペリジン　エタノ　１７．０ １．４−ジアザビシクロ（２，２，２）オクタン　３．４ ＥＤＴＡ　０．　２ ｐＨ ＴＸＧ、６ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組成物によって放出される電磁放射線を検出するＥＣＬ検定に用いるのに適 する前記組成物であって、（ａ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることに よって酸化されたときには、電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に励起 ＥＣＬ部分が曝されると励起状態から電磁放射線が放出されるそのような励起状 態に変換させられることが可能である金属含有ＥＣＬ部分； （ｂ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されたときに前 記組成物中に強い還元剤を生成するアミンまたはアミン部分；および（ｃ）前記 ＥＣＬ部分および前記アミンまたはアミン部分が電気化学エネルギーに曝される ことによって酸化されることがその中でできるそのような媒体として機能するこ とが可能である電解質を含む前記組成物。 ２．前記ＥＣＬ部分が金属キレートである、請求項１に記載の組成物。 ３．前記強い還元剤が、次の式によって定義されるレドックス電位Ｅａ Ｅａ≦−ｈｃ／λ＋Ｋ＋Ｅｍ （式中、ｈはブランクの定数であり、ｃは光速であり、λはＥＣＬ部分の励起状 態から放出される放射線の波長特性であり、Ｋは絶対温度°Ｋとエントロピー変 化との積であり、そしてＥｍはＥＣＬ部分のレドックス電位である）を有する、 請求項１に記載の組成物。 ４．前記電解質が水性である、請求項１に記載の組成物。 ５．前記電解質が非水性である、請求項１に記載の組成物。 ６．組成物によって放出される電磁放射線を検出するＥＣＬ検定に用いるのに適 する前記組成物であって、（ａ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることに よって酸化されたときには、電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に励起 金属キレートが曝されると励起状態から電磁放射線が放出されるそのような励起 状態に変換させられることが可能である金属キレート； （ｂ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されたときに、 次の式によって定義されるレドックス電位Ｅａ Ｅａ≦−ｈｃ／λ＋Ｋ＋Ｅｍ （式中、ｈはプランクの定数であり、ｃは光速であり、λは金属キレートの励起 状態から放出される放射線の波長特性であり、Ｋは絶対温度°Ｋとエントロピー 変化との積であり、そしてＥｍは金属キレートのレドックス電位である） を有する強い還元剤を生成するアミンまたはアミン部分；および （ｃ）前記キレートおよび前記アミンまたはアミン部分が電気化学エネルギーに 曝されることによって酸化されることがその中でできるそのような媒体として機 能することが可能である電解質 を含む前記組成物。 ７．前記金属キレートの金属が遷移金属または希土類金属である、請求項６に記 載の組成物。 ８．前記金属キレートの金属がルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム 、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、 クロム、またはタングステンである、請求項６に記載の組成物。 ９．脂肪族アミン、芳香族アミン、ジアミン、ポリアミン、かかるアミンの、− ＯＨ、アルキル、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、−ＳＯ２、アリール、− ＳＨ、−Ｃ−Ｈ、−Ｃ−ＯＨ、エステル基、エーテル基、アルケニル、アルキニ ル、−Ｃ−、−Ｎ２＋、シアノ、エポキシド基、および複素環式基からなる群か ら選択された一つまたはそれ以上の置換基によって置換されている置換アミン、 式Ｒ２ＮＨ＋（式中、ＲはＨまたは上記置換基である）のプロトン化された塩、 および複素環式アミンからなる群から選択されたアミンを含むか、または上記の アミンまたは置換アミンのいずれかから誘導されたアミン部分を含む、請求項６ に記載の組成物。 １０．トリプロピルアミンまたはそれから誘導されたアミン部分を含む、請求項 ６に記載の組成物。 １１．組成物が水性である請求項６に記載の組物。 １２．組成物が非水性である、請求項６に記載の組成物。 １３．水中に溶解された塩から構成された電解質を含む、請求項６に記載の組成 物。 １４．燐酸塩緩衝液から構成された電解質を含む、請求項６に記載の組成物。 １５．有機液体から構成さた電解質を含む、請求項６に記載の組成物。 １６．アセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、または、 それらのうちの二つまたはそれ以上の混合物から構成された電解質を含む、請求 項６に記載の組成物。 １７．水およびそれと混和性の有機液体から構成された電解質を含む、請求項６ に記載の組成物。 １８．ルテニウム含有キレートと、トリプロピルアミンと、燐酸塩緩衝液を含む 、請求項６に記載の組成物。 １９．水性であり、そしてｐＨが６〜９である、請求項６に記載の組成物。 ２０．前記アミンまたはアミン部分が金属キレートに対して化学量論的に過剰に 存在する、請求項６に記載の組成物。 ２１．（ｉ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されたと きには、電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に励起ＥＣＬ部分が曝され ると励起状態から電磁放射線が放出されるそのような励起状態に変換させられる ことが可能である金属含有ＥＣＬ部分；（ｉｉ）有効量の電気化学エネルギーに 曝されることによって酸化されたときに強い還元剤を生成するアミンまたはアミ ン部分；および（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ部分および前記アミンまたはアミン部分が 電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されることがその中でできるそ のような媒体として機能することが可能である電解質を含む組成物によって電磁 放射線が放出されるＥＣＬ検定に用いるための前記組成物を提供するのに適する 試薬であって、 前記のＥＣＬ部分（ｉ）、アミンまたはアミン部分（ｉｉ）、および電解質（ｉ ｉｉ）からなる群のうちの二つの成員を含む前記試薬。 ２２．前記金属含有ＥＣＬ部分（ｉ）と前記アミンまたはアミン部分（ｉｉ）を 含む、請求項２１に記載の試薬。 ２３．前記金属含有ＥＣＬ部分（ｉ）と前記電解質（ｉｉｉ）を含む、請求項２ １に記載の試薬。 ２４．前記アミンまたはアミン部分（ｉｉ）と前記電解質（ｉｉｉ）を含む、請 求項２１に記載の試薬。 ２５．次の式によって定義されるレドックス電位ＥａＥａ≦−ｈｃ／λ＋Ｋ＋Ｅ ｍ （式中、ｈはプランクの定数であり、ｃは光速であり、λはＥＣＬ部分の励起状 態から放出される放射線の波長特性であり、Ｋは絶対温度°Ｋとエントロピー変 化との積であり、そしてＥｍはＥＣＬ部分のレドックス電位である）を有する強 い還元剤を生成するアミンまたはアミン部分を含む、請求項２１、２２、２３、 または２４に記載の試薬。 ２６．（ｉ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されたと きには、電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に励起金属キレートが曝さ れると励起状態から電磁放射線が放出されるそのような励起状態に変換させられ ることが可能である金属キレート；（ｉｉ）有効量の電気化学エネルギーに曝さ れることによって酸化されたときに強い還元剤を生成するアミンまたはアミン部 分；および（ｉｉｉ）前記キレートおよび前記アミンまたはアミン部分が電気化 学エネルギーに曝されることによって酸化されることがその中でできるそのよう な媒体として機能することが可能である電解質を含む組成物によって電磁放射線 が放出されるＥＣＬ検定を遂行するための前記組成物を提供するのに適する試薬 であって、 前記の金属キレート（ｉ）、アミンまたはアミン部分（ｉｉ）、および電解質（ ｉｉｉ）からなる群の成員から選択された二つまたはそれ以上の構成成分を含み 、かつ、前記アミンまたはアミン部分が、次の式によって定義されるレドックス 電位Ｅａ Ｅａ≦−ｈｃ／λ＋Ｋ＋Ｅｍ （式中、ｈはプランクの定数であり、ｃは光速であり、λは金属キレートの励起 状態から放出される放射線の波長特注であり、Ｋは絶対温度°Ｋとエントロピー 変化との積であり、そしてＥｍは金属キレートのレドックス電位である）を有す る強い還元剤を生成する、前記試薬。 ２７．（８）前記金属キレート（ｉ）と前記アミンまたはアミン部分（ｉｉ）、 （ｂ）前記金属キレート（ｉ）と前記電解質（ｉｉｉ）、または（ｃ）前記アミ ンまたはアミン部分（ｉｉ）と前記電解質（ｉｉｉ）を含む、請求項２６に記載 の試薬。 ２８．前記アミンが、脂肪族アミン、芳香族アミン、ジアミン、ポリアミン、か かるアミンの、−ＯＨ、アルキル、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、−ＳＯ ２、アリール、−ＳＨ、−Ｃ−Ｈ、−Ｃ−ＯＨ、エステル基、エーテル基、アル ケニル、アルキニル、−Ｃ−、−Ｎ２＋、シアノ、エポキシド基、および複素環 式基からなる群から選択された一つまたはそれ以上の置換基によって置換されて いる置換アミン、式Ｒ３ＮＨ＋（式中、ＲはＨまたは上記置換基である）のプロ トン化された塩、および複素環式アミンからなる群から選択されるか、または、 前記置換または非置換アミンから誘導されたアミン部分を含む、請求項２６に記 載の試薬。 ２９．トリプロピルアミン、または、トリプロピルアミンから誘導されたアミン 部分を含む、請求項２８に記載の試薬。 ３０．水中に溶解された塩から構成された電解質を含む、請求項２６に記載の試 薬。 ３１．水性電解質を含む、請求項２６に記載の試薬。 ３２．ルテニウム含有キレートと、トリプロピルアミンと、燐酸塩緩衝液を含む 、請求項２６に記載の試薬。 ３３．水性燐酸塩緩衝液から構成された水性電解質を含む、請求項２６に記載の 試薬。 ３４．有機液体から構成された電解質を含む、請求項２６に記載の試薬。 ３５．前記有機液体がアセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノ ール、または、それらのうちの二つまたはそれ以上の混合物である、請求項２６ に記載の試薬。 ３６．水およびそれと混和性の有機液体から構成された電解質を含む、請求項２ ６に記載の試薬。 ３７．励起状態にある組成物によって放出される電磁放射線を検出するＥＣＬ検 定を遂行するための、（ｉ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることによっ て酸化されたときには、電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に励起ＥＣ Ｌ部分が曝されると励起状態から電磁放射線が放出されるそのような励起状態に 変換させられることが可能である金属含有ＥＣＬ部分；（ｉｉ）有効量の電気化 学エネルギーに曝されることによって酸化されたときに強い還元剤を生成するア ミンまたはアミン部分；および（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ部分および前記アミンまた はアミン部分が電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されることがそ の中でできるそのような媒体として機能することが可能である電解質を包含する キットであって、 前記のＥＣＬ部分（ｉ）、アミンまたはアミン部分（ｉｉ）、および電解質（ｉ ｉｉ）からなる群のうちの一つまたはそれ以上の成員を含む少なくとも一つの独 立した構成要素からなる、前記キット。 ３８．前記群のうちの任意の二つの成員を含む第一の独立した構成要素と、前記 群の残りの成員を含む第二の独立した構成要素からなる、請求項３７に記載のキ ット。 ３９．前記群のうちの任意の二つの成員を含む第一の独立した構成要素と、前記 群の残りの成員および前記群のその他の成員のどれか一つを含む第二の独立した 構成要素からなる、請求項３７に記載のキット。 ４０．三つの構成要素からなり、その各々が前記群の三つの成員のうちの異なる 一つを含む、請求項３７に記載のキット。 ４１．前記群の三つの成員全てを含む第一の独立した構成要素と、前記群の成員 のうちの任意の一つまたは二つを含む第二の独立した構成要素からなる、請求項 ３７に記載のキット。 ４２．前記第二の独立した構成要素が前記群の三つの成員のうちの一つを含み、 そして前記キットがさらに、前記群のうちの一つまたは二つの成員を含む第三の 独立した構成要素を有する、請求項４１に記載のキット。 ４３．前記第一の独立した構成要素が前記ＥＣＬ部分（ｉ）と前記アミンまたは アミン成分（ｉｉ）を含み、そして前記第二の独立した構成要素が前記電解質（ ｉｉｉ）を含む、請求項３８に記載のキット。 ４４．前記第一の独立した構成要素が前記ＥＣＬ部分（ｉ）と前記電解質（ｉｉ ｉ）を含有し、そして前記第二の独立した構成要素が前記アミンまたはアミン部 分（ｉｉ）を含有する、請求項３８に記載のキット。 ４５．前記第一の独立した構成要素が前記アミンまたはアミン部分（ｉｉ）と前 記電解質（ｉｉｉ）を含み、そして前記第二の独立した構成要素が前記ＥＣＬ部 分（ｉ）含む、請求項３８に記載のキット。 ４６．前記第一の独立した構成要素が前記ＥＣＬ部分（ｉ）と前記電解質（ｉｉ ｉ）を含み、そして前記第二の構成要素が前記アミンまたはアミン部分（ｉｉ） と前記電解質（ｉｉｉ）を含む、請求項４１に記載のキット。 ４７．組成物によって放出される電磁放射線を検出するＥＣＬ検定を遂行するた めの、（ｉ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されたと きには、電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に励起金属キレートを曝さ れると励起状態から磁放射線が放出されるそのような励起状態に変換させられる ことが可能である金属キレート；（ｉｉ）有効量の電気化学エネルギーに曝され ることによって酸化されたときに、次の式によって定義されるレドックス電位Ｅ ａ Ｅａ≦−ｈｃ／λ＋Ｋ＋Ｅｍ （式中、ｈはプランクの定数であり、ｃは光速であり、λは金属キレートの励起 状態から放出される放射線の波長特性であり、Ｋは絶対温度°Ｋとエントロピー 変化との積であり、そしてＥｍは金属キレートのレドックス電位である）を有す る強い還元剤を生成するアミンまたはアミン部分；および（ｉｉｉ）前記キレー トおよび前記アミンまたはアミン部分が電気化学エネルギーに曝されることによ って酸化されることがその中でできるそのような媒体として機能することが可能 である電解質を包含するキットであって、 （ａ）前記金属キレート（ｉ）、前記アミンまたはアミン部分（ｉｉ）、および 前記電解質（ｉｉｉ）からなる群の成員のうちの一つを含む第一の独立した構成 要素と、（ｂ）前記群の残りの二つの成員を含む第二の独立した構成要素らなる 、前記キット。 ４８．前記金属キレートが遷移金属または希土類金属である、請求項４７に記載 のキット。 ４９．前記金属キレートの金属がルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウ ム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅 、クロム、またはタングステンである、請求項４７に記載のキット。 ５０．前記金属キレートの中の金属がルテニウムまたはオスミウムである、請求 項４９に記載のキット。 ５１．金属キレートの金属が遷移金属である、請求項４７に記載のキット。 ５２．脂肪族アミン、芳香族アミン、ジアミン、ポリアミン、かかるアミンの、 −ＯＨ、アルキル、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、−ＳＯ２、アリール、 −ＳＨ、−Ｃ−Ｈ、−Ｃ−ＯＨ、エステル基、エーテル基、アルケニル、アルキ ニル、−Ｃ−、−Ｎ２＋、シアノ、エポキシド基、および複素環式基からなる群 から選択された一つまたはそれ以上の置換基によって置換されている置換アミン 、式Ｒ３ＮＨ＋（式中、ＲはＨまたは上記置換基である）のプロトン化された塩 、および複素環式アミンからなる群から選択されたアミンを含むか、または上記 のアミンまたは置換アミンのいずれかから誘導されたアミン部分を含む、請求項 ４７に記載のキット。 ５３．トリプロピルアミンまたはそれから誘導されたアミン部分を含む、請求項 ４７に記載のキット。 ５４．電解質が水性である請求項４７に記載のキット。 ５５．電解質が非水性である、請求項４７に記載のキット。 ５６．電解質が水中に溶解された塩から構成される、請求項４７に記載のキット 。 ５７．電解質が燐酸塩緩衝液から構成される、請求項４７に記載のキット。 ５８．電解質が有機液体から構成される、請求項４７に記載のキット。 ５９．金属キレートがルテニウム含有キレートでありアミンがトリプロピルアミ ンであり、そして電解質が燐酸塩緩衝液から構成される、請求項４７に記載のキ ット。 ６０．サンプルの中に存在する、全細胞または表面抗原、細胞下粒子、ウィルス 、プライオン、バイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、蛋白質、リ ポ蛋白質、多糖、リポ多糖、糖蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、細胞中間代謝 物、ホルモン、薬剤、非生物学的重合体（好ましくは、可溶性）、合成有機分子 、有機金属分子、トランキライザー、バルビツル酸塩、アルカロイド、ステロイ ド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、粗換え体または誘導蛋白質、ビオチン 、アビジン、ストレプトアビジン、または無機分子からなる群から選択された検 体の検出に適する、請求項４７に記載のキット。 ６１．１０−２〜１０−１８モルの濃度の検体の検出に適している、請求項４７ に記載のキット。 ６２．組成物によって放出される電磁放射線を検出するＥＣＬ検定によって関心 検体を検出または定量するための、（ｉ）有効量の電気化学エネルギーに曝され ることによって酸化されたときには、電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条 件に励起金属キレートが曝されると励起状態から電磁放射線が発生されるそのよ うな励起状態に変換させられることが可能である金属キレート；（ｉｉ）有効量 の電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されたときに強い還元剤を生 成するアミンまたはアミン部分；および（ｉｉｉ）前記キレートおよび前記アミ ンまたはアミン部分が電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されるこ とがその中でできるそのような媒体として機能することが可能である、電解質と ；を包含するキットであって、 前記キットは前記金属キレート（ｉ）、前記アミンまたはアミン部分（ｉｉ）、 および前記電解質（ｉｉｉ）からなる群のうちの一つまたはそれ以上の成員を含 有する少なくとも一つの独立した構成要素を含み、かつ前記キットは（ａ）追加 の関心検体、または関心検体の類似体、（ｂ）関心検体またはその前記類似体の 、結合パートナー、および（ｃ）物質（ａ）または（ｂ）と結合可能な反応性成 分、からなる群から選択された少なくとも一つの物質を含み、前記物質はキット に包含される別の独立した構成要素の中にまたは前記群の成員の一つまたはそれ 以上を含有する前記キットの構成要素の中に含有されている、前記キット。 ６３．サンプルの中に存在する、全細胞または表面抗原、細胞下粒子、ウィルス 、プライオン、バイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、蛋白質、リ ポ蛋白質、多糖、リポ多糖、糖蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、細胞中間代謝 物、ホルモン、薬剤、非生物学的重合体（好ましくは、可溶性）、合成有機分子 、有機金属分子、トランキライザー、バルビツル酸塩、アルカロイド、ステロイ ド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、組換え体または誘導蛋白質、ビオチン 、アビジン、ストレプトアビジン、または無機分子からなる群から選択された検 体の検出に適する、請求項６２に記載のキット。 ６４．前記金属キレートの中の金属がルテニウムまたはオスミウムである、請求 項６２に記載のキット。 ６５．トリプロピルアミンと燐酸塩緩衝液からなる電解質を含む第一の独立した 構成要素と、ルテニウム含有キレートを含む第二の独立した構成要素からなる請 求項６２に記載のキット。 ６６．電解質が水性である請求項６２に記載のキット。 ６７．電磁放射線の放出を生じさせる方法であって、（ａ）（ｉ）有効量の電気 化学エネルギーに曝されることによって酸化されたときには、電磁放射線の放出 を誘発するのに十分な条件に励起ＥＣＬ部分が曝されると励起状態から電磁放射 線が放出されるそのような励起状態に変換させられることが可能である金属含有 ＥＣＬ部分；（ｉｉ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることによって酸化 されたときに強い還元剤を生成するアミンまたはアミン部分；および（ｉｉｉ） 前記ＥＣＬ部分と前記アミンまたはアミン部分が電気化学エネルギーに曝される ことによって酸化されることがその中でできるそのような媒体として機能するこ とが可能である電解質を含む組成物をつくり； （ｂ）組成物を適切な条件下で、組成物が電磁エネルギーを放出するのを誘発さ せるのに有効な量の電気化学エネルギーに曝し；，そして （ｃ）放出された電磁放射線を検出する工程を含む前記方法。 ６８．前記ＥＣＬ部分（ｉ）、前記アミンまたはアミン部分（ｉｉ）、および前 記電解質（ｉｉｉ）からなる群のうちの成る成員を含有する第一キット構成要素 と、前記群の残りの成員を含有する第二キット構成要素とを合わせることによっ て、ＥＣＬ検定を遂行するためのキットから前記組成物をつくることを含む、請 求項６７に記載の方法。 ６９．前記電気化学エネルギーに曝される間、前記組成物が生理的ｐＨにある、 請求項６７に記載の方法。 ７０．前記ｐＨが６〜９である、請求項６７に記載の方法。 ７１．アミンまたはアミン部分がＥＣＬ部分に対して化学量論的に過剰に存在す る、請求項６７に記載の方法。 ７２．ＥＣＬ部分が遷移金属キレートまたは希土類金属キレートである、請求項 ６７に記載の方法。 ７３．ＥＣＬ部分が金属キレートであり、その金属がルテニウム、オスミウム、 レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン 、テクネチウム、銅、クロム、またはタングステンである、請求項６７に記載の 方法。 ７４．前記金属がルテニウムまたはオスミウムである請求項６７に記載の方法。 ７５．前記アミンまたはアミン部分によって生成された強い還元剤が、次の式に よって定義されるレドックス電位Ｅａ Ｅａ≦−ｈｃ／λ＋Ｋ＋Ｅｍ （式中、ｈはプランクの定数であり、ｃは光速であり、λは金属キレートの励起 状態から放出される放射線の波長特性であり、Ｋは絶対温度°Ｋとエントロピー 変化との積であり、そしてＥｍは金属キレートのレドックス電位である）を有す る、請求項６７に記載の方法７６．脂肪族アミン、芳香族アミン、ジアミン、ポ リアミン、かかるアミンの、−ＯＨ、アルキル、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨ ード、−ＳＯ３、アリール、−ＳＨ、−Ｃ−Ｈ、−Ｃ−ＯＨ、エステル基、エー テル基、アルケニル、アルキニル、−Ｃ−、−Ｎ２＋、シアノ、エポキシド基、 および複素環式基からなる群から選択された一つまたはそれ以上の置換基によっ て置換されている置換アミン、式Ｒ３ＮＨ＋（式中、ＲはＨまたは上記置換基で ある）のプロトン化された塩、および複素環式アミンからなる群から選択された アミンを前記組成物の中に組み入れることを含むか、または上記のアミンまたは 置換アミンのいずれかから誘導されたアミン部分を前記組成物の中に組み入れる ことを含む、請求項６７に記載の方法。 ７７．トリプロピルアミンまたはそれから誘導されたアミン部分を前記組成物の 中に組み入れることを含む、請求項７６に記載の方法。 ７８．ＥＣＬ部分がルテニウム含有キレートであり、了ミンがトリプロピルアミ ンであり、そして電解質が燐酸塩緩衝液から構成される、請求項６７に記載の方 法。 ７９．組成物が水性である、請求項６７に記載の方法。 ８０．組成物が非水性である請求項６７に記載の方法。 ８１．電解質が水中に溶解された塩から構成される、請求項６７に記載の方法。 ８２．電解質が燐酸塩緩衝液から構成される、請求項６７に記載の方法。 ８３．電解質が有機液体から構成される、請求項６７に記載の方法。 ８４．電解質がアセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、 または、それらのうちの二つまたはそれ以上の混合物を含有する、請求項６７に 記載の方法。 ８５．電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に曝すと電磁放射線を放出す るような物質を検出または定量するため、 （ａ）（ｉ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されたと きには、電磁放射線の放出を誘発するのに十分な条件に励起ＥＣＬ部分が曝され ると励起状態から電磁放射線が放出されるそのような励起状態に変換させられる ことが可能である金属含有ＥＣＬ部分；（ｉｉ）有効量の電気化学エネルギーに 曝されることによって酸化されたときに強い還元剤を生成する種と；および（ｉ ｉｉ）前記ＥＣＬ部分と前記アミンまたはアミン部分が電気化学エネルギーに曝 されることによって酸化されることがその中でできるそのような媒体として機能 することが可能である電解質を含む組成物がつくられ；（ｂ）組成物を適切な条 件下で、組成物が前記放射線を放出するのを誘発させるのに有効な量の電気化学 エネルギーに曝し；そして （ｃ）放出された電磁放射線を検出する方法において、 組成物の中に、前記種として、有効量の電気化学エネルギーに曝されることによ って酸化されたときに組成物中に前記強い還元剤を生成するアミンまたはアミン 部分を組み入れることを含む、改善された前記方法。 ８６．次のように定義されるレドックス電位ＥａＥａ≦−ｈｃ／λ＋Ｋ＋Ｅｍ （式中、ｈはプランクの定数であり、ｃは光速であり、λはＥＣＬ部分の励起状 態から放出される放射線の波長特性であり、Ｋは絶対温度°Ｋとエントロピー変 化との積であり、そしてＥｍはＥＣＬ部分のレドックス電位である）を有する強 い還元剤を生成するアミンまたはアミン部分を組成物の中に組み入れることを含 む、請求項８５に記載の方法。 ８７．脂肪族アミン、芳香族アミン、ジアミン、ポリアミン、かかるアミンの、 −ＯＨ、アルキル、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、−ＳＯ３、アリール、 −ＳＨ、−Ｃ−Ｈ、−Ｃ−ＯＨ、エステル基、エーテル基、アルケニル、アルキ ニル、−Ｃ−、−Ｎ２＋、シアノ、エポキシド基、および複素環式基からなる群 から選択された一つまたはそれ以上の置換基によって置換されている置換アミン 、式Ｒ３ＮＨ＋（式中、ＲはＨまたは上記置換基である）のプロトン化された塩 、および複素環式アミンからなる群から選択されたアミンを組成物の中に組み入 れることを含むか、または、前記置換または非置換アミンのいずれかから誘導さ れたアミン部分を組成物の中に組み入れることを含む、請求項８５に記載の方法 。 ８８．トリプロピルアミンまたはそれから誘導されたアミン部分を組成物の中に 組み入れることを含む、請求項８５に記載の方法。 ８９．さらに、組成物の中に金属キレートを組み入れることを含み、その金属が ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム 、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロム、およびタングステンか らなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。 ９０．金属がルテニウムまたはオスミウムである、請求項８９に記載の方法。 ９１．組成物が水性である、請求項８５に記載の方法。 ９２．金属キレートがルテニウム含有キレートでありアミンがトリプロピルアミ ンであり、そして電解質が燐酸塩緩衝液から構成される、請求項８５に記載の方 法。 ９３．ＥＣＬ検定によって関心検体を検出または定量する方法であって （１）（ａ）関心検体について試験されるべきサンプル、（ｂ）（ｉ）追加の関 心検体または関心検体の類似体、（ｉｉ）関心検体またはその前記類似体の、結 合パートナー、および （ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）と結合可能な反応性成分 からなる群から選択された少なくとも一物質、（ｃ）有効量の電気化学エネルギ ーに曝されることによって酸化されたときには、電磁放射線の放出を誘発するの に十分な条件に励起キレートが曝されると励起状態から電磁放射線が発生される そのような励起状態に変換させられることが可能である金属キレート、前記金属 キレートは関心検体または（ｂ）（ｉ）、（ｂ）（ｉｉ）、もしくは（ｂ）（ｉ ｉｉ）に規定されている物質との結合相互作用に入ることができる； （ｄ）有効量の電気化学エネルギーに曝されることによって酸化されたときに強 い還元剤を生成するアミンまたはアミン部分、および （ｅ）前記キレートおよび前記アミンまたはアミン部分が電気化学エネルギーに 曝されることによって酸化されることがその中でできるそのような媒体として機 能することが可能である電解質 を含む組成物をつくり、 （２）前記組成物を、組成物が電磁放射線を放出することを誘発させるのに有効 な量の電気化学エネルギーに曝し、そして （３）放出された電磁放射線を測定することを含む前記方法。 ９４．サンプルの中に存在する、全細胞または表面抗原、細胞下粒子、ウィルス 、プライオン、バイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、蛋白質、リ ポ蛋白質、多糖、リポ多糖、糖蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、細胞中間代謝 物、ホルモン、薬剤、非生物学的重合体（好ましくは、可溶性）、合成有機分子 、有機金属分子、トランキライザー、バルビツル酸塩、アルカロイド、ステロイ ド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、組換え体または誘導蛋白質、ビオチン 、アビジン、ストレプトアビジン、または無機分子からなる群から選択された検 体の検出に適する、請求項９３に記載の方法。 ９５．トリプロピルアミンまたはそれから誘導されたアミン部分を含む、請求項 ９３に記載の方法。 ９６．電解質が水性である、請求項９３に記載の方法。 ９７，金属キレートがルテニウム含有キレートでありアミンがトリプロピルアミ ンであり、そして電解質が燐酸塩緩衝液から構成される、請求項９３に記載の方 法。 ９８．サンプルの中に関心検体をＥＣＬ検出または定量するためのシステムであ って、 （ａ）サンプル、 （ｂ）（ｉ）付加された関心検体または関心検体の類似体（ｉｉ）関心検体また はその前記類似体の、結合パートナー、および （ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）と結合可能な反応性成分 からなる群から選択された少なくとも一物質、前記物質の一つは、電磁放射線の 放出を誘発するのに十分な条件にＥＣＬ部分が曝されると励起状態から電磁放射 線が放出されるそのような励起状態に変換させられることが可能である金属含有 ＥＣＬ部分に、直接にまたは一つもしくはそれ以上の他の分子を介して連結され ている；（ｃ）強い還元剤になるように酸化されることが可能なアミンまたはア ミン部分、および電解質；（ｄ）ＥＣＬ部分をして電磁放射線の放出を誘発させ るための手段； （ｅ）サンプルの中の関心検体の存在または量を求めるために放出放射線を測定 する手段 を含む前記システム。