JPH04503151A - ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター１、発明の分 野 本発明は、外来タンパク質をグラム陰性細菌、特に大腸１ｔ（Ｅ、ｃ。 １ｉ）の細胞質から細胞周辺腔、好ましくは細胞外液体中に外向化することに関 する。大腸菌適合性のプロモーターの支配下にＥ　ｒｖｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖ ｏｒａ由来のペクチン酸リアーゼ遺伝子のシグナルペプチド配列を含有する分泌 ベクターを構築することによってこの外向化を可能にするものである。 ２、発明の背景 通常、単細胞宿主中に発現された外来タンパク質は細胞質外に分泌されず、従っ て目的産物の単離には、細胞の破壊、ならびに生成°した細胞残骸および細胞に よって産生される所望ではない天然の細胞質タンパク質の全てからの分離が必要 となる。通常、グラム陰性細菌は、その自己のタンパク質を細胞質の外側の領域 であって細胞の内側および外側の膜の間の細胞周辺腔中に分泌する。ペリプラズ ムからのタンパク質の単離は、細胞質からの単離に比べてかなり簡単である。細 胞壁の破壊は必要とされるが、細胞膜の破断は必要ではなく、従って、細胞質の 残骸による外来タンパク質の汚染が避けられる。細胞外培地に分泌されたタンパ ク質の単離および分離は、勿論、常法によって行われる。 ２．１９組換えＤＮＡ法 組換えＤＮＡ法の出現は、治療処方または工業過程において価値を有する実質的 に純粋なタンパク質を大量に製造するための「工場」として単細胞微生物を利用 する可能性を開いた。簡単に言うと、組換えＤＮＡ法は特定のＤＮＡ配列をＤＮ Ａ媒体またはベクター、通常はファージまたはプラスミドのどちらかに挿入する ことを必要とする。はとんどの場合、ベクター中に挿入されるＤＮＡ配列はベク ターにとって外来のものであり、挿入されるＤＮＡ配列とベクターＤＮＡ配列は 天然においては遺伝情報を交換しないのが普通である生物群から導かれるか、ま たは挿入されるＤＮＡが部分的もしくは全合成によるものであることもある。こ れらＤＮＡベクターの調製方法は今では当分野で周知である。例えば、Ｃｏｈｅ ｎおよびＢ　ｏｙｅｒ［米国特許Ｎ　ｏ、　４．２３７．２２４　；その記載は 本明細書の一部を構成する〕は、制限酵素と連結を使用することによる組換えプ ラスミドの調製について記載している。次いで、得られたプラスミドを適合する 単細胞宿主中に入れ、これにより外来遺伝子を細胞に導入する。外来タンパク質 の発現を達成するためには、組換えプラスミドは宿主細胞中で自律的に複製する ことができるものでなければならず、また、好ましくは形質転換された宿主細胞 の同定を可能にするマーカー機能を有しているであろう。適切な複製、転写およ び翻訳シグナルの全てがプラスミドに正しく配置されているときには、外来遺伝 子は形質転換細胞およびその子孫中で発現されるであろう。 ２．２．タンパク質の分布 細胞によるタンパク質産生の進行はその翻訳によっては終了しない。通常、あら ゆる細胞内に産生されるタンパク質は細胞全体には見い出されず、むしろ、区画 される傾向にある。ある種のタンパク質は分泌され、即ち細胞質から放出され、 他のものは分泌されない。 細胞質外へのある種のタンパク質の分布はシグナル配列の支配下にある。細胞か ら分泌される運命にあるこれら細胞タンパク質は、約１６〜３０アミノ酸残基の 、その大部分が疎水性であるＮ−末端配列を有しているのが普通である。この疎 水性領域がシグナルの機能に必須である。この領域の翻訳によって生成するペプ チドは細胞膜に結合するものと考えられている。タンパク質の残りの翻訳が続く につれて、この非シグナル部分は脂質二重層を通って引き出される。 次いで、酵素シグナルペプチダーゼによってシグナル配列が残りのタンパク質か ら切断される。 シグナル配列およびペプチドの機能の理解は、研究者等を、大腸菌の翻訳および 輸送機序を利用して通常は大腸菌によって産生されないタンパク質（原核性およ び真核性の両外来タンパク質が含まれる）を製造しようとする試みに向かわせた 。しかし、目的タンパク質の成功裏の分泌には、遺伝子が宿主細胞プロモーター によって認識されつるシグナル配列と結合していることが必要とされる。適合す るシグナル配列が存在しないと、外来タンパク質は宿主細胞によって発現されう るが、細胞質を越えて細胞周辺腔または細胞外液体中には分布しないであろう。 宿主細胞において種々の外来タンパク質を発現させ、そして分泌させうるベクタ ーは、明らかに、大量の価値あるタンパク質を製造するために組換え法を用いる 際に極めて大きな利点を与えるであろう。本発明の分泌ベクターはそのような利 点を与えるものであり、驚くべきことに大腸菌には非天然のシグナル配列を有し ている。 ４、

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐｅｌＢ遺伝子を含有するプラスミドｐｓｓ１００４、およびａｒａ Ｂ　Ａ　Ｄプロモーターの支配下にあるｐｅｌＢ遺伝子を含有するｐｓｓ１０３ ８を創製するために用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例６． １．１に挙げる。 第２Ａ図は、ｐｅｌＢシグナルペプチド暗号領域の配列、および対応するアミノ 酸配列を示すものである。第２Ｂ図は、ｐｅｌＢシグナル配列を含有するプラス ミドｐｉ　ＮＧ　１７３、およびｌａｃプロモーターの下流にｐｅｌＢシグナル 配列を含有するプラスミドｐＲＲ１７５の構築に用いた方法の概略を示すもので ある。その詳細は実施例６゜２に挙げる。 第３図は、ａｒａＢ　Ａ　Ｄプロモーターの支配下にあるｐｅｌＢシグナル配列 および植物タウマチン遺伝子を含有するプラスミドｐｒ　ＮＧ　１７７−１の構 築に用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例６．３．２に挙げる 。 第４図は、プレータウマチン　リーダーペプチド配列と共に植物タウマチン遺伝 子を含有するプラスミドｐＩＮＧ１７７−３のＩ築ｉ：用いた方法の概略を示す ものである。その詳細は実施例６．３．３に挙げる。 第５図は、キメラマウスーヒ）Ｌ５抗体軽鎖の発現に用いたプラスミドの構築に 用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例６．４．２に挙げる。 第６図は、キメラマウス−ヒトＬ６構築重鎮の発現に用いたプラスミドの構築に 用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例６．４．２に挙げる。 第７図は、キメラマウス−ヒトＬ６抗体Ｆａｂの発現に用いたプラスミドの構築 に用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例６．４．２に挙げる。 第８図は、ｐＦＫｌｏｏ、ｐＦＫｌｏｌ、ｐＦＫ１０２、ｐＦ　Ｋ　１０３、お よびｐＦＫ１０４中の軽鎖およびＦｄ遺伝子カセｙトの制限地図を示すものであ る。これらのプラスミドは、第６図および第７図に示したプラスミドを用い、本 明細書の記載のようにして構築した。 矢印はｌａｃプロモーターからの転写の方向を示す。Ｅ　、　ｃａｒｏｔｏｖｏ ｒａおよび真核性の非暗号配列は白の部分で示す。ｐｅｌＢリーダー配列は網目 の部分で示し、抗体遺伝子（Ｆｄ）および軽鎖（Ｋ）は黒の部分で示す。 ４、発明の要約 本発明は、細菌宿主細胞の形質転換に用いたときに、発現された外来タンパク質 の外向化を可能にするプラスミド分泌ベクターを提供するものである。このプラ スミドは、グラム陰性細菌のペクチン酸リアーゼのシグナル配列をコードしてい るＤＮＡ配列を含有している。次いで、これらのプラスミドを用いて、実質的に シグナル配列と非宿主タンパク質遺伝子配列からなるフラグメントを含有してい る誘導体プラスミド、およびこのフラグメントが宿主適合性のプロモーター配列 に隣接して配置されているプラスミドを調製した。 このプロモーター配列を含有している後者のプラスミドは、細菌宿主細胞の形質 転換に用いると、宿主細胞が外来タンパク質を翻訳し、そして外向化することを 可能にする。即ち、本発明は、細胞の溶解、および細胞質不純物を除去するため に必要とされる付随の厳格な精製工程を必要とせずに、宿主細胞によって外来タ ンパク質を大量に産生させうる手段を提供するものである。即ち、宿主から発現 された非宿主タンパク質の単離は、それらがこのようにして外向化されうるとき には、著しく容易になるであろう。ペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌ）のシグナル配 列は大腸菌細胞系でよく機能し、本発明の分泌ベクターはこの系で用いられる実 質的に全てのタンパク質の分泌を引き起こしつることが示された。タンパク質の 細胞周辺腔または細胞外環境への分泌は、特定のタンパク質をコードしている既 知の遺伝子配列を、プラスミドベクターのｐｅｌシグナル配列および適当なプロ モーター配列の後のある位置に挿入し、次いで細菌宿主細胞をこの分泌ベクター で形質転換することによって達成される。 本明細書に開示したようにして、細菌宿主細胞の形質転換に用いたときに宿主細 胞の細胞質膜の外側に外来タンパク質を分泌させる組換えプラスミドを調製した 。本発明は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子を大腸菌中にクローンし、そして発現さ せると、大量のペクチン酸リアーゼが細胞周辺腔または細菌が増殖している培養 液中に分泌されるという観察に基づいている。このことは、ペクチン酸リアーゼ シグナル配列が非−Ｅ　ｒｖｉｎｉａ細菌系で認識され、そして翻訳されるとい う結論に導く。プラスミドが外来タンパク質遺伝子と共にｐｅｌ遺伝子のシグナ ル配列を含んで調製されると、宿主適合性のプロモーターの存在下では、ｐｅｌ 遺伝子のシグナル配列がタンｉ＜り質をさせうることが発見された。本発明の分 泌ベクターは、その利用性が単一の菌株に限定されず、多種多様の容易に利用で きる大腸菌株（その全ては、少なくともある種の組換えタンパク質を直接培養培 地に普通に分泌する）において効率的に機能することが示されており、特に有用 である。また、本プラスミドは、原核性および真核性の両方の広範な外来遺伝子 配列を用いて操作しうろことかわかっている。さらに、このようにして製造した タンパク質は、その天然の、および適切な立体配置で分泌されることが確かめら れている。 これらプラスミドの調製およびそれらの細菌形質転換における利用の方法を、以 下でさらに詳しく説明する。 ５．１．ペクチン酸リアーゼ遺伝子の同定および単離ペクチン酸リアーゼは、ポ リガラクツロン酸の加水分解を触媒する酵素の１つであり、多数の植物病原性の 細菌および菌類において見い出されている。ＰＬａ、ＰＬｂおよびＰＬｃと呼ば れる３種のペクチン酸リアーゼが細菌Ｅ　ｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ から同定されており、また、類似の酵素が細菌Ｅ　ｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａ ｎｔｈｅｍｉ［Ｋｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂａならびに菌類Ｒｈｉｚ ｏｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉにおいて知られている。Ｅ　、　ｃａｒ。 ｔｏｖｏｒａ［Ｌｅｉ　ｅｔ　ａｌ、　＋　Ｇｅｎｅ　３５　：　Ｈ−７０，１ ９８５］およびＥ　、　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ　［Ｋｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、 　；上記コの両方から遺伝子が単離されている。本発明においては、Ｅ　、　ｃ ａｒｏｔｏｖｏｒａ由来のｐｅｌＢ遺伝子をペクチン酸リアーゼシグナル配列の 供給源として用いた。プラスミドｐｓｓ１００４［Ｌｅｉ　ｅｔ　ａｌ、　、　 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９　：　４３７９−４３８３．１９８７］は、 Ｅ　、　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのｐｅｌＢ遺伝子を含有している。シグナル配列 近辺の制限部位を、この遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて同定した。また、Ｎ−末 端アミノ酸配列を調べてリーダーペプチドの位置を確認した。ｐｓｓ１００４プ ラスミドをＨａｅｌｌｌおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で処理することによってリー ダー配列を含有するフラグメントを得た。ｐｅｌＢシグナルペプチドの遺伝子配 列および対応するアミノ酸配列を第２Ａ図に示す。別の方法によれば、このペプ チド配列は既知のペプチド合成法によって化学的に合成することもできる。 ５．２１分厳ヱ又又二Ω贋葺 適切なシグナル配列を含有するフラグメントが同定され、そして単離されたなら 、次いで、これをクローニング媒体、好ましくはプラスミド中に挿入する。本ベ クターを、当分野で既知の通常のベクター構築法に従って調製する。本明細書お よび請求の範囲で用いる「分泌」なる用語はタンパク質の細胞周辺腔への輸送を 意味し、そして「排出」なる用語はタンパク質の培養培地への輸送を意味する。 挿入した遺伝子の転写および翻訳を最終的に達成するためには、この遺伝子は選 択した宿主細胞に適合するプロモーターの支配下に置かれていなければならない 。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが付着し、転写を開始するＤＮＡの領域 である。選択されるプロモーターは、宿主細胞生物から単離されたか、またはそ こで機能することができるあらゆるプロモーターであってよい。例えば、大腸菌 は、それ自体、そのバクテリオファージまたはそのプラスミドに関係したｌａｃ またはｒｅｃ　Ａプロモーターなどの移しいプロモーターを有している。また、 λフアージＰｔ、およびＰＲプロモーターなどのファージプロモーターを用いて 、それに隣接してＤＮＡセグメントを有するようにコードされている産物を高レ ベルで産生させることもできる。この産物は天然、合成または組換えのものであ ってよい。 また、遺伝子の効率的な翻訳を達成するためには開始シグナルが必要である。例 えば、大腸菌ｍＲＮＡでは、リポソーム結合部位は翻訳開始コドン（ＡＵＧまた はＧＵＧ）および１６ＳリポソームＲＮＡの３゛−末端の塩基に相補性の別の配 列を含んでいる。いくつかのこれら後者配列（Ｓ　ｈｉｎｅ−Ｄ　ａｌｇａｒｎ ｏまたは５−Ｄ）は、大腸菌および他の適切な宿主細胞型で同定されていた。宿 主細胞系に適合するあらゆる５Ｄ−ＡＴＧ配列を用いることができる。これらに は、フッファージλのＮ遺伝子もしくはｃｒｏ遺伝子、または大腸菌トリプトフ ァンＥ、Ｄ、Ｃ，ＢもしくはＡ遺伝子が含まれるが、これらに限定はされない。 インビトロでのＤＮＡフラグメントのクローニングベクターへの挿入のためには 多数の方法が存在する。ＤＮＡリガーゼは、２本鎖ＤＮＡ鎖中の隣接ヌクレオチ ドの間の１本鎖の傷をふさぐ酵素である。従って、この酵素を用いて、ある種の 制限酵素によって生成し、アニーリングされた付着末端を共有結合によって結合 させることができる。また、これとは別に、ＤＮＡリガーゼを用いて平滑末端フ ラグメントの間のホスホンエステル結合の形成を触媒させることができる。最後 に、酵素末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてフラグメント の末端にホモポリマー性の３’−１本鎖尾部を形成させることもできる。即ち、 ある集団の３°−末端にオリ：ｒ（ｄＡ）配列を、そして第２の集団の３°−末 端にオリゴ（ｄＴ）グロックを付加することによって、２種類の分子をアニーリ ングしてダイマー環状体を形成させることができる。これら方法のどれかを用い て、遺伝子セグメント、プロモーターおよびその他のコントロール要素をベクタ ー中の特定の部位に連結することができる。即ち、タンパク質の遺伝子配列がベ クターのＡＴＧ配列に関して正しいリーディング・フレーム内にあるように、特 定タンパク質の暗号配列を、選択したベクター中に、ベクターのプロモーターお よびコントロール要素ならびにｐｅｌ／グナル配列との特別の関係のもとに連結 する。 通常、使用されるベクターは、形質転換された細胞が同定されうるように、アン ピシリン耐性あるいはテトラサイクリン耐性などのマーカー機能を有している。 ベクターは既知のあらゆる発現ベクターまたはそれらの誘導体であってよい。最 もよく用いられるベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＡｃ１０５、ｐＶＡ５、ｐＡｃ Ｙｃ１７７、ＰＫＨ４７、ｐＡｃＹｃ１８４、ｐＵＢｌｌｏ、ｐＭＢ９、ｐ’Ｂ 　Ｒ３２５、Ｃｏ１Ｅ　Ｌ　ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２１、Ｒ３Ｆ ２１２４、ｐｃＲｌあるいはＲＰ４などのプラスミドベクター、λｇｔｌｌ、λ ｇｔ−ＷＥＳ−λＢ、　Ｃｈａｒｏｎ　２８、Ｃｈａｒｏｎ　４　Ａ、λｇｔ− １−λＢＣ。 λｇｔ−１−λＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１３ａ＋ｐ８、Ｍ１３ｍｐ９などのバクテ リオファージベクター；ＳＶ４０およびアデノウィルスベクター、ならびに酵母 ベクターである。 本発明は、好ましくはクローニングベクターとしてプラスミドを用いる。例えば 、大腸菌での多数の異なるタンパク質のクローニングにおいて、本実施例で採用 した方法は、始めにＰＬｂシグナル配列を独立してクローンすることであった。 これは、完全なペクチン酸すアーゼＢ配列を含有しているプラスミドｐｓｓｌｏ ０４からＨａｅｌｌ［＋　Ｅ　ｃｏＲＩ消化フラグメントを単離することによっ て行った。 次いで、このフラグメントをｐＢ　Ｒ３２２プラスミド（ＳｓｐＩで消化し、５ ｓｔｌリンカ−と連結し、次いでＥｃｏＲＩで消化しておいた）に連結した。こ うして得られたのがｐｅｌＢシグナル配列を含有するプラスミドｐｉ　ＮＧ　ｌ 　７３である。このｐｒ　ＮＧ　１７３プラスミドを、目的タンパク質の配列を 含むプラスミドに後に連結することができるｐｅｌＢシグナル配列のクローニン グ媒体として用いた。このようにして調製したプラスミドは、関係タンパク質の 遺伝子配列に隣接したｐｅｌＢシグナル配列からなるハイブリッド遺伝子を含有 している。次いで、適切なプロモーター配列をこのハイブリッド遺伝子の５°− 末端に挿入して最終の発現ベクターを創製することができる。 また、始めにプロモーター配列とｐｅｌＢシグナル配列を含有するプラスミドを 調製し、次にタンパク質遺伝子配列をプロモーター−シグナル配列の下流に挿入 してもよい。本発明において特に有用であることがわかったプロモーターは、大 腸菌宿主系と組み合わせたときの大腸菌１ａｃプロモーターおよびＳ　ａｌｍｏ ｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのａｒａＢＡＤプロモーターである。しか し、選択した宿主系に適合する他のあらゆる適切なプロモーターも用いることが できる。上記の方法によって調製したのはＬ６キメラＦａｂおよびタウマチンの 遺伝子を含有するプラスミド発現ベクターであるが、あらゆる種類のタンパク質 遺伝子を本ベクターおよび方法に用いることができることは当業者には明らかで あろう。 ５．３．形質転換 適切なプロモーターを有するベクターが得られたなら、このプラスミドを用いて 宿主細菌を形質転換する。例えば、処理した実質的に全ての大腸菌株が形質転換 可能（ただし、形質転換率は異なる）であったので、本発明は単一の菌株での使 用に限定されない。形質転換に用いられる方法の大部分は、細菌細胞の塩化カル シウム処理によってベクターＤＮＡの取込みが実質的に増強されるというＭａｎ ｄｅｌおよびＨｉｇａ［Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３　：　１５９−１６ ２．１９７０］の観察に依存している。 ベクターＤＮＡを塩化カルシウム処理した細菌に短い期間（通常は１２〜２４時 間を越えない）暴露する。次いで、暴露した細胞を形質転換体についてスクリー ニングする。これは、ベクター由来の適切なマーカーの性質を発現している細菌 を選択することによって行われる。例えば、テトラサイクリン含有のマーカーを 有するプラスミドが用いられたときには、細菌をテトラサイクリン含有の培地で 増殖させ、増殖し続ける細菌を推定の形質転換体として回収する。 次イで、これらの細菌を目的のタンパク質の産生についてさらにスクリーニング してもよい。 ５．４．遺伝子産物の単離 本発明は、遺伝子産物を細胞周辺腔または周囲の増殖培地のどちらかから単離す ることを可能にするものである。発現されたタンパク質の位置は、宿主として用 いた特定の菌株に依存するようである。 本発明の最も予想外の特徴の１つは、試験した菌株の全てが少なくとも一部の組 換え産物を培養培地中に排出することができるということである。菌株の間の主 な相違は、細胞周辺腔中に分泌された量に対する、排出された産物、即ち培地中 に輸送された産物の量の比率である。高レベルの排出を示す大腸菌株にはＭＣ１ ０６１、ＪＭ１０３および７０６が含まれる。培養液中に排出されるタンパク質 はそれから既知のタンパク質回収法によって容易に単離することができるが、細 胞周辺腔に局在化しているタンパク質の回収は細胞質膜を破壊することなくタン パク質の放出を達成するために細胞壁の浸透を必要とする。ペリプラズムタンパ ク質を除去する方法の１つは、ＺｉｎｄｅｒおよびＡｒｎｄｔ［ＰＮＡＳ　ＵＳ Ａ　４２　：　５８６−５９０．１９５６コが最初に記載した方法であり、細胞 壁の除去を含むものである。簡単に説明すると、細胞を卵アルブミン（リゾチー ムを含有する）で処理し、細胞壁の大部分が除去されたスフ二ロプラストの細胞 株を生成させる。また、ペリプラズムタンパク質は、細胞壁の除去を必要としな いが、代わりにタンパク質の放出を引き起こす機序によって単離することもでき る。細胞をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有の高張スクロース培地に入 れる。この培地は細胞に水を失わせ、収縮させ、それによって細胞質膜を細胞壁 から取り去る。次いで、この細胞を塩化マグネシウム溶液中に入れ、浸透圧ショ ックを与える。即ち、細胞の外側の浸透圧を減少させ、水を細胞中に急激に取り 込ませ、細胞を膨潤させ、外側の膜を越えてペリプラズムタンパク質が排除され るようにする。上記方法の変法は当業者には明らがであろう。 ６．実施例 本分泌ベクターを用いて大腸菌中で種々の別種タンパク質を分泌させることに成 功した。以下に挙げる実施例は、上記の開示に従う多数の別種プラスミドの製造 方法を詳しく説明するものである。 Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ由来のペクチン酸リアーゼ遺伝子を含有 している。ｐｅｌＢ遺伝子は２つのＤｒａｒ制限部位の間に位置している。この 遺伝子の単離は、プラスミドｐｓＨ２１１１のＤｒａＩによる消化とアガロース ゲルでの１．９キロ塩基フラグメントの同定によって行った。次いで、単離した フラグメントを、ＳｍａＩで消化しておいたプラスミドｐＵＣ８に連結した。得 られたプラスミドはｐｓｓ１００４である（第１図参照）。 次いで、プラスミドｐｓｓ１００４をＮｄｅｌ、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼおよび Ｈｉｎｄｌｌ！で処理し、得られたフラグメントをプラスミドｐｉ　Ｔ２（Ｎｃ ｏｌ、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＨｉｎｄｌ［ｌで消化しておいた）に連結 してプラスミドｐｓ３１０３８を得た（第１図）。 プラスミドｐＩＴ２は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのａｒ ａＢ　Ａ　ＤプロモーターおよびａｒａＣ遺伝子の両方を含有している［Ｊｏｈ ｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｇｅｎｅ　３４　：　１３７−１４５．１９８５］。次いで、このプラスミドを 用いて大腸菌株７０６を形質転換した。従って、プラスミドｐｓｓ１０３８のｐ ｅｔＢ遺伝子の発現は、ａｒａＢ　Ａ　Ｄプロモーターの支配下にあり、増殖培 地中のアラビノースの存在によって作動するものと予想される。 ６．１，２．　ＰＬＢの排出および精製プラスミドｐｓｓ１０３８を担持する大 腸菌細胞７０６　（Ｆ＼ｐｒｏ、ｔｈｒ、　Ｉｅｕ、　ａｒｇＨ，ｈｉｓ、　Ｉ ａｃ、　ｐｈｏＳ　ｔ、　ｒｐｓＬ、　１ｋｙ−２０７）を用いてＰＬｂの産生 および排出の特徴を調べた。この大腸菌細胞をＴＹＥ［１゜５％トリプトン、１ ％酵母エキスおよび０．５％ＮａＣｆ２］中で増殖させ、３７°Ｃでインキュベ ートし、増殖の対数期（０，Ｄ、、、、＝０．６付近）に１％のアラビノースを 増殖培地に加えてａｒａＢ　Ａ　Ｄプロモーターを作動させ、ＰＬｂの産生を開 始させた。４時間のインキュベートの後（０，Ｄ、５４ｏ＝約２．５）、培養ブ ロスを遠心し、この大腸菌細胞の培養培地からＰＬｂを直接精製した。培養液を 濃縮し、Ａ　ｍ１ｃｏｎ（メンブランＹＭ２）で脱塩し、次いで、ＣＭ−５２カ ラム（ｐＨ７゜４）に通し、０．２ＭＮａＣＱで溶離することによってタンパク 質を精製した。これらの簡単な工程によって精製されたＰＬは、ＳＤＳゲル電気 泳動とそれに続くクーマノシー・ブルー染色で判定すると、９５％以上の純度を 有していた。 ６．２１分叉二ヱｌ二咥贋１ ｐｓｓ１００４プラスミドをｐｅｌＢのシグナル配列の供給源として用いた。こ の配列を、ｐｓｓ１００４の制限酵素Ｈａｅ［１１による消化、Ｓ　ｓｔ　Ｉ　 Ｄ　Ｎ　Ａリンカ−との連結、およびそれに続＜ＥｃｏＲＩによる消化によって 単離した。５°−末端非暗号領域およびリーダーペプチドを含有するＥｃｏＲＩ 　−５ｓｔｒ　ＤＮＡフラグメントを、次いで５ｓｐｌおよびＥｃｏＲＩで消化 したｐＢ　Ｒ３２２プラスミドに連結した。このように調製したシグナルペプチ ドを含有しているプラスミドはｐｌ　ＮＧ　１７３である。第２図は、このシグ ナルペプチドのＤＮＡ配列、およびｐＩ　ＮＧ　１７３プラスミドの製造方法を 示すものである。このプラスミドを用いて、以下のように別の誘導体を構築した 。 タウマチンは植物Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄａｎｉｅｌｌｉから初めて 単離されたタンパク質甘味料である。タウマチンは２０７個のアミノ酸を含み、 スクロースより２，０００〜５，０００倍甘い。タウマチンは８つのジスルフィ ド結合を有しており、タウマチンの３次構造がその生物学的機能に必須である。 ６、３．２．ペクチン酸リアーゼＢのシグナル配列および合成の植物タウマチン 遺伝子を担持するプラスミドの構築上記のプラスミドｐＩ　ＮＧ　１７３由来の ＰＬｂシグナルペプチドをコードしているＤＮＡ配列を、大腸菌宿主系でタウマ チンを分泌させるため、プラスミドｐＩＮＧ１７４由来のタウマチン遺伝子の前 にクローンした。得られたプラスミドｐＩＮＧ１７７−１を用いて大腸菌におい てタウマチンを発現させ、分泌させた。これは、ＰＬｂリーダーペプチドの５° −非暗号領域の５０ｂｐに融合させたａｒａ　Ｂ遺伝子の一部およびａｒａＢ　 Ａ　Ｄプロモーターを有している。このプラスミドを調製するため、プラスミド ｐＩ　ＮＧ　ｌ　７３の５ｓｔＩおよびＥｃｏＲＩフラグメントを、タウマチン 遺伝子を含有するプラスミドｐｌ　ＮＧ　１７４にクローンした。ｐｌＮＧ１７ ４をＢａｓ＋ＨＩおよびＰｓｔｒで消化し、ｐｒ　ＮＧ　１７３からのリーダー 配列をその制限部位に連結し、ｐＩＮＧ１７６を得た。後者のプラスミドをＮｄ ｅｌおよびＸｈｏｌで消化し、得られたフラグメント（タウマチン遺伝子に隣接 してペクチン酸リアーゼのリーダー配り１１を含有する）をプラスミドｐｌＮＧ ６１の５ａｌＩ、ＸｈｏＩ部位にクローンした。得られたプラスミドはａｒａＢ 　Ａ　Ｄプロモーターの支配下にＰＬｂリーダー配列をコードしている遺伝子お よびタウマチン遺伝子を含有しており、これをｐＩ　ＮＧ　１７７−１と命名し た。この構築工程の詳細を第３図に示す。 ６．３．３．大腸菌の組換え株からのタウマチンの産生およびそのプラスミドｐ ｌ　ＮＧ　１７７−１を保持している大腸菌株７０６をＴＹＥブロス（１ｆ２） 中で増殖させた。Ｏ，Ｄ、＝０．３５のときに、細胞を１％（ｖ／ｖ）アラピ／ −スで誘導した（約１２時間）。次いで、培養物を収穫し、細胞周辺腔タンパク 質の特徴を５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタン分析およびＲＩＡ検定により適切に折 り畳まれたタウマチンについて調べた。５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン分析 の両方は、大腸菌細胞がタウマチンを合成することができることを示した。また 、ＲＩＡ検定も、大腸菌の細胞周辺腔に分泌されたタウマチンが適切に折り畳ま れていることを示した（第１表）。さらに、プレータウマチンシグナルペプチド を用いて大腸菌中でタウマチンを分泌させた。プレータウマチンシグナルペプチ ド配列およびタウマチンの構造遺伝子を含有するプラスミドｐｒ　ＮＧ　１７７ −３を用いてタウマチンを産生させた。構築工程の詳細は第４図に示す。細胞増 殖および誘導の条件は上述のものと同じである。ＲＩＡ検定の結果は、プレータ ウマチンシグナルペプチドによって導かれる適切に折り畳まれたタウマチンの産 生が、ＰＬｂリーダーペプチドによって導かれる産生よりもその効率が劣ってい ることを示した（第１表）。 プラスミド　ＲＩＡ交差反応性タウマチン（μｇ）／細胞（生重量９）培　地　 可溶性細胞抽出物　全分泌量 １７７−１　５．４　３５．２　４０．６１７７−３　１．８　６．３　８．１ 抗体のＦａｂ分子は１個のジスルフィド架橋によって結合した２つの非同−のタ ンパク重鎖を含有している。この２つの鎖は無傷抗体の軽鎖とＦｄである。この 抗体のＦｄ分子は抗体重鎖のＶ、Ｊ、およびＣＨＩタンパク質を含有している。 Ｌ６キメラ軽鎖およびＦｄ遺伝子の適切なｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンは既に同定さ れていた。本実施例では、ＰＬｂリーダーペプチドをコードしている配列を用い て、Ｌ６キメラ抗体の免疫学的に活性かつ適切に組み立てられたＦａｂを培養増 殖培地に排出させた。 ６．４．２．Ｌ６キメラ抗体の大腸菌発現および排出系の作成プラスミドｐｌ　 ＮＧ　１７３のＳ　ｓｔ　Ｉ　ｓ　Ｅ　ｃｏＲＩフラグメントをｐＵＣ１８にク ローンしてｐＲＲ１７５を得た。このプラスミドは、ｌａｃプロモーターの下流 にｐｅｌＢリーダーおよび隣接の上流非暗号配列を含有している。ｐＲＲ１７５ 構築の概略を第２図に示す。 無傷のし６キメラ軽鎖遺伝子（シグナル配列プロセッシング部位にＡａｔｌｌ制 限部位を、およびこの遺伝子の下流に唯一のＢｇｌ１１部位を含む）を、酵母発 現プラスミドｐＩＮＧ１２９８（第５図）から１２００ｂｐのＤＮＡフラグメン トとして切り出した。このフラグメントをプラスミドｐＲＲ１７５に挿入した。 得られたプラスミドｐＲＲ１７７−８は、親プラスミド中に存在するｌａｃプロ モーターの下流に、ｐｅｌＢリーダーとＬ６軽鎖遺伝子のフレーム内融合を含ん でいた。 このプラスミドの多数の誘導体を構築し、ｐＲＲ１７７−８中のｐｅｌＢ：：軽 鎖遺伝子融合体の５°および３°の両末端から非暗号配列を削除した。上流の非 暗号配列は、ｐｅｌＢ！Ｊ−グー配列開始コドンから一４８ｂｐのＮｄｅｌ制限 部位を用いて削除し、ｐＲＲ１８０−２を得た（第５図）。３゛非暗配列は、酵 母中でのＬ６軽鎖の発現に最適のプラスミドルｌＮ０１４３１由来のフラグメン トをｐＲＲ１８０−２中に置換することによって削除し、ｐＲＲ１９１を得た（ 第５図を参照）。これらの構築を第５図に示す。別のブラスミ）”ｐＲＲ１９０ はｐＲＲ］、９１に類似しているが、軽鎖遺伝子の３°末端に９０ｂｐの非暗号 真核性ＤＮＡを含有している。 シグナル配列プロセッシング部位に５ｓｔｌ制限部位、部位指向性の突然変異誘 発によって導入されアミノ酸２２６のところに終止コドンを創製するＢｃｌＩ部 位、および遺伝子の下流に唯一のＢａｍＨ［制限部位を含有する無傷のし６キメ ラＦｄ遺伝子を、酵母発現プラスミドｐＩＮＧ１４０６から８８０ｂｐのＤＮＡ フラグメントとして切り出した（第６図）。このＤＮＡフラグメントをプラスミ ドｐＲＲ１７５中に挿入し、ｌａｃプロモーターの下流のｐｅｌＢリーダー配列 とＬ６　Ｆｄ遺伝子からなるフレーム内融合体ｐＲＲ１７８−５を得た。 ｐＲＲ１７８−５に含まれる配列の５゛および３°の両末端から非暗号配列を削 除するために多数の誘導体を構築した。３°非暗号配列は、酵母中でのＬ６Ｆｄ の発現を最適にしたプラスミドｐｌ　ＮＧ　１４２８（Ｆｄ遺伝子の終止コドン にすぐ続いてＸｈｏｌリンカ−を含有している）からの制限フラグメントを置換 することによって削除し、プラスミドｐＲＲ１８６を得た（第６図）。リーダー 配列から−４８のところのＮｄｅ１部位の上流のＥ　、　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ のＤＮＡ配列の除去によってプラスミドｐＲＲ１９６を得た。これらプラスミド の構築を第６図に示す。 細菌誘導のＦａｂを産生させるためには、軽鎖およびＦｄの両方が同時に細胞内 に産生されることが必要である。これら遺伝子のそれぞれを用いて別々に構築し たプラスミドを用い、１個のプロモーターから両方の遺伝子が転写されるように 並べられた両遺伝子含有の一連の発現ベクターを構築した。これは、２つの遺伝 子の間の非暗号ＤＮＡを６０ｂｐまて最少化するような方法で行った。それぞれ の遺伝子は、翻訳開始に必要なリポソーム結合部位、および−４８からｐｅｌＢ リーター：、抗体遺伝子連結点までの同じＤＮＡ配列を有している。２つの遺伝 子を一緒に並べるためにはいくつかのクローニング工程が必要であった。ｐＲＲ １８０−２中のｐｅｌＢリーダーに結合した軽鎖遺伝子の一部をｐＲＲ１８６中 のＦｄ遺伝子の下流にクローンしてｐＦＫｌｏｏを得た。軽鎖遺伝子の残りをｐ ＲＲ１７７−８からｐＦＫｌｏｏにサブクローンしてｐＦＫｌｏｌを得た。同様 に、ｐＲＲ１９０およびｐＲＲ１９１からの真核性配列の３°欠失を含むＤＮＡ フラグメントをｐＦＫｌｏｌにクローンしてそれぞれｐＦＫ１０３およびｐＦ　 Ｋ　１０２を得た。ｐＲＲ１９２およびｐＦＫｌｏｌからのＤＮＡフラグメント を連結し、Ｆｄ遺伝子から一４８ｂｐの上流の配列の欠失を含むｐＦＫ１０４を 得た。これらプラスミド中のＦｄおよび軽鎖遺伝子カセットの地図を第８図に示 す。プラス、、　トｐＦＫ１０２は、ベクターｐＵｃ１８中のｌａｃプロモータ ーの支配下に連続してクローンされたＦｄおよび軽鎖遺伝子を含有している。犬 腸閤株、例えばＪ　Ｍ　］　０３　Ｆ　’　１ａｃｉＱ　［Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９−　：　３０９．１９８１］ においては、ペリプラズムに蓄積する軽鎖の量は、Ｉａｃプロモーター誘導物質 イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって影響されな い。さらに、細菌の増殖は比較的遅＜（ｐＵｃ１８を含む細胞に比べて）、細菌 コロニーは小さく、乾燥した、そして雑な、形態の変化を示す。このことは、構 成的な外来遺伝子の発現が細胞増殖にとって有害であることを示唆している。こ の遺伝子カセットをもっと緊密に調節されるプロモーターのもとに配置するため に２つの方法を用いた。 第１には、ｐＦＫ１０４からのＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＴ　７ラグメントをｐＩ Ｔ２０６に連結して、Ｆｄおよび軽鎖遺伝子カセットを、その特徴がよく調へら れている大腸菌における強力なプロモーターであるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙ ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ａｒａＢプロモーターの直接支配のもとに置いた。ｐｌＴ ２０６の制限地図およびｐ１７１０４の構築を第７図に示す。細菌遺伝子の発現 のためにａｒａ　Ｂプロモーターおよびその調節タンパク質Ａｒａｃを用いるこ とは、米国特許出願Ｎ　ｏ、　６９５．３０９（１９８５年１月２８日出願）、 およびＮ　ｏ、　７９７．４７２（１９８５年１１月１３日出願）に記載されて いる。得られたプラスミドｐｌＴ１０４は、培養増殖培地へのアラビノースの添 加によって軽鎖の合成について調節されている。アラピ／−スの添加によって少 なくとも１０倍の誘導が為される。増殖培地に分泌されるＦａｂは１０倍以上に 増加するが、細胞の増殖はアラビノースによる誘導の後に停止する。このことは 、Ｆａｂ遺伝子の高レベルの発現が細胞増殖にとって有害であることを示すもの である。ｐｌＴ１０４を保持している細菌コロニーは、アラビノースの非存在下 で増殖させたとき、表現型によってはｐＩＴ２０６を保持している大腸菌と区別 することができない。 第２には、ＩａｃプロモーターのリプレッサーであるＩａｃｉ遺伝子を含有して いるＤＮＡフラグメントを高コピー発現ベクターｐＦＫＩ０２にクローンした。 高コピー数ベクターからの１ａｃｉの発現は、高コピー数ベクター上でのＩａｃ プロモーターの発現を調節するのに有用である［Ｒｕ５ｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｐｌａｓｍｉｄ、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ（１９８７）　；　Ｈｓｕｉｎｇ　ｅｔ 　ａｌ、。 ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを切り出し、Ｔ４ポリメラーゼで充填して平滑末 端にし、ＰＳｔＩリンカ−と連結し、そしてｐＦＫ１０２の唯一のＰｓｔ１部位 にクローンしてｐＦ　Ｋ　１０２１ａｃｉを得た。ｐＦＫ１０２１ａｃｉの地図 を第７図に示す。正しいクローンを同定するために用いた選択方法は、得られた プラスミドｐＦ　Ｋ　１０２１ａｃｉがａ能的に抑制されたｌａｃプロモーター を含有していることを確実にした。 ＭａｃＣｏｎｋｅｙ−ラクトースプレート上で白色または淡いピンクである全て のコロニーは１ａｃｉ挿入体を有するプラスミドを含んでおり、一方、ｐＦＫ１ ０２だけを含有している形質転換体は赤色であり、高コピー数１ｍｃｉ遺伝子に よるｌａｃプロモーターの機能的な抑制を示した。第３表は、ｐＦ　Ｋ　１０２ １ａｃｉを含有する細胞からの細菌性Ｆａｂの発現がｐＦＫ１０２からの発現に 類似していることを示すものである。異ｉなコロニーを形成し、ブロス培養でゆ っくりと増殖するｐＦＫ１０２含有の細胞とは異なり、ｐＦＫ１０２１ａｃｉ含 有の細胞はｐＵｃ１８含有の細胞に似ている。 ６．４．３．細菌産生のＦＡＢの発現および精製通常の大腸菌形質転換法によっ て、プラスミドＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０３またはＭＣ１０６１のいずれかに導入 した。細菌培養物を、適当な抗生物質（ペニシリン２５０μ９／　１１２または テトラサイクリン１５μ？／１１２）を追加したＴＹＥ［トリプトン１．５％、 酵母エキス１゜０％、およびＮａＣＱ　Ｏ，５％］中で増殖させた。５Ｒ（ｌ〜 １１２の容量中、３７℃で光学密度０Ｄ６００＝０．８（約４ｘｌＯ＠細胞／ｌ ρ）になるまで細菌培養物を増殖させ、その一部をＩＰＴＧ（０，２ｍＭ）、ラ クトース（１，０％）またはアラビノース（１，０％）で誘導した。培養物をさ らに４〜２１時間増殖させた。それぞれの培養物の一部を軽鎖産生について分析 した。文献記載［Ｙａｎａｇｉｄａ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８６．　Ｊ、　Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６６　：　９３７］のように浸透圧ショックによって大 腸菌細胞の細胞周辺腔からタンパク質を放出させた。これとは別に、培養上清を 抗体鎖の存在について直接検定した。 Ｌ６軽鎖の定量は、ヤギ抗−ヒトに軽鎖抗体（にｌ）を用いるＥＬＩＳＡによっ た。Ｆｄは、マウスモノクローナル抗−ヒトＦｄ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ） ヲ用イるＥＬＩＳＡによって検出することができた。第２表は、大腸菌培養上清 中の軽鎖反応性物質の発現についての代表的データを示すものである。これは大 腸菌中で発現される真核性タンパク質の特有の性質であるかもしれないが、ある 種の条件下では、細菌性タンパク質が大腸菌から放出されることが知られている ［＾ｂｒａｈｍｓｅｎ　ｅｔ　ａｔ、　、　１１８６．　ＮＡＲ１４：　７４ｇ ？−７５００　；　Ｐａｇｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８６．　ＪA　Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ、　１６ト１３８８３゜第３表は、ペリプラズム中に分泌された 軽鎖の量を培養上清中の量と比較するものである。軽鎖反応性物質は、クローン した軽鎖単独または軽鎖とＦｄを保持するプラスミド含有培養物中に存在する。 Ｆａｂの最良の産生体（ｐＦＫ１０２およびｐＦＫ　１０２１ａｃｉ）は、通常 、培養培地中に３００−１０００ｎｙ／ｚ（ｌのＥＬＩＳＡ反応性軽鎖を排出す る。 ！ｚ嚢大大腸ペリプラズムからの軽鎖の定量プラスミド　ｎ９／培養物肩ρ ｐＲＲ１７５００ ｐＲＲ１７７−８８，５１１ ｐＲＲ１８０３９９４１２ 大腸菌ＪＭ１０３またはＭＣ１０６１（結果は類似）をそれぞれのプラスミドで 形質転換した。０Ｄ６００＝０．８になるまで新鮮な形質転換体をＴＹＥ中、３ ７°Ｃで培養した。培養物を分割し、誘導物質（ＩＰＴＧ）を０．２＋ｎＭて加 えた（−または＋　ＩＰＴＧ）。細胞を３７°Ｃで４時間増殖させた。ペリプラ ズムタンパク質抽出物を調製し、その一部を、ヤギ抗ヒトに抗体を用いるＥＬＩ ＳＡにより軽鎖について試験した。それぞれの値は少なくとも２回の独立した実 験の平均である。抗体遺伝子の５′および３“の非暗号配列の除去は、ペリプラ ズムにおける軽鎖の蓄積の増加に有効であった。 ｐＲＲ１９００ｎｄ　２００　ｎｄ＊ ｐＲＲ１９０＋　５　１８８　２４１　ｎｄｐＦＫ１０２　１２　ｎｄ　６８　 ｎｄｐＦＫ１０２　＋　５７　８２８　５５　４０ｐＦＫ１０２１ａｃｉ　２５ 　３６０　５０　１００＊ｎｄ・測定せず プラスミド含有の大腸菌株を増殖させ、調製し、そして検定した。 ｐＲＲ１９０、ｐＦＫｌ○２、およびｐＦＫ１０２１ａｃｉについて、細胞を０ ．２ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導した。それぞれの値は少なくとも２回の独立した実験 の平均である。大腸菌培養上清の分析のためには、細菌を遠心によって除き、培 養上清を０．４５μｌのフィルターに通した。数値はｎｉ＋／培養物ｘ（ｌで表 す。 Ｂ、細菌産生の軽鎖およびＦｄの５ＤＳ−ＰＡＧＥ細菌によって生産された抗体 鎖を、還元および非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析 した。溶解した全細菌細胞のタンパク質抽出物、浸透圧ショックによって細胞周 辺腔から放出させたタンパク質、および培養上清中に排出されたタンパク質を分 析した。ウェスタン分析による完全な還元条件下でのケル分離タンパク質のニト ロセルロースへの移動およびヤギ抗−ヒト軽鎖抗体を用いる免疫学的染色は、真 正のし６キメラ軽鎖と同一の分子量のタンパク質が存在することを明らかにした （約２３Ｋｄ）。非還元ポリアクリルアミド電気泳動条件下でのタンパク質試料 の分析は、軽鎖遺伝子単独を有するプラスミド（ｐＲＲ１９１またはｐＲＲ１９ ０）を保持している細胞由来の抽出物が、より大きい分子量形態を予想させる高 い比率の軽鎖反応性物質を含んでいることを示した。この物質の多くは約４６Ｋ ｄで移動し、軽鎖の二量体のようである。軽鎖二量体は軽鎖だけを産生ずるミエ ローマ細胞で観察されていた。また、他の免疫反応性のタンパク質バンドも存在 し、これは軽鎖と大腸菌タンパク質の間の非特異的なジスルフィド結合形成を示 すものであろう。軽鎖およびＦｄ遺伝子の両方を保持している大腸菌細胞からの タンパク質試料（ペリプラズム抽出物または培養上清）は、非還元ゲル条件下で 分離したときに、約４８Ｋｄのところに軽鎖反応性バンドを含んでおり、これは 細菌性の軽鎖二量体よりもわずかに高い分子量のところで移動する。この物質は 細菌産生のＬ６キメラＦａｂである。ｐＦ　Ｋ　１０２１ａｃｉまたはｐＦＫ１ ０２を保持している大腸菌においては、非還元条件下で移動するポリアクリルア ミドゲル上で観察される４８Ｋｄのバンドが、最も主要な免疫反応性の種である 。 さらに、軽鎖だけを含有している抽出物で観察される免疫反応性タンパク質のバ ックグラウンド塗抹は、軽鎖とＦｄの両方を含有している細胞からの抽出物にお いては大きく減少していた。 Ｃ９細菌産生のＦａｂの精製 免疫学的に、および機能的に活性な細菌性Ｆ　ａｂ（以下を参照）を、ｐＦ　Ｋ 　１０２１ａｃｉまたはｐ＋Ｔ１０４を保持している大腸菌の培養上清またはべ りブラズムタンパク質抽出物のどちらかから精製した。 ペリプラズム物質の精製のためには、４時間誘導した細胞（１１２）からペリプ ラズム分画を蒸留水（５０１１２）中に放出させた。この物質を５０００ｘｐで ２０分間遠心し、０．４５μｍのフィルターに通した。 次ニ、コノヘリプラズム抽出物をＹＭＩＯメンプラン（Ａｍｉｃｏｎ）　テ濃縮 して約５ｘＱにした。この物質を出発緩衝液［ＩＱｓＭＫオＨＰＯ，、ｐＨ７， ５］で８倍に希釈し、１　、０　Ｉ（２／分の流速のＳ　−Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓ ｅカラム＜　ｉ　ｘａ＞にかげた。このカラムを出発緩衝液（２５ｘＱ）で洗浄 し、出発緩衝液中のＯ〜２００＋Ｍ　ＮａＣｌ２勾配液（合計容量２００　ｍ＋ ２）で溶離した。免疫反応性の勾配ピークを集め（溶出は約１００−Ｍのところ ）、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０で濃縮した。精製したＦａｂはＰＢＳ＋２゜０％ ＢＳＡ中で保存した。 細菌培養上清（ＩＣ）からの分泌Ｆａｂの精製のためには、誘導物質と共に２１ 時間増殖させた後に細胞を遠心によって除去し、その上清を０．４５μ肩のフィ ルターで濾過した。この培地をＹＭＩＯメンプラン（八ｓ＋１ｃｏｎ）で濃縮し て約１６１１２とし、次いでｌＱｍＭＫ、ＨＦＯ２で希釈して１０５１１２にし た。この物質をＳ　−Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１、６ｘＱ）にかけ、４０ １（ｌの０〜２００ｍＭ　ＮａＣＱ勾配液で溶離した。 Ｓ　−８ｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーから回収したＦａｂは、非還元の Ｃｏｏｍａｓｇｉｅ染色した１０％アクリルアミドゲルのデンシトメトリー追跡 によって測定すると７０％以上の純度であった。ＤＮＡ配列に基づ＜Ｆｄと軽鎖 の分子量は２４．５Ｋｄおよび２３Ｋｄであり、観察されたタンパク質の大きさ によく一致している。２つのバンドの小さい方は、ウェスタン・プロットでヤギ 抗−ヒトに軽鎖抗血清と強く反応した。細胞周辺腔または細菌培養上清から精製 した細菌性Ｆａｂは、ここで試験した全ての分析尺度によって区別することがで きなＳ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって精製した細菌産生の Ｆａｂを、Ｌ６抗原含有の細胞に対する結合について試験した。第４表に示すよ うに、細菌性Ｆａｂはヒト結腸癌セルラインＨ３３４７に特異的に結合した。Ｔ 細胞セルラインＴ５１からの細胞を陰性対照として用いた。標的細胞を、細菌産 生のＬ６キメラＦａｂ、５ｐ２１０細胞中に産生させた無傷のし６キメラ抗体、 あるいはマウスの腹水から精製したマウス上６抗体と、４°Ｃで３０分間インキ ュベートした。これに続いて、Ｆａｂ検出のためにはＦ　ＩＴＣ−ラベルしたヤ ギ抗−ヒト軽鎖抗体と、キメラ抗体検出のためにはＦＩＴＣ−ラベルしたヤギ抗 −ヒト免疫グロブリンと、あるいはマウス抗体検出のためにはＦＩＴＣ−ラベル したヤギ抗−ネズミ免疫グロブリンと共にインキユベートした。細胞表面への抗 体の結合をＣｏｕｌｔｅｒ　Ｅ　Ｐ　Ｉ　Ｃ−Ｃ型細胞ソーターを用いて測定し た。 また、細菌産生のＦａｂは、５ｐ２１０産生のキメラム６抗体と同一かつ特徴的 な、抗原ポジティブな３３４７結腸癌細胞の表面へのＦＩＴＣ−ラベルのマウス 上６抗体の結合の抑制を示す。細菌性のＦａｂおよび５ｐ２１０由来のキメラＬ ６は本質的に同一の結合抑制プロフィールを有しており、このことは、細菌性Ｆ ａｂと５ｐ２１０由来のキメラＬ６の結合活性が同一であることを示唆する。 鼻土ス細菌性Ｆａｂの結合検定 抗　体　結合比ネ Ｈ３３４７細胞　Ｔ５１細胞 標準マウスＬ６　９５　１ Ｓｐ２１０　キメラＬ６　１１６　１ 細菌性Ｌ６Ｆａｂ　５４　１ 標準Ｌ６Ｆａｂ　１６　１ ＊結合比は、ＦＩＴＣ−コンジュゲートした第２の抗体で処理した対照試料より も輝いている試験試料の倍数である。 標準のＬ６Ｆａｂは、マウス上６抗体の酵素消化によって調製した。 Ｑｍｎｒ ヨ　Ｅ　薙　百　■Ｊ藩 ヨ　６　”＝　Ｈ２１コ基 ５　巨　式　１　！嚢　Ｈ Ｅ　ジ　巨　３　■　ぎ属 Ｅ　７　口　茗　■　ぎ包 “　４　グ　自ヨ ＜ｈｈ ト　！４　の 定　＝ｉ：　定　−０ ＣＪ　！４　１４　ａ　２８ ５　鰐　目　箇　１ ・　２１　１１と ゴ　ペ　の υ　ロ　ト Ｑ　ト　ト　１　！号 ｕａ ご　乏　ｒ、’ｉ　！Ｅ ＠４　ロ　− ＦＩＧ、　３ 国際調査報告 ｂｕ＠ｌＡ＋＋１ｌｌｌＩｌａｌ＾”””””’　ＰＣＴ／ＵＳ８９／Ｇ００７ ７

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的にペクチン酸リアーゼのシグナルペプチドをコードしているＤＮＡ配 列からなるフラグメントを含有していることを特徴とする、細菌宿主の形質転換 に有用な組換えベクター。
2. ２．該ペクチン酸リアーゼのシグナル配列に隣接して非宿主タンパク質をコード しているＤＮＡ配列をさらに含有している請求項１記載のベクター。
3. ３．宿主中で該タンパク質を発現するように、該シグナルおよびタンパク質配列 と関係させて設置したＤＮＡプロモーター配列をさらに含有している請求項２記 載のベクター。
4. ４．宿主がグラム陰性細菌である請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
5. ５．宿主が大腸菌である請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
6. ６．プラスミドである請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
7. ７．プラスミドｐＩＮＧ１７３である請求項１記載のベクター。
8. ８．タンパク質がタウマチンである請求項２または３記載のベクター。
9. ９．タンパク質が抗体またはそのフラグメントである請求項２または３記載のベ クター。
10. １０．ペクチン酸リアーゼがＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクチン 酸リアーゼＢである請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
11. １１．プロモーターがａｒａＢＡＤまたは１ａｃプロモーターである請求項５記 載のベクター。
12. １２．プラスミドｐＩＮＧ１７７−１またはその誘導体である請求項８記載のベ クター。
13. １３．プラスミドｐＲＲ１７７−８またはその誘導体である請求項９記載のベク ター。
14. １４．プラスミドｐＲＲ１７８−５またはその誘導体である請求項９記載のベク ター。
15. １５．請求項１記載のベクターを含有する細菌宿主。
16. １６．請求項２記載のベクターを含有する細菌宿主。
17. １７．請求項３記載のベクターを含有する細菌宿主。
18. １８．グラム陰性細菌である請求項１５〜１７のいずれかに記載の宿主。
19. １９．大腸菌である請求項１５〜１７のいずれかに記載の宿主。
20. ２０．ベクターがプラスミドである請求項１５〜１７のいずれかに記載の宿主。
21. ２１．タンパク質がタウマチンである請求項１６または１７記載の宿主。
22. ２２．タンパク質が抗体またはそのフラグメントである請求項１６または１７記 載の宿主。
23. ２３．ペクチン酸リアーゼがＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクチン 酸リアーゼＢである請求項１５〜２０のいずれか記載の宿主。
24. ２４．プロモーターがａｒａＢＡＤまたはＩａｃプロモーターである請求項２３ 記載の宿主。
25. ２５．プラスミドｐＩＮＧ１７３またはその誘導体である請求項１８記載の宿主 。
26. ２６．プラスミドｐＩＮＧ１７３またはその誘導体である請求項１９記載の宿主 。
27. ２７．受託番号ＮＲＲＬで同定される請求項２６記載の宿主。
28. ２８．プラスミドｐＩＮＧ１７３−１またはその誘導体を含有する請求項２１記 載の宿主。
29. ２９．プラスミドｐＩＮＧ１７７−８またはその誘導体を含有する請求項２２記 載の宿主。
30. ３０．プラスミドｐＲＲ１７８−５またはその誘導体を含有する請求項２２記載 の宿主。
31. ３１．菌株７０６、ＭＣ１０６１またはＪＭ１０３である請求項１９記載の宿主 。
32. ３２．タンパク質をコードしているＤＮＡ配列およびプロモーターＤＮＡ配列を 含有する組換えベクターで宿主を形質転換することからなる細菌宿主においてタ ンパク質を製造するための方法であって、該タンパク質配列と該プロモーター配 列の間にペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含有している組換えベクターを用 いることを特徴とする方法。
33. ３３．宿主がグラム陰性細菌である請求項３２記載の方法。
34. ３４．宿主が大腸菌である請求項３２記載の方法。
35. ３５．ベクターがプラスミドである請求項３２記載の方法。
36. ３６．タンパク質がタウマチンである請求項３２〜３５のいずれかに記載の方法 。
37. ３７．タンパク質が抗体またはそのフラグメントである請求項３２〜３５のいず れかに記載の方法。
38. ３８．ペクチン酸リアーゼがＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクチン 酸リアーゼＢである請求項３２〜３５のいずれかに記載の方法。
39. ３９．プロモーターがａｒａＢＡＤまたはＩａｃプロモーターである請求項３２ 〜３５のいずれかに記載の方法。
40. ４０．プラスミドがｐＩＮＧ１７７−１またはその誘導体である請求項３６記載 の方法。
41. ４１．プラスミドがｐＩＮＧ１７７−８またはその誘導体である請求項３７記載 の方法。
42. ４２．プラスミドがｐＲＲ１７８−５またはその誘導体である請求項３７記載の 方法。
43. ４３．宿主の細胞質からタンパク質を排出させるための方法であって、非宿主タ ンパク質ＤＮＡ配列に隣接してペクチン酸リアーゼのシグナルＤＮＡ配列、なら びに宿主中で該タンパク質を発現させるように該シグナルおよびタンパク質配列 に関係させて設置したプロモーターＤＮＡ配列を含有するプラスミドを含む宿主 を適切な培養培地で培養することを特徴とする方法。
44. ４４．宿主がグラム陰性細菌である請求項４３記載の方法。
45. ４５．宿主が大腸菌である請求項４３記載の方法。
46. ４６．ベクターがプラスミドである請求項４３記載の方法。
47. ４７．タンパク質がタウマチンである請求項４３〜４６のいずれかに記載の方法 。
48. ４８．ペクチン酸リアーゼがＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクチン 酸リアーゼＢである請求項４３〜４６のいずれかに記載の方法。
49. ４９．プロモーターがａｒａＢＡＤまたはＩａｃプロモーターである請求項４３ 〜４６のいずれかに記載の方法。
50. ５０．大腸菌が菌株ＭＣ１０６１、ＪＭ１０３または７０６である請求項４４記 載の方法。
51. ５１．プラスミドがｐＩＮＧ１７７−１またはその誘導体である請求項４５記載 の方法。
52. ５２．プラスミドがｐＩＮＧ１７７−８またはその誘導体である請求項４７記載 の方法。
53. ５３．プラスミドがｐＲＲ１７８−５またはその誘導体である請求項４７記載の 方法。
54. ５４．ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド、またはその突然変異体もしくは 組換え体をコードしている精製遺伝子配列。
55. ５５．ペクチン酸リアーゼがＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクチン 酸リアーゼＢである請求項５４記載の配列。
56. ５６．第２Ａ図に示される請求項５４記載の配列。