JPH04503306A - 単純ヘルペスウイルス１型発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 単純ヘルペスウィルス１を発現ベクター泣旦ユ元！： 本発明は、真核細胞中で遺伝子産物を発現し得る欠損単純ヘルペスウィルスｌ型 ベクターに関するものである。本発明は更に、神経細胞のような分裂終了細胞お よび神経系のその他の細胞中への遺伝子配列の導入および発現におけるこのベク ターの用途に関するものである。本発明は連邦準備銀行準備金で行われ、政府当 局はこの発明に幾分かの権利を有している。

泣肌ユ！１ 哺乳動物細胞へ特定の外来まＩ；は固有の遺伝子配列を導入し、その遺伝子の発 現を制御し得るということは、医薬および生物学的研究の分野で非常に価値のあ ることである。これが可能であるということは、遺伝子調節の研究、病気の分子 レベルでの原因の解明、および病気治療のための治療基準のデザインのための手 段が得られることになる。

遺伝子転移法は、概して２つの目的のために使用することができる。第１に、例 えば、遺伝子発現レベルを調節する調節エレメントを明らかにすること、交互に 起るＲＮＡスプライシング、ペプチドの翻訳後プロセッシング、蛋白質のその適 当な細胞内位置へのＷｔＱ分け、および蛋白質の生物学的活性を研究することに よって、その修飾および種々の細胞への導入後の、クローンされた遺伝子の調節 および機能を評価するために、この方法を使用することができる。

第２に、培養およびイン・ビボにおいて神経系の細胞の様な細胞を修飾するため に、遺伝子転移法を使用することができる。この様な研究には、例えば細胞系統 の分析、表現型特性の変更、および特定の細胞群の除去、並びに遺伝病状態の作 成および治療が包含される。

従って、細胞の成長、機能および生存の分子的局面を理解する場合の道具として 、遺伝子転移法を使用することができる。

哺乳動物宿主細胞への特定の外来または固有の遺伝子の導入は、先ず適当な核酸 ベクターに遺伝子配列を導入することによって促進される。この様な組換ベクタ ーを所望の宿主細胞へ導入し得る種々の方法が開発されている。

例えば、この様な組換ベクターは、ＤＮＡが介在する形質転換によって宿主細胞 へ導入することができる（Ｃｈｏｏ、に、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ４８： ２７７−２８６（１９８６）ｉ　Ｐｅｒｅｚ、Ｃ，Ｆ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｒａ ｄｉａｔ、Ｒｅｓ、１０４：２００−２１３（１９８５）；　Ｈｏｒｓｔ、Ｊ、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｏｐｐｅｙ−Ｓｅｙｌａｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、３６３：４４５−４４８（１９８２）；　Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ、Ｒ， Ｒ，ａｔ　ａｌ、、　Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、４１：Ａｂｓｔｒａｃｔ　６５２５（ １９８２）；　Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ：Ｔｈｅ　Ｗｉ ｓｔａｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ。

Ｖｏｌｕｍｅ　ｌ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ ｌｅｓ　１ｎｔｏ　Ｖｉａｂｌｅ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ、　Ａｌａ ｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、　ｐａｇｅ　 ３−２６（１９８０）；　Ｕｐｃｒｏｆｔ、Ｐ、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、１６２：１−４（１９８７））。ベクターは、プロトプラスト融合（Ｙｏａｋ ｕｍ、Ｇ、Ｈ，、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２：２４−２６．２８−３０（ １９８４））、またはマイクロインジェクション（Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ、Ｄ、Ａ 、　ａｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒｊ、ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、３７：２３４−２３９（ １９８５）；　Ｆｏｌｇｅｒ、に、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１、 Ｂｉｏｌ、２：１３７２−１３８７（１９８２）；　Ｇｏｒｄｏｎ、Ｊ、Ｗ、　 ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＩＪｓＡ　７７：７ ３８０−７３８４（１９８０））によって哺乳動物細胞へ導入することもできる 。残念なことに、これらの方法は、培養または動物に存在する全てまたは大部分 の細胞に組換分子が導入されることを必要とする状況で使用するには比較的不十 分であり、適切でない。

トランスジェニック遺伝学の方法は、動物の全てまたは大部分の細胞に、クロー ンされた遺伝子配列を効率的に導入するために使用された。この様なアプローチ では、組換プラスミドを受精卵の前核に導入し、トランスジェニック動物へ成長 させる。この様な動物は通常、その生殖細胞系を包含するその体の全ての細胞に 、導入された遺伝子を含有するであろう。しかしながら、トランスジェニック遺 伝学は技術的に困難であり、骨の折れる方法である。

ウィルスベクターは、好都合に感受性を有する宿主細胞への組換ベクターの導入 効率を増大するために使用された。哺乳動物細胞における外来遺伝子の導入およ び発現のためのベクターとして使用されたウィルスには、ＳＶ４０ウイルス（Ｃ ｈｕｎｇ、Ｍ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　ＫｏｒｅａｎＪ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　 ２５：１６５−１７２（１９８７）；　Ｉｎｎ１ｓ、Ｊ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ、　３：２２０３−２２１０（１９８３）； 　Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉ。

１、５：１１３６−１１４２（１９８５））、ウシパピローマウィルス（Ｍｅｎ ｅｇｕｚｚｉ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅ＋ｎｂｏｊ、　３：３６５−３７２（ １９８４）；　Ｄｉｍａｉｏ、Ｄ、　ｓｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９：４０３０−４０３４（１９８２）；　Ｌｕ５ ｋｙ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３６：３９１−４０２（１９８４）； 　Ｇｉｒｉ、１．　ｅｔ　ａｌ、　Ｖｉｒｏｌ、　１２７：３８５−３９６（１ ９８３）；　Ｌｕ５ｋｙ。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　３：１１０８−１ １２２（１９８３））等がある。

哺乳動物細胞における外来遺伝子の導入および発現のためのベクターとして使用 されたレトロウィルスには、モロネイ（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス肉腫ウィルス（ Ｐｅｒｋｉｎｓ、Ａ、Ｓ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ 、　３：１１２３−１１３２（１９８３）；　Ｌｅｅ、Ｗ、Ｈ，ａｔ　ａｌ、、 　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４４：４０１−４１２（１９ｇ２）；　Ｃｕｒｒａｎ、Ｔ、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４４：６７４−６８２（１９８２）；　 Ｇａｚｉｔ、Ａ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　６０：１９−２８（１９８６））等がある。ＤＮＡによる形質転 換または形質導入を含む方法とは対照的に、ウィルスベクターを使用すると、広 範な宿主細胞に組換分子を迅速に導入することができる。

しかしながら、分裂終了した神経細胞およびその他の神経細胞に組換分子を導入 する努力は、この様な細胞が上記ウィルスまたはレトロウィルスベクターによっ て感染され得ないために阻止された。

即ち、神経細胞における遺伝子発現の研究および神経疾患を治療するための治療 法を得ることは、神経細胞へ遺伝子を転移する適当な方法がないことによって阻 止されている。従って、この様な細胞への遺伝子導入を媒介し得る効率よいウィ ルスベクターが必要とされている。

発明の要約 本発明は、非有糸分裂細胞に感染し、該細胞内で生存し得る組換Ｈ３Ｖ−１ベク ターに関するものである。このベクターを使用し、神経学的疾患を治療しｊこり 、この様な疾患の動物およびイン・ビトロモデルを作成することができる。詳細 には、本発明は、神経細胞に感染し得る組換Ｈ５Ｖ−１ベクターであって、（１ ）ＨＳＶ−１パツケ一ジング部位を含有している配列；（２）ＨＳＶ−１のＤＮ Ａ複製起点を含有している配列；および（３）ベクターの認識または選択を行う に十分なヘテロローガスなレポーターまたは選択可能なマーカー遺伝子配列を含 有するベクターを提供するものである。

本発明はまた、更に以下の配列： （４）神経細胞において遠位に位置する配列の転写を惹起するに十分なプロモー ター配列； （５）神経細胞において遠位に位置する配列の翻訳を惹起するＣ；十分な配列； （６）神経細胞に発現蛋白を加工させるに十分な配列；（７）細菌中でベクター を増殖させるに十分な配列：（８）挿入遺伝子配列が配列（４）、（５）および （６）に機能的に連結されるようにベクターに挿入されている、挿入遺伝子配列 の１またはそれ以上を含有する上の組換ベクターに関するものである。

本発明は更に、非有糸分裂細胞中で存続し得る上記組換ベクターに関するもので ある。

本発明は更に、ｐＨ５Ｖ１ａｃである上記組換ベクターに関するものである。

本発明は更に、挿入遺伝子配列（８）がリゾソーム貯蔵疾患、レフ・シューナイ ハン症候群、アミロイド多発性神経障害、アルツハイマーアミロイド、およびデ ュシェーヌ筋ジストロフィーからなる群から選択される病気に関連する遺伝子配 列である上記組換ベクターに関するものである。

本発明は更に、非有糸分裂細胞中で遺伝子配列を発現させるための方法であって 、 （ａ）非有糸分裂細胞中で存続し得る組換ベクターのプロモーター配列に該遺伝 子配列を機能的に連結し、（ｂ）ベクターを細胞に導入し、 （ｃ）ベクターに細胞中で遺伝子を発現させることからなる方法に関するもので ある。

本発明はまた、神経学的欠乏状態疾患を治療するための方法であって、 （ａ）神経細胞中で増幅し得る組換ベクターのプロモーター配列に、遺伝子産物 が欠乏状態疾患の欠乏を補足する遺伝子配列を機能的に連結し、 （ｂ）ベクターを細胞に導入し、 （ｃ）ベクターに細胞中で遺伝子を発現させ、該発現によって欠乏を補足する ことからなる方法に関するものである。

本発明は更に、神経学的アンバランスな状態の疾患を治療し得る薬物を確認する ための方法であって、 （ａ）神経細胞中で増幅し得る組換ベクターのプロモーター配列に、発現すると 動物においてアンバランスな状態の疾患を惹起するに十分である遺伝子配列を機 能的に連結し、（ｂ）ベクターを細胞に導入し、 （ｃ）ベクターに細胞中で遺伝子を発現させ、該発現によってアンバランスな状 態の疾患を惹起し、 （ｄ）細胞におけるアンバランスな状態の疾患を治療し得ると予想される薬物を 細胞に投与し、 （ｅ）細胞におけるアンバランスな状態の疾患を治療し得る薬物を確認する ことからなる方法に関するものである。

図面の簡単な説明 第１図は、ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃの構造を示す。明瞭な領域は、ＨＳＶ−１のａセ グメントヌクレオチド１２７〜１１３２．パッケージング部位を含有している（ Ｄａｖｉｓｏｎ、Ａ、Ｊ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　５５ ＝３１５（１９８１））。線形をつけた斜線の領域は、ＨＳＶ−１のＣ領域、ヌ クレオチド４７〜１０６６を表わしている（ＭｃＧｅｏｃｈ、Ｄ、Ｊ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：１７２７（１９８６ ））。ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃは、Ｉ）ＣＨＩＩＯから構築された（Ｈａｌｌ、Ｃ， Ｖ、　ｃｃ　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐ、Ｇａｎａｔ、　２：１０１（ １９８３））。

本発明は、神経細胞、神経膠細胞等のような神経系の細胞へ遺伝子配列を導入す るための手段に関するものである。本明細書では、この様な細胞を集合的に“神 経”細胞として記載する。神経細胞は、例えばＢａｒｒ、Ｍ、Ｌ、、　Ｔｈｅ　 ）ｌｕｍａｎ　Ｎｅｒｖｏｕｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ａｎ　Ａｎａｔｏｍｉｃ　Ｖｉ ｅｗｐｏｉｎｔ、　３ｒｄ、Ｅｄ、、　Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ、　ＮＹ　（ １９７９）によって記載されており、本明細書の一部を構成している。

クローンされた神経細胞遺伝子の機能を研究する！こめには、神経系の細胞へ遺 伝子を輸送する方法が必要とされる。細胞に遺伝子を導入するために使用された ４つのアプローチ（カエルの卵母細胞マイクロインジェクション基（Ｎｏｄａ、 Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０２：８１８（１９８３））、トラン スジェニックマウス（Ｐａｌｍｉｔａｒ、Ｒ，Ｄ、　ａｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２２：８０９（１９８３））、細胞へのＤＮＡの直接トランスフェク シヨン（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２： ４５６（１９７３））、およびレトロウィルスベクター（Ｍａｎｎ　Ｒ，ｅｔ　 ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３３：１５３（１９８３））の内、非有糸分裂細胞に遺伝 子を直接輸送し得るものはない。

出生前の神経系の細胞への組換分子の輸送は形質転換またはマイクロインジェク ションを使用して達成することができるが、出生後のこの様な細胞への輸送は、 細胞が比較的入手し難く、それが多様であり、成熟神経細胞が分裂終了状態であ ることから、複雑である。

従って、この様な方法は、神経細胞へ遺伝子配列を導入するには比較的適当でな い。

神経細胞へ遺伝子配列を導入するための現存の方法は上記の如く欠点を有してい るという観点から、神経細胞へこの様な配列を輸送するために使用し得る好適な ウィルスベクターを開発することは非常に望ましい、この様な遺伝子配列輸送系 の開発は、本発明の一態様である。神経細胞へ遺伝子配列を導入するための方法 は、Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ、Ｘ、Ｏ，ａｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｎｅｕｒ ｏｂｉｏｌ、　ｌ：３３９−３７１（１９８７）によって再考されており、本明 細書の一部を構成する。

本明細書で使用される時、ウィルスベクターなる語句は、（転移させようとする ）遺伝子配列がウィルス配列のサブセットに融合される核酸分子（好ましくはＤ ＮＡ）である。ウィルスの配列および全ゲノムサイズは、ベクターがウィルス粒 子中に包まれ得、それによりウィルス感受性宿主細胞に結びつけて、その遺伝子 配列を導入し得るように選択される。従って、この様なピリオンの感染特性は、 野生型ウィルスゲノムを含有しているそれと同じである。

本明細書で使用される°′遺伝子配列”なる語句は、核酸分子（好ましくはＤＮ Ａ）を意味するものとする。この様な遺伝子配列は、ＤＮＡ％ｃＤＮＡ、合成り ＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせを包含する種々の供給源に由来し得る。こ の様な遺伝子配列は、天然のイントロンを含有するかまたは含有しないゲノムＤ ＮＡを包含する。

更に、この様なゲノムＤＮＡは、プロモーター領域またはポリＡ配列と結合した 状態で得ることができる。本発明の遺伝子配列は、好ましくはｃＤＮＡである。

ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、幾つかの方法のいずれでも入手することができ る。当該技術分野周知の方法によって、適当な細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、 精製することができる。また、ｍＲＮＡを細胞から単離し、逆転写またはその他 の手段によってｃＤＮＡを作成するために使用することができる。

本発明のウィルスベクターを作成するためには、幾つかの因子を考慮するのが好 ましい。第１に、ベクターは野生製ウィルスによって感染され得る（予防的にま たは生産的に）細胞にのみ輸送されるので、神経細胞に感染し得る野生型ウィル スからウィルスベクターを作成することが必要である。また、組織培養またはイ ンパビポで細胞に感染するウィルスベクターの能力を考慮しなければならない。

第２に、長時間、ベクターを維持し、クローンされた遺伝子配列を発現させるこ とが望ましいかもしれないので、使用されるウィルスは、細胞を死滅させること なく長時間細胞中に生存し得るものであるべきである。

第３に、神経細胞の核または細胞質のいずれかで保持されるウィルスからウィル スベクターを作成することができるので、ウィルス遺伝子融合を受容細胞の核内 に保持しようとするのか、または細胞質内に保持しようとするのかを考慮しなけ ればならない。例えばウィルスベクターが細胞の核において２本鎖ＤＮＡ分子と して存在する場合、その転写は細胞のトランスアクティング調節因子に対する適 当な応答を保持するであろう。対照的に、ウィルスベクターが細胞質に保持され る場合、これはその様なトランスアクティング調節因子に遭遇せず、従って調節 を受けないかもしれない。

第４に、ウィルスゲノムのサイズはベクターおよびそれに挿入される遺伝子配列 のサイズの上限を決定するので、所望のサイズの挿入遺伝子配列を含有す°るよ う適合させ得るようにサイズが十分大きいウィルスからウィルスベクターを作成 することが必要である。

神経細胞へ遺伝子配列を輸送し得るウィルスベクター系を選択するにあたり、複 製部位が感染細胞の核にあるＤＮＡウィルスを使用するのが最も望ましいことが 見い出された。更に、ウィルスが潜伏感染し得ること（即ち、細胞を死滅させる ことなく感染細胞中に存続すること）が望ましいことが見い出された。好ましく は、実質量の導入遺伝子配列を含有し得るウィルス誘導体を作成するために、ウ ィルスベクターも実質的なサイズにするべきである。この様なウィルスベクター の特性は、単純ヘルペスウィルス−１（“Ｈ５Ｖ−１つに存在していることがわ かった（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ、Ｘ、Ｏ，ａｔ　ａｌ、、　Ｍ。

１、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、　１：３３９（１９８７）；Ｇｅ１ｌｅｒ、Ａ、１． 　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ：２４１：１６６７−１６６９（１９８８） 、本明細書の一部を構成する）。

単純ヘルペスウィルス−１ Ｈ３Ｖ−１は、細胞の核で複製および転写される２零１１［ＤＮＡウィルスであ る。ピリオンでは、Ｈ５Ｖ−１ベクターはへッドツーテイルリピート（ｈｅａｄ 　ｔｏ　ｔａｉｌ　ｒｅｐｅａｔｓ）で構成されている（Ｓｔｏｗ、Ｎ、Ｄ。

ａｔ　ａｌ、、　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、　Ｙ、 Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｅｄ、　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、ｙ、、　１ ９８２）＋　ｐｐ、１９９−２０４；　５ｐａｅｔｅ、Ｒ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、 　Ｃｅ１ｌ　３０：２８５（１９８２））。ＨＳＶ−１の遺伝子は、細胞性ＲＮ Ａポリメラーゼ■によって転写される。ＨＳＶ−１は約１００個の遺伝子を含有 し、約１５０キロ塩基サイズである。５つの即時型（”ＩＥつ遺伝子は、ウィル スの主要な調節蛋白をコードしている。即時型遺伝子は、ＤＮＡの複製に関与す る初期（“Ｅ″）遺伝子の発現を誘導する。後期（“Ｌ″）遺伝子は、ＤＮＡ複 製後に誘導され、ウィルス粒子の組立てに必要な構造成分および酵素をコードし ている。後期遺伝子が誘導されると、即時型遺伝子の転写が低下される。

ＨＳＶ−１は、溶菌および潜伏の両サイクルを有している。ＨＳＶ−１の溶菌サ イクルの間に、３種類の遺伝子の発現が複雑な連続カスケードで起こる。対照的 に、その潜伏サイクルでは、ＨＳＶ−１遺伝子の発現は多くてもＩＥ遺伝子およ び潜伏に関連する転写に限定されている（Ｗａｇｎｅｒ、Ｅ、に、　ｅｔ　ａｌ 、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：１０５６（１９８７）；　Ｄａａｔｌｙ、Ａ、 Ｍ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４ ：３２０４（１９８７）；　Ｗａｇｎｅｒ、Ｅ、に、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖ ｉｒｏｌ、　６２：１１９４（１９８８）；　Ｇｒｅｅｎ、Ｍ、Ｔ、　ｅｔ　ａ ｌ、。

Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３４：９８７（１９８１）；　Ｐｅｒｓｓｏ ｎ、Ｒ，Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

５４：４１４（１９８５）；　Ｍｏ５ｃａ、　Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、　５６：８６７（１９８５））。ＤＮＡの複製は起こらず、後代ウ ィルスは産生されない（Ｓｔｅｖｅｎｓ、ＩＧ、、　Ｃｕｒｒａｎｔ　Ｔｏｐｉ ｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ　 ７０：３１（１９７５））。

即ち、溶菌および潜伏の両状態で、細胞性遺伝子の調節に非常に類似している広 範な遺伝子調節が起こる。電気生理学的特性は、潜伏感染されｔ；神経細胞では 変化しない（Ｆｕｋｕｄａ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　２ ６２ニア９（１９８３））。

ＨＳＶ−１は広範な宿主範囲を有し、哺乳動物および鳥類にワトリ、ラット、マ ウス、サルおよびヒトを包含する）の多数の細胞種に感染する（Ｓｐｅａｒ、Ｐ 、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｊ、Ｔｏｏ ｚｅ。

Ｅｄ、（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、。

１９８１）、　ｐｐ、６１５−７４６）。ＨＳＶ−１は、神経細胞、繊維芽細胞 およびマクロファージを包含する広範な細胞に溶菌的に感染することができる。

また、ＨＳＶ−１は、動物成体において分裂終了後の神経細胞に感染し、潜伏状 態で無期限に保持され得る（Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｊ、（＋、、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　 Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ　７０：３１（１９７５））。

分裂終了後の神経細胞は、ウィルスの潜伏状態のＨＳＶ−１を有する（Ｓｔｅｖ ｅｎｓ、Ｊ、Ｇ、、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　７０：３ｌ−５０（１９７５））。ＨＳＶ−１が潜伏期に到達したら 、これは神経細胞の寿命の間、保持され得る。上記の様に、潜伏期のＨＳＶ−１ は遺伝子を発現し得；　ＨＳＶ−１によってコードされている遺伝子の発現は、 潜伏感染された神経細胞において免疫化学によって検出された。更に、ＨＳＶ− １は、神経細胞中、巡行まＩ；は逆行の両方向性で輸送される。この特性は、Ｈ ＳＶ−１ベクターがインジェクション部位から幾分離れた対象細胞に到達し得る であろうということを示唆するという意味においてとりわけ有利である。

ＨＳＶ−１によって感染され得る不死化神経細胞株には、マウス神経芽細胞腫セ ルラインＮ５２０ＹおよびＮＩＥ−１１５、およびラット褐色細胞腫セルライン ＰＣ１２がある。ＨＳＶ−１のピリオンは、電子顕微鏡によってイン・ビポで神 経細胞中に検出することができる（Ｃｏｏｋ、Ｍ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ ｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　９：９４６−９５１（１９７４））。

２つのセルラインの証拠は、ＨＳＶ−１が中枢神経系の、全てでないとしても大 部分の種類の神経細胞に感染し得るということを示唆している。第１に、末梢で のＨＳＶ−１の接種後、まず接種の部位に分布している感覚ニューロンおよび運 動ニューロンにおいて、次いで、を髄、脳幹、小脳、および大脳皮質において、 急激なウィルス生産が神経軸を上昇する（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｈ，、Ｉｎ：Ｐ ｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｆ、Ｇ、　ｅｄ−）＋ 　ｐｐ、６９１−６９９．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ（１９７８ ））。

第２に、組織培養において種々の神経細胞標本でＨＳＶ−１潜伏を模倣する試み は、溶菌感染が全ての神経細胞に伝播するのを防ぐために、高温、ＤＮＡ合成イ ンヒビター、およびＨＳＶ−１ピリオンに対する抗血清を必要とした（Ｗｉｇｄ ａｈｌ、Ｂ、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ ｓＡ　８１：６２１７−６２０１（１９８４））。

本発明のＨＳＶ−１ベクタ一 本発明の好ましいベクターは、ＨＳＶ−１から作成される。本発明のＨＳＶ−１ ベクターは、 （１）ベクターが、細胞に吸着し得る粒子に封入されるようにＨｓｖ−１パツケ 一ジング部位（好ましくは、ＨＳＶ−１ウイルスの配列の約１２７−１１３２ヌ クレオチドに位置するＨＳＶ−１ａセグメント、またはその等価物）を含有する 配列（Ｄａａｖｉｓｏｎ、Ａ、Ｊ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ 、　５５：３１５（１９８１））、（２）ＨＳＶ−１（７）ＤＮＡ複製起点（好 マシくハ、ＨＳＶ−１ウイルスの約４７−１０６６ヌクレオチドに位置する、Ｈ ＳＶ−１０ｒｌ＋領域を含有するＨＳＶ−１ｃ領域、またはその等価物）を含有 する配列（ＭｃＧｅｏｃｈ、Ｄ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、’　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：１７２７（１９８６））および （３）宿主細胞においてベクターの認識または選択を行なうに十分なレポーター または選択可能なマーカー遺伝子配列を含有するのが好ましい。本明細書で使用 する時、レポーター遺伝子配列とは、発現された時、存在または活性を容易にモ ニターし得る蛋白を産生せしめる全ての遺伝子配列である。本明細書で使用する 時、レポーターまたは選択可能なマーカー遺伝子配列は、これが野生型Ｈ５Ｖ− １ゲノムに天然に存在しない場合、“ヘテロローガス”であると言われる。好適 なレポーター遺伝子の例には、ガラクトキナーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、 クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベーターラクタマーゼ等の ための遺伝子がある。また、レポーター遺伝子配列は、発現によって神経生理学 に影響する遺伝子産物（第２のメツセンジャー系または神経伝達代謝産物または イオンチャンネルを包含する）が産生されるいずれの遺伝子配列であってもよい 。

選択可能なマーカー遺伝子配列は、その存在によって、それを含有している細胞 を選択的に増殖させることができる蛋白を発現し得る全ての遺伝子配列である。

選択可能なマーカー遺伝子配列の例には、宿主に抗生物質（例えばアンピシリン 、テトラサイクリン、カナマイシン、ストレプトキナーゼ等）耐性を付与したり 、アミノ酸同族体耐性を付与したり、別の炭素供給源または別の許容できない培 養条件下で細菌を増殖させ得る遺伝子配列がある。遺伝子配列はレポーター遺伝 子配列および選択可能なマーカー遺伝子配列の両者であってよい。本発明の最も 好ましいレポーター遺伝子は、Ｅ、ｃｏｌｉのベーターガラクトシダーゼ活性を コードしている１ａｃＺ遺伝子である。最も好ましい選択可能なマーカー配列は 、ｐＢ　Ｒ３２２のべ一ターラクタマーゼ遺伝子である。

最も好ましいレポーターまたは選択可能なマーカー遺伝子配列は、神経細胞にお いてベクターの認識または選択を行うのに十分である。

好ましくは、選択されたレポーター遺伝子配列は、哺乳動物細胞に通常存在して おらず、従ってその存在によってのその様な細胞中のベクターの存在を明確に証 明することができる酵素またはその他の蛋白をコードするであろう。最も好まし いこの様な配列は、）：、ｃｏｌｉ　ＩａｃＺ遺伝子である（Ｓａｎｓｓ、Ｊ、 Ｒ，ａｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　５：３１３３（１９８６）；Ｐｒ１ｃａｊ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４： １５６（１９８７））。

本発明の更に好ましいベクターは、上記の配列（１）、（２）および（３）以外 に、ｌまたはそれ以上の以下の配列を含有する：（４）神経細胞において遠位に 位置する配列（即ち、プロモーター配列の５′末端に結合している配列）の転写 を惹起するに十分な、プロモーター配列のような配列。最も好ましいこの様な配 列は、ＨＳＶ−１１Ｅ　４１５プロモ一ター配列である（ＭｃＧｅｏｃｈ、Ｄ、 Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：１７２７（１９８６））。

（５）、神経細胞において遠位に位置する配列の翻訳を惹起するに十分な、ＡＴ Ｇまｔ：はその他の翻訳開始コドンのような配列。最も好ましいこの様な配列は 、ＨＳＶ−１１Ｅ　４１５プロモ一ター配列に続く配列である。

（６）神経細胞に、発現された蛋白を効率的かつ効果的にプロセッシングさせる に十分な、ポリアデニル化配列、局在配列、シグナル配列または終止配列の様な 配列。最も好ましいポリアデニル化配列はＳＶ４０初期領域ポリアデニル化部位 である（Ｈａｌｌ、Ｃ，Ｖ、　ｅｔ　ａｔ、。

Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐ、Ｇｅｎｅｔ、２：１０１（１９８３））。

（７）　Ｅ、ｃｏｌｉのような細菌中でウィルスベクターを増幅させるに十分な 配列。この様な配列は、複製起点のみを含有するか、まｌ；は細菌中で複製し得 る全プラスミドを包含することができる。例えば、好ましい態様では、細菌はＥ 、ｃｏｌｉであり、配列はＥ　、ｃｏｌｉ　ｏｒｉ配列、または（更に好ましく は）Ｃｏｌ　Ｅ　ｌ、ｐＢＲ３２２等のようなプラスミドのいずれかとすること ができる。最も好ましいこの様な配列は、ｐＢＲ３２２のＣｏ１Ｅ１複製起点を 含有する。全ｐＢ　Ｒ３２２プラスミドを使用することもできる。

本発明の更に好ましいベクターは、ｌまたはそれ以上の上記配列以外に以下の配 列を含有する： （８）神経細胞において導入、転写または発現が所望されるｌまたはそれ以上の 挿入配列。この様な配列は、転写が望ましい場合にはプロモーター配列（４）と 、または翻訳およびプロセッシングが望ましい場合には更に翻訳開始およびプロ セッシング配列（５および６）とこの配列を機能的に連結する！こめにベクター に挿入される。

また、挿入配列はベクター中のいずれの位置に配置されてもよい。

゛機能的連結”なる語句は、機能的に連結されたプロモーター配列に、よって遺 伝子配列の転写が惹起され、機能的に連結された翻訳調節配列によって遺伝子配 列の翻訳が惹起され、機能的に連結されたプロセッシング配列によって遺伝子配 列の翻訳後プロセッシングが惹起されるような、遺伝子配列とプロモーターまた はその他の調節またはプロセッシング配列間の連結を記述することを意図する。

もちろん、挿入遺伝子配列として、既にプロモーター、翻訳開始配列、またはプ ロセッシング配列を有している遺伝子配列を使用することは可能である。この様 な場合、更にこれらの配列を含有しているウィルスベクターを使用することは不 必要であろう。

当業者なら理解できるであろうが、挿入遺伝子配列のヌクレオチド配列は、いず れのヌクレオチド配列であってもよい。

本発明のウィルスベクターは、好ましくは、５〜１５ｋｂサイズであり、１５０ ｂｂ（野生型Ｈ３Ｖ−１のサイズ）までの種々の長さのへッドツーテイルリピー ト（ｈｅａｄ　ｔｏ　ｔａｉｌ　ｒｅｐｅａｔ）としてＨＳＶ−１ウィルス粒子 に封入される。ＨＳＶ−１は、３個のＤＮＡ複製起点（Ｑｒｉ）、または５０ｋ ｂ毎に１個のｏｒｉを含有し、一方、上記のベクターは５ｋｂ−１５ｋｂ毎に１ 個のＤＮＡ複製起点を含有している（Ｓｔｏｗ・Ｎ・Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅ ｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、　ＹｊＣｌｕｚｍａｎ、　 Ｅｄ、　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、　１９８２）＋　ｐｐ。

１９９−２０４；　５ｐａｅｔｅ、Ｒ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３０： ２８５（１９８２））。

本発明のウィルスベクターを含有しているウィルスストックは、繊維芽細胞を、 ベクターＤＮＡとヘルパーＨ３Ｖ−Ｉ　ＤＮＡの混合物でトランスフェクトする ことによつて好都合ｌ２得ることができる（Ｓｔｏｗ、Ｎ、Ｄ、　ａｔ　ａｌ、 、　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、　Ｙ、Ｇｌｕｚｍａ ｎ、　Ｅｄ。

（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、　１９８２）、　ｐｐ、１９９− ２０４；　５ｐａｅｔｅ、Ｒ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３０：２８５（ １９８２））。こ（７１）様すｆ！染では、ベクターが多数の複製起点を有する ことによってこれらにヘルパーウィルス以上の増幅有利性を与えるため、ベクタ ーは保持され、増殖される（Ｆｒｅｎｋａｌ、Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、 Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

３５４：３４７−３７０（１９８０））。また、Ｇｅｌ　Ｉｅｒ、Ａ、　ｌの方 法（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

１６：５６９０（１９８８））によって、ベクターを増幅させることができる。

野生ＷＨＳＶ−１ウィルス（ヘルパーウィルスとして）を使用してＨＳＶ−１ウ イルスベクターを増幅することができるが、神経細胞をｗｔＨＳＶ−１で一様に 感染させると、幾分かの細胞が死滅する。

多くの遺伝子発現の研究にとってこの様な細胞の死滅はとりわけ望ましくないの で、突然変異、最も好ましくは温度感受性突然変異を有するＨＳＶ−１ヘルパー ウイルスを使用してＨＳＶ−１ベクターを増幅するのがとりわけ好ましい。これ によって、神経ｍ＃Ｉ惑染感染７〜３９℃のウィルス生育制限温度で行われる時 、ヘルパーウィルスが溶菌サイクルに入ることを阻止する（それによって、細胞 が損傷されることを阻止する）。

ＨＳＶ−１温度感受性（ｔｓ）変異体によって、大脳内インジェクシヨン（Ｗａ ｔｓｏｎ、に、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　４９：１４９（ １９８０））およびマウス神経芽細胞腫細胞の感染（Ｇｅｒｄａｓ、Ｊ、Ｇ、　 ｅｔ　ａｔ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９４：４３０（１９７９））を行なうこと によって、細胞を死滅させることなくウィルスを存続させることができる。

本発明のＨＳＶ−１ベクターの構造および遺伝子特性は、最も好ましいＨＳＶ− １ベクターであるｐＨ５ＶＩａｃの記載によって最も明確に説明することができ る。この欠損ＨＳＶ−１ウィルスベクターは、８．１ｋｂの２本鎖ＤＮＡを含有 している。このベクターを第１図に示す、　ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃは、以下の遺伝 子配列を含有している＝（１）ＨＳＶ−１ａ領域の約１２７−１１３２ヌクレオ チドを含有しているＨＳＶ−１パツケ一ジング部位、（２）約４７−１０６６ヌ クレオチドに位置するＨＳＶ−１ｃ領域を含有しているＨＳＶ−１のＤＮＡ複製 起点、（３）ｐＢＲ３２２のベーターラクタマーゼ遺伝子配列、および（４）Ｈ ＳＶ−Ｉ　ＩＥ　４１５プロモ一ター配列、（５）ＨＳＶ−Ｉ　ＩＥ　４１５プ ロモ一ター配列の後の介在配列（イントロン）、 （６）ＳＶ４０初期領域ポリアデニル化配列、（７）ｐＢＲ３２２のＣｏ１Ｅｌ 複製起点領域、および（８）　Ｅ、ｃｏｌｉ　１ａｅＺ遺伝子（神経細胞におけ る発現を容易に検出し得る挿入遺伝子配列として）。

ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃは１９８９年１月３１日にアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクシヨンに寄託され、ＡＴＣＣ４０５４４の受託番号を付与された。

ｐＨ５Ｖ１ａｃ　ＤＮＡは、ヘルパーウィルスとして）（ＳＶ−１株１７ｔｓＫ （以後、“ｔｓＫ”と呼ぶ）を使用し、）ＩＳＶ−１ウィルス粒子へ好都合に封 入される（Ｄａｖｉｓｏｎ、Ｍ、Ｊ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏ ｌ、、　６５：８５９（１９８４）；　Ｂｒｏｗｎ、Ｓ、Ｍ、　ａｔ　ａｌ、、 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　７６：２３６４ −２３６８（１９７９）；　Ｗａｔｓｏｎ、に、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、 　４９：１４９−１６０（１９８０）；　Ｄａｒｇａｎ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６４：１３１１（３２６（１９８３）；　Ｍａｔ ｚ、Ｂ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６４：２２６１−２２ ７０（１９８３）；　Ｄａｒｇａｎ、Ｄ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉ ｒｏｌ、　６５：４７７−４９２（１９８４）。ＨＳＶ−１株１７ｔｓＫは、Ｉ Ｅ３遺伝子に突然変異を有している。このウィルスは即時型表現型を有し、３７ −３９℃でＤＮＡの複製を許容し得ない。しかしながら、これは、３１℃で培養 される時、複製することができる。

ｐ）ｌ　５　Ｖ　ｌａｃは、３個のＥｃｏＲＩ部位、即ちｐＢＲ３２２セグメン トの各末端にある部位およびこの遺伝子の３′末端から１３３ｂｐの１ａｃＺ遺 伝子にある３番目の部位を有している。ｐＨ５Ｖ１ａｃの転写ユニットの大部分 は４．３ｋｂフラグメントに存在する。ｐｌ（ＳＶ　ＩａｃのｐＢＲ３２２配列 は、２．３ｋｂフラグメントに存在する。ｌａｃ　Ｚ遺伝子の３′末端、５Ｖ− ４０初期領域ポリアデニル化部位、およびＨＳＶ−１ａ配列は、ｐＨ５Ｖ１ａｃ の１．５ｋｂフラグメントに含有されている。

神経科学および神経化学への遺伝子転移法の適用遺伝子転移法は、神経科学およ び神経化学へ幾つか適用されている。最も直接的な適用はたぶん、神経ペプチド の製造および蛋白の機能的ドメインの解明である。グロセツシングおよび細胞生 育における細胞種特異的相違を研究するために、神経蛋白のためのクローンされ たｃＤＮＡまたはゲノム配列を、培養またはイン・ビポにおいて種々の細胞種に 導入することができる。強いプロモーターの制御下にコード配列を位置させるこ とによって、実質量の蛋白を製造することができ、それによって微量を特性化す る困難を回避することができる。更に、コード配列の別個の残基における突然変 異的変更によって、蛋白グロセッシング、細胞内振り分け、または生物学的活性 に関係がある特定の残基を調べることができる。

遺伝子転移法は、蛋白の発現を制御したり細胞状態を調節するその能力を評価す る方法を提供するためにも適用することができる。

神経蛋白の幾つかの機能、例えば分化におけるその役割は組織培養で研究するこ とができるが、その他は、レセプター密度、細胞数、線維成長、電気的活性度、 およびその他の一連ある特性における変化をモニターするために、成長または老 化における種々の時点で神経系に再導入することを必要とするであろう。

遺伝子転移は、神経特異的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列および細胞性因子 を研究するための手段を提供する。この様な研究へのアプローチの１つは、研究 しようとする調節エレメントを特定のレポーター遺伝子に融合させ、次いでレポ ーター遺伝子の発現について分析することであろう。

神経細胞における遺伝子発現の調節は、安定性の維持にある役割を果しているこ とが見い出されており、外部および内部のシグナルへの応答における情報保存の 媒介にある役割を果していると思われる（Ｂｌａｃｋ、１．Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、 、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２６３−１２６８（１９８７））。成長の間、 遺伝子発現を調和よく調節すると、例えばカテコールアミン代謝およびミニリン 生合成におけるような、分化した表現型を生じるように働く。調節は、クロマチ ンの構造、ＤＮＡのメチル化、およびホスホリル化、ホルモンおよびその他のシ グナルに応答するトランス作用性因子を包含する多数の因子に依存する。これは 、幾組かの遺伝子を一緒にまたは別個に発現させ、調節配列の組み合わせコード を包含し得る複雑な過程である。

神経系における細胞の生育および相互作用の問題も、遺伝子転移によって生じる ことがある。例えば、組織学的マーカーをコードしている遺伝子を胚細胞に導入 し、生育の間に系列の関係を調べたり、神経経路を解明することができる。また 、成長因子、腫瘍蛋白、毒性ペプチド、またはその他の生理学的に重要な蛋白を コードしている遺伝子を神経系の特異な領域に導入し、細胞分裂、生存および分 化に対するその効果を研究することができる。ある種の研究のためには、遺伝子 転移または遺伝子発現は、神経系の特異な細胞に制限されねばならない。

遺伝子転移は、病気の理解および治療法の提供にも、実質上有効な用途を有して いる。欠損遺伝子が知られ、クローンされている多数の遺伝性神経学的疾患があ る。幾つかの場合には、これらのクローンされた遺伝子の機能が知られている。

ヒトでは、（１）β−ヘキソースアミニダーゼ（Ｋｏｒｎｅｒｌｕｋ、Ｒ，Ｇ、 　ａｔ　ａｌ−、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：８４０７４４１３（１９ ８６）；　Ｍｙｅｒｏｗｉｔｚ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２ニア８３０−７８３４（１９８５））およびグル コセレブロシダーゼ（Ｓｏｒｇｅ　ａｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：５４４２−５４４５（ １９８５）；　Ｔｓｕｊｉ、Ｓ、、　ａｔ　ａｌ、。

Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３１６：５７０−５７５（１９８７））に関連す る遺伝子のようなリゾソーム貯蔵異常、（２）ヒボキサンチンホスホリボシルト ランスフェラーゼ活性の欠乏（ｔｈｅ　”Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ”　ｓｙｎｄ ｒｏｍｅ；　５ｔｏｕｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５１ ：５１９−５３０（１９８７））、（３）アミロイド多発性神経障害（ｐｒｅａ ｌｂｕｍｉｎ；　５ａｓａｋｉ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１２５：６３６−６４２（１９８４）） 、（４）アルツハイマーアミロイド（Ｔａｎｚｉ、Ｒ，Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：８８０−８８４（１９８７）；　Ｇｏｌｄｇａｂｅｒ 、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：８７７−８８０（１９８６ ））；（５）デュシェーヌ筋ジストロフィー（特性化されていない筋蛋白；　Ｍ ｏｎａｃｏ、Ａ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２３：６４６−６５ ０（１９８７））および（６）網膜芽細胞腫（網膜およびその他の組織で発現さ れる、特性化されていない蛋白、　Ｌｅｅ、Ｗ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２３５：１３９４−１３９９（１９８７）；　Ｆｒｔｅｎｄ、Ｓ、Ｈ， ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２３：６４３−６４６（１９８６））につい て、欠損酵素のための遺伝子が確認されている。

遺伝子転移法は、“震え（ｓｈｉｖｅｒｅｒ）”突然変ｐｃ（ミニリン塩基性蛋 白、　Ｒｏａｃｈ、Ａ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４２：１４９−１５５（ １９８７）；　Ｍｏ１ｉｎｅａｕｘ、Ｓ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３ニア５４２−７５４６（１９８６）） および“ジムビー（ｊｉｍｐｙ）”突然変異（プロテオリポ蛋白、　Ｎａｖｅ、 に、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８３：９２６４−９２６８（１９８ ６）；　Ｈｕｄｓｏｎ、Ｌ−Ｄ−ｅＬ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：１４５４−１４５８（ １９８７））を研究するためにも使用することができる。

上の病気は、通常酵素である、劣性で遺伝される欠乏状態、および少なくとも時 々構造または調節蛋白に関連する、優性で遺伝されるアンバランスな状態の２種 類に分けられる。

欠乏状態の病気のためには、置換療法として、胃されている組織に正常な遺伝子 を導入したり、アンチセンス突然変異の使用により病気のための動物モデルを作 成するために遺伝子転移を使用することができる。アンバランスな状態の病気の ためには、平衡異常の影響を相殺するために使用し得るモデル系で病気状態を作 成するために遺伝子転移を使用することができる。従って、本発明の方法によっ て、神経学的病気の治療が可能となる。本発明で使用する時、欠乏状態の病気は 、欠乏を生じるかまたはそれをより重篤にする欠乏を一部または全部修復するこ とによって“治療″される。本発明で使用する時、アンバランスな状態の病気は 、病気を生じるかまたはそれをより重篤にする平衡異常を一部または全部修復す ることによって“治療″される。突然変異を起こすかまたは欠損を修正するため にＤＮＡ配列の部位特異的組み込みを使用することも、可能である。

要約すると、ｐＨ３ＶＩａｃのようなＨ３Ｖ−１ウイルスベクターを使用して、 神経細胞のような分裂終了細胞を安定にトランスフェクトしたり、β−ガラクト シダーゼを安定に発現させることができる。

Ｅ、ｃｏｌｉ　１ａｃＺ遺伝子は、その他のコード配列と交換し得るｐＨＳ　Ｖ ｌａｃである。現在では、このベクターを使用し、神経細胞へ、第２メツセンジ ヤー系および神経伝達代謝物質の成分を包含する、生理学的に作用する産物をコ ードしている遺伝子を導入することが可能である。本発明のベクターは、神経系 疾患の遺伝子療法または神経生理学の実験的改善のために有用となり得る。

今まで本発明を一般的に記載したので、本発明は、幾つかの具体例を参照するこ とによってよりよく理解されるであろう。これらの具体例は、特に断らない隈り 本発明の例示のみを目的として記載されるものであって、本発明を限定すること を意図するものではない。

表裏性上 細胞およびウィルスの増殖のための方法ＣＶＩサル線維芽細胞を、１０％ウシ胎 児血清を含有するダルベツコの改良最小必須培地で増殖させた。ＨＳＶ−１株１ ７ｔｓＫは、ダビソン等によって記載された（Ｄａｖｉｓｏｎ、Ｍ、ｌ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、。

６５：８５９（１９８４））。ヒュエットナー等の方法（Ｈｕｅｔｔｎｅｒ、Ｊ 、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６：３０４４−３０６６（１９８６））によって、胚性 マウスを髄の培養を得た。以下の記載の様にして、線条および全新皮質（Ｆｒｅ ｅｓｅ　Ａ　ｅｔａｔ、、　Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　１４：Ａ ｂｓｔｒａｃｔ　１６９−１０（１９８８）％小脳・視床および皮質領域（Ｈｕ ｅｔｔｎｅｒ、Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　６：３０ ４４−３０６６（１９８６））の培養を調製した。５つの１３＋ａｍガラスのカ バーガラスで培養を調製し、それぞれをポリーＬ−リシンで被覆した。プレート した５日後、ｐＨ８ｖｌａｃで感染させる前に少なくともｌＯ日日間培養を維持 した。培養は、ｐＨ５Ｖｌａｃ感染の時点で３５ｍ＋ｗディツシュ当たり約ｌＸ ｌ０ゝ細胞を含有した。

東裏江１ Ｈ３ＶＬＡＣストックの構築および増幅通常の組換ＤＮＡ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ 、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ。

）を使用し、ｐＨ３Ｖ１ａｃを構築した。ＳＶ４０初期領域およびＢａｍＨＩお よびＥｃｏＲＩ制限部位の間の７５０ｂｐフラグメントをプラスミドｐｃＨ１ｌ Ｏから切り出した（Ｈａｌｌ、Ｃ，Ｖ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　 ａｎｄＡｐｐ、　Ｇｅｎｅｔ　２：１０１−１０９（１９８３））。ＳＶ４０初 期領域をＨＳＶ−ＩＣ領域ヌクレオチド４７〜１０６６で置換しくＭｃＧｅｏｃ ｈ、Ｄ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４：１７２７−１７４５（ １９８６））、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間の７５０ｂｐフラグメ ントをａ配列（Ｄａｙ　ｉ　ｓｏｎ　。

Ａ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、５５：３１５−３３１（ １９８１））ヌクレオチド１２７〜１１３２で置換して、８　、　ｌ　ｋｂグラ スミドｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃを得た。

このベクターを、以下の様にしてＨＳＶ−１ウイルスストツクに封入した：ｔ、 ５ｘｌｏ’個ＣＶＩサル線維芽細胞を６０ｍｌ１１プレートに蒔き、３７℃でイ ンキュベートした。翌ａ、ＨＳＶ−１ベクターＤＮＡ（１μｇ）とサケ精子Ｄ　 Ｎ　Ａ（９μｇ）を含有しているリン酸カルシウム共沈殿（０，５ａ＋１）で細 胞をトランスフェクトした（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ。

ａｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌ、５２：４５ｆｒ４６７（１９７３））。４時間後 、細胞に１５％グリセロールでショックを与えた（Ｐａｒｋｅｒ、Ｂ、Ａ、　ａ ｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、３１：３６０−３６９（１９７９））。３７℃ で２４４時間インキュベートた後、各プレートに室温で１時間、１００／７１中 １．５ＸＩ　Ｏ’ＰＦＵ（７）ＨＳＶ−１を加えた。ウィルス接種物を吸引し、 プレートを培地（５ｔｍｌ）で１回洗浄した。ウィルスにもＤＮＡにも接触させ ていないＣｖｌ細胞の半面成長プレートをトリプシン処理した。５Ｘ　ｌ　Ｏ’ 個の新しくトリプシン処理されたＣＶＩ細胞を含有している培地（５＋ｍｌ）を 加え、単層を形成させた。３７℃で１．５時間インキュベートしてＣｖｌ細胞を プレートに結合させた後、培地を除去し、新しい液体培地またはメトセルで置き 換えた。３日間インキュベートした後にウィルスを集めるか、または５日間イン キュベートした後にニュートラルレッドでプラークを可視化した。次いで、ウィ ルスのストックをＣｖ１細胞に１＝２希釈で継代接種した。この方法は、多種類 の欠損ＨＳＶ−１ベクターを増幅し、ＨＳＶ−１ヘルパーウイルスの種々の株お よび変異体の特性を評価するのに役立つであろう。

哀裏町ｌ 神経細胞からのｐＨ５ＶＬＡＣの回収 感染の２週間後、ｐＨ５ＶｌａｃＤＮＡが細胞に存在することを証明するために 実験を行なった。潜伏感染した神経細胞の重複感染によって溶菌感染が起こるこ とが証明された。潜伏感染および重複感染している両ゲノムが後代ウィルスに存 在する（Ｌｅｗｉｓ、Ｍ、Ｅ、　ｅＬ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６５：２１５（１９８４））。この様な実験は、ｐＨＳ 　Ｖ　ｌａｃが前記感染細胞から回収され得るか否かを調べるために変更された 。

この目的を達成するために、抜根神経節の培養（Ｈａｗｒｏｔ、Ｅ、　ｅｔａｌ 、　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　、　５８：５７４（１９７９Ｘ　１ 　、５　ｍｌ中９ＸＩＯ’細胞）をｐＨＳ　Ｖ　Ｉａｃウィルスストック（０， ０５ｍ１）で感染させ、３７℃で２週間インキュベートした。ｐＨＳ　Ｖ　Ｉａ ｃ感染の２週間後、Ｈ５Ｖ−１ウイルスストツク中のｐＨ５ＶｌａｃＤＮＡを回 収するために、培養を１７ｔｓＫ株のみで感染させ、３１”Ｏで２日間インキュ ベートした。

培養をＨ５Ｖ−１株１７　ＬｓＫＣ５Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｐｆｕ）で感染させ（Ｄａｖ ｉｓｏｎ。

Ｍ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、　６５二８５９（１９ ８４））、３１”Ｏで２日間インキュベートした。得られたウィルスストックを ３１℃にてＣＶＩサル線維芽細胞（２Ｘ１０’）に３回継代接種し、ウィルスス トックＤＲＧＩおよびＤＲＧ２を得た。ＣＶＩ細胞（ＩＸＩＯりをウィルススト ック（ＤＲＧＩ、ＤＲＧ２、ｔｓＫのみ、または偽感染Ｘ５ＸｌＯ’ｐｆｕ）で 感染させ、３１℃で２４時間インキュベートした。

以下の様にして、ＤＮＡを分析した：ＣＶｌ細胞（ＩＸＩＯりをｐＨＳ　Ｖ　ｌ ａｃウィルスストック（５Ｘ　１０　’ｐｆｕ）で感染させ、細胞を３１℃で２ ４時間インキュベートした。全細胞ＤＮＡを記載（Ｗｉｇｌｅｒ。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７−７８５（１９７９））に従っ てＣＶｌ細胞から調製し、ＤＮＡ（５μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉ　（１２−５単位）にて３７°Ｃで一夜消化し、０．７％アガロースゲルに溶 解し、記載（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　９ ８：５０３−５１７（１９７５））に従ってジェネトラン（Ｇｅｎｅｔｒａｎ） に移した。ハイブリダイゼーシヨンおよび洗浄条件は、記載（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 、Ｅ、Ｍ、、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　９８：５０３−５１７（１９７５ ））に従った。

３２Ｐで放射１１Ｍｋした（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｐ、　ａｔ　ａｌ、、　Ａ ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２：６−１３（１９８３））、グ ラスミドｐｃ）（１１０（Ｈａｌｌ、Ｃ，Ｖ、　ｅＬ　ａｌ、。

Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ　Ａｐｐ、　Ｇｅｎｅｔ　２：１０１（０９（１９８ ３））由来の５．９ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとした。このプロ ーブはｐＢＲ３２２配列および大部分のＩａｃ　Ｚにホモローガスであり、３′ 末端の１３３ｂｐに相同性を欠いていた。ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃは３個のＥｃｏＲ Ｉ部位、即ちｐＢＲ３２２セグメントの各末端に１つ、フラグメントの３′末端 から１３３ｂｐのＩａｃ　Ｚ遺伝子に３番目の部位を有している。４　、３　ｋ ｂ／＜ンドはｐＨ３Ｖ１ａｃにおける転写ユニットの大部分を含有し、２．３ｋ ｂバンドはｐＢＲ３２２配列を含有している。Ｉａｃ　Ｚ遺伝子の３′末端、５ Ｖ−４０初期領域ポリアデニル化部位およびａ配列を含有している１　、　５　 ｋｂｙラグメントはグローブにホモローガスではない。ｐＨ３Ｖ１ａｃ配列は、 ベクターを含有しているウィルスストックに存在するが、ｔｓＫ単独のウィルス ストックおよび非感染細胞には存在しない。

ｐＨ３ＶｌａｃＤＮＡの存在は、この方法で確認された。感覚二ニーロンに２週 間持続するｐＨ５ＶｌａｃＤＮＡの構造は、Ｅ、ｃｏｌｉがら単離されたｐＨ５ Ｖ１ａｃＤＮＡの構造に類似していることが見い出された。ｐＨ５ＶｌａｃＤＮ Ａは、株１７ｔｓＫのみのウィルスストックおよび偽感染細胞の両者に存在しな いことが見い出された。ＰＣＩ２細胞の１〜１０％は、感染の２週間後に神経細 胞から回収されたｐＨ３Ｖ１ａｃのウィルスストックによる感染の２４時間後に 、β−ガラクトシダーゼポジティブであった。即ち、ｐＨ５Ｖ１ａｃＤＮＡは感 覚ニューロンにおいて少なくとも２週間変更されず存続し、Ｈ５Ｖ−１１Ｅ　４ １５グクモーターからβ−ガラクトシダーゼを安定に発現することができる。

実施例４ ３７℃の制限的温度における有糸分裂細胞中のｐＨ５ｖＬＡＣのＩａｃＺ転写ユ ニットの発現 ３７℃の制限的温度でインキュベートされた細胞におけるｐＨ５Ｖ　１ａｃＤ　 Ｎ　Ａの運命を調べた。ＣＶＩ細胞をｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルスストックで感 染させ、細胞を３７℃でインキュベートした。感染の２４時間後、全細胞ＤＮＡ を単離し、前記の様にしてサザン分析にかけた。結果は、３７℃で２４時間イン キュベートされたＣＶＩ細胞にｐＨ５Ｖ１ａｃＤＮＡが存在することを示した。

ＨＳＶ−１特異的プローブでグローブされた同様のプロットは、これらの細胞中 にＨＳＶ−Ｉ　ＤＮＡも存在することを示した。

ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃにおいて１ａｃＺ転写ユニツトを転写するｐＨ８Ｖｌａｃの 能力を調べた。ＳＶＩ細胞をｐＨＳ　Ｖ　Ｉａｃウィルスストックで感染させ、 細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。全細胞ＲＮＡを調製して（Ｃｈｉ ｒｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：５ ２９４−５２９９（１９７９））アガロースゲルに広げ、得られたノザンプロッ ト（Ｅｃｋｅｒ、Ｊ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　８４：５２０２−５２０６（１９８７））を１ａｃＺ特異的プロ ーブでプローブした。４．Ｏｋｂで見られる主要なバンドは、ｐＨＳ　Ｖ　ｌａ ｃにおいてＨＳＶ−１１Ｅ　４１５プロモーターを使用して１ａｃＺ転写ユニツ トから正確に転写を行うために適切なサイズである。この４ｋｂ転写物はｔｓＫ のみで感染された細胞にも非感染細胞にも存在しない。従って、これはｐＨＳ　 Ｖ　ｌａｃに由来するに違いない。

ＨＳＶ−１特異的プローブでプローブされた同様のプロットは、ｐＨＳ　Ｖ　ｌ ａｃで感染された細胞およびｔｓＫのみで感染された細胞でＨＳＶ−Ｉ　ＩＥ遺 伝子の発現を示すバンドのパターンを示したが、非感染細胞では示さなかった。

里簾亘ｌ ＨＳ　Ｖ　ｌａｃによるβ−ガラクトシダーゼの発ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルス ストックが神経細胞を感染させ、β−ガラクトシダーゼを発現するか否かを調べ るために、分離した神経細胞の一次培養を調製しくＨａｗｒｏｔ、Ｅ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５８：５７４（１９７９））、 新生ラットの後根神経節および上類神経節由来の細胞における、ｐＨ５Ｖｌａｃ 由米のβ−ガラクトシダーゼの発現を調べた。

ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃを含有しているウィルスストックは、ヘルパーウィルスとし てＨＳＶ−１株１７　ｔｓＫ（Ｄａｖｉｓｏｎ、Ｍ、Ｊ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ 、Ｇｅｎ、Ｖｉｒ。

１、、６５：８５９（１９８４））を使用して調製された。このウィルスストッ クの力価は、ｌ＋＋１当たり株１７ウイルス　ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｐｆｕであり、 １ｍｌ当たりｐＨ５Ｖｌａｃ８Ｘｌｏ’感染性粒子であった。培養をｐＨＳ　Ｖ 　ｌａＣウィルスストックで感染させ、次いで３７℃で２４時間インキュベート し、固定し、色素産生基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルβ− Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を使用してイン・ジツでβ−ガラクトシダーゼ 活性について分析した（Ｓａｎｅｓ、Ｊ、Ｒ，ｅｔａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　５ ：３１３３（１９８６）；　Ｐｒ１ｃｅ、Ｊ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：１５６（１９８７））。新生ラットの後根神経節（ＤＲ Ｇ）または上類神経節（Ｓ　ＣＧ）から、解離した細胞培養（Ｈａｗｒｏｔ、Ｅ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５８＝５７４（１９ ７９））を調製し、１０−″Ｍシトシンアラビノシドで２４時間処理した。イン ・ビトロで１０日後、培養は３５−ｍｍプレート当たり３〜８Ｘ１０″細胞を含 有しており、そこで、培養をｐＨ５ｖｌａｃウイルスストツク（０，１ｍ１）で 感染させ、３７℃で２４時間インキュベートした。０．５％グルタルアルデヒド で細胞を固定し、ベーターガラクトシダーゼ活性のためにＸ−ガルで染色した。

染色した標本を写真に撮り、分析した。

０．１−０．４（ｌ細胞当たりのｐＨＳ　Ｖ　１ａｃ）の感染多重度（ｍｏｉ） で感染させた時、後根神経節の培養中、約３８％の細胞、および上類神経節の培 養中、ｌ′１％の細胞がβ−ガラクトシダーゼポジティブであった。

細胞に対してより高い割合のｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルスで行なった実験では、 実質１全ての細胞にβ−ガラクトシダーゼが発現した。ＨＳＶ−１株１７ｔｓＫ のみで感染させた培養または偽感染培養は、０゜２％より少ないβ−ガラクトシ ダーゼポジティブ細胞を含有した。

観察された大部分のβ−ガラクトシダーゼボジテイプ細胞は、神経細胞の形態学 的特性を有した。しかしながら、神経節に類似したβ−ガラクトシダーゼポジテ ィブ細胞も観察された。

これらの結果は、ＩＥ４１５プロモーターが、感染された神経細胞において構造 遺伝子の発現を媒介し得るということを示している。β−ガラクトシダーゼの発 現は、ｔｓＫヘルパーウィルスのｍｏｉに依存しないということがわかった。ｐ ＨＳ　Ｖ　ｌａｃの１個の粒子は細胞をβ−ガラクトシダーゼポジティブにする に十分であった。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させるためには、多くの溶 菌感染は必要ではなかった。

実施例６ ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃの神経細胞感染 実施例５の実験で確認されたβ−ガラクトシダーゼポジティブな細胞の幾つかが 実際に神経細胞であるか否かを調べるために、β−ガラクトシダーゼおよび神経 細胞マーカーがその細胞に存在するか否かを調べる実験を行なっｌ；。これを行 なうｌこめに、後根神経節の一次培養（Ｈａｖｒｏｔ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５８：５７４（１９７９））をｐＨＳ　Ｖ 　ｌａｃウィルスストックで感染させ、３７℃で２４時間インキユベートシ、固 定させ、β−ガラクトシダーゼに対するウサギ抗血清、および２種類の神経細胞 マーカー、即ちＡ２Ｂ５抗ｊｊ（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ。

Ｇ、Ｓ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ］、ＩＪＳＡ 　７６：４９１３（１９７９））または神経フィラメントの１５０８よび１８０ ｋＤサブユニツト（ＳＬｅｒｎｂｅｒｇｅｒ。

Ｌ、＾、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 ８０：６１２６（１９８３））のいずれか１つに対するマウス抗ラットモノクロ ーナルで処理した。

詳細には、ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルスストックおよび後根神経節の培養を、ラ ミニン（０，８μｇ）で被覆した１３ｍｍガラスのカバーガラスで培養を調製し た以外、前記と同様にして調製した。培養（０，５ｍｌ中、５ＸＩＯ’細胞）を ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルスストック（０，１＋ａｌ）で感染させ、３７℃で２ ４時間インキュベートした。Ｏ−Ｉ　Ｍ　ＮａＰ　Ｏａ（ｐＨ７，０）中４％パ ラホルムアルデヒドで固定し、ｌ：８００希釈したＥ、ｃｏｌｉβ−ガラクトシ ダーゼに対するラビット抗体（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｍａｌ ｖｅｒｎ　Ｐａ、）、およびｌ：８００希釈したラット神経フィラメントに対す るマウスモノクローナル（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ、Ｌ、Ａ、　ａｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０：６１２６（１９８３） ＸＳＭＩ３３．　Ｓｔｅｎｂｅｒｅｒ−Ｍｅｙｅｒ）または１：２希釈したマウ スモノクローナルＡ　２　Ｂ　５　（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ、Ｇ、Ｓ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６：４９１３（ １９７９））上溝のいずれかを一次抗体として使用し、免疫組織化学的に調べた 。二次抗体として、ｌ：２００希釈したマウスＦ　（ａｂ’　）、に対するフル オレセインインチオシアネート−コンジュゲートしたヤギＦ　（ａｂ’　）、抗 体（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、およびｌ：２５０希釈したウサギ Ｆ　（ａｂつ、に対するローダミンイソチオシアネート−フンシュゲートしたヤ ギＦ（ａｂ’）２抗体を使用した。カバーガラスを、０．４％ｎ−プロピルガレ ートを含有しているＰＢＳグリセロールｌ：１にて作成した。ウサギ免疫グロブ リンＧに対するローダミンコンジュゲートしたヤギ抗体でβ−ガラクトシダーゼ 様免疫反応性（β−ｇａｌ−ＩＲ）が視覚化され、マウス免疫グロブリンＧに対 するフルオレセインコンジュゲートしたヤギ抗体でＡ２Ｂ５または神経フィラメ ント様免疫反応性（Ａ２Ｂ５−ＩＲまたはＮｆ−ＩＲ）が視覚化された。

神経細胞形態を有するこの細胞の多くは、Ａ２Ｂ５−ＩＲおよびβ−ｇａｌ−Ｉ ＲまたはＮｆ−Ｉ　Ｒ８よびβ−ｇａｌ　−Ｉ　Ｒの両者を含有した。神経細胞 マーカーおよびウサギ前免疫血清のいずれかに対する抗体、次いで、フルオレセ ント−コンジュゲートした抗体で処理した対応する培養は、Ａ２Ｂ５−ＩＲまた はＮｆ−Ｔ　Ｒのいずれかを含有したがβ−ｇａｌ−ＩＲを含有しなかった。ｔ ｓＫのみで感染させるかまたは偽感染させ、神経細胞マーカーおよびβ−ガラク トシダーゼのいずれかに対する抗体で処理した培養は、Ａ２Ｂ５−ＩＲまたはＮ ｆ−Ｉ　Ｒを含有したが、β−ｇａｌ　−Ｔ　Ｒを含有しなかった。即ち、ｐＨ ５Ｖｌａｃはラットの感覚ニューロンに感染し、次いでβ−ガラクトシダーゼを 発現することができる。

を髄、小脳、視床、線条、海鳥、後頭皮質、側頭皮質、および前頭皮質を包含す る種々のＣＮＳ領域から、−次培養を調製した。培養を少なくともｌＯ日間増殖 させ、シトシンアラビノシドで処理して有糸分裂細胞を殺滅し、それによって培 養の神経節細胞の過増殖を防いだ。次いで、培養をｐＨ５Ｖ１ａｃで感染させ、 ２４時間または２週間、３７℃でインキュベートした後、分析を行なって、神経 細胞中のｐＨ３Ｖ］ａｃＤＮＡおよびＥ、ｃｏＪｉβ−ガラクトシダーゼの発現 を検出した。

この様な発現を証明するために、培養を固定し、前記の蛍光染色検定法を使用し て、β−ガラクトシダーゼ様免疫反応性および神経フィラメント様免疫反応性の 共局在性（ｃｏ−ｌｏｃａｌ　１ｚａｔｉｏｎ）について検定した。後頭皮質、 側頭皮質および海鳥からの７エイズポジテイブな細胞は、β−ガラクトシダーゼ 様および神経フィラメント様免疫反応性の両者について、染色を示した。これら の培養では、顕微鏡視野で調べた神経細胞の６０−７０％がβ−ガラクトシダー ゼポジティブであった。β−ガラクトシダーゼ様反応性を有する細胞の幾つかは 神経フィラメント様活性を有しておらず、神経節の形態学的外観を有したが、こ れらの細胞を更に特性化することはしなかった。

を髄、小脳、視床、線条および前頭皮質の培養中、神経フィラメント様反応性を 有する細胞において、β−ガラクトシダーゼ様反応性が観察された。フルオレセ インおよびローダミンフルオレセインのバックグラウンドレベルを有する前免疫 −次血清で処理した姉妹培養、および神経フィラメント抗原およびウサギ前免疫 血清に対する抗体、次いで、フルオレセント−コンジュゲートした抗体で処理し た姉妹培養は、神経フィラメント様免疫反応性を含有したが、β−ガラクトシダ ーゼ様免疫反応性を含有しなかった。

ＨＳＶ株１７ｔｓＫのみで感染させるかまたは偽感染させ、抗神経フィラメント および抗β−ガラクトシダーゼ抗体、次いでフルオレセントコンジュゲートした 二次抗体で処理した培養は、神経フィラメント様免疫反応性を含有したが、β− ガラクトシダーゼ様免疫反応性を含有しなかった。全新皮質および線条由来の７ エイズポジテイブな細胞は、ｐ）ｌ　ＳＶ　ｌａｃ感染の２週間後、神経フィラ メント様免疫反応性およびβ−ガラクトシダーゼ様免疫反応性の両者を示した。

調べた線条および新皮質神経細胞の６０−７０％がβ−ガラクトシダーゼポジテ ィブであった。

実施例８ ＨＳ　Ｖ　ｌａｃの残存率および発現の　定性培養された感覚ニューロンで、ｐ Ｈ５Ｖ１ａｃの残存率およびその発現の安定性を調べた。後板神経節の培養（Ｈ ａｗｒｏｔ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ−５８：５７４（１９７９））をｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィ ルスストックで感染させ、３７℃で２週間インキュベートした後、Ｘ−ｇａｌで 検定したところ、４９％の細胞がβ−ガラクトシダーゼポジティブであった。

これらの細胞の大部分は、神経細胞形態を有した。Ｈ３Ｖ−１株ｔｓＫのみで感 染させるかまたは偽感染させた培、！、０．２％より低いβ−ガラクトシダーゼ ポジティブな細胞を有した。

β−ガラクトシダーゼポジティブな細胞の存在は、その細胞中でｐＨＳ　Ｖ　ｌ ａｃが２週間安定に存続すること、またはｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃの水平伝播に帰す ることができるであろう。β−ガラクトシダーゼの存在がｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃの 安定な存続に起因する場合、β−ガラクトシダーゼを発現している全細胞の割合 は、ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃベクターで最初に感染させた細胞の割合とほぼ同じとな ろう。逆に、水平伝播が有意な割合で起こった場合、全ての細胞はｐＨ５Ｖ１ａ ｃＤＮＡを含有し、β−ガラクトシダーゼを発現し、培地中に１７ｔｓＫウイル スおよびｐＨ３Ｖ　ｌａｃウィルスの両者が見い出されるであろう。

感染の２週間後、３０−５０％の細胞がβ−ガラクトシダーゼネガティブである が、免疫蛍光により神経フィラメントポジティブであることがわかっＩ；。更に 、感染の２週間後、培地中のウィルスの量は検出限界以下（即ち、１ミリリツト ル当たり、ｌＯグラーク形成単位（ｐｆｕ）以下の株１７ｔｓＫ、および１ミリ リツトル当たりｌＯ感染性粒子以下のｐＨＳ　Ｖ　１ａｃ）であるか、または非 常に低かった（第１表）。観察されたウィルスが低レベルであることは、標本の 凍結および解凍の間に死滅した細胞からウィルスが放出されたことによるもので あろう。対照的に、ｖｔＨｓＶ−１は２４時間までに全ての細胞を殺滅する。

更に、培養された末梢神経系神経細胞、および分化したＰＣ−１２１４色細胞腫 および分化したＮＩＥ−１１５マウス神経芽細胞腫細胞では、ｐＨ９Ｖｌａｃ感 染させても、感染２週間後、培養培地において検出可能なｔｓＫまたはｐＨＳ　 Ｖ　ｌａｃウィルスを生じない。即ち、これは必ずしも存在しないのではないが 、ｐＨ５Ｖｌａｃの水平伝播の割合は非常に低い。

実験の結果は、ベーターガラクトシダーゼの発現は、完全にではない場合、主と してベクターの水平伝播よりもその存続性に起因することを示している。

第１表 ｐＨ３ＶＩａｃ感染の２週間後に、新皮質の一次培養由来の培地に存在するｔｓ ＫおよびｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルスの量＠’１１　ｔｓＫ／ｍｌ”　ｐＨＳ　 Ｖ　ｌａｃ／ｍ１本１　８Ｘ１０”　ｌＸｌ０’ ２　＜１０’　４Ｘ１０’ ３　＜１０’　＜１０１ ５ＸＩＯ’個のＰＣ１２細胞（Ｇｒｅｅｎｅ、Ｌ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７３：２４２４−２４２８（１９ ７６）Ｘ　５　ｍｌ）を、ｌ　ＯＯｕｇ／ｍｌコラーゲン（０−２ｍｌ）で被覆 した６０ｍｍプレートに蒔き、１２時間後、Ｉｏｎｇ／ｍｌの終濃度まで神経成 長因子（ＮＧＦ）を加えた。５×ｌＯ″個のＮＩＥ−１１５細胞（Ａｍａｎｏ、 Ｔ、　ｅＬ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９ ：２５８−２６３（１９７２）；　Ｇａｒｖｉｃａｎ、Ｊ、Ｈ，ｅｔａｌ、、　 Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７６：２５１−２６１（１９７７）；　Ｎｅ１ｓ ｏｎ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 　６４：１００４−１０１０（１９６９）Ｘ　５　ｍｌ）を、被覆していない６ ０ｍｍプレートに蒔き、１２時間後、１ｍＭの終濃度までジブチリルサイクリッ クＡ　Ｍ　Ｐ　（ｂ５ＣＡＭＰ）を加えた。２日目に、適当な分化誘発剤を含有 している培地を培養に加えた。３日目に、１ｘ１０１ｐｆｕのｐＨＳ　Ｖ　ｌａ ｃウィルスストックで培養を感染させ、３７°Ｃで２４時間または２週間インキ ュベートした。２週間インキュベート後、幾つかのＮＩＥ−１１５培養にｌＸｌ ０’個ＣＶ１細胞を加え、次いで３７℃で更に２日間インキュベートした。次い で、培養のβ−ガラクトシダーゼ活性をイン・ジブで検定した。

更に、５　Ｘ　１０　’ｐｆｕのＨＳＶ−１株１７ｔｓＫで培養を感染させ、３ １℃で２日間インキュベートした。得られたウィルスストックを３１℃で、２Ｘ １０’個ＣＶＩサル線維芽細胞に３回継代接種した。

１Ｘｌｏ’ｃＶｌ細胞を５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｐｆｕのウィルスストックで感染させ 、３１°０で２４時間インキュベートし、全細胞ＤＮＡを調製した（Ｗｉｇｌｅ ｒ、Ｍ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７”７８５（１９７９））− ウィルスストック中のｐＨ５ＶＩａｃＤＮＡおよびヘルパーウィルスＤＮＡの構 造を調べた。ＣＶ１細胞をｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルスストックで感染させ、細 胞を３１℃の許容温度でインキュベートした。感染の２４時間後、全細胞ＤＮＡ を単離しくＷｉｇｌｅｒ、Ｍ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７−７ ８５（１９７９））、前記と同様にしてサザン分析によって分析した。

この実験は、ｐＨ５ＶｌａｃＤＮＡがヘルパーウィルスとしてｔｓＫを使用して ＨＳＶ−１ウイルスストツク中で正確に増幅されることを示した。同様のサザン プロットをＨＳＶ−１およびｐＨ３Ｖ１ａｃ特異的プローブでプローブした。こ れらのプロットは、ｐＨ３ＶＩａｃの存在下で増幅されたｔｓＫの構造が、単独 で増幅されたｔｓＫの構造に類似していること、およびＨＳＶ−１配列が非感染 細胞に存在していないことを示した。更に、ｐＨ３Ｖｌａｃに特異的なバンドお よびｔｓＫに特異的なバンドのデンシトメトリースキャンニングから、ｐＨ９Ｖ ｌａｃがｔｓＫとほぼ等モル量で存在することがわかった。

実施例１０ 非有糸分裂細胞ノｐＨＳ　Ｖ　Ｌ　Ａ　Ｃ感染ニヨる、ｐＨ３ＶＬＡＣＤＮＡの 維持およびβ−ガラクトシダーゼの　定な発現上記の様に、ｐＨＳ　Ｖ　Ｉａｃ はラット末梢神経に感染し、異種細胞群でβ−ガラクトシダーゼを発現させるこ とができる。多種類の実験のために、均一な群が必要である。２種類の非有糸分 裂細胞培養系、即ち、ＮＧＦで分化させたＰＣＩ２ラット褐色細胞腫細胞（Ｇｒ ｅｅｎｅ。

Ｌ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７ ３：２４２４−２４２８（１９７６））およびｂｔ２ｃＡＭＰで分化させたＮＩ Ｅ−１１５アドレナリン作動性マウス神経芽細胞腫細胞（Ａｍａｎｏ、Ｔ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９：２５８ −２６３（１９７２）；　Ｇａｒｖｉｃａｎｊ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７６：２５１−２６１（１９７７）；　Ｎｅ１ｓｏｎ、 Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６４ ：１００４−１０１０（１９６９））は、神経細胞に非常に類似している均一な 細胞群である。

ｗｔＨＳ　Ｖ　−１はＰＣ１２細胞に感染することができ（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉ ｎ、Ｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６４：２５０！ｒ２５０９（１９ ８３））、ｔｓＫは分化したＮＩＥ−１１５細胞に感染し、維持することができ る（Ｇｅｒｄｅ、Ｊ、Ｇ、　ａｔａｌ、、　Ｖｉｒｏｌ、　９４：４３０−４４ １（１９７９））。ＰＣｌ３およびＮＩＥ−１１５細胞は３日間、適当な薬物を 用いると分化された。次に、ｐＨ３Ｖ１ａＣウイルスストツクで培養を感染させ 、３７℃で２４時間インキュベー）１．．０．５％グルタルアルデヒドで固定し 、Ｘ−ｇａｌを使用してイン・ジツでβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した（Ｐ ｒｉｃｅ、Ｊ、　ｅＬａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ　８４：１５６−１６０（１９８７）；　５ａｎｅｓ、Ｊ、Ｒ，ｅｔａｌ、、 　ＥＭＢＯＪ、　５：３１１１−３１４２（１９８６））。その結果、ＰＣ１２ 細胞の１３％およびＮＩＥ−１１５細胞の７％がβ−ガラクトシダーゼポジティ ブであった。β−ガラクトシダーゼポジティブな細胞における長いプロセスは、 ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃ感染の前に有糸分裂が阻止され、分化が起こったことを示す 。ｔｓＫのみで感染させるか、または感染させていない、分化したＰＣ１２細胞 およびＮＩＥ−１１５細胞は、０゜２％より低いβ−ガラクトシダーゼポジティ ブな細胞を含有した。

ｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃが非有糸分裂細胞で維持され得るか否かを調べるために、分 化したＰＣ１２細胞およびＮＩＥ−１１５細胞をｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルスス トックで感染させ、３７℃で２週間インキュベートし、分析を行なってｐＨ５Ｖ ｌａｃＤＮＡおよびβ−ガラクトシダーゼの発現を検出しＩ；。ｐＨＳ　Ｖ　ｌ ａｃによる感染の２週間後にβ−ガラクトシダーゼの発現を証明するために、培 養を固定し、Ｘ−ｇａｌを使用してβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した（Ｐｒ ｉｃｅ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ Ａ　８４：１５６（６０（１９８７）；　５ａｎｅｓ、Ｊ−Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、 　ＥＭＢＯＪ。

５：３１１１−３１４２（１９８６））。ｔｓＫのみで感染させるか偽感染させ た培養は、０．２％より低いβ−ガラクトシダーゼポジティブな細胞を含有した 。

非有糸分裂ＰＣ１２およびＮＩＥ−１１５細胞中で持続するｐＨ５ＶｌａｃＤＮ Ａの能力を調べた。潜伏感染している神経細胞が重複感染すると溶菌感染となり 、重複感染しているゲノムおよび潜伏性ゲノムの両者が後代ウィルスに存在する ということがわかった（Ｌｅ冒ｉｓ、Ｍ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、　６５＝２１５−２１９（１９８４））。分化したＰＣｌ３および ＮＩＥ−１１５細胞をｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルスストックで感染させ、３７℃ で２週間インキュベートした。次に、培養をｔｓＫのみで感染させ、３１℃で２ 日間インキュベートした。得られたウィルスストックから全細胞ＤＮＡを単離し くＷｉｇｌｅｒ、Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１１１６：７７７−７８５（１９ ７９））、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化し、サザン分析（Ｓｏｕｔ ｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　９８：５０３−５１７（１ ９７５））を行ない、上記と同様にしてｐＨ３ＶｌａｃＤＮＡを検出した。サザ ンブロットから、ｐＨ５Ｖ１ａｃＤＮＡが感染２週間後に非有糸分裂細胞中で正 確に維持されるがｔｓＫのみのウィルスストックおよび非感染細胞には存在しな いことがわかった。感染２週間後に非有糸分裂細胞から回収したｐＨ３Ｖｌａｃ ウイルスストツクでＰＣ１２細胞を感染させ、３７℃で２４時間インキュベート し、固定し、Ｘ−ｇａｌでβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した結果、１％〜ｌ Ｏ％の細胞がβ−ガラクトシダーゼポジティブであった。要約すると、３種類の 細胞株の証拠が、ｐＨ３ＶｌａｃＤＮＡが非有糸分裂細胞中で２週間変更されず に維持され得ることを示す。第１に、回収されたｐＨＳ　Ｖ　１ａｃＤ　ＮＡは ＨＳＶ−１ウイルスストツク中で増幅されたので、これは機能的ａ配列およびＨ ＳＶ−１のＤＮＡ複製起点を有しており：第２に、これは、感染２週間後に両非 有糸分裂細胞で、重複感染による回復後にＰＣ１２細胞でβ−ガラクトシダーゼ を発現する機能的転写ユニットを有しており；第３に、サザン分析によって証明 されたように、ｐＨ５Ｖ１ａｃＤＮＡの構造は変更されなかった。即ち、ｐＨ３ Ｖ１ａｃは、分化したＰＣｌ３およびＮＩＥ−１１５細胞に感染して維持され、 少なくとも２週間、β−ガラクトシダーゼを安定に発現することができる。

実施例１１ ヒト、サルおよび誓書類動物由来の広範な有糸分裂細胞種のＰＨ５ＶＬＡＣ感染 による、β−ガラクトシダーゼの　視程々の有糸分裂細胞種へ遺伝子を輸送する 欠損Ｈ３Ｖ−１ベクターの能力を調べた。ヒト、サルおよび誓書類動物由来の広 範な不死化セルラインをｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃで感染させ、β−ガラクトシダーゼ の発現について分析した。試験したセルラインには、サルおよびマウス繊維芽細 胞、アドレナリン作動性およびコリン作動性マウス神経芽細胞腫細胞（Ａｍａｎ ｏ、Ｔ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 ６９：２５８−２６３（１９７２）；　Ｇａｒｖｉｃａｎ、Ｊ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ 、、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｏ＋、　７６：２５１−２６１（１９７７）； 　Ｎｅ１ｓｏｎ、Ｐ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　６４：１００４−１０１０（１９６９））、ラット褐色細胞腫細胞 （Ｇｒｅｅｎｅ、Ｌ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 ｓｃｉ、ＵｓＡ　７３：２４２４−２４２８（１９７６））、ラットおよびマウ ス下垂体細胞（Ｋｉｔａｇａｗａ、Ｓ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌｏｇｙ　１２０：２５９１−２５９６（１９８７）；　Ｈｅｒｂａｒｔ、Ｅ、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１０２：２１８−２２６（１ ９７８））、およびヒト神経芽細胞腫（Ｂｉｅｄｌｅｒ、Ｊ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３８：３７５１−３７５７（１９７８ ））が包含される。培養をｐＨＳ　Ｖ　ｌａｃウィルスストックで感染させ、３ ７℃で２４時間インキュベートし、β−ガラクトシダーゼ活性の量を、０ＮＰＧ を使用する定量溶液検定によって調べＩ；。

対応する培養物を固定し、発色性基質であるＸ−ｇａｌを使用してイン・ジツに てβ−ガラクトシダーゼ活性について分析し、β−ガラクトシダーゼポジティブ な細胞のパーセンテージを調べた。ｐＨ５ＶｌａｃおよびｔｓＫで感染させた培 養におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の割合を評価した。この割合を、イン・ジ ッ分析からの結果を使用し、ｐＨ５Ｖ１ａｃをベースとして感染させた細胞当た りに標準化した。第２表Ｉこ示す様に、試験した全てのセルラインで高レベルの β−ガラクトシダーゼ活性が観察された。試験したセルラインには、β−ガラク トシダーゼレベルに５倍の変動があった。ｐＨ５ＶＩａｃ感染の２４時間後、Ｃ Ｖ１細胞に８けるβ−ガラクトシダーゼ比活性は１１５ナノモル○ＮＰＧ（分離 ）／分／ｍｇ蛋白であった。従って、ＨＳＶ−１ベクターは、ヒト由来のセルラ インを包含する広範な有糸分裂哺乳動物セルラインに遺伝子を転移させるのに有 用であろう。

第２表 ｐＨ５ＶＬＡＣウイルス感染の２４時間後の種々のセルラインにおける感染細胞 当たりのβ−ガラクトシダーゼ活性セルライン　Ａ４□。

ｐＨ５ＶＩａｃ／ＬｓＫ ＣＶＩサル線維芽細胞　２６４ ＬＭｔｋ−マウス繊維芽細胞　５９ ＮＩＥ−１１５マウスアドレナリン 作動性神経芽細胞腫　８５ ＮＳ−２０マウスコリン作動性 神経芽細胞腫　６５ ＰＣ１２ラット褐色細胞腫　１５６ ＡｔＴ−２０マウス下垂体細胞　６５ ＧＨ４ラット下垂体細胞　７８ ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）ヒト神経芽細胞腫　５２１Ｘ］０’ＪＩ胞を、ｐＨ５ＶＩ ａｃウイルスストツクまたはｔｓＫのみで０．１の多重度にて感染させた。細胞 を３７°Ｃで２４時間インキュベートした。ｐＨ３ＶＩａｃ感染細胞当たりのβ −ガラクトシダーゼ活性を寅験法の記載の様にして調べた。各測定値は、値が１ ０％以下の変動である少なくとも２種類の寅験からの３種類の培養の平均値であ る。

本発明をその具体的な態様について記載したが、本発明を更に変更することがで き、この出願は通常、本発明の原理に従い、本発明の変法、用途または翻案を包 含し、本発明が関係する技術内の既知まｔ；は通常のプラクティスに含まれ、以 下の請求の範囲に記載された主要な特性に適用し得る、本発明の記載からの変更 物をも包含することを意図することは理解されよう。

ＦＩＧｔＪＲＥ　ｌ 国際調査報告 ｌ呻″”−１Ｎ″　−ｒＴｌさ頓ｌ菌１５７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（１）ＨＳＶ−１パッケージング部位を含有している配列、（２）ＨＳＶ− １のＤＮＡ複製起点を含有している配列、および（３）ベクターの認識または選 択を行なうに十分なヘテロローガスなレポーターまたは選択可能なマーカー遺伝 子配列を含有する、神経細胞に感染し得る組換ＨＳＶ−１ベクター。 ２．更に、（４）神経細胞中、遠位に位置する配列の転写を惹起するに十分なプ ロモーター配列、 （５）神経細胞中、遠位に位置する配列の翻訳を惹起するに十分な配列、 （６）神経細胞に発現蛋白を加工させるに十分な配列を含有する請求項１に記載 の組換ベクター。 ３．更に、（７）細菌中でベクターを増幅させるに十分な配列を含有する請求項 ２に記載の組換ベクター。 ４．更に、該配列（４）、（５）および（６）に機能的に連結するように該ベク ターに挿入された（８）挿入遺伝子配列を含有する請求項３に記載の組換ベクタ ー。 ５．該ＨＳＶ−１パッケージング部位を含有している配列（１）がＨＳＶ−１ａ セグメントを含有する請求積１または４のいずれかに記載の組換分子。 ６．該ＨＳＶ−１のＤＮＡ複製起点配列（２）がＨＳＶ−１ｏｒｉ，領域を含有 する請求項１または４のいずれかに記載の組換分子。 ７．該ヘテロローガスなレポーターまたは選択可能なマーカー遺伝子配列（３） がＥ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ遺伝子由来の配列を含有する請求項１また は４のいずれかに記載の組換分子。 ８．該プロモーター配列（４）がＨＳＶ−ｌＩＥ４／５プロモーター配列を含有 する請求項２または４のいずれかに記載の組換分子。 ９．神経細胞中、遠位に位置する配列の翻訳を惹起するに十分な該配列（５）が 、ＨＳＶ−１ＩＥ４／５プロモーター配列に続くＨＳＶ−１イントロン配列を含 有する請求項２または４のいずれかに記載の組換分子。 １０．神経細胞に発現蛋白を加工させるに十分な該配列（６）がＳＶ４０初期領 域ポリアデニル化部位を含有する請求項２または４のいずれかに記載の組換分子 。 １１．非有糸分裂細胞中で存続し得る請求項１に記載の組換分子。 １２．ｐＨＳＶｌａｃである請求夜１に記載の組換分子。 １３．該挿入遺伝子配列（８）がリソソーム貯蔵疾患、レッシューナイハン症候 群、アミロイド多発性神経障害、アルツハイマーアミロイド、およびデュシェー ヌ筋ジストロフィーからなる群から選択される病気に関連する遺伝子配列である 請求夜４に記載の組換分子。