JPH08501686A - 中枢神経系、特に脳における細胞への外来遺伝子の転移のためのアデノウィルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は中枢神経系の細胞における選択されたヌクレオチド配列の発現及び／又は転写を支配することができ、（ｉ）アデノウィルスのゲノムの中の、通常そのアデノウィルスに感染し得る細胞中にそのアデノウィルスが侵入するのに必要な領域を含む少なくとも一部、及び（ｉｉ）該ゲノム部分中に存在するか、又は挿入され、該細胞中で作用性のプロモーターの制御下でアデノウィルスのゲノムの該部分中に挿入された選択された該ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組み換えＤＮＡベクターに関する。この組み換えベクターは中枢神経系の疾患の処置及び又は遺伝子療法において特別な用途を見いだす。

Description

【発明の詳細な説明】 中枢神経系、特に脳における細胞への外来遺伝子の転移のためのアデノウィルス ベクター 中枢神経系への安全で有効な治療的ＤＮＡの転移は脳疾患における能動的治療 （ａｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の開発における侮り難い挑戦である。 予備的研究が多数のベクター、さらに具体的にはレトロウィルスベクター及び 単純ヘルペス誘導ベクターを用いて行われてきた。しかしこれまで、そのような 遺伝子転移伝達体の有用性は限られてきた。 ほとんどの場合レトロウィルスは、ほとんどの神経細胞を含む分裂終了細胞に 感染できないので、有用ではない（１）。単純ヘルペス誘導ベクターは神経細胞 に感染するが病原性の問題及び遺伝子発現の安定性の問題が未解決で残っている （２，３）。さらに単純ヘルペス誘導ベクターはこれまで、発現の効率が限られ ていることが見いだされている。最も最近の文献（４）において著者等は、用い られたほとんどのプロモーターがウィルス感染の急性の段階のみにしか（感染後 １０日以内）活性でないので、ＨＳＶ−１誘導ベクターを以前に報告した短期発 現と呼んでいる。彼らは通常ウィルスの潜在性付随転写（ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓ ｓｏｃｉａｔｅｄ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）（ＬＡＴ）配列に伴うＬＡＴプロモ ーターの制御下での中枢神経系の細胞におけるｂ−グルクロニダーゼ遺伝子の発 現を開示した。しかし著者等は、彼らの実験が、中枢神経系の細胞における外来 遺伝子の長期発現にＬＡＴプロモーターを用 い、感染細胞における遺伝的酵素の欠陥を修正する可能性を示したが、修正され る細胞が少なすぎるので疾患の表現型を改変できないとも報告している。結局彼 らのベクター系は臨床的に有意な効果を得るのに十分な細胞が修正されるように 改良されることが必要である。 本発明はそのような困難を取り除き、外来遺伝子及び適宜その転写産物又は発 現産物を中枢神経系の細胞、特に末端分化細胞に直接デリバーすることができ、 増殖することができない最も有効なベクター系を提供することを目的とする。本 発明のさらに特定の目的は、そのようなベクター系を感染させるべき神経組織全 体に広く広げ、しかも実質的にそこに制限して残すことでもある。 本発明のさらに別の目的は、そのような細胞又は試験動物におけるクローニン グされた遺伝子の試験管内の研究及び調節を可能にし、遺伝子療法を含むヒト及 び動物における選択的発現産物のその場生産を伴う治療を可能にするのに十分安 全であるベクター系の製造である。 本発明はアデノウィルス誘導ベクター、特に非複製性アデノウィルスベクター が試験管内及び生体内の両方においてこれらの目的を満たすことができるという 認識に基づいている。それらは中枢神経系の細胞、さらに具体的には脳細胞への 遺伝子の強力なデリバリー系を与える。それらは有意な細胞の集団の感染を可能 にするのに十分な大きさの感染度を特徴とする。後述される生物学的実験は、ア デノウィルス誘導ベクター（又はアデノウィルスベクター）が試験管内及び生体 内の両方において有効に神経細胞、特にニューロンに感染できることを示す。 かくして本発明は、選択されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の 転写産物又は発現産物を中枢神経系の細胞、例えば脳細胞、特 に神経細胞、膠細胞又は上衣細胞で標的化させるか又は生産させることを含む方 法において有用な組み換えベクターであって、該組み換えベクターが、通常アデ ノウィルスにより感染可能な細胞中にそのアデノウィルスが侵入するのに必要な 遺伝情報を提供するゲノム領域を包含するアデノウィルスのゲノムの少なくとも 一部を含むアデノウィルスベクターであり、該ヌクレオチド配列が該アデノウィ ルスベクター内に存在するか、又は挿入されたプロモーターの制御下の該ゲノム 部分に挿入されており、そして該プロモーターが該細胞において作用性（ｏｐｅ ｒａｔｉｖｅ）である、前記ベクターの製造方法を提供する。 本発明はさらに特定的には、中枢神経系の細胞における選択されたヌクレオチ ドの発現のためのアデノウィルス誘導ベクターの利用に関する。 本発明は又、中枢神経系の細胞における選択されたヌクレオチド配列の発現及 び／又は転写を支配（ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）できることを特徴とし、（ｉ）アデ ノウィルスが中枢神経系の細胞中に侵入するのに必要な領域を包含するアデノウ ィルスのゲノムの中の、少なくとも一部、及び（ｉｉ）該細胞中で作用性のプロ モーターの制御下の選択された該ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組み 換えＤＮＡベクターを提供する。 生体内で静態（休止）（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）神経細胞中に遺伝子フラグメン トを転移するアデノウィルスベクターの強力な能力は、成体ラットの神経細胞に おいてＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ｌａｃ Ｚ遺伝子又はヒト チロシン ヒドロ キシラーゼ遺伝子を担持するアデノウィルスベクターで行った後述の実験により 具体的に説明される。多数の神経細胞（ニューロン、星状膠細胞、小膠細胞及び 上衣細胞を含む）が種々の 脳領域の接種の少なくとも６０日後にこれらの移植遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ）を発現した。１０μｌ中で最高３ｘ１０⁵ｐｆｕの注入は検出可能な細胞変性 効果を与えず、細胞変性効果は最高の力価の注入（＞１０⁷ｐｆｕ／１０μｌ） の場合のみに観察され、そして注入部位に近い神経細胞におけるウィルス粒子の 完全なエンドサイト−シスを伴うようであった。 さらにアデノウィルスのゲノムを操作して長さが７．５ｋｂか又はそれ以上の 外来遺伝子を順応させることができる。それは広い宿主範囲と人間における低い 病原性を有し、高力価のウィルスを得ることができる（５）。 これらの結果が、アデノウィルスがその高い感染能、長期間の発現、広い宿主 範囲及び低い毒性の故に、ベクターとして神経系の休止細胞を遺伝的に改変する ための新しくて注目するべき手段を与えるという予測を強く支持することは容易 に認識されるであろう。かくしてアデノウィルスはクローニング遺伝子産物の生 理学的及び解剖学的意味における機能の研究における道具となる。（後に示す通 り）海馬への感染能力は、動物における長期間協力作用（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉ ｏｎ）などの統合された（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）現象の研究のために非常に興 味深い。 さらにアデノウィルスは明確に、外来遺伝子を治療的目的を持って脳に転移さ せる有効な手段であるとみなせる。アデノウィルスベクターは神経系の疾患の遺 伝子療法、例えば退化的疾患のための成長因子又は神経伝達物質の局所デリバリ ー、及びより一般的には適当な細胞における欠陥遺伝子の置換のための大きな可 能性を有している。比較的低力価のアデノウィルスベクターは病原的効果を誘発 せずに外来遺伝子を有意な 数の脳細胞に有効に転移させることができる。脳細胞にデリバーするべき外来遺 伝子を含む組み換えアデノウィルスベクター用量の最適化を条件として、それら は多くの遺伝的及び後天的神経疾患の処置における新しい道、結局、薬物処置又 は胎児組織の脳移植の代わりとなる道を開く。 アデノウィルス、特に２型又は５型のアデノウィルス（Ａｄ２又はＡｄ５）が 特に好ましい。それらは比較的安定であり、簡易及び迅速に（約３０時間のウィ ルスサイクル）培養でき、感染細胞当たり最高１０⁴〜１０⁵プラーク形成単位（ ｐ．ｆ．ｕ．）という高い力価を与える。それらは発がん性でない。それらのウ ィルスゲノムの完全配列は確立されており（６）、その分子生物学は広く研究さ れている。最後に、数種の突然変異体、特に大きなフラグメントをその中に挿入 することを可能にする欠失突然変異体が得られている（７）。 本発明で用いる組み換えベクターは、そのゲノムが、通常アデノウィルスが感 染し得る細胞（脳細胞以外）でウィルスの複製に必要なヌクレオチド配列を最早 や含んでいない欠陥アデノウィルスが好ましい。それらはその複製に必要なウィ ルスの他の初期転写単位を活性化する初期Ｅ１ａ領域、ならびに完全に形質転換 された表現型の確立、ウィルス感染の間のＤＮＡ配列の保護に関連しそして後期 のウィルス現象（ｅｖｅｎｔ）の正常な進行に必要なＥ１ｂ領域を初とするＥ１ 領域を有していないのがさらに好ましい。 生体内における細胞性免疫に必要とされ、試験管内の生育には完全に省略でき るＥ３領域がないのも好ましい。 しかし発明において用いる組み換えベクターはアデノウィルス包膜化に必須の 配列をすべて含むのが好ましい。 中枢神経系の細胞内で標的化されるか、又は生産されるべき選択されたポリペ プチドをコードする配列を制御するプロモーターは、組み換えベクターのアデノ ウィルス部分に関して内在性であることも、又は外来性であることもできる。 好ましい同族プロモーターは、そのようなアデノウィルスに感染したヒト又は 動物細胞のポリメラーゼ、特にＲＮＡポリメラーゼＩＩにより認識されると思わ れるいずれかである。特に好ましい内在性プロモーターは２型のヒト アデノウ ィルスの主要後期強プロモーター（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｓｔｒｏｎｇ ｐｒ ｏｍｏｔｅｒ）（ＭＬＰ）である（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ，１９９１）（ ８）。用いることができる他のプロモーターはアデノウィルスのＥ１ａ領域の初 期プロモーターから成る。後者の場合、好ましい欠陥アデノウィルスはその初期 プロモーターに関して通常上流の５’領域を含まない。その場合、神経細胞に導 入しようとするヌクレオチド配列をＥ１Ａ領域と置換する。 アデノウィルスのための内在性プロモーターは異種又は外来性起源の他の普遍 的に存在するプロモーター、例えば： −ラウス肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）の ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）に含まれるプロモーター 又は上記で言及したＬＡＴプロモーター、 −サイトメガロウィルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）のＩＥ 遺伝子のプロモーター、 −誘導ＭＭＴＶプロモーター（マウス乳がんウィルス起源）又はメタロチオネイ ンプロモーター で置換することができる。 他のプロモーターも用いることができる。特にアデノウィルスベクターに挿入 されるヌクレオチド配列が、より特定種類の神経細胞に対してより特異的に標的 とされるべき場合、神経細胞又は膠のプロモーターが特に好ましい。例えば特に 神経伝達物質合成酵素をコードする遺伝子に関与する以下のプロモーターを挙げ る： ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ） ＣＨＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ） ＴＰＨ（トリプトファンヒドロキシラーゼ） ＧＦＡＰ（膠繊維酸性タンパク質） エノラーゼｇ（ニューロンタンパク質マーカー） アルドラーゼＣ。 本発明は又、そのような組み換えベクターの製造法に関しており、その方法は 、その発現が求められているヌクレオチド配列を出発ベクターに挿入し、感染可 能な細胞を該ベクターを用いて形質転換することを含む。ベクターが完全な生存 ウィルスである場合、組み換えウィルスは細胞培養培地から回収される。組み換 えベクターが欠陥ウィルスである場合、好ましい方法は形質転換可能な真核細胞 系（ヒト又は動物起源が好ましい）の形質転換を含み、その細胞系はアデノウィ ルスゲノムの中の、アデノウィルスの複製に必須で該ベクター中に存在しない部 分を補足することができる明確なヌクレオチド配列をそれ自身が含み、それによ って補足配列を該細胞系のゲノムに挿入するのが好ましい細胞系である。 そのような細胞系の好ましい例として、ヒト胚腎臓から誘導されたいわゆる“ ２９３細胞系”を挙げるべきであり、それはＡｄ５ウィルスゲノムの５’領域の 最初の１１％をそのゲノム中に組み込んで含む。Ａｄ ５ゲノムのその部分は、その領域の一部の欠失によりその領域に欠陥がある組み 換えウィルスを適宜補足することができる。欠陥ウィルス製造のためのそのよう な方法は１９８５年１１月２０日出願のヨーロッパ特許第１８５５７３号明細書 にさらに具体的に記載されている。 そのような細胞系の形質転換の後、欠陥組み換えウィルスを増殖し、回収し、 精製する。 言うまでもなく、上記で言及した５’領域以外の領域の欠失の結果としての他 の欠陥アデノウィルスの製造に同一の方法を適用することができ、その場合、そ のような製造で用いられる細胞系はアデノウィルスゲノムから欠失している配列 をそれ自身のゲノム中に含み、それによってそのような欠陥アデノウィルスを補 足することができなければならないと理解される。 かくして本発明は、代謝欠陥又は標的細胞、特に分裂終了ニューロンにおける 欠陥を修正することを目的とした遺伝子療法における、脳の領域への例えば関連 する遺伝子情報を有する胚細胞などの細胞の注入に対する重大な代替え法を初め て提供する。これは、アデノウィルスが有し、対応する欠陥アデノウィルス−誘 導ベクターも保持している重要な感染力、標的とされた神経組織全体に広がるが 、特異的にそこに注入されれば選択された組織内に実質的に制限されて残りもす るその能力、ならびにそのようなアデノウィルスベクターにより神経組織中に運 ばれたヌクレオチド配列の長期間転写、及びほとんどの場合、長期間発現の結果 である。 中枢神経系の細胞に導入することが求められているヌクレオチド配列は、その ような細胞の代謝と相互作用する分子を与えることができるい ずれの配列から成ることもできる。そのような分子は、例えば多くの神経−精神 疾患、てんかんなどにおいて対応する疾患が起因するそのさらなるプロセシング が阻害されなければならない欠陥メッセンジャーＲＮＡと相互作用することがで きる選択されたアンチ−センスＲＮＡ又はアンチ−センスオリゴリボヌクレオチ ドから成ることができる。この方法はアルツハイマー病の処置において特に興味 深いと思われる。アンチ−センス法は、例としてのみ挙げると、老人斑における ｂ−アミロイドペプチドの蓄積を予防するためにｂ−アミロイド前駆体の封鎖（ ｂｌｏｃｋａｄｅ）を誘導するのに用いることができる。別の場合、例えばアル ツハイマー病に関与するＴＡＵタンパク質などのタンパク質の異常なリン酸化に 必要な酵素の発現を阻害することができるアンチ−センスオリゴヌクレオチドを 用いることができる。さらに別の場合、ヌクレオチド配列は、その転写又は発現 の阻害が求められているＤＮＡ又はＲＮＡのプロセシングに通常関与する特定の 結合タンパク質を封鎖することができる配列である。 中枢神経系の細胞への導入を求めることができるヌクレオチド配列は、生物学 的性質を有する発現産物をコードすることもできる。該発現産物は例えば（Ｉ） 対応する欠陥ヌクレオチド配列によりコードされる産物を含む対応する天然の欠 陥ポリペプチドを補うことができるか、又は（２）該標的細胞における対応する 天然の内在性ポリペプチド含有産物の内在性生産の欠如を補うことができるか、 又は（３）感染細胞に新しい治療活性を導入することができるものであることが できる。そのような欠陥ポリペプチド−含有産物の例は神経伝達物質−合成酵素 及び成長因子から成ることができる。例えばパーキンソン病の場合（ドーパミン 作動性細胞の易損性を特徴とする）、チロシンヒドロキシラーゼをコードするｃ ＤＮＡを発現することにより局所的なＤＯＰＡ又はドーパミンの生産を、あるい はドーパミン作動性ニューロンの生存に有利であるＢＤＮＦ（脳誘導神経栄養性 因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）などの成長因子の生産を予期 できる。 同様に不足の神経伝達物質の１つがコリンアセチルトランスフェラーゼにより 合成されるアセチルコリンであるアルツハイマー病の場合、さらにＮＧＦ（神経 成長因子）がコリン作動性ニューロンの退化を防ぐことができる。 おそらく発現して有用な他の因子は、ニューロンの死を防ぐことができるＣＮ ＴＦ（繊毛神経栄養性因子）である。しかしＣＮＴＦは脳において、例えば末梢 神経の破壊（糖尿病患者において誘導されると思われる）の阻害の場合に興味深 い効果も有する。その発現を求めることができる他の栄養因子には、例えばＩＧ Ｆ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）ＮＴ３及びＮＴ５が含まれる。 一般にニューロパシー、卒中、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン 舞踏病、アルツハイマー病及びパーキンソン病、脳性小児麻痺にかかった患者の ニューロン細胞において成長因子を生産させることができる。他の可能性の中で もてんかんを、中枢神経系においてグルタミン酸デカルボキシラーゼの発現の結 果として神経伝達物質ＧＡＢＡを局所的に生産することにより処置することがで きる。 本発明は又、突然変異遺伝子の欠陥又は欠失産物に作用する遺伝病の処置にお いて用いるための組成物の製造に関しても特に興味深い：リソソーム病における リソソーム酵素（例えばテイ・サックス病及びサンド ホフ病におけるヘキソサミニダーゼ、異染型ロイコジストロフィーにおけるアリ ールスルファターゼ、ゴーシェ病におけるグルコセレブロシダーゼ、ムコ多糖体 症におけるｂ−グルクルソロニダーゼ（ｂ−ｇｌｕｃｕｒｓｏｒｏｎｉｄａｓｅ ）、レッシュ・ナイハン病におけるＨＧＰＲＴなど）。遺伝性進行性ニューロン 退化は、アデノウィルスベクターを介した正常な疾患遺伝子の転移により、又は 上記で議論した通り成長因子の局所的生産の誘導により処置することができる。 例えばＣＮＴＦの生産がマウスにおける進行性運動ニューロン（ｐｍｎ）退化を 遅くすることが示され（Ｓｅｎｄｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ １９９ ２；３５８：５０２−５０４）、ラットの先天性網膜栄養失調症における光受容 体退化に対するａＦＧＦの場合に同様のことが観察される（Ｆａｋｔｏｒｏｖｉ ｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ １９９０；３４７：８３−８６）。多くの場 合、及び一定して死に至る筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のような後天性脊髄疾 患は、運動ニューロンを保護することが示されているＣＮＴＦの類似の局所的生 産からおそらく利益を得ることができる。 先天性異常ミエリン形成疾患もミエリン−合成細胞へのアデノウィルス−媒介 遺伝子転移により改善することができる。 最後に、可能性のあるいくつかの他の種類の治療薬をＣＮＳ中に局所的に生産 することができ、例えばがん患者において痛みを減衰させるためにエンケファリ ンを生産することができる。 本発明は又、選択されるべき投与経路、例えば関連する神経組織で得られるウ ィルス懸濁液の直接その場注入（又はあまり好ましくないが、特にアデノウィル スベクターが決められた神経組織又は細胞において選 択的に作用性であるプロモーターも含む場合、一般経路、例えば静脈内経路を介 した）などに適した製薬学的担体と一緒に上記で定義したヌクレオチド配列を含 む組み換えアデノウィルスベクターを含んでなる製薬学的組成物に関する。 本発明は、上記で意図されているアデノウイルスベクターの治療的利用に限ら れない。アデノウィルスベクターはその高い感染性の故に、神経細胞の決められ た集団に関する試験管内アッセイにおいて、例えば該神経細胞のポリメラーゼに より認識されるプロモーターの容量の研究のために（その場合、適した“マーカ ー”、例えばｂ−ｇａｌにカップリングさせる）用いることもできる。別の場合 そのようなアデノウィルスベクターを、神経細胞又はもっと複雑な神経組織のあ る集団との相互作用組み換えウィルス（そのような細胞において作用性のプロモ ーターの制御下におけるヌクレオチド配列により発現される）の検出又は評価に 用いることもできる。例えば評価又は検出は、より複雑な組織におけるウィルス に関するレセプターを有する細胞の位置決定を目的とすることができる。検出は いずれの適した古典的標識法も用いることができ、例えば分析されるヌクレオチ ド配列の発現産物の検出のための標識抗体を用いることができる。これらの評価 の展望は神経解剖学の分野において考慮することができる。 本発明の組み換えベクターは、選択されたポリペプチドをコードするヌクレオ チド配列の転写産物又は発現産物を、動物の中枢神経系の細胞、例えば脳及び脊 髄細胞、特に神経、膠細胞又は上衣細胞において標的化させるか、又は生産させ 、該動物において該転写産物又は該発現産物によって誘導されて得られた生理学 的又は行動的改変を検出することを含 む方法においても有用である。 例えば海馬においてアセチルコリンが枯渇する隔海馬トラック（ｓｅｐｔｏｈ ｉｐｐｏｃａｍｐｉｃ ｔｒａｃｋ）の障害の場合、海馬におけるコリンアセチ ルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をコードする遺伝子の転移の効果を研究する ことができる。コリン性繊維（障害により切断）の標的コアにおけるその遺伝子 の導入は、利用できるアセチルコリンの量の再増加を誘引し、結局欠陥（ｄｅｆ ｉｃｉｔ）を修正することができる。この欠陥は記憶の行動試験により評価する ことができる。例えば“水泳プール”に投げられたマウスは、水から逃げられる プラットホームを再発見することを学ぶことができる（Ｍｏｒｒｉｓ水泳プール ）。しかし隔海馬トラックが悪化している動物はその操作において非常に不利で ある。従って遺伝子発現の結果として生産されるアセチルコリンの増加の検出は 、動物がプラットホームを再発見する容易さにより認識することができる。 別の実施例に従うと本発明は、特に間脳のドーパミン作動性コア（黒質）の障 害の際に、線条体の除神経によって起こる運動行動の問題の補償の程度の分析を 可能にする。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードする遺伝子を線条体に 導入するとこの欠陥が修正される。補償は回転試験におけるラットの行動の研究 により評価することができる：片側のみが損傷を受けた動物はアポモルフィンの 注入を受けると繰り返して回転する（１分当たり１０回転以上）。ドーパミンの 生産（ＴＨ遺伝子の導入に関連した）はその行動試験において認めることができ る。 さらに他の実施例に従うと、本発明は他の場合の電気生理学的及び行動的研究 を可能にする。例えば侵害剌激に結合した情報を伝達する脊髄 の背角（ｄｏｒｓａｌ ｈｏｒｎ）（ペインチャンネル（Ｐａｉｎ ｃｈａｎｎ ｅｌ））のニューロンはその活性を低下させるモルフィンに敏感である。脊髄に おけるエンドモルフィンをコードする遺伝子の導入は、モルフィンと同様にこれ らの細胞に作用するこの物質の分泌を誘発することができる。そのような作用は 行動試験（侵害剌激に対する動物の反応の閾値）、ならびに脊髄のニューロン自 身に関する電気生理学的研究により評価することができる。これらの細胞の活性 の記録により、転移された遺伝子の発現により誘導されたモジュレーション（ｍ ｏｄｕｌａｔｉｏｎ）の存在が認められる。 本発明により与えられる可能性を多くのアッセイの説明によりさらに例示する が、それは制限的なものではなく、アッセイは本明細書に添付する図によりその 一部が裏付けられている。特にＡｄ．ＲＳＶｂｇａｌは、注入部位における細胞 のゴルジ−様染色を与えることにより、脳の特定の領域のニューロン及び膠形態 を分析するための興味が持たれる手段であると思われる。酵素による軸索のファ イリングアップ（ｆｉｌｉｎｇ ｕｐ）はさらに、別個のニューロン集団の突起 の分析の方法を与えることができる。逆に、末端によるウィルスの吸収及び続く ニューロン細胞体への逆行的輸送は、特定の脳領域への輸入の方向の追跡を可能 にする。 神経解剖学のためのこの方法の１つの主要な利点は、Ｘ−ｇａｌ染色とすべて の種類の他の標識法、特に免疫細胞化学の容易な組み合わせである。ｎｌｓ配列 が省略されたベクターの使用は、そのような方法の効率を向上させ得る。 同様にアデノウィルスベクターは、種々の神経細胞集団に関し、ＲＳ Ｖ ＬＴＲプロモーターと置換した他のプロモーターの作用の研究の基礎を与え る。アッセイ１： ラウス肉腫ウィルス長末端反復（ＲＳＶ ＬＴＲ）プロモーターにより駆動さ れる核標的（ｎｕｃｌｅａｒｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ）ｂ−ガラクトシダーゼ（ ｂ−ｇａｌ）を発現する複製欠陥アデノウィルス（Ａｄ．ＲＳＶｂ−ｇａｌ）を 用いた（９）。該ベクターにおけるＳＶ４０ｎｌｓ（核局在化シグナル）はベク ターに細胞の核を標的とさせた。このベクターの、上部頚管神経節（ｓｕｐｅｒ ｉｏｒ ｃｅｒｖｉｃａｌｇａｎｇｌｉａ）（ＳＣＧ）の交感神経ニューロン及 び星状膠細胞の一次培養物に対する感染能を調べた。ｂ−ｇａｌ活性は、色素源 基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシダー ゼ（Ｘ−ｇａｌ）を用いて組織化学的に視覚化した（１０）。抗分裂剤の存在下 で培養したＳＣＧは、ニューロンの純粋で均一な試料を得る簡便な手段を与える （１１）。 さらに特定的には、アデノウィルスＡｄ．ＲＳＶｂ−ｇａｌの接種後の培養交 感神経ニューロン及び星状膠細胞におけるｂ−ｇａｌの発現は、以下の通りに行 った： ＳＣＧを２日令のＷｉｓｔａｒラットから取り出し、解離し、１６ｍｍのコラ ーゲン−塗布皿上で平板化し、（１１）に記載の通りに培養した。培養の第１週 の間にシトシン アラビノフラノシド（１０μＭ）を加え、神経節の非−ニュー ロン細胞の増殖を妨げた。培養中の６日後に、培養培地中の１０⁶プラーク形成 単位（ｐｆｕ）のＡｄ．ＲＳＶｂ−ｇａｌを細胞に接種するか、又は標準として 培養培地のみに細胞を暴露し た。２４時間後、ウィルスを除去し、細胞を培養培地中で２日間保持した。細胞 を洗浄し、パラホルムアルデヒドを用いて固定し、次いで組織化学的染色（１０ ）によりｂ−ｇａｌ活性を明らかにした。 培養の６日後、以下の観察を行った：視覚によりすべての細胞はｂ−ｇａｌ陽 性であり、毒性効果又は形態学的変化は現われなかった。平行して得た非−接種 培養物に染色反応を行うと、陽性に標識された細胞は検出されなかった。 星状膠細胞が濃縮されたラット海馬組織の一次培養物に感染するアデノウィル スの能力も調べた。接種により細胞の約３分の２において青色核染色が生じた。 ｂ−ｇａｌ陽性細胞を星状膠細胞とする同定は、膠繊維酸性タンパク質（ＧＦＡ Ｐ）に対する抗体で追加の染色を行うことにより確認した。 さらに具体的には、アッセイは以下の通りに行った。一次濃縮星状膠細胞培養 を、他所に記載の通り（１２）新生ラット海馬組織から確立した。細胞を直径が ３５ｍｍのプラスチック皿において平板化し、補足Ｄｕｂｅｌｃｃｏ修正Ｅａｇ ｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で５日間生育した。 次いで各皿に２μｌのアデノウィルス溶液（力価１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ）を２４時 間接種した。洗浄及びパラホルムアルデヒド固定の後、ｂ−ｇａｌを発現する細 胞をＸ−ｇａｌ組織化学を用いて特性化した。２つの標識の重なりが観察された （示していない）。アッセイ２： アデノウィルスが生体内で脳細胞に感染する可能性を多くの特徴的構造におい て評価した。 １７の雄のＷｉｓｔａｒラット（１０週令）の海馬又は黒質に深い麻 酔下で、１０¹⁰プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌの非常に精製されたウィルス を含む１〜５μｌの培地を定位固定的に（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃａｌｌｙ） 注入した。接種後１、２、３、５、７、３０及び６０日に動物を犠牲にした。陽 性細胞におけるｂ−ｇａｌ活性をＸ−ｇａｌ基質及び、タンパク質に対する抗体 （抗体はｂ−ｇａｌに対するアフィニティー精製ウサギＩｇＧ画分（Ｃａｐｐｅ ｌ，１：８００希釈）であり、次いで色素源としてジアミノ−ベンジジンを有し 、ニッケルで強化されたストレプトマビジンービオチニル化パーオキシダーゼ錯 体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と結合される）の両方を用いて組織化学的に検出した。 後者の方法がより感度が高く、いくつかの場合には転移遺伝子の高い発現による 微細細胞質突起におけるｂ−ｇａｌを明らかにした。 注入された動物はすべて高度のｂ−ｇａｌ活性を示した。発現は接種後２４時 間もの早期に検出され、２カ月後に分析した動物において存続した。ウィルスの 拡散は黒質より海馬において大きく、背部海馬（ｄｏｒｓａｌ ｈｉｐｐｏｃａ ｍｐｕｓ）全体に広がった。黒質の場合、感染の全体的パターンはより制限され 、中−横方向（ｍｅｄｉｏ−ｌａｔｅｒａｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に沿っ て分布した。この差はウィルスが海馬組織、及び歯牙状頭回（ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ）の顆粒球細胞層と回りの組織の境界などの接着性の低い組織を通っ て広がるという傾向を反映していると思われる。 海馬の場合、感染面積の広さは投与されたウィルス溶液の体積と関連していた 。典型的に、海馬接種の後３〜７日で犠牲にしたラットの場合、感染面積は３〜 ５μｌの注入ウィルス（１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌ）に対して１〜４ｍｍ³の範囲であ った。興味深いことに、時間を経て海馬切片を 注意深く調べると標識のパターンの変化が明らかになった。接種後の第１週以内 では小さな差しか見られなかったが、１カ月後に標識細胞の分布における顕著な 改造が観察された。この新しいパターンは２カ月後に保持されていた。この長期 間パターンにおいて、ｂ−ｇａｌ陽性細胞の分布はあまり拡散せず、標識は限定 された細胞層に制限されていると思われた。 感染動物において細胞毒性効果は観察されないようであった。すべてが顕著な 行動的異常なしで接種に耐えて生存した。ウィルス−感染脳を調べると、側脳室 の拡大も構造上正常な細胞構造の破壊もないことが明らかにされた。唯一の顕著 な変化は局所的組織壊死及び反応性グリオーシスであり、それは注入部位に限ら れていた。生理食塩水を注入した動物において類似の効果が観察されるので、こ の現象は大部分注入自体によるものであった。最後に、Ｎｉｓｓｌ染色を用いた 細胞レベルにおける海馬切片の分析は、錐休細胞層又は歯牙状頭回の顆粒球細胞 層内で細胞の損失も細胞溶解の証拠も示さなかった。アッセイ３： 前記の結果はアデノウィルスが脳細胞に感染できることを確証している。以下 の実験はニューロンが生体内で感染し得ることをさらに具体的に確証する。 膠細胞型及びニューロン細胞型に、アデノウィルスＡｄ．ＲＳＶｂ−ｇａｌを 直接生体内接種により感染させた。小膠細胞におけるｂ−ｇａｌ発現は、免疫組 織化学的検出によると、犠牲にする５日前に海馬内注入を受けたラットの注入部 位近辺において行われた。免疫組織化学的反応はニッケルで強化したパーオキシ ダーゼ及びフルオレセイン結合二次 抗体を用いて行った。 注入の直後に多くのｂ−ｇａｌ陽性細胞は小膠細胞に典型的な形態を示した。 これらの小細胞は細胞体から放射状に延びる微細な、高度に分枝した突起を示し た。小膠細胞は１週目までｂ−ｇａｌ発現細胞の大きな割合を占めていたが、そ の数は感染後の長期間において激減した。初期の時点の間に検出された他の感染 細胞はＸ−ｇａｌ基質及び星状膠繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体 を用いた二重染色により星状膠細胞であることが示された（データは示していな い）。 感染細胞のいくらかがニューロンであるという強い証拠が、注入された両方の 脳構造において確立された。黒質の場合、ドーパミン性細胞中のｂ−ｇａｌの存 在はカテコールアミン性ニューロンの古典的なマーカーであるチロシンヒドロキ シラーゼ（ＴＨ）に対する抗体を用いて実証された。高い倍率により、ＴＨ抗体 で標識された細胞が青色核（ｂｌｕｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）も示すことが明らかに された。これらの細胞は感染ドーパミン性細胞領域内のｂ−ｇａｌ陽性細胞の約 ５０％にのぼる。海馬の場合、多数の標識細胞が形態学的及び解剖学的特徴の両 方に基づいてニューロンであると明確に同定された（図１）。いくらかの細胞で は染色により、酵素の多量の発現から生じたｂ−ｇａｌの拡散の故のゴルジ−様 プロファイルが明らかにされた。このパターンはほとんどが４８時間〜１週間で 観察された。錐体ニューロン、顆粒球細胞及び門介在ニューロンが錐体細胞層Ｃ Ａ１、顆粒球細胞層及び歯牙状頭回の門で見られた。これらの後者の細胞は、別 個に分離し、積層した細胞サブグループから成る海馬の特徴的は細胞構造の故に 容易に同定することができる。時々染色された長い突起が細胞体から４００μｍ 以上の距離で観察 され、これらの細胞のニューロン性を確証した。さらに巨大静脈瘤様腫脹を有す る数個のセグメントが門を通って移動するのが見られ、苔状繊維も標識されたこ とを示した。 上記で指摘した通り、接種の１又は２カ月後に犠牲にしたすべてのラットにお いて、陽性ｂ−ｇａｌ細胞の分布及び数は初期の時点で観察されたものと顕著に 異なる。ｂ−ｇａｌ陽性細胞の分布を、Ａｄ．ＲＳＶｂ−ｇａｌアデノウィルス 接種の１カ月後に歯牙状頭回においてＸ−ｇａｌ組織化学を用いて評価した。青 標識細胞は非注入の逆の横側と比較して注入された海馬の左の歯牙状頭回に濃縮 されていることが見いだされた（図２、目盛り棒１ｍｍ）。感染細胞の歯牙状頭 回局在化は、免疫組織化学的ｂ−ｇａｌ検出（パーオキシダーゼ及びニッケルを 用いて染色）によって確証された。高倍率（４０ｘ）の図は、歯牙状頭回の顆粒 球細胞層において多数、及び密に充填されたｂ−ｇａｌ標識細胞核を示している （図３、目盛り棒３００μｍ）。 接種後の短時間に高度に感染した分子層にはこの時点で染色細胞はなかった。 クレシルバイオレットを用いて対比染色した切片において検出された通り（デー タは示していない）、ｂ−ｇａｌ陽性細胞は顆粒球層の細胞と共存しており、ほ とんどの籠細胞及び数個の膠細胞を含む層の最も内側の部分には陽性細胞が見ら れなかった。２カ月後に犠牲にしたラットにおける青色染色は顆粒球細胞層のみ に濃縮されていた。アッセイ４： アデノウィルスによる高度の神経細胞感染性を後述する実験の結果によりさら に示す。 方法： ＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウィルスベクターを以前に記載された方法（５） に従って製造した。１３の成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒ ｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｆｒａｎｃｅ）を抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ腹腔 内）を用いて麻酔し、定位固定装置に置いた。１ｍｌ当たり３．３ｘ１０¹⁰〜１ ０¹¹プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含むウィルス懸濁液をＨａｍｉｌｔｏｎシリ ンジを用いて１０分かけ、第ＸＩＩ核（ＸＩＩｔｈ ｎｕｃｌｅｕｓ）（ｎ＝６ ）又は前脳の種々の領域（ｎ＝７）に注入した（１０μｌ、合計注入量：３．３ ｘ１０⁸〜１０⁹ｐｆｕ）。４日の生存時間の後、ラットを再麻酔し、リン酸塩緩 衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドを経心臓潅流した 。中枢神経系を取り出し、４時間、後固定し、次いで３０％スクロース中で終夜 凍結保護した。矢印様（ｐａｒａｓａｇｉｔｔａｌ）切片（厚さ−４８μｍ）を クリオスタット上で切断した。４番目の切片毎に以前に記載された通り（１０） 、Ｘ−ｇａｌ染色して２８〜３０℃で４〜１２時間インキュベートした。３ラッ トにおいてＸ−ｇａｌ処理切片をリン酸塩緩衝液中で濯ぎ、次いでＶｅｃｔａｓ ｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）を用いた古典的免疫組織化学的方法 により、ＧＦＡＰ（１／５００）に対して誘起されたウサギポリクローナル抗体 又はラット中枢神経系の小膠細胞を特異的に染色するマウスモノクローナル抗体 ＯＸ−４２（１／１２００）を用いてさらに処理した。次いで切片をゼラチン化 スライド上に載せ、すべての他の切片をトルエンからの最終的カバースリップの 前にクレシルバイオレットを用いて対比染色した。 図４は上記の該アデノウィルス注入の後にラット脳の種々の細胞集団 におけるｂ−ガラクトシダーゼ組織化学的染色 ａ．及びｂ．第１２神経（ＸＩ Ｉ）の核中への注入の後に観察された標識を示す顕微鏡写真を提示している。実 際に第ＸＩＩ核のすべてのニューロンが感染し、染色は軸索（ａ．における矢印 ）を含むすべてのニューロン突起で延び、細胞の“ゴルジ−様”外観を与えてい る。感染細胞のいくつかはＧＦＡＰ（膠繊維酸性タンパク質）に関する免疫反応 性を示す褐色の反応生成物により星状膠細胞（矢印の先）であると同定すること ができる。ｄ、心室内注入に続く上衣細胞（ｅｐ）の染色。ａ、ｂ及びｄにおけ る切片はクレシルバイオレットを用いて対比染色した。 以下の観察を行った。 動物の健康及び行動に対するこの接種の大きな悪影響は接種後の最高６０日間 （研究の最長時間）観察されなかった。すべての場合に多数の細胞が組織化学的 に染色された。ニューロン（図４ａ、ｂ）及び星状膠細胞（図４ｃ）又は小膠細 胞（示していない）と同定された膠細胞を含む神経細胞が、特異的細胞化学的マ ーカーを用いて二重染色実験において感染していた。注入が心室系を目的とした 場合、豊富な上衣細胞が遺伝子を発現した（図４ｄ）。 脳実質組織の場合、標識細胞はほとんどが針の跡から５００〜１０００μｍ以 内に見いだされた。感染細胞を含む領域の境界は、大きな繊維の進路（ｌａｒｇ ｅ ｆｉｂｅｒ ｔｒａｃｔｓ）又はラメラなどの解剖学的境界と関連する傾向 があった。例えば第ＸＩＩ神経の核を目的とした注入は（図４ａ、ｂ）、核内の すべてのニューロンを事実上完全に強く染色したが、回りの領域は感染細胞が散 乱しているのみであった。同様に、注入された上衣細胞は心室内注入の後、数ミ リメーターにわたっ て観察されたが、隣接する神経組織は染色細胞を含まなかった（図４ｄ）。従っ て注入部位におけるｂ−ガラクトシダーゼ発現細胞のトポグラフィーは組織内の ウィルス粒子の限られた広がりに対応し、大きな繊維の進路又は膠制限物（ｇｌ ｉａ ｌｉｍｉｔａｎｓ）などの解剖学的境界がその拡散を妨げていると思われ る。アッセイ５： 核周部のレベルにおけるウィルス粒子のエンドサイト−シスがあると思われる 針の跡の回りで標識された細胞の他に、注入の領域に軸索突起を出している隔た った群のニューロン、例えば黒質ニューロン（ｎｉｇｒａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ） を線条体中への注入の後に標識した（図５ｂ）。 実際に図６は線条体中へのアデノウィルス注入の後のｂ−ガラクトシダーゼ組 織化学的染色を示す顕微鏡写真を提示している。方法はアッセイ４と同様であっ た。ａ．注入部位の周辺における細胞中の反応生成物。反応生成物はほとんど核 −核周領域にあり、強度は極弱（矢印の先）から強までの範囲であり、線条体か らウィルスベクターを逆行的に輸送した黒質（ＳＮ）及び腹面被蓋領域（ｖｅｎ ｔｒａｌ ｔｅｇｍｅｎｔａｌ ａｒｅａ）（ＶＴＡ）のニューロン中に延びて いる。ｘ２０ 黒質細胞における染色の核−核周局在化、ならびに黒質−線条体軸索経路にお ける豊富な染色の欠如は、酵素でなくてウィルス粒子が軸索末端で吸収され、線 条体から黒質に逆行的に輸送されたことを示している。対照的に、注入部位を横 切る（しかし中で終わっていない）軸索を有するニューロンの場合は組織化学的 染色は観察されず、ウィルス粒子に対する通過する軸索によるエンドサイト−シ スが行われないことを示す。アッセイ６： これらの上記の結果は、アデノウィルスによる神経細胞の高度の感染性を強調 している。これは以下の通りに行われたアッセイにおいても示された： 方法：３．３ｘ１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの懸濁液を直接、又は１０ラットの脳中に注 入する前に無菌の塩類溶液を用いて希釈して用いた。他の方法は、切片を冠状平 面（ｃｏｒｏｎａｌ ｐｌａｎｅ）で切断する以外はアッセイ４に記載の通りで ある。 種々の希釈におけるアデノウィルス懸濁液を視床中に注入してから１週間後に 得た結果を示す顕微鏡写真（切片はクレシルバイオレットを用いて対比染色）。 ａ．１ｍｌ当たり３．３ｘ１０¹⁰ｐｆｕのウィルス懸濁液を１０μｌ（合計：３ ．３ｘ１０⁸ｐｆｕ）注入した後に観察された細胞溶解効果。組織喪失領域及び 神経膠症（ｇｌｉｏｔｉｃ）領域（矢印はウィルス注入により起きた細胞死を明 示している。ｘ２０。（切片はＸ−ｇａｌで処理せず）。ｂ．合計３．３ｘ１０⁵ ｐｆｕの注入の後の染色。数千の細胞がまだ遺伝子を発現しており、数個の短 かい神経突起（矢印の先）以外はほとんど核−核周染色を示す。顕著な細胞溶解 効果はなかった。ｘ２００。ｃ．３．３ｘ１０³ｐｆｕの注入後の染色。数個の 細胞が針の先の跡に対応する小さい領域でまだ遺伝子を発現した（矢印の先）。 細胞溶解効果はみられなかった。ｘ４００。 高力価のウィルス懸濁液を用いた接種の後、かなりの数の細胞が感染したが、 多くの細胞はずっと低力価を用いた場合も感染した。３．３ｘ１０⁷ｐｆｕ／ｍ ｌの力価の懸濁液１０μｌ（最高の３．３ｘ１０⁵感染粒子）を用いて注入した ラットの場合、接種の８日後もまだ数千の神経細胞が１ａｃＺ遺伝子を発現した （図６ｂ）。３，３００ｐｆｕもの低 い力価の注入は百に近い細胞の標識を生じた（図６ｃ）。標識の強度は神経細胞 の鋭敏な感染性のもう１つの指標であった。高力価のウィルス懸濁液を用いた場 合（１０⁹ｐｆｕ／ｍｌ以上）、通常染色強度は、細胞が最高のウィルス粒子濃 度に供される注入部位の中心領域で非常に強い。ｂ−ガラクトシダーゼに加えら れたｎ１ｓ配列にもかかわらず、標識は非常に強く、各細胞の核に制限されずに 細胞質及び突起（例えばニューロンの樹状突起及び軸索）に拡散し、細胞の完全 な“ゴルジ−様”染色を与える（図６ａ、ｂ及び図５ａ）。対照的に注入部位の 周辺に位置するほとんどの細胞及び逆行的に感染した細胞の場合、核のみが標識 された（図５ａ、ｂ）。同様に低力価ウィルス懸濁液を用いた場合、酵素の核局 在が原則であった。 かくして１つの神経細胞、特にニューロンは大量のウィルス粒子をエドサイト ーシスすることができる。この高い感染性は、高力価懸濁液の注入の部位で観察 された細胞変性性（ニューロン死、グリオーシス、血管炎症反応及び組織喪失を 特徴とする）を最も良く説明していると思われる（図６ａ）。低力価ウィルス懸 濁液（≦１０⁷ｐｆｕ／ｍｌ）の場合に見掛けの細胞変性性が不在であるのはこ の仮定を支持している。従って細胞変性性は注入部位の近くに位置する細胞によ る膨大な数のウィルス粒子のエンドサイトーシスに関連すると思われる。アッセイ７： ｌａｃＺ遺伝子を発現する十分に保存された神経細胞は接種後４５日にまだ観 察されるので、アデノウィルス感染は明確に、組織的（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａ ｌｌｙ）細胞変性性ではない（図７）。９匹のラットに注入し、注入後隔週毎に 犠牲にした（ｎ＝３）。切片を冠状平面で切 断する以外は外科手術及び組織学的方法は図４に記載の通りであった。顕微鏡写 真は第ＸＩＩ神経（ＸＩＩ）の核中にアデノウィルスを注入した後４５日間生存 させたラットにおけるｂ−ガラクトシダーゼ組織化学的反応生成物を示す。核− 核周組織化学的染色により示される通り、数個の細胞はまだ遺伝子を発現した。 挿入図に例示される通り、それらの中には運動ニューロンがあった（クレシルバ イオレットを用いて対比染色）。数個の軸索も酵素を含んだ（矢印）。ｘ４０・ 挿入図ｘ１０００。 これらの結果はニューロンを初めとする中枢神経系の細胞を、複製欠陥アデノ ウィルスを成功裏に多数感染させることができ、その結果転移された外来遺伝子 を発現させることに成功できることを示している。 かくして遺伝子療法への衝撃は注目すべきである。上記の通り本発明は、細胞 が遺伝子欠陥を有している患者において、該遺伝子欠陥を補う目的で核酸配列を 含む全神経細胞を、特に胚から移植することの代替え法を提供することを目的と しているが、本発明はさらにそのような移植法の改良において用途を見いだすこ とができると理解するべきである。 特に移植されるべき細胞に、細胞療法ですでに用いられている方法に従って移植 する前に、必要な核酸配列を含むアデノウィルスベクターを用いて試験管内形質 転換することによりその核酸配列を濃縮するか、又は与えることができる。この 改良は分裂を行わないニューロンの一次培養の場合に特に重要であり得る。アッセイ８： この実施例はヒト チロシン ヒドロキシラーゼ（ｈＴＨ）ｃＤＮＡを発現す る組み換え欠陥アデノウィルスベクター：ＡｄＬＴＲ．ｈＴＨの構築を開示する 。 アデノウィルスＡｄＬＴＲ，ｈＴＨは、２９３細胞におけるプラスミドｐＬＴ Ｒ−ＩＸ−ｈＴＨとアデノウィルス欠失突然変異体Ａｄ−ｄｌ１３２４（Ｔｈｉ ｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３１（１９８２）５４３）のコト ランスフェクションにより構築した。 １．プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ｈＴＨの構築 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ｈＴＨは、ｈＴＨ−１ ｃＤＮＡを含むｐＳＰ６ ＨＴＨ−１（Ｈｏｒｅｌｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５ １（１９８８）６５２）の１７６９ｂｐ ＳａｌＩ−ＢｓｔＸＩフラグメントを プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸのユニークＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶ部位の間、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーターに関して下流に挿入することにより構築した。その挿入の ために、ＢｓｔＸＩ制限部位をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端に変 換した。 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸはプラスミドｐＬＴＲβｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒ ｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９ ０（１９９２）６２６）から、βｇａｌ遺伝子を有するＣｌａＩ−Ｘｈｏｌフラ グメントの欠失、クレノウ酵素を用いた消化及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用 いた連結により得た。 ２．欠陥組み換えアデノウィルスＡｄＬＴＲ．ｈＴＨの構築 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ｈＴＨ及びアデノウィルス欠失突然変異体Ａｄ− ｄｌ１３２４をＣｌａＩを用いて線状化し、リン酸カルシウムの存在下で細胞系 ２９３中にコトランスフェクトし、相同的組み換えを可能にした。組み換えの後 、アデノウィルスを選択し、２９３細胞系上で増幅し、塩化セリウム上の遠心に より回収した（Ｇｒａｈａｍ ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７３ ）４５６）。アッセイ９： この実施例はアデノウィルスＡｄＬＴＲ．ｈＴＨを用いたｈＴＨの試験管内及 び生体内生産を開示する。 ９．１．ｈＴＨの試験管内生産 アッセイ８で開示されたアデノウィルス組み換えベクターＡｄ．ＬＴＲ．ｈＴ Ｈを用い、２９３細胞系に感染させ、感染の後２４〜４８時間で培養物の遠心に より細胞ペレットを回収した（１０００ｒ／分、５分）。細胞ペレットをＴＨ酵 素活性の試験管内放射線量の判定（ａ）及びウェスタン分析（ｂ）に用いた。 （ａ）ＴＨ酵素活性の放射線量 Ｒｅｉｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３９（１９８６）２１ ８５）から修正した方法を用いてＴＨ酵素活性を分析した。凍結細胞ペレットを 氷冷した０．２％／１００ｍＭ Ｎａ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ６．９９中で３０秒間 音波処理し、遠心した（１０，０００ｘｇ、１０分間）。上澄み液の一部（１０ μｌ）を用い、１００μｌの反応媒体（１００ｍＭ Ｎａ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６ ．９９、カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）５０μｇ、２５μＭ Ｌ−チロシン（遊離の 塩基、Ｓｉｇｍａ）及び０．２μＣｉ Ｌ−［３，５−³Ｈ］チロシン（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ）、１ｍＭ ＦｅＳＯ₄、０．５ｍＭ ＤＬ−６−メチル−５，６， ７，８−テトラヒドロプテリン、５ｍＭ ジチオトレイトール）中でインキュベ ートする間に（１０分間、３７℃）Ｌ−［３，５−³Ｈ］チロシンから形成され る³Ｈ₂Ｏの量を測定することによりＴＨ活性を分析した。１Ｍ ＨＣｌ中の７． ５％（ｗ／ｖ）の活性炭（活性化、Ｓｉｇｍａ）を１ｍｌ加えることにより反応 を停止した。次いで混合物を渦動させ（３ 秒）、遠心した（１０，０００ｘｇ、１０分間）。次いで上澄み液のアリコート （１００μｌ）を１０ｍｌのシンチレーションカクテル（シンチレーションカウ ント水溶液、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含むシンチレーションびんに移し、形成され た³Ｈ₂Ｏの量を測定した。Ｌ−チロシン原液の調製のために、Ｌ−［３，５−³ Ｈ］チロシンを最初に迅速−真空乾燥して汚染³Ｈ₂Ｏを除去してから５００μｌ の冷Ｌ−チロシン５００μＭを加えた。結果を１時間当たりにタンパク質１ｍｇ 当たりで［³Ｈ］チロシン加水分解により形成される³Ｈ₂Ｏのピコモルで表す。 タンパク質の定量はＢｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．の方法に従って行った。 このアッセイはＡｄ．ＬＴＲ．ｈＴＨに感染した２９３細胞が５μモルのＤＯ ＰＡ／時／ｍｇタンパク質を形成することができるＴＨ活性を与えるが、非感染 ２９３細胞はＴＨ活性を与えないことを示す。 （ｂ）ウェスタン分析 タンパク質抽出物をＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動ゲル（１０％アクリルアミド） 上に置き、タンパク質を移動させ、ニトロセルロース膜上にタンパク質を転移さ せることによりウエスタン分析を行った。次いでニトロセルロース膜を、２％ ＮＳ／０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で１：１０００に 希釈した抗−ＴＨ血清（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｂｏｙ）と共に４ ℃で４８時間インキュベートした。３回濯いだ後、膜をＰＢＳ／０．０５％ Ｔ ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／２％ ＮＳ中で１：５０に希釈したブタ−抗−ウサギ ＩｇＧ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で２．５時間インキュベート した。さらに３回濯いだ後、それらをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ− １００中で１：１００に希釈したウサギパーオキシダーゼ− 抗−パーオキシダーゼ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）中でインキュベートした。それら を３，４−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）及び過酸化水素で染色し、顕微鏡 分析のためにスライドに固定した。 Ａｄ．ＬＴＲ．ｈＴＨに感染した２９３細胞の場合、抗−ＴＨ抗体はＴＨの分 子量に対応する６２ｋＤａバンドを現したが、非感染２９３細胞ではバンドが検 出されない。 ９．２．ｈＴＨの生体内生産 すべての実験で若い成体の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ＡＬＡＢ ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。６−ＯＨＤＡをエクイテシン 麻酔下で１２ラットの右上行性中線条体（ｒｉｇｈｔ ａｓｃｅｎｄｉｎｇ ｍ ｅｓｏｓｔｒｉａｔａｌ）ＤＡ経路中に定位固定的に注入した（３ｍｌ／ｋｇ、 腹腔内）。 アポモルフィン又はｄ−アンフェタミンの投与の後、６−ＯＨＤＡ障害に続く １０日間、回転行動を最初に監視した。運動非対称性をｄ−アンフェタミンの注 入（５ｍｇ／ｋｇＮ腹腔内）又はアポモルフィンヒドロクロリドの注入（０．０ ５ｍｇ／ｋｇ、首における皮下）に続く４０分間、自動化ロトメーターボール（ Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔ ａｎｄ Ａｒｂｕｔｈｎｏｔｔ，１９７０）で監視した 。６−ＯＨＤＡ障害に続く１１日間、組み換えアデノウィルスベクターＡｄ．Ｌ ＴＲ．ｈＴＨ（６ラット）又はＡｄＲＳＶβＧａｌ（６ラット、標準として）の 線条体内注入を３つの異なる部位で行った（各注入の場合に３μｌ中で１０⁷ｐ ｆｕ）。回転行動（前に開示した通りに行った）及び組織学的分析を２０日目及 び２７日目に行った。得られた結果は以下を示している： −Ａｄ．ＬＴＲ．ｈＴＨはラットにおいて毒性効果を誘起しなかった （ドーパミンレセプターはまだ機能性であった） −Ａｄ．ＬＴＲ．ｈＴＨ注入ラットはＴＨタンパク質を生産したことが免疫学 的反応性により示された：脳を２０％スクロース、１００ｍＭ リン酸カルシウム（ｐＨ７．４）中に１〜２日間沈め、次いで凍結ミクロトー ム上で４０μｍの厚さで切片にした。３番目の切片毎にクレシルバイオレットで 染色し、隣接する切片を以前に記載された通り（Ｄｏｕｃｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９０）ＴＨ免疫細胞化学用に加工した。簡単に記載すると、リン酸塩緩衝塩 類溶液（ＰＢＳ）で３〜４回濯いだ後、自由−浮遊切片を１０％正常ブタ血清（ ＮＳＳ）、ＰＢＳ中０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００において１時間予備イ ンキュベートし、次いでそれらを５％ ＮＳＳＮ ０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −１００を含むＰＢＳ中で１：１０００に希釈した抗−ＴＨ血清（Ｉｎｓｔｉｔ ｕｔ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｂｏｙ）と共にインキュベートした。３回濯いだ後、切 片をＰＢＳ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％ ＮＳＳ中で１：５０ に希釈したブタ−抗−ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中 で２．５時間インキュベートした。さらに３回濯いだ後、それらをＰＢＳ、０． ５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で１：１００に希釈したウサギパーオキシダ ーゼ−抗−パーオキシダーゼ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）中でインキュベートし、３ ，４−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）及び過酸化水素で処理し、スライドに 固定した。 −Ａｄ．ＬＴＲ．ｈＴＨ注入ラットはより優れた回転行動を有し、Ａｄ．ＬＴ Ｒ．ｈＴＨ注入の有益な効果を示している。アッセイ１０ ： この実施例はネズミ繊毛神経栄養因子を発現する組み換え欠陥アデノ ウィルスベクタ−ＡｄＬＴＲ．ＣＮＴＦの構築を開示する。 アデノウィルスＡｄＬＴＲ．ＣＮＴＦは、２９３細胞におけるプラスミドｐＬ ＴＲ−ＩＸ−ＣＮＴＦとアデノウィルス欠失突然変異体Ａｄ−ｄｌ１３２４（Ｔ ｈｉｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３１（１９８２）５４３）の コトランスフェクションにより構築した。 １．プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ＣＮＴＦの構築 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ＣＮＴＦは、ネズミＣＮＴＦ ｇＤＮＡ（エキソ ン１及び２、イントロン１）及びＮＧＦリーダー配列を含むプラスミドｐＲＣ． ＣＭＶ．ＣＮＴＦ（Ｓｅｎｄｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５８（ １９９２）５０２）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ １８００ｂｐフラグメントを プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸのユニークＥｃｏＲＶ部位に、ＲＳＶ ＬＴＲプロモ ーターに関して下流で挿入することにより構築した。その挿入のために、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ−ＸｂａＩ １８００ｂｐフラグメントをクレノウＤＮＡポリメラーゼ を用いて平滑末端に変換した。 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸはプラスミドｐＬＴＲβｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒ ｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９ ０（１９９２）６２６）から、βｇａｌ遺伝子を有するＣｌａＩ−Ｘｈｏｌフラ グメントの欠失、クレノウ酵素を用いた消化及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用 いた連結により得た。 ２．欠陥組み換えアデノウィルスＡｄＬＴＲ．ＣＮＴＦの構築 Ｅａｇｌ−線状化ｐＬＴＲ−ＩＸ−ＣＮＴＦ ＤＮＡ及びＣｌａＩ−線状化ア デノウィルス欠失突然変異体Ａｄ−ｄｌ１３２４をリン酸カルシウムの存在下で 細胞系２９３中にコトランスフェクトし、相同的組み 換えを可能にした。組み換えの後、アデノウィルスを選択し、２９３細胞系上で 増幅し、塩化セリウム上の遠心により回収した（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７３）４５６）。アッセイ１１： この実施例はヘキソサミニダーゼＡの鎖をコードするｃＤＮＡを含む組み換え 欠陥アデノウィルスベクターＡｄＬＴＲ．ＨＥＸＡの構築を開示する。ＨＥＸＡ 遺伝子における遺伝子欠陥はテイ・サックス リソソーム病の原因である。 アデノウィルスＡｄＬＴＲ．ＨＥＸＡは、２９３細胞におけるプラスミドｐＬ ＴＲ−ＩＸ−ＨＥＸＡとアデノウィルス欠失突然変異体Ａｄ−ｄｌ１３２４（Ｔ ｈｉｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３１（１９８２）５４３）の コトランスフェクションにより構築した。 １．プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ＨＥＸＡの構築 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ＨＥＸＡは、ｌｇｔ肝臓ｃＤＮＡ ライブラリ（ Ｐｒｏｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７）５６ ７７も参照）のスクリーニングにより得たヘキソサミニダーゼＡの鎖をコードす るｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ ２０００ｂｐフラグメントをプラスミドｐＬＴＲ −ＩＸのユニークＥｃｏＲＶ部位の間に、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーターに関して 下流で挿入することにより構築した。その挿入のために、ＥｃｏＲＩ ２０００ ｂｐフラグメントをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端に変換した。 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸはプラスミドｐＬＴＲβｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒ ｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９ ０（１９９２）６２６）から、βｇａｌ遺伝子を有す るＣｌａＩ−ＸｈｏＩフラグメントの欠失、クレノウ酵素を用いた消化及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いた連結により得た。 ２．欠陥組み換えアデノウィルスＡｄＬＴＲ．ＨＥＸＡの構築 ＡｓｅＩ−線状化ｐＬＴＲ−ＩＸ−ＨＥＸＡ ＤＮＡ及びＣｌａＩ−線状化ア デノウィルス欠失突然変異体Ａｄ−ｄｌ１３２４をリン酸カルシウムの存在下で 細胞系２９３中にコトランスフェクトし、相同的組み換えを可能にした。組み換 えの後、アデノウィルスを選択し、２９３細胞系上で増幅し、塩化セリウム上の 遠心により回収した（Ｇｒａｈａｍｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１ ９７３）４５６）。アッセイ１２ ： この実施例はネズミ神経成長因子（ｈＮＧＦ）ｃＤＮＡ（プレプロＮＧＦ）を 発現する組み換え欠陥アデノウィルスベクターＡｄＬＴＲ．ＮＧＦの構築を開示 する。 アデノウィルスＡｄＬＴＲ．ＮＧＦは、２９３細胞におけるプラスミドｐＬＴ Ｒ−ＩＸ−ＮＧＦとアデノウィルス欠失突然変異体Ａｄ−ｄｌ１３２４（Ｔｈｉ ｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３１（１９８２）５４３）のコト ランスフェクションにより構築した。 １．プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ＮＧＦの構築 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ＮＧＦは、プレプロＮＧＦ ｃＤＮＡを含む１ｋ ｂ ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントをプラスミドＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）の対応する部位に挿入することにより構築した。次いでこ のｃＤＮＡをＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして単離し、クレノウ酵素を 用いて平滑末端に変換し、プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸのユニークＣｌａＩ及びＥ ｃｏＲＶ部位の間に、ＲＳ Ｖ ＬＴＲプロモーターに関して下流で挿入した。 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸはプラスミドｐＬＴＲβｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒ ｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９ ０（１９９２）６２６）から、βｇａｌ遺伝子を有するＣｌａＩ−Ｘｈｏｌフラ グメントの欠失、クレノウ酵素を用いた消化及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用 いた連結により得た。 ２．欠陥組み換えアデノウィルスＡｄＬＴＲ．ＮＧＦの構築 プラスミドｐＬＴＲ−ＩＸ−ＮＧＦ及びアデノウィルス欠失突然変異体Ａｄ− ｄｌ１３２４をＣｌａＩを用いて線状化し、リン酸カルシウムの存在下で細胞系 ２９３中にコトランスフェクトし、相同的組み換えを可能にした。組み換えの後 、アデノウィルスを選択し、２９３細胞系上で増幅し、塩化セリウム上の遠心に より回収した（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７ ３）４５６）。参考文献

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年７月１１日 【補正内容】 請求の範囲 １．（ｉ）通常アデノウィルスが感染可能な細胞中にそのアデノウィルスが侵 入するのに必要な領域を包含するアデノウィルスのゲノムの少なくとも一部、及 び（ｉｉ）該ゲノム部分中に存在するか、又は挿入され、該細胞中で作用性のプ ロモーターの制御下でアデノウィルスのゲノムの該部分中に挿入された選択され たヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡベクターの、中枢神経系の障害の処置 のための製薬学的組成物の製造のための利用。 ２．該組み換えベクターが、欠陥アデノウィルスであり、そして好ましくは、 このようなアデノウィルスが感染した細胞中でアデノウィルスの包膜化に必要な アデノウィルスゲノム配列のすべてをさらに含む請求の範囲第１項に記載の利用 。 ３．該組み換えベクターがアデノウィルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域、な らびに場合により領域Ｅ３を含まない請求の範囲第１又は２項に記載の利用。 ４．該プロモーターがアデノウィルスゲノムに関して外因性である請求の範囲 第１〜３項のいずれか１つに記載の利用。 ５．該プロモーターがニューロン、膠細胞又は上衣細胞プロモーターである請 求の範囲第１〜３項のいずれか１つに記載の利用。 ６．該プロモーターの制御下の該ヌクレオチド配列が、対応する欠陥ヌクレオ チド配列によりコードされる対応する天然の欠陥ポリペプチド−含有産物の生物 学的性質を補うことができるか、あるいは該標的細胞において対応する天然の内 在性ポリペプチド含有産物が内在的に生産されないことを補うことができる生物 学的性質を有する発現産物の形態で 発現されることができる請求の範囲第１〜５項のいずれか１つに記載の利用。 ７．上記の該プロモーターの制御下の該ヌクレオチド配列が神経伝達物質又は 神経伝達物質−合成酵素、あるいは該神経伝達物質又は神経伝達物質−合成酵素 の生物学的活性を有する該神経伝達物質又は神経伝達物質−合成酵素の一部をコ ードする請求の範囲第１〜６項のいずれか１つに記載の利用。 ８．上記の該プロモーターの制御下のヌクレオチド配列が神経伝達物質の前駆 体、又は該前駆体の生物学的活性を有する該前駆体の一部をコードする請求の範 囲第１〜６項のいずれか１つに記載の利用。 ９．プロモーターの制御下のヌクレオチド配列が栄養因子又は該栄養因子の生 物学的活性を有するその一部をコードする請求の範囲第１〜６項のいずれか１つ に記載の利用。 １０．プロモーターの制御下のヌクレオチド配列が成長因子又はその成長因子 の性質を有する該成長因子の一部をコードする請求の範囲第１〜６項のいずれか １つに記載の利用。 １１．プロモーターの制御下のヌクレオチド配列がアンチセンス配列である請 求の範囲第１〜６項のいずれか１つに記載の利用。 １２．プロモーターの制御下のヌクレオチド配列が、その転写産物が毒性タン パク質（例えばプリオン、キナーゼ、タンパク質ＴＡＵ、ｂ−アミロイドなど） あるいは該毒性タンパク質又はグルタメートの合成に含まれる酵素の発現を阻害 することができるアンチセンス配列である請求の範囲第１１項に記載の利用。 １３．（ｉ）通常アデノウィルスが感染可能な細胞中にそのアデノウィ ルスが侵入するのに必要な領域を包含するアデノウィルスのゲノムの少なくとも 一部、及び（ｉｉ）存在するか、又は挿入されたプロモーターの制御下のアデノ ウィルスのゲノムの該部分中に挿入された選択されたヌクレオチド配列を含み、 該ヌクレオチド配列が神経伝達物質又は神経伝達物質−合成酵素、あるいは該神 経伝達物質又は神経伝達物質−合成酵素の生物学的活性を有する該神経伝達物質 又は神経伝達物質−合成酵素の一部をコードする組み換えＤＮＡベクター。 １４．ヌクレオチド配列が神経伝達物質の前駆体、又は該前駆体の生物学的活 性を有する該前駆体の一部をコードする請求の範囲第１３項に定義された組み換 えＤＮＡべクター。 １５．ヌクレオチド配列が栄養因子又は該栄養因子の生物学的活性を有するそ の一部をコードする請求の範囲第１３項に定義された組み換えＤＮＡベクター。 １６．ヌクレオチド配列が成長因子又はその成長因子の性質を有する該成長因 子の一部をコードする請求の範囲第１３項に定義された組み換えＤＮＡべクター 。 １７．ヌクレオチド配列がアンチセンス配列である請求の範囲第１３項に定義 された組み換えＤＮＡベクター。 １８．該ヌクレオチド配列が選択されたメッセンジャーＲＮＡと相互作用でき るアンチ−センスＲＮＡ又はアンチ−センスオリゴヌクレオチドにおいて転写さ れることができる請求の範囲第１７項に記載のベクタ。 １９．ヌクレオチド配列が、転写産物が毒性タンパク質（例えばプリオン、キ ナーゼ、タンパク質ＴＡＵ、ｂ−アミロイドなど）あるいは該 毒性タンパク質又はグルタメートの合成に含まれる酵素の発現を阻害することが できるアンチセンス配列である請求の範囲第１７又は１８項に記載のベクター。 ２０．（ｉ）通常アデノウィルスが感染可能な細胞中にそのアデノウィルスが 侵入するのに必要な領域を包含するアデノウィルスのゲノムの少なくとも一部、 及び（ｉｉ）より特定の種類の神経細胞にヌクレオチド配列の発現を標的化する ことができるプロモーターの制御下で該アデノウィルスのゲノムの部分中に挿入 された選択されたヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡベクター。 ２１．該プロモーターが神経細胞、膠細胞又は上衣細胞プロモーターである請 求の範囲第２０項に記載のベクター。 ２２．請求の範囲第１３〜２１項のいずれか１つに定義された組み換えアデノ ウィルスベクターを、それを中枢神経系の障害の処置のためにヒト又は動物に投 与できるようにする製薬学的ビヒクルと一緒に含む製薬学的組成物。 ２３．プロモーターの制御下の遺伝子を含む複製欠失組み換えアデノウィルス を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の中枢神経系における遺伝子の転移の方 法。 ２４．遺伝子を脳及び脊髄細胞、特に神経、膠又は上衣細胞中に転移させるた めの請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２５．プロモーターの制御下の、中枢神経系障害を軽減することができる遺伝 子を含む複製欠失組み換えアデノウィルスを哺乳類に投与することを含む、哺乳 類における中枢神経系障害の軽減、予防又は処置の方法。 ２６．−通常アデノウィルスが感染可能な細胞にアデノウィルスが侵入するの に必要な遺伝情報を提供する対応するアデノウィルスの領域を包含し、さらに該 アデノウィルスの領域に挿入されたマーカーをコードするヌクレオチド配列を含 み、かつプロモーターが遺伝子構築を用いて組み換えアデノウィルス中に挿入さ れて該ヌクレオチド配列がその制御下におかれている組み換えアデノウィルスベ クターを神経細胞の集団に感染させ、 −該集団の中でマーカーの発現が起こった細胞を検出することを含む神経細胞の ある集団の細胞の一部又は全部におけるプロモーターの有効性又は作用性の検出 の方法。 ２７．神経細胞又は少なくともそのいくらかが、非−ヒト動物又は該動物の祖 先に導入された請求の範囲第１項に定義されたベクターを含有する非−ヒト動物 からなる動物病理学的モデル。 ２８．神経退化疾患のためのモデルである請求の範囲第２７項に記載の動物病 理学的モデル。 ２９．請求の範囲１項に定義されたベクターを含む神経細胞を培養することを 含み、かつベクターの選択されたヌクレオチド配列がポリペプチドである組み換 えポリペプチドの生産の方法。 ３０．それぞれ請求の範囲第１項に定義された組み換えＤＮＡベクターを用い て形質転換された中枢神経系の細胞、例えば脳及び脊髄細胞、特に神経細胞、膠 細胞又は上衣細胞の集団。 ３１．宿主、特にこれらの細胞を最初に与えた宿主における移植に適した形態 である請求の範囲第３０項の細胞の集団。 ３２．請求の範囲第３０項に定義された細胞の集団を培養することを 含み、かつ問題のヌクレオチド配列がそのタンパク質又はポリペプチドをコード する、治療的価値を有するタンパク質又はポリペプチドの生産の方法。 ３３．該ヌクレオチド配列が請求の範囲第６〜１０項のいずれか１つに定義さ れている請求の範囲第３２項に記載の方法。 ３４．プロモーターの制御下でヒト チロシン ヒドロキシラーゼ遺伝子を含 む複製欠失組み換えアデノウィルス。 ３５．プロモーターの制御下でＣＮＴＦ遺伝子を含む複製欠失組み換えアデノ ウィルス。 ３６．プロモーターの制御下でＨＥＸＡ遺伝子を含む複製欠失組み換えアデノ ウィルス。 ３７．プロモーターの制御下でＮＧＦ遺伝子を含む複製欠失組み換えアデノウ ィルス。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 7/00 8931−4Ｂ 7/04 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9453−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/12 7431−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マレ， ジヤツク フランス国エフ―75013パリ・リユシヤル コ18 (72)発明者 ペリコーデ， ミシエル フランス国エフ―28150ウアルビル・レジ ダンスデユムーラン20 (72)発明者 ペシヤンスキ， マール フランス国エフ―94000クルテイユ・リユ モンフレイ14 (72)発明者 ロベール， ジヤン−ジヤツク フランス国エフ―92330ソー・ブールバー ルデグランジユ12レジダンスレペピニエー ル (72)発明者 ル・ガル・ラ・サル， ジルダ フランス国エフ―92210サン―クルー・ア ベニユーポゾ―デイ―ボルゴ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．中枢神経系の細胞中で選択されたヌクレオチド配列の発現及び／又は転写 を支配することができ、（ｉ）通常アデノウィルスが感染可能な細胞中にそのア デノウィルスが侵入するのに必要な領域を包含するアデノウィルスのゲノムの少 なくとも一部、及び（ｉｉ）該ゲノム部分中に存在するか、又は挿入され、該細 胞中で作用性のプロモーターの制御下のアデノウィルスのゲノムの該部分中に挿 入された選択された該ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組み換えＤＮＡ ベクター。 ２．該組み換えベクターが、好ましくは該アデノウィルスが感染した細胞中で アデノウィルスの包膜化に必要なアデノウィルスゲノムの配列のすべてを含む欠 陥アデノウィルスである請求の範囲第１項に記載のベクター。 ３．該組み換えベクターがアデノウィルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域、な らびに場合により領域Ｅ３を含まない請求の範囲第１又は２項に記載のベクター 。 ４．該プロモーターがアデノウィルスゲノムに関して外因性である請求の範囲 第１〜３項のいずれか１つに記載のベクター。 ５．該プロモーターがニューロン、膠細胞又は上衣細胞プロモーターである請 求の範囲第１〜３項のいずれか１つに記載のベクター。 ６．上記の該プロモーターの制御下の該ヌクレオチド配列が神経伝達物質又は 神経伝達物質−合成酵素、あるいは該神経伝達物質又は神経伝達物質−合成酵素 の生物学的活性を有する該神経伝達物質又は神経伝達物質−合成酵素の一部をコ ードする請求の範囲第１〜５項のいずれか１つに記載のベクター。 ７．上記の該プロモーターの制御下のヌクレオチド配列が神経伝達物質の前駆 体、又は該前駆体の生物学的活性を有する該前駆体の一部をコードする請求の範 囲第１〜５項のいずれか１つに記載のベクター。 ８．プロモーターの制御下のヌクレオチド配列が栄養因子又は該栄養因子の生 物学的活性を有するその一部をコードする請求の範囲第１〜５項のいずれか１つ に記載のベクター。 ９．プロモーターの制御下のヌクレオチド配列が成長因子又はその成長因子の 性質を有する該成長因子の一部をコードする請求の範囲第１〜５項のいずれか１ つに記載のベクター。 １０．プロモーターの制御下のヌクレオチド配列がアンチセンス配列である請 求の範囲第１〜５項のいずれか１つに記載のベクター。 １１．プロモーターの制御下のヌクレオチド配列が、その転写産物が毒性タン パク質（例えばプリオン、キナーゼ、タンパク質ＴＡＵ、ｂ−アミロイドなど） あるいは該毒性タンパク質又はグルタメートの生合成に関与する酵素の発現を阻 害することができるアンチセンス配列である請求の範囲第１０項に記載のベクタ ー。 １２．選択されたヌクレオチド配列の転写産物又は発現産物を中枢神経系の細 胞、例えば脳及び脊髄細胞、特に神経細胞、膠細胞又は上衣細胞で標的化させる か又は生産させることを含む方法において有用な組み換えベクターの製造方法で あって、該組み換えベクターが、通常アデノウィルスにより感染可能な細胞中に そのアデノウィルスが侵入するのに必要な遺伝情報を提供するゲノム領域を包含 するアデノウィルスのゲノムの少なくとも一部を含むアデノウィルスベクターで あり、該ヌクレオチド配列が該アデノウィルスベクター内に存在するか、又は挿 入された プロモーターの制御下の該ゲノム部分に挿入されており、そして該プロモーター が該細胞において作用性である、前記組み換えベクターの製造方法。 １３．請求の範囲第２〜１１項のいずれか１つに記載のベクターである請求の 範囲第１２項に記載の方法。 １４．動物において、選択されたヌクレオチド配列の転写産物又は発現産物を その中枢神経系の細胞、例えば脳及び脊髄細胞、特に神経細胞、膠細胞又は上衣 細胞で標的化させるか又は生産させ、そして該動物において該転写産物又は該発 現産物により引き起こされて生じた生理学的又は行動的改変を検出することを含 む方法において有用な組み換えベクターの製造のための請求の範囲第１２又は１ ３項に記載の方法。 １５．中枢神経系の障害の処置で用いるための組み換えベクターの製造のため の請求の範囲第１２〜１４項のいずれか１つに記載の方法。 １６．遺伝子療法のための方法で有用に有用な組み換ベクターの製造用であり 、該プロモーターの制御下のヌクレオチド配列が中枢神経系の該細胞における対 応する欠失又は欠陥ヌクレオチド配列を補うことができる外因性配列である請求 の範囲第１５項に記載の方法。 １７．該プロモーターの制御下の該ヌクレオチド配列が選択されたメッセンジ ャーＲＮＡと相互作用することができるアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオ リゴヌクレオチドにおいて転写されることができる請求の範囲第１５又は１６項 に記載の方法。 １８．該プロモーターの制御下の該ヌクレオチド配列が、対応する欠陥ヌクレ オチド配列によりコードされる対応する天然の欠陥ポリペプチド−含有産物の生 物学的性質を補うことができるか、あるいは該標的細 胞において対応する天然の内在性ポリペプチド含有産物が内在的に生産されない ことを補うことができる生物学的性質を有する発現産物の形態で発現されること ができる請求の範囲第１５又は１６項に記載の方法。 １９．請求の範囲第１〜１１項のいずれか１つに定義された組み換えアデノウ ィルスベクターを、それを中枢神経系の障害の処置のためにヒト又は動物に投与 できるようにする製薬学的ビヒクルと一緒に含む製薬学的組成物。 ２０．プロモーターの制御下の遺伝子を含む複製欠失組み換えアデノウィルス を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の中枢神経系における遺伝子の転移の方 法。 ２１．プロモーターの制御下の、中枢神経系の障害を軽減することができる遺 伝子を含む複製欠失組み換えアデノウィルスを哺乳類に投与することを含む、哺 乳類における中枢神経系障害の軽減、予防又は処置の方法。 ２２．−通常アデノウィルスが感染可能な細胞にアデノウィルスが侵入するの に必要な遺伝情報を提供する対応するアデノウィルスの領域を含み、さらに該ア デノウィルスの領域に挿入されたマーカーをコードするヌクレオチド配列を含み 、かつプロモーターが遺伝子構築を用いて組み換えアデノウィルス中に挿入され て該ヌクレオチド配列がその制御下におかれている組み換えアデノウィルスベク ターを神経細胞の集団に感染させ、 −該集団の中でマーカーの発現が起こった細胞を検出することを含む神経細胞の ある集団の細胞の一部又は全部におけるプロモーターの有効性又は作用性の検出 方法。 ２３．神経細胞又は少なくともそのいくらかが、非−ヒト動物又は該動物の祖 先に導入された請求の範囲第１〜１１項のいずれか１つに記載のベクターを含有 する非−ヒト動物からなる動物病理学的モデル。 ２４．神経退化疾患のためのモデルである請求の範囲第２３項に記載の動物病 理学的モデル。 ２５．ベクターの選択されたヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする請 求の範囲１〜１１項のいずれか１つに記載のベクターを含有する神経細胞を培養 することを含む組み換えポリペプチドの生産方法。 ２６．それぞれ請求の範囲第１〜１１項のいずれか１つに定義された組み換え ＤＮＡベクターを用いて形質転換された中枢神経系の細胞、例えば脳及び脊髄細 胞、特に神経細胞、膠細胞又は上衣細胞の集団。 ２７．宿主により移植に適する形態にある細胞集団であって、特にこれらの細 胞が最初に得られた形態にある請求の範囲第２４項の細胞の集団。 ２８．請求の範囲第２４項に定義された細胞の集団を培養することを含み、か つ問題のヌクレオチド配列が治療的価値を有するタンパク質又はポリペプチドを コードする、該タンパク質又はポリペプチドの生産方法。 ２９．該ヌクレオチド配列が請求の範囲第６〜９項のいずれか１つに定義され ている請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３０．プロモーターの制御下でヒト チロシン ヒドロキシラーゼ遺伝子を含 む複製欠失組み換えアデノウィルス。 ３１．プロモーターの制御下でＣＮＴＦ遺伝子を含む複製欠失組み換えアデノ ウィルス。 ３２．プロモーターの制御下でＨＥＸＡ遺伝子を含む複製欠失組み換えアデノ ウィルス。 ３３．プロモーターの制御下でＮＧＦ遺伝子を含む複製欠失組み換えアデノウ ィルス。