JPH04503408A - 非多孔質単分散ポリマー充填物質を含む高速アフィニティクロマトグラフカラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高速アフィニティクロマトグラフィー（ＨＰＡＣ）、即ちＨＰＡＣに 使用する分離装置及びこの装置を使用するＨＰＡＣの方法に関する。

背景技術 高速アフィニティクロマトグラフィーは、水性媒体から生物学的物質を分離する ための価値ある手段になってきた。例には、小さなリガンド、蛋白質、核酸、酵 素などのような生物学的に活性な分子が含まれる。

アフィニティクロマトグラフィーの基本原理には、相互作用系の成分の一つ（例 えば、リガンド）を不溶性支持体に固定化することが含まれ、次に、クロマトグ ラフィー操作において、支持体を流体媒体（例えば、水溶液）の成分（例えば、 酵素）を選択的に吸着するのに使用し、吸着された成分が選択的に反応して二つ の成分の錯体を形成することが含まれる。

次いで所望の成分の溶出は、錯体の解離を生ずる多くの方法の何れかにより行う ことができる。かくして、巨大分子の特定の生物学的性質を精製のために利用で きる。この方法は、固定化されたリガンドとの生物学的特定相互作用に基づいて 、酵素、ホルモン、特定蛋白質、阻害剤、抗原、抗体などのような特定の物質を 単離するのに使用できる。

高速液体アフィニティクロマトグラフィーは、アフィニティクロマトグラフィー の優れた特異性を、高速液体クロマトグラフィ一方法及び装置の効率、感度及び 操作速度と結び付ける。

高速液体クロマトグラフィー及びそれに従って高速アフィニティクロマトグラフ ィーを実施する装置は、溶離液貯槽及び高圧計量ポンプを含む溶離液供給手段； 試料物質注入器を含む試料物質手段；目的とする生物学的物質を分離するための 充填物質が充填されたクロマトグラフカラムを含む分離装置；並びに検出器が、 流れの順路に沿って直列に配置されている。

高速液体アフィニティクロマトグラフィーを行う方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０４巻、２１２頁以降に記載されている 。この方法は、一般に、目的とする生物学的物質を含む水性試料をクロマトグラ フカラムの中を通過させることを含む。溶液は加圧下にカラム内を通過させる。

カラムにはリガンドが結合した支持体が充填されている。このリガンドは試料中 の生物学的種のための親和力を有している。試料がカラムの中を通過する際に、 この生物学的種はリガンドに結合してリガンド−生物学的種錯体を形成する。試 料がカラムの中を通過した後、リガンドから生物学的物質を除去するために設計 された溶離液を加圧下にカラムに通す。溶離液はリガンド−生物学的種錯体を破 壊し、それによりカラムから生物学的種を除去する。

この方法は、逆に、目的とする生物学的種を結合させることなくカラムの中を通 過させ、一方、生物学的種と分離すべき他の物質をリガンドに結合させる方式で 行うこともできる。

高速アフィニティクロマトグラフィーで使用される従来の分離装置における充填 物質は、シリカ又は多孔質ポリマー粒子のような多孔質物質である。このような 多孔質物質は幾つかの問題点を示す。

先ず、孔が分離すべき混否物中の生物学的種により閉塞される。このことは、固 定化されたリガンドの利用の効率を減少させ、一定の流速の維持のためにより高 い圧力を必要とするようになる。多孔質充填物の機械的強度は、一般に低く、か なり低い圧力（巨大多孔質ポリマーでは＜　１．０００ｐｓｉで、シリカ粒子で は４．０００ｐＳｉ以下）でベッドの崩壊を起こす。この制限は、濃厚試料の使 用も妨げる。即ち、一般には、多孔質粒子に適応するために試料を希釈する必要 がある。　。

多孔質粒子は非多孔質粒子よりも大きい表面積を与えることが期待される。実際 には、このことは事実ではない。孔のサイズに依存して、生物学的目的物の大き な分子に使用するには、多孔質粒子は比較的非効率的である。例えば、有用なリ ガンドは、孔の一つの中で多孔質ビーズに付着される。液体流から除去又は分離 することが望まれる生物学的種は、サイズが大きく、孔の中に入り込んでリガン ドに到達することはできない。逆に、大きな親和性リガンドの固定化は、リガン ド自体が多孔質の壁を貫通できないので、全表面積の小部分を利用することがで きるのみである。即ち、結合の効率は減少し、多孔質粒子の見掛上の表面積の利 点は見掛けだけのものになる。

また、先行技術の多孔質粒子は、背圧の蓄積及びベッドの崩壊を避けるために約 ５〜１０−のサイズである。

発明の開示 本発明は、Ｂ）充填物質を含むＡ）クロマトグラフカラムを含んでなり、その充 填物質が、ｉ）０．０１〜約５ミクロメートル（ＩＭ）の範囲内の粒子サイズ及 びｉｉ）生物学的リガンドの遊離のアミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシ基 又はアルデヒド基と直接又は間接に反応性である表面反応性基を有する、複数の 非多孔質、単分散性ポリマー粒子である、高速アフィニティクロマトグラフィー 分離装置を提供する。

充填物質として使用される粒子は、多孔質ビーズよりも大きい圧力に耐えること ができる。この粒子は、先行技術の多孔質粒子が崩壊する圧力で崩壊しない。

これらは先行技術で使用される、より大きい多孔質粒子よりも更に存効な表面積 を育する。

この粒子は好ましくは１〜３−である。驚くべきことに、これらはカラムを閉塞 させない。妥当な背圧が、これらの粒子を含むカラムを通して溶離液を送液する ために使用することができる。粒子は多分散ではなく単分散であることが重要で ある。単分散とは、粒子サイズの分布の３σ（シグマ）が、平均粒子径の７％に 等しいか、それ未満であることを意味する。多分散は広範囲に変化するサイズを 育する粒子を指す。

多分散物は前記の状況下では作動しない。多分散粒子の混合物のより小さい粒子 は、より大きい粒子の間の間隙を埋め、それにより背圧を増大させる。

本発明は、また、 Ａ）目的とする生物学的種を含むと考えられる水性試料を準備する工程、 Ｂ）本発明に係る高速アフィニティクロマトグラフィー分離装置を準備する工程 及び Ｃ）前記試料について高速液体クロマトグラフィーを行うことにより所望の分離 を達成する工程を含んでなる、水溶液から生物学的種を分離する方法を提供する 。

発明を実施するための最良の形態 本発明の分離装置には、充填物質として上記の粒子のベッド（床）を含む特育の クロマトグラフカラムが含まれる。このカラムは一般にステンレススチールで作 られている。例えば、ステンレススチール翫３１６がしばしば使用される。これ は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ｉ ｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　（Ａ　ｌ５Ｉ）により定義された合衆国標準による合金 である。これは腐食に対して優れた抵抗性を示す合金である。管の内壁の粗さは クロマトグラフィーにより左右される仕様である。大略、ピーク対ピーク値とし て表した壁粗さは、カラムに充填される粒子の平均サイズの１０分の１未満にす べきである。このことは、５岬の粒子をカラムに充填する場合には、壁粗さを０ ．５岬よりも小さくすべきであることを意味する。ガラス、ポリマー又は金ライ ニング管もクロマトグラフカラムで使用される。

ガラス管が最近導入された。ガラスの優れた壁特性はこのための動機であった。

圧力制限によって、これらは低い及び中間の圧力適用に於いて有用である。

分析カラムのために使用される管径は、中程度の内径のカラムについては４〜８ 叩内径であり、小内径カラムについては２〜４順内径であり、微小内径カラムに ついては１〜２０内径の範囲である。

直径なる用語は、カラム及びそのクロマトグラフィー適用に対して一般に使用さ れている表示である。カラムの内径は非常に重要な要因であり、適用に合致する ように正しく選択する必要がある。上記範囲内の内径のカラムは市販されている 。

カラムは高圧下に操作される。安全性の理由から必要となる、壁厚がある。最も しばしば使用される４、６ｍｍの内径を存する０、２５インチ管は、０．９ｍｍ の充分な壁厚を有する。同じ内径を有する、より厚い壁の管が、幾つかのメーカ ーにより提供されている。カラムの長さは５０〜１００ｍｍとすることができる 。しかしながら、もっと長い又はもっと短い長さも有用である。

小さい径の充填物（く〜１０〜２０１Ｍ）のために、クロマトグラフィー樹脂を スラリーからカラムに充填する。カラムの一端に、フリット及び端部材をはめ込 む。他の端部は、スラリー充填装置に取り付ける。高圧（しばしば１０．０００ ｐｓｉ又は６８、９４８ｋＰａ）を、スラリーをカラム内に充填するために適用 し、それを急速に（数分以内に）充填する。カラムを更にゆつくり（３０〜６０ 分以内に）充填するために、より低い圧力（６，０ＯＯｐｓｉ又は４１．３６９ ｋＰａ以下）も使用することができる。

次いでカラムを充填装置からはずし、端部材をはめ込む。

従来のＨＰＬＣ装置は、一般に室温で分離するのに使用できる。流速は普通、標 準Ｓ　ｍｍ　Ｉ　Ｄカラムについて約０．１〜３ｍｌ／分に維持される。典型的 な値は１ｍｌ／分であり、これは２−粒子が充填されたＳａｎカラムに約１．０ ００〜３．０００ｐｓｉ（６，９００〜２１．０００ｋＰａ）の圧力を与える。

カラム充填物質 充填物質はポリマー粒子から作られる。この粒子は、約０、Ｏ１〜約５ＩＭ、好 ましくは約０．１〜約３岬の範囲内の粒子サイズを育する水不溶性ラテックス粒 子である。この粒子は非多孔質で単分散である。

この粒子はまた、生物学的リガンドの核性遊離アミノ基及びスルフヒドリル基と 直接的又は間接的に反応する、表面反応性基を有する。このような反応性基は電 子性であり、ａ）活性ハロゲン基、 ｂ）活性化された２−置換エチルスルホニル基又は活性化されたビニルスルホニ ル基、 Ｃ）反応性カルボキシル基、 ｄ）エポキシ基、 ｅ）イソシアネート基、 ｆ）アジリジン基、 ｇ）アルデヒド基、 ｈ）２−置換エチルカルボニル基及び ｉ）サクシンイミドキシ力ルボニル基を含む。表面活性基ａ）、ｂ）、ｃ）及び ｉ）が好ましい。

生物学的種が請求電子性基（カルボキシ、アルデヒドなど）を含むか又は含むよ うに変性された蛋白質の場合には、ポリマー粒子はアミン、スルフヒドリルなど のような表面反応性求核性基を有することができる。

一般に、本発明の粒子を形成するのに使用されるポリマーは、−膜構造式： ％式％ （式中、−Ａ−は、１種又はそれ以上の疎水性エチレン系不飽和モノマーから誘 導される繰り返し単位を表し、−Ｂ−は、本明細書に記載したような生物学的特 殊性を有するリガンドの遊離アミノ基又はスルフヒドリル基と直接的又は間接的 に反応する、必要な反応性基を有する１種又はそれ以上のエチレン系不飽和モノ マーから誘導される繰り返し単位を表し、そして、 −Ｄ−は、−Ａ−又は−Ｂ−により表されるものとは異なっている１種又はそれ 以上のエチレン系不飽和モノマーから誘導される繰り返し単位を表す） で表される。

式Ｉに於いて、０は０〜９９．９モル％であり、ｐは約０．１〜１００モル％で あり、そしてｑは０〜約２０モル％である。好ましくは、０は約４５〜約９９モ ル％であり、ｐは１〜約５０モル％であり、そしてｑは０〜約１０モル％である 。

−Ａ−繰り返し単位は、１種又はそれ以上の疎水性エチレン系不飽和モノマーか ら誘導される。このようなモノマーは水に不溶性である。代表的な疎水性モノマ ーには、スチレン及びスチレン誘導体（例えば、ビニルトルエン、２，５−ジメ チルスチレン、４−ｔ−ブチルスチレン及び２−クロロスチレン）、アクリル酸 エステル及びメタクリル酸エステル（例えば、ｎ−ブチルアクリレート、プロピ ルメタクリレート、メチルアクリレート、エチルメタクリレート、２−エチルへ キシルメタクリレート、Ｎ−フェニルアクリルアミド及びメチルメタクリレート ）、アクリロニトロル並びに酢酸ビニルが含まれるが、これらに限定されない。

ポリマーは、所望ならば、任意の適当な様式で架橋することができる。一つの方 法は、少量の、即ち、約１５モル％以下、好ましくは約０．３〜約５モル％の、 ２個又はそれ以上の工≠レン系不飽和重合性基を有するモノマーを含めることで ある。

これらのモノマーは、Ａが誘導される疎水性モノマーの中に含まれる。代表的な モノマーはＲｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ。

ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　１９５５Ｌ　１９８０年７月、３０４頁に記載されて おり、レート、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、２．２−ジメチル−１ ，３−プロピレンジアクリレート、アリルアクリレート、エチリジントリメタク リレート及びエチレンジアクリレートが含まれる。

−Ａ−が誘導される特に有用なモノマーは、スチレン、ビ−ト、ジビニルベンゼ ン、２−エチルへキシルメタクリレート及びメチルメタクリレートである。

−Ｂ−繰り返し単位は、中間架橋剤を使用して又は使用しないで、アミン又はス ルフヒドリル基と容易に反応する付属の反応性基を許容する。それで、Ｂ基はこ のような反応性基を含有する全てのモノマーから誘導できる。好ましいモノマー は、前記の付属反応性基ａ）〜ｉ）からなるものである。

必要な反応性基を提供するモノマーの一つの好ましい種類は、アミン及びスルフ ヒドリル基と容易に反応する活性ハロゲン原子からなるものである。

活性ハロゲン原子を有するモノマーの例には、クロロ酢酸ビニル、ブロモ酢酸ビ ニル、ハロアルキル化ビニル芳香族（例えば、クロロメチルスチレン又はブロモ メチルスチレン）、ハロアルキルアクリルエステル又はメタクリルエステル（例 えば、クロロエチルメタクリレート、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルメタ クリレート及び３−クロロプロピルアクリレート）並びに当業者に公知のその他 のものが含まれる。

例えば、１〜３個の炭素原子の活性ハロアルキル基を有するものであるハロアル キル化ビニル芳香族類が、活性ハロゲン原子が反応性基として使用される場合に 好ましい。クロロメチルスチレンが非常に有用である。

活性ハロゲン原子を有するモノマーは多くの利点を示すが、２−置換エチルスル ホニル及びビニルスルホニル基を有するモノマーは、蛋白質が穏和な条件下でポ リマーに結合でき、加の利点を有する。このことは、製造をより効率的にし、コ ストをより少なくする。後者の基を有する多数の代表的モノマーは当該技術分野 で知られており米国特許第４．１６１．４０７号（１９７９年７月１７日Ｃａｍ ｐｂｅｌｌに対し発行）及び米国特許第４、５４８．８７０号（１９８５年１０ 月２２日Ｏｇａｗａらに対し発行）に開示されたものを含む。

好ましい活性化２−置換エチルスルホニル及びビニルスルホニルモノマーは、式 （■）： 〔但し、Ｒは、水素又は置換若しくは非置換アルキル（一般的に、メチル、エチ ル、イソプロピル又はヘキシルのような炭素原子１〜６個のもの）である〕 により表すことができる。好ましくは、Ｒは水素又はメチルである。

Ｒ１は、−ＣＨ＝　ＣＨＲ”又は−ＣＨ，ＣＨ，Ｘ　（但し、Ｘは核試薬により 置き換えられるか又は（例えば、ハロ、アセトキシ、メチルスルホニルオキシの ようなアルキルスルホニルオキシ、Ｉ）−）リルスルホニルオキシのようなアリ ールスルホニルオキシ、トリアルキルアンモニノ、例えば、トリメチルアンモニ ノ塩若しくはビリジニノ塩のような）塩基での処理によりＨＸを形成して除去さ れる離脱基である）である。Ｒ２は、水素、置換若しくは非置換アルキル（一般 的に、Ｒについて定義した炭素原子１〜６個のもの）又は置換若しくは非置換ア リール（一般的に、フェニル、ナフチル、キシリル又はトリルのような、核炭素 原子６〜１２のもの）である。好ましくは、Ｒ’は−ＣＨ２ＣＨ２Ｘである。活 性化２−置換エチル基であるこの基は、脱離基Ｘの置き換えを損なわないどのよ うな基によっても置換できる。

Ｌは、一般的に、主鎖に１〜２０個の炭素及びヘテロ原子を有する置換若しくは 非置換アルキレンとすることができる結合基である。このアルキレンの定義は、 オキシ、チオ、−ＮＲ”　−（但し、Ｒ２は、水素、炭素原子１〜６の置換若し くは非置換アルキル（例えば、メチル、クロロメチル又は２−ヒドロキシエチル ）又は炭素原子６〜ｌＯの置換若しくは非置換アリール（例えば、フェニル、ナ フチル又はキシリル）である〕、エステル（−Ｃｏｏ−）、アミド（−ＣＯＮＨ −）　、ウリスルホンアミド、アゾ、ホスホノ又は他の同様の基が、中間又は末 端に入ったアルキレン基を含むことを意味する。代表的なアルキレン基には、メ チレン、エチレン、イソブチレン、ヘキサメチレン、カルボニルオキシエトキシ 力ルポニル、メチレンビス（イミノカルボニル）、カルボニルオキシドデシレン 力ルポニルオキシエチレン、カルボニルイミノメチレンイミノカルボニルイミノ エチレン、カルボニルイミノメチレンイミノカルボニルエチレン及び上記米国特 許第４．１６１．４０７号及び同第４．５４８．８７０号に記載又は示唆された 他の基が含まれる。

Ｌはまた、一般的に核炭素原子６〜１２個を有する置換若しくは非置換アリーレ ンであってもよい。代表的なアリーレン基には、フェニレン、トリレン、ナフチ レン及び上記の特許に記載された他のものが含まれる。また、Ｌのこの定義には 、上記のアルキレン及びアリーレン基のそれぞれの１個又はそれ以上の組合せで ある二価の基（例えば、アリーレンアルキレン、アルキレンアリーレンアルキレ ン及び当業者により容易に決定できる他のもの）が含まれる。好ましくは、Ｌは 、置換若しくは非置換フェニレンアルキレン、１個又はそれ以上の（Ｒについて 定義したような）アルキル基、アルコキシ基（一般的に炭素原子１〜６のもの、 例えば、メトキシ、プロポキシ又はブトキシ）若しくはハロ基で置換されたフェ ニレンアルキレン又はカルボニルイミノメチレンイミノカルボニルエチレンであ る。

Ｂが誘導される、代表的な２−置換エチルスルホニル及びビニルスルホニルモノ マーには、ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン、ｍ＆ｐ　 −（２−（ｐ−トリルスルホニルオキシ）エチルスルホニルメチル〕スチレン、 ｍ＆ｐ−ビニルスルホニルメチルスチレン、Ｎ−Ｃｍ＆ｐ−（２−クロロエチル スルホニルメチル）フェニルコアクリルアミド及びＮ−（２−（２−クロロエチ ルスルホニル）エチルホルムアミドメチルコアクリルアミドが含まれる。最初の モノマーが好ましい。

繰り返し単位Ｂを形成するために付属できる他の好ましい反応性基は、カルボキ シル基である。

カルボキシル基は、例えばアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、２−カルボ キシエチルアクリレート、フマル酸、マレイン酸、２−カルボキシエチルメタク リレート、カルボキシメチルスチレン、メタクリルアミドヘキサン酸、Ｎ−（２ −カルボキシ−１，１−ジメチルエチル）アシルアミドなどのような基を含有す るモノマーを含有させるか又はカルボキシル基に転換できる他の反応性基を有す るポリマーの追加の化学反応により（例えば、無水マレイン酸のような無水物の 加水分解により又は表面メチロール若しくはアルデヒド末端基の酸化により）粒 子に追加できる。

カルボキシル基は単独では多くの実用的な目的のためにアミン及びスルフヒドリ ル基とゆっくり過ぎる反応をするので、カルボキシル基を介して、蛋白質、例え ば抗原、抗体、ハブテンなどに共有結合で付けるために、補助架橋剤が使用され る。補助架橋剤の一つの有用な種類は、公知のカルボジイミド、例えば１−シク ロへキシル−３−〔２−モルホリニル−（４）−エチル〕カルボジイミド　メト −ｐ−トルエンスルホネートであり、これは写真ゼラチン層でゼラチンを架橋す るために及び米国特許第４．１８１．６３６号に記載されているような診断試薬 を作るために使用されてきた。

補助架橋剤の他の好ましい種類には、米国特許第４．４２１．８４７号（１９８ ３年１２月２０日Ｊｕｎｇらに対し発行）に記載されているようなカルバモイロ ニウム塩が含まれる。代表的なカルバモイロニウム化合物には、１−（４−モル ホリノカルボニル）−４−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒドロキシド、内 部塩及び１．−（４−モルホリノカルボニル）ピリジニウムクロライドが含まれ る。

必要な反応性基を与えるために、ポリマーに含有できる他のモノマーには、エポ キシ基を含有するモノマー（例えば、グリシジルアクリレート、グリシジルメタ クリレート、ビニルグリシジルエーテル又はメタリルグリシジルエーテル）、イ ソシアネート基を含有するモノマー（例えば、イソシアナートエチルアクリレー ト、イソシアナートエチルメタクリレート又はα、α−ジメチルメタイソプロペ ニルベンジルイソシアネート）、アジリジン基を含有するモノマー〔例えば、ビ ニルカルバモイルアジリジン、Ｎ−メタクリロイルアジリジン、Ｎ−アクリロイ ルアジリジン及び２−（１−アジリジニル）エチルアクリレート〕、アルデヒド 基を含有するモノマー（例えば、ビニルベンズアルデヒド又はアクロレイン）又 は２−置換エチルカルボニル含有モノマー（例えば、２−クロロエチルアクリレ ート、２−クロロエチルメタクリレート、２−メチルスルホニルオキシエチルメ タクリレート及び２−ｐ−）リルスルホニルオキシエチルアクリレート）が含ま れる。

Ｄは、Ａ又はＢにより表されるもの以外の１種又はそれ以上のエチレン系不飽和 モノマーから誘導される繰り返し単位を表す。このようなモノマーは、水溶液中 で得られる粒子へ分散安定性を与え、そして固定化リガンドの生物学的活性に影 響を与えるイオン性又は他の親水性基を有し得る。有用なイオン性モノマーには 、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、３−アクリ ロイルオキシプロパンスルホン酸ナトリウム、アクリル酸ナトリウム、メタクリ ル酸ナトリウム及びスチレンスルホン酸ナトリウム並びに他の公知のスルホン酸 塩、硫酸塩、カルボン酸塩、その塩又は無水物が含まれるが、それらに限定され るものではなく、有用な非イオン性極性モノマーには、２−ヒドロキシエチルア クリレート、２．３−ジヒドロキシプロピルアクリレート、アクリルアミド、２ −ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２−ヒ ドロキシプロピルメタクリレート、アクリロニトリル及びＮ−イソブトキシメチ ルアクリルアミドが含まれる。好ましいモノマーは、２−アクリルアミド−２− メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、アクリル酸ナトリウム、３−アクリロイ ルオキシプロパンスルホン酸ナトリウム、メタクリル酸ナトリウム、２−ヒドロ キシエチルアクリレート、２．　３−ジヒドロキシプロピルアクリレート、アク リルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド及びアクリロニトリルである。

本発明のポリマー粒子は、全体が同じポリマーからなる均一な粒子であってよく 又はこれは、例えば、米国特許第３、７００．６０９号（１９７２年１０月２４ 日Ｔｒｅｇｅａｒらに対して発行）に記載されているようなグラフトポリマー及 び、例えば米国特許第４．４０１．７６５号（１９８３年８月３０日Ｃｒａｉｇ らに対して発行）のポリマーからなる粒子であってもよい。このことは、反応性 基又は分散安定性を与える基を含有するもののような、粒子表面上に存在しなく てはならないポリマーの繰り返し単位の全てが高価であるとき有利である。ポリ マー粒子は安価なモノマー又は浮力を調節するモノマーから製造でき、次いで、 必要な表面基を有する異なったポリマーのシェルを付加するために重合を続ける 。

このポリマー粒子は、乳化重合（回分式、半連続式及び連続式を含む）及び懸濁 重合技術、グラフト共重合並びにポリマー化学技術の当業者に公知の他のものを 含む、全ての適当な重合技術を使用して製造できる。例えば米国特許第４、４１ ５．７００号（前記した）及びＲｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｐｕｂ ｌｉｃａｔｉｏｎ　１５９６３（１９７７年７月）に記載されているような界面 活性剤又は乳化剤を使用すること無く、より小さい粒子を一般に提供するために それを使用する場合に、乳化重合が好ましいｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌ ｏｓｕｒｅは、Ｋｅｎｎｅｔｈ　ＭａｓｏｎＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｌｔ ｄ、、　Ｔｈｅ　Ｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒｍａｓｔｅｒ’ｓ、　８　Ｎｏｒｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ、　Ｅｍｓｗｏｒｔｈ、　Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ　ＰＯＩＯ７ＤＤ、 　Ｅｎｇｌａｎｄから入手できる刊行物である。

連続乳化重合は上記Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ刊行物に記載され ているように、最も好ましい技術である。調製方法の他の詳細は、米国特許第４ ．１６１．４０７号及び同第４．５４８．８７０号に見出すことができる。

二つの異なったポリマーからなるコアーシェルポリマーを提供するために、段階 乳化重合を使用できる。コアの乳化重合は、標準条件下で、反応容器に反応剤を 連続的に添加することにより、実質的な完結まで行う。次いで、シェルポリマー を作るために必要なモノマー及び触媒を、コアポリマーのラテックスを含む容器 に連続的に添加する。この方法で、シェルは、コアモノマーとシェルモノマーの 混合物であるものではない、一定の既知の組成を育する。

本発明で存用な代表的ポリマーには下記のものが含まれる。ポリ（ｍ＆ｐ−クロ ロメチルスチレン）、ポリ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−共 −２−ヒドロキシエチルアクリレート）（６７：３０：　３モル比）、ポリ（ス チレン−共−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン）（９５，５：　 ４．５モル比）、ポリ　（スチレン−共−Ｎ−Ｃｍ＆ｐ−（２−クロロエチルス ルホニルメチル）フェニルコアクリルアミド）　（９９，３：　０．７モル比） 、ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−共−メタクリル酸）（９５：５．９８ ：２及び９９．８：０．２モル比）、ポリ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロエチ ルスルホニルメチルスチレン−共−メタクリル酸）　（９３，５：　４．５　： ２モル比）、ポリ　（スチレン−共−Ｎ−Ｃｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホ ニルメチル）フェニルコアクリルアミド−共−メタクリル酸）　（９７，３：　 ０．７　＋　２モル比）、ポリ（スチレン−共−ｍ　＆　ｐ−クロロメチルスチ レン（７０：　３０モル比）、ポリ（スチレン−共−ビニルベンジルクロライド −共−アクリル酸）（８５：　１０：　５モル比）、ポリ（スチレン−共−アク リル酸）（９９：１モル比）、ポリ（スチレン−共−メタクリル酸）（９０：　 １０モル比）、ポリ（スチレン−共−アクリル酸−共−ｍ＆ｐ−ジビニルベンゼ ン’）（８９：１０：　１モル比）、ポリ（スチレン−共−２−カルボキシエチ ルアクリレ−））　（９０：１０モル比）、ポリ（メチルメタクリレート−共− アクリル酸）（７０：　３０モル比）、ポリ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−ビニルベ ンズアルデヒド）（９５：５モル比）、ポリ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−ビニルベ ンズアルデヒド−共−メタクリル酸’）　（９３：５：２モル比）。

どのようなアミン−又はスルフヒドリル含有リガンドも、そのリガンドが、それ ぞれポリマーの反応性基と、又はカルボジイミド若しくはカルバモイロニウム化 合物と、ポリマーが反応性のカルボキシル基を有している場合に粒子上のカルボ キシル基との反応により形成される中間物と反応する反応性のアミン又はスルフ ヒドリル基を含有している限り、本発明によりポリマー粒子に付着できる。

リガンド上のアミン又はスルフヒドリル基と直接容易に反応する反応性基を有す るポリマーを、必要ならば適当な緩衝液中で、リガンドと単純に混合し、そして 反応させる。

しかしながら、カルボキシル基含有ポリマー粒子へのリガンドの付着は、二段階 で行われ、その第一段には、ポリマー粒子の水性懸濁液をカルボジイミド又はカ ルバモイロニウム化合物と接触させ、カルボキシル基の代わりに中間の反応性基 を有する反応性中間ポリマー粒子を生成することが含まれる。この段階は、所望 のｐＨを与えるために適当な酸又は緩衝剤を使用して適当なｐＨで行われる。一 般に、ｐＨは６未満であるが、反応が進行する限りこれは限定的ではない。多分 、ｐＨは約３．５と約６との間である。カルボジイミド又はカルバモイロニウム 化合物の、粒子の表面上のカルボキシル基に対するモル比は、約１：１００〜約 １０＝１、好ましくは約１：１０〜約２：１である。

この方法の第二段に於いて、第一段で形成した反応性中間物を、反応性アミン− 又はスルフヒドリル基含有リガンドと接触させる。それにより粒子と反応性化合 物との間に共有結合が形成される。反応性化合物のポリマー粒子に対する重量比 は、一般に約１　：　１０００〜約ｌ：１、好ましくは約１：１００〜約１：ｌ Ｏである。

リガンド 必要な遊離のアミノ又はスルフヒドリル基を有する目的の生物学的リガンドには 、下記のものが含まれる。

ａ）ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に対して親和性を有する蛋白質入〇 ｂ）ビオチン又はビオチン錯体に対し親和性を有するアビディン又はアビディン 錯体。

本発明の試薬を調製するのに使用することができるアビディン及びビオチン誘導 体には、ストレプトアビディン、スクシニル化アビディン、モノマーアビディン 、ビオシチン（即ち、ビオチン−ε−Ｎ−リジン）、ビオシチンヒドラジッド、 ２−イミノビオチンのアミン又はスルフヒドリル誘導体及びビオチニル−ε−ア ミノカプロン酸ヒドラジッド並びにビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ ステル、スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート、Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドイミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラジ ッド、ｐ−ジアゾベンゾイルビオチン及び３−（Ｎ−マレイミドプロピオニル） ビオチンが含まれる。

Ｃ）それが高められたものに対する抗原に対する特定の親和性を有するモノクロ ーナル抗体及びその抗原。

ｄ）ポリクローナル抗体及びそれらのそれぞれの抗原。

ｅ）プラスミノーゲンに対する親和性を有するリジン。

ｆ）フィブロネクリン（ｆ　１ｂｒｏｎｅｃｌ　ｉｎ）に対する親和性を有する ゼラチンのような、他の蛋白質又は目的とする生物学的巨大分子に対する特定の 親和性を有する、蛋白質及びその他の生物学的巨大分子。

ｇ）オリゴマー又は巨大分子の生物学的分子に対する特定の親和性を有する、小 さい分子及びオリゴマー種、例えば糖類、ＤＮＡベース、ＤＮＡオリゴマー及び ホルモン。

ｈ）ある種の糖類及び糖含有巨大分子に対する特殊性を有するコンカバリンＡ　 （Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ　Ａ）　、凝固ファクターに対する親和性を有するヘパ リン、脂蛋白質、プラズマ蛋白質などのような、生物学的分子の特別の種類に対 する特殊性を有する巨大分子。

ｉ）色素Ｃ１ｂａｒｃｏｎ＠　Ｂｌｕｅ　Ｆ３Ｇ−Ａ及びアルブミン、アルデヒ ド含有コファクター、凝集ファクター及びインターフェロンに対する特殊性を存 する他の蛋白質特殊疎水性色素のような生物学的分子の種類に対する特定の親和 性を有する小さい分子。

ポリマー粒子から充填物質を製造する一般的な方法には、一般的に公知の反応を 使用して選択されたリガンドを粒子に共有結合で付けることが含まれる。多くの 付属基、例えば、ハロアルキル、２−置換活性化エチルスルホニル及びビニルス ルホニルで、リガンドは粒子に直接付着できる。一般的に、ポリマー粒子を、緩 衝水溶液（一般的に、約７〜約１０のｐＨ）中で、約０．１〜約４０重量％の（ 好ましくは、約０．１〜約１０重量％の）ポリマー粒子の濃度で、リガンドと混 合する。

リガンドの量は、ポリマーに対する比で、約ｏ、　ｉ　：　ｔｏｏｏ〜約１：１ ０、好ましくは約１：１００〜約１：１０である。混合は、約５〜約５０°Ｃ１ 好ましくは約５〜約゛４０°Ｃの範囲内の温度で、約０．５〜約４８時間行う。

任意の適当な緩衝剤を使用することができる。

ある例では、外表面のペンダント反応性基は、リガンドの共有結合付着を起こさ せるために、変性又は活性化されなくてはならない。例えばカルボキシル基は、 上記の公知のカルボジイミド又はカルバモイロニウム化学を使用して活性化され なくてはならない。

他の例で、外表面上のエポキシ基は、加水分解して、免疫学的種の中のアミン基 のためのカップリング剤として作用し得る臭化シアンと反応できるジオール化合 物を形成できる。

アルデヒドはアミンと直接反応して、続いて還元され共有結合を形成することが できるシッフ塩基を形成することができる。また、アルデヒド基は酸に酸化する ことができ、カルボキシル基について前記同定した化学をアミド結合を形成する ために使用できる。

下記の例は本発明の利用性を立証する。

例１ Ａ、付着したリガンドを育する高速アフィニティクロマトグラフィー（ＨＰＡＣ ）ポリマー粒子の製造２−のポリ（スチレン−共−２−クロロエチルスルホニル メチルスチレン）（モル比９５．５／　４．５　）ビーズのある量（１３，０２ ｇ）を、８６．４８ｍ１のＯ，１Ｍ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラ ジンプロパンスルホン酸（Ｅ　Ｐ　Ｐ　Ｓ）緩衝液（ｐＨ８，５）及び０．５０ ｍ１の２０ｍｇ／ｍｌでの蛋白質入と一緒にした。

蛋白質Ａは、側鎖のクロロエチルスルホニル基を介してポリマービーズに共有結 合で結合している。室温で５時間後に、１０ｍ１のｌＯ％ＢＳＡ　（ウシ血清ア ルブミン）を添加し、反応を１６時間室温で続けた。蛋白質Ａと反応しなかった 全ての側鎖クロロエチルスルホニル基に蓋をかぶせるためにＢＳＡを使用する。

これは全ての望ましくない成分の結合を防止する。

ビーズを遠心分離し、浮遊物を捨てた。ビーズを再懸濁し、ＰＢＳ　（燐酸塩緩 衝食塩水）で３回洗浄し、最終的に０．０１％メルチオレートを含有するＰＢＳ の３０ｍ１中に再懸濁させ、４°Ｃで貯蔵した。

Ｂ、高速アフィニティクロマトグラフィー（ＨＰＡＣ）充填カラムの製造 付着した蛋白質Ａリガンドを有する上記製造したポリマー粒子（４，４％固形分 で２２ｍ１）を、前カラムを取り付けたマイクロメーター調製スラリー充填器（ Ｍｉｃｒｏｍｅｔｒｉｃｓ　ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＳｌｕｒｒｙ　Ｐａｃｋｅ ｒ）内に入れ、１．６　ｍｌ／分で充填器内へＰＢＳを送液することにより４． ６　Ｘ４０ｍｍクロマトグラフィーカラム内へ充填した。圧力が６０００ｐｓｉ 　（４３ｋＰａ）になった後、流速を６分間１．５　ｍｌ／分に減少させ、次い で２５分間１．４　ｍｌ／分に減少させた。カラムを充填器から取り外した後、 末端部品を取り付け、カラムを目的の分離で使用する結合及び溶出溶剤（移動相 ）で前処理した。こうして、カラムを、ａ）１．５Ｍグリシン及び２．０ＭＮａ ＣＬを含有する溶液（９８８，９）で、次いでｂ）０．１Ｍクエン酸ナトリウム を含有する溶液（ｐＨ３）で、次いでｃ）１．．５Ｍグリシン及び２．０ＭＮａ Ｃ１を含有する溶液（ｐＨ８，９）で平衡化した。次いでカラムを１ｍｌの１％ ＢＳＡで処理し、最終的に２８０ｎｍでの吸収のベースラインが戻るまで０．１ Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）で処理した。全ての流速は０．５　ｍｌ／分で あった。カラムを０．１ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で４°Ｃで貯 蔵した。

溶剤としてＰＢＳでの流速／圧力特性を表Ｉに示す。データをそれらが得られた 順で示す。結果は、少なくとも１．４ｍｌ／分ＰＢＳ以下の流速についてヒステ リシスが無い（ビーズが崩壊しなかったことを意味する）ことを示している。

表■ ０．５　１３８０　（９，５ｋＰａ） ０．６　１６２０　（１１，２ｋＰａ）０．８　２１６０　（１４，９ｋＰ＆） １．０　２６４０　（１８，２ｋＰａ）１．２　３１２０　（２１，５ｋＰａ） １．４　３６００　（２４，８ｋＰａ）１．２　３１２０　（２１，５ｋＰａ） １．０　２６４０　（１８，２ｋＰａ）０．８　２１６０　（１４，９ｋＰａ） ０．６　１６２０　（１１，２ｋＰａ）Ｃ９培養媒体からのラットモノクローナ ル抗体ＣＫ　１４．５２の分離 ラットセルライン分泌ＣＫ　１４．５２からのコンディションドメディアの硫酸 アンモニウム沈澱の濃縮ＰＢＳ溶液を調製した。その０．５ｍｌの試料を、上記 Ｂに記載したようにして製造した高速アフィニティクロマトグラフィー蛋白質Ａ カラムに１．０ｍｌ／分で適用した。カラムを２ＭＮａＣ１中の１．５Ｍグリシ ンの緩衝溶液（ｐＨ８，９）で平衡化した。同じ緩衝液を非生成物ピークを溶出 するために使用した。非生成物ピークには、水性試料をカラムに適用したとき結 合しないでカラムを通過した量のＣＫ　１４．５２を含んでいる。ＣＫ１４．５ ２の溶出を０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５で行った。試料（それぞれ１．０ ｍ１）を、分離工程を通して捕集した。試料を０．０６より大きい２８０ｎｍで の吸収で、ラットモノクローナル抗体についてのＥＬＩＳＡ特定評価を使用して ＣＫ　１４．５２について分析した。その結果を表■に示す。

この結果はＣＫ　１４．５２の定量的回収及び１．０ｍｌ／分の流速で９４５” ｇの容量を示している。

フラクション３４２０±２８ フラクション４　３２±　０．９ フラクシヨン９　３７±　３ フラクシヨン１０　７００±１００ フラクシヨン１１　２０８±２８ 適用した試料　１３７５±２０ 通　過　４５２±　２８９ 生成物ピーク　９４５±１０４０ 全溶出　１３９７±１０７ ３　フラクション３及び４０合計 ０フラクション９．１０及び１１の合計興スー腹水からのマウス■ｇＧ２Ａの分 離再構成した腹水（シグマ）の試料（０，０５ｍ１）を、例ＩＢで製造したカラ ムに、１ｍｌ／分で適用し、次いで１．５Ｍグリシン及び２ＭＮａＣ１緩衝液（ ｐＨ８，９）でカラムの平衡化を行った。同じ緩衝液で非結合物質を溶出した。

マウスＩｇＧｔＡの溶出を０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３，０で行った。

１ｍｌのフラクションそれぞれを、０．５ｍｌの０．２　Ｍ　Ｔｒｉｓ　５ｐ８ ８．０を含有する管内へ捕集した。カラムフラクションを、マウス■ｇＧ２Ａの ためのＥＬＩＳＡを使用して定量し、その結果を表■に示す。カラムに適用した ＩｇＧ２Ａの全てが、非結合フラクションで通過したものがその１％未満で、回 収されることが明らかである。

フラクション１〜３１．０ フラクション１１＋１４　８．４ フラクシヨン１２２８１ フラクション１３８２ 適用した試料　３６９ 通　過　１．０９ 生成物ピーク　３７１．４゜ 全溶出　３７２ ０　フラクション１〜３の全量 一フラクション１１〜１４の全量 例３−リジンリガンドを含めるためにｉｎ　５ｉｔｕで変性された非多孔質ビー ズで充填されたＨＰＡＣカラムでの、ウシ血漿からのプラスミノーゲンの分離 Ａ、このカラムはｉｎ　５ｉｔｕで製造した。２ｐのポリ（スチレン−共−２− クロロエチルスルホニルメチルスチレン）非多孔質ビーズ（モル比９５．５／　 ４．５　）の量（８，０％固形分で１４ｍ１）を、前カラムを取り付けたマイク ロメーター調製スラリー充填器内に入れ、０．８　ｍｌ／分で充填器内へ水を送 液することにより４．６　Ｘ５０ｍｍカラム内へ充填した。充填が終了した時点 で、カラムを充填器から取り外し、末端部品を取り付けた。

充填されなかったラテックスの固形分を測定することによって、全部で０．５４ 　ｇの非多孔質ビーズがカラム内に充填されたことが示された。

リジンをＯ，ＩＭ　ＥＰＰＳ、ｐＨ８，５中の１ｍＭで、０．３ｍｌ／分で１５ 時間カラム内に送液することによって、リジンリガンドを非多孔質ビーズに共存 結合で結合させた。ウシ血清アルブミンのアリコート（１ｍｌ中に１■）を、添 加された全部の蛋白質試料が溶出される（溶出緩衝液０．１Ｍ　ＥＰＰＳ、ｐ） ４８．５）まで、０．５　ｍｌ／分でカラム内に注入した。全部で６アリコート を注入した。０．４■のウシ血清アルブミンがカラムにより保持された。カラム を室温で一夜インキユベートさせ、結合したウシ血清アルブミンを樹脂にカップ リングさせた。

Ｂ、プラスミノーゲンの分離 ウシ血漿の１ｍｌ試料（０，１ｍＭ　ＥＤＴＡでＰＢＳに対して予備透析した） をカラムに注入した。このカラムを０．４Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ７，２中で、 ０．５　ｍｌ／分で平衡化した。非保持蛋白質を溶出するために、同じ緩衝液を 使用した。生成物の溶出を、ＰＢＳ中の０．２Ｍε−アミノカプロン酸で行った 。

この緩衝液により溶出された小さいピークを、ゲル電気泳動により分析した。単 一の蛋白質バンドが、銀着色で可視化された。これはプラスミノーゲンについて 期待されるような、見掛は分子量９１．０００を有していた。

これらの結果は、リガンドが予備充填された非多孔質単分散ポリマー粒子に付着 でき、高速アフィニティクロマトグラフィーで複合混合物からの蛋白質の分離を 行うために機能できることを示している。

本発明をその好ましい態様を特に参照して詳細に記載したが、変形及び修正が本 発明の精神及び範囲内で有効であることが理解されるであろう。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年８月ｚＯ日

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｂ）充填物質を含む、Ａ）クロマトグラフカラムを含んでなり、その充填物 質が、ｉ）０．０ｌ〜約５ミクロメートルの範囲内の粒子サイズ及びｉｉ）生物 学的リガンドの遊離のアミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシ基又はアルデヒ ド基と直接的又は間接的に反応性である表面反応性基を有する、複数の非多孔質 、単分散ポリマー粒子である、高速アフィニティクロマトグラフィー分離装置。
2. ２．ポリマー粒子の表面反応性基が、 ａ）活性ハロゲン基、 ｂ）活性化された２−置換エチルスルホニル基又は活性化されたビニルスルホニ ル基、 ｃ）反応性カルボキシル基、 ｄ）エポキシ基、 ｅ）イソシアネート基、 ｆ）アミン含有基、 ９）アジリジン基、 ｈ）アルデヒド基、 ｉ）２−置換エチルカルボニル基、 ｊ）サクシンイミドキシカルボニル基及びｋ）スルフヒドリル基 からなる群から選択される請求の範囲第１項記載の装置。
3. ３．表面反応性基が、 ａ）活性ハロゲン基、 ｂ）活性化された２−置換エチルスルホニル基又は活性化されたビニルスルホニ ル基、 ｃ）反応性カルボキシル基及び ｄ）サクシンイミドキシカルボニル基 からなる群から選択される請求の範囲第２項記載の装置。
4. ４．表面反応性基が、炭素原子１〜３の活性ハロメチル基から選択される請求の 範囲第３項記載の装置。
5. ５．表面反応性基が、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン又は式： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｖ 〔式中、Ｒは、水素又は置換若しくは非置換アルキルであり、Ｒ１は、−ＣＨ＝ ＣＨＲ２又は−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ（但し、Ｘは求核試薬により置き換えられるか又 は塩基での処理によりＨＸを形成して除去される脱離基である）であり、Ｒ２は 、水素、炭素原子１〜６の置換若しくは非置換アルキル又は核炭素原子６〜１２ の置換若しくは非置換アリールであり、 Ｌは、主鎖に１〜２０個の炭素及びヘテロ原子を有する置換若しくは非置換アル キレン結合基であり、核炭素原子６〜１２を有する置換若しくは非置換アリーレ ン又は上記定義のアルキレン及びアリーレン基のそれぞれの１個又はそれ以上の 二価の組合せである〕 を有する群から選択された重合したモノマーから誘導される、請求の範囲第３項 記載の装置。
6. ６．ポリマー粒子が、ポリ（スチレン−共−ビニルベンジルクロライド−共−ア クリル酸）（８５：１０：５モル比）、ポリ（スチレン−共−アクリル酸）（９ ９：１モル比）、ポリ（スチレン−共−メタクリル酸）（９０：１０モル比）、 ポリ（スチレン−共−アクリル酸−共−ｍ＆ｐ−ジビニルベンゼン）（８９：１ ０：１モル比）、ポリ（スチレン−共−２−カルボキシエチルアクリレート）（ ９０：１０モル比）、ポリ（メチルメタクリレート−共−アクリル酸）（７０： ３０モル比）、ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）、ポリ（スチレン−共− ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン）（９５．５：４．５モル比） 、ポリ｛スチレン−共−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル） フェニル〕アクリルアミド｝（９９．３：０．７モル比）、ポリ（ｍ＆ｐ−クロ ロメチルスチレン）、ポリ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−共 −２−ヒドロキシエチルアクリレート）（６７：３０：３モル比）、ポリ（ｍ＆ ｐ−クロロメチルスチレン−共−メタクリル酸）（９５：５、９８：２及び９９ ．８：０．２モル比）、ポリ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニル メチルスチレン−共−メタクリル酸）（９３．５：４．５：２モル比）、ポリ｛ スチレン−共−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル 〕アクリルアミド−共−メタクリル酸｝（９７．３：０．７：２モル比）及びポ リ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）（７０：３０モル比）から なる群から選択されたポリマーの粒子である請求の範囲第２項又は第３項記載の 装置。
7. ７．ポリマー粒子が表面ペンダント反応性基を介して生物学的リガンドに結合し ている請求の範囲第２項又は第６項記載の装置。
8. ８．ポリマー粒子が表面ペンダント反応性基を介して、蛋白質Ａ、アビディン又 はアビディン錯体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、リジン、ゼラチ ン、ヘパリン、コンカバリンＡ及びＣｉｂａｒｃｏｎ■ＢｌｕｅＦ３Ｇ−Ａから なる群から選択された生物学的リガンドに結合している請求の範囲第２項又は第 ６項記載の装置。
9. ９．ポリマー粒子が表面ペンダント反応性基を介して、蛋白質Ａ、ヘパリン、ゼ ラチン、コンカバリンＡ、蛋白質Ｇ又は蛋白質特定疎水性色素からなる群から選 択された生物学的リガンドに結合している請求の範囲第２項又は第６項記載の装 置。
10. １０．ポリマー粒子が１〜３μｍの範囲内のサイズを有する請求の範囲第２項又 は第６項記載の装置。
11. １１．Ａ）目的の生物学的種を含むと考えられる水性試料を準備し、 Ｂ）請求の範囲第７、８、９又は１０項に記載の高速アフィニティクロマトグラ フィー分離装置を準備し、そしてＣ）前記試料について高速液体クロマトグラフ ィーを行うことにより所望の分離を達成する、 各工程を含んでなる、水溶液から生物学的種を分類する方法。
12. １２．キットが、 ａ）クロマトグラフカラム、 ｂ）請求の範囲第２項又は第６項に記載のクロマトグラフカラム充填物質及び ｃ）生物学的リガンド からなる、高速アフィニティクロマトグラフィーに使用する要素を含んでなるキ ット。
13. １３．生物学的リガンドがペンダント基を介してポリマー粒子に共有結合で結合 している、請求の範囲第１２項記載のキット。
14. １４．生物学的リガンドがキット中に存在するが、粒子に付着していない請求の 範囲第１２項記載のキット。
15. １５．キットが、 ａ）クロマトグラフカラム及び ｂ）請求の範囲第２項又は第６項に記載のクロマトグラフカラム充填物質、 からなる、高速アフィニティクロマトグラフィーに使用する要素を含んでなるキ ット。
16. １６．充填物質が請求の範囲第２項又は第６項に記載のものであるクロマトグラ フカラム用の充填物質を含んでなるキット。