JPH04503752A - インビトロでのｄｎａの増幅、ゲノムクローニングおよびマッピングの、改良された方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 インビトロでのＤＮＡの増幅、ゲノムクローニングおよびマツピングの、改良さ れた方法 発明の背景 本発明の分野は核酸のインビトロでの増幅に関する。さらに詳しくは、本発明は 配列決定および物理的マツピング操作における核酸のクローニングおよび複製の 新規な方法に関する。さらにまた本発明は、非常に複雑で長いゲノムの効率良い 物理的マツピング法に関する。

ゲノムＤＮＡのマツピング（地図作製）能力および配列決定能力ぼ生物科学およ び医科学分野に重要な応用をもたらす。まれな疾患に関係するヒト遺伝子の位置 決定は、遺伝子の単離とクローニング、および原因遺伝子産物および突然変異の 同定の重要な出発点であり、その結果、疾患の分子的基盤をより良（理解するこ とができる。がん、アルツハイマー症および他の疾患の遺伝形に関連した、ヒト 染色体ＤＮＡ中の遺伝子または領域を同定することにより新たな診断法および治 療法が開発され得る。

ゲノムのマツピングは特定の染色体上の遺伝子および他の特徴の位置を正確に示 すことを意味する。配列決定は染色体上のヌクレオチドの順番を決定することを 意味する。主要な２種のゲノム地図は、遺伝的連鎖地図（リンケージマツプ）と 物理的地図である。連鎖地図は、一般に、２つの異なる特徴が一緒に遺伝される 、あるいは連鎖している頻度を研究することにより、作成される。物理的地図は 主に、ゲノムを構成するＤＮＡの化学的な測定により作成される。

従って、物理的地図には幾つかの異なるタイプがあり、そのままハイブリダイゼ ーションすることにより得られる低分解度の地図（ｌ。

★ｅｒ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍａｐ）と、制限地図が含まれる。これらの地 図はいずれも染色体上の遺伝子の相対的な位置に従って、それらの遺伝子情報を 系統的に直線に表すという共通の目的を有する。

制限地図は制限酵素と呼ばれる特異的なタンパク質によって切断されるＤ　Ｎ　 Ａ内の部位に基つく。各酵素は°“認識配列”と称される短い特殊なヌクレオチ ド配列を認識し、Ｄ　Ｎ　Ａの各鎖を゛′開裂部位”または“制限部位”、これ らは認識配列内かそれから幾分離れた位置にある、と言われる幾つかの点で切断 する。１つの、または他の制限酵素によって多くの異なるヌクレオチド配列が認 識され、またこれらの配列が一般的に無作為にゲノム中に散在しているので、物 理的地図は異なる制限部位の相対的な位置を正確に決定することにより構築され 得る。

細菌大腸菌のゲノムはおよそ４７０万塩基対からなる。最小のヒト染色体はその １０倍の大きさであり、完全（ハブロイド）ヒトゲノムは約３ｏ億塩基対からな る。大多数のゲノムは大きいサイズを有するので、制限マツピングにおいて特に 価値のある酵素は長いＤＮＡ断片、好ましく１００，０００から２，０００，０ ００またはそれ以上の塩基対長さのＤＮＡ断片にゲノムを切断する、かなり低頻 度の認識部位を有する酵素か、ゲノムを通してスペースの距離が長い認識部位を 有する酵素である。ＤＮＡ基質を制限酵素で消化して生成したＤＮＡ断片は“制 限断片”と称される。一般に、生成するゲノム制限断片の数が少なければ少ない ほど、それらを物理的地図に正確に配列する仕事が容易になる。

ＤＮＡを低頻度で切断する制限酵素でマツピングされた最大ゲノムは大腸菌の単 一の染色体であった。スミスら［Ｓｍ１ｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃ ｅ　２３６：　１４４８−１４５３　（１９８７）］。その当時とられた手段は 大腸菌染色体ＤＮＡを８個のヌクレオチド認識配列内を切断する制限酵素Ｎｏｔ ｌで切断し、１５，０００塩基対から１００万塩基対の範囲のＤＮＡ断片を生成 することであった。ＤＮＡ制限断片を順番に配置する上で必要な情報の大部分は 、既にクローンされ特性化された、大腸菌遺伝子に対応する標識プローブを用い るハイブリダイゼーション研究に由来していた。

このように、ゲノムの物理的地図の組み立てにおける第１段階は、一般に、個々 別々のＤＮＡ断片の単離とクローニングに関する。理論的には、感受性ＤＮＡプ ローブ法によりマツピングされるゲノムの小さい断片だけをクローニングして物 理的地図を作成することが可能である。しかしながら、実際には、そのような方 法は粗雑な物理的マツピングの段階にのみ適する。より高度な分解度を得るには 、大部分の物理的マツピングは、全ゲノムを網羅する重なり合ったＤＮＡクロー ンのコレクションを分析することにより行われているようである。物理的マツピ ングは個々のＤＮＡクローンの元のゲノム内での位置に従って個々のＤＮＡを配 置することが要求される。個々のクローンは、各ゲノム領域からの無尽蔵のＤＮ Ａ供給源を与えられるので特に有用である。ゲノムＤＮＡクローンは配列決定の ために精製され調製された実際のＤＮＡ断片を与えるので、ゲノムＤＮＡクロー ンコレクシランが手に入ることは、ゲノムのヌクレオチド配列を決定する上でも 必須条件である。

順序づけられたＤＮＡクローンコレクションから高分解度のゲノムの物理的地図 を構築する場合の主な限界は、非常に大きいＤＮＡ断片のクローニングを与える 現方法が提供されていないことにある。

例えば、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて細菌細胞内でクローニングで増幅され た最大のＤＮＡ断片のサイズは約５０，０００塩基対またはそれ以下である。こ の結果はＤＮＡ断片をコスミノド（４０゜０００から５０，０００塩基対長さの ＤＮＡ断片を含有するよう特別に設計された改良バクテリオファージラムダベク ター）にスプライシングすることにより達成される。

ゲノムの物理的地図の構築におけるこのコスミッドクローニングシステムの欠点 は２重である。第１に全ゲノムについて相互にオーバーラツプする完全な１セン トのＤＮＡ断片を生成するためには非常に多数のコスミッドクローンを構築する 必要がある。ノ＼プロイドヒトゲノムの場合、例えば、高い分解度の物理的地図 を得るためには、７５，０００から３７５，０００またはそれ以上の異なるコス ミッドクローンが必要であると見積もられていた。ビンズ［Ｐｉｎｓ。

１９８７、　“Ｍａｐｐｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ”　（Ｈｏｗａｒｄ　Ｈｕ ｇｈｅｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）］。第２に、コスミソドクローンは、より早い転写 のために短いサイズのものを選択する結果、しばしば欠失が蓄積され、および／ または細菌宿主細胞の増殖に影響を及ぼすコスミ・ノド上の特定の遺伝子の用量 が増加することにより、代謝の不均衡が起きることが知られている。従って、コ スミノドクローン、特に基本的な遺伝子を含有するコスミッドクローンは、通常 、維持することが困難である。

近年、異種ＤＮＡの大きい断片を人工染色体ベクターを用いて酵母でクローニン グする方法が記載された［パークら（Ｂｕｒｋｅ、　ｅｔ　ａｌ。

）　＋　１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ、　２３６：　８０６−８１２］　ｏこの“ 酵母人工染色体”　（ＹＡＣ）クローニングシステムの使用は、１００，０００ 塩基対に及ぶサイズのゲノムＤＮＡ断片をうまく増幅することができるという点 でコスミッドクローニングシステムよりも進歩している。しかしながら、ＹＡＣ クローニングシステムの使用にも幾つかの限界があり、特にそれをゲノムマツピ ングに適用する際にはそうである。例えば、ＹＡＣクローニングにおいては、酵 母細胞あたりのクローン化分子の数およびコロニー当たりの酵母細胞の数の両方 が細菌によるコスミッドクローニングよりもはるかに低く、分析に利用できるク ローン化ＤＮＡの量が制限される。さらに、どのようなインビボクローニング法 でも、ＹＡＣベクターによりクローン化されるＤＮＡ断片は、宿主細胞内でリア レンジメントまたは欠失を受けることがあるので、全ゲノムを表す１セツトのク ローンを得ることが困難になる。

従って、本発明の１つの目的は、ゲノムＤＮＡの大きい断片を、現行のインビボ クローニング法における問題を避けて、効率良くクローニングする方法を提供す ることにある。本発明の他の目的は、クローン化ＤＮＡ断片に示されているよう な、所望の核酸配列を増幅する方法を提供し、物理的および化学的分析に供する に充分な量の配列を生産することにある。この方法をインビトロで行う能力は、 あらゆる起源の核酸を、外来性核酸配列を宿主細胞内で増幅する場合ニ起き得る 、選択性、リアレンジメントおよび欠失等の問題を回避して増幅するために一般 的に適用し得る。同時に、数１００，０００塩基対またはそれ以上の大きさの範 囲の核酸配列を増幅する能力は、複雑なゲノムの高分解度の物理的地図の作成ま たは医学または生物学的に重要な無傷の遺伝子または遺伝子クラスターの単離等 に適用するのに適当である。

図１ａ−１ｂ（以下、図１と称する）はゲノムＤＮＡ基質を制限エンドヌクレア ーゼ５ｆｉｌで消化して得られる可能な制限断片の粘着末端の各々に相補的な粘 着末端配列を有する６４オリゴヌクレオチドリンカーを示す。

本発明はゲノムＤＮＡのクローニングおよびゲノムＤＮＡ制限断片のマツピング の改良法、およびそれらの方法と一緒にまたは独立して用いるためのＤＮＡの増 幅の改良法であって、バクテリオファージｐｈｉ２９複製起点とｐｈｉ２９にと って異種のゲノムＤＮＡを含有する新規で複製可能なりＮＡ類の合成を可能にす る方法を目的とするものである。

ゲノムＤＮＡのクローニング法は以下の工程を含む：（ａ）ゲノムＤＮＡを複数 の異なる粘着末端配列を生成する制限酵素で消化し； （ｂ）？Ｍ化したゲノムＤＮＡと、リポータ−ヌクレオチド配列と工程（ａ）の 制限酵素消化で生成した粘着末端配列に相補的な粘着末端配列とを含有するリン カ−を、リンカ−がゲノムＤＮＡの制限断片と結合するような条件下で接触させ ：（Ｃ）工程（ｂ）の生成物を増幅させる。

ゲノムＤＮＡ制限断片のマツピング法は以下の工程からなる：（ａ）ゲノムＤＮ Ａを複数の異なる粘着末端配列を生成する制限酵素で消化し： （ｂ）工程（ａ）の制限断片生成物を増幅させ；（Ｃ）該制限断片各々の粘着末 端配列を決定し；そしてそれに従って、 （ｄ）制限断片を物理的地図に配列する。

核酸配列の増幅法は以下の工程からなる：（ａ）２本鎖核酸、バタテリオファー ジｐｈｉ２９複数起点およびｐｈｉ２９にとって異種の核酸配列を合成し；（ｂ ）該２本鎖核酸から該複製起点のコントロール下でＤＮＡを合成する。

当該技術分野で既知の方法との比較において、本発明のゲノムＤＮＡのクローニ ング法およびゲノムＤＮＡ断片のマツピング法を用いて得られる利点は、本発明 方法によれば、ゲノムＤＮＡを特別のベクターに挿入し、それをインビボで複製 するという面倒で誤りの多い工程にたよることなく、またゲノムＤＮＡのいかな る部分１こついても、核酸配列または遺伝的機構についての予備知識なしに、事 実上、任意の長さのゲノムＤＮＡのクローニングおよびマ・ノビングが可能であ るという点である。

異種ＤＮＡをバタテリオファージｐｈｉ２９複製起点のコントロール下で増幅さ せる利点はｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシドトリ ホスフェートの存在下、１００，０００塩基対またはそれ以上の長さのＤＮＡを 鋳型として用い、ＤＮＡ産物のインビトロ合成が連続的に起きる点にある。従っ て、本発明方法では、当該技術分野で一般に用いられているポリメラーゼ鎖反応 （ＰＣＲ）法［Ｍｕｌｌｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔ、　Ｎｏ、 ４，６８３，１９５　］が要求する多数回の厳格なプライマーハイブリダイゼー ション反応を回避し、また長いＤＮＡ基質の増幅へのＰＣＲ法の適用における固 有の制限を排除することができる。

本明細書中“ゲノムＤＮＡ”とは、原核性細胞、真核性細胞またはウィルゲノム 中に通常存在する配列を含む任意のＤＮＡを指す。

真核性細胞のゲノムＤＮＡには、例えば、核染色体Ｄ’ＮＡ、またはミトコンド リアや葉緑体に存在するＤＮＡ等の核外染色体ＤＮＡが含まれる。また“ゲノム ＤＮＡ”という語句には、メツセンジャーＲＮＡやウィルスのＲＮＡゲノムから 調製されたあらゆるｃ　ＤＮＡが包含される。ゲノムＤＮＡの抽出および／また は精製法は例えば、クロスーベラードら（Ｃｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ、　ｅｔ 　ａｌ、＋　１９７８　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ術分野で周知である［マニア ティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｔ、）　＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ　（Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１ ９８２］。

本明細書中、“異種の（ヘテロローガス）”という語句はバクテリオファージｐ ｈｉ２９の複製起点のコントロール下で、普通は複製されない核酸配列を意味す る。通常、異種の核酸配列には原核性または真核性生物の核内または核外ゲノム に存在するＤＮＡ配列、ｐｈｉ２９以外のウィルスのゲノムが含まれる。異種の 核酸配列は任意の適当な方法、例えば、制限酵素を用いて天然に存在する核酸か ら回収するか、ＲＮＡから相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を合成する等のインビト ロ合成により調製され得る。

本明細書中、“リポータ−配列”という語句は、該リポータ−配列により、それ が関連している他の核酸分子を直接または間接的に同定することができる配列を 指す。リポータ−配列は明確にされた配列または明確にされた機能、または両方 を有するものであろう。

例えば、もしもリポータ−配列が明確にされた核酸配列を有するものであれば、 それと関連する核酸配列は、ハイブリダイゼーション（ここで、リポータ−配列 が固相支持体に固定化された相補的核酸配列とハイブリダイゼーションする）よ ってそれと関連する核酸分子が同定される。ハイブリダイゼーション法は例えば シャウテルらの記載（Ｃｈｏｕｔｅｌｌｅ、ｅｔ　ａｔ、、　＋９７８．　Ｇｅ ｎｅ　、３＋　１１３−１２２）や欧州特許出願（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔ、 　Ａｐｐ、　０２２１３０Ｂ（Ｃａｒｒｒｃｏ乃等の適当な方法を用いて行うこ とができる。またはリポータ−配列はその配列に関する知識と共に、または知識 なしに、それ自身の機能によって検出される。

例として、検出可能な表現型の遺伝子、または好ましくは複製起点またはプロモ ーターを挙げることができる。もしもリポータ−配列が複製起点またはプロモー ターを含有するならば、リポータ−配列に関連する核酸分子はリポータ−配列の コントロール下での複製または転写に基づいて容易に同定される。

本明細書中、リンカ−および制限断片に関して“粘着末端”という語句は２本鎖 核酸分子の末端に、相補鎖の塩基対領域を越えて突出する１本鎖延長部分を指す 。そのような１本鎖延長は、相補的ヌクレオチドの塩基対を介して他の配列とハ イブリダイズし、そのことにより分子内または分子間核酸結合をもたらすことが できるので、粘着末端と呼ばれる。１本鎖延長のヌクレオチド配列は“粘着末端 配列”と呼ばれる。粘着末端を有する制限断片は２本鎖ＤＮＡを後述する適当な 制限酵素で消化することにより好適に得ることができる。粘着末端を有するリン カ−も同様にして、または１本鎖オリゴヌクレオチドのアニーリング等によって 得ることができる。

リンカ−およびブラーマーに関して本明細書中、“オリゴヌクレオチド”という 語句は２またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはりボヌクレオチドか らなる核酸分子を意味する。所望のオリゴヌクレオチドは、天然に存在する核酸 から精製する、または新規に製造する、等の任意の適当な方法で製造される。幾 つかの方法、例えば、有機化学の種々の方法を用いて明確な配列を有するオリゴ ヌクレオチドを合成する方法が文献に記載されている［ナランら（Ｎａｒａｎｇ 、ｅｔ　ａｌ、）、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６８：９０−１０９．　１ ９８５；カウルサーズら（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、）、１９８５． 　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１５幻２８７；　フレーマー（Ｆｒｏｅｈｌｅ ｒ、　ｅｔ　ａｌ、）＋　１９８６　ｒ　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ ４：　５３９９−５４０７］。

任意の方法で調製されたオリゴヌクレオチドを、次いでライゲーションぐ結合） によって結合させるか、またはなんらかの必要な長さおよび配列の単一のオリゴ ヌクレオチドを形成する。

本明細書中、“リンカ−”という語句は天然に存在するものであるか、または合 成されたものであるにかかわらず、２本鎖ＤＮＡを含有するオリゴヌクレオチド を指す。

本明細書中、“プライマー”という語句は天然に存在するものであるか、または 合成されたものであるかにかかわらず、増幅すべき核酸の全部または１部と実質 上、相補的であるか、ホモロガス（同質）であるオリゴヌクレオチドを指す。プ ライマーは増幅すべき配列を含有する鋳型核酸とハイブリダイゼーションし、ポ リメライゼーションのための試薬の存在下で延長産物の合成をプライムする上で 充分な長さを有する必要がある。通常、プライマーは１５−３０またはそれ以上 のヌクレオチドを含有するが、それ以下であってもよい。しかしながら、プライ マーは増幅されるべき核酸配列またはその相補体の厳密な配列を反映したもので なくともよい。例えば、プライマーは、選択された条件下で増幅すべき核酸配列 またはその相補的配列とハイブリダイゼーションする限り、プライマーに非相補 的塩基が分散されていたり、プライマーから相補的塩基が欠失されていてもよい 。

本明細書中、゛起点（オリジン）プライマー”という語句は天然に存在するか、 または合成されたオリゴヌクレオチドであって、以下に定義する複製起点をプラ イマーの５°に有するオリゴヌクレオチドを指す。適当な条件下、およびポリメ ライゼーションのための試薬の存在下、起点プライマーは、増幅すべき核酸配列 またはその相補的配列と起点プライマーの複製起点とを含有する起点プライマー 延長産物の開始点として作用することができる。

本明細書中、“二次（セコンダリー）プライマー”という語句は天然に存在する か、または合成されたオリゴヌクレオチドであって、適当な条件下、およびポリ メライゼーションのための試薬の存在下、増幅すべき核酸配列またはその相補的 配列を含む二次プライマー延長産物の開始点として作用することができるオリゴ ヌクレオチドを指す。

本明細書中“延長産物（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ）”という語句は 核酸分子であって、プライマーがハイブリダイゼーションする核酸分子を合成の ための鋳型に用い、プライマーの３’　−ＯＨ末端から合成が開始されて得られ る核酸分子を指す。

本明細書中“ポリメライゼーションのための試薬”という語句は、通常、デオキ シリボヌクレオチドまたリボヌクレオチドから、既存の核酸を鋳型として用いて 核酸分子を合成するなんらかの酵素または触媒を意味すると理解される。そのよ うな酵素の例として、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写 酵素を挙げることができる。

本発明はその１態様において、ゲノムＤＮＡのクローニング法に関し、第１段階 としてゲノムＤＮＡを複数の異なる粘着末端配列を生成する制限酵素で消化する 。そのような酵素は当業者に既知であり、例えば、制限酵素旦担■、旦５ｔＸＩ 、旦ｇａｒ、Ｓ旦Ｉである。

制限酵素による２本鎖ＤＮＡの予測される開裂は、酵素がＤＮＡ基質のある塩基 対配列を認識する（認識配列）ことに起因する。この特異性はすべての制限酵素 各々の特徴であり、それはＤＮＡ類に関して基本的に一定である。大多数の制限 酵素の認識配列は４〜８塩基対またはそれ以上の特異配列からなり、さらに１ま たはそれ以上の無作為な塩基配列を含有していることもある。

認識配列に加えて、制限酵素はまた、ＤＮＡ基質の各鎖のホスホトリエステル結 合中に破損箇所をもたらし個々別々の制限断片を生ずる部位（開裂部位〉に関し ても特徴づけられる。特定の制限酵素の開裂部位は酵素の認識配列内またはそれ から幾分離れた位置に存在するかもしれない。複数の異なる粘着末端配列を生成 し得る制限酵素の場合、配列は必然的に１またはそれ以上の任意の（無作為な） 塩基対を含む開裂部位で直接的に囲まれているであろう。

例として制限酵素５ｆｉｌの認識配列は、下記のように、４塩基対の特異配列が ５個の無作為な塩基対で４塩基対の特異配列から分離されたものである。

番 ５’　、、、ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ，、、３。

３“　、、ＣＣＧＧＮＮＮＮＮＣＣＧＧ、、、　５　”式中、Ｎは４種のヌクレ オチド、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）またはシトシン（Ｃ） のいずれでもよい、３Ｍ１Ｉは認識配列内の、上下方回の矢印で示した部位でジ グザグの開裂をもたらす。従って、生じた各５ｆｉｌ制限断片は１方または両末 端に以下の配列の粘着末端を有する。

５”、、、ＧＧＣＣＮＮＮＮ３’ ３’　、、、ＣＣＧＧＮ　５’ ここに、粘着末端配列、５’　−ＮＮＮ−３’　は６４の可能なトリヌクレオチ ド配列のいずれかを含有する。

一般に、基質ＤＮＡが線状分子であれば、基質ＤＮＡを複数の粘着末端配列を生 成する制限酵素で消化して得られる制限断片は２つのタイプに分けられ、それら は、線状基質ＤＮＡの末端に由来する１つの末端と制限酵素によって生成した１ つの粘着末端を有する制限断片と、いわゆる制限酵素によって生成した２つの粘 着末端を有する“内部”制限断片である。もしも基質ＤＮＡが環状であればすべ ての制限断片は、制限酵素によって生成した２つの粘着末端を有するであろう。

本明細書の記載から明らかに、基質ＤＮＡを制限酵素で完全に消化して得られる 異なる制限断片の数と制限断片に関して可能な異なる粘着末端配列の数は用いる 制限酵素に依存する。

基質ＤＮＡを制限酵素で完全に消化して得られる異なる制限断片の数はまた、基 質ＤＮＡ内に存在する制限酵素認識配列の数に依存する。特異的認識配列の存在 数は制限酵素認識配列の長さと基質ＤＮＡのサイズから推測することができる。

ＤＮＡは異なる４種のヌクレオチドからなるので、ｎ塩基対長さの特異的認識配 列の統計的頻度は以下の式でめられる。

頻度−１／４″ 例えば、４塩基対の認識配列は頻度１／２５６で存在すると予測され、５塩基対 の認識配列は認識１／１０２４．６塩基対の認識配列は頻度１／４０９６等々で ある。次いで、基質ＤＮＡ中に特異的認識配列が存在する数は計算した認識配列 頻度に基質ＤＮＡのサイズ（塩基対）を掛ければよい。

複数の異なる粘着末端配列を生成し得る制限酵素により生成された制限断片の内 、あり得る粘着末端配列の数は、粘着末端配列内で起こり得る核酸の変化の関数 である。最も普通には、粘着末端配列内の無作為なヌクレオチドはアデニン、グ アニン、チミン、シトシンの４ヌクレオチドのいずれかであり、この場合具なる 粘着末端配列の予測される数は４ｎに等しい（ここに、ｎは粘着末端配列内の無 作為なヌクレオチドの数を表す）。

本発明には、複数の粘着末端配列を生成する任意の制限酵素を用いることができ るが、特定の場合の制限酵素の選択は基質ＤＮＡのサイズおよび複雑さに応じて 決定されるのが好ましい。

生成した後に、操作および／または分析に充当されるＤＮＡ制限断片の数を少く するために、選択される制限酵素は、通常、認識配列が基質ＤＮＡ内で比較的低 頻度なものであることが望ましい。例えば、原核性または真核性染色体ＤＮＡの マツピングでは、得られる制限断片の平均サイズが約１０，０００塩基対から１ ００，０００塩基対以上の範囲となるよう、通常、少なくとも６塩基対の認識配 列、好ましくは少なくとも８塩基対の認識配列を有する制限酵素が必要である。

所望により、制限断片産物の数の減少（これに対応してそれらの平均サイズの増 大）は、基質ＤＮＡと制限酵素との接触条件（反応時間や温度）を調整し、ＤＮ Ａ基質が部分的にのみ消化され、１またはそれ以上の制限酵素開裂部位を開裂さ れないままに残すことにより行うことか出来る。

同時に、制限酵素としては、十分な数の異なる粘着末端配列を有する基質ＤＮＡ の制限断片を生成し得る制限酵素が望ましい。一般に、粘着末端配列の数が大き くなるほど、得られた制限断片をその粘着末端配列に応じて区別し得る可能性が 増大し、次いで、個々のＤＮＡ制限断片のクローニングおよび／またはそれらを 物理的地図に配列することが容易になる。原核性または真核性染色体ＤＮＡの消 化のためには、例えば、選択される制限酵素は通常、最小限３つの無作為ヌクレ オチドを含む粘着末端配列に対応する少なくとも６４の異なる粘着末端配列を生 成し得るものである。

ゲノムＤＮＡのクローニング法では、適当な制限酵素てゲノムＤＮＡを消化した 後、次工程として、得られたＤＮＡ制限断片（類）をリポータ−配列と制限酵素 により生成された複数の異なる粘着末端配列の１つに相補的な粘着−末端配列と を有するオリゴヌクレオチドリンカーと接触させる。

オリゴヌクレオチドリンカーとＤＮＡ制限断片く類）を−緒にオリゴヌクレオチ ドリンカーの粘着末端が制限断片の相補的な粘着末端と特異的にハイブリダイゼ ーションするような条件下でインキュベーションすることが好ましい。リンカ− とそれがハイブリダイゼーションしているＤＮＡ制限断片とを、適当な任意の方 法、好ましくはＤＮＡリガーゼを用いるライゲーションにより共有結合的に結合 させる。リポータ−配列の存在は、得られた生成物のＤＮＡ制限断片混合物から の同定手段を提供し、好ましくは、得られた生成物の単離および／または選択的 な増幅の手段を与える。

ゲノムＤＮＡの消化によって異なる粘着末端配列を有する異なる制限断片が生成 したならば、本発明方法に従い、混合物を異なる制限断片の粘着末端配列と相補 的な配列を有する２またはそれ以上のリンカ−の組み合わせと接触させることに より、混合物中の異なる制限断片の各々をクローニングすると好都合である。

混合物中の異なる制限断片の粘着末端配列は通常、確実には知られていないので 、そのような状況下では、特定の制限酵素によって生成する可能性のある個々の 粘着末端配列と実質上相補的な粘着末端配列を有するリンカ−ライブラリーから なるリンカ−混合物を用いることが望ましい。このような方法で、実質上、各制 限断片粘着末端の各々が確実にリンカ−と結合し得る。ゲノムＤＮＡの消化で生 じた異なる制限断片の数に応じて、混合物の各部分を、別々の反応容器、例えば マイクロタイタープレートの別々のウェル等の中で個別にリンカ−ライブラリー の各リンカ−１好ましくは異なる粘着末端配列を有する２またはそれ以上のリン カ−と接触させることも好ましい。この方法により、いずれかの１つの反応でリ ンカ−と結合する異なる制限断片の数が減少し、その結果、個々のゲノムＤＮＡ 制限断片それぞれのクローニングを達成するために、異なる制限断片各々を相互 に分離する次工程を短縮または消去することができる。

ゲノムＤＮＡのクローニングの最終工程はなんらの適当な方法でリンカ−および リポータ−配列が結合したゲノムＤＮＡ制限断片のインビボ（宿主細胞内での複 製）またはインビトロにおける増幅である。明確にされた配列のリポータ−配列 が結合した制限断片のインビトロ増幅は、例えば、リポータ−配列の配列と相補 的な配列を含有するプライマーを用い文献記載の方法で行うことができる［ムリ スら（Ｍｕｌｌｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、）　前掲；ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ、　 ｅｔ　ａｌ、）、　ＰＣＴ　Ｐｕｂｌ、　Ｎｏ、　１０８９１０６７００．１９ ８９年７月２７日公開］。しかしながらこれらの方法のいずれも長いＤＮＡ断片 の増幅には十分に適当であるとは言えない。例えば、Ｍｕｌｌｉｓらの方法は増 幅反応に用いたＤＮＡポリメラーゼのプロセノシビティ−（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖ ｉｔｙ）が低く、誤操作率がかなり高いために、一般に数千塩基対以下の大きさ のＤＮＡ断片の増幅に制限される。ヒグチら（Ｈｉｇｕｃｈｉ、ｅｔ　ａｌ、） 、　１９８ｇ、　Ｎｕｃｔ性およびブライマーハイブリダイゼーションのサイク ルを複数回、行う必要があり、面倒な工程または自動化に要する費用が必要であ った。

本発明の特に好ましい態様ては、ゲノムＤＮＡのクローニングに用いるリポータ −配列はバクテリオファージｐｈｉ２９複製起点を含有し、それが結合した制限 断片の増幅はバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いてインビ トロで行われる。

“複製起点”という語句は、一般にポリメライゼーションのための試薬によって ＤＮＡ合成が開始されるＤＮＡ内の配列を指す。ギテレツら［Ｇｕｉｔｅｒｒｅ ｚ、ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：　 ５８９５−５９１４］はｐｈｉ２９ポリメラーゼが用いる最小のｐｈｉ２９複製 起点はｐｈｉ２９ＤＮＡの各端の末端１２塩基対内に位置することを開示した。

いわゆる゛″左側複製起点（ｌｅｆｔ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔ ｉｏｎ）”は配列５”　−ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣ−３′を含有し、“右側複 製起点（ｒｉｇｈｔ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）”は配列 ５’　−ＡＡＡＧＴＡＧＧＧＴＡＣ−３°を含有しており、複製は記載の５′− ３°方向に進む。しかしながら、これらの配列内の１またはそれ以上の位置で、 その機能を消滅させることなく、ヌクレオチドを変化させることができるので、 そのような配列の変化すべてを本明細書では“バクテリオファージｐｈｉ２９複 製起点”という語句の範囲に包含させてもよいと思われる。

ブランコら（Ｂｌａｎｃｏ、　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．　Ｇｅｎｅ　２９：　 ３３−４０）　、およびブランコおよびサラス（Ｂｌａｎｃｏ　ａｎｄ　５ａｌ ａｓ、１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　８１：５３２５−５３２９）は、いずれもｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラ ーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドで形質転換された大腸菌細胞からバクテ リオファージｐｈｉ２９ＤＮＡボゾメラーゼを精製したと記載している。ガルシ アら（Ｇａｒｃｉａ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｇｅｎｅ　２１：　６５ −７６）およびブリットら（Ｐｒｉｅｔｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｐ ｒｏｃ、　Ａｃａｄ、　Ｍａｔｌ、　Ｓｃｉ。

１９８４、８１：１６３９−１６４３　）はいずれもｐｈｊ２９末端タンパク質 遺伝子を含有する組換えプラスミドで形質転換された大腸菌細胞からバクテリオ ファージｐｈｉ２９末端タンパク質（ターミナルプロティン）を精製したと記載 している。

ブランコおよびサラス（Ｂｌａｎｃｏ　ａｎｄ　５ａｌａｓ、１９８５．　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８２：　６４０４−６４０８）お よびブランコら（Ｂｌａｎｃｏ、　ｅｔ　ａｌ、、１９８ｇ、　”ＥＭＢＯＷｏ ｒｋＳｈｏｐ　−Ｇｅｎｅ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ″ｐ、６３）は精製ｐｈｉ２９ 末端タンパク質およびｐｈｉ２９ＤＮ　Ａ　ホＩ／メラーセの存在下、バクテ２ ノオファー：；ｐｈｉ２９ＤＮＡの複製を記載している。２本鎖バクテリオファ ージｐｈｉ２９ＤＮＡの複製はプロティンプライミング機構により、ＤＮＡの両 端に存在する複製起点から開始される。ｐｈｉ２９末端タンパク質、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼおよび４種のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在 下、末端タンパク質−ｄＡＭＰ開始複合体（コンプレックス）が形成され、ｐｈ ｉ２９ポリメラーゼにより鎖置換機構を通して完全長さのｐｈｉ２９ＤＮＡが形 成される。

従って、本発明は他の態様において、長さ１０，０００塩基対以下の異種ＤＮＡ 配列と同様、長さ１０，０００から１００，０００塩基対以上のオーダーの異種 ＤＮＡ配列を増幅する方法であって、バタテリオファージｐｈｉ２９複製起点と 高度にブロセッシブなバクテリオファージｐｈｉ２９ポリメラーゼとを用いる方 法を提供するものである。本発明方法によれば、今や、いかなるＤＮＡ配列であ っても、その１または両方の末端にバクテリオファージｐｈｉ２９複製起点を導 入することにより容易に増幅することができる。このように、本発明は、天然に 存在せず、バタテリオファージｐｈｉ２９の複製起点のコントロール下で複製可 能な、新規なりＮＡ構築物を提供するものである。

バクテリオファージｐｈｉ２９複製起点は天然起源から得るか、合成によって得 ることができ、それをＤＮＡリガーゼを用いて異種ＤＮＡ断片の末端に結合させ るか、または部位特異的突然変異等の当業者既知の方法で増幅すべきＤＮＡに隣 接して導入するか、Ｍｕｌｌｉｓら（前掲）によって総括的に記載された方法に 従い、起点プライマーを用いる方法で増幅すべきＤＮＡに隣接して導入すること ができる。

バクテリオファージｐｈｉ２９複製起点のコントロール下での異種ＤＮＡ配列の 増幅は一般に水性緩衝液中、バタテリオファージｐｈ１２９末端タンパク質、バ クテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、および４種のデオキシヌクレ オシドトリホスフェートの存在下、および好ましくは完全長さの異種ＤＮＡの複 数コピーが合成されるよう、温度、塩濃度（例えばＭ　ｇ　’　”、　Ｎ　Ｈ４ ”等）およびｐ）（等の適当な条件下、インビトｏで行われる。

バクテリオファーンｐｈｉ２９複製起点からの復製は２本鎖ＤＮＡの１本鎖を鋳 型に用いて一方方向で進行するので、２本鎖異種ＤＮＡの増幅は、ＤＮＡ鋳型の 両路が複製されるようにＤＮＡの両末端にバクテリオファージｐｈｉ２９複製起 点を含有するリンカ−を結合させることにより行われる。従って、ゲノムＤＮＡ 制限断片の増幅は制限断片の両末端にバクテリオファージｐｈｉ２９複製起点を 含有するリンカ−類を結合させることにより、好適に行われる。バタテリオファ ージｐｈｉ２９複製起点を含有するリンカ−を、便宜上、“ｐｈｉ２９起点リン カ−（ｐｈｉ２９　オリジンリンカ−）”と称スる。

本発明の１態様では、ゲノムＤＮＡ制限断片は２つの制限酵素により生成された 粘着末端（類）を含有し、ｐｈｉ２９起点リンカ−（類）の各々は好ましくは、 ゲノムＤＮＡ制限断片の両末端の１方と相補的な粘着末端配列を有するであろう 。本発明の他の態様では、ゲノムＤＮＡ制限断片はゲノムＤＮＡ基質の元の末端 の１方と、制限酵素によって生成された粘着末端とを含有するであろう。通常、 ゲノムＤＮＡ基質の元の末端は平滑末端であり、その場合ゲノムＤＮＡ制限断片 の増幅は、好ましくは、元の末端には平滑末端を有するｐｈｉ２９起点リンカ− を結合させ、制限酵素によって生成された粘着末端にはそれと相補的な粘着末端 を有するｐｈｉ２９起点リンカ−を結合させることにより行うことができるであ ろう。本明細書中、“平滑末端”という語句は、２本鎖核酸の１本鎖突出を全く 持たない末端を指す。ゲノムＤＮＡ基質の元の末端が平滑末端でないならば、例 えば、Ｓｌヌクレアーゼまたは他の適当な１本鎖エキソヌクレアーゼを用いて１ 本鎖の突出部分を除去するか、既知の方法で元の末端を充填することにより好適 に平滑末端に変換することができる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前掲）参照 。

当業者ならば、本明細書中に開示した、異種ＤＮＡをバクテリオファージｐｈｉ ２９複製起点のコントロール下で複製させる本発明の増幅方法は、分子生物学お よび診断技術の様々な局面で適用可能であること、さらに発明のゲノムＤＮＡの クローニングおよびマツピング法との関係でのみ用いられるものではないことを 容易に理解するであろう。例えば、２本鎖ＤＮＡの１方の末端にバクテリオファ ージｐｈｉ２９複製起点を結合させることにより、ＤＮＡ配列決定またはハイブ リダイゼーションプローブとして用いるのに適する複数の１本鎖ＤＮＡ類を合成 する方法が得られる。

もしも１つの増幅工程で２またはそれ以上の異なるゲノムＤＮＡ制限断片が同一 反応で増幅されるならば、個別のゲノムＤＮＡりａ−ンを生成するために異なる 制限断片を相互に分離する必要がある。

異なる制限断片の分離は増幅の後、クロマトグラフィー、遠心分離、または電気 泳動等の、核酸を物理的に分離するための既知の方法のいずれかを用いて行うこ とができる。約１０，０００から１００゜０００塩基対またはそれ以上の長いＤ ＮＡ分子は、パルス電界ゲル電気泳動（ｐｕｌｓｅｄ　ｆｉｅｌｄ　ｇｅｌ　ｅ ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法で好適に分離される。カールおよびオルソン （Ｃａｒｌｅ　ａｎｄ　０１ｓｏｎ、　１９８４．　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄされた ＤＮＡ分子を既知の任意の方法で単離し、所望により、単離したＤＮＡを再び増 幅して、個々のＤＮＡゲノムクローンの各々の複数コピーを得ることができる。

または、異なるＤＮＡ制限断片を直接または間接的に異なる検出可能なシグナル を生成し得る部分で標識しく例えば、そのような部分をＤＮＡ制限断片と結合さ せるリンカ−に導入することにより）、これらの異なるシグナルに基いてＤＮＡ 制限断片を物理的に分離することができる。従って、例えば、検出可能な部分は 発蛍光団でもよく、ＤＮＡ制限断片をフローサイトメトリーによって分離するこ とができる。グレイら（Ｇｒａｙ、ｅｔ　ａｌ、、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３８：　３２３−３２９）。

さらにまた他の実施態様においては、本発明は複数の異なる粘着末端配列を有す るゲノムＤＮＡ制限断片の物理的マ、／ピングの効率良い手段を提供するもので ある。ゲノムＤＮＡを複数の粘着末端を有する配列を生じさる制限酵素で消化し た後、生成した様々な制限断片各々について、少なくとも各粘着末端の配列を含 めて、１方または両方の末端の配列を決定することにより、各制限断片の基質ゲ ノムＤＮＡ内での相対位置を確立する。様々な制限断片各々について粘着末端が 異なる場合、配置には、ゲノムＤＮＡ基質内で隣接する制限断片、従って共通の 開裂部位を有するもの、は相補的な粘着末端配列を有するという事実を利用する ことができる。

ゲノムＤＮＡ制限断片の末端のヌクレオチド配列は既知の核酸配列決定法の任意 の方法、例えばマクサムおよびギルバートの化学分解法（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　 Ｇ１１ｂｅｒｔ、　１９８０．　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５：　４９ ９−５６０）またはサンガーらのチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ、 　ｅｔ　ａｌ、。

１９７７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７４：　５４６３ −５４６７）で直接決定するか、制限断片に結合させたリンカ−（類）の粘着末 端の配列から間接的に決定することができる。

蓄積した配列データの処理および分析、特に個々のゲノムＤＮＡ制限断片の物理 的地図への配列は、コンピューターを用いて容易に行うことができる。例えばス タテン（Ｓｔａｄｅｎ、　１９ｇ２．　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０ ：　４７３１−４７５１）はコンピューターによるＤＮＡ配列情報の処理、およ びそれらの配列が重ね合って相互に関連しているＤＮＡ制限断片クローンの配列 について記載している。

以下の実施例は例示のために示したものであって、決して本発明を制限するもの ではない。実施例では、特許および文献を説明のために引用した。

精製アデノウィルス−２Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｈａｖｎ、ＣＴ）を１０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−Ｈｃｌ　（ｐＨ７，９）　、１０ｍＭＭｇＣＩｚ、１０ｍＭ２−メルカ プトエタノール、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ＩＯμｇ／ｍ＋ウシ血清アルブミン、２ ０μｓ／ｍｌアゾノウイスルー２ＤＮＡ、および５単位の５ｆｉｌを含有する全 量ＩＢｅｖｅｒｌＬ　ＭＡ）により５０℃においてＩｎ１ＪＴ消化する。

アゾノウイスルー２末端タンパク質の除去アゾノウイスルー２ＤＮＡは線状ＤＮ Ａ分子の各鎖の５“末端に共有結合的に結合したウィルス−コード化タンパク質 を有し、リンカ−と結合し得る末端を得るためにはこれを除去する必要がある。

ステイルマンら（Ｓｔｉｌｌｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、）　１９８Ｌ　Ｃｅ１ｌ　２ ３：　４９７−５０８；タマノイら（Ｔａｍａｎｏｉ、　ｅｔ　ａｌ、）　、１ ９ｇ２．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、７９：２２２１−２２ ２５゜アゾノウイスルー２ＤＮＡから５°末端タンパク質を分離するために、１ ０ｍｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７，５中の２０μｇ／ｍｌアゾノウイスルー２ ＤＮＡを等容量の１Ｍピペリジンと混合し、３７℃で２時間インキュベーション し、次いで、凍結乾燥し、水に溶解し、再度凍結乾燥する。

オリゴヌクレオチド合成 １本鎖の１２量体オリゴヌクレオチド５’　ＧＧＧＧＣＴＴＡＣＴＴＴ　Ｓ’　 と一般的な配列５°ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＮＮＮ３゜（ここにＮはアデニン 、チミン、グアニン、シトシンの４ヌクレオチドのいずれかである）を有する６ ４の異なる１本鎖１５１１体オリゴヌクレオチドの各々をフレーレルの方法（Ｆ ｒｏｅｈｌｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　前掲）に従い、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｍｏ ｄｅｌ　８６００　ＤＮＡ合成装置によって合成する。異なる１５量体オリゴヌ クレオチドの各々を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨｃＬ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍｇ ＣＩｔ、２０ｍＭ　ＮａＣ１を含有するハイブリダイゼーションバッファー中で 相捕的な１２量体オリゴヌクレオチドと２５°Ｃから３０’Ｃの温度範囲でアニ ーリングしてリンカ−を調製する。−殻構造： ５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＮＮＮ３“３°　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　 ５゜を有する６４リンカ−産物のヌクレオチド配列を図１に示す。

アゾノウイスルー２ゲノムのクローニングアゾノウイスルー２末端タンパク質を 上記のごとくにしてアゾノウイスル−２ＤＮＡの末端から除去する。２つのバク テソオファージｐｈｉ２９左側複製起点をテイルーテイル方向性で含有し、構造 ＝５“　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＧＧＧＧＣＴＴＡＣＴＴＴ３’３’　ＴＴＴ ＣＡＴＴＣＧＧＧＧＣＣＣＣＧＡＡＴＧＡＡＡ５’を有するリンカ−１００ｐｍ ｏｌを、得られたアゾノウイスルー２ＤＮＡ１００μｇについて用い、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７，８，１０ｍＭＭｇＣ１２，２ｍＭ　ジチオスレイト ーフ、１ｍＭ　ＡＴＰ。

１ｍＭスペルミジンおよび５０μｇ　／　ｍ　Ｉウソ血清アルブミンを含有する ライゲーションバッファー中でアゾノウイスルー２ＤＮＡの平滑末端に結合させ る。反応混合物中のアゾノウイスルー２、マクログラムあたりＴ４ＤＮＡリガー ゼ２単位（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）を加え、反応混合物を１５℃で１時間インキュベーシ ョンする。

バタテリオファージｐｈｉ２９起点リンカ−のアゾノウイスル−２の元の末端へ の結合の後、アゾノウイスルー２ＤＮＡを上記のように５ｆｉｌで消化する。次 いで、生成した５ｆｉｌ制限断片のクローニングは、個々の９６ウエルマイクロ タイタープレートで本発明方法に従って好都合に行われる。

マイクロタイタープレートの別個のウェルに図１の異なる２個のリンカ−各１０ ０１００ｐを加え、図１の異なる２個のリンカ−の可能な組み合わせがすべて１ つのまたは他のマイクロタイターウェルに含有されるようにする。図１の６４リ ンカ−の異なる組み合わせの数、即ち５ｆｆｌ制限断片のクローニングのために 用意すべきマイクロタイターウェルの数は２０１６である。一般に、Ｎ個の異な るリンカ−の異なる組み合わせの数は以下の式によりめられる。

組み合わせの数＝　（Ｎ”−Ｎ）／２ 次いで、別個のウェルの各々に５ｆｉｌ消化アゾノウイスル一２ＤＮＡＩμｇを 、ライゲーションバッファー２５μｌ中のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ） ２単位と一緒に加える。反応混合物を１５°Ｃで１時間インキュベーションし、 リンカ−をアゾノウイスルー２ＤＮＡ制限断片と結合させる。

このライゲーション反応は６８℃で１５分間加熱することで終止する。

リンカ−のアゾノウイスルー２ＤＮＡ制限断片への結合の後、各マイクロタイタ ーウェル内の反応混合物に各２０μＭ０）ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰＳｄＣＴＰ、２０ｍＭ　（ＮＨ，）、ＳＯ，，５％（ｖｏｌ ／ｖｏｌ）グリセリン、精製バクテリオファージｐｈｉ２９末端タンパク質３０ ０ｎｇおよびバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ２０ｎｇを加え る。３０℃で２時間インキュベーションした後、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを加え６８ ℃で１０分間加熱してＤＮＡ合成反応を停止する。

ＤＮＡ合成反応混合物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲルを臭化 エチジウムで染色して、増幅されたアゾノウイスル２　Ｄ　Ｎ　Ａ制限断片を観 察し、電気溶出でゲルから精製する。制限断片の各鎖のそれぞれの末端の配列決 定はα５ａｐ−コルジセピン−５°　−トリホスフェートを３′末端の標識に用 いて上記のマキサムおよびギルバートの方法で行う。

から１６．０００塩基対の範囲の４つの制限断片が生成する。各制限断片の３′ 末端のヌクレオチド配列は以下の通りである。

断片　配列 ２５゛　・・・・・・ＧＡＣ３゜ ３”ＧＡＣ・・・・・・　５゛ ３５”　・・・・ＡＴＧ３’ 物理的地図への制限断片の配列は各制限断片の核酸配列のヌクレオチド配列を、 相補的な３°末端配列を得るために、分析することにより行われる。従って、ア ゾノウイスル−２ＤＮＡの４つの江Ｉ制限断片は以下のごとく配置される。

（断片　３） アゾノウイスルー２ＤＮＡの内部５ｆｉＩ断片のクローニングこの実施例では予 め定められた粘着末端を有するゲノムＤＮＡ制限断片のクローニングの態様を説 明する。

アゾノウイスルー２ＤＮＡを上記と同様５ｆｉｌで消化する。アゾノウイスルー ２ゲ／ムの既知のヌクレオチド配列［ロバーツら（Ｒｏｂｅｒｔｓ、ｅｔ　ａｌ 、）　１９８６．　“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ″、Ｗ、Ｄｏｅｒｆｌｅｒ 　（ｍ）　（Ｍａｒｔｉｎｕｓ　ＮｉｊｈｏｆｆＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｂｏ ｓｔｏｎ、　ＭＡ）　］　、得られた制限断片の１つは以下の構造： ５’　ＣＧＧＣ，、、ＧＣＣＧＧＡＣ３’３°　ＧＡＣＧＣＣＧ、、、ＣＧＧＣ ５’を有し、アゾノウイスルー２ＤＮＡのヌクレオチド１７３０５からヌクレオ チド２３０４６に至るものと推測される。

この制限断片のインビトロクローニングの最初の工程として、Ｓ■工消化アゾノ ウイスルー２ＤＮＡ１μｇを配列：５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＣＴＧ３゜ ３“ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’ を有するオリゴヌクレオチドリンカー１００１００ｐおよび配列＝５’　ＡＡＡ ＧＴＡＡＧＣＣＣＣＧＴＣ３’３’ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５゜ を有するオリゴヌクレオチドリンカー１００１００ｐと、ライゲーションバッフ ァー２５μｌ中で混合する。次いで、混合物にＴ　４　ＤＮＡリガーゼ２単位を 加え、１５°Ｃで１時間結合反応を行う。

リンカ−を所望のアゾノウイスルー２ＤＮＡ制限断片の相補的な粘着末端に結合 させた後、結合反応混合物に各２０μＭのｄＡＴＰ、ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ、　ｄ　Ｇ Ｔ　Ｐ　Ｓｄ　ＣＴ　Ｐ　、　２０ｍＭ　（Ｎ　Ｈ−）　ｙｓ　Ｏ４，５０％（ ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセリン、精製バタテリオファージｐｈｉ２９末端タンパク 質３００ｎｇおよびバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ２０ｎｇ を加えて制限断片の増幅を行う。３０°Ｃで２時間インキュページ目ンした後、 １０ｍＭ　ＥＤＴＡを加え６８℃で１０分間加熱してＤＮＡ合成反応を停止する 。

ＦＩＧＵＲＥ　Ｉａ ５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＡＡ　３’　５’　入ＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣ ＣＡＡＴ　３’３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１　３”　’ｆｆｉ’ｃＡ ＴＴｃＧＧＧＧ　５１５１　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＴＡ　３１　５１　Ｍ ＡＧＴＭＧＣＣＣＣＡＴＴ　３１３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’　３’ 　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧ　３ ’　５言　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＴＣ３’３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧ Ｇ　５’　３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣ ＣＣＡＧＡ　３’　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＧＴ　３’３１　ＴＴＴ ＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’　３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１５１　人Ａ ＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧ　３’　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣ３ ’３１　ｆｆｒＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’　３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　 ５’５菅　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡ　３曾　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣ ＣＣＣＡＣＴ　３’３”　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’　３１　ＴＴＴＣＡ ＴＴＣＧＧＧＧ　５’５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＣＧ　３’　５’　Ａ ＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣ３’３１　’Ｍ’ｒＣＡＴｒＣＧＧＧＧ　５１　 ３１　ＴＩ’ＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＡ Ａ　３’　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＡＴ　３’３’　ＴＴＴＣＡＴＴ ＣＧＧＧＧ　５嘗　３’　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１５’　ＡＡＡＧＴＡ ＡＧＣＣＣＣＴＡＧ　３’　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＡＣ３’３’　 ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’　３１　ｆｆｒＣＡＴｒＣＧＧＧＧ　５１５’ 　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＴＡ　３’　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴ ＴＴ　３’３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１　３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧ ＧＧＧ　５１５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧ　３’　５’　ＡＡＡＧＴ ＡＡＧＣＣＣＣＴＴＣ３’３１’ｒ’Ｍ’ＣＡＴＴＣＧＧＧＧ５１３１ＴＴＴＣ ＡＴＴＣＧＧＧＧ５１５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡ　３’　５’　Ａ ＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＧＴ　３’３１　ＴｒＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’　 ３’　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’５１　人ＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧ 　３’　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＧＣ３’３’　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧ ＧＧＧ　５’　３”ｆｆｉ’ｃＡＴｒｃＧＧＧＧ　５’５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧ ＣＣＣＣＴＣＡ　３’　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴ　３’３１　Ｔ ＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１　３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１５’　 ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＣＧ　３’　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＴＣ Ｃ３雷３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’　３・　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧ Ｇ　５１Ｆ工ＧυＲＥ　ｌｂ ３’　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１　３’　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５ ’５１　人ＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＣＧＧ　３’　５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣ ＣＣＣＧＣ３’３１　ＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１　３１　ＴＴＴＣＡＴＴ ＣＧＧＧＧ　５１５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＣＣＡ　３１　５’　入入Ａ ＧＴＡＡＧＣＣＣＣＣＣＴ　３’３瞥　’Ｉ？Ｌ”ＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１　 ３’　ＴＴｒＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５１５’　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＣＣＧ 　３’　５曾　ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＣＣＣＣ３’３”ＩＴＩ’ＧＡＴＴＣＧ ＧＧＧ　５’　３’　ＴＩ’ｒＣＡＴＴＣＧＧＧＧ　５’国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９０００９４２ Ｓ＾　３５０３０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．異種の核酸配列を増幅する方法であって：（ａ）異種の配列とバクテワオフ ァージｐｈｉ２９の複数起点とを含有する２本鎖核酸を合成し；そして （ｂ）該複製起点のコントロール下で該２本鎖核酸からＤＮＡを合成することか らなる方法。 ２．工程（ａ）の２本鎖核酸がバクテリオファージｐｈｉ２９複製起点と２本鎖 核酸との結合によって得られるものである請求項１の方法。 ３．工程（ａ）の２本鎖核酸が以下の工程により得られるものである請求項１の 方法： （１）プライマーと結合したバクテリオファージｐｈｉ２９複製起点を含有する オリゴヌクレオチド起点プライマーおよびオリゴヌクレオチド二次プライマーを 得、ここに、該プライマー類は相互に相補的でなく、１個のプライマーから合成 された延長産物は、その相補体から分離されると、他のプライマーの延長産物の 鋳型として作用し得るよう選択されている； （２）核酸と起点プライマーとを、起点プライマーの延長産物が合成されるよう なハイブリダイゼーション条件下で接触させ；そして（３）核酸と二次プライマ ーとを、二次プライマー延長産物が合成されるようなハイブリダイゼーション条 件下で接触させる。 ４．複製が該２本鎖核酸の１端から開始され、工程（ｂ）のＤＮＡ産物が１本鎖 である請求項１の方法。 ５．複製が該２本鎖核酸の両端から開始され、工程（ｂ）のＤＮＡ産物が２本鎖 である請求項１の方法。 ６．バクテリオファージｐｈｉ２９にとって異種の核酸配列を増幅する方法であ って： （ａ）異種の配列を含有する２本鎖核酸を得；（ｂ）バクテリオファージｐｈｉ ２９複数起点を含有するＤＮＡリンカーを得； （ｏ）該リンカーと該２本鎖核酸とを結合させ：そして（ｄ）工程（ｃ）の産物 とバクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ２９末端 タンパク質、および４種の異なるデオキシヌクレオシドトリホスフェートとを、 ＤＮＡが合成されるような条件下で接触させることからなる方法。 ７．バクテリオファージｐｈｉ２９複製起点が配列５′ＡＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣ Ｃ３′を含有する請求項１または６の方法。 ８．バクテリオファーｐｈｉ２９複製起点が配列５′ＡＡＡＧＴＡＧＧＧＴＡＣ ３′を含有する請求項１または６の方法。 ９．異種の核酸配列が真核性核酸配列である請求項１または６の方法。 １０．異種の核酸配列がヒト核酸配列である請求項１または６の方法。 １１．工程（ｂ）のＤＮＡリンカーがインビトロ合成で製造されたものである請 求項６の方法。 １２．異種のＤＮＡ配列の１端または両端にバクテリオファージｐｈｉ２９複製 起点を含有する複製可能なＤＮＡ。 １３．異種のＤＮＡ配列が真核性ＤＮＡ配列である請求項１２の産物。 １４．異種のＤＮＡ配列がヒトのＤＮＡ配列である請求項１２の方法。 １５．バクテリオファージｐｈｉ２９複製起点を含有する起点プライマー。 １６．ゲノムＤＮＡのクローニング法であって：（ａ）ゲノムＤＮＡを複数の異 なる粘着末端配列を生成する制限酵素で消化し； （ｂ）消化したゲノムＤＮＡを、リポーターヌクレオチド配列と工程（ａ）で制 限酵素により生成した粘着末端配列に相補的な粘着末端配列とを含有するリンカ ーに、該リンカーがゲノムＤＮＡの制限断片と結合するような条件下で接触させ ；そして（ｃ）工程（ｂ）の生成物を増幅させることからなる方法。 １７．工程（ｂ）において、消化したゲノムＤＮＡを２またはそれ以上の異なる リンカーと接触させる請求項１６の方法。 １８．工程（ａ）の制限酵素で生成した粘着末端配列が同じ長さである請求項１ ６の方法。 １９．工程（ａ）の制限酵素がＳｆｉＩである請求項１６の方法。 ２０．工程（ｂ）のりポーター配列がバクテリオファージｐｈｉ２９複製起点を 含有し、工程（ｃ）がバクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用い て達成される請求項１６の方法。 ２１．工程（ｂ）および（ｃ）が少なくとも１回繰り返される請求項１６または １７の方法。 ２２．工程（ｃ）の前または後に、消化したゲノムＤＮＡから工程（ｂ）の生成 物を分離する、請求項１６または１７の方法。 ２３．工程（ｂ）の産物を電気泳動によって分離する請求項２２の方法。 ２４．ゲノムＤＮＡ制限断片のマッピング法であって：（ａ）ゲノムＤＮＡを複 数の異なる粘着末端配列を生成する制限酵素で消化し： （ｂ）工程（ａ）の制限断片生成物を増幅させ；（ｃ）該制限断片の各々の粘着 末端配列を決定し：そしてそれに従って、 （ｄ）制限断片を物理的地図に配列することからなる方法。 ２５．工程（ｂ）が、以下の工程によって達成される請求項２４の方法： （１）リンカーライブラリー、ここに、各リンカーはバクテリオファージｐｈｉ ２９複製起点と粘着末端配列とを含有し、ライブラリーは工程（ａ）の制限酵素 で生成した各粘着末端配列と実質上棺補的な粘着末端配列を含有する、を得； （２）工程（ａ）の制限断片と該ライブラリーからのリンカーとを、各制限断片 の粘着末端がリンカーと結合するような条件下で接触させ：そして （３）工程（２）の生成物、バクテリオファージｐｈｉ２９ポリメラーゼ、バク テリオファージｐｈｉ２９のＤＮＡ合成プライミングプロテインおよび４種の異 なるヌクレオシドトリホスフエートを、該バクテリオファージｐｈｉ２９複製起 点のコントロール下で各制限断片の複数のコピーが合成されるような条件下で接 触させる。 ２６．さらに、工程（ｂ）の前または後に、工程（ａ）の制限断片生成物を相互 に分離することを含む請求項２４の方法。 ２７．さらに、工程（ｂ）の前か後に、工程（ａ）の生成物をゲル電気泳動によ って相互に分離することを含む請求項２４の方法。 ２８．工程（２）が、さらに工程（ａ）の制限断片生成物を、該ライブラリーの 幾つかの異なるリンカーの混合物であって、該ライブラリーからの２またはそれ 以上のリンカーを含む混合物と、別個の反応容器内で接触させることを含む請求 項２５の方法。 ２９．工程（ａ）のゲノムＤＮＡが真核性ゲノムＤＮＡである請求項２４または ２５の方法。 ３０．工程（ａ）のゲノムＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡである請求項２４または２ ５の方法。 ３１．工程（ａ）の制限酵素がＳｆｉＩである請求項２４または２５の方法。