JPH04504119A - ブタクサからのアレルゲン蛋白質およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ブタフサからのアレルゲン蛋白質およびそれらの使用人口の約１０％を構成して いるところの、遺伝的に病気にかかり易い個人は、彼らがさらされている種々の 環境源からの抗原に対して過敏性（アレルギー性）を示すようになる。人に対し て速効および／または遅延型の過敏性を誘発し得る抗原はアレルゲンと呼ばれて いる。Ｋｉｎｇ、　Ｔ。

Ｐ９、Ａｄｖ、Ｉｍａ＋ｕｎ、、２３ニア７−１０５　（１９７６）、枯草熱、 ぜん息およびじんましんの徴候を含むところの、過敏症またはアトピーは、速効 的アレルギーの１種である。これは種々のアトピー性アレルゲン類、例えば草、 木、雑草、動物のふけ、昆虫、および食物の生産物、並びに医薬品および化学品 によって引き起こされ得る。

アトピー性アレルギーに伴う抗体は、主に、ＩｇＥ種の免疫グロブリンに属して いる。ＩｇＥは植物の実の細胞および好塩基性細胞と結合する。植物の実の細胞 と結合したＩｇＥと特定のアレルゲンとを組み合わせると、このＩｇＥはその細 胞表面上で架橋して、ＩｇＥ−抗原相互作用の生理学的効果をもたらす。脱顆粒 は、他の物質の中で、ヒスタミン、ヘパリン、好酸性白血球およびロイコトリエ ンのための化学走性因子Ｃ４、Ｄ４およびＥ４（これらは気管支平滑筋細胞の長 男いた圧縮を引き起こす）の放出をもたらす。Ｈｏｏｄ、　Ｌ、Ｅ、他、Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙｓ　（第２版）、４６０らの放出された物質は、特定のアレルゲ ンとＩｇＥとの組み合わせによって引き起こされるアレルギー性徴候の原因とな る媒体である。それらを通してアレルゲンの影響が明らかになる。このような影 響は、体内に抗原が入り込むルートそしてＩｇＥおよび植物の実の細胞の堆積様 式に応じて、実際上全身的もしくは局所的であり得る。局所的な発現は、一般に 、体内にアレルゲンが入った場所の上皮表面上に生じる。全体的な影響には、循 環（脈管内）抗原に対するＩｇＥ−好塩基性細胞応答の結果である過敏症（過敏 症ショック）が含まれる。

数多くの人々に対して特に関心が持たれている１つのアレルゲンは、抗原Ｅまた はＡｉｂ　ａ　Ｉ、即ち短いブタフサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ　ａｒｔｅｍｉｓｉｉ ｆｏｌｉａ　Ｉ。

またはＡｎ＋ｂｒｏｓｉａ　ｅｌａｔｉｏｒ）花粉の主要アレルゲン成分（類） でありそして化アメリカおよびカナダにおける晩夏の枯草熱の主要原因であると ころの、充分な定義がなされていない構成要素（または構成要素の群）である。

５ｗ１ｔｈ、　Ｊ、Ｊ、他、１ｌｏ１．　Ｉｍｍｕｎ、　２５：３５５−３６４ 　（１９８８）；　Ｋｉｎｇ、　Ｔ、Ｐ。

他、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３：４５８−４６８　（１９６４）：　Ｋｉｎｇ、　Ｔ 、Ｐ、、＾ｄｖ、　Ｉａｍｕｎ、、２３ニア７−１０５　（１９７６）。平均と して、ブタフサに敏感な個人中の全血清ＩｇＥの１３％に及ぶ量が、＾ｍｂａＩ に特異的であると予想されていた。Ｚｅｉｓｓ、　Ｃ。

Ｒ０他、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、、１１０：４１４−４２１　（１９７３）　。Ａｍ ｂ　ａ　Ｉは、酸性であり３８゜０００の分子量を有しておりそして抽出および クロマトグラフィー単離中に開裂して２つの非共有結合的に会合した鎖（分子量 が２６．０００のアルファ鎖および分子量が１２，０００のベータ鎖）を生じる ところの非グリコシル化蛋白質であると主張されてきた。Ｋｎｏｘ、　Ｒ，Ｂ、 他、Ｎａｔｕｒｅ、　２５５：１０６６−１０６８　（１９７０）；　Ｋｎｏｘ 、　Ｒ，Ｂ、およびＨｅ５ｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ、　Ｊ、、Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、、６：１−２７　（１９７０）：　Ｋｉｎｇ、Ｔ、Ｐ、、＾ ｄｖ、　Ｉｏｏｎｕｎ、、２３ニア７−１０５　（１９７６）　：　Ｋｉｎｇ、 　Ｔ、Ｐ、他、＾ｒｃｈｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２１２：１ ２７−１３５　（１９８１）。

Ａｉｂ　ａ　Ｉの二鎖および単鎖形態（これらは両方共１ｇＥに対して高い反応 性を示す）は、アレルゲン的および抗原的に関係している。Ｋｉｎｇ、　Ｔ。

Ｐ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　３：４５８−４６８　（１９６４）。し かしながら、Ａｍｂ　ａ　Ｉを物理的および化学的に変化させたいくつかのもの は抗原およびアレルゲン活性を著しく損失させることが示された。Ｋｉｎｇ、　 Ｔ、Ｐ、他、＾ｒｃｈｓ　Ｂｉｏｃｈｅｔｓ、Ｂｆｏｐｈｙｓ、、　２］２：１ ２７−１３５　（１９８１）：　Ｋｉｎｇ、Ｔ、Ｐ、他、　Ｉｍｏ＋ｕｎｏｃｈ ｅｓｉｓｔｒｙ。

１１：８３−９２　（１９７４）。

ブタフサの花粉は米国東部およびカナダにおける晩夏枯草熱の原因となる主要作 用物であるため、異なる研究室において、いかなる他の花粉アレルゲンよりも多 く試験対象となってきた。Ｋｉｎｇ、　Ｔ、Ｐ、他、■龍ｕｎ、、２３ニア７− １０５　（１９７９）。熱心な研究にも拘らず、Ａｍｂ　ａ　Ｉの免疫化学的定 義はまだ完全とは程遠いものである。Ｓａ＋ｉｔｈおよび共同研究者達は、精製 した天然のＡｍｂ　ａ　Ｉに対して上昇する一連のネズミ単クローン抗体を用い て、八ｍｂ　ａ　Ｉのエピトープ構造の特徴付けを開始した。３つの、非重複で あり非反復の抗原部位が明らかにされ（部位Ａ、ＢおよびＣ）、そして部位Ａお よびＢ両方に向かう単クローン抗体は、Ａａ＋ｂ　ａ　Ｉに結合するヒトＩｇＥ の８０％の抑制をもたらす。使用するこの単クローン抗体の反応性は、Ａｉｂ　 ａ　Ｉが物理的もしくは化学的に修飾されると、大きく減少した。０１ｓｅｎの 博士号論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａ、　 Ｃｈａｐｅｌ　）ｆｉｌｌ　（１９８６）’、　０１ｓｏｎ、　Ｊ、Ｒ，および Ｋｌａｐｐｅｒ、　Ｄ、Ｇ、、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、、１３６：２１０９−２１１ ５　（１９８６）。彼らは、これらの２つの部位（ＡおよびＢ）は形態的に依存 しているエピトープであることを示した。即ち、それらは、修飾中にそれらの形 態を損失した単一構造物であるか、或は天然のアレルゲンに近いがしかしこのア レルゲンが一度修飾されると分離するところの、２個以上の不連続ペプチド類か ら成る複合構造物である。Ｓｍ１ｔｈ、　Ｊ、Ｊ。

他、Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎ、、２５：３５５−３６５　（１９８８）。

ブタフサのアレルゲンはかなりの注目を集めているにも拘らず、ヒトに対する副 作用の原因となるアレルゲンの構造（類）または成分（類）の定義付けもしくは 特徴付けは、完全なものからは遠（離れたものであり、そして現在の脱感作治療 では、複雑な、明確に定義されていないブタフサ花粉抽出物を用いた治療が行わ れている。

発明の要約 本発明は、ブタフサからのアレルゲン蛋白質またはペプチド類、上記アレルゲン 蛋白質またはペプチド類の全ておよび一部をコード化するＤＮＡ、上記アレルゲ ン（類）または該アレルゲン（類）の一部を含有する組成物、並びにブタフサに 敏感な個人が該アレルゲンにさらされた時に通常化じる副作用を減少させるか或 は防止するため（即ち、該アレルゲンに対して個人を脱感作させるか、或は該ア レルゲンの影響を防ぐため）の、該アレルゲン（類）またはそれらの一部、或は 該アレルゲン（類）またはそれらの一部含有組成物の投与方法に関する。本発明 は更に、ブタフサ花粉に対する敏感性の診断方法に関する。

抗原ＥまたはＡｉｂ　ａ　Ｉは、単一蛋白質ではなく、むしろブタフサに敏感な 個人が反応する蛋白質の系であることが示された。特に、本発明は、ブタフサ花 粉からのアレルゲン蛋白質中に存在しているアミノ酸配列もしくはペプチドをコ ード化するＤＮＡに関する。これは、単離されたブタフサアレルゲン＾ｍｂａＩ もしくは抗原Ｅ調剤の全てもしくは一部をコード化するＤＮＡに関する。上記ブ タフサアレルゲン調剤は、実際上不均一であり、そしてこれは、現在へｍｂ　ａ 　Ｉまたは抗原Ｅと呼んでいるものに加えて、アレルゲン性を示す（即ち、ブタ フサ花粉にさらされた時ブタフサに対して感受性を示す個人において観察される 典型的な副作用を生じさせる）他のブタフサ成分が含まれていてもよい。これら には、例えば、文献中では抗原にとして呼ばれておりそしてここではＡ＋ａｂ　 ａ　Ｈと呼ぶものが含まれ得る。本発明はまた、短いブタフサ以外の種類のブタ フサ、例えばジャイアントブタフサおよびウェスターンブタフサ中の同様なアミ ノ酸配列をコード化するＤＮＡ　（即ち、アレルゲン類のアミノ酸破裂をコード 化するｒ）ＮＡ）に関する。

図の簡単な説明 図１は、Ａｍｂ　ａ　Ｉ中に存在している蛋白質もしくはペプチド類および上記 蛋白質もしくはペプチド類をコード化するＤＮＡが同定単離されそして特徴付け られる評価のいくつかのルートに関する図式的表示である。

図１Ａは、単クローン抗体およびオリゴプローブを用いた八ｍｂ　ａ　ｒもしく は抗原Ｅ調剤のスクリーニングに関する図式的表示である。

図ＩＢは、ブタフサ花頭λｇｔｌｏ収集のスクリーニングに関する図式的表示で ある。これはまた、Ａｍｂ　ａ　ＩおよびＡｎ＋ｂ　ａ　ＩＩをコード化する全 長のｃＤＮＡクローン体を得るための、クロス雑種形成およびポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ）方法の使用を説明するものである。

図２は、Ａｍｂ　ａ　Ｉ調剤の成分に特異な単クローン抗体を用いたスクリーニ ングによるλｇｔｌｌ収集から単離されたところの、ＵＮＣクローン１のＤＮＡ 挿入断片のヌクレオチド配列である（Ａｍｂ　ａ　Ｉ＾と呼ぶ）。

図３は、Ａｍｂ　ａ　Ｉ調剤の成分に特異な単クローン抗体を用いたスクリーニ ングによるλｇｔｌｌ収集から単離されたところの、ＵＮＣクローン６のＤＮＡ 挿入断片のヌクレオチド配列である（Ａｉｂ　ａ　ＩＢと呼ぶ）。

図４は、Ａｉｂ　ａ　Ｉ調剤の成分に特異な単クローン抗体を用いたスクリーニ ングによるλｇｔｌｌ収集から単離されたところの、ＵＮＣクローン１５のＤＮ Ａ挿入断片のヌクレオチド配列である（八ａ＋ｂ　ａ　ＩＣと呼ぶ）。

図５は、ブタフサアレルゲン調剤＾−ｂａＩ中に存在していることが知られてい るアミノ酸配列から推論された配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用い たλｇｔｌＯｃＤＮＡ収集から単離されたところの、ＩＰＣクローン１のｃＤＮ Ａ挿入断片のヌクレオチド配列である。このオリゴヌクレオチドプローブ配列の 推論の基となる配列の位置にアンダーラインを引く。

図６は、ブタフサアレルゲン調剤＾＋ｎｂ　ａ　Ｉ中に存在していることが知ら れているアミノ酸配列から推論された配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ を用いたＩｇｔｌｏ　ｃＤＮＡ収集から単離されたところの、ＩＰＣクローン５ のｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列である。このオリゴヌクレオチドプロー ブ配列の推論の基となる配列の位置にアンダーラインを引く。

図７は、ブタフサアレルゲン調剤Ａｓ＋ｂ　ａ　Ｉ中に存在していることが知ら れているアミノ酸配列から推論された配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ を用いたλｇｔｌｏ　ｃＤＮＡ収集から単離されたところの、ＩＰＣクローン６ のｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列である。このオリ図８は、ＩＰＣクロー ン１のＤＮＡ挿入断片の構成物分析オープン読み取りに関する図式的表示である 。

図９は、ＩＰＣクローン５のＤＮＡ挿入断片の構成物分析オープン読み取りに関 する図式的表示である。

図１０は、ＩＰＣクローン６のＤＮＡ挿入断片の構成物分析オープン読み取りに 関する図式的表示である。

図１１は、全長＾ｍｂ　ａ　Ｉ＾クローン体のヌクレオチド配列および推論され るアミノ酸配列である（ＵＮＣクローン１に関する）。

図１２は、全長Ａｍｂ　ａ　ＩＤクローン体のヌクレオチド配列および推論され るアミノ酸配列である（ＵＮＣクローン６に関する）。

図１３は、全長Ａｍｂ　ａ　ｒｃクローン体のヌクレオチド配列および推論され るアミノ酸配列である。（ＵＮＣクローン１５に関する）。

図１４は、全長Ａａｂ　ａ　ＩＤクローン体のヌクレオチド配列および推論され るアミノ酸配列である。

図１５は、全長Ａｍｂ　ａ　ＩＩクローン体のヌクレオチド配列および推論され るアミノ酸配列である。

図１６は、類似した領域並びに不適合領域を示している、Ａｍｂ　ａ、　Ｉおよ びＡｍｂ　ａ　ＩＩの多重遺伝子族に関する複合アミノ酸配列である。

図１７は、ラビットの抗＾ａ＋ｂ　ａ　Ｉ多クローン抗体、ＪＢＩＥ３−４抗Ａ ＩＩ＋ｂ　ａ　Ｉ単りローン抗体またはブタフサアレルギー患者の血清で処理し たところの、アフィニティー精製したＡｍｂ　ａ　Ｉのウェスタンプロットに関 する写真である。

粉の水抽出物の二次元ゲルに関する写真である（ヤギの多クローン抗Ａ園図１９ は、ヤギの抗＾ｍｂａＩ抗体で処理したいくつかの大腸菌発現組換＾ａｂａｌｃ ＤＮＡのウェスタンプロットに関する写真である。

図２０は、抗ヒト［ｇＥを用いて染色したヒトのアレルギー血清で処理したとこ ろの、いくつかの大腸菌発現組換Ａａ＋ｂ　ａ　Ｉ　ｃＤＮＡのウェスタンプロ ットに関する写真である。

図２１は、短いブタフサ花粉の水抽出物、アフィニティー精製した脂ｂａ　Ｉ　 （Ｂ７）　、クロマトグラフィー精製したＡｍｂ　ａ　Ｉ、および発現した組換 ＾ｍｂａＩ蛋白質含有大腸菌溶解産物に対するブタフサアレルギー患者ＰＢＭＣ のＴ細胞増殖応答に関する図式的表示である。

発明の詳細な説明 本発明は、ブタフサ花粉アレルゲン、詳細には、各々以下に説明するところの、 いくつかの相互関係を有する方法を用いて、短いブタフサからのＡｍｂ　ａ　Ｉ 　（または抗原Ｅ）として知られている調剤に関する研究を基とするものである 。言葉Ａｍｂ　ａ　Ｉおよび抗原Ｅは、互いに交換可能な様式で用いる。ブタフ サ花粉から得られる上記調剤は、他のブタフサアレルゲン類、例えば抗原Ｋまた はＡｍｂ　ａ　ＩＩを含有している可能性がある。

他の上記アレルゲンを上記調剤が含有している可能性は予測されており、そして 試験の結果はそのことを示している。

本文中に記述する試験の結果は、Ａｍｂ　ａ　Ｉは単一蛋白質もしくはペプチド ではなく、実際上不均一系であることを示している。即ち、抗原Ｅ（または八１ ｂａＴ）と現在呼ばれているものは、明らかに、蛋白質の一族もしくは族類であ るか、或は現実に多重である。本文中に示す研究により、ブタフサアレルゲン中 に存在しているペプチド類もしくはアミノ酸配列をコード化するＤＮＡの同定お よび単離がもたらされた。説明した如く、Ａｍｂ　ａ　Ｉ＾、Ａｍｂ　ａ　ＩＢ 、Ａｍｂ　ａ　ＩＣおよびＡｍｂ　ａ　ＩＤ、並びに八ｍｂａＩＩをコード化す る全長ｃＤＮＡが単離され配列決定された。これによりまた、ヒトのブタフサＩ ｇＥと結合し、そして精製したＡｍｂ　ａ　ＩＩｌｉ剤を用いて製造したラビッ トの＾ｍｂａＩ抗血涜に結合することが示されたところの、蛋白質のＡｍｂ　ａ 　Ｉ調剤からの単離および精製がもたらされた。

以下に示す項中に記述する方法により同定および単離したところの、ＤＮＡと蛋 白質もしくはペプチド類との間の相互関係が示された。表示を容易にするため、 用いたいくつかの方法を図式的に図ＩＡおよび図ＩＢに示し、これを参照にして 以下の考察を行う。

本文中に記述する研究の結果として、ブタフサアレルゲン中に存在している蛋白 質もしくはペプチド類をコード化するＤＮＡを同定および単離し、そしてコード 化された生産物のアミノ酸配列を推論した。更に、Ａｍｂ　ａ　Ｉまたは抗原Ｅ に特異な単クローン抗体の使用を通して、Ａ＋ｓｂ　ａ　Ｉ調剤から蛋白質を得 た。この蛋白質（アフィニティー精製したＡｎ＋ｂ　ａ　ｒと呼ぶ）は生物学的 活性（ヒトのＩｇＥと結合する能力およびラビットのＡｍｂ　ａ　Ｉ抗血清と結 合する能力）を有することが示され、従ってこれは、アレルゲンである可能性が 高い。２つの単離したＤＮＡ中に存在しているヌクレオチド配列の領域によって コード化されることも示された。

以下は、Ａｍｂ　ａ　Ｉまたは抗原Ｅ調剤からの蛋白質もしくはペプチド類をコ ード化するＤＮＡを同定および単離するため、並びにＡｍｂ　ａ　Ｉ調剤からＡ ｍｂ　ａ　Ｉ活性を有することが知られている蛋白質を単離するために用いられ てきたいくつかの方法に関する説明である。図ＩＡ中に示すように、Ｔ、　Ｐ、 　Ｋｉｎｇおよび共同研究者の方法を基とする方法により花粉抽出物から調製さ れたところの、Ａｍｂ　ａ　Ｉもしくは抗原Ｅ調剤を製造した。Ｋｉｎｇ、　Ｔ 、Ｐ、他、＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２１２：１ ２７−１３５　（１９８１）。この調剤中の蛋白質を同定するため、Ｋｌａｐｐ ｅｒおよび共同研究者によって作られた単クローン抗体のパネルを用いた。Ｓ… ｉｔｈ、　１．１．他、Ｍ（１１，Ｉｍｍｕｎ、　。

２５・３５５−３６５　（１９８８）。抗原Ｅ調剤からのいくつかのペプチド類 の配列を通常の技術で測定した。

以下の項で下記を説明する＝１）反応性を示す生成物をコード化するＤＮＡ挿入 挿入断片含有クロー同体同定め、これらの単クローン抗体のプール（即ち、＾ｍ ｂａＩに対して反応性を示す単クローン抗体のプール）の使用、そして２）該ア ミノ酸配列をコード化するＤＮＡ挿入挿入断片含有クロー同体同定め、Ａｍｂ　 ａ　Ｉ調剤中に存在しているアミノ酸配列から構成されたオリゴヌクレオチドプ ローブの使用。各々の方法は、Ａ＋＋＋ｂａＩもしくは抗原Ｅ調剤中に存在して いるアミノ酸配列をコード化するＤＮＡを含有しているところの、３つのクロー ン体の同定をもたらした。

以下に記述するようにして単離された２組のクローン体は互いに異なっているこ とが示された。

ブタフサ蛋白質をコード化するＤＮＡ挿入挿入断片含有クロー同体同定め、＾ｍ ｂａＩ調剤の成分に対して特異的な反応性を示す７個の単クローン抗体のプール を用いた。Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、およびＲ，ｆ、　ＤａｖｉｓＳＰｒｏｃｅｅ ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓＳＵＳＡ、　８０：１１９４−１１９８　（１９８３）。

この結果、本文中それぞれＡｍｂ　ａ　Ｉ＾、ＩＢおよびＩＣで表されていると ころの、３つのクローン体、即ち最初に表示したＵＮＣクローン１．６および１ ５が同定され、これらは、該パネル中の単クローン抗体の少な（とも１つによっ て認識される生成物を表している。アレルゲン＾ｍｂ　ａ　ＩおよびＡｍｂ　ａ 　ＩＩをコード化するｃＤＮＡの学名は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉ ｏｎｏｆ　ＩｍｍｕｎｏＬｎｇｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ　５ｕｂ−ＣｏＩ Ｉｕｏｉｔｔｅｅ　ｆｏｒ　Ａｌｌｅｒｇｅｎ　Ｎｏ＋５ｅｎｃ撃≠狽■ ｒｅ　（Ｍａｒｓｈ他、＾ｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ、　６０：４９９ −５０４　（１９８８））の推奨に従って命名した。

Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、他の方法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７４：５４６３　（１９７７））を用いて 、この３つの、反応性を示すクローン体から単離したＤＮＡを、配列決定した。

これらの３つのクローン体のヌクレオチド配列を図２〜４に示す。

図２〜４中に示す部分的ｃＤＮＡ配列を使用し、Ａｍｂ　ａ　Ｉ＾（図１１）、 Ａｍｂ　ａ　ＩＢ　（図１２）、八ｍｂ　ａ　ＩＣ（図１３）および＾ａ＋ｂ　 ａ　ＩＤ　（図１４）をコード化する全長ｃＤＮＡを単離するため、クロス雑種 形成（実施例２に記述）およびＰＣＲ方法（実施例３に記述）を用いた。

別々に構成させたλｇｔｌＯブタクサ花頭収集花類のｃＤＮＡをクロス雑種形成 するＤＮＡ配列決定の過程において、Ａｍｂ　ａ　ＩＩペプチド配列を有する配 列を共有している新規なｃＤＮＡが誘導された（図１５および図１６）。この収 集の構成およびこの新規なｃＤＮＡの単離を実施例２に記述する。示されている 類似領域および不適合領域と共に、＾ｍｂａＩおよびＡｍｂ　ａ　ＩＩ多重遺伝 子族の複合アミノ酸配列を図１６に示す。９図１６に、Ａｍｂ　ａ　Ｉの配列を 標準１文字コードで示す。＾ｍｂａＩのそれに関係している他のへｍ１２ａＩ族 の一員に関する配列を、相違のみを示すことで表す。傍線は２つの配列の間の同 一性を示している。星印は、最大整列を保持するために導入した配列中の破断部 を示している。アミノ酸の番号は＾ａ＋ｂ　ａ　ＩＢ配列を基としている。与え られた族の一員中に配列多型性が認められた場合は常に、主要配列を上つき文字 で表しそして副次的配列を下つき文字で表す。与えられた族の一員中の条里性は 、この条里性がブロックとして存在しているところのＡｍｂ　ａ　ＩＤのアミノ 酸１８３〜１８９を除いて、独立した出来事として生じる。

図ＩＡにも示すように、通常技術により同定しそして配列決定したところの、Ａ ｍｂ　ａ　Ｉ調剤中のアミノ酸配列（ＷＥＮＦＫ）を、アミノ酸配列をコード化 するオリゴヌクレオチドプローブ（オリゴプローブ）の配列を推論するために用 いた。このオリゴヌクレオチド配列を推論するために用いたアミノ酸配列は、Ｖ ＷＶＫＰＷＥＮＦＫであった。ＡＧＥ＃１で表示するオリゴプローブの配列を推 論するため１．そのアミノ酸配列の一部（ＷＥＮＦＫ）を用いた。プールした短 いブタフサの花類からの、ｐｏｌｙＡ＋の豊富なＲＮＡを用いて１ｇｔｌＯ中に 構成させたｃＤＮＡ収集をスクリーニングするため、実施例１に記述したように ＡＧＥ＃１を用いた。

このオリゴプローブを用いたスクリーニングの結果、１０個の重複した信号が同 定された。これらの重複信号（クローン体）に、同じＡＧＥ＃１オリゴヌクレオ チドプローブを用いた第ニスクリーニングを受けさせた。陽性を示したものの３ 種（第二陽性と呼ぶ）は明らかに重複して検出された。この様式で同定したこれ らのクローン体（ＩＰＣクローン１、ＩＰＣクローン５およびＩＰＣクローン６ で表示）を、適当な条件下で増殖させた後、サザンプロット分析により陽性を確 認した。

この３種のクローン偉容々からのＣＤＮＡ挿入断片を単離し、Ｍ１３ｍｐ１８中 にクローン化した後、配列決定した（図５〜７）。アミノ酸配列もまた推論した （図８〜１０）。この配列決定したｃＤＮＡ中のオープン読み取り構成物を検査 しく図８〜１０）、そして配列を同定した（これにより、該オリゴヌクレオチド プローブの配列が推論された）。このＣＤＮＡ挿入断片が、翻訳された蛋白質の 一部をコード化することは、該ＤＮＡ配列（ＶＷＶＫＰ）から推論された周辺の アミノ酸配列が該オリゴプローブの配列を推論するために最初用いたアミノ酸配 列と一致していることにより、支持された（図８〜１０）。アレルギー患者から のＴ細胞が合成ペプチドＲＡＥ４により刺激された（表５）。このＲＡＥ４配列 はＩＰＣクローン５から推論された（図８）。

二「組」のヌクレオチド配列（即ち、単クローン抗体の使用を通して単離された ＤＮＡであるところの組１、そして該オリゴプローブの使用を通して単離された ＤＮＡであるところの組２）を比較することで明らかなように、−組の範囲内（ 即ち、図２〜４の範囲内、および図５〜７の範囲内）の配列の間には相同性が存 在しているが、組と組との間では配列に関してほとんど類似性がない。

従って、Ａｌｌ１ｂａＩまたは抗原Ｅ調剤は実際上不均一であり、そして蛋白質 の一族（または族類）を示していることは明らかであるか、或は＾１ｂａＩをコ ード化するＤＮＡ中に相当の条里性が存在していることは明らかである。このこ とは、Ａｍｂ　ａ　Ｉまたは抗原Ｅに関する現在の文献記述（これは、ブタフサ に敏感な個人が反応するところの、ブタフサ花粉中に存在しているアレルゲン性 蛋白質の群もしくは群類としてよりはむしろ蛋白質として抗原Ｅを表している） に反するものである。

Ａｌａｂ　ａ　Ｉの抗原性ペプチド類およびＤＮＡの単離に関する追加的立証追 加的結果は更に、＾ｍｂａＩの抗原性ペプチド類およびそれらをコード化するＤ ＮＡが同定されそして単離されたことを明らかに示している。

図ＩＡに示すように、変性条件を受けさせていない＾１ｂａＩ調剤を認識すると ころの、選択された単クローン抗体（４Ｂ　５／Ｂ　７で表示）を、花粉抽出物 から単一蛋白質（アフィニティー精製した八ｍｂ　ａ　Ｉと呼ぶ）をアフィニテ ィー精製するために用いた。これは、所望の単クローン抗体を生産させ、腹水か ら多量にそれを単離した後、セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）上にそれを固定化することによる公知の技術を用いて行った。花粉 の水抽出物を単クローン抗体含有カラムの上から流して、蛋白質種を溶離させた 。この様式で単離した抗原ＥがヒトのＩｇＥと結合することを、ウェスタンプロ ット（図１７）およびＥＬＩＳＡ技術の両方を用いて示し、従って八ｍｂ　ａ　 Ｉ蛋白質もしくはペプチドの期待される生物活性が立証された。

ペプチド配列決定分析を以下のようにして行った７２種のペプチドを、それぞれ 、アフィニティー精製したＡｍｂ　ａ　Ｉの部分的トリプシン消化または臭化シ アン（ＣＮＢｒ）開裂から単離した後、ペプチド配列決定を行った。Ａａｂ　ａ 　ＩのＮ末端がブロックされているため、直接Ｎ末端蛋白質配列決定分析からは いかなるアミノ酸配列も得ることができない。このトリプシンのペプチドに関す る配列決定分析の結果は、そのアミノ酸配列の主要部分が、該＾ｏｒｂ　ａ　Ｉ ＡのｃＤＮＡによってコード化されたペプチド配列４５〜７７に一致しているこ とを明らかに示していた（表１）。

表１は、蛋白質配列決定分析により測定されたＡｍｂ　ａ　Ｉ蛋白質のアミノ酸 配列と、Ａｌ１ｂ　ａ　ＩのｃＤＮＡから推論されたアミノ酸配列との比較であ る。ＣＮＢｒ開裂ペプチド配列決定は、そのＣＮＢｒ開裂ペプチドが、＾−ｂａ Ｉ＾のｃＤＮＡによりコード化されたペプチド配列１７１〜１８４に類似してい ることを示していた（表１）。

個々のペプチド類を単離することなしに蛋白質開裂混合物を用いて、より一層の ペプチド配列決定分析を行った。この使用した技術には、＾ｍｂａＩのｃＤＮＡ 配列から推論された推定上のＡｓｐ−ＰｒｏおよびＭｅｔ−Ｐｒｏ結合を特異的 に加水分解（７０％の蟻酸もしくはＣＮＢ　ｒを用いて）することが含まれてい た。このように、いかなる第一級アミノ基も、通常の配列決定に先立つ０−フタ ルアルデヒドとの反応により、利用できるいかなるＮ末端プロリン残基からもブ ロックされた。

これらの評価の結果（表１参照）は、アフィニティー精製したへｍｂａｒ調剤か ら測定された２つのペプチド配列が、八ｍｂ　ａ　ＩＡのＤＮＡ配列の２つの部 分（２７７〜３２１または３６１〜３９７）によりコード化されたものと一致し ていることを明らかに示していた。このペプチド配列決定分析で検出された副次 的配列もまた、＾ｍｂａＩまたはＡｎ＋ｂ　ａ　ＩＩのＣＤＮＡによりコード化 されたペプチド配列の一部に相当していた。上記ペプチド配列決定分析は、八ｍ ｂ　ａ　Ｉもしくは抗原Ｅコード化ＤＮＡが単離されたことに対する強力な支持 を与えていた。

Ｔ、　Ｐ、　Ｋｉｎｇ博士の方法によって得た抗原Ｅの調剤もまたペプチド配列 決定した。同様のペプチド配列決定技術を用いた。４種のペプチド配列が同定さ れ、これらは、Ａｍｂ　ａ　ＩＡのＤＮＡによりコード化されたペプチド配列の 同様な４種のセグメント（表１中の４５〜９２．１７１〜１８６．２７７〜３２ １および３６１〜３９７）と一致していた。このことは、＾ｍｂａＩもしくは抗 原Ｅコード化ＤＮＡが単離されたことに対する追加的証拠を与えていた。

Ｔ、　Ｐ、　Ｋｉｎｇ博士の方法により得られた精製抗原Ｋ（＾ｎｉｂ　ａ　Ｉ Ｉ）に関して同様の技術を用いた。結果は、２つのペプチド配列が、Ａｍｂ　ａ 　ＩＩのＤＮＡによりコード化されたペプチド配列の２つの部分と一致している ことを明らかに示していた（表２、実施例２参照、図１５）。表２は、蛋白質配 列決定分析により測定されたＡｍｂ　ａ　ＩＩ蛋白質のアミノ酸配列と、Ａｍｂ ａＩＩのｃＤＮＡから推論されたアミノ酸配列との比較である。この発見は、ブ タフサ花粉のアレルゲンをコード化するＤＮＡが単離されたことに対する支持を 与えていた。

ラビットおよびヒトの抗血清を用いて、八ｍｂａＩおよびＡｍｂ　ａ　Ｈはいく つかの抗原性決定因子を共有することが以前に報告された（Ｋｉｎｇ、　Ｔ、　 ＋Ｐ０、Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕｎ、２３ニア７−１０５　（１９７６））　、しか しながら、本発明以前には、この２つの抗原間の正確な関係は不明確なままであ った。Ｋｉｎｇおよ　′び共同研究音速はまた、イオン交換クロマトグラフィー により抗原Ｅお　１よびＫの異なるイソ型（Ａｍｂ　ａ　ＩおよびＡｍｂ　ａ　 ＩＩ）が単離できることを報告している（Ｋｉｎｇ、　Ｔ、Ｐ他、＾ｃｈ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２１２：１２７−１３５（１９８１））。

ＡＳＢＳＣおよびＤで表示されるところの、記述された異なるイソ型は、損傷を 受けていないＡｍｂ　ａ　ＩおよびＡｍｂ　ａ　ＩＩ種の制限蛋白質分解により 生産されると解釈された。Ａ、ＢＸＣなどで表示されるところの、これらのイソ 型は、本発明中に概略を示す学名（即ち、Ａｌｌ１ｂａＩＡ、　Ａｍｂ　ａ　Ｉ Ｂなど）とは直接的な関係を有するものでないことを特記する。

硫酸アンモニウムの４５％飽和溶液中のＡｍｂ　ａ　ＩＩを用いて、ブタフサ花 粉抽出物から３５．０００ダルトン種を共沈させる。これらの蛋白質の大部分は ゲル濾過クロマトグラフィーで凝集することが示される。これらの蛋白質の中の いくつかの単量体形態を、イオン交換クロマ、トゲラフイーによりＡｍｂ　ａ　 ＩＩから分離した。推定上の結合したＡｓｐ−Ｐｒ。

の７０％蟻酸加水分解そして第一級アミノ基のＯ−フタルアルデヒドによるブロ ック化を含む配列決定技術により、主要蛋白質は＾ａｌｂ　ａ　ＩＣのＤＮＡ配 列によりコード化されたものに一致することが明らかに示された。

このペプチド配列を表１の３５ｋＤと呼ぶ。この結果により、＾ｍｂａＩ蛋白質 は実際上不均一でありそして密接に関係したＤＮＡによりコード化されることに 対する追加的支持が得られた。

図１Ａ中にも示されているように、ラビットの多クローン抗体がＫｉｎｇＶ抗原 Ｅ調抗原用調剤生産された。これらの抗体は、花粉抽出物のウェスタンプロット で３８ｋｄ蛋白質種を同定することが示された（図１７）。

電荷を基とする一方向および大きさを基とするもう１つの方向で電気泳動した後 、ヤギの抗Ａ＋＋＋ｂ抗体で処理したところの、ブタフサ花粉抽出物り二次ゲル を図１８に示す。結果は、Ａｌｏｂ　ａ　Ｉ蛋白質と以前呼ばれてい忙ものを差 別的に帯電させた形態に相当しているところの、相対分子量６（３５ｋＤのブタ フサ花粉抽出物中に存在しているいくつかの蛋白質とつ結合を明らかに示してい る。同様の技術を用いて、前述したアフィニティー精製Ａｍｂ　ａ　Ｉとこれら の抗体とが結合することも示された（図１７）。

この抗体の反応性を考慮すると、この４　Ｂ　５／Ｂ　７アフイニテイー精製し た八ｍｂａＩが、花粉のＡｌｗｂ　ａ　Ｉの認識パターン、そしてラビットの多 クローン抗Ａｍｂ　ａ　ｒおよびＪＢＩＥ３−４抗Ａｍｂ　ａ　Ｉ単りローン抗 体の両方を用いた皮膚試験試薬の認識パターンと同様の認識パターンを有してい ることは明らかである（図１７）。これはまた、ウェスタンプロットで容易に検 出できる［ｇＥ反応性を有している（図１７；患者番号１５５）。クロマトグラ フィーで精製したＡｍｂ　ａ　ＩＩ　（抗原Ｋ）が、アフィニティー精製したＡ ｍｂ　ａ　Ｉに対して交差反応性を示すＢ細胞エピトープ類を有していることも 、明らかである（図１７、抗＾ｍｂ　ａ　Ｉ多クローン）。

ここに記述した実験の結果として、Ａｍｂ　ａ　Ｉ調剤から得られる蛋白質のア レルゲン性ペプチドをコード化するｃＤＮＡ、ブタフサの主要ヒトアレルゲンお よびＡｍｂ　ａ　ＩＩの調剤がクローン化され、単離され、配列決定され、そし てこのコード化されたアミノ酸配列（アレルゲン類の）が推論された後、＾ｍｂ ａＩおよびＡｍｂ　ａ　ＩＩから誘導されるペプチド類が同定され、単離された 。

更に、いくつかの数のＡｍｂ　ａ　Ｉ多重遺伝子族、並びにＡｉ＋ｂ　ａ　ＩＩ をコード化するところの、全長のそして端を切り取ったｃＤＮＡを、発現ベクタ ーｐＴｒｃ９９中に構造物内クローン化した（Ａｍａｎｎ他、Ｇｅｎｅ、６９： ３０１−３１５、（１９８８））後、ＪＭ１０９宿土中に形質転換した。１ｍＭ のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより、組換え＾ｍｂａＩお よびＡａｂ　ａ　ＩＩ蛋白質の発現を誘発させ、細胞を収穫し、リゾチーム処理 し、音波処理した後、低速遠心分離により不溶の含有物を回収した。この回収し たペレット中に存在している組換え＾ｎｉｂ　ａ　ＩおよびＡａｂ　ａ　ＩＩ蛋 白質を、８Ｍの尿素、５０ｍＭのトリスＨＣＩ　ｐＨ８，０，５ＱｍＭのＮａＣ １，１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのフッ化フェニル メチルスルホニルの入っている緩衝液で可溶化した。

可溶化後、この粗尿素溶解産物をＰＢＳに対して４℃で透析した。この発現した 組換えＡａｂ　ａ　ＩおよびＡａｂ　ａ　ＩＩ蛋白質をウェスタンプロットし、 この結果を図１９および２０に示す。結果（図１９）は、ヤギの抗ＡｍｂａＩ抗 体が、特異的に、い（っかの形態の＾ｍｂａＩ（Ａ、Ｂおよび℃）並びにＡａｂ 　ａ　ＩＩ　（抗原Ｋ）と結合することを示している。この抗原性交差反応性は 、該ｃＤＮＡの観察された配列相同性と一致している（図１６参照）。これらは 更に、アレルギー性のヒトＩｇＥが特異的にＡｍｂ　ａ　Ｉ多重遺伝子族の一員 のい（つかと結合することを示している（図２０）。

患者＃２９５の場合、ＩｇＥは、八ｍｂ　ａ　ＩＢもしくはＡｍｂ　ａ　ＩＩよ りも更に大きな度合でＡｉｂ　ａ　ｒ＾（全長）および＾ａ＋ｂ　ａ　ＩＣと結 合する。ＩｇＥの結合パターンに関する高い水準の変動性が認められ（表３およ び示されていないデータ）、そしてこのことは、異なる患者は異なる八ｍｂ　ａ 　Ｉ蛋白質に異なる度合で反応することを示している。

２ｇ１　＋＋＋　＋　＋＋＋　−＋＋＋　＋−２ｇ５　＋＋＋　＋　＋＋＋　＋ 　＋＋＋　−２９６＋＋　＋＋　＋＋　− 一　背景に対していかなる信号もなし。

十−背景に対してほとんど区別できない。

＋　明らかに陽性 ＋＋　強い陽性 ＋＋＋　高度に陽性 ＊　その時までにスクリーニングした１０人の患者全体から選択。

Ａａｂ　ａ　ＩおよびＡａｂ　ａ　ＩＩのい（つかの組換え形態と結合するＩｇ Ｅの５ＯＳ−ＰＡＧＥウェスタンプロット分析は、異なる患者に対して相当のパ ターン変化が観察されることを示していた。検査した１０人のブタフサアレルギ ー患者の中で、全ての患者が少なくとも１つの組換えＡｌｌ１ｂａＩおよび＾ｉ ＋ｂ　ａ　ＩＩと結合する血清ＩｇＥを有しており、数人の患者のＩｇＥはいく つかの異なる組換え種と結合する（表３に要約）。組換えＡａｂ　ａ　ｒおよび Ａａｂ　ａ　ＩＩ蛋白質と結合するヒトＩｇＥと、抗ペプチドおよび単りローン 抗Ａ＋ｏｂ　ａ　Ｉ抗体との比較により、Ａｍｂ　ａ　ＩＡのＮ末端部分（歴史 的にはβ領域と呼ぶ）が主要ＩｇＥエピトープ（類）を含んでいるとの結論に一 致したデータが得られた。このデータ（表３）は、＾ａ＋ｂａｌＡ（ｔ）（端が 切り取られたＡｍｂ　ａ　ＩＡ、アミノ酸７０〜３９８）が全長Ａｍｂ　ａ　Ｉ Ａ　（アミノ酸１０〜３９８）よりもうまくはブタフサアレルギー患者のＩｇＥ と結合しないとの観察を基としている。その他の＾ｍｂａｒおよびＡａｂ　ａ　 ＩＩ形態も同様のＩｇＥ結合特性を有していると期待される（例えば図２０参照 ）。

混合ブタフサ花粉抽出物で予め刺激されたところの、ブタフサに対してアレルギ ーを示す患者からのＴ細胞は、花粉抽出物、ブタフサ皮膚試験試薬（ＲＷＳＴ） 　、アフィニティー精製Ａａ＋ｂ　ａ　Ｉ蛋白質、および組換えＡａｂ　ａ　Ｉ 遺伝子生産物ＩＡ、ＩＢおよびＩＣを含有している粗バクテリア溶解産物と反応 して、認識しそして増殖することができる（表４）。

これらの患者からのＴ細胞は、等量の対照バクテリア溶解産物ＪＭＩ　Ｃ９の存 在下で増殖しない。これらの結果は、各々の遺伝子生産物がある種のＴ細胞反応 性を刺激できることを明らかに示している。抗原として粗バクテリア溶解産物を 使用した時の負の応答によっては、固定した結論が排除されるものではない、何 故ならば、溶解産物中の組換え蛋白質の相対的水準が測定されていなかったから である。

主題のアレルゲン性蛋白質／ペプチド類およびこれらをコード化するＤＮＡの使 用 ここに記述した研究によって得られる材料並びにこれらの材料を含有し、ている 組成物は、ブタフサアレルギーの診断、治療および予防方法で用いられ得る。加 うるに、該ｃＤＮＡ（またはそれを転写したところのｍ　ＲＮ　Ａ　）は、いか なる変種もしくは種類のブタフサ中の類似配列をも同定するために用いられ、従 って、例えば短いブタフサ花粉から得られるＤＮＡに対して雑種形成させるに充 分な相同性を有する配列を、同定もしくは「引き出す」ことができる。これは、 例えば、厳密でない条件下で行うことができ、そして充分な相同性（一般に４０ ％以上）を有する配列が、ここに記述した方法を用いて、更に一層の評価のため に選択され得る。二者択一的に、高い紙密度を有する条件も使用できる。

このようにして、本発明のＤＮＡは、＾ｍｂａＩの配列と同様のアミノ酸配列を 有するペプチド類をコード化するところの、他の種類のブタフサ（例えばジャイ アントブタフサ或はウェスタンブタフサ）中の配列を同定し、従って、このよう な他の種類のブタフサ中のアレルゲンを同定するために用いることができる。従 って、本発明には、Ａｍｂ　ａ　Ｉおよび本ＤＮＡ配列によってコード化された 他のブタフサアレルゲン（例えばＡｍｂ　ａ　ＩＩまたは抗原Ｋ）ばかりでな（ 、本発明のＤＮＡに対して雑種形成させたＤＮＡによってコード化されたところ の、他のブタフサアレルゲンも含まれる。

本発明のｃＤＮＡによってコード化された蛋白質もしくはペプチド類は、例えば 「精製」アレルゲンとして使用できる。上記精製アレルゲンは、ブタフサアレル ギーの診断および治療のための鍵となる試薬であるところの、アレルゲン抽出物 の標準化において有益である。更に、図２〜１６中に挙げた配列を基とするペプ チド類を用いることにより、抗ペプチド抗血清または単クローン抗体が標準方法 で得られる。上記試薬は、Ａｍｂ　ａ　ＩまたはＡｍｂ　ａ　ＩＩの個々のイソ 型に対して特異的に向かわせることができる（即ち、この分子の分枝領域／エピ トープに向かわせることができる）か、或は全ての形態のＡｍｂ　ａ　Ｉまたは Ａｍｂ　ａ　ＩＩに対して特異的であり得る（即ち、通常の配列／エピトープに 向かわせることができる）。Ａｍｂ　ａ　ＩもしくはＡａｉｂ　ａ　ＩＩに向か うこれらの血清もしくは単クローン抗体は、アレルゲン抽出物の標準化のために 使用できる。このような１つの単−特異性抗ペプチド抗血清は既に成功裏に生産 されている。

Ａ＋＊ｂ　ａ　ＩＩ配列（アミノ酸３２６〜３３８；配列ＣＬＲＴＧＡＱＥＰＥ ＷＭＴを有するＲＡＥ　５０．にで表示される）に向かうこのラビットの抗血清 は、ウェスタンプロットに関して、組換えＡｍｂ　ａ　ＩＩと特異的に結合する が、Ａａｉｂ　ａ　Ｉ＾、ＢまたはＣとは結合しない（データは示されていない ）。

本発明のペプチド類の使用を通して、矛盾のない充分に限定された組成および生 物活性を有するアレルゲン調剤が製造でき、そしてこれらは治療目的で投与され 得る（例えば、ブタフサ花粉に対して、ブタフサに敏感な個人のアレルギー反応 を修正するため）。上記ペプチド類もしくは蛋白質（或はそれらの修飾型、例え ば以下に示すもの）は、例えば、ブタフサアレルゲンに対するＢ細胞応答、ブタ フサアレルゲンに対するＴ細胞応答、或はそれらの両方の応答を修正させ得る。

精製アレルゲンもまた、ブタフサアレルギーの免疫治療の機構を研究するため用 いられ、そして修飾した誘導体、或は免疫治療において未修飾の（「天然に存在 する」）ペプチド類よりも有益な類似物を設計するために用いられてもよい。

他の研究音速の研究によって、高い服用量のアレルゲンが一般に最良の結果をも たらすことが示された（即ち、最良の症状軽減）。しかしながら、数多（の人々 は、アレルゲンのアレルギー反応のため、多量のアレルゲン服用には耐えられな い。天然に存在している相当するアレルゲンと同じか或は増強された治癒特性を 有しているが減少した副作用（特にアナフィラキシ−反応）を有する修飾ペプチ ド類もしくは修飾アレルゲン類が生産できるように、天然に存在しているアレル ゲンの修飾を設計することができる。これらは、例えば、本発明のペプチド（例 えばクローン＾ｍｂ　ａ　Ｉ＾、クローン八ｍｂ　ａ　ｒＢ、クローン＾ｍｂ　 ａ　ＩＣ，Ａｍｂ　ａ　ＩＩ、ＩＰＣクローン１、ＩＰＣクローン５またはＩＰ Ｃクローン６のＤＮＡ挿入断片、或はそれらの全長ｃＤＮＡから誘導されるペプ チドのアミノ酸配列の全てもしくは一部を有するペプチド）、或は修飾ペプチド またはペプチド類似物（例えば免疫原性を修飾、および／またはアレルゲン性を 減少させるためにアミノ酸配列を変化させであるか、或は同様の目的のためある 種の成分が加えられているところのペプチド）であり得る。

例えば、Ａ＋ｓｂ　ａ　Ｉペプチド類は、＾、　５ｅｈｏｎおよび共同研究者の ポリエチレングリコール方法を用いて修飾され得る。

脱感作すべき個人に対する本発明のペプチド類の投与は公知の技術を用いて行わ れ得る。１つのペプチドもしくは異なるペプチド類の組み合わせが、例えば適当 な緩衝液、担体および／またはアジュバントの入っている組成物で、個人に投与 され得る。上記組成物は、一般に、注射、経口投与、吸入、経皮投与または直腸 投与により投与される。現在利用できる構造的情報を用いることで、ブタフサに 敏感な個人に対して充分な量で投与された時ブタフサアレルゲンに対する個人の アレルギー反応を修正するところの、ブタフサ花粉ペプチドを設計することが可 能である。これは、例えば、ブタフサ蛋白質の構造を検査し、ブタフサに敏感な 個人中のＢ細胞および／またはＴ細胞応答に影響を与えるそれらの能力を試験す るためのペプチドを作り出した後、この細胞によって認識される適当なエピトー プ類を選択することによって行われる。このエピトープ類の配列を模擬しそして ブタフサアレルゲンに対するアレルギー反応を下方調整することのできるところ の、合成アミノ酸配列もまた使用できる。ブタフサアレルギーの検出および診断 のためにも、本発明の蛋白質、ペプチド類または抗体が使用できる。例えば、ブ タフサアレルゲンに対する敏感性を評価すべき個人から得た血液もしくは血液生 産物と、ブタフサ花粉の単離アレルゲン性ペプチドとを、この血液中の成分（例 えば抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）と該ペプチドとを結合させそして上記結合が生じる 度合を測定するに適当な条件下で、−緒にすることによる。

ここで、ブタフサに敏感な個人中のアレルギー反応を誘発させるブタフサアレル ゲンの能力を阻止するか或は抑制することのできる薬剤もしくは薬を設計するこ とも可能である。上記薬剤は、例えば、それらが関係している抗ブタクサＩｇＥ と結合し、従ってＩｇＥ−アレルゲン結合そして次に起こる植物の実細胞の脱顆 粒を防止するように、設計され得る。二者択一的に、上記薬剤は、免疫系の細胞 成分と結合し、結果としてブタフサアレルゲンに対するアレルギー反応を抑制も しくは脱感作する。この非制限的実施例では、ブタフサアレルゲンに対するアレ ルギー反応を抑制するため、本発明のｃＤＮＡ／蛋白質構造を基とするところの 、適当なり細胞およびＴ細胞エピトープペプチド、或はそれらの修飾物を使用す る。これは、ブタフサに敏感な個人から得た血液細胞を用いたインビトロ実験で Ｂ細胞およびＴ細胞機能に影響を与えるところの、Ｂ細胞およびＴ細胞エピトー プペプチドの構造を明らかにすることによって、行われ得る。

ブタフサから得られるアレルゲン性蛋白質もしくはペプチドをコード化するｃＤ ＮＡは、遺伝子クローン化の如き公知の技術を用いた追加的ペプチド類の製造に 、用いられ得る。本発明の蛋白質もしくはペプチドの製造方法には、例えば、発 現ベクター（これはまた、選択されたアレルゲン性蛋白質もしくはペプチド（例 えば＾ａ＋ｂａＩ蛋白質もしくはペプチド）の全てもしくは一部をコード化する ＤＮＡを含有している）を含有している宿主細胞を培養することが含まれる。Ｄ ＮＡ挿入断片の発現に適切な条件下で細胞を培養する（コード化された蛋白質も しくはペプチドの製造）。次に、公知の技術を用いて、この発現した生産物を回 収する。二者択一的に、Ａｍｂ　ａ　Ｉアレルゲンまたはその一部は、公知の機 構もしくは化学技術を用いて合成され得る。ここで用いる言葉蛋白質もしくはペ プチドは、これらの技術のいずれかで製造された蛋白質もしくはペプチド類を表 している。また、この得られるペプチド類は前述の如（使用され得る。

本発明のいずれかの具体例中で用いるＤＮＡは、ここに記述したようにして得ら れるｃＤＮＡであるか、或は二者択一的に、ここに示す配列（図２〜１６参照） の全てもしくは一部を有するいずれかのオリゴデオキシヌクレオチド配列、或は それらの機能的同等物であり得る。このようなオリゴデオキシヌクレオチド配列 は、公知の技術を用いて化学的もしくは機械的に製造され得る。オリゴヌクレオ チド配列を有する機能的同等物は、図２〜１６の配列（或は相当する配列部分） を雑種形成し、および／または、図２〜１６の配列（或は相当する配列部分）に よってコード化された生産物の同様な機能特性を有する生産物（例えば、ポリペ プチドもしくはペプチド）をコード化するところの、相補的オリゴヌクレオチド 配列に対して雑種形成し得る同等物である。機能的同等物がこの１つもしくは両 方の判断基準に合致する必要があるか否かはその使用に依存している（例えば、 それをオリゴプローブとしてのみ使用する必要がある場合、それは第一判断基準 のみに合致する必要があり、モして＾ｍｂａＩアレルゲンを生産するために使用 する場合は、第二判断基準にのみ合致する必要がある）。

Ａｍｂ　ａ　Ｉペプチド類に対する抗体は、Ａｌ１ｂ　ａ　Ｉ族の特徴を更に明 確にするために使用できるところの、ブタフサアレルゲンの追加的成分を単離す るために使用され得る。更に、抗ペプチド血清、或はＡｍｂ　ａ　Ｉおよび／ま たはＡｍｂ　ａ　ＩＩに向かう単クローン抗体は、ブタフサ皮膚試験試薬（ＲＷ ＳＴ）の内容物を標準化しそして限定するために使用され得る。これには、アン プロシア・アルテミシイホリアＩ　（Ａｍｂｒｏｓｉａ　ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆ ｏｌｉａｌ、）から誘導されるもの以外のＲＷＳＴが含まれる（例えばウェスタ ン、砂漠、ジャイアントブタフサなど）。

構造に関する現在利用可能な情報（例えばＤＮＡ、蛋白質／ペプチド配列）もま た、ブタフサアレルギー反応に重要なＴ細胞エピトープペプチド類および／また はＢ細胞エピトープペプチド類を同定もしくは限定し、そしてこれらの反応が生 じる介在物もしくは機構（例えばインターロイキン−２、インターロイキン−４ 、ガンマインターフェロン）を明らかにするために、用いられ得る。この知識に より、これらの反応を和らげるために用いられ得るペプチドを基としたブタフサ 治療剤もしくは薬剤を設計することも可能である。

いかなる様式でも範囲を限定することを意図するものではない以下の実施例によ り、ここに本発明を更に詳しく説明する。

ベクター１ｇｔｉｏ中のｃＤＮＡ収集を構成させるため、プールした短いブタフ サ花類から抽出したところの、Ｐｏ１ｙＡ＋が豊富なＲＮＡを用いた。

ＧｕｌｂｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの方法そしてＡｍｅｒｓｈａｍ供給キットを 用いて、ｃＤＮＡ収集を構成させた。Ｇｕｌｂｅｒ、　Ｕ、およびＢＪ、Ｈｏｆ ｆ＋＋ａｎ、　Ｇｅｎｅ、　２５：２６３（１９８３）、約７Ｘ１０’個の組換 え体を構成している１、４　ｘ　１０’プラークの収集を構成させた。この収集 をプレートアウトさせた後、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓの方法に従ってスク リーニングした。Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、Ｄ、およびＲ９Ｗ、　ＤａｖｉｓＳＳｃ ｉｅｎｃｅ、　１９６：１８０　（１９７７）。

ｃＤＮＡ収集のスクリーニング： ｃＤＮＡ収集をスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプローブを推論す るため、抗原Ｅから誘導されたと考えられるアミノ酸配列（ＶＷＶＫＰＷＥＮＦ ＫＫ）を用いた。

アミノ酸配列 ＥＮＦＫＫ 推論ヌクレオチド配列 ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＴＴＣＡＡＡ　ＡＡＡＣＴＧＧ ＡＧＥ＃１オリゴプローブ このＡＧＥ＃］オリゴプローブは３２ｐで末端標識した後、以下に挙げる雑種形 成条件を用いて７０．０００の組換え体を試験するために用いた： ６　ｘ　５ＳＣ １ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔの　３０℃で２２時間５０μｇ／ｍＬ大腸菌ｔ　ＲＮＡ １０個の重複した信号が検出され、そしてこれらのクローン体に、同じＡＧＥ＃ １オリゴプローブを用いた第ニスクリーニングを受けさせた。

結果として、正確なアミノ酸配列はＷＥＮＦＫＥであることが分かった。

クローン化操作の要約を以下に挙げる：第一スクリーン：　７０，０００プラー ク３２Ｐ　−ＡＧＥ＃１オリゴプローブ 重複フィルター上に、１０個の信号を有する数多くの斑点が明らかに観察された 。

第ニスクリーン： １０個の重複信号からのプラークを取り上げ、低密度でプレー、ドアウドさせた 後、Ｃ１ｏｎｔｅｃｈのカタログ中に概略が示されている方法により再びスクリ ーニングした。

第三スクリーニング： ３つの第二陽性番号＃１、＃５および＃６が重複して明らかに検出された。各々 のクローン体を増殖させた後、サザンプロット分析により陽性であることを確か めた。

該クローン体の各々から得られるｃＤＮＡ挿入断片を単離した後、Ｍ１３ｍｐ１ ｇ中にクローン化させた。Ｓａｎｇｅｔジデオキシ方法を用いて各々のクローン 体を配列決定した後、推論アミノ酸配列を測定した。Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ。

他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、ＵＳ＾、７４：５４６３　 （１９７７）。

ＷＥＮＦＫＫおよび周辺配列の同定： このｃＤＮＡクローン体のＤＮＡ配列を図５．６および７に示す。このｃＤＮＡ クローン体は全長ではな（、その長さは５００個のヌクレオチド未満である。こ のＡＧＥ＃１オリゴプローブヌクレオチドの配列は図５．６および７中にアンダ ーラインで示しである。配列決定したｃＤＮＡ中のオープン読み取り構造物を検 査し、図８．９および１０中に示す。ＡＧＥ＃１オリゴプローブ配列を推論する ために用いたところの、翻訳したアミノ酸配列（ＷＥＮＦＫ）に、Ｎ末端周辺配 列（ＶＷＶＫＰＷＥＮＦＫ、図８．９および１０参照）と同様にアンダーライン を引く。

ＩＰＣクローン１および５に関しては、１０個の残基の中の１つのみ（即ち、Ｐ の代わりにＬ）においてアミノ酸配列が一致していない。正確な周辺配列（ＶＷ ＶＫＰ）が存在していることにより、このｃＤＮＡは花粉中の蛋白質をコード化 していることが立証される。更に、ＥＦ、ＰＩＬＧＧＩＴＥＶＫＤＮＤＮＳＶＤ ＦＣ配列を有するところの、ＲＡＥ４で表示されるｃＤＮＡ配列を基とする合成 ペプチドは、インビトロの増殖評価においてブタフサアレルギー患者のＴ細胞を 刺激する（表５および図８．９および１０の配列参照）。

！旌豊エ　全長ｃＤＮＡを得るために用いたクロス雑種形成方法抗原Ｅは分子量 が約３８，０００の蛋白質であると報告されており、従ってこの蛋白質をコード 化する全長ｃＤＮＡの長さは少な（とも１゜１Ｋｂである必要がある（Ｋｉｎｇ 、　Ｔ、ｒ’、他、＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｃｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２１２： １２７　（１９８１））。従って、ＩＰＣクローン体１．５および６、並びにＵ ＮＣクローン１．６および１５（それぞれ＾ｎｉｂ　ａ　ＩＡ、ＩＢおよびＩＣ で表示されている）は全長ではない。

全長クローン体を単離する目的で、ニック翻訳された３２ｐ標識の＾＠ｂａＩｃ ＤＮＡプローブをブタフサ花類λｇｔｌｏ　（実施例１参照）および標準方法使 用ブタフサ花粉λｇｔｌｌ収集のスクリーニング用として使用した（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ他、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

（１９８２））、この方法を用いて、八ｍｂ　ａ　ＩＢ　（図１２および１６） および八ｍｂ　ａ　ＩＣ（図１３および１６）をコード化するところの１、全長 もしくは全長に近いｃＤＮＡを単離した（図ＩＢ）。約１４５個のアミノ酸（ア ミノ酸２５３〜３９８；図１５）のオーブン読み取り構造物を有するところの、 １つのクロス雑種形成用ｃＤＮＡクローン体（Ｋ６−５と呼ぶ）が、先に単離さ れたＡａ＋ｂ　ａ　ＩＡ、Ａｍｂ　ａ　ＩＢ、Ａｍｂ　ａ　ＩＣおよびＡｌａ６ 　ａ　ＩＤから著しく分枝していることを見い出し、そしてこれは、通常に精製 した抗原Ｋ　（Ｔ、Ｐ、Ｋｉｎｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋから贈与）から誘導され たペプチド配列に対して完全な一致を示していた（表２）。その結果、この部分 的ｃＤＮＡをＡａ＋ｂ　ａ　ＩＩで表示した（図１５および以下を参照）。

レア・メツセージ（ｒａｒｅ　ｍｅｓｓａｇｅ）　ｃ　ＤＮＡ並びに公知の配列 を有するゲノム状クローン体の両方を単離するためＰＣＲ方法が成功裏に使用で きる（Ｍｕｌｌｉｓ他、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓ ｉｕｍ　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、、５１：２６３−２７３　（１９８６））。

５゛および３′オリゴヌクレオチドブライマーを合成し、そしてこれらを、鋳型 として働くブタフサ花粉ｃＤＮＡ使用ＰＣＲ実験で用いた。この５°プライマー は、Ａｍｂ　ａ　ｒＢ　（図１２）およびＡｍｂ　ａ　ＩＣ（図１３）のＮ末端 保護領域から推論した。該３゛プライマーは、ｃＤＮＡの３°末端の、Ａｍｂ　 ａｉＡｉこ特異な（ＵＮＣクローン１、へｍｂａ丁へで表示、図２）および八ｍ ｂ　ａ　ＩＩに特異な（クローンに６−５、図１５の部分的３゛配列）非コード 化ストランド配列から推論した。ＰＣＲクローン八ｍへ　ａ　ＩＤに対して用い た３番目の３゛プライマーは、Ａｍｂ　ａ　ＩＡ、ＢおよびＣのＣ末端の保護領 域から誘導した（ＧＡＰＣ，末端に相当するアミノ酸３９５〜３９８）。増幅さ せるために用いたオリゴヌクレオチドブライマーおよびクローン体Ａｍｂ　ａ　 ＩＡ、　Ａｍｂ　ａ　ＩＤおよびＡｍｂ　ａ　ＩＩのＣＤＮＡを以下に挙げる： 全長Ａｌｌ１ｂａ工＾およびＡｍｂ　ａ　ＩＩを製造するために用いたＮ末端プ ライマー（アミノ酸１０〜１５） ＥＣＯＲＩ　Ｌ　Ｙ　Ｆ　Ｔ　Ｌ　Ａ Ｇ３８ ＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＧ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣＴＴＡ　ＧＣ５′３′ 端を切り取ったＡｍｂ　ａ　ＩＡおよびＡｌｎｂ　ａ　ＩＩを製造するために用 いたＮ末端プライマー（アミノ酸７０〜７５） ＥＣＯＲＩ　Ｄ　ＣＡ　Ｑ　Ｇ　Ｆ Ｇ３３ ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＧＴ　ＧＣＣＣＡＡ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　Ｇ全長および 端を切り取ったＡｍｂ　ａ　ＩＡを製造するために用いたＣ末端プライマー（Ｔ ＡＡ終止コドンの非コード化ストランド３′の１２〜２９ヌクレオチド：図２参 照）。

ｓｔＩ Ｇ３２ 全長＾ｍｂ　ａ　ＩＤを製造するために用いたＣ末端プライマー（Ｃ末端が保護 されたＧＡＰＣコード化領域に相当）。このプライマーは非コード化ストランド であり、そしてこれには、終止コドンおよび人工的に導入したＰｓｔ　Ｉクロー ン化部位が含まれる（図１５参照）。

ｓｔＩ Ｇ４９ ＧＧＧＣＴＧＣＡＧ　ＴＧＣＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣＴＣＣ５′３′ 全長および端を切り取ったＡｍｂ　ａ　ＩＩを製造するために用いたＣ末端プラ イマー（ＴＡＡ終止コドンの非コード化ストランド３゛の４４〜７６ヌクレオチ ド；図１５参照）。

ｓｔＩ 八ｇＫ２ ＧＧＧＣＴＧＣＡＧ　ＣＧＴ　ＧＴＣＣＡＡ　ＡＴＣＴＡＡ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　 ＧＡＡ　ＣＡＣＴＴＡ　ＴＧＣ５・　３′ プライマーとしてｐｏｌｙ　ｄＴを用いそしてｃＤＮＡ合成システムとキット（ ＾ａ＋ｅｒｓｈａｍ）を用いて、第１ストランドｃＤＮＡを１μｇのＲＮＡから 合成した。この単一ストランド化したｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐキット（ＵＳ 　Ｂｉｏｃｈｅｉｉｃａｌｓ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　Ｏ■）中に推奨されて いる方法に従うプライマーの組（［Ｇ　３８とｌＧ３２　：　［Ｇ３３とｌＧ３ ２　：　ｌＧ３８とｌＧ４９　：　［Ｇ３８とＡｇＫ２　；　［Ｇ３３とＡｇＫ ２）を用いて、増幅させた。このサンプルを、プログラム可能な熱調整装置で増 幅させ、この最初５回の増幅は９４度で３０秒間の変性から成り、鋳型に対して プライマーを４５度で１分３０秒アニールし、そして７０度で４分間鎖伸長を行 う。最終２０回の増幅は上と同じ変性から成り、５５度で１分３０秒アニールし た後、上と同じに伸長を行う。このＰＣＲは、分析用ゲル上に、推論された大き さに相当する帯を生じさせ、そしてＤＮＡ配列決定は、このｃＤＮＡが、全長お よび端が切り取られたＡｍｂ　ａ　ＩＡおよびＡｍｂ　ａ　ＩＩ　（それぞれ図 １１および１５）並びに全長Ａｏｂ　ａ　ＩＤ　（図１４）に相当していること を立証した。

図１１〜１５中に示すほぼ全長のｃＤＮＡは、その第一ヌクレオチドを番号１と 表示して番号付けをしたところのヌクレオチド配列を有している。いくつかのｃ ＤＮＡは、恐らくはＮ末端のメチオニンと思われる部分で開始しているが（Ａｍ ｂ　ａ　ＩＢ、図１２：Ａｍｂ　ａ　ＩＣ，図１３）、あるものはそうでない（ Ａｍｂ　ａ　ＩＡ、図１１　；　Ａｍｂ　ａ’ＩＤ、図１４；ＡｍｂａＩＩ。

図１５）。このように、これらのｃＤＮＡは異なる長さを有しているため、それ らのヌクレオチド番号は必ずしも１つの配列ともう１つの配列とが一致している とは限らない。ｃＤＮＡ配列からアミノ酸配列を推論するため万国共通の遺伝コ ードを用い、クローン体同士の完全アミノ酸配列比較を図１６に示す。図１６に おいて、アミノ酸は、八ｍｂ　ａ　ＩＢ配列の可能なＮ末端メチオニン（番号１ で表示）から連続的に番号付けする。

実施例４　ブタフサ蛋白質およびペプチド類に対するＴ細胞応答末梢血液の単核 細胞（ＰＢＭＣ）を、ブタフサアレルギーの患者から得た６　０ｍｌ、のヘパリ ン化した血液から精製した。次に、ＰＢＭＣを以下の如く処理したが、個々の場 合として、刺激のために用いたｔｔ、−２およびＩＬ−４そして特異性を示すブ タフサ蛋白質およびペプチドを用い、培養時間を変化させた。例として、１０’ ／ｍＬで患者２２２ＰＢＭＣの１０ｍＬを、プールした５％のヒトＡＢ血清を補 充した１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０当たり２０ミクログラムのブタフサ花粉水抽 出物存在下、３７℃で７日間培養した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離 機で生細胞を精製した後、１ｍＬ当たり５単位の組換えヒトＩＬ−２および１ｍ Ｌ当たり５単位の組換えヒトＩＬ−４で３週間培養した。その後、３日間Ｘ線照 射した（３５００ＲＡＤＳ）自系のＰ　ＢＭＣ（５ｘ　１０’／ｍＬ）存在下、 試験用Ｔ細胞を、２ｘｌＯ’個Ｔ細胞／ｍＬの密度で、１ｍＬ当たり２０ミクロ グラムのブタフサ花粉水抽出物を用いて再び刺激（第二）し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈ ｙｐａｑｕｅ遠心分離機で精製した後、２週間、５単位の■Ｌ−２／ｍＬおよび ５単位のＩＬ−４／ｍＬ中で増殖させた。評価に関して、９６個のウェルを有す る丸底評価プレート中、２００ミクロリツトルの容積で３日間、種々の濃度のア レルゲンもしくはそれらのフラグメントを用いて、２ｘｌＯ’個の静止第二Ｔ細 胞を、５ｘｌＯ’個のＸ線照射した（３５００ＲＡＤＳ）自系ＰＢＭＣまたは２ ｘｌＯ’個の自系のＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスで形質転換したＢ細胞（ ２０，０ＯＯＲＡＤＳ）の存在下、再び刺激（第三）した。次に、各々のウェル に１６時間１ミクロキユーリーのトリチル化した（メチル）チミジンを入れた。

計数用を一緒にしてガラス繊維フィルター上に採取した後、液体シンチレーショ ン計数のために処理した。図２１は代表的な定量結果を示しており、これは、ブ タフサ花粉蛋白質に対するＴ細胞培養物の反応性および特異性を示している。使 用した抗原は、ｌＰＣ花粉水抽出物（花粉）　、Ｈｏ１ｌｉｓｔＣｒ−３ｔｉｅ ｒブタクサ皮膚試験抽出物（ＲＷＳＴ）　、ＡＬＫネコ上皮皮膚試験抽出物（Ｃ ８Ｔ）、アフィニティー４８５／Ｂ　７抗体精製した（透析した）＾ｍｂａＩ（ Ｂ７）およびクロマトグラフィー精製した＾＋ａｂ　ａ　Ｉ　（Ａｍｂ　ａ　Ｉ ）である。媒体のみの対照区は、記号なしで線として示す。二者択一的にＰＢＭ Ｃを、時には単に、２０ミクログラムの花粉水抽出物を用いた７日間の第二分析 （第三評価用として上に概略を示した）に従わせ、そして続いて、２〜３週間、 ５単位の１Ｌ−２／ｍＬおよび５単位のＩＬ−４／ｍＬで培養した。１人のブタ フサアレルギー患者のＴ細胞は、第二評価で、花粉抽出物、ＲＷＳＴ、Ｂ７また はＡｍｂ　ａ　Ｉに反応したが、Ｃ３Ｔもしくは媒体のみには反応しなかった（ 図２１）。１つのパネルのブタフサアレルギー患者の第二および第三評価を、種 々９ブタクサ花粉蛋白質の配列から誘導される合成ペプチド類を用いて行った。

いくつかの実験結果を表５に示す。３つの異なるＡｍｂ　ａ　ＩのｃＤＮＡの配 列から誘導されるところの３種のペプチド（ＲＡＥ１６．６、ＲＡＥ４５．１５ 、ＲＡＥ２４．Ｅ）は、その患者のＴ細胞のいずれをも刺激できなかった。同じ ３種のｃＤＮＡの配列から誘導された他の４種のペプチド（ＲＡＥ１５．６、Ｒ ＡＥ３．Ｄ、ＲＡＥ２８．１、ＲＡＥ２６゜１５）は、その患者のＴ細胞の３５ 〜５８％を刺激することができた。

ｌＰＣクローン５のｃＤＮＡから誘導されるところの１つのペプチド（ＲＡＥ４ ）もまたその患者のＴ細胞の２５％を刺激することができた。これらの結果は、 ブタフサ花粉蛋白質をコード化する上記ｃＤＮＡと一致している。それらは更に 、ブタフサアレルギー患者から得られたＴ細胞中の応答を刺激する、ペプチド状 フラグメントと刺激しない他のものとを同定するための、八ｍｂ　ａ　Ｉ／ＩＩ 族（類）の蛋白質構造の知識により得られる機会を示している。この方法により 、ブタフサアレルギー治療および診断における使用のための新規な、治療および 診断上の本質を同定することが可能となる。

ＲＡＥ４　クローン＃５　２８　７　２５°応答は、ブタフサ花粉に特異性を示 すＴ細胞のＴ細胞増殖応答が培地対照区よりも２倍大きくなったとき、陽性とし て記録した。

５名前を付けたペプチドの配列は下記の通りである：ＲＡＥ１６．６　ＲＴＤＫ ＤＬＬＥＮＧ＾ＩＣＲＡＥ４５．１５　ＬＮＱＥＬＶＶＮＳＤＫＴＩＤＧＲＧＶ ＫＲＡＥ２４．　Ｅ　ＥＴＲＲ３ＬＫＴＳＧＡＹＮＩＩＤＧＣＷＲＧＫＡＤＲＡ Ｅ４　ＥＦＰＩＬＧＧＩＴＥＶＫＤＮＤＮＳＶＤＦＣＲＡＥ１５．６　ＹＴＶＴ ＳＤＫＤＤＤＶＡＮＣＲＡＥ３．　Ｄ　ＧＫＡＤｆＡＥＮＲＣＲＡＥ２ｇ、Ｉ　 ＬＥＮＧＡ［ＦＶＡＳＧＶ［ｌｒ’ＶＬτＰＥＱＲＡＥ２６．１５　ＧＦＦＱＶ ＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡアフィニティー精製した＾ｍｂａＩを電気泳動にかけ 、ウェスタン転移させた（Ｔｏｗｂｉｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ＾、７６：４３５０　（１９７９））後、アレルギー患者か ら得たＩｇＥを含む種々の抗体で試験した（図１７）。

花粉抽出物において、八ｍｂａＩは、損傷を受けていない３８−ＫＤ種として存 在しているのみでなく、酵素開裂によって生じるところの、その成分２６−ＫＤ アルファ鎖および１２−ＫＤベータ鎖によって、特徴づけられる。この損傷を受 けていない３８−ＫＤ種および該アルファ鎖は、ラビットの抗＾＋ｎｂ　ａ　Ｉ 、多クローンアフィニティー精製した抗ＲＡＥＩ６および単りローン抗＾ｍｂａ ＩＪＢＩＥ３　４を用いて、明らかに検出される（図１７；ＲＡＥ１６ペプチド は、Ａｍｂ　ａ　ＩＢ（７）アミノ酸３４２〜３５３から誘導される配列ＲＴＤ ＫＤＬＬＥＮＧＡＩＣを有している）。

アフィニティー精製したＡｍｂ　ａ　Ｉ　（表１に部分的配列が示されている） 並びにクロマトグラフィー精製したＡｍｂ　ａ　ＩＩ　（表２に部分的配列が示 されている）は、これらの抗体並びに患者のＩｇＢと、ウェスタンプロットで結 合する（図１７）。ヤギの抗＾ｍｂ　ａ　Ｉ多クローン抗体もまた、花粉抽出物 の二次ウェスタンプロットで、多重Ａｍｂ　ａ　Ｉおよび＾ｌｌＩｂ　ａ　ＩＩ 種と結合する（図１８）。このウェスタンプロットは以下に概略を示すようにし て行った。

１５μｇの粗可溶花粉蛋白質を用い、Ｈｏｅｆｆｅｒゲル装置上で等電点電気泳 動を行った。このゲルは、３５％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓ　ｐＨ４，５〜５゜ ３　（１’ｈａｒＩｌａｃｉａ）および３，５％の八ｍｐｈｏｌｉｎｅｓ　ｐｉ （３，５〜１０　（ＬＫＢ）と−緒に７．５％のアクリルアミドから成っており 、一定電圧に到達するまで３．５時間１３Ｗで流した。このゲル部分を、１０％ のアクリルアミド５ＤＳ−ＰＡＧＥのスラブ上に置き、引用されているプロトコ ルに従って４０ｍＡで３．５時間電気泳動させた。この蛋白質を、０．２Ａでホ スフェート緩衝液中０．１ミクロンのニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ および５ｃｈｕｅｌｌ）に、−晩移動させた。このプロットを、このプロット溶 液（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５，０，１７１ＭのＮａＣ１，０，０ ５％のＴｗｅｅｎ−２Ｑ　；　５１ｇ１Ｉｌａ）中ですすいだ。プロット溶液中 のヤギ抗＾ｍｂ　ａ　Ｉ　Ｉ　ｇ　Ｇ　（Ｄａｖｉｄ　Ｍａｒｓｈ博士から入手 ）の１　：　０００希釈を用いて室温で一晩、第一抗体培養を行った。プロット 溶液で１５分間３回すすぐことによって、過剰の第一抗体を除去した。第二抗体 に関しては、プロット溶液中のビオチン化したブタの抗ヤギＩ　ｇＧ　（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｅｈｅｉａ＋）の１＋２．５００希釈液を用いて２時 間培養した。次に、このプロットを、プロット溶液で１５分間３回すすいだ後、 ２μＣ１の■１２５ストレプトアビジン（＾ｍｅｒｓｈａａ）含有プロット溶液 中で１時間培養した。洗浄廃液が背景レベルに低下するまで、このブロッ、トを プロット溶液ですすいだ。その後、このプロットを一８０℃で一晩フィルムに暴 露した。゛−次５ＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンプロットの場合（図１７．１９およ び２０）、等電点電気泳動段階は削除した。このウェスタンプロットを試験する ためヒトの血清を用いた場合（図１７および２０）、プロット溶液中の１％ミル ク中１０％のヒトの血漿を、第二抗体ビオチン化したヤギの抗ヒトＩｇＥとして の使用に先立って一晩、該プロットと一緒に培養した。

同等物 常規以下の実験を用いることで、本分野の技術者は、詳細に本文中に記述した本 発明の特定の具体例に対する数多くの類似物を認識するか或は確かめることがで きるであろう。このような同等物は、以下に示す請求の範囲内に包含されること を意図している。

ＦＩＣｌｌｌｌＥ　２ ｕｓｃ　７ａ−ンｌ 核酸配列の翻訳 ＡＭＢ　Ａ　ＩＢり０−ンのＤＥ配列。　ＦＩＧＵＲＥ　３塩基の全数は！３２ ８である。

完全配列に対して行った分析。

（絶対）相（類）に対して行った　１゜万国共通遺伝コード使用。

ＡＬＡＤＣＡＱＧＦＡＫＧＴＹＧＧＸＨＧＤＦ工ＧＵＲＥ　３　１ｃｏｎｔ’ｄ ｌ ＶＮＩＶＮＡＧＬＴＬＭＮＶＫＮ　工　ＩＩＨＮＩＮＩＨＤＩＫＶＣＰＧＧＭ　 工　１’Ｃ３ＮＤＧＰＰＩＬＲＱＱＳＤＧＤＡ　工　ＮＶＡＧＳＳＱＩＷＩＤＨ Ｃ５ＬＳＫＡＳＤＧＬＬＤＩＴＬＧＳＳＨＶＴＶＳＮＣＫＦＴＱＨＱＦＶＬＬＬ ＧＡＤＤＴＨＹＱＤＩＣＧＭＬＡＴＶＡＦＮＭＦＴＤＨＶＤＱＲＭＰＲＣＲＦＧ ＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡ　工　ＧＧＳＳＡＰＴ　工ＬＳＱＧＮＲＦＦ ＡＰＤＤ　エ　エ　ＫＥＮＶＬＡＦＩＧＵＲＥ　ｊ　（ｅｏｎｔ’ｄｌ ＦＩにＩＪＲＥ　１ｉ Ｆ１ｕｒ＠４（Ｃｏｎｅ、） ｘｐｃ　７０−ン１ ＩＦＣ７Ｑ−ン５ ＦＩＧＬＩＲＥ　７ エｐｃ　７０−ン６ ＤＮ”””９　”ｅ　Ｈ−フ”ｉＨｈ取りＦＲ造物分ｔｋＩｉ８０１２０＋ｇｏ ２ｏｏ２ａｏ２ＢＯコ２０コロ０４００４４０ｎｕＤＮＡインスペクター１１ｅ 　オープン読み取り構造物分析　（１０，０コ、１９８θノペプチド＃１読み取 り構造の分析：３ ｎＬ＃で開始：＋３ アミノ酸の数：９２ １文字表示： ＩＰＣクローン１ ＤＮＡインスペクター１１ｅ　オフ’ア読み取り構造物分析ＤＮＡインスペクタ ーＩＩｓ　オープン読み取り構造物分析　ｆ１シの４９θ８ノペプチド＃ｌ読み 取り構造の分析＝１ ｎｔ＃で開始：＋１ アミノ酸の数：９４ ［ＰＣクローン５ ＤＮＡ４’ｉｌ″：９９−１１ｅ　、１−−ジン５ｈ取りＦＲ造約物分析測定た ｌオープン読み取り構造物 アミノ酸の数：９９ １文字表示： ＩＰＣクローン６ 核酸配列の翻訳 ＡＭＢ　Ａ　ＩＡクローンのＤＥ配列。

完全配列に対して行った分析。

（絶対）相（１１１）に対して行った：ｌ。

万国共通遺伝フード使用。

ｒｘｃｏＲＥｌ’１−ｆｃｏｎｔ’ｄｌＦ工ＧＵＲＥ　ｘｉ　（ｃｏｎｔ’ｄ 核は配列の翻訳 ＤＮＡ配列ＡＭＢ　Ａ　ＩＢに対して行つＩこ。

ＡＭＢ　Ａ　ＩＢクローンのＤＥ配列。

完全配列に対して行った分析。

（絶対）相（ＩＩ）に対して行った：ｌ。

万国共通遺伝コード使用。

Ｆ工ＧＵＲＥ　１２　ｆｃｏｎｔ’ｄｌＦＩＧＵＲＥ１’２ノｆｃｏｎｔ’ｄｌ 楼酸配列の翻訳 ＡＭＢ　Ａ　ＩＣクローンのＤＥ配列。

完全配列に対して行フだ分析。

（絶対）相（類）に対して行った：ｌ。

万国共通遺伝コード使用。

ＦＩＧＵＲＥ　ｌ’ｌ　（ｃｏｎｔ’ｄｌＤＧＲＧＶＫＶＥＩ　ＩＮＧＧＬ’！ ’ＬＭＮＶＫＮＩＩＩＨＮＩ：ＮＩＨＤＶＫＶＬＰＧＧＭＺＡＧＳＳＱＩＷＩＤ ＨＣ８ＬＳＫ５ＦＤＧＬ５）ＣＡＩＬＬＧＡＤＤＴＨＶＱＤＫＧＭＬＡＴＶＡＦ ＮＭＰＴＤＮＶＤＱＲＭＰＲＣＲＦＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡＩＧＧ ｖｘｃｘｔ？舊”ｃｏｎｔ’ａ 核酸配列の翻訳 ＤＮＡ配列ＡＭＢ　Ａ　ＩＤに対して行った。

ＡＭＢ　Ａ　ＩＤクローンのＤＥ配列。

完全配列に対して行った分析。

（絶対）相（ｗｌ）に対して行った。１０万国共通遺伝コード使用。

ＤＣＡＱＧＦＡＸＧＴＩＧＧＫＤＧＤＩＹＴＡＡＱＮＲＰＬＷＩＩＦＥＲＤＭＶ 　工　ＲＬＤＦ工ＧＵＲＥ　１４’　（ｃｏｎｔ’ｄｌＧＳＹＡｒ、ＧＧＳＡＧ ＰＴＩＬＳＱＧＮＲＦＬ、ＡＳＤ　工　Ｋ）ＣＥＶＶＧＲＹＧＥＳＡＭＳＥＴ工 ＧＯＲＥ’　１／４−　（ｃｏｎｔ’ｄ）核醜配列の翻訳 ＤＮＡ配列Ａ八ＩへＡＩ＋に対して行った。

ＡＭＢ　Ａ　ＩＩクローノのＤＥ配列。

完全配列に対して行った分析。

（絶対）相（１１）に対して行った＝１゜万国共通遺伝コード使用。

ＦＩＧＵＲＥ　１５’　ｃｏｎｔ’ｄｌＦ工ＧＵＲＥ　１’（−１ｃｏｎｔ’ｄ ｌ＃ＩＩＩ）　ａ　Ｉ　＋Ｊ］４１１１＋Ａｌネ餐合Ａａ　ａＪ　ＲＸひ工［Ｐ Ｊ−−Ｓ１１−−−−−−−−に−Ｖ−−−１１Ｙ−−−−ＣＬ−Ｔ−Ａ”Ｏ！ Ｆ−Ｍ−’ｒ−−−−−ＯＮ−−−−−ｍＪんハ＼Ｉ）ａｌｌＪたｆ各１遺す合 １しｌＶギー會魂Ａ５　＃咽５　菖、Ｋ　曾＾　、ＦＭ＋ｏｑ ＦＩＧＬＩＲＥ　２１ 、ろｚ２２２　才２（に輪′才、１） 丁に＃Ｉ　（ｕ９１ｒｒＩす 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成３年９月１７日 同

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．ブタクサ花粉の単離されたアレルゲン性ペプチド。
2. ２．該ブタクサがアンブロシア・アルテミシイフォリアＩ（Ａｍｂｒｏｓｉａ　 ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ　Ｉ）である請求の範囲１の単離ペプチド。
3. ３．それが投与された、ブタクサに敏感な個体において、ブタクサ花粉に対する アレルギー反応を修正し得る請求の範囲１の単離ペプチド。
4. ４．ブタクサアレルゲンに対するＢ細胞応答、ブタクサアレルゲンに対するＴ細 胞応答、或はこれらの両方を修正し得る請求の範囲３の単離ペプチド。
5. ５．抗ブタクサＩｇＥと結合し得る請求の範囲１の単離ペプチド。
6. ６．ＡｍｂａＩの単離されたアレルゲン性ペプチド。
7. ７．下記のアミノ酸配列：Ｗ　Ｅ　Ｎ　Ｆ　Ｋ［ここで、 Ｗは、アミノ酸であるトリプトファンを表し、Ｅは、アミノ酸であるグルタミン 酸を表し、Ｎは、アミノ酸であるアスパラギンを表し、Ｆは、アミノ酸であるフ ェニルアラニンを表し、そしてＫは、アミノ酸であるリジンを表す］ で構成されている請求の範囲６の単離ペプチド、或はその機能的同等物。
8. ８．ａ）　ＥＦＰＩＬＧＧＩＴＥＶＫＤＮＤＮＳＶＤＦＣ；ｂ）　ＹＴＶＴＳＤ ＫＤＤＤＶＡＮＣ；ｃ）　ＧＫＡＤＷＡＥＮＲＣ； ｄ）　ＬＥＮＧＡＩＦＶＡＳＧＶＤＰＶＬＴＰＥＱ；ｅ）　ＧＦＦＱＶＶＮＮＮ ＹＤＲＷＧＴＹＡから成る群から選択されるアミノ酸配列を有する請求の範囲６ の単離ペプチド。
9. ９．アレルギー反応を防止し得る請求の範囲６の単離ペプチド。
10. １０．抗ブタクサＩｇＥと結合し得る請求の範囲６の単離ペプチド。
11. １１．ＡｍｂａＩの単離されたアレルゲン性ペプチド。
12. １２．図１１中に示すようなＡｍｂａＩＡのアミノ酸配列；図１２中に示すよう なＡｍｂａＩＢのアミノ酸配列；図１３中に示すようなＡｍｂａＩＣのアミノ酸 配列；および図１４中に示すようなＡｍｂａＩＤのアミノ酸配列：から成る群か ら選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を有する請求の範囲１１の単離ペプ チド。
13. １３．図１５中に示すようなＡｍｈａＩＩのアミノ酸配列の全てまたは一部を有 する単離ペプチド。
14. １４．ブタクサに敏感な個体に投与されたとき、この個体のブタクサ花粉に対す るアレルギー反応を減少させるところの修飾されたブタクサ花粉ペプチド。
15. １５．天然に存在している相当する花粉ペプチドよりも少ない副作用をもたらす 請求の範囲１４の修飾されたブタクサ花粉ペプチド。
16. １６．修飾されたＡｍｂａＩペプチドである請求の範囲１５の修飾されたブタク サ花粉ペプチド。
17. １７．修飾されたＡｍｂａＩＩである請求の範囲１４の修飾されたブタクサ花粉 ペプチド。
18. １８．ブタクサ花粉のアレルゲン性蛋白質の全てもしくは一部、ブタクサ花粉の アレルゲン性ペプチドの全てもしくは一部をコード化する単離ＤＮＡ、或は上記 ＤＮＡいずれかの機能的同等物。
19. １９．短いブタクサ花粉のアレルゲン性蛋白質の全てもしくは一部、短いブタク サ花粉のアレルゲン性ペプチドの全てもしくは一部をコード化する請求の範囲１ ８の単離ＤＮＡ、或は上記ＤＮＡいずれかの機能的同等物。
20. ２０．ＡｍｈａＩのアレルゲン性蛋白質の全てもしくは一部、ＡｍｂａＩのアレ ルゲン性ペプチドの全てもしくは一部をコード化する単離ＤＮＡ、或は上記ＤＮ Ａいずれかの機能的同等物。
21. ２１．図１１中に示すようなＡｍｂａＩＡのヌクレオチド配列；図１２中に示す ようなＡｍｈａＩＢのヌクレオチド配列；図１３中に示すようなＡｍｂａＩＣの ヌクレオチド配列；および図１４中に示すようなＡｍｂａＩＤのヌクレオチド配 列；から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲２０の単離 ＤＮＡ。
22. ２２．下記のアミノ酸配列：Ｗ　Ｅ　Ｎ　Ｆ　Ｋ［ここで、 Ｗは、アミノ酸であるトリプトファンを表し、Ｅは、アミノ酸であるグルタミン 酸を表し、Ｎは、アミノ酸であるアスパラギンを表し、Ｆは、アミノ酸であるフ ェニルアラニンを表し、そしてＫは、アミノ酸であるリジンを表す］ を有するペプチドをコード化する請求の範囲２０の単離ＤＮＡ、或はその機能的 同等物。
23. ２３．ａ）　ＥＦＰＩＬＧＧＩＴＥＶＫＤＮＤＮＳＶＤＦＣ；ｂ）　ＹＴＶＴＳ ＤＫＤＤＤＶＡＮＣ；ｃ）　ＧＫＡＤＷＡＥＮＲＣ； ｄ）　ＬＥＮＧＡＩＦＶＡＳＧＶＤＰＶＬＴＰＥＱ；ｅ）　ＧＦＦＱＶＶＮＮＮ ＹＤＲＷＧＴＹＡから成る群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコ ード化する請求の範囲２０の単離ＤＮＡ。
24. ２４．図１５中に示すようなＡｍｂａＩＩのヌクレオチド配列の全てまたは一部 のヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ。
25. ２５．ＡｍｂａＩのアレルゲン性ペプチドに対して特異的な反応性を示す単クロ ーン抗体。
26. ２６．ＡｍｂａＩＩのアレルゲン性ペプチドに対して特異的な反応性を示す単ク ローン抗体。
27. ２７．個体に対して治療学的に有効な量で、ＡｍｈａＩのアレルゲン性蛋白質も しくはアレルゲン性ペプチド、或はＡｍｂａＩの免疫抗原的に修飾した蛋白質も しくは免疫抗原的に修飾したペプチドを投与することから成る、個体中のブタク サ花粉に対する敏感性の治療方法。
28. ２８．個体に対して治療学的に有効量の請求の範囲５のペプチドを投与すること から成る、個体中のＡｍｂａＩペプチドに対する敏感性の治療方法。
29. ２９．ＡｍｈａＩのアレルゲン性ペプチドを含む治療学的組成物。
30. ３０．請求の範囲１４の修飾されたブタクサ花粉ペプチドを含む治療学的組成物 。
31. ３１．請求の範囲１のペプチドの有効量を個体に投与した後、上記ペプチドに対 する該個体中のアレルギー反応の発生を測定することから成る、ブタクサ花粉ア レルゲンに対する個体中の敏感性を検出する方法。
32. ３２．血液成分とペプチドとが結合するに適当な条件下で、個体から得た血液サ ンプルとブタクサ花粉の単離アレルゲン性ペプチドとを一緒にした後、上記結合 が生じる度合を測定することから成る、ブタクサ花粉アレルゲンに対する個体中 の敏感性を検出する方法。
33. ３３．Ｔ細胞機能、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞機能の評価、該ペプチドと血液中に存在 している抗体との結合、或はそれらの組み合わせで、結合が生じる度合を測定す る請求の範囲３２の方法。
34. ３４．Ｂ細胞によって認識されるか或はＴ細胞によって認識されるアミノ酸配列 を有するペプチドを個体に投与しそしてこのＢ細胞またはＴ細胞による認識が、 それぞれ、Ｂ細胞応答を下方修正するか或はＴ細胞応答を下方修正することから 成る、ブタクサに敏感な個体中のブタクサアレルゲンに対するアレルギー反応を 修飾し得るブタクサ花粉ペプチドの設計方法。