JPH01502077A

JPH01502077A - 原発性胆汁肝硬変自己抗原

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Publication number: JPH01502077A
Application number: JP62506357A
Authority: JP
Inventors: コペル、ロス・レオン; ガーシュイン、メリル・エリク
Original assignee: アムラド・コーポレーション・リミテッド
Priority date: 1986-12-16
Filing date: 1987-12-16
Publication date: 1989-07-27
Anticipated expiration: 2013-10-27
Also published as: JP2815582B2; CA1341231C; NZ222942A; US5196319A; JP2875226B2; JPH1175864A; EP0293471A4; WO1988004689A1; AU604087B2; EP0293471A1; US5891436A; DE3751834D1; EP0293471B1; DE3751834T2; AU1086888A; ATE139259T1; JPH09308490A; ZA879403B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】原発性胆汁肝硬変自己抗原本発明は、原発性胆汁肝硬変（ＰＢＣ）における特有の自己抗体応答のターゲットとして認識される自己抗原の同定、クローニングおよび発現に関し、また本蛋白質、そのフラグメントまたは蛋白質もしくはフラグメントを含む融合ポリペプチドのＰＢＣ診断テスト、およびＰＢＣにかかっている患者の処置における利用に関する。

原発性胆汁肝硬変（ＰＢＣ）は、肝臓内胆汁管の進行性炎症性閉塞により特徴づけられた慢性病である。この病気は、当初免疫蛍光法５により同定されたミトコンドリアに対する自己抗体応答１−４を特徴とした。

プロット免疫検出の最近の利用により、特定の蛋白質が、ＰＢＣの抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）のターゲットとして認識されるに至った１．６．７。具体的には、７０キロダルトン（ｋｄ）蛋白質に対する血清抗体が、ＰＢＣ患者の９５％以上にみられるが、他の自己免疫肝臓病の患者にはなく２．８、４５と３９ｋｄの２つの他の蛋白質はＰＢＣ血清では頻度が少なく検出される１．２．９。これらの自己抗原の各々の本体は、病気の病原性とこれらの抗原の関連と同様に知られていない。しカルながら、７０ｋｄの抗原は、進化上高度に保存され、哺乳類、酵母や細菌に存在するので１０、重要な構造もしくは生物学的機能をもっと信じられる３゜抗ミトコンドリア抗体の生成のメカニズムの資料が少ないにもかかわらず、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によると、ＰＢＣによる患者の９５％以上に臨床的に上記のような抗ミトコンドリア抗体が見られた″−０粗製のミトコンドリア抗原製品を使うと、ＰＢＣや真性結合組織病や薬物反応以外の肝臓病を含む様々の病気の患者および、時々健康な個体でさえも、ミトコンドリアに対する抗体をもっことが証明できる。従って、このような粗製の製品を使った検定は、ＰＢＣの特有な診断を可能にし得ない。例として、ドイツ特許公開３，２３７，６０２号では、粗製のミトコンドリア抗体製品を使った血清中の抗ミトコンドリア抗体の検出と定量のＥＬＩＳＡを発表している。検定の特異性の欠如は、たとえばＰＢＣや慢性活動性肝炎の胆汁うつ滞、梅毒（ｎ）、エリテマトーデス症候群型薬療、ある種の一次性非肝性免疫疾患、イブロニアジド誘導肝炎やβ受容器しゃ新薬の副作用の病気の特別な診断におけるこの検定の利用が提案されていることから明らかである。ミトコンドリア膜のより活発な単離により、抗原性の不均質の問題はより明らかになり、トリプシン感受性およびミトコンドリア膜内対膜外の抗原の位置に基づいた特有なミトコンドリア抗原の定義が導かれた。これにもかかわらず、ＰＢＣの診断は、免疫蛍光の相対的感度の低さもしくは補完固定、ＥＬ　Ｉ　ＳＡや免疫沈降を含む方法が感度が高いが非特異性のため、抗ミトコンドリア抗体の呈示に、まだ大きく依存している２３本発明は、ＰＢＣの７０ｋｄのミトコンドリア自己抗原（いくつかの研究グループによりＭ２と命名１−）を発現するラットの肝臓遺伝子発現ライブラリー由来ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの同定におよびその配列決定に基づく。配列は、ミトコンドリアＤ　Ｎ　Ａではなく核ＤＮＡによって暗号化されている。

本発明は、ＰＢＣにみられる抗７０ｋｄの抗体の極めて感受性が高く特異的な診断ＥＬＩＳＡの基礎を提供する。

本発明の最初の見地によると、原発性胆汁肝硬変（ＰＢＣ）の７０ｋｄミトコンドリア自己抗原またはその抗原活性を有するフラグメントを暗号化している塩基配列の全部または一部に実質的に対応するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子が提供される。

本発明の見地によるＤ　Ｎ　Ａ分子は、少なくとも実質的に第６図に示された塩基配列またはそのフラグメントを含む部分によって特徴づけられたものであるのが好ましい。

もう１つの見地では、本発明は、」二記に記載し、および発現調節配列に機能し得るように結合したヌクレオチド配列からなる組換え体ＤＮＡ分子を提供する。

この組換え体Ｄ　Ｎ　Ａ分子は、例えばバクテリオファージやプラスミドのような発現ベクターまたはそれで形質転換した細菌や他の微生物のような宿主細胞からなっている。

本発明のさらに他の見地では、原発性胆汁肝硬変の７０ｋｄミトコンドリア自己抗原またはその抗原活性を有するフラグメントの全部または一部の抗原性を表示する合成ペプチドまたはポリペプチドが提供される。

本発明の見地による合成ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも実質的に第６図もしくは第８図に示されたアミノ酸配列またはその抗原活性を有するフラグメントを含む部分によって特徴づけられるのが好ましい。

本合成ペプチドまたはポリペプチドは、上記に広く記載された組換え体Ｄ　Ｎ　Ａ分子で形質転換した宿主細胞の発現により融合ポリペプチドとしてまたは直接製造される。

別法として、例えば既知のメリフィールド同相合成方法のような化学的合成により製造される。

本発明は、７０ｋｄ自己抗原全体に対応する合成ペプチドおよび、自己抗原全体を暗号化しているヌクレオチド配列およびそのフラグメントに及ぶ。例として、この１つのフラグメントは、第６図に示されたヌクレオチド７ロー６７９によって暗号化されたフラグメントである。約２００残基のこのフラグメントは、天然の自己抗原に対するすべての抗体を患者血清から吸収することができる。このフラグメントの中に、実質的に自己抗体に対する反応性をもつことがわかった、アミノ酸配列２０残基フラグメント、ＡＥＩＥＴＤＫＡＴＩＧＦＥＶＱＥＥＧＹＬがある。本フラグメントは、第６図および第８図両方の配列に共通している。したがって、本発明は、診断検定法における上記のような抗原性活性フラグメントの使用および自己抗原全体の使用に及ぶ。

本発明は、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡテクノロジーを使用するか、抗原を被覆したビーズ等を用いた患者の血清中の抗ミトコンドリア抗体の検出または力価の定量による、ＰＢＣの診断試験における抗原としての本発明の合成ペプチド、ポリペプチドまたはフラグメントの使用にも及ぶ。後者の見地で（よ、この処置方法はＰＢＣ抗体または患者の反応細胞を除去するための吸着剤としての合成抗原の使用や、ＰＩ３Ｇ自己抗原に対する患者の反応性を除去または減少させるための減感剤として患者に直接投与するこれらの活性成分の使用を含む。

血清サンプル中の抗ミトコンドリア抗体の検出における合成自己抗原の使用に加えて、本発明の特異的なタイピング試薬を使ったクラス特異的免疫グロブリンカ価の測定における合成ペプチド、ポリペプチドまたはフラグメントの使用に及ぶ。応用は、自己抗体の全体の親和性または自己抗体の各々のクラスまたはサブクラスの親和性の測定にも及ぶ。親和性は、例えばグアニジンチオシアネートの異なった洗液を使用し１こ複製ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法のような様々の方法により測定される４２゜さらに診断用の検定法の拡張は、７０ｋｄ自己抗原の酵素機能による自己抗体の妨害の程度の測定である（後に示すがリボエートアセチル転移酵素を表す）。酵素の源は、天然のポリペプチドまたは融合ポリペプチドとして完全な長さのクローンの発現または、酵素的活性フラグメントまたはミトコンドリアから精製したタンパク質の発現から誘導される。酵素検定法は、当技術において既知の標準な検定法であるが、サンプルの血清または細胞とインキュベートする段階を含むように修正した。さらに合成ペプチド、ポリペプチドまたはフラグメントの使用の拡張とし、自己抗原に対する患者の細胞の反応性の測定を含む。

合成ペプチド、ポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中または固体支持体に結合して、末梢血管または組織バイオプシーから誘導された非分画、分画または連続セルラインの患者細胞に加えることができる。自己抗原に対する反応性は、トリチウム化したチミジンの取り込みのような標準増殖検定法、標的細胞からのマーカー放射能の遊離のような標準細胞障害検定法または、当技術に既知の細胞反応性の他の標準検定法により測定できる。

本発明の特に重要な見地では、血清試料中の抗ミトコンドリア抗体検出のための診断試験であって、（ｉ）上記血清試料を、ＰＢＣの７０ｋｄミトコンドリア自己抗原またはその抗原活性を有するフラグメントを表示する合成ペプチドまたはポリペプチドと接触させ、上記合成ペプチドまたはポリペプチドは、支持体上に固定されているものとし、（ｉｉ）上記合成ペプチドまたはポリペプチドに結合した上記血清中の抗ミトコンドリア抗体の存在を検出する工程を含む試験が提供される。

この見地では、本発明は、血清試料中の抗ミトコンドリア抗体の検出のための診断試験用キットであって、（ｉ）　ＰＢＣの７０ｋｄミトコンドリア自己抗原またはその抗原活性を有するフラグメントの全部または一部の抗原性を表示する合成ペプチドまたはポリペプチドがその上に固定されている支持体および（ｉｉ）　上記合成ペプチドまたはポリペプチドに結合した上記血清中の抗ミトコンドリア抗体の存在を検出する手段を含むキットを提供する。

結合したＡＭＡの存在の検定は、既知のＲＩＡまたはＥＬ　Ｉ　ＳＡ技術の使用によるのが好ましい。

ＰＢＣの７０ｋｄミトコンドリア自己抗原の抗原性を表示した組換え体融合ポリペプチドの製造の結果、本自己抗原はりポエートアシル転移酵素として同定された。さらに、抗ミトコンドリア抗体の免疫グロブリンのイソタイプが決定しており、ＩｇＧ３がＰＢＣ患者のグループの著しいアイソトープであり、次いでＩｇＭが多い。健康で正常な大人とＰＢＣ患者の血清免疫グロブリンのイソタイプの含量を比較すると、血清１ｇＧ３およびＩｇＭがＰＢＣでは高く、正常よりＩｇＧ３では５．５倍、ｒｇＭでは４．３倍も高い。

本発明によれば、ミトコンドリア自己抗原またはそのフラグメントを暗号化したｃＤＮＡ挿入断片の発現は、種々の異なった方法により達成される。本発明の詳細な説明では、ＪＭｌｏｌ、ＪＰＡＩＯｌや７１１８のようなエシェリヒア・クリ株の宿主細胞を使用したベクターλｇｔｌｌおよびｐＢＴＡ２２４のβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現させている。融合タンパク質としての自己抗原の成功した発現は、既知のＰＶＣベクター、グルタチオンＳ−転移酵素融合タンパク質の発現によりここでも宿主細胞としてエシェリヒア・コリを用いて達成された。別法として、ミトコンドリア自己抗原は適当なベクターおよび宿主細胞の組み合わせを使うことにより、融合しないポリペプチドとして発現することができる。

本発明により使用できる他のベクターおよび宿主細胞の組み合わせは、多数の既知の酵母細胞中に生育させた酵母シャトルベクターの連続したセルライン中の真核ベクターまたは遺伝形質転換動物を含んでいる。

本発明によるＰＢＣの７０ｋ（ｌミトコンドリア抗原の同定、クローニングおよび発現並びにＥＬＩＳＡによる使用を次の添付の図面を参考にして詳細に述べる。

第１図は融合ポリペプチドの特異性を示す。レーンＡおよびＢでは、１０００分の１に希釈した２つの異なったＰＢＣ血清を、ｐＲＭＩＴで形質転換したＪＭＩＯＩ細胞の溶菌液に対してプローブした。血清は両方とも１６０ｋｄのポリペプチドと反応した。対照的に、レーンＣおよびＤでは、β〜ガラクトシダーゼと融合しｆこ無関係の挿入断片を含んだ対照細胞の溶菌液に対してプローブしたところ同血清は無反応であった。レーンＣおよびＤの反応バンドは、エシェリヒア・コリタンパク質と一致した。１００分の１および１０００分の１希釈の正常血清を用いた２重プロットでは、融合ポリペプチドを検出せず、図示しなかった。３６ｋｄに反応性の融合タンパク質の破片がみられた。

第２図は、ｐＲＭＩＴ融合ポリペプチドの同定を示す。ＰＡＧＥ後のヒト胎盤ミトコンドリアタンパク質に対する吸収および無吸収ＰＢＣ血清の反応性が測定された。レーンＡでは、プローブを、最終希釈２０００分の１の無吸収ＰＢＣ血清にした。レーンＢでは、プローブを、弁組換え体ｐＢＴＡ２２４で形質転換した細胞で７２時時間分に吸収しおよび弁組換え体ｐＢＴＡ２２４で形質転換した細胞の溶菌液を結合した固体支持体に通した最終希釈２０００分の１の同血清にした。レーンＣでは、プローブを、弁組換え体ｐＢＴＡ２２４で形質転換した細胞で７２時間吸収しおよび発現ｐＲＭＩＴで形質転換した細胞の溶菌液を結合した固体支持体に通した最終希釈２０００分の１の同血清にした。血清はまた、２００分の！および２０，０００分の１で研究した（表■）。

第３図は、親和性−精製抗体の特異性を示す。レーンＡでは、２０００分の１の無吸収のＰＢＣ血清を７０および４５ｋｄタンパク両方に反応する胎盤ミトコンドリアに対してプロットした。レーンＢでは、カラム溶出液を同ミトコンドリア製品に対してプロットした。

注意することは、反応性が７０ｋｄタンパク質だけであり、シグナルの減少はこのような溶出液の予期した回収と一致したことである。

１週間の長時間オートラジオグラフ露出でさえ、活性は７０ｋｄタンパク質だけであった（データは示していない）。レーンＣでは、溶出液を、ｐＲＭＩＴで形質変換した誘導ＪＭＩ　０１の音波処理物に対してプロットしｙ、：、１６０ｋｄ融合ポリペプチドの強度は、発現した融合ポリペプチドが多いためである。レーンＤでは、溶出液を、豊富な融合ポリペプチドを暗号化した無関係なプラスミドで形質転換した誘導ＪＭＩ　０１の音波処理物に対してプロットした。

第４図は、ｐＲＭＩＴ誘導融合ポリペプチドで免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫応答を示す。胎盤ミトコンドリアは、７．５％ゲル上でＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上にプロットした。

そして、分画化したタンパク質は１０００分の１の希釈濃度（レーンＡ）またはＰＢＳの患者の血清１０００分の１でプローブした。

免疫したマウスは７０ｋｄに対しての抗体が誘導されたが４５ｋｄのり第５図は、ＨＥｐ−２細胞の免疫蛍光を示す。Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスは、精製した融合ポリペプチドで免疫され、血清は、ＨＥｐ−２細胞とインキュベートした。反応性の典型的なミトコンドリアパターンが注目されている。

第６図は、ｐＲＭＩＴのヌクレオチド配列および推測したＰＢＣの７０ｋｄミトコンドリア抗原のアミノ酸配列を示す。

第７図は、ＰＢＣのＡＭＡ検出におけるＥＬ　Ｉ　ＳＡ（＋）および免疫蛍光法（ロ）の間の感度の比較を示す。ＰＢＣ血清は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡでは１：１０００から始めて１０倍希釈ごとに試験しているのに対して、Ｈｅｐ−２細胞の免疫蛍光法では、ｌ：１０から始めて２倍希釈ごとに試験をしている。ＥＬＩＳＡにおける陽性は、正常血清の平均値上の２Ｓ、Ｄ、Ｏ，Ｄ、とじて定義した。

第８図は、ヌクレオチド配列および第６図のヌクレオチド１０５−１０６５領域のヒト対応部を含む、第６図に描かれたヒト対応部の配列を暗号化した２、２ｋｂｃＤＮＡ挿入断片の推挿入足ノ酸配列を示す。本ヒトｃＤＮＡクローンは、既知の技術によるハイブリッド形成プローブとしてｐＲＭＩＴを使うことによるヒト胎盤ライブラリーのプローブにより得られた。配列は相同性が高く、自己ミトコンドリア抗体との反応性において超似性がある。それ故に、いずれの抗原配列も、抗ミトコンドリア抗体または自己反応細胞を検出する診断試験の基礎として使用され得る。

Ａ、材料および方法ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング１５．０００の組換え体からなり、平均長１．４ｋｂのλｇｔｌｌ−Ａｍｐ３内のラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、ＰＢＣを有する患者由来の血清を用いてプローブした。スクリーニングに使用した血清は、ひと胎盤ミトコンドリア２の電気泳動で分離した蛋白の免疫プロット分析によってミトコンドリアに対する抗体を持つことが示されている典型的ＰＢＣを有する各々３人の患者から得た。ＰＢＣを有する患者のある者はエシェリヒア・コリに対して高力価の抗体を持つため、非相換え体ファージに感染したエシェリヒア・コリに充分量に血清を前吸収させた。最終濃度１：１０００”、”でプローブするのに血清を使用した。λ−Ａｍｐ３ライブラリーを、Ｓｒ１株のエシェリヒア・コリを用いて１５分間３７°Ｃでインキュベートし、その後２時間、４２℃でＬＢ寒天中で培養した。その後、あらかじめ１０ｍ１イソプロピル− チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）中に浸漬し、風乾させたニトロセルロースフィルターを各プレート上に積層した。その後プレートを一夜３７℃でインキュベートした。整列後ニトロセルロースを取り出し、１時間５％粉乳を有するＰＢＳ（ｐＨ７，４）中で洗浄した。その後４５分間、ＰＢＳを有する患者のあらかじめ吸収させた血清と共にろ過物をインキュベートし、３０分間で３回洗浄し、その後１！Ｊ−プロテインＡ（３００，０００ｃｐＩＩｌ／ｍｌ）を用いて、４５分間インキュベートした。最終的に、ろ過物を３回洗浄し、風乾させ、−夜（１２時間）照射の間、増強スクリーンを伴ったＸＲＰ−１フイルム上に置いた。血清の全ての洗浄および希釈を粉乳を用いて行った。陽性推定クローンを取り出し、プラーク精製■、＋３のため再スクリーニングした。

サブクローニング３つのクローンは、５０，０００クローンに約１つの頻度で陽性徴候を呈した。

これらの陽性クローンをプラーク精製した。これらのクローンの各々は、約１．４ｋｄの同一寸法の挿入物を生成した。

λ−、Ａａｐ３の挿入部位と一致する外来ＤＮＡの挿入部位を有する高複製プラスミド発現ベクターである、プラスミド・ベクターｐＢＴＡ２２４中で挿入物をサブクローニングした。従って、挿入物がλ−Ａａ＋ｐ３としての同様の解読わく内にあるため、サブクローンの５０％は、イムノアッセイにおいて陽性徴候を示す。ラット肝臓非関連のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｆ同種抗原）を発現するクローンを対照として使用した。ｐＢＴＡ２２４クローンの配列を作成して免疫反応性クローンを同定した。１６時間、３７℃でコロニ一群をインキュベートし、その後１０ｎ＋ＭＩＰＴＧを用いて４時間誘導した。コロニ一群を溶菌させ、文献記載１１のように抗体ブロービングを製造した。希釈率１／１０００のＰＢＣ吸収血清または希釈率１／１００の通常血清のいずれかを用いて、ろ過物をプローブした。さらに研究するために１６０ｋｄの融合ポリペプチドを発現したｐＲＭＩＴと称される１つの陽性クローンを選択した。

ミトコンドリアたんばくのイムノブロッティングひとの胎盤由来のミトコンドリアを文献記載２．１４のように製造した。０．１％ＳＤＳ内の１ｍｍ厚のスラブ・ゲル上で、３６８％スタッキング・ゲルおよび１０％分解ゲルを用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行った。ＰＡＧＥの前に、精製ミトコンドリアを４ｍｇたんば＜／ａｌｌの濃度で懸濁させてから、３０分間１Ｏ１０００Ｕのやぎ膵臓ＤＮＡアーゼ１を用いて、３７℃でインキュベートし、その後等量の水性３％オクチルグルコシドで１５分間４℃で保持した。最終生成物を４％ＳＤＳ、２０％グリセロールおよび５％の２−メルカプトエタノール（試料緩衝液）を含有するトリス−ＨＣＩ（ｐＨ６，８）を用いて希釈し、５分間煮沸させた。約１０μｇの１こんぼくを各ゲルレーン２に装填した。

ｐＲＭＩＴ融合ポリペプチドの特徴ｐＲＭＩＴが、ＰＢＣを持った患者由来の血清と特異的に抗原反応性を発現することを示すにめに、発現クローンの溶菌物を健常者由来または異なった自己免疫病にかかつている患者由来の血清を用いてプローブした。すなわち、ｐＲＭＩＴで形質転換させたＪＭＩ０１細胞の１００＋１の一夜培養物を１０ｍＶＩＰＴＧを含有するし一ブロスで１／１０に希釈した。４時間後培養物を５００ＸＧで１０分間遠心し、２０ｍ１のりん酸緩衝生理食塩水を加えた後冷凍した。

１ｍｍ厚の０．１％ＳＤＳ含有スラブ・ゲル上で、３．８％スタッキング・ゲルおよび７．５％分解ゲルを用いてＰＡＧＥを行った。上記試料緩衝液で試料を１／１００に希釈し、５分間煮沸した。各々のレーンは、約５から１０８ｇのたんばくを含有した。１／１０００に希釈したＰＢＣ血清を用いて試料をプローブし、反応性は、１１５■−プロティンＡおよび１８時間照射を使用して上述のように測定した。これらの同一血清も、弁組換え体対照クローンまたは無関係なりＮＡ挿入物によってコード化された融合ポリペプチドを発現するクローンの溶菌物のイムノプロットをプローブするのに使用した。使用した血清はＰＢＣ１全身性紅斑性狼癒、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、慢性活動性肝炎を有する患者および健常提供者由来のものであった。全ての対照血清を１／１００の希釈率で調査した。

融合ポリペプチドの同定ｐＲＭＩＴによって発現した融合ポリペプチドを特徴づけをして、ＰＢＣ血清によって認識されたミトコンドリア抗原があるかどうかを決定した。クローンｐＲＭＩＴを液体培地中で一夜生育させた。

それから対数期に入り、ｌＯＩＩＩＭ・Ｉ　ＰＴＧを用いて４時間融合したポリペプチドの最大発現物を付与するために誘導した。細菌溶菌物を上述のように製造し、臭化シアン−セファロース＋５と結合させた。その後この固体支持体を７つの異なったＰＢＣ血清由来の抗体を選択的に結合するアフィニティー試薬として使用した。最初、ＰＢＣを有する７人の患者由来の血清を、弁組換え体ｐＢＴＡ２２４で形質転換したエシェリヒア・コリの超音波処理物を用いて大量に吸収させた。その後、１／２００．１／２０００および１／２００００の希釈率の血清を固体支持体と結合したｐＲＭＩＴ形質転換細菌の溶菌物を通過させた。非吸収抗体を採取し、最終希釈時の非操作血清と比較して、上述のように製造した胎盤ミトコンドリアをプローブするのに使用した。

アフィニティー精製抗体の製造ＪＭＩＯＩの超音波処理物を用いて、弁組換え体ｐＢＴＡ２２４を用いて形質転換した５つの異なった反応性血清を最初に大量に前吸収させ、その後この吸収血清を、非相換え体ｐＢＴＡ　２２４　”を用いて形質転換させたＪＭＩＯＩのカラムを通すことで、アフィニティー精製抗体を製造した。ｐＲＭＩＴを用いて形質転換させた誘導ＪＭＩＯＩ細胞のカラムに各血清を通し、その後２４時間、カラムのベッド量の１００倍量でカラムを洗浄した。その後リジンＨＣ１を使用して結合抗体１５を溶出させた。分画した胎盤ミトコンドリア、ｐＲＭＩＴを発現している溶菌物、および対照の組換え体クローンの溶菌物に対してｐＲＭＩＴ吸収剤と結合した抗体をプローブさせた。またそれらをＨＥｐ−２細胞または肝臓組織切片のいずれかを用いた免疫蛍光法によって反応させた。

融合ポリペプチドとして発現したミトコンドリア抗原の単離ＳＤＳの存在下でゲルろ過を使用することによって融合ポリペプチドの単離を行って、不溶性ペレットを分画し、免疫化に適応する材料を得た。１０μｇ　／ｌａ　１アンピシリンを含有するし一ブロス中で、−夜、３７℃でｐＲＭＩＴのクローンをインキュベートした。８時間後対数期生長用に希釈し、１０ｍＭ−ＩＰＴＧを用いて４時間誘導した。その後エシェリヒア・コリ製品を５０００ｘＧで、１０分間回収し、ｌＯｍＭ）リス−ＭＣＩ（ｐＨ８，０）４０ｗｌ中で２ｍＭ−ＥＤＴＡを含有するペレットを再懸濁した。その後リゾチームを加えて最終濃度０　、２５ｍｇ／ｍｌにし、混合物を３０分間、室温で回転させた。溶液をさらに１０分間室温で混合を続けながらトリトンＸ−１００の０．２％までにした。２ｆｆ１Ｍ−ＥＤＴＡ、５０ｍＭＮａＣ１および１０ｍＭ−ＭｇＣ○、を有する等量の１０ｍＭトリス−ＭＣＩを、最終濃度２ｍｇ／ｍｌのＤＮＡエースと共に加えた。これを室温で１５分間回転させ、その後１５００ＸＧで５分間遠心した。ペレットを捨て、上滑を３０分間＋００００ＸＧで遠心した。２％ＳＤＳおよび１０ＩＩＩＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を有する０、１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６，０）でペレットを分散後、この最終ペレットを、セファクリルＳ−４００と直列に並べたセファクリルＳ−３００カラムで分画した。両分を５０ｍ１／時で溶出させて、６つの小画分を分析５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによる分析のために採集した。最終的に、０．５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６，８）および１ｍＭ・ＤＴＴを用いて希釈した後、ＳＤＳをヒドロキシアパタイトカラム上で取り除いた。上記のように５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって両分の純度を確認した。

マウスの免疫化完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中の１０μｇの精製融合ポリペプチドを用いて６匹のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌性マウスの群を免疫化した。３週間後、ＣＦＡ中の同一用量を用いて量を高めた。初期免疫化６週間後、マウスを採血し、血清を単離した。これらの血清をｌ／１０００の希釈率でアッセイし、アフィニティー精製１ｔＪ−やぎ抗マウスＩｇを使用する以外は上記のようにＰＡＧＥ −分離胎盤ミトコンドリアに対してプローブした。免疫蛍光法によって、上記１．１．５のようにＨＥｐ−２細胞の切片および肝臓組織切片を使用して血清を１／１００で調べた。

ヌクレオチドおよびアミノ酸配列１）ＲＭＩＴのｃＤＮＡ挿入物をＭ２Ｓ中にサブクローン化し、ヌクレオチド配列を決定１１１．１７シた。発現クローンの二重鎖シーケンシングによって挿入物の正確なフレームおよび配向を決定した１７゜両方の配向で配列を決定し、合成オリゴヌクレオチドをプライム反応′８に用いた。

固相酵素免疫測定法炭酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに希釈した精製組換え体融合ポリペプチドをイムロン１マイクロタイタープレート（グイナテック・ラボラトリーズ社、アレクサンドリア、バージニア）に−夜４℃で吸収させた。胎児仔牛血清（ＰＣＳ）緩衝液（ＰＢＳ中５％ＦＣＳＳ　１％ＢＳＡ、０．３％ゼラチン）を用いて非特異的部位を保護した後、ＦＣ８緩衝液で希釈したＰＢＣ血清を１時間インキュベートした。ＰＢＳｌｏ、１％ツインを用いてプレートを３回洗浄し、その後以下に示すひと長鎖イソタイプに対して特異的なマウスモノクローナル抗体の各々を用いてインキュベートした。ＩｇＧ１に対する５Ｇ−１１，１ｇＧ２に対するＧＯＭ−１％　ＩｇＧ３に対する５Ｊ−３３、ＩｇＧ４に対する５Ｋ−４４、ＩｇＭに対するＭＢ−１１，ＩｇＡに対するＧＡ−１Ｃマイルズ・サアイエンティフィック社、ネイパービル、イリノイ）。マウスＭｏＡｂｓの結合を、ペルオキシダーゼ結合やぎ抗マウスＩｇＭ（ティゴ社、バーリンガム、カリフォルニア）を用いて検出される５ｌ−３３を除く全てのペルオキシダーゼ結合やぎ抗体マウスＩｇＧ（テイゴ社、バーリンガム、カリフォルニア）を用いて検出した。ＡＢＴＳをペルオキシダーゼの色の基質として使用した。全てのイソタイプのＡＭＡの検出のために、ＨＲＰ−ＧＨｕｌｇをイソタイプの特異的モノクローナルの代わりに使用した。

ひと骨髄腫蛋白を使用して最適の希釈のイソタイプの特異的ＭＯＡｂｓを得た。

骨髄腫蛋白の予じめ定めた希釈物をミクロタイタープレートの上に被覆し、イソタイプ特異的ＭｏＡｂｓの連続希釈物、ついでペルオキシダーゼ結合試薬によって、前述のように固相酵素免疫測定法を行った。はぼ同等の血清イソタイプ濃度で同様のＯ，Ｄ。

単位を示すイソタイプ特異的ＭｏＡｂｓの希釈物を酵素結合イムノ吸着アッセイに使用した。

スクリーニングのための最適な血清希釈物を得るために、最初にスクリーンした（免疫蛍光法により）ＡＭＡ陽性ＰＢＣ１進行性軟骨炎および正常血清を固相酵素免疫測定法によって力価測定した。血清希釈率１：１０００がノイズ比に対して最も高い信号を生じることが分り、この希釈率を使用して全ての結果を得た。

陰性の切捨点を正常血清の平均０．Ｄ、上の２標準偏差として決定した。

Ｂ、結果ＢＴＡ２２４中のｐＲＭＩＴの配列ＰＢＣを有する患者由来の血清を用いてプローブした際、Ｊ　Ｍ　１０１中のｐＲＭＩＴのサブクローンは非常に免疫反応性があったが、対照クローンは非反応性であった。対照的に正常提供者由来の血清は、ＪＭＩＯＩ中のｐＲＭＩＴにもまｆこは対照クローンにも反応しなかった。アレイ由来の陽性コロニーを全ての後の研究に使用した。

ｐＲＭＩＴ融合ポリペプチドの特異性ＰＢＣを有する患者２５名中２５名からの１／１０００の希釈率の血清は、ｐＲＭＩＴ内で作られた１６０ｋｄの融合ポリペプチドと反応した（第１表および第１図）。このバンドはβ−ガラクトシダーゼに対するうざぎ抗血清とも反応した（データは示さず）。約３６ｋｄの血清を含め、明らかに１６０ｋｄの破砕生成物である低分子量の成分に対応する多くのバンドが認められた。これらの低分子量材料はｐＲＭＩＴのみにあり、ＰＢＣ血清に免疫反応性があった。これら２５の血清の反応性の力価は、１：１．ＯｏｏからＩ：１，０００，０００の範囲であった。同じ２５の血清の使用によって、非相換え体ｐＢＴＡ２２４によって生成された細菌または不適切な挿入物で形質転換し、種々の融合ポリペプチドの発現を誘導した細菌の溶菌物にはこの融合ポリペプチドは検出されなかった。全身性紅斑性狼癒、慢性関節リウマチまたは慢性活動性肝炎を有する患者由来の血清は、１／１００の希釈率で融合蛋白と反応し、４日までのオートラジオグラフ露出でら反応した。

第１表　ｐＲＭＩＴ融合ポリペプチドを用いたひと血清の反応性ＰＢＣ２５／２５正常人　０／２５全身性紅斑性狼癒　０／２１慢性関節リウマチ　０／１８慢性活動性肝炎　Ｏ／３２ａ：　ＰＢＣ血清を１／１０００血清希釈で調査し、他の群を１／１００血清希釈で調査した。

ｂ＝　陽性プロットは１２時間オートラジオグラフ露出レベルで、１６０ｋｄのバンドに対する反応性が直ちに明らかとなるプロットである。第１図参照。

融合ポリペプチドの同定ｐＲＭＩＴの溶菌物で吸収後、ＰＢＣを有する７人の患者全てからの血清が、７０ｋｄ抗原に反応性を有する抗体を奪われたことを示した（第１Ｉ表）。反射熱に、上記吸収は４５ｋｄまたは３９ｋｄ抗原に対する反応性を変化しない。上記奪取は、固体支持体に結合した対照クローンの溶菌物にＰＢＣ血清が吸収される際には見られない。

ｐＲＭＩＴ融合ポリペプチドとＰＢＣ血清の反応が、検出可能な抗７０ｋｄ反応性を取り除くことの発見は、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが７０ｋｄ抗原に対する自己抗体によって認識される全決定基を暗号化することを示している（第１Ｉ表、第２図）。

アフィニティー精製抗体５つの異なるＰＢＣ血清の溶出抗体は、分画された胎盤ミトコンドリアの７０ｋｄポリペプチドと反応し、ｐＲＭＩＴ中の１６０ｋｄの融合ポリペプチドと反応しく第３図）、更にｐＲＭＩＴが７０ｋｄ抗原を暗号化することを示している。

溶出抗体は、対照肝臓ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを　。

発現するクローン由来の細菌たん白の溶菌物とは反応しなかった。

溶出抗体は、ＨＥｐ−２細胞またはじん臓組織切片を用い、免疫蛍光法によって染色する抗ミトコンドリアの特異的パターンも付与した。

マウスの免疫応答ｐＲＭＩＴ融合ポリペプチドの注入後、ＢＡＬＢマウスは７０ｋｄ胎盤ミトコンドリアたん白に応答する抗体を生成した。対照非免疫化マウス血清は非反応性であった（第４図）。更に、これらの血清は、ＨＥｐ−２細胞およびじん臓組織切片の両方での抗ミトコンドリア免疫蛍光法の典型的パターンを生じた（第５図）。

ヌクレオチドおよびアミノ酸配列挿入物は、ｌ３７０の塩基対長で、全てのコード化領域から成る（第６図）。４５６のアミノ酸は、クローンによって生成された融合ポリペプチドの観察寸法と一致する約４８ｋｄのポリペプチドをコード化する。従って、全長の配列の抗原ではない。配列は、１１％プロリンを含有し、プロリンは例えば５４から１０２のヌクレオチドにみられるように、しばしばアラニンおよびバリンのような疎水性アミノ酸の短鎖によって先行されることが分かった。７０ｋｄミトコンドリア自己抗原の配列および公知たん白とＤＮＡ配列の比較は、よく一致する配列をなんら示さなかった。配列は、ミトコンドリアＤＮＡ中には存在しなく（データは示さず）、従って７０ｋｄたん白は核遺伝子によってコード化されている。

固相酵素免疫測定法の感受性を、ＰＢＣを有する３７名の患者に対する免疫蛍光法と比較した（第７図）。固相酵素免疫測定法は約２５０倍以上の感度であることが分かった。固相酵素免疫測定法によりて検出した平均力価は、１０’、’であるが、免疫蛍光法によると、僅か１０３であった。

第■表：　ｐＲＭＩＴ融合ポリペプチドを有するＰＢＣ血清の吸収たん白　吸着前方価　吸着後方価７０ｋｄ　４５ｋｄ　３９ｋｄ　７０ｋｄ　４５ｋｄ　３９ｋｄ１　１：２．Ｇｏｏ　１：２，０００　０　０　１：２，０００　０２　＞Ｌ：２０．ＱＱＯＬ：２（１，（ＩＱＱ　ＯＬ：２Ｇ（ｌ　ｌ：２．（１（１０（１３＞１：２０，０００　＞１：２０，０００　１：２，０００　１：２００　＞１：２０，０００　１：２．Ｇｏ。

４　１：２，０００　１：２００　０　０　１：２００　。

５　＞１：２０，０００　＞１：２０，０００　１：２，０００　１：２００　＞１：２０，０００　１：２，０００６　１：２．０００　０　０　０　０　０７　＞１：２０．Ｇｏｏ　１：２，０００　０　０　１：２，０００　０ａ：　既報胎盤ミトコンドリアを使用するイムノプロット上での反応性。対照溶菌物での吸収は力価に影響を与えない。

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１３、Ｈ，Ｄ、Ｘタール、Ｒ，Ｌ、ニアペル、Ｇ、Ｖ、ブラウン、Ｒ，セント、Ｋ。リンゲルバブハ、Ａ、Ｐ、カラマン、Ｒ，Ｆ、アンダースおよびり、Ｊ、ケンプ、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスエイ　第８１巻、第２４５６頁（１９８４年）。

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２１、Ｓ、アンダーリン、Ａ、Ｔ、バンガー、Ｂ、Ｇ、ノ（レル、Ｍ、！（。

Ｌ、デブルイン、Ａ、Ｒ，クールラン１．■、ドローウイン、［、Ｃ，エフ（− リン、Ｄ、Ｐ、ニアリツヒ、Ｂ、Ａ、ロー、Ｆ、サンガー、Ｐ、Ｈ，シュライア −１Ａ、Ｊ、Ｈスミス、Ｒスターデンおよび１．Ｇ、ヤング、ネイチャー　第２９０巻、第４５７頁（１９８１年）。

２２、Ｓ、アンダーリン、Ｍ　、　Ｈ、デブルイン、Ａ、Ａ、クールリン、Ｉ　、Ｃ，エパーソン、Ｆ、サンガーおよびＩ　、Ｃ，ヤング、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー　第１５６巻、第６８３頁（１９８２年）。

２３、Ｐ、Ａ、バーブおよびＨ，ボーム、セミナー・イン・イムツバソロジー　第３巻、第３５５〜３７３頁（１９８０年）。

２４、Ｒ，フレイン、Ｊ、リンデンボーンおよびＰ、Ａ、バーブ、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド　第６４巻、第２２７〜２３８頁（１９８３年）。

２５、に、ミャチ、Ｒ，Ｃ，グプタ、Ｅ、Ｒ，ディックリンおよびＥ。

Ｍ、タン、クリニカル・アンド・イクスペリメンタル・イムノロジー、第３９巻、第５９９〜６０６頁（１９８０年）。

２６、Ｌ、Ｅ、ムノツ、Ｈ，Ｃ，）−マス、Ｐ、Ｊ、シャーシー、Ｄ。

ドニアシコ、Ｓ、シャーロック、ダート　第１３６〜１４０頁（１９８１年）。

２７、Ｂ、Ｇ、タール、Ｓ、Ｗ、シャルム、Ｆ、Ｗ、Ｊ、ケン・ケイト、Ｊ、バーマン、Ｒ，Ｇ、ギールツエンお上びＢ−Ｅ、Ｗ、フエルトカンプ、ヘパトーガストロエンテロロジー　第３０巻、第１７８〜１８２頁（１９８４年）。

２８、Ｓ、エリクソンおよびＳ、リングレン、スカンジナビアン・ジャーナル・オブガストロエンテロロジー、第１９巻、第９７１〜９７６頁（１９８４年）。

２９．Ｐ、Ａ、バーブ、Ｋ、Ｈ，ウィードマン、Ｔ、セイヤース、Ｇ。

クロベルおよびＨ，リンドナー、ランセット　第１巻、第１３２９頁（１９８０年）。

３０、Ｐ、ウニバー、Ｊ、ブレンナー、Ｅ、シェケメッサー、Ｒ，フレイン、Ｕ、ウエツケンマン、Ｇ、クロペル、Ｍ、キルヒホフ、■、フィンチルマンおよびＰ、Ａ、バーブ、ヘパトロジー　第６巻、第５５３頁（１９８６年）。

３１、Ｖ、モデナ、Ｃ，マレンゴー、Ａ、アモロソ、Ｆ、ロジナ、Ｐ。

コスタンティニ、Ｐ、ベランド、Ｒ，コツホおよびＭ２リッツエト、クリニカル・アンド・インスベリメンタル・リュマトロジー、第４巻、第１２９頁（１９８６年）。

３２、Ｆ、ウデーンフェルトおよびＡ、ダニエルラン、アナルズ・オブ・クリニカル・リサーチ　第１８巻、第１４８頁（１９８６年）。

３３、Ｈ，−Ｐ、シュルテイス、Ｐ、Ａ、バーブおよびＭ、クリンゲンベルグ、クリニカル・アンド・インスペリメンタル・イムノロジー　第５８巻、第５９６頁（１９８４年）。

３４、Ｓ、Ｐ、ジェイムズ、Ｊ、Ｈ，７−７ネイグル、Ｗ、ス）ｏ−バーお上びＥ、Ａ、ジョーンズ、アナルズ・オブ・インターナル・メディシン　第９９巻、第５００頁（１９８３年）。

３５、Ｔ、ナミヒサ、Ｈ，クロノおよびＨ、イマナリ、ジャパニーズ・ソサイエティ・オブ・ガストロエンテロロジー　第１８巻、第４４５頁（１９８３年）。

３６、Ｊ、Ｊ、パン・デン・オール、Ｊ、フエバリー、Ｊ、デ・グルーテおよびＶ、Ｊ、デスメ、リバー　第４巻、第２６４頁（１９８４年）。

３７、Ｍ、シミズ、Ｋ、コラ、Ｓ、アオヤマ、■、イチハラ、Ｈ，ワタナベ、Ｈ，シロおよびＭ、オフムラ、リバー　第６巻、第１頁（１９８６年）。

３８、Ｍ、１．アビガン、Ｇ、アダムソン、Ｊ、Ｈ，フーフネイグルおよびＥ、Ａ、ジョーンズ、ヘパトロジー　第６巻、第９９９頁（１９８６年）。

３９、Ｒ，Ｈ，フェンネル、パソロジー・アニュアル　第１６巻（Ｐｔ、２）、第２８９頁（１９８１年）。

４０、Ｊ、ニューバーガー、Ｂ、ポートマン、Ｂ、Ｒ，Ｄ、マクドーガル、Ｒ，Ｙ、カルシおよびＲ，ウィリアムス、二ニー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン　第３０６巻、第１頁（１９８２年）。

４１、Ｈ，Ｈ，ハンドレイ、Ｍ、Ｃ，グラッシー、Ｐ、Ｈ，クレベランドおよび ■、クロスタン、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド　第５４巻、第２９１〜２９８頁（１９８２年）。

４２、Ｒ，Ａ、マクドナルド、Ｃ，Ｓ、ホスキングおよびＣ，Ｌ、ジョーンズ、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド、１９８７年出版。

Ｂ　ＣＤ −一〇− Ａ　Ｂ　ＣＡＢＣＤＦＩＧ、２゜ＢＦ／ｃ；、４゜Ｆ／Ｇ、６σ ＦＩ６．６ｄ。

Ｆ／Ｇ、Ｚ／ｊ″／ｃ、８ａＦｔａ、　８ｂ− 国際調査報告Ｉ＋ψ明−リ’　””””””　ＰＣＴ／ＡＵ　８７１０Ｃ４２７１両横Ｎ１− ＩＩ＋１−＾帥Ｉ―τ沖ＩＮ・　ＰＣＴ／ＡＵ　８７１００４２７

Claims

【特許請求の範囲】

１．原発性胆汁肝硬変（ＰＢＣ）の７０ｋｄミトコンドリア自己抗原またはその抗原活性を有するフラグメントを暗号化している塩基配列の全部または一部に実質的に対応するヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
２．少なくとも、実質的に第６図もしくは第８図に示された塩基配列またはそのフラグメントを含む部分によって特徴づけられた、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
３．少なくとも、実質的に第６図に示されたヌクレオチド７６−６７９に対応する塩基配列を含む部分によって特徴づけられた、請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子。
４．少なくとも、アミノ酸配列【配列があります】を暗号化している塩基を含む部分によって特徴づけられた、請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子。
５．発現調節配列に機能し得るように結合した請求の範囲第１−４項の何れかに記載のヌクレオチド配列を含む、組換え体ＤＮＡ分子。
６．発現調節配列に機能し得るように結合した請求の範囲第１−４項の何れかに記載のヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
７．発現調節配列に機能し得るように結合した請求の範囲第１−４項の何れかに記載のヌクレオチド配列を含む、形質転換した宿主細胞。
８．原発性胆汁肝硬変（ＰＢＣ）の７０ｋｄミトコンドリア自己抗原またはその抗原活性を有するフラグメントの全部または一部の抗原性を表示する合成ペプチドまたはポリペプチド。
９．少なくとも、実質的に第６図もしくは第８図に示されたアミノ酸配列またはその抗原活性を有するフラグメントを含む部分によって特徴づけられた、請求の範囲第８項記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。
１０．少なくとも、実質的に第６図示されたヌクレオチド７６−６７９によって暗号化されたアミノ酸配列を含む部分によって特徴づげられた、請求の範囲第９項記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。
１１．少なくとも、アミノ酸配列【配列があります】を含む部分によって特徴づけられた、請求の範囲第９項記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。
１２．請求の範囲第５項記載の形質転換した宿主細胞を適当な条件下で培養し、発現されたペプチドまたはポリペプチドを分離精製することを含む、請求の範囲第８項記載の合成ペプチドまたはポリペプチドの製造法。
１３．診断試験における抗原としての、請求の範囲第８−１１項の何れかに記載の合成ペプチドまたはポリペプチドの使用。
１４．患者の処置における、請求の範囲第８−１１項の何れかに記載の合成ペプチドまたはポリペプチドの使用。
１５．血清試料中の抗ミトコンドリア抗体検出のための診断試験であって、（ｉ）上記血清試料を、ＰＢＣの７０ｋｄミトコンドリア自己抗原またはその抗原活性を有するフラグメントの全部または一部の抗原性を表示する合成ペプチドまたはポリペプチドと接触させ、上記合成ペプチドまたはポリペプチドは支持体上に固定されているものとし、（ｉｉ）上記合成ペプチドまたはポリペプチドに結合した上記血清中の抗ミトコンドリア抗体の存在を検出する工程を含む試験。
１６．血清試料中の抗ミトコンドリア抗体の検出のための診断試験用キットであって、（ｉ）ＰＢＣの７０ｋｄミトコンドリア自己抗原またはその抗原活性を有するフラグメントの全部または一部の抗原性を表示する合成ペプチドまたはポリペプチドがその上に固定されている支持体および（ｉｉ）上記合成ペプチドまたはポリペプチドに結合した上記血清中の抗ミトコンドリア抗体の存在を検出する手段を含むキット。