JPH04504355A - ハイブリッド種子生産の分子的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ハイブリッド種子生産の分子的方法 技術分野 本発明は、雄性不稔性植物類およびハイブリッド種子の生産方法、雄性不稔性形 質を付与するために使用される遺伝材１４および前記方法によって生産される新 規産物類、すなわち、雄性不稔性形質を保持する遺伝的形質転換植物類、ｔｌｉ 付不稔性両性類、および前記植物を雄性両性植物類からの花粉で受粉することに よって生産されたハイブリッド種子に関する。 ！東技街 市販用ハイブリッド種子の生産は、大規模産業である。ハイブリッド種子から生 長したハイブリッド植物類は、２つの遺伝的に明確に異なる育種系統を交雑させ ることによるペテロ効果の恩恵を受ける。この子孫の農学的挙動は、双方の親よ りも特に丈夫さ、収率および均一性において優れている。放任受粉品種に比較し た場合のハイブリッド種子品種の優れた挙動は、農作業者が栽培する際にハイブ リッド種子をより魅力的なものとしており、それによって、市場では高価格が約 束される。 自家受粉種子によって汚染されていないハイブリッド種子を生産するためには、 他家受粉および非自家受粉を確保するために受粉コントロール手段を課さな（プ ればならない。受粉制御機構は、機械的、化学的または遺伝的であることができ る。 ハイブリッド種子生産のための単純な機械的方法は、もし問題の植物種子が空間 的に分離された雄花および雌花であるかまたは分離された離水および襲来である ならば、使用できる。例えば、トウモロコシは、この植物の頂端の花序において 花粉産生性の雄花を付け、かつ茎に沿った葉の葉えきに雌花を付ける。自家受粉 を避けるために、機械的に芝性植物の房を取り除くことによって、他家交雑を確 実とする。 しかし、間層の主な栽培作物のほとんどは、同一の花の中に機能的に雄性のおよ び雌性の器官を双方とも有しており、従って、除雄は単純な操作ではない。花粉 が落ちる前に花粉形成器官を手で除去することも可能であるが、しカルこの０懇 のハイブリッド種子生産は極めて手間かがかり、したがって、高価格となる。 種子は、もし回収された種子の価値および量がそれだけの手間に相当するならば このようにして生産される。 ハイブリッド種子を生産する第２の一般的方法は、活動中の花粉形成を停止させ るかまたは阻害する化学物質類を使用することである。これらの化学物質類はガ メトサイド（ｇａｍｅｔｏｃ　１ｄｅ）ｔＪ［と命名されており、一過性の雄性 不稔性を付与するために使用される。ガントサイド類の使用によるハイブリッド 種子の商業的生産は、この化学物質類の価格および入手可能性、およびその適用 による作用の信頼性および長さによって制限されている。これらの化学物質類は 、影響を受けないであろう新たな花が付くので、長い開花期間を有する作物に対 してば効果がない。化学物質類を繰り返して適用することは、コストがら見て実 用的ではない。 野処作物のために現在商業的に行われている多くのハイブリッド種子生産システ ムは、遺伝的受粉コントロール方法に依存している。雌性として使用される植物 類は、花粉を作ることができないが、花粉を落とすことができないがまたは自家 授精を生化学的に行うことができない花粉を作るかのいずれかである。（種々の 異なる手段によっても）自家受粉ができない植物類は、自家不和合性と命名され ている。自家不和合性の使用にＭＡした困難なこととして、自家不和合性難性系 統の入手可能性および繁Ｎ性、および自家不和合性の安定性が挙げられる。いく つかの例では、自家不和合性は化学的に克服できるか、あるいは、花粉を阻害す る生化学的４ｉｉ横が活性化される前に未成熟芽を手で受粉させることができる 。 不活化できる自己不和合性システムは、しばしば、自家受粉に対する生化学的阻 害の有効性を破壊または低下させるストレスに満ちた気象条件に対して極めても ろい。 商業的種子生産にとってより広範囲の問題であるのは、！！性不稔性を惹起する 遺伝ｍｔｓに基づく花粉制御システムである。これらのシステムには、２つの一 般的型があり、（ａ）　ｌａｔ以上の核遺伝子の為に花粉形成不可である接離性 不稔性または（ｂ）細胞質器官（ミトコンドリア〕における欠陥の故に花粉形成 が阻害されているかまたは放棄されている細胞質−遺伝雄性不稔性（通常、細胞 質雄性不稔性またはＩｓといわれている）。 核（ｇ、ｅｎｉｃ）不稔性は優性であるがまたは劣性であるかのいずれかである ことができる。優性不稔性は、もしハイブリッド植物類の徳性が重大ではなくか つもし罵性系統の繁殖が可能であれば（例えばクローン繁殖または不稔性遺伝子 に強く連結した選択的マーカーの使用によって）、ハイブリッド種子生産のため に使用できるに過ぎない。 多くの成果を納めているハイブリダイゼーション法は、ＣＭＳの使用に関連して いる。これらのシステムでは、細胞質に局在するミトコンドリア内における特殊 な変異が適切な核背景におかれたときに、成熟花粉形成不可をもたらす。他のい くつかの例では、核背景が細胞質変異を補償できそして正常な花粉形成が起こる 。植物内においてＣＭＳミトコンドリアによって花粉を形成させる核形質は。 復旧といわれており、そして特定の”復旧遺伝子類”の性質である。一般に、商 業的種子生産のためのＣＭＳの使用には、３種の育種系統、雄性不稔性系！（Ｍ 親）、前記雄性不稔性系統と同質核であるが機能的ミトコンドリアを十分に含有 している保持系統および雄性親系統の使用を伴っている。 雄性親系統は特定の復旧遺伝子類を保有することができ（通常復旧系統といわれ る）、次にこれはハイブリッド種子に対して徳性を付与する。前記ハイブリッド からの種子回収が重要でない作物（例えば野菜類）に対しては、ＣＭＳシステム は復旧がなくても使用できるであろう。ハイブリッドの果実また（よ種子が商業 的産物である作物に対しては、ハイブリッド種子の徳性は雄性親の特殊な復旧遺 伝子類によって復旧されねばならないか、または、ｉａ性不稔性ハイブリッドが 受粉されなければならない。非復旧ハイブリッド類の受粉は、ハイブリッド類と ともに低パーセントの雄性両性植物類を含むことにより受粉させることによって 、達成できる。はとんどの種において、このＣＭＳ形質は母系的に遺伝され（全 ての細胞質器官は卵細胞からのみ遺伝されるので）、このことは本システムの使 用を制限できる。 本文で特に問題となっている１作物、一般にセイヨウアブラナ（Ｃａｎｏｌａ） と言われている禮　−？　″　Ｂｒａｓｓｉｃａ一旦立２旦１）またはス之之左 二カクベ　＋　Ｂｒａｓｓｊｃ鉦−立１皿」ｅｓｔｒｉｓ）の脂肪検子作物にお いて、今日まで商業的なハイブリッドシステムは完成されていない。 いかなる規模においても、花を機械的に除雄することは、ハイブリッド種子生産 のために実用的ではない。現、右利用できるガントサイド類を使用することは、 花生産が確定的でない性質であることから非実月的である。化学物質類を繰り返 し適用することは高価格となり、かつ、この方法は自家受粉種子による汚染を受 け易い。 自家不和合性を結果としてもたらす遺伝子は、−ゝ　ｒ　°　）種において極め て広く分布しており、そして、自家不和合性ハイブリッド系は、野菜におけるハ イブリッド種子生産のために使用されてきた。大きな問題は、雄性系列の繁殖お よびストレスに満ちた条件下における自家不和合性の破壊に間違している。これ らの系の　−８Ｂｒａｓｓｉｃａ）脂肪種子に対する適応は、雄性系列増加の費 用および適当な自家不和合性遺伝子類の優性ユＬユニΩ且ユ旦！且）種・　−８ °　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａ　ｕｓ）の入手可能性によって制限されている。 種々の雄性不稔性源が　−ｓ　Ｂｒａｓｓｉｃａ）種において入手可能である。 劣性および優性遺伝系の双方が報告されているが、しかし、それらの使用は、雌 性系統の大規模乙２旦玉旦繁殖または間引きがほとんどの場合において大規模種 子生産のためには非実用的であることから、制限されている。 さらに、いくつかのＣＭＳ系が　′″Ｓ　Ｂｒａｓｓｉｃａ）種において研究さ れてきた。これらの系の内４種、ｐｏｐ、、ｎａｐ、ａｎａｎｄおよびｏｇｕが ハイブリッド種子生産のための可能な遺伝運搬系として探索された。ポリマ（Ｐ ｏｌｉｍａ）系（ｐｏｌ）は広く使用されてきており、商業的使用に最も近い。 ｐｏｌ　ＣＭＳの良好な復旧および保持が達成されたが、しかし、本系は高温に よるＣＭＳの潜在的不安定性、異なる系列を交雑するペテロ効果（欠損性ミトコ ンドリアのため）の低下およびハイブリッド種子脂肪含量の低下によって障害さ れる。その他のＣＭＳ系の使用は、同様に、熱感受性（ｎａｐ３　、徳性の復旧 困＠　（ｏｇｕ、ａｎａｎｄ）、不稔性の維持における困ｉｔ！　（ｎａｐ）お よび不稔性遺伝子に関連した低温追録の制限を受ける。これらの系の改良は実質 的研究の対象であるが、ｘ系のどれもがその用途を限定する固有の弱点をいくつ か有していいかなる作物においてもハイブリッド種子生産のための理想的系は、 難性系統のｙＸ殖または増加のための雄性稔性を可能とするためまた）よハイブ リッド類における徳性を許容するため制御されるかまたは克服されることができ る接離性不稔性の形態であろう。この認識は、ハイブリッド種子形成のために使 用可能な咳払性不稔性を実行する分子システムの使用に関する研究を刺激した。 さらイユ異なる種間の遺伝的交換の限定的性的方法によっては可能ではない組換 えＤＮＡ方法論を有利にかつ広く応用することによって、非常にさまざまな異な る作＃Ｊ櫂へ新規Ｄ　Ｎ　Ａ　＆列類を導入する機構が得られる。この分子的手 法は、ハイブリダイゼーションシステムが、広範囲の戻し交雑育種法および確立 された通交系統の破壊を要せずして、いかなる品種改良系またはいかなる一定の 作物の栽培変種植物にも課すことができるという利点を有しており、それによっ て、十分：こ形質解析されかつ優れた農業上の特性を有する雄性不稔性系列が迅 速に生産される。 分子手法の開発は、小胞子内部で機能的花粉の生産のためまたは小胞子を支える あらゆる体細胞の発生のために特に必要ないくつかの発生段階の全てを破壊する ことに基づいている。 ！１辺翌丞 本文で特許請求した本発明の目的は、植物において接離性不稔性をもたらす方法 を提供することである。また、本文に特許請求したように本発明の目的は、雄性 稔性であるハイブリッド種子を含めてハイブリッド種子の生産に容易に適応でき る接離性不稔性をもたらす方法を提供することである。 野菜のような問題の作物類に付いて、商業的に販売されるのは、葉、茎類または 接層のみである。したがって、雄性不稔性形質がハイブリッド植物に遺伝されか つ発現可能であるにしても、ハイブリッド植物の種子において雄性稔性を克服ま たは復旧することは必要ではない。しかし、他の作物類に付いて、商業的産物は 、ハイブリッド植物によって生産された種子または果物である。したがって、ハ イブリッドの最適商業的用途のためには、このハイブリッドは自家授精であるさ らに、核５性不稔惇植物類の商業的種子生産のための使用は、接離性不稔性系統 の種子の増加（ｌ；Ｔ４繁に維持と言われる）を必要とする。不発明はこの要件 を検討している。 我々は、雄性不稔性植物または雄性不稔性形質を保有する植物に付いて、前記植 物のゲノム甲に、選択的に機能性花粉粒子類の産生を阻害するかまたは発生過程 中の粒子を化学薬剤または生理的ストレスに感受性とする花粉をターゲットとす る組換えＤＮＡ分子を組み込むことｉこよって、雄性不稔性形質を保有している 植物を生産する方法を提供する。不文で使用の花粉をターゲットとする組換え分 子は、花粉そのものを含めて花粉形成および機能に重大な組織中において選択的 に発現される組換えＤＮＡ分子である。 花粉形成または機能１こ重大である組織類として、また、フィラメント、花序お よび１壁の仄うな小胞子生長および発生または小胞子機能に関連した組織が挙げ られるが、それらに限定されるわけではない。 下記の述べる本発明の種々の面に従って、花粉をターゲットとする組換えＤＮＡ 分子は、選択的に機能性花粉粒子類の生産を阻害するかまたは発生過程中の両法 で使用することができる。 （１）花粉形成または機能に重大な遺伝子を、花粉形成または機能に重大な組織 の生長、発生または機能を選択的に距害する遺伝子すなわちアンチセンス遺伝子 を用いて阻害すること、 （２）細胞に必須の構成的遺伝子に対するアンチセンス遺伝子発現を制御する花 粉ターゲットプロモータ、すなわち花粉そのものを含めて花粉形成および機能に 重大である組織における遺伝子の発現を選択的に制御するプロモータを使用する こと、 （３）細胞毒性の分子または非毒性分子を細胞毒性にする分子をコードする遺伝 子の発現を制御する花粉ターゲットプロモータを用いること。 我々は、前記雄性不稔性植物を適切な雄性稔性植物で受粉することによってハイ ブリッド種子を生産する方法を提供する。 我々は、また、前記植物を適切な雄性稔性植物と受粉させることによって前記雄 性不稔性形質が発現される時点において、この雄性不稔性形質を保有すル１７１ 　記植物を受粉させることによって、ハイブリッド種子を産生ずる方法を提供す る。 我々は、また、上記のように（害された遺伝子機能を補償すること、または花粉 形成または機能に重大な組織に引き起こされた破壊を無効とすることによって徳 性ハイブリッド種子を産生ずる方法を提供する。 我々は、また、特定の復旧方法を必要としないハイブリッド種子生産の方法を詳 しく述べる。 特に、遺伝的に形質転換されたＭ性親植物を適切な雄性稔性雄性親植物と交雑す ることによって、ハイブリッド種子を生産する方法を提供することが本発明の目 的であり、前記遺伝的に形質転換されセンスまたはアンチセンス遺伝子からなる 組換えＤＮＡ配列を含有する難性親植物は、発現されたときに、花粉形成または 機能に重大な組織産生を阻害するかまたは前記組織を前記組織の機能を阻害する 化学薬剤または生理的ストレスに感受性とし、前記適切な雄性稔性雄性親植物は 必要な時に１害された遺伝子機能を補償するかまたは前記遺伝的に形質転換変換 された雄性栽植物甲において花粉形成または機能に重大な組織

【こ惹起された破 壊を無効とする組換えＤＮＡ配列を含有する。 本発明のひとつの側面によれば、接離性稔性は、センス遺伝子によってコードさ れたＲＮＡと相補性でありハイブリダイズでき、それによってこのセンス遺伝子 の発現を阻害するＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子（″アンチセンス遺伝子 ”）によって、分化した植物個体に再生可能な植物細胞を形質転換することで得 られる。 このセンス遺伝子は、花粉形成または機能に重大な組織中において発現される遺 伝子であるかまたは花粉形成または機能に重大な組織を含めて種々の組織の適切 な発生または機能に必要な遺伝子である。もしこのセンス遺伝子が花粉形成また は機能に重大な組繊内においてのみ発現されるならば、その時には、花粉形成ま たは機能にとって重大な組織を含めて全ての細胞、多くの細胞または種々の細胞 型において機能するプロモーターがアンチでンス遺伝子の構築のために使用でき る。このような構成的プロモーターの例として、Ｃａ＞４Ｖ３５Ｓ、または下記 に記載のように我々が１立之左二丈ブス」Ｂｒａξｉよ工１−ユＪ」曳ｓ−）カ ラ単離し特性解析したＨＰＩＯＩが挙げられる。この型の構築体において使用さ れるプロモータは、全ての細胞型または多くの細胞型において構成的に活性であ るが、しかし、花粉形成または機能に重大な組織が問題のセンス遺伝子ＲＮＡ産 生性の唯一の細胞であるので、花粉発生または機能を阻害するだけである。下記 にも記載したように、花粉特異的プロモータならびに誘導性プロモータを使用す ることも可能である。 これとは別に、もしセンス遺伝子が花粉形成または機能に重大な組織を含め全て の細胞または種々の細胞の発生または機能に必要な遺伝子であるならば、その時 には、アンチセンス遺伝子を発現するために使用されるプロモータは、花粉形成 または機能にとって重大な組織においてのみ活性であるプロモータでなければな らない。 このアンチセンス遺伝子は、センス遺伝子が転写のためにその正常形態に関して 逆転しておりかつプロモータの下流に挿入された時に産生されるＤＮＡ配列であ る。このアンチセンス遺伝子がセンス遺伝子によって産生されたＲＮＡに相補性 でありかつこのＲＮＡの翻訳を阻害できるＲＮＡに転写されることができるとい う条件を満たすならば、それは、いくつかの異なる方法で構築される。センス遺 伝子発現を制御するためには、制御しようとしているセンス遺伝子に対して全体 としてまたは実質的部分で相補性であるアンチセンス遺伝子を産生ずるだけで十 分であることがわかる。 このアンチセンス遺伝子は、センス遺伝子のコード領域をその正常形態に対して 転写に関して逆転して３つ、その相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の転写すなわ ちこれらのＤＮＡｆｉによってコードされたそれぞれのＲＮＡが相補性を示すよ うに、好適に構築される。センス遺伝子によって産生されたｍＲＮＡの産生を阻 害するためには、アンチセンス遺伝子発現の時期は、このアンチセンスＲＮＡが 問題のセンス遺伝子からの前記ｍ　ＲＮ　Ａと同時期に存在していなければなら ないという点において適切でなければならない。センスおよびアンチセンス遺伝 子類の同時発現は、構成的、誘導的および器官特異的プロモータ閏の組み合わせ を用いることによって種々の方法で達成することもできるが、アンチセンス遺伝 子の発現をセンス遺伝子を制御するのと同一のプロモータで制御することによっ て容易ニ達成することができ、それによって両者が司一時間枠で転写されること ：：なる。アンチセンス遺伝子類を用いて遺伝子発現を制御するという概念は、 Ｗ６ｉｎ、ｔｒａｕｂ、Ｈ，ら、Ｗ　た　−Ｅ二　・　′・　ＲＮＡＡｎｔｉｓ ｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｒｎｏｉｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｒ　ｎ　ｉ 　ＬＬ影１呈）、遺伝学の動向に関するレビュー（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄ ｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｗ、１　（１）１９８６）に記載されている 。 したがって、種々の型のセンスおよびアンチセンス遺伝子類およびプロモータ類 が本発明の特定態様を実行するために使用できる。この点に間して、不活化を目 的とした遺伝子が、不発明を実行するために必要なプロモータを決定するであろ う。 以上より、本文に記載の本発明のひとつの側面によれば、我々は、遺伝的に形質 転換可能な花粉産生植物類種からＭ沢された１植物から雄性不稔性植物を産生ず る方法を提供し、この方法は、 （ａ）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子を、 好適には前記花粉産生植物から同定しかつ単離すること、（ｂ）分化した植物個 体に再生可能な前記植物の植物細胞ゲノム中に、（１）前記センス遺伝子によっ てコ・−ドされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、 （２）前記植物中において、前記センス遺伝子の転写時またはその頃において前 記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように機能するプロモータ、（３）前記 ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義するターミネータ配列 からなる遺伝子を挿入すること、 （Ｃ）前記植物の形質転換植物細胞を得ること、および（ｄ）前記形質転換植物 細胞から雄性不稔性である遺伝的に形質転換された植物を再生すること かうなる。 問題のセンス遺伝子は最初その自然のままの形態でＭＩＩされるので、本文に用 いる”センス遺伝子”という用語は、５“非翻訳リーダー配列類、コード配列類 、プロモータ配列類、イントロン配列類、および非転写３”配列類またはこれら の配列類の全ての実質的断片類を含む１個以上の遺伝子部分を意味することを理 解されたい。同一プロモータがこのアンチセンス遺伝子を発動させるために用い られる場合、このプロモータをＭＩＩすることが望ましいであろう。 さらに、このセンス遺伝子を云二ゴで同定し単離することは必須ではないことが わかる。このセンス遺伝子は、むしろ、いかなる手段によっても得られるであろ う（例えば、文献に記載されておりまたは市販されている）。 このアンチセンス遺伝子から転写されたＲＮＡは、たとえターミネータ配列が前 記アンチセンス遺伝子からなる前記組換えＤＮＡ分子によってコードされなくて も、このセンス遺伝子によってコードされたＲＮＡの翻訳を阻害する点において 有効である可能性がある。 この組換えＤＮＡ分子は、前記形質転換植物細胞が容易に選択できるように、化 学試薬または生理的ストレスに対する感受性を前記植物の植物細胞に付与する遺 伝子からなることが望ましい。 先の方法によれば、不発明は、また、段階（ｂ）に記載の組換えＤＮＡ分子によ って形質転換されかつ雄性不稔性植物に再生可能な植物細胞に関する。 本発明は、また、前記雄性不稔性植物のハイブリッド交雑における使用にも関す る。 下記に述べるように、商業規模でハイブリッド種子を産生ずるために、雄性不稔 性植物類を増加させるための種々の方法が採用できる。ひとつの方法によれば、 このアンチセンス遺伝子は、選択的因子に対する耐性を付与する遺伝子に結合す ることができる。この方法によれば、遺伝的に形質転換された植物（雄性不稔性 ）を適切な非形質転換雄性稔性植物と交雑することおよび前記選択的因子を用い てこのような交雑によって産生じた種子から生長した植物からアンチセンス遺伝 子含有植物を選択することによって、雄性不稔性系統を産生ずることが可能であ る。 理論的には、耐性遺伝子が同定されているいかなる有効選択的因子も、本発明の この面の範囲内で使用することができ、除草剤・抗生物質・毒物および植物病気 に対する耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。このよ うな選択的因子として、２つの両立しうる広い範】、化学薬剤および生理的スト レスが挙げられる。除草剤の≦うな化学薬剤は、商業的規模で！ｉ性不稔徳性物 類を生産するために使用することができる。耐性遺伝子が同定された除草剤の例 として、グリホセート（Ｃｏｍａｉ、Ｌ、、Ｆａｃｃｉｏ℃ｔｉ、Ｄ、　、Ｈｉ ａｔｔ、ｗ、Ｒ，、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｇ、、Ｒｏｓｅ、Ｒ，Ｅ、、、５ｔａｉ ｋｅｒ。 Ｄ、Ｍ、、１９８５．ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、３１７巻、７４０−７４ ４頁に記載）、クロロスルフロン（Ｈａｕｇｈｎ、Ｇ、Ｗ、８よびＳｏｍｅｒｖ ｉｌｉｅ、Ｃ，Ｒ，，１９８６，モレキュラー・エンド・ジエネラルジエネテツ クス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）、２ＬＯ巻、４３０−４３４頁にＬＥ載 ）２３よびホスフィノトリシン（ＭｕｒａＫａｍｉ、Ｔ、ら、モレキュラー・エ ンド・シェネラルジエネテツクス（Ｍｏ　１．Ｇ　ｅ　ｎ、Ｇ　ｅ　ｎｅ　ｔ− ）　２０５：　４２−５０．１９８６）が挙げられる。 別の方法によれば、雄性不稔性植物類の数は、その組織外植体を用いるクローン 繁殖または他の血ｚ旦上二繁殖技術によって増加できる。 他の方法は、当業者に明白であろう。したがって、本文に記載した本発明の種々 の面の実施例は、さまざまなこのような方法のいずれかひとつを用しλて実行す ることができることがわかる。 以上より、本文に特許請求された不発明のもうひとつの面の１実施例によれば、 我々は、遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物種から選択された植物力）らハイ ブリッド種子を生産する方法を提供し、本方法は、（ａ） （１）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子を、 好適には前記花粉形成植物から同定しかつ単離すること、（２）分化した植物個 体に再生可能な前記植物の植物細胞ゲノム中に、（Ａ）前記センス遺伝子によっ てコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）前記植物中において、前記センス遺伝子の転写時またはその頃ｉこお１１ て前記ＤＮＡ配列のＲＮ　Ａ−への転写を起こすように機能するプロモータ、（ Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義するターミネータ配列 、 からなる遺伝子３よびこの遺伝子に連結した化学薬剤または生理的ストレスに対 する耐性を前記植物に付与する遺伝子を挿入すること、（３）前記植物の形質転 換植物細胞を得ること、および（４）前記形質転換植物細胞から、上記の段ｊ！ 　（ａ）２）に記載の遺祖子類で遺伝的に形質転換された植物を再生すること、 によって雄性不稔性である遺伝的に形質転換された植物を産生ずること、および （ｂ） １）その組織外植体を用いるクローン繁殖または他のＬ２旦上ユ繁殖技術、また は、 Ａ）上記の段階（ａ）４）に記載の遺伝的に形質転換された植物を適切な雄性徳 性植物と交雑すること； Ｂ）同一化学薬剤または生理的ストレスを用いて、このような交雑によって産生 された種子から成長した植物から上述の段階（ａ）２）に記載の遺伝子を含有し ない植物を除去すること、 Ｃ）前記化学薬剤または生理的ストレス存在下において、上述の段階（ｔ）＞　 ２）のようにして得られた植物において数世代にわたってこのような交雑を繰り 返し、雄性不稔性植物類の数を増加させること、によって、遺伝的に形質転換さ れた植物類の数を増加させること、（Ｃ）前託雄性不徳性植物類を適切な雄性不 性植物類の花粉で受粉することによってハイブリッド交雑を行うこと。 の段階からなる。 上述の方法によって産生されたハイブリッド種子は、雄性不稔性を誘発する組換 えＤＮＡの隔離のゆえに、不稔性ハイブリッド種子および徳性ハイブリッド種子 の混合物を含有することもできる。異系交雑の種において、存在する徳性植物屋 は雄性不稔性ハイブリッド類の十分な受粉を可能とするであろう。 ハイブリッド種子を産生ずる目的のために適切であるかどうかは、異なる系統の 憬準的交雑とその後の子孫の分析、および優れた組み合わせ能力および所望の農 業上の特性によって決められることがわがる。雄性不稔性の数増加のための雄性 不稔性植物との交雑目的のために雄性稔性植物が適切であることは、雄性不稔性 植物が派生した同−通交系の植物が使用されたことを意味しているが、必ずしも その使用に限定されるわけではない。下記に述べた数例において、雄性不稔性系 統の維持は、皿に隔離下における自殖によってもたらすことができる。 先の方法によれば、本発明は、上述の段階（ａ＞　２）に記載の遺伝子類によっ て形質転換されかつ雄性不稔性植物に再生可能な植物細胞、ならびに上記（ａ） ２）に記載の遺伝子類含有植物類およびハイブリッド種子に関する。−雄性不稔 性植物類と雄性不性植物類とを交互の列に植えであるハイブリッド種子を生産す る方法において、雄性稔性トーナー類に沿って植えた畑で雄性不稔性の最終選択 を実施する方がより容易であるが、必須と言うわけではない。したがって、もし 適切な雄性稔性トーナー類が先に前記選択薬剤耐性に形質転換されており、前記 薬剤を雄性不稔性植物類の列にのみ選別的に適用しなければならないことを回避 できることが、望ましい。したがって、段階（Ｃ）は、前記化学薬剤または生理 的ストレス（選択９子）に対して先に耐性とされた適当な雄性稔性トーナー類の 種子とともに、前記選択された遺伝的形質転換植物類および適切な雄性稔性トー ナー類との交雑から産生された種子を生長させることによって、達成されるであ ろう。 同定されカリ単離されたセンス遺伝子が転写されるが翻訳されない配列を有する 場合、前記配列に対するアンチセンス遺伝子を用いて前記センス遺伝子を不活化 し雄性不稔性植物を作製することおよび前記センス遺伝子の機能を復ＩＢ系統中 において復旧することによって、復旧された徳性によりハイブリッド種子を産生 ずることができる。復旧系統は、前記アンチセンス遺伝子に相補性の領域を有さ す従ってアンチセンス制御を受けない改質された形態のセンス遺伝子で遺伝的に 形質転換された植物類からなるであろう。 前記転写されるが未翻訳の配列には、未翻訳５゛リーダー配列、介在配列類およ び未翻訳３°配列またはこれらの配列類の全ての実質的断片類が含まれる。前記 配列またはその断片類は、天然または人為的に導入されたものであると理解され たい。 以上より、不発明のひとつの側面によれば、我々は、遺伝的に形質転換可能な花 粉形成植物（から選択された植物から雄性不稔性植物を生産する方法を提供し、 本方法は、 （ａ）（１）花粉形成または機能にとって重大であるコード配列および転写され てはいるが未翻訳の配列からなるセンス遺伝子を、好適には前記花粉形成植物が ら同定しかつ単離すること、 （２）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞ゲノムに、化学薬剤ま たは天然または人為的に誘発した生理的ストレスに対する耐性を前記植物に付与 する遺伝子、およびこの遺伝子に連結し、（Ａ）前記転写されてはいるが未翻訳 の配列に相補性のＤＮＡ配列、（Ｂ）前記植物中において、前記センス遺伝子の 発生過程中の花粉への転写時またはその頃において、前記ＤＮＡ配列のＲＮＡ９ への転写を起こすように前記植物中において機能するプロモータ、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、によって雄性不稔性植物を産生ずる こと、（３）前記植物の形質転換植物細胞を得ること、および（４）前記植物細 胞から、上記の段階（ａ）２）に記載の前記ＤＮＡ配列で遺伝的に形質転換され かつ雄性不稔性である植物を再生すること、によって雄性不稔性植物を産生する こと、の段階からなる。 以上より、不発明のひとつの側面によれば、我々は、遺伝的に形質転換可能な花 粉産生植物種から選択された植物から復旧された雄性稔性を有するハイブリッド 種子を生産する方法を提供し、本方法は、（ａ） （１）花粉形成または機能にとって重大であるコード配列および転写されてはい るが未翻訳の配列からなるセンス遺伝子を好適には前記花粉産生植物から同定し かつ単離すること、 （２）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞ゲノムに、化学薬剤ま たは天然または人為的に誘発した生理的ストレスに対する耐性を前記植物に付与 する遺伝子、およびこれに連結し、 （Ａ）前記転写されてはいるが未翻訳の配列に相補性のＤＮＡ配列、（Ｂ）発生 過程中の花粉中における前記センス遺伝子の転写時またはその頃において、前記 ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物中において機能するプロモ ータ、および好適には、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植物細胞 を得ること、および（４）上記（ａ）（２）に記載の前記ＤＮＡ配列で遺伝的に 形質転換されかつ雄性不稔性である植物を前記植物細胞から再生すること、によ って、雄性不稔性植物を産生ずること、（ｂ） （１）段階（ａ）に記載の前記遺伝的に形質転換された雄性不稔性植物のその組 織外植体を用いるクローン繁殖またはその他のＬｚＫΣ旦繁殖技術、（２）前記 遺伝的に形質転換された雄性不稔性植物を適切な雄性稔性植物と交雑すること、 （３）前記化学薬剤または生理的ストレスを用いて、このような交雑によって産 生された種子から成長した植物から上述の段階（ａ）２）に記載のＤＮＡ配列を 含有しない植物を除去すること、 （４）前記化学薬剤または生理的ストレス存在下において、上述の段階（ｂ）３ ）のようにして得られた植物と数世代にわたりこのような交雑を繰り返し、雄性 不稔性植物類の数を増加させること、 によって、遺伝的に形質転換された雄性不稔性植物類の数を増加させること、（ ｃ） （１）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞ゲノムに１、（Ａ）前 記アンチセンス遺伝子に相補性の領域を含有しない前記センス遺伝子の改質形態 からなる組換えＤＮＡ分子、 （Ｂ）前記植物中において、好適には前記アンチセンス遺伝子の活動時またはそ の頃において、センス遺伝子の機能復１日時点において前記改質ＤＮＡ配列の転 写を誘発するように前記植物中において機能するプロモータ、列、からなる組換 えＤＮＡ分子に連結した化学薬剤または天然または人為的に誘発した生理的スト レスに対する耐性を前記植物に付与する遺伝子を挿入すること、によって、雄性 稔性復旧植物を産生ずること、（ｄ）前記復旧形質に関してホモ接合性の植物を 選択しかつ隔離下に呂殖することによって遺伝的に形質転換された植物の数を増 やすこと、（ｅ）前記雄性稔性復旧植物の花粉によって、前記雄性不稔性植物類 を受粉することによってハイブリッド交雑を行うこと、からなる。 前記復旧形質に関してホモ接合性の植物の選択は、前記復旧形質を有する遺伝的 に形質転換された植物の朽または単離された小胞子を培養することによって、ま たは好適には選択の前に前記植物を隔離下に自殖することによって実施すること ができる。 ターゲットとされた植物種が異系交雑しない場合、上述のように徳性を復旧する ことが特に好適である。ターゲット植物種が実際に異系交雑する場合、上述の段 Ｆｉ　（ｃ）および（ｄ）に記載のように復旧系統を産生ずることが好適である が必要というわけではない。適切な誰性稔惇植物との交雑は、雄性不稔性を誘発 する組換えＤＮＡの隔離の故に不稔性ハイブリッド種子および徳性ハイブリッド 種子の混合物からなるハイブリッド種子を生成する。存在する徳性植物類は、雄 性不稔性ハイブリッド類の十分な受粉を可能とする。 復旧遺伝子の発現は、そうでなければ花粉発生が破壊される時において転写を可 能とするいかなるプロモータによっても駆動される。この復旧遺伝子が、前記ア ンチセンス遺伝子の駆動に使用されたのと同一のプロモータまたは花粉形成また はその機能にとって重大な組織中において非常に活性の全てのプロモータによっ て駆動されるのが好適である。 先の方法によれば、本発明は、また、 （１）上述の段ＦＭ　（ａ）　（２）または（ｃ）（１）４こ記載の組換えＤ　 Ｎ　、Ａ　分子ニよって形質転換されかつ雄性不稔性形質を有する植物に再生可 能である植物細胞、（２）上述の段ＦＪ（ａ）（２）または（Ｃ）（ＩＮ、：記 載の組換えＤＮＡ分子によって形質転換された植物、および （３）上述の段階（ａ）（２）また：よ（ｃ）（１）に記載の組換えＤＮＡ分子 によって形質転換されたハイブリッド種子、に関する。 本文で特許請求したように本発明のコ態様によれば、我々は、誘導性プロモータ を使用することによってアンチセンス遺伝子のコード領域の発現を制御する。 この方法において、本プロモータは、花粉形成時全体にわたりまたは少なくとも センス遺伝子の転写時にわたる期間において、誘導された状態にプロモータをお くことができる。単純な化学試薬によって誘導可能なプロモータは、雄性不稔性 植物が前記化学ｔｔ、Ｍ不左下に生長したときに会友受粉によって簡単に維持で きるので、特に有用である。復旧は、前記インデューサー不在時においてハイブ リッド種子から産生された生長♀の植物に１有である。 以上より、本文に特許請求された不発明の別の面の１．ｇ様によれば、我々は、 遺伝的に形質転換可能な花粉保持植物種から選択された植物類から復旧稔性を有 するハイブリッド種子を産生ずる方法を提供し、この方法は、（ａン １）花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子を好適には前記花粉産生植 物から同定しかつ単離すること、 （２）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞ゲノム甲に。 （Ａ）前ｇ己センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に全体としてまたは 部分的に相補性のＲＮＡをコードするアンチセンス遺伝子、（Ｂ）前記センス遺 伝子またはコード配列の転写時において、前記植物細胞中において前記ＤＮＡ配 列のＲＮＡへの転写を起こすように機能できる誘導性プロモータ、および好適に は、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列 かうなる組換えＤＮＡを挿入すること、３）前記植物の形質転換植物細胞を得る こと、および４）前記形質転換植物細胞から上記（２）に記載の前記ＤＮＡ分子 によって遺伝的に形質転換されかつ前記インデューサーによって！！性不稔性と できる植物を再生すること、 によって、雄性不稔性形質を保有する遺伝的に形質転換された植物を産生ずるこ と、 （ｂ） （１）段階（ａ）に記載の前記形質転換された植物をその組織外植体のクローン 繁殖、またはその他り之旦土ユ繁殖技術、（２）（ａ）記載の誘導雄性不稔性形 質を有する遺伝的に形質転換された植物を自殖し、この誘導雄性不稔性形質に関 してホモ接合性の植物を選択しかつインデューサー不在下において数世代にわた り隔離下に自殖させることによって前記植物を増加させ、遺伝的に形質転換され た植物の数を増加させることによって、遺伝的に形質転換された植物類の数を増 加させること。 （Ｃ）＊記インデューサー存在下において生長した前記遺伝的に形質転換された 植物類と適切な雄性不性植物類とをハイブリッド交雑させること。 の段階からなる方法である。 先の方法の段＃（ａ〉によれば、我々は、雄性不稔性形質を保有する植物を産生 ずる方法を提供する。 先の方法によれば、本発明は、また、上記段階（ａ）（２）に記載の組換えＤＮ Ａ分子によって形質転換されかつ難性不稔性形質を保有する植物に再生可能な植 物細胞に関する。 先の方法によれば、本発明は、また、 （ａ）前記植物中に３いて花粉形成またはそのＩＩ能にとって重大なセンス遺伝 子によってコードされたＲ　Ｎ　Ａ配列に相補性のＲＮＡをコードするＤＮＡ配 列、（ｂ）前記遺伝子の転写時において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を引き 起こすように前記植物中に３いてｍ能できる誘導性プロモータ、および（Ｃ）前 記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義するターミネータ配列、から なる組換えＤＮＡ分子を含有する植物に関する。 先の方法によれば、不発明は、また、 （ａ）前記種子から生長した植物中において花粉形成またはその機能にとって重 大なセンス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードす るＤＮＡ配列、 （ｂ）前記センス遺伝子の転写時において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を引 き起こすように前記植物中において機能できる誘導性プロモータ、および（Ｃ） 前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義するターミネータ配列、か らなる組換えＤＮＡ分子を含有するハイブリッド種子に関する。 不文で特許請求した本発明のもうひとつの面の１態様によれば、我々は、橿ブー ”・Ｂｒ　ｓｓｉ　ａ　ｎａ　ｕｓ　ｓｓ’ｐ　ｔレイフニラ（Ｑｌｅｉｆｅｒ ａ）　ｗ　ウェスター（Ｗｅｓｔａｒ）の植物から単離し、小胞子においてのみ 発現されかつその発現が小胞子発生に重大であるＤＮＡコード配列類を提供する 。Ｌ４．ＬＩＯ，Ｌｉ２およびＬｉ２として周定された小胞子特異的遺伝子類の 制限地図類およびそれらのコード領域を本文で図により示した。クローンＬ４の 完全なヌクレオチド配列、およびＬＩＯ，Ｌｉ２およびＬｉ２の関連配列も同様 に本文に示した。クローンＬ４．ＬＩＯおよびＬｉ２内の遺伝子類または関連遺 伝子族類に対応する単離ｃＤＮＡクローン類のヌクレオチド配列も不文に示した 。 本文に記載のものと等しいかまたは相同性のＤＮＡ配列類は、花粉保持植物類の その他の種、特に厘　−ゝ　Ｂｒａｓｓｉｃａ）および科久止乞２孟二工（Ｃｒ ｕｓｉｆｅｒａｅ　”−’　ｘ　Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）としても公知であ る）内の植物類の種、さらにより特定すれば１立ｚ友二力ヱスユ旦ｒａｓｓｉｃ ａ　ｎえ且旦旦）のその他栽培植物変種の花粉に見られおよび発現されるであろ うと確信されている。 花粉保持植物類のその他の種におけるこの配列の出現は、公知のハイブリダイゼ ーション法によって定型的に確認できる。種から種への植物遺伝子類の類似性に よって、本発明の先の面が、遺伝的に形質転換可能ないかなる数の花粉保持植物 種においても前１己ＤＮＡ断片を使用することによって実行できることを可能と すると確信されている。植物遺伝子類の普通性は文献に広範囲に記載されており 、かつ相同植物遺伝子類は、植物アクチン類について（Ｓｈａｈ、Ｄ、Ｍ、ら、 ジャーナル・オブ・モレキュラーアプリケージ目ン・ジェネティクス（Ｊ、Ｍ。 １、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、＞２：１１１−１２６．１９８３）　、フチイトク ロームについて（Ｈｅｒｓｈｅｙ、Ｈ，Ｐ、　ら、プロシーディングズ・オブ・ ナショナルアカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａ９ａｄ　 Ｓｃｉ　ＵＳＡ））、貯蔵タンパク貢について（Ｓ　１　ｎ　ｇ　ｈ、　Ｎ、　 Ｋ、ら、プラントモレキュラーバイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ！、　Ｂｉｏｌ 、）ｉｌ：６３３−８３９．１９８８）、グルタミンシンターゼについて（Ｌｉ ｇｈｔｆｏｏｔ。 Ｄ、　Ａ、ら、プラントモレキュラーバイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉ 。 １、）１１：　１９１−２０２，１９８８お、！ｔＦ＋（７）中の参考文献）オ ヨヒ硝ｉ１ルダクターゼ（Ｃｈｅｎｇ、Ｃ，ら、ＥＭＢＯジャーナル、７　：　 ３３０９−３３１４）のような酵素について記載されてきた。これらおよび文献 における例は、多くの植物遺伝子類が高度に保存されることを明白に実証してい る。また、この保存が、構造タンパク質類ばかりでなく細胞生理学上重要な酵素 タンパク質類にも適用されることが明白である。したがって、前記ＤＮＡ断片が 別の植物種において見られるとき、これは、小胞子発生に重大でありかつこのよ うな種において不発明を実行するために使用することが可能であろうと確信され ている。 ある植物種由来アンチセンスＲＮＡ配列類が、異なる種において相同Ｄ　Ｎ　Ａ 配列類の発現を有効に阻害できることがまた実証されている（Ｖａｎ　ｄｅｒ　 Ｋｒｏｌら、１９８Ｂ、　ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）３３３：　８８８−８ ８９）。 したがって、１立乏友（Ｂ　ｒ　ｓ　ｓ　ｉ　ｃ　ａ　）花粉特異的ＤＮＡ配列 類から全体または部分的に由来するアンチセンスＲＮＡが他の植物類において機 能性であろうと予測されている。 さらに、小胞子発生または小胞子生長に単独で関連しかつ重大である組織にとっ て極めて重要であるいかなる数の異なる遺伝子も先の方法にしたがって単票でき かつ使用できることがわかる。 本発明のもうひとつの面の態様によれば、我々は、花粉特異的プロモータ配列類 および不文に記載のこれらの配列類を含有する形質転換ベクター類を提供する。 これらの配列類は、花粉組織および花粉形成時の期間に、いかなるＤＮＡ配列の 発現も限定するために使用できる。この花粉特異的プロモータは、特定実施例に おいて述べたように、それに隣接したＤＮＡ配列類の発現をｚｉ丈太エエｉ免よ ｌ１１ｓ」」ｎおよびグルン１１ｊ」孔１ｑ二Ｍ−灸ＬＬ丈二且し科の双方にお ける花粉組織に限定する為に使用でき、これらのＤＮＡ断片類またはその機能的 断片類がすべてとはいわないまでも数多くのその他の遺伝的に形質転換可能な花 粉保持植物種における花粉特異的プロモータ類として機能するであろうと強く確 信されている。 これらの花粉特異的プロモータ類は、不文に記載の天然の隣接領域、コード領域 または転写された配列類、または花粉形成または機能にとって重大であるその地 金てのコード配列と関連させ、本発明の先の面および態様を実行するため［こ使 用することができる。 Ｌ４．ＬＩＯおよびＬ１９クローン類田来天然の花粉特異的プロモータ類の間に 高度のＤＮＡ配列相同性があるわけではないことに注意されたい。試験データは 、これらの遺伝子類の発現の時期およびレベルが花粉甲で等しくはないが、やが て全ての活性が重複することを示している。このことは、花粉特異的プロモータ 類としてまだ機能する種々の遺伝子配列類が１１之左二丈プヌｉ旦二ｌ旦５」。 ａ　ｎ　ｕ　）にあることを例示している。 本発明の先の面および下記に述べる不発明の新たな面を実施するために、いかな る数の異なる花粉特異的プロモータ類も用いることができると予測される。花粉 発生、または細胞機能および発生に重大である遺伝子を阻害するためにどの花粉 特異的プロモータを使用できるかを２−に決定することは困難であるが、ある条 件は満たさなければならない。 使用した花粉特異的プロモータは、不発明を実施するために十分なレベルの転写 ＲＮＡを生産するために適切な時点において活性であるプロモータ、またはこの プロモータの改良であるべきである。花粉特異的クローン類由来花粉特異的プロ モータ類は、遺伝子発現が花粉母細胞の減数有糸分裂時およびその後の双方にお いて起こるように、小胞子の発生早期に活性であることが、本文に開示されてい る。したがって、これらのプロモータ類の活性：よ、漏出＝によって１定されな い。 プロモータ領域の同定は、通常、１組のＤＮＡ配列よりもむしろ豊能：こよって 規定されることを明記すべきである。２００塩基禾満はどの小さい塩基が５プロ モ一タ機能を維持するために十分なりＮＡ配列である。また、一部の二流ＤＮＡ 配列類は反対方向に配列でき、それでもなお増大されたプロモータ機能を保持ま たは発揮できる。ざらに、′エンハンサー噌”ＤＮＡ配列類：よ、通常、二〇ヌ クレ万チド宋溝から実質的に大きい数のヌクレオチド類までの大きさにわたる小 さい保存ＤＮＡ配列類であり、これも同様にプロモータ９Ｆ４域に挿入され発現 を増大させる。 また、コード領域にイントロン配列類を挿入すること１こより結果として発現お よび特異性増強が起こることが示されているので、プロモータ構築体類口におい ていくつかのイントロン配列類を組み込むことも同様に望ましい。したがって、 発現すべきＤＮＡ断片類を花粉特異的遺伝子の第１イントロンおよびエクソン配 列類を含有するブコモータ断片に連結すること：よ有利である。 さらに、所望のプロモータ活性を得るために、ひとつのプロモータの領域を異な るプロモータからの領域に連結することも可能である。本発明の面を実施するた めに使用できるキメラプロモータ構築体類の特異的例が、開示されている。 花粉特異的プロモータは、また、センス遺伝子産物レベルが低下するように、十 分なレベルのアンチセンスＲＮＡを産生するために機能するはずである。遺伝子 発現のアンチセンスＲＮＡ阻害機構のモデルシステムにおける研究は、等しいか またはそれ以上のレベルのアンチセンスＲＮＡが、センス遺伝子活性の有意な低 下を観察するために必要であることを示唆している。しかし、一部の場合におい ては、低レベルのアンチセンスＲＮＡがセンス遺伝子活性の特異的低下を引き起 こすことができることが示されている。したがって、一部の場合においてもしア ンチセンスＲＮＡによる不活化をターゲットとする遺伝子がいわゆるハウスキー ピング遺伝子であるならば、または低レベルで全細胞型に３いて発現される遺伝 子であるならば、過剰のアンチセンスＲＮＡは阻害のために必要ではないであろ う。さらに、遺伝子活性の全てほどではない低下でも、多くのストレス条件に極 めて感受性であることが公知である花粉発生を破壊するのに十分すぎるであろう 。したがって、本発明のある面を実施するために使用される花粉特異的プロモー タは、花粉特異的プロモータがそれに隣接するいかなる配列も発現させ、不活化 しようとしているでンス遺伝子が発現される時間的期間と平行してかまたは重複 する時において転写させるように機能するという観察に基づき選択されるべきで あること、およびアンチセンス遺伝子から発現されたアンチセンスＲＮＡのレベ ルはセンス遺伝子発現を阻害するために十分なレベルであり、通常、センスＲＮ Ａのレベルを越えているかまたはそれに等しいことを意味していることが、示唆 されている。 また、これらの組換え配列類を含有する植物の形質転換および回収の成功が常に 遺切な花粉特異的発現をもたらすとは限らないことが理解される。この形質転換 可能は外来性ＤＮＡの無作為挿入をもたらすので、いわゆる位置効果が全ての導 入ＤＮＡの活性を無効にしかつ抑制する可能性がある。故に、いかなる限定的位 置効果も示さない植物個体を回収するために、いかなる組換え構築体においても それぞれの形質転換植物についていくつか作製することが助言される。また、高 レベルの発現が得られるように、導入アンチセンス遺伝子構築体の１つ以上のコ ピーを含有する植物を選択することが好適である。 センス遺伝子が不活化の標的とされる可能性が最も高い発生段階の決定は、花粉 形成の発生様式においてセンス遺伝子が最大発現される時点を選択することおよ び類似の発展様式を示す花粉特異的プロモータを用いることによって達成できる 。 我々は、花粉特異的プロモータを用いて、本発明のさらに別の面を検討する。 アンチセンス遺伝子の発現を制御する花粉特異的プロモータを用いることによっ て、最初に前記植物のゲノムＤＮＡから小胞子生長に重大な発生的に制御された タンパク質をコードする遺伝子を！離する必要がなく、いかなる一定の植物にお いても正常小胞子発生を阻害することが可能である。我々は、不活化の標的とさ れたセンス遺伝子が細胞機能または発生に重大でかつ代謝的に応答性の細胞型に おいて発現される遺伝子である雄性不稔植物を産生ずる方法を記載するであろう 。雄性不稔植物を産生ずるために、このような遺伝子は、花粉特異的プロモータ を用いて花粉組織に相補性のそのアンチセンス遺伝子転写を制限することによっ て、特異的に不活化される。 我々は、また、雄性不稔植物を生産する方法で、不活化の標的とされたでンス遺 伝子がこの植物に対して化学試薬または天然または人為的に誘発された生理スト レスに耐性を付与する回生または外来性遺伝子である方法を記載するであろう。 もしこの遺伝子が外来遺伝子であるならば、それは、アンチセンス遺伝子の前、 その後またはそれと司時に植物ゲノム中に挿入されることができる。雄性不稔植 物は、花粉形成時においてこのようなストレスの存在下に植物を生長させること および花粉形成時に、植物の残余に対して前記ストレスに対する耐性を付与する 遺伝子を特異的に不活化する前記花粉特異的プロモータからなるアンチセンス遺 伝子を花粉中において用いることによって生産できる。大規模で適切に制御可能 でありかつ耐性遺伝子が同定されているいかなるストレスも理論的にはこの方法 に採用でき、これには、除草剤、病Ｎ性生物、ある種の抗生物質類、および毒物 が含まれる。この方法において、８ｉ性不捻性植物系統が、生化学的または生理 的ストレスの不在下において生長したときに自家受粉によって保持できる。復旧 は、前記ストレスの不在下においてハイブリッド種子から産生された生長中の植 物に固有である。 以上より、我々の発明のもう一つの面の１態様によれば、我々は、遺伝的に形質 転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不稔性植物を産生ずる 方法を提供し、本方法は、 （ａ）好適には前記花粉産生植物から、細胞機能または発生に重要でありかつ代 謝的に応答性の細胞型において発現されるセンス遺伝子またはコード配列を同定 しかつ単離すること、 （ｂ）植物細胞のゲノム甲に、 （１）前記センス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡに相補性 のＲＮ　ＡをコードするＤＮＡ配列。 （２）前記植物細胞中において、前記センス遺伝子またはコード配列によってコ ードされたＲＮＡの機能を前記ＲＮＡに阻害させることができる時間枠において 前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こさせるように機能する花粉特異的プロモ ータ、および好適には （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義するターミネータ配 列、 かるなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列によって遺伝 的に形質転換された植物細胞を得ること、（ｄ）前記形質転換植物細胞から雄性 不稔である遺伝的に形質転換された植物を再生すること、 の段階からなる。 先の方法によれば、本発明はまた、 （１）上述の段階（ｂ）に記載の組換えＤＮＡ分子によって形質転換されかつ雄 性不稔植物に再生可能な植物細胞、および（２）上述の段階（ｂ）に記載の組換 えＤＮＡ分子によって形質転換されかつ雄性不稔である植物に関する。 同様に、本発明のもう一つの面によれば、我々は、遺伝的に形質転換可能な花粉 産生植物類種から選択された植物類からハイブリッド種子を産生ずる方法を提供 し、この方法は、 （ａ） （１）細胞機能または発生にとって重大でかつ代謝的に応答性の細胞型において 発現されるセンス遺伝子を好適には前記花粉産生植物から測定しかつ単離するこ と、 （２）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞遺伝子中に、前記植物 に対して化学試薬または生理的ストレスに対する耐性を付与する遺伝子２および 前記遺伝子に連結し、 （Ａ）前ご己センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡを コードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）前記植物中において、花粉Ｉ！能または形成に重大な組織中に３いて前記 センス遺伝子の転写時またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を 誘発するように機能する花粉をターゲットとしたプロモータ、および好適には（ Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義するターミネータ配列 からなる組換えＤＮＡ配列を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植物細胞 を得ること、および（４）上述の段階（ａ）２）に記載の遺伝子類で遺伝的に形 質転換されかつ雄性不稔である植物を前記形質転換植物細胞から再生すること、 によって、雄性不稔性植物を産生ずること、（ｂ） （１）その組織外植体を用いるクローン繁殖、またはその他のＬｚＺ上且繁殖技 術、または （Ａ）上述の段階（ａ）（４）に記載の遺伝的に形質転換された植物を適切な雄 性両性植物と交雑すること、 （Ｂ）このような交雑によって産生された種子から生長した植物から、上述の段 階（ａ）（２）に記載の遺伝子類を含まない植物を除去するために同一の化学薬 剤または生理的ストレスを用いること、および（Ｃ）前記化学薬剤または生理的 ストレスの存在下において上述の段１（ｂ）２）で得られた植物との数世代にわ たる交雑を反復し、雄性不稔性植物類の数を増加させること、 によって、遺伝的に形質転換された植物類の数を増加させること、（Ｃ）前記遺 伝的に形質転換された植物類と適切な雄性不稔性植物類とのハイブリッド交雑を 行うこと、 の段階からなる方法を提供する。 上記にも述べたように、雄性不稔性を生じる組換えＤＮＡの隔離の故に、上記方 法によって産生されたハイブリッド種子は、不稔性ハイブリッド種子および稔性 ハイブリッド種子の混合物を含有することができる。異系交雑の種においては、 存在する稔性植物類は、雄性不稔性ハイブリッド類の十分な受粉を可畦とするで あろう。 また、雄性不稔性植物類と雄性不性植物類とを交互の列に植えた場合、雄性両性 トーナー類に沿って植えた畑で雄性不稔性の最経選択を実行することがより簡単 であるが、必須と言うわけではない。したがって、もし通切な雄性稔性トーナー が先に選択薬剤にＳ性であるように形質転換されるならば、前記薬剤を雄性不稔 性植物類の列に選択的に適用しなければならないことが互選されるので望ましい 。 先の方法によれば、２！：発明は、また、上述の段階ａ）２）に定義した遺伝子 および組換えＤＮＡ配列で形質転換されかつ雄性不稔性植物中に再生可能である 植物細胞に関する。 本発明の先の面によれば、本発明は、また、（ａ）代謝的に応答性の細胞型にお いて細胞機能または発生にとって必須の遺伝子によってコードされたｍＲＮＡに 相補性のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、（ｂｌ前記植物口または前記ハイブリ ッド種子から生長した植物中（こおいて、前記遺伝子によってコードされたＲＮ Ａの機能を下記ＲＮＡに゛阻害させる時間枠において、前記ＤＮＡ配列のＲＮＡ への転写を起こすようｉこ機能する花粉をターゲットとするプロモータ、および 好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するター ミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子からなるＤＮＡを含有する植物およびハイブリッド種 子に関する。 細胞機能または発生に重大なタンパク質をコードするセンス遺伝子が参考文献に 明確にされており、かつ下記に述べる方法により簡潔な様式でＩＬＩｉできるこ とを理解すべきである。 このようなタンパク質の例として、アクチン、チューブリンまたはユビキチンの ようなタンパク質類があり、３種のタンパク質類は、細胞生長および発生に必須 である。 植物から単離されたアクチン遺伝子の配列に付いては公表されており（例えば、 Ｂａ１ｒｄ　Ｗ、Ｖ、、およびＭｅａｇｈｅｒ、Ｒ，Ｂ、、ＥＭＢＯＪ、、６： 　３２２３−３２３１，１９８７、または５ｈａｈ、Ｄ、Ｍ、、ＨｉｇＴｈｔｏ ｗｅｒ、　Ｒ，Ｃ，およびＭｅａｇｈｅｒ、　Ｒ，Ｂ１．プロシーデイングズ万 ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｉ　Ａｃ ａｄＳｃｉ　ＵＳＡ）　７９：１０２２−１０２６．　ユ９８２）、ｇよびアク チンは５特にアクチンが細胞分割のための細胞装！の一部を形成する減数有糸分 裂時において正常細胞機能に重大な役割を果たすことが公知である。 植物チューブリンの配列についても記載されている（Ｒａｈａ、Ｄ、、Ｓｅｎ。 Ｋ、およびＢｉｓｗａｓ、Ｒ，Ｂ、プラントモレキュラーバイオロジー（：’１ ａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ）９：５６５−５７Ｌ、１９８７Ｌチユーブリンはア クチンのように、特に細胞形状、輸送および減数有糸分裂時における紡錘体形成 に関して細胞生活環において重要であることが公知である。 植物ユビキチンの為のＤＮＡ配列も、公表されている（Ｇａｕｓｉｎｇ、に−お よびＢａｒＲａｒｄｏｔｔｉｒ、Ｒ，、レビュー・τブ・ヨーロピアンジャーナ ル・オブ・バイオケミストリ（Ｒ，Ｅｕｒ　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ）。ユビキチン は、細胞タンパク質類の代謝回転Ｉこ関連するタンパク質であり、そのようなも のとして特定の細胞タンパク賀レベルの制御に重大な役割を果たしている。さら に、ユビキチンは、真核細胞において最も高度に保専されたタンパク質類のひと つである。ユビキチン発現の阻害は、細胞タンパク質類の代謝回転に異常をもた らすことができる。 もし上記タンパク質類のいずれかが細胞に存在しないならば、適切な細胞機能が 阻害されそして細胞は適切に発生できない。 ある種の植物において細胞生長または発生に必須であることがわかっている遺伝 子は、その他の植＃１櫂においても類似の対照物を有していると確信されている が、その理由として、一般に、植物界では、はとんど等しいかまたは極めて相同 である遺伝子が細胞発生を制御するかまたはその結果である基本的過程に関連し ていると理解されている。さらに、前記遺伝子の１植物における発現を阻害する 遺伝子、すなわちアンチセンス遺伝子がその他の植物種においてそうする能力を 有していると確信されている。 これらの遺伝子類の類似性および普遍性は、参考文献で例示されてきた。小麦遺 伝子により組織特異的および発生的に制御され、遺伝的に形質転換されたタバコ 植物類において合成された小麦的胚乳タンパク質の発現について、報告されてい る（Ｆｌａｖｅｌｌ、Ｒ，Ｂ、　ら、Ｗｌ角物分子物学第２コ国原会！１（Ｓｅ ｃ。 ｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｆｏｒ　ＰｌａｎｔＭ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏＬｏｇｙ）、アブストラクト＃　９７　）　、　ソノ 例Ｔ−１：、小麦遺伝子が、小麦植物甲で機能する方式と等しい方法で、タバコ 植物甲で機能した。その他の参考文献では、多くの場合複雑である可能性のある 特定遺伝子の制御は、トランスジェニック植物類中において維持されていること が明らかとされている。このひとつの例として、トランスジェニックタバコにお ける／ｊＸ麦クロりフィルａ／ｂ結合タンパク質のファイトクローム介在制御が あげられる（ＮａｇＬ　Ｆ、ら、ＥＭＢＯＪｏｕｒ、５　：　ｉｌ　１−ＩＬ２ ４，１９８８）　、この例では、小麦遺伝子の光応答性特異的制御が外来性遺伝 的環境において維持された。実際に穀物遺伝子類は保存的に機能するばかりでな く、より緊密に関連している他の植物種由来遺伝子類は、非相潤性遺伝系におい て機能性を維持する。えんどう豆種子タンパク質類は、大豆種子タンパク質ｆｉ （Ｂａｒｋｅｒ、Ｓ、Ｊ。 ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・γブ・サイエンシズ （Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｌ″５Ａ）８５　：　４５８−４６ ２．１９８５））およびえんどう豆ｒｂｃｓ遺伝子（Ｎａｇｙ、Ｆ、ら、ＥＭＢ Ｏジャーナル（Ｊｏｕｒ、）４：　３０６３−３０６８．Ｌ９８５）におけると 司じようにタバコ植物類において適切に発現される（Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｔ、Ｊ、 Ｖ、ら。 プラントモレキュラーバイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）１１： ６８３−６９６．１９８８）。科学文献は、遺伝的に形質転換された植物類に使 用されてきた遺伝子類の数多くのその他の例を有しており、かつ、その遺伝子類 は、この新しい遺伝的環境において適切に機能する能力を保持している。したが って、これらの遺伝子類が、これらの遺伝子類の発現を制御するＤＮＡ配列類内 においてばかりでなくこれらの遺伝子類によってコードされた実際のタンパク質 構造においても保存される佐賀は、植物種間において類似している。 したがって、上述の方法にしたがって、公表された配列類および花粉特異的プロ モータによってコードされたｍＲＮＡＩＩに特異的なアンチセンス遺伝子を用い て、これらのタンパク質類の生産を特異的に坦害できることになる。 本文で特許請求した本発明のもうひとつの面の１態様によれば、我々は、遺伝的 に形質転換される花粉産生植物類種から選択された植物から！ｉ性不稔性形質を 保有する植物を産生ずる方法を提供し、五方法は、（ａ）Ｗ記植物に対して化学 薬剤または天然のまた：；人為的！こ誘発した生理的または化学的スごレス；こ 対する耐性を付与するセンス遺伝子によって、分化した植物個体に再生可能な前 記植物の植物細胞を形質転換すること、（ｂ）前記形質転換植物細胞から同一ス トレスに対して耐性の遺伝的；こ形質転換された植物を再生すること、 （ｅ）分化した植物個体に再生可能なストレス耐性植物の植物細胞のゲノム中に 、下記： （１）前記センス遺伝子によってツー゛くされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡを コードするＤＮＡ配列、 （２）前記植物細胞甲において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように 機能する花粉特異的プロモータ、おｌび好適に：よ、（３）前記ＤＮＡ配列の転 写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること２（ｄ）上述の段階（Ｃ）に記載の遺 伝子で形質転換された前記ストレス耐性植物の植物細胞を得ること、および （ｅ）上述の段階（ａ）および（Ｃ）に記載の遺伝子類によって遺伝的に形質転 換され前記化学薬剤またはストレスによって雄性不稔性とすることができる植物 を前記形質転換植物細胞から再生すること、の段階からなる。 先の方法によれば、本発明はまた、 （１）上記の段階（ａ）および（Ｃ）に定義された遺伝子を含有しかつ雄性不稔 性形質を有する植物に再生可能な植物細胞、（２）上記の段階（ａ）および（Ｃ ）に定義された遺伝子を含有しかつ雄性不稔性形質を有する植物、 に関する。 雄性不稔性としようとしている植物は、化学薬剤または天然のまたは人為的誘発 生理的または化学的ストレスに対する耐性を付与するセンス遺伝子で形質転換さ れるが、もしこのセンス遺伝子がこの植物に本来あるならば、このセンス遺伝子 で形質転換される必要がないことを理解すべきである。 我々の発明の先の面はまた、上記で：同時に（ａ）および（Ｃ）に述べられた遺 伝子類の双方で植物細胞を形質転換することによって達成することもでき、した がって、中間的再生段１（ｂ）なしで達成できる。 本文で特許請求した本発明のもうひとつの面の１態様によれば、我々は、遺伝的 に形質転換されることが可能な花粉産生植物類檜から選択された植物から復旧さ れた両性を有するハイブリッド種子を産生ずる方法を提供し、この方法は、（ａ ） （１）分化した植物個体に再生可能な前記花粉産生植物の植物細胞ゲノムに、前 記植物に対して化学薬剤または天然のまたは人為誘発生理的または化学的ストレ スを付与するセンス遺伝子、および、 （Ａ）前記センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコ ードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）前記植物細胞甲において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように 機能する花粉ターゲットプロモータ、および好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の 転写時においシグナルを定義するターミネータ配列、からなる組換えＤＮＡ分子 を同時にまたは独自に挿入すること、（２）上記段階（１）に記載の遺伝子類に よって形質転換された植物の植物細胞を得ること、 （３）上記段階（１）に記載の遺伝子類によって遺伝的に形質転換されかつ前記 化学薬剤またはストレスによって雄性不稔性とすることができる植物を前記形質 転換植物から再生すること、 によって、雄性不稔性形質を保有する植物を産生ずること。 （ｂ） （１）その組織外植体を用いるクローン繁殖、またはその他の血２監上二繁殖技 術、 （Ａ）上記の段階（ａ）４）に記載の遺伝的に形質転換された植物を適切な雄性 稔性植物によって交雑すること、 （Ｂ）同一の化学薬剤または生理的ストレスを用いて、このような交雑によって 産生された種子から生長した植物から二連の段階（ａ）２＞に記載の遺伝子類を 含まない植物を除去すること、および （Ｃ）前記化学薬剤または生理的ストレスの存在下において上述の段１（１：） ）２）で得られた植物との数世代にわたる交雑を反復し雄性不稔植物類の数を増 加させること、 （Ａ）前記化学薬剤またはストレスによって雄性不稔性とできる（ａ）に記載の 遺伝的に形質転換された植物を当帰し、その当帰子孫からこの雄性不稔性形質に 間してホモ接合性の植物を選択すること、（Ｂ）上記段ｊｉ！（ａ）（３）に記 載の同一ストレスまたは化学薬剤から隔離して遺伝的に形質転換された植物を生 長させ自適植物を産生すること、（Ｃ）自家授精を行わせること、およびＣＤ） 前記回家授精植物の種子を、同一ストレスまたは化学薬剤から隔離して数世代に わたり生長させ、遺伝的に形質転換された植物類の数を増加させること、によっ て遺伝的に形質転換された植物類の数を増加させること、（Ｃ）花粉形成時に存 在する同一ストレスまたは化学薬剤の存在下において生長した前記遺伝的に形質 転換した植物類と適切な雄性両性植物類とのハイブリッド交雑を行うこと。 の段階からなる。 雄性不稔性としようとしている植物は、化学薬剤または天然のまたは人為的誘発 生理的または化学的ストレスに対する耐性を付与するセンス遺伝子で形質転換す るが、もしこのセンス遺伝子がこの植物に元来あるならば、このセンス遺伝子で 形質転換される必要はないことを理解すべきである。 先の方法によれば、本発明は、また、下記からなるＤＮＡを含有するハイブリッ ド種子にも関する。 （ａ）前記種子から生長した植物に対して化学薬剤または天然または人為的に誘 発された生理的ストレスに対する耐性を付与するセンス遺伝子、および（ｂ）下 記からなる組換えＤＮＡ遺伝子；１）前記センス遺伝子によってコードされたＲ ＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、 ２）前記植物中において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こす様に機能する 花粉特異的プロモータ、 ３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義するターミネータ配列 。 本特許請求の範囲に記載の本発明のもうひとつの面の１態様によれば、我々は、 花粉特異的プロモータおよび細胞毒性分子をコードするＤＮＡ配列からなる組換 えＤＮＡ分子によって植物を形質転換することによって、雄性不稔性植物を産生 ずる方法を記載する。理論的には、１０種以上の同定可能なりＮＡ配列類によっ てコードされることが公知であるリシンおよびジフテリアトキシンを含む全ての 毒性分子が、本発明のこの面の範囲内に用いることができるが、これに限定され るわけではない。我々は、前記細胞毒性分子をコードするＤＮＡ配列の方向に対 してアンチセンス方向にあるＤＮＡ配列および前記細胞毒性分子をコードする前 記ＤＮＡ配列の転写時またはその頃において、その転写を起こす前記アンチセン ス配列を制御するプロモータからなる組換えＤＮＡ分子で形質転換された適切な 雄性徳性植物と前記雄性不稔性植物を交雑し、それによって、細胞毒性分子をコ ードする前記ＤＮＡ配列のハイブリッド植物における発現を阻害することによっ て、復旧された雄性稔性を有するハイブリッド種子を産生ずる方法を提供する。 アンチセンス配列を制御するプロモータは、好適には、細胞毒性分子の産生を制 御する同一花粉特異的プロモータである。誘導的かつ構成的プロモータ類は、ま た。 前記アンチセンス配列の発現時期を制御するためにも有利に使用することができ る。 したがって、本文で特許請求した不発明のもう一つの面の１態様によれば、我々 は、遺伝的に形質転換されることができる花粉産生植物類の種から雄性不稔性植 物を産生ずる方法を提供し、この方法は、（ａ） （１）花粉特異的プロモータ、 （２）細胞毒性分子をコードするＤＮＡ配列、（３）前記ＤＮＡ配列の転写時に おいて終止シグナルを定義するターミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子を前記植物の植物細胞のゲノムに挿入すること、（ｂ ）形質転換された植物細胞を得ること、および（Ｃ）前記形質転換された植物細 胞から遺伝的に形質転換された雄性不稔性の植物を再生すること、 からなる。 先の方法によれば、不発明は、また、 （１）上記の段ｉ　（ａ）に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換されかつ雄性不 稔性植物に再生可能な植物細胞、および （２）上記の段階（ａ）に記載の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子で形質転換されかつ雄性 不稔性である植物、 に関する。 本文に特許請求された本発明のもう一つの面によれば、我々は、遺伝的に形質転 換されることができる種の花粉産生植物類から復旧雄性稔性を有するハイブリッ ド種子を産生ずる方法を提供し、この方法は、（ａ）分化した植物個体に再生可 能な前記花粉産生植物の植物細胞ゲノム中に、前記植物に対し化学薬剤または生 理的ストレスに対する耐性を付与する遺伝子、およびこの遺伝子に対して連結し 、 （１）細胞毒性分子をコードするＤＮＡ配列、（２）前記植物細胞中において前 記ＤＮＡ配列の転写を起こすように機能する花粉ターゲットプロモータ、 （３）このようなりＮＡ配列の転写時において耕止シグナルを定義するターミネ ータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（ｂ）形質転換された植物細胞を得 ること、（Ｃ）前記植物細胞から遺伝的に形質転換された雄性不稔性植物を再生 すること、（ｄ） （１）上記段階（Ｃ）に記載の遺伝的に形質転換された植物を適切な雄性徳性植 物と交雑させること、 （２）化学薬剤または生理的ストレスを用いて、このような交雑によって産生す れた種子から生長された植物類から、二記段階（ａ）に記載の遺伝子類を含有し ない植物を除去すること、および （３）前記化学薬剤または生理的ストレスの存在下において上記段１ｔｉｉ（ｄ ）　（２）のようにして得られた植物と数世代にわたる交雑を繰り返すことによ って雄性不稔性植物類の数を増加させること、 によって遺伝的に形質転換された植物類の数を増加させること、（ｅ）阿一種か ら選択された適切な雄性徳性植物の植物細胞中に、前記植物に対して化学薬剤ま たは生理的ストレスに対する耐性を付与する遺伝子、８よび前記遺伝子に対して 連結し、 （１）前記細胞毒性分子をコードするＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードする Ｄ　Ｎ　Ａ配列、 （２）段階（ａ）（１）に記載のＤＮＡ配列の転写時およびその頃において段階 （ｅ）（１）に記載のＤＮＡ配列の転写を起こすプロモータ、（３）上記段階（ ｅ）（１）に記載のＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミ ネータ配列、 からなる組換えＩＬｊＡ分子を挿入すること、げ）段階（ｄ）から形質転換植物 細胞を得ること、（ｇ）上記段階（ｄ）に記載の前記形質転換植物細胞から遺伝 的に形質転換された雄性徳性植物を再生すること、 （ｈ） （１）（ｇ）に記載の遺伝的に形質転換された植物を自殖しかつその１殖子孫か ら運性復旧形質に関してホモ接合性の植物を選択すること、２）雄性復旧形質に 関してホモ接合性の前記植物を自家授精させること、３〉数世代にわたり前記植 物の種子を生長させ、遺伝的に形質転換された植物の数を増加させること、 によって、復旧系統を産生ずること、 （ｉ）前記雄性不稔性植物類を前記遺伝的に形質転換された雄性徳性植物類から の花粉で受粉させることによってハイブリッド交雑を行うこと、の段階からなる 。 前記後［日形質に関してホモ接合性の植物の選択は、前記復旧形質を有する遺伝 的に形質転換された植物の釣または単離された小胞子を培養することによって、 好適には選択の前に隔離下に前記植物を自殖することによって、実行することが できる。 ターゲット植物種が異系交雑しない場合上記のように両性を復旧することが特に 望ましい。ターゲット植物種が実際に異系交雑する場合、上記の段階（ｅ）から （ｈ）に記載のように復旧系統を産生ずることが好適であるが、必須と言うわけ ではない。適切な雄性徳性植物と交雑することによって、不稔性ハイブリッド種 子および稔性ハイブリッド種子の混合物からなるハイブリッド種子が、雄性不稔 性を起こす組換えＤＮＡの隔離の故に生成される。存在する徳性植物類は、雄性 不稔性ハイブリッド類の十分な受粉を可能とするであろう。 上記にも述べたように、雄性不稔性植物類および雄性徳性植物類とを交互の列に 植えるハイブリッド種子生産法において、適切な雄性徳性植物類に沿って植えた 畑で雄性不稔性植物類の最終選択（先の方法の段階（ｄ））を行うことがいっそ う簡単であるが、必須というわけではない。したがって、もし適切な雄性徳性植 物類が前記選択薬剤に対して耐性となるように形質転換されるならば、前記薬剤 を雄性不稔性植物類の列に選択的に適用しなければならないことが回避できる。 先の方法によれば、本発明は、 （１）上記段階（ｅ）に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換されかつ復旧形質を 有する雄性徳性植物に再生できる植物細胞、（２）上記の段階（ｅ）に記載の組 換えＤＮＡ分子によって形質転換されかつ復旧形質を有する植物、および （３）上記の段階（ａ）および（ｅ）に記載の遺伝子類含有ハイブリッド種子、 に関する。 花粉特異的細胞毒性に関連する方法の改良およびさらに態様に付いては、次に検 討する。 ひとつの改良は、電粉粒子に対して有害であるかまたは毒性である分子類の性質 に関する。リシンおよびジフテリアトキシンのような細胞毒に加えて、アブ１ノ シンはそのもう一つの例であり、これらの物質類には、リボヌクレアーゼ、ＤＮ Ａ５ｅ、リパーゼまたはプロテアーゼのような分解切または破壊件の酵素、ポリ リシンまたはポリプロリンのような紀胞質一体性を障害するがまたは不安定とす る分子類、または細胞毒性分子に分解するクリプトサイトトキシン類が挙げられ る。クリプトサイトトキシン類の例として、切断されたときに細胞毒性である分 子類の切断可能複合体類、例えば、グルクロネートおよびある除草剤（例　グル ホセート）の切断可能複合体、ナフタレン−アセトアミドおよびインドール−ア セトアミドが挙げられる。 したがって、花粉ターゲットプロモータを用いて、改良サイトトキシン類のいず れかをコードする遺伝子の発現を制御し雄性不稔性植物類を産生ずること、およ び前記雄性不稔性植物類をいかなる適切な捻性雄性植物とも交雑し雄性不稔性お よび雄性稔性種子の混合物からなる種子を産生ずること、または前記雄性不稔性 植物類を復旧系統と交雑することにより両件ハイブリッド種子を生成することに よって、先の方法を実行することが可能である。 使用できる復旧系統の型の変異について次に検討する。 最初に、細胞毒性に関して、適切な復旧系統は、解毒分子の産生をコードするＤ ＮＡ配列含有１１日植物類からなる。第２に、破壊酵素類に関して、適切な復旧 系統は、特定酵素阻害剤産生をコードするＤＮＡ配列含有復旧植物類からなるこ とができる。第３に、細胞質破壊分子類に関して、適切な復旧系統は、特定ペプ チダーゼの産生をコードするＤＮＡ配列含有復旧植物類からなることができる。 したがって、雄性不稔性植物類を産生ずる細胞ａｔ性法は、花粉機能の混乱また は花粉一体性の破壊を起こすことができる分子類の花粉特異的合成に関連し、が っ、対応する復旧方法には、花粉機能の混乱または花粉一体性の破壊を起こすこ とができる前記分子類を特異的に阻害し、中和しまたは破壊する分子類を花粉特 異的に合成することを伴う。 前駆クリプトサイトドキン法に関して、復旧系統は、復旧がクリプトサイトトキ シン分子の不在下において植物類を生長させることによって達成できるので、必 ずしも必要ではない。上８己細胞毒性法のいずれに関してもクリプトサイトドキ ン法を含めて上記に述べたように、雄性不稔性系統を適切な雄性稔性系統と交雑 させ稔性種子および不稔さ種子との混合物からなるハイブリッド種子を得る場合 、復旧系統を使用することは必須ではない。 要約すれば、我々は、形質転換されかつ分化した植物個体に再生可能な花粉産生 植物類の種から復旧された雄性稔性を有するハイブリッド種子を生産する方法を 提供し、この方法は、 （ａ） （１）分化した植物個体に再生可能な前記花粉産生植物の植物細胞ゲノム甲に、 前記植物に対し化学薬剤または生理的ストレスに対する耐性を付与する遺伝子、 および前記遺伝子に対して連結し、 （Ａ）転写されかつ翻訳された時に細胞Ｓ性分子または物質を細胞ｉ性とする分 子をコードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）発生通稈中の花粉において前記センス遺伝子の転写時またはその頃におい て前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように機能する花粉ターゲラ）・プ ロモータ、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（３）形質転換された植物細胞を得 ること、および（４）上記（ａ）（２）において記載された前記ＤＮＡ配列によ って遺伝的に形質転換されかつ雄性不稔性である植物を前記植物細胞から再生す ること、および （ｂ） （１）段階（ａ、）に記載の前記遺伝的に形質転換された雄性不稔性植物をその 組織外植体を用いたクローン繁殖、またはその他の血２ど上皿繁殖技術、（Ａ） （ａ）に記載の遺伝的に形質転換された雄性不稔性植物を同質遺伝子（ｉｓｏｇ ｅｎｉｃ）雄性稔性植物と交雑させること、（Ｂ）このような交雑によって産生 された種子から生長された植物類から、（ａ）（２）に記載の化学薬剤または生 理的ストレスを用いて上記（ａ）（２）に記載のＤＮＡ配列を含有していない植 物を除去すること、および（Ｃ）前記化学薬剤または生理的ストレスの存在下に おいて上記段階（ｄ）（２）のようにして得られた植物と数世代にわたる交雑を 繰り返すことによって雄性不稔性植物類の数を増加させること、 によって遺伝的に形質転換された植物類の数を増加させること、（Ｃ） （１）分化し植物個体に再生可能な適切な難性親植物の植物細胞ゲノム９に、（ Ａ）前記遺伝的に形質転換された型性親植物において花粉形成または機能に重大 な組織に引き起こされた混乱を無効とする分子をコードする遺伝子、ＣＢ＞花粉 形成または機能に重大な前記組織中において、（ａ）（１）に記載のセンス遺伝 子が活性である時またはその頃において、前記遺伝子のＲＮＡへの転写を起こす プロモータ、好適には花粉ターゲットプロモータ、および好適には、（Ｃ）上記 段階（ｅ）（ｉ）に記載のＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを定義する ターミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子に連結し、前記植物に対し化学薬剤または天然または 人為的に誘発された生理的ストレスに対する耐性を付与する遺伝子を挿入するこ と、 によって、雄性不穏さ復旧植物を産生ずること、（ｄ） （１）上記段１（ｃ）に記載の復旧形質を有する前記形質転換植物細胞を１殖す ることおよび前記復旧特性に関してホモ接合性の植物を選択しかつ前記植物を隔 離下における１殖によって増加させること、または、（２）適用されるときには 、（Ｃ）に記載の復旧形質を有する遺伝的に形質転換された植物の約または単離 した小胞子を培養しかつ復旧形質に関してホモ接合性の植物を選択することおよ び前記植物を隔離下の１殖によって増加させること、によって遺伝的に形質転換 された雄性稔性復旧植物類の数を増加させること、（ｅ）（ａ）に記載でかつ（ ｂ）で増加された前記雄性不稔性植物類を（ａ）（２）に記載の化学試薬または 生理的ストレスの存在下において、（もし必要であれば）（Ｃ）に記載でかつ（ ｄ）で増加した雛性稔性復旧植物類からの花粉によって受粉することによってハ イブリッド交雑を行うこと、からなる。 ターゲット植物種が異系交雑しない場合、上記に記載のように両性を復旧するこ とが望ましい。ターゲット植物種が実際に交雑する場合、上記の段Ｎ　（ｅ）か ら段Ｎ　（ｅ）に記載のように復旧系統を産生ずることが好適であるが、必須と 言うわけではない。適切な雄性稔性植物との交雑は、雄性不稔性を起こす組換え ＤＮＡの隔離の故に、不稔性ハイブリッド種子および稔性ハイブリッド種子の混 合物からなるハイブリッド種子を産生ずるであろう。存在する稔性植物類は、雄 性不稔性ハイブリッド類の十分な受粉を可能とするあろう。上記にも述べたよう に。 復旧は、また、クリプトサイトトキシン法に必要ないであろう。 上述の方法によれば、細胞毒性分子は、活性であるときに正常細胞機能を障害し その結果細胞死を招くいかなる分子であフても良い。このような細胞毒性分子類 の作用は、アンチセンス遺伝子を用いて細胞毒性分子の発現を制御することによ って無効とすることができる。これとは別に、このような細胞毒性の作用は、前 記細胞毒性分子をブロックし、阻害し、または破壊する無効分子をコードする遺 伝子によって無効とすることができる。このような細胞毒性分子類および無効分 子類の例として、プロテイナーゼ酵素トリプシンおよび大豆またはササゲトリプ シン阻害剤、リボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ阻害剤、またはアルファ ーアミラーゼおよびアルファーアミラーゼ阻害剤のようなスターチ分解酵素であ る。 クリプトサイトトキシン法の特定態櫂を次に検討する。 理論的には、非毒件物質を毒性物質に変換できる１種以上の同定可能ＤＮＡでコ ードされることが公知である全ての活性が、不発明の範囲内で用いられる。これ には、酵素インドールアセトアミドヒドロラーゼ（工ａＭＨ）をコードする花粉 特異的組換えＤＮＡ分子で植物を形質転換することによって発生中の花粉を■Ａ Ａ（インドール酢酸）またはＮＡＡ　（アルファーナフタレン酢酸）の細胞毒性 効果に感受性とする方法が含まれる。Ｍ素ＩａＭＨの一つの供給源として、菌１ グ旦バ交テ亙ｌムニ乏λ二差フｌ之工之区」込　ｒｏｂａｃｔｅ工１ｕｍ　ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　（工ｎｚｅ、Ｄ、、　ら、１９８４．モレキュラー−ｃン ド、ジｘネーｙルージエネテイ’）ス（Ｍｏｉ　Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＴ−、）Ｌ９ ４　：２６５−７４）がある。この酵素は、非毒性インドールアセトアミドをＩ ＡＡまたは非毒性ナフタレンアセトアミドをｌｌ性ＮＡＡに変換するであろう。 これとは別に、不発明は１、酵素メトキニンデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）をコー ドする花粉特異的組換えＤＮＡ分子で植物類を形質転換することによって、発生 中の花粉をメトキシビニルグリシンの細胞毒性効果に対して感受さとすることが できる。ＭＤＨの一つの供給源として、菌乞ユニ」」Ｊ≦Ｌじ仁−肚虻１す（Ｒ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ　Ｍａｒｇｒａｆｆ、Ｒ，、ら、 １９８０、エクスペリメンチア（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ）、３６：４８６） がある。ＭＤＨは、非毒性２−アミノ−４−メトキシ−ブタン酸（メトキニン） を毒性のメトキシビニルグリシンに変換する。 これとは別に、本発明は、また、醒素すゾビトキシンシンターゼをコードする花 粉特異的組換えＤＮＡ分子で植物類を形質転換することによって、発生中の花粉 をリゾビトキシン（２−アミノ−４−７２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル］ −トランス−３−ブタン酸）の細胞毒性効果に対して感受性とすることができる 。 本シンターゼのひとつの供給源として、菌し　・ぐ゛　ボ果１１工Ｌｌｈ１１− ｂｉｕｍ　’ａ　ｎｉ　ｍ　（Ｏｗｅｎｓ、Ｌ、Ｄ、ら、１９７３．　ウイード サイエンス（Ｗｅｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅ）、２１：６３−６６）がある。リゾビ トキシンシンターゼは、２−アミノ−４−メトキシ−ブタン酸をリゾビトキンに 変換する。 これとは別に、不発明は、また、非毒性グリホセート−グルクロン酸複合体から グリホセート放出する酵素ベータ・グルクロニダーゼをコードする花粉特異的組 換えＤＮＡ分子で植物類を形質転換することによって、発生中の花粉をグリホセ ート（Ｎ−［ホスホメチルコグリシン）の細胞毒性効果に対して感受性とするこ とができる。 先の方法によれば、本発明は、また、上記の段階（ａ）および／または（Ｃ）に 記載の組換えＤＮＡによって形質転換された細胞、上記の段階（ａ）および／る 。 区面！睨亜 図１は、トランスジェニック植物類においてベータ・グルクロニダーゼ遺伝子活 性のアンチセンスＲＮＡ阻害のために使用されるアンチでンス遺伝子ベクターの ｍ築を示したものである。 ［Ｚ１２ａは、　−ゝ　−Ｂａ１ａｎａｏｕ）ゲノムライブラリから単離された 小胞子特異的クローン、クローン番号Ｌ４の制限地図およびコード領域の概略図 面である。このクローンは、単一遺伝子の３つの類似コピーを含んでいる。これ らの遺伝子類は、Ｂｐ４Ａ、Ｂｐ４ＢおよびＢｐ４Ｃとして同定されている。第 １　（Ｂｐ４Ａ）および第３　（Ｂｐ４Ｃ）の遺伝子類は機能的であり、第２の 遺伝子は、それを非機能性とする可能性が非常に高い改変を有している。制限地 図は、非転写領域が単線で示され、一方、転写領域は枠で囲んだ範囲として示さ れ、図式的に示されている。第２の遺伝子（Ｂｐ４Ｂ）は、配列相同性に基づき 同定されかつ点線の枠で囲んだ範囲として示される。記号″ｄｅ１２２０”は、 このクローンに３いて第２遺伝子（Ｂｐ４Ｂ）をおそらく不活化したおよそ２２ ０の塩基対の欠失／再配置を意味している。転写の開始は各枠で囲んだ範囲の最 も左側に位置しており（遺伝子Ｂｐ４Ｂの場合を除く）、およびエクソンおよび イントロン位置は黒で塗りつぶされたエクソンによって示されており、かつイン トロン位置は、塗りつぶされていない。小さな矢印は、各遺伝子の非転写５′領 域上に描かれており、この矢印先端は、各遺伝子のプロモータ領域を示している 。制限部位は、制限酵素認識部位の第１番目のヌクレオチド番号を示すように、 明示されている。全ての制限部位が示されているわけではなく、本文に詳細に示 した＃Ｉ築体に関連するもののみを示している。遺伝子類は、左側に５°領域を 右側に３′領域を示しである。ＤＮＡ配列の番号付けは、金側において左から右 に、５°から３゛に行われている。 図２ｂは、　−ゝ　・　Ｂｒａｉａ　）ゲノムライブんでいる。転写の開始、エ クソン・イントロンおよびプロモータ位置は、Ｊ２ａに示した通りである。制限 部位は、制限酵素認識部位の第１のヌクレオチド番号を示すように、明示されて いる。この遺伝子類は、左側に５′領域をおよび右側に３′領域を示しである。 ＤＮＡ配列の番号付けＣよ、金側において左から右へ、５′から３′へ行われて いる。 面２Ｃは、−ゝ　−Ｂｒａ　ｓｉ　ａ　ｎａｏｕ　）ゲノムライブラリから単離 された小胞子特異的クローンであるクローン番号Ｌ１６の制限地図およびコード 領域を概略示したものである。このクローンは、クローンＬＬＯに類似性を示す 単一の遺伝子を含有している。イントロンおよびエクソン位置は、１図と同様に 示しである。制限部位類は、制限酵素認識部位の第１のヌクレオチド番号を示す ように明示されている。この遺伝子類は、左側に５゛領域をおよび右側に３゛領 域を示しである。ＤＮＡ配列の番号付けは、金側において左から右へ、５′から ３゛へ行われている。 図２ｄは、　−ぐ　・　Ｂｒａ　ｉ　ａ２ふ１〕ゲノムライブラリから単離され た小胞子特異的クローンであるクローン番号Ｌ１９の制限地図およびコード領域 を概略示したものである。このクローンは、１個の遺伝子を含んでいる。転写の 開始、エクソン・イントロンおよびプロモータ位置は、１図に示した通りである 。＃限部位は、ＷｆＪ限酵素認識部位の第１のヌクレオチド番号で示すように、 明示されている。この遺伝子類は、左側に５′領域をおよび右側に３′領域を示 しである。ＤＮＡ配列の番号付けは、金側において左から右へ、５°から３′へ 行われている。 図３ａは、図２ａに示したクローンＬ４の完全なヌクレオチド配列である。コー ド鎖のみが明確とするために示されている。 図３ｂは、図２ｂにおいてアンダーラインを付した図面に示したクローンＬ１６ の部分のヌクレオチド配列である。コード鎖のみが明確とするために示されてい る。 図３ｄは、図２ｄにおいてアンダーラインを付けた図面に示したクローンＬ１９ の部分のヌクレオチド配列である。コード鎖のみが明確とするために示されてい る。 図４は、−ぐ　−Ｂｒａｓ　ｉｃ　ｎａｏｕ　）のｔＪｓ胞子由来ＣＤＮＡライ ブラリから単離した３種のｃＤＮＡクローン類のヌクレオチド配列である。これ らのクローン類は、ｃＢｐ４０１．ｃＢｐ４０５．およびＣＢｐ４０８と命名さ れている。これらの３種のｃＤＮＡクローン類は、Ｌ４　ヱ之ｚユニＢｒ１ｃｎ 　）小胞子特異的遺伝子族（Ｂｐ４Ａ、Ｂｐ４Ｂ、Ｂｐ４Ｃ）の構成員に極めて 相同性である。これらの３櫂のＬ４　グラぐ　・　Ｂｒ　ｉ　ｎ　ｕｓ）小胞子 特異的遺伝子族の２つのヌクレオチド配列をこの図面に示した（Ｂｐ４．Ａ、Ｂ ｐ４Ｃ）。この遺伝子Ｂｐ４Ｃは、比較のためのマスター配列として選択された 。遺伝子Ｂｐ４ＡおよびＢｐ４Ｂの推定ヌクレオチドコード配列は、前記遺伝子 類の２つのエクソンがインビボで正常にスプライスされる位置においてともにス プライスされた配列として示しである。これによって、成熟ｍＲＮＡにおいてコ ード配列を生じることになる。このｃＤＮＡクローン類は、ヌクレオチド変化の みが示されるように、１３ｐ４Ｃの配列と並列されている。この配列類は、従っ て、ライン１上で示される遺伝子Ｂｐ４Ｃの単一マスター配列の変異として示さ れる。ＡＴＧ開始コドンならびにＴＧＡまたはＴＡＡ終止コドンには、アンダー ラインがつけである。これらの３種のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａり白−ン類は　−’　−Ｂ ｒ５ｉａ　ｕＳ）小胞子特異的遺伝子の関連構成員に対応し、その一部分はクロ ーンＬ４に含まれている。 図５は、クローンＬ１０に含有される遺伝子に緊密に相同性であるｃＤＮＡクロ ーンの部分的ヌクレオチド配列であり、その制限地図は、図２ｂに示されている 。 １！１６は、クローンＬ１９の遺伝子産物であるｃＤＮＡクローンのヌクレオチ ド配列であり、その制限地図はｌｉｔ！１２ｄに示されている。 図７　（７Ａ、７Ｂ、７Ｃ，７Ｄ）は、クローンＬ４からのプロモータおよびプ ロモータ領域を含有するベクター類の産生な概略記載したものである。特定実施 例については、下記でさらに詳細に検討する。 図８は、クローンＬＩＯのプロモータ領域を含有するベクターの産生方法を概略 示したものである。 ［ｆｆ１９ハ、りｏ−ンＬ１９のプロモータ領域を含有するベクターの産生方法 を概略示したものであり、その詳細に付いては下記Ｓこ述べる。 図１０は、発生過程中の花粉細胞を含めた全細胞において高レベルで構成的に発 現される遺伝子を含有する１１ｚ友二カズ２ｊ−Ｂ　、ニー益−５ｓｉｃａｎ− 倶見■）ゲノムクローンの制限地図を概略示したものである。アンチセンスＲＮ Ａの産生のためのプロモータ領域を提供するために使用されるクローンの部分が 示されているが、この構築体は、この遺伝子から転写されたＲＮＡの領域を含有 するアンチセンスＲＮＡを生じる。 図１１は、ポリリシンタンパク質をコードする遺伝子を産生ずる概略を示したも のである。 ！１２は、クローンＬ１９のイントロン領域に特異的なアンチセンス遺伝子およ びアンチセンスＲＮＡ’ＪＩ害の樟的としたイントロン領域を欠失する復旧遺伝 子を産生ずる概略を示したものである。 図１３は、ヱグ旦’ｉ−１−−ｊフ−１）≦Ｌン　Ａ　ｒｏ’ｏａｃｔｅｒＬｕ ｍ　ｔ　ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ遺伝子２（ＩａｍＨ 遺伝子）を単離するために使用される操作およびこの遺伝子のプロモータを有し ていない変種（バージョン）の産生を示したものである。 図１４は、リシンＡ鎖コード領域の変種（バージョン）を含むクローンの産生を 概略示した七のである。 ！！１１５は、センスおよびアンチセンスＧＵＳ遺伝子類で形質転換された植物 中におけるＧＵＳ活性を示すヒストグラムである。 区１ａ臣柾ｌ説所 図１において、アンチセンスベクターＰＡＬ１３０２の産生を概略示した。アン チセンス方向においてＣａＭＶ３５Ｓによって隣接されたＧＵＳ遺伝子（べ一ダ グルクロニダーゼ、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、Ｒ，Ａ、、プランドモレキュラー・バ イオロジー・レポーター（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。 ｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）、１９８７，５：３８７−４０５）およびｎｏｓ”ｔ ｅｒＨ止シグナルを含有するプラスミドが、ベクターｐＢＩ２２１．１　（クロ ンテックラボラトリズ（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃ：１　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、 　バ。 アルド、ＣＡ、ＵＳＡ）から得られた。ＣａＭＶ３５Ｓプロモータおよびベクタ ーｐＢＩ２２１．１のｎｏｓ　ｔｅｒの間に見られるＧＵＳコード配列を制限酵 素ＳｍａＩおよび５ｓｔＩによって切断消化した。Ｓｓｔ　Ｉ部位は、ＤＮＡポ リメラーゼエのフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いて平滑末端とし、この平滑 末端ベクターおよびＧＵＳコーツー列を再度連結した。（：ａ：ＭＶ３５Ｓブロ モ〜りの転写の方向に関して逆転されたＧＵＳコード配列含有プラスミド（ｐＰ ＡＬ３０３）が同定された。 アンチセンスＧＵＳ遺伝子を含有する２元ベクターＰＡＬ１３０２は、ベクター ｐＶＵ１０１］、（ブラントブリーディングインスチチュート（ＰＬａｎｔ　Ｂ ｒｅｅｄｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ）を 用いて構築された。ｐＶＵｌｏｌｍは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータによって隣接 されたハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼのコード配列を含有しており 、そしてこのｎｏｓ　ｔｅｒは、Ｂｅｖａｎ、Ｍ、、ヌクレイツクアシッドリサ ーチ（Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１９８４．１２：８７１１−８７２１ に記載の１グ且Δターテ謀シ乙にユＡＪ　ｒ　ｏ　ｂａ　ｅ　ｔ　ｅ　ｒ　ｉ　 ｕ亀）のポリリンカーに挿入される。ベクターｐＶＵ１０１１は、形質転換され た植物細胞に対してハイグロマイシンおよびカナマイシン耐性を付与できる。Ｃ ａＭＶ３５ＳプロモーターアンチセンスＧＵＳｎｏｓ　ｔｅｒ断片のｐＶＵｌｏ ｌｌへの挿入は、このベクターのＮ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ遺伝子を不活化するようにし て行われ、そして、下記のようにして実行される。右側境界（ＲＢ）、ＮＯＳプ ロモータおよびｐＶＵｌｏｌｌのＮＰＴＩＩコード配列の始点を含有する５ｐｈ Ｉ−ＰｓｔＩ制限小断片は、最初にｐＰＡＬ　３０３のＣａＭＶ３５Ｓプロモー タに先行する５ｐｈｉおよびＰｓｔ１部位にサブクローン化され、ｐＰＡＬ３０ ６を形成した。ｐＰＡＬ３０６の５ｐｈＩお、ｌびＥｃｏＲＩによる消化ニヨッ テ、ＲＢ、ＮＯＳプロモータ、Ｎ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ　：１−ド配列の始点およびＣ ａＭＶ３５Ｓプロモータ・−アンチセンスＧＵＳｎｏｓｔｅｒｍ築体からなる断 片を遊離させた。この断片は次に、ＥｃｏＲＩおよび５ｐｈＩによって切断され た連結ｐＧＥＭ４ｚを付加することによってｐＶＵｌｏｌｌの５ｐｈＩ部位にそ れぞれ連結され、ｐＶＵｌｏｌｌの５ｐｈＩ部位とｐｐＡＬ３０８のＥＣｏＲＩ 部位との間の架橋としてのポリリンカーｔＪｓ断片を提供する。挿入物の方向は 確認し、再構築ＲＢ断片およびＣａＭＶ３５Ｓによって不活化されたＮ　Ｐ　Ｔ 　１１遺伝子を有する２元ベクター（ＰＡＬ１３０２）−アンチセンスＧＵＳ遺 伝子−ｎｏｓ　ｔｅｒ−挿入物を確認した。このベクターは、植物に対してハイ グロマイシン耐性のみを付与することができ、かつ、アンチセンスＧＵＳ遺伝子 を有している。 １！１２ａ−ｄにおいて、１ユ２友二丈ノスＪＢｒａ　ｉ　ｎ　ｕ）由来の４つ の小胞子持異的クローン類内部に含有される遺伝子類の方向は、５゛から３′で ある。示したように、この５′領域はプロモータ領域に対応しており、小矢印に よって示されている。この３′領域は前記遺伝子の転写の終端を示している。ク ローンＬ４．ＬＩＯおよびＬｉ２は、小胞子特異的プロモータ断片類の単離のた めおよび小胞子特異的コード領域の単離のために使用した。この非転写領域は細 線で示されており、一方、転写されるクローン類の領域は、枠で囲んだ範囲によ って区別されている。この枠で囲んだ範囲内部において、エクソン領域を示す転 写ＤＮＡの部分は黒で塗りつぶして明らかとし、一方、イントロン配列類はその まま塗りつぶしていない。クローンＬＩＯ，Ｌ１６およびＬｉ２の為に配列され たＤＮＡのおよその領域は、アンダーラインによって示しである。同定した制限 部位は、下記に示した構築体に関連している。ラムダクローンユングベクター類 の右および左腕は、示していない。 図３ａ−ｄにおいて、クローンＬ４の完全なりＮＡ配列は、図２ａ−ｄにおいて 確認したクローンＬＩＯ，Ｌ１６および？、１９の部分のＤＮＡ配列とともに示 しである。図３ａにおいて、完全配列のクローンＬ４のヌクレオチド１は、最も 左側のＥｃｏＲＩ部位にあり、一方、ヌクレオチド８５７９は、最も右側のＥｃ ｏＲＩの第１番目のヌクレオチドである。クローンＬ４の遺伝子１の転写の開始 は、ヌクレオチド２３５である。５′および３′ゼインロンスプライス部位は、 太字で示しである。開始ＡＴＧコドンは、停止終止コドンとともに示されている 。 これらの遺伝子によってコードしたタンパク質類の推定アミノ酸配列がまた示さ れている。遺伝子１の転写末端は、およそヌクレオチド１４２７である。クロー ンＬ４の第２番目の遺伝子は、プロモータおよび第１エクソンの領域において起 こる挿入および欠失により非機能性である可能性が極めて高い。この遺伝子は、 構築体類のために利用されなかった。クローンＬ４の第３番目の遺伝子は、この ＤＮＡ配列の６２９８位に転写始点を有し、転写は大体ヌクレオチド７４９ｏで 終わる。ＡＴＧ開始コドン、インにロンスプライス部位類および終止停止コドン は、上記のように全て同定されている。ベクターは、遺伝子１および２の双方か らのプロモータ断片ならびに第１エクソンおよびイントロン配列類および各遺伝 子の第２エクソンの短い部分を含む遺伝子１および２由来プロモ一タ断片を用い て、このクローンから構築された。特異的プロモータ断片構築体を下記に示す。 １！１３ｂに３いて、図２ｂに区別したクローンＬＩＯの領域のヌクレオチド配 列を示しである。転写の開始はヌクレオチド１である。この配列において、ＡＴ Ｇ開始コドンはヌクレオチド４５−４７であり、第１のエクソンはヌクレオチド ３１５で終わり、第２のエクソンはヌクレオチド４７６で始まり、ヌクレオチド １５８６にまで延びている。第３のエクソンは１６７３で始まり、ヌクレオチド １９８９にまほぼ延びている。転写の精確な終端は決まっていなかった。推定ア ミノ酸配列も同様に示しである。一部のプロモータ構築体に付いて、配列決定さ れた部位に対するクローン５′領誠を使用した。この構築体の特異的詳細に付い ては下記に示しである。 図３Ｃに３いて、クローンＬ１６のヌクレオチド配列が示しである。クローンＬ １６は、特にタンパク質配列をコードする２つのクローン類の部位において、ク ローンＬ　１．０に対して実質的相同性を示す。この２つのクローン類のイント ロン配列は、しかし、実質的に異なっている。クローンＬ１６は５′プロモータ 領賊を含有しておらず、そのようなものとして、アンチセンスＲＮＡＷｌ築体類 のためのコード配列耀の供給源としてのみ使用された。ヌクレオチド１は、クロ ーンＬＩＯの第１エクソンに相同性のＤＮＡのコード領域で起こるＥｃｏＲｆｆ 部位を区別する。相同であることによって、このコード領域はヌクレオチド１２ ４にまで延びており、そこに第１イントロンが位置している。このイントロンは 、クローンＬＩＯの第１イントロンとして同一の相対位置にあり、クローンＬＩ Ｏのイントロンよりも長く、ヌクレオチド６８８にまで延びている。ヌクレオチ ド６８９は第２エクソンの始点であり、これは、クローンＬＩＯの第２エクソン に対して強い相同性を示しており、ヌク１ノγチド１７９３にまで延びている。 この点において第２のイントロンがあり、このイントロン；よヌクレオチド１９ ０９にまで延びている。第３のエクソンは１９１０で開始し、およそヌクレオチ ド２２１０にまで電びている。推定したアミノ酸配列は、クローンＬｉＯに実質 的相同坩を示すクローンの特異的領域のために示しである。転写が停止するヌク レオチドの詳細については、決定されていない。　゛図３ｄにおいて、ｆｆ１２ ｄで区別したクローンＬ１９の領域のヌクレオチド配列を示しである。転写の開 始は、この配列の１位に局在している。ＡＴＧ開始コドンは、ヌクレオチド１３ ６−１３８であり、第１イントロンは、ヌクレオチド１２０１で開始する。転写 は、およそヌクレオチド２０７４で停止する。ごのイントロンは、第２のエクソ ンが開始するヌクレオチド１３３８で終わる。推定アミノ酸配列を同様に示した 。 図４において、クローンＬ４に含まれる遺伝子煩に相同の３種のｃＤＮＡクロー ンのＤＮＡ配列を示しである。これらの３種のｃＤＮＡクローン類のＤＮＡ配列 ならびにゲノムクローンＬ４において遺伝子Ｂｐ４ＡおよびＢｐ４Ｃの正確にス プライスされた転写領域類の配列が１直線となり、これらのクローンのヌクレオ チドの違いを示してあり、この配列類の間で保存されているヌクレオチド類は上 列配列上においてのみ示しである。図４に示した星印は、ｃＢｐ４０１．ｃＢｐ ４０５およびｃＢｐ４０８のｃＤＮＡクローン類の５゛末端をマークしている。 図５において、クローンＬＩＯのコード領域に相同のｃＤＮＡクローンの部分ヌ クレオチド配列を示しである。このｃＤＮＡクローンは、およそ長さ１．３Ｋｂ でありｃＤＮＡクローニング操作において合成リンカ−類を介して付加されたｃ ＤＮＡ配列の５′および３′末端類においてＥｃｏＲ１部位を有している。 図６において、クローンＬ１９のコード領域に対応するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローン のヌクレオチド配列を示しである。この配列においてＬｉ２の転写領域の５′末 端に存在するＥｃｏＲＶ部位が確認されている。ポリＡ末端配列の一部分を示し である。ｃＤＮＡクローニング操作においてリンカ−として付加されたＥｃｏＲ ４部位は示していない。これらの部位はｍｃＤＮＡクローンの５”および３′末 端に隣接して存在する。 ７図（ａ、’Ｄ、Ｃ，ｄおよびｅ）において、クローンＬ４田来プロモータおよ びプロモータ断片類を含有するベクター６個の構築を記載しである。これらのベ クター類の構秀における最初の段階は、このベクターのポリリンカーのＥｃｏＲ ニー５ＳｔＩ部位を用いて、商業的に入手可能なベクターｐＧＥＭ４ｚ　（プロ メガ、バイオチック、マジソン、ＷＩ、ＵＳＡ）においてクローンＬ４の第１遺 伝子（プロモータ／エクソン／イントロン／第２エクソンの塩基対２３５個）を 含有するＥｃｏＲＩ−３ｓｔＩ　（ヌクレオチド１−２１３２）断片を最初にサ ブクローニングすること（こよって達成された。このプラスミドをｐＰＡＬＯ４ ０２と命名した。第３の遺伝子（Ｂｐ４Ｃ）を含有するクローンＬ４のＥ　ｃ　 ｏ　Ｒ，Ｉ断片２．７に’ｏ　（Ｂｐ４（）を次にｐＧＥＭ　４ｚのＥｃｏＲＩ 部位にクローン化し、ｐＰＡＬＯ４１１と命名したプラスミドを生成した。この プラスミドｐＰＡＬ。 ４０２を次にＥｃｏＲＩで消化し、そしてこのｐＰＡＬＯ４１１田来２．　７ｋ ｂのＥｃｏＲＩ斯片（ヌクレオチド５８５９−８５７９）はクローンＬ４由来の 遺伝子番号３　（Ｂｐ４Ｃ）を含有しており、それに付加された。第１遺伝子の プロモータ領域に関して両方向に挿入された２、７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含有 するクローン類を回収した。第１の遺伝子においてこのプロモータに第３の遺伝 子由来プロモータが対向するような方向にある１１３の遺伝子断片を含有するク ローンを選択し、ｐＰＡＬ０４０３と命名した。このプラスミドｐＰＡＬＯ４０ ３は、ｐＰＡＬＯ４０３における第１の遺伝子の塩基対２３５個のプロモータ領 域をｐＩ’ＡＬ３０６の０４０３の第１遺伝子のプロモータ領域の塩基対２３５ 個に直接隣接して有するように韮ぺられたクローンＬ４由来第３の遺伝子を全て 含有している。このプラスミドｐＰＡＬＯ４０３をＤｄｅＩで消化し、およそ１ ．９Ｋｂの断片を作製した。このＤｄｅＩ部位は、ヌクレオチド３０３および７ ３６６に局在している。これらの断片の方向性のために％Ｄｄｅｒによる消化に よって１゜９Ｋｂ断片が産生ずる。この１．９Ｋｂ断片は、この第３の遺伝子（ Ｂｐ４Ｃ）の転写の方向が右から左に転写されたクローンＬ４　（Ｂｐ４Ａ）の 第１遺伝子由来２３５個の塩基対のプロモータ領域を融合し、転写の主な開始部 位から塩基対６７個だけ下流にあるＤｄｅＩで終わるように並べられた第３遺伝 子（Ｂｐ４Ｃ）する。この１．９に’ｂのＤｄｅＩ断片は、フレノウ新月によっ て平滑末端トサレ、フレノウ断片によって先に平滑天端とされたｐＧＥＭ４ｚの ポリリンカー領域のＸｂａＩ部位にクローン化された。結果として生成したｐＰ ＡＬＯ４０８を回収しかつその後５ａｉｌおよび５ｓｔｌで消化し、これＣ，ｔ 、左ｆ４に（ヌクレオチド７３６６３のＳａｌ　Ｉお゛よび右端に（ヌクレオチ ド３０３）構築体が隣接したクローン化されたＤｄｅ　Ｉ断片を遊離し、さらに 、下記の独自の部位を有するｐＧＥＭ４ｚのポリリンカ一部分を含有している； 　ＢａｍＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩおよび５ｓｔｌ制限酵素部位。このＳａｌ　ｌ −５ｓｔ　Ｉ断片をＰＡＬｌｏｏＩの５ａｌＩ−ＳｓｔＴ部位中にクローン化し た。ＰＡＬｌｏｏｌは、Ｂ　ｉ　ｎ　１９ノポリリンカー領域の５ｓｔＩ−Ｅｃ ｏＲ１部位中においてプラスミドｐＲＡＪ２２１（クロンチックラボラド７ノズ 、バロアルト、ＣＡ　ＵＳＡ）から単離した２６０塩基対の５ｓｔｌ−ＥｃｏＲ １部位としてｎｏｓ　ｔｅｒ’ポリアデニル化シグナルを付加した２元ベクター Ｂｉ、ｎ１９　（Ｂｅｖａｎ、Ｍ、、ヌクレイツクアシズリサーチ、（Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１９Ｂ４，１２：８７１１−８７２１）であ る。このｎｏｓ　ｔｅｒは、点で示した枠の範囲として示しである。ｐＰＡＬＯ ４０８の５ａｌＩ−９ｓｔＩ断片のＰＡＬｌｏｏｌへの挿入の結果生じた２元形 質転換ベクターは、ＰＡ、Ｌｉ２Ｏ２と命名された。この構築の詳細を図７ａに 示した。このベクターｊよ、この第３の遺伝子（Ｂｐ４Ｃ）の転写の方向が右か ら左であり、左から右に転写されたクローンＬ４の第１遺伝子由来２３５個の塩 基対のプロモータ領域を融合し、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎｌおよびＳｓｔ ！その後にｎｏｓ　ｔｅｒシグナルが続いているＤＮＡ挿入のための独自部位を 有するポリリンカーが後続している。このベクターは、余分の５′非コ一ド配列 類がＢｐ４Ａ上において２３５塩基対のコアプロモータに対して上流に配置され ているが、しかしこれらの付加５“配列類が反対の方向性であるという特徴を有 している。これらの配列類のこの方向性における配置によっても、コア２３５塩 基対プロモータの花粉特異性には影響を及ぼさない。 このベクターに加えて、不質的に阿−型の遺伝子プロモータ配列を含んでいるが クローンＬ４の第１遺伝子（Ｂｐ４Ａ）のイントロンも含む類似構造のベクター 類が作製された。植物遺伝子類におけるイントロン配列類は、いくつかの場合に おいて遺伝子発現に役割を果たすことが示されている。このイントロン含有ベク ターは、クローンｐＰＡＬＯ４０２の欠失群を作製することによって構築された 。ｐＰＡＬＯ４０２は、最初に、Ｐｓｔ　ＩおよびＳｍａＩにょフて消化された 。 エクソヌクレアーゼＩＩＩを用いて、示したように（１！７ｂ）ＤＮＡを一方向 的に消化した。Ｓ１ヌクレアーゼによる処理およびフレノウによる修復の後に、 このプラスミドを再度連結し、かつそれらから消化された遺伝子Ｂｐ４Ａのコー ド領域の異なる部分を有するクローン類を回収した。欠失サブクローンを配列決 定した。 一つをベクター構築のために選択した。これを欠失２３Ｂという。このサブクロ ーンは、除去された遺伝子Ｂｐ４Ａの第２エクソンのほとんどを有するが遺伝子 Ｂｐ４Ａのイントロンスプライス部位およびＮ１エクソンを含有する欠失を示し た。このサブクローンは、ヌクレオチドｌからヌクレオチド１１６６まで延びる クローンＬ４の部分を含有している。このサブクローンにｐＰＡＬＯ４１１由来 Ｌ４の第３遺伝子を含有する２、７ｋｂのＥｃｏＲｒ断片を、第３遺伝子の転写 方向が右から左である（ＰＡＬ１１０７．Ｉ）ＰＡＬＯ４０８のように）ように 付加し、左から右に転写されるように方向づけられ、その後に遺伝子１の第１エ クソン、遺伝子１の全イントロンおよびクローンＬ４由来遺伝子Ｂｐ４Ａの第２ エクソンの３３個のヌクレオチドが続くクローンＬ４の第１遺伝子由来２３５塩 基対のプロモータ領域に融合させる。欠失２３Ｂおよび第３遺伝子断片含有２． ７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むこのプラスミドをｐＰＡｉ、０４０６と命名した 。このプラスミドをＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉｌｌによって消化し、これによって、第３ 遺伝子のプロモータの小部分を含有する断片および第１遺伝子の全プロモータ、 第１エクソン、イントロンおよび第２エクソンの一部を含有する断片を生成する 。このＢｉｎｄ■断片は、ＰＡＩｌｏｏＩのＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位中に挿入 し、ベクターＰＡＬ　ｌ　１　：Ｌｏ６となった（欠失２３Ｂ由来）。このベク ターは、第１遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流に局在するＤｄｅＩ部位中の 第３遺伝子由来プロモータ部分、クローンＬ４の第１遺伝子の２３５塩基対の全 プロモータ、次に第エクソン、イントロンおよびクローンＬ４の遺伝子１の第２ エクソン、下記の独自の部位：５ａｌＩ％Ｘｂａ工、Ｂａｍ　１．ＳｍａＩ、Ｋ ｐｎＩおよび５ｓｔｌおよびｎｏｓｔｅｒポリデアニル化シグナルをこの順序で 有している。この構築体をｆｆｉ７ｂに示しである。 クローンＬ４に含有される遺伝子類のプロモータ領域１こよる付加的構築を、遺 伝子配列の花粉特異的発現に有用な適切なベクター類をいくつか提供するために 行った。クローンＬ４内部の３種の遺伝子類（Ｂｐ４Ａ、Ｂｐ４Ｂ、Ｂｒ＋４Ｃ ）は、はぼ極めて正確なりＮＡ相同性を示し、このことは、第１（Ｂｐ４Ａ）ｇ よび第３　（Ｂｐ４Ｂ）遺伝子間で明確である。第２遺伝子（Ｂｐ４Ｂ）は、不 活化をもたらすように見える配列変化を受けた相同コピーである。クローンＬ４ 内の第１、第２および第３遺伝子の間の類似性は、第１および第３遺伝子プロモ ータ領域の最初の２３５個のヌクレオチドにおいて、それらの間で異なっている のはたった５個のヌクレオチドであると言うように、このプロモータ領域におい て保持されている。これらの２種のプロモータ中のＴＡＴＡボックスの下流にお いて、それらの間の唯一の差は、転写開始における１つの付加的ヌクレオチドの 存在のみである。例えば、部分的に・・・・・・・・・・・・Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｇ　 Ｔ　Ｔ　Ｔ　ｔ　Ａ　ＡＡＡ・・・・・・として示されるプロモータＩ　Ｂｐ４ Ａと、部分的に・・・・・・・・・・・・ＴＡＴＧＴＴＴＡｉ八Ａ・・・・・・ へして示されるプロモータ３　Ｂｐ４Ｃとの比較から、アンダーラインをつけた 転写領域と１個のヌクレオチドが下記の場合に異なっていることが示される。し かし、第１遺伝子の配列内部において、クローンＬ４の第３遺伝子の来転写リー ダー配列に存在していないＡＴＧ開始コドンの上流の未翻訳５”リーダー配列内 にＤｄｅｒ部位を挿入するヌクレオチド変化が１個ある。第１遺伝子のこのＤｄ ｅ部位部位別用したキメラプロモータ構築体が作製され、第３遺伝子プロモータ からの配列と組み合わされた。これらの構築体のために使用された第１プロモー タの領域は、ＴＡＴＡボックスの近くの５ｎａＢＩ部位（ヌクレオチド２１）と 第１遺伝子のＡＴ　Ｇ５！始コドンのすぐ上流に局在するＤｄｅＩ部位の間に含 有される配列類からなる（ヌクレオチド３０３は、Ｄｄｅ　Ｉの認識部位中にお いて最初のヌクレオチドである）。このキメラプロモータの他の領域（ＴＡＴＡ ボックスの５“）は、第３のプロモータ（ヌクレオチド５８５Ｂ）のＥｃｏＲＩ 部位からＴＡＴＡボックス近くの５ｎａＢＩ部位（ヌクレオチド６２７３）まで 延びる断片である。したがって、これらの花粉特異的ベクター類の構築を促進す るために、下記の再構築を行った。 クローンＬ４内の第１遺伝子のプロモータ領域をカバ・−するＥｃｏＲ：かうＤ ｄｅＩ断片を、ｐＰＡＬＯ４０２をＤｄｅ工で最初：こ切断し、フレノウでＸＱ Ｉ末端とし、次：こＥｃｏＲｌで−ＪＪ断することによって正確した。この領麓 ：こ対応する２３５塩基対の断片をｐＧＥＭ４ｚのＥ　ｃ　ｏ　ＲニーＳ　ｍ　 ａ　Ｉ　Ｗ位口にクローン化し、た。このブラスミ；　（ｐＰＡＬＯ４２２）を 次：こ’ｆ：、ｃｏＲｒおよびＳｎａ、Ｂ４によって切断した。ＥｅｏＲＩおよ び５ｎａＢ属こよってＩ）ＰＡＬＯ４１１を消化することによって、クローンＬ ４内の遺伝子３に対するプロモータのＥｅｏＲＩから５ｎａＢＩ部分を含有する ＤＮＡ断片を、Ｑｉ［、た。これ：こよって、クローンＬ４からの遺伝子３プロ モータの５゛領域のほとんどを示すおよそ４１５塩基対のＥｃｏＲＩ　（ヌクレ オチド５８５８）から５ｎａＢＩ（ヌクレオチ”、６２７３）断片が、遊離され た（この５ｎａＢ工認識部位は、Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａボックスの下流の２塩基対であ る）。このＥｃｏＲＩ−５ｎａＢｉ：断片を用いて、除去された短いＥＣ０ＲＩ −ＳｎａＢＩ断片を第１プロモータサブクａ−ン（ｐＰＡＬＯ４２２）に置換し 、およそ５５０塩基対のプロモータ断片を再構築した。このプラスミドをＩ）Ｐ ＡＬＯ４２１と命名する。このキメラプロモータ断片は、クローンＬ４内の遺伝 子３のプロモータの４１５塩基対および第１遺伝子プロモータ／禾翻訳リーダー 配列のおよそ９９（１のヌクレオチドを含有している。 花粉特異的カセットベクターの構築のために、下記のプラスミド類を最初に構築 した。第１の構築プラスミドは、１以旦−ユ且エシグナルの前にポリリンカーを 有するｎｏｓ　ｔｅｒポリアデニル化シグナルを含有した。これは、最初にｐＲ ＡＪ２２１からｎＯ８ｔｅｒを５ｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片として単離することに よって達成され、そして、この断片は、前記ポリリンカー中のＳｓｔ　Ｉおよび ＥｅｏＲ１部位を用いてｐＧＥＭ４ｚ甲にクローン化された。このサブクローン を、ｐＰＡＬＯＯｌという。ｐＰＡＬＯＯｌに対して、プラスミドｐＲＡＪ１６ ２由来でネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする断片（ＮＰＴＨ＋ を下記のアンチセンス方向にそれに付加した。プラスミドｐＲＡＪ１６２は、５ ａｌＩ断片として挿入されかつプラスミドｐＵＣ−９（これは、プラントブリー デイングインスチチ：Ｌ　−ト（Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｉｔ ｕｔｅ）、ケンブリッジ、ＵＫから得られた）中においてポリリンカーによって 境界を接しているトランスポゾンＴＮ５からのＮ　Ｐ　Ｔ　工ｉ遺伝子を含有し ている。ｐＲＡＪ　１６２：よ、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｉｌ＋およびＳｍａ　工によっ て消化された。このＮ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ遺伝子含有ＤＮＡ断片を、アガロースゲル からの溶出によって単離した。ｐ　Ｐ　Ａ　Ｌｏｏｌは、ＨｉｎｄｌｌおよびＳ ｍａＩによって消化され、Ｎ　Ｐ　Ｔ！■遺伝子断片を挿入した。結果として生 じたプラスミドはｐＰＡＬＯＯ２とし、下記のような制限部位の方向およびＮ　 Ｐ　Ｔ　ＴＩ遺伝子およびユ」」Ｌ−℃旦ｌ−を有している。＝Ｈ工ＮＤＩ■、 Ｐｓｔ　Ｉ、Ｓａｌ工、３′末端Ｎ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ　：Ｉ−ド配列５′末端、Ｓ ｎａ、Ｉ、ＢａｍＨＩ、Ｓｍａｉ、Ｋｐｎｌ、５ｓｔＩ、ｎｏｓ　ｔｅｒ、Ｅｃ ｏＲＩ。ｐＰＡＬＯＯ２はＨｌ　ｎｄ　ＩＩＩによって切断し、その部位をフレ ノウ断片の使用によって平滑末端とした。ｐＰＡＬＯ４２１は、Ｈｉ　ｎ　ｃ　 ！ＩおよびＰ　ｖ　ｕ　ＩＩによッテ消化し、その両者とも平滑末端を残し、そ してプロモータ断片はＨｉ　ｎ　ａ　ＩＩＩ切断平滑末ｍｐＰＡＬＯＯ２に連結 された。ｎｏｓ　ｔｅｒシグナルに関して両方向のプロモータを含有するプラス ミド類が得られた。適切な方向を有する１プラスミド（５”プロモータ／アンチ センスＮＰＴＩＩ／ｎｏｓ　ｔｅｒ）を選択し、ｐＰＡＬ０４１９と命名した。 ｐＰＡＬＯ４１９は、下記のＤＮＡｆ片を有している。ＳＰ６ブロモータを含有 する少さい（およそ１３０個の塩基対）Ｉ）ＧＥＭ４２．５５０塩基対のキメラ プロモータ、このプロモータに関してアンチセンス方向のＮ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ遺伝 子、次にｎＯ８ｊｅｒポリアデニル化シグナルが続く。このプロモータ／ＮＰＴ Ｈ／ｎｏｓ　ｔａｒ全構築体は、ＥｃｏＲＩで切断可能である。ｐＰＡＬＯ４１ ９をＥｃｏＲＩで切断し、このプロモータＮ　Ｐ　Ｔ　ＩＩｎｏｓ　ｔｅｒｍ造 を、ＢＩＮ１９のポリリンカー中の１個のＥｅｏＲＩ部位を用い、ＢＩＮ１９０ にクローン化した。結果として生成した形質転換ベクターを、ＰＡＬＬ４１９と 命名した。このアンチセンスＮ　Ｐ　Ｔ　Ｉｆ遺伝子に加えて、このベクターは 、ｎｏｓプロモータの制御下に構成的Ｎ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ遺伝子を含有している。 このベクターは、したがって、構成的プロモータの遺伝子発現がＰＡＬ１４１９ 中に含まれるプロモータ／　Ｎ　Ｐ　Ｔ　Ｔ■／　ｎ　ｏ　ｓ　ｔ　ｅ　ｒ構築 体から産生されたアンチセンスＲＮＡによって阻害されている花粉細胞を例外と して、全細胞型に対してカナマイシン耐性を付与する。 付加的遺伝子構築体とともに利用できるプロモータ配列類を提供するために、プ ラスミドｐＰＡＬＯ４１９を５ａｌＩによって消化した。この消化によって、Ｎ ＰＴコード領域を除去し、このＳａｌ　Ｉ消化ｐＰＡＬＯ１４９を再度連結して ｐＰＡＬ０４２０を生成した。Ｉ）ＰＡＬＯ４２０は、下記の独自の部位；Ｈｉ ｎｃｎ、Ｐｓｔ　Ｉ、５ａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、Ｓ　ｓ　’ 、、、　Ｉ、それに続＜ｎｏｓ　ｔｅｒポリアデニル化シグナルを有する遺伝子 類挿入のためのポリリンカーが続いた花粉特異的プロモータを示す。プロモータ ／ポリリンカー／ｎｏｓ　ｔｅｒ全構築体は、単一のＥｃｏＲＩ断片として都合 よく切断できる。 この構築体の詳細をズ７Ｃに示した。 追加の花粉特異的プロモータ構築体類のために、下記の手法を用いた。ラムダク ローニングベクター中の未変性のＬ４クローンは、制限酵素類５ＳｔＩおよびＨ ｈａ工によって完全に消化された。結果として生成した断片類をゲル電気泳動に よって分離し、クローンＬ４内の遺伝子３のプロモータ／第１エクソン／インド ロン／部分的第２エクソン領域を含有しかつクローンＬ４の配列内のヌクレオチ ド４５６５から７２１６までに対応する２−６５ｋｂの断片を単離した。この断 片をフレノウ断片を用いて平滑末端とし、先に記載の二元形質転換ベクターＰＡ Ｌ１００１中にクローン化した。ＰＡＬｌｏｏｌは、Ｈｉｎｄｌｌｌによって最 初に切断しそしてフレノウで平滑末端とした。この断片（プロモータ／第１エク ソン／インドロン／部分的第２エクソン領域）を含むクローンを回収した。転写 の方向がＰＡＬｌｏｏＩにおいてｎｏｓ　ｔｅｒに向いているように適切な方向 にこの断片を含むクローンを１＠選択した。このベクターをＰＡＬ１４２１と命 名した。このベクターは、クローンＬ４において遺伝子３から上流プロモータ領 域のおよそ１．９ｋｂを含有しており、それに続いて第１エクソン、完全なイン トロン、および遺伝子３の第２エクソンの塩基１５個およびそれに続いて下記の 独自の部位：　Ｓａｌ　Ｉ％ＸｂａＩ％ＢａｍＨＩ、Ｓｍａｌ、ｋｐｎＩ、Ｓ　 ｓ　ｔ、　Ｉ、および最後にｎｏｓ　ｔｅｒポリアデニル化シグナルを有するポ リリンカーが続いている。このベクターの変異体は、ＰＡＬ１４２１をＥｃｏＲ Ｉによって消化することおよびこの断片をプロモータポリリンカーｎｏｓ　ｔｅ ｒ配列類を含むが、より少ないプロモータの上流傾城を含んでいる断片をこのク ローンから単離することによって構築した。この断片をＰＡＬ１００９に再クロ ーン化した。ＰＡｌ５Ｏ１２は、はとんどのポリリンカーが除去されたＢＸＮ１ ９白来ベクターである。このベクターは、ＢＩＮ１９をＨｉｎａｌｎおよび５ｓ ｔｌによって消化すること、これらの部位をフレノウによって平滑末端とするこ と、１個の独自のＥｃｏＲＩ部位を断片類挿入のために含有しているベクターが 回収されるように再連結することによって、構築された。ＰＡＬ１００９はＥｃ ｏＲＩによって消化し、ＰＡＬ１４２１からの短いプロモータ／エクソン／イン トロン／第２エクソン／ポリリンカー／ｎｏｓ　ｔｅｒｍ造を含有するＥｃｏＲ Ｉ断片をそれに付加した。これによって、５′プロモータ領域が少ないことを例 外として木質的にＰＡＬ１４２１と同じであるベクターＰＡＬ１４２２を生成し た。ＰＡＬ１４２１およびＰＡＬ１４２２の双方ともに第３遺伝子からのイント ロンを含有することを記しておく。イントロンの存在が望ましくない構築体につ いて、イントロン配列類を最初にＰＡＬ１４２１をＥｃｏＲＩによって消化する こと、および、より長い５゛プロモータ領域が２元形質転換ベクター田において 再構築されるように、ＥｃｏＲＩを用いて、ｐＰＡＬＯ４２０からのプロモータ ／ポリリンカー／ｎｏｓ　ｔｅｒｌｌ造でプロモータ／エクソン／イントロン／ 第２エクソン／ポリリンカー／ｎｏｓ　ｔｅｒ構造を置換することによって、ｐ ＰＡＬ１４２１から除去した。この結果として生じたベクターは、ＰＡＬ　１４ ２３と命名した。この構築の概要を図７ｄに示した。 図７ｅにおいて、１託記載のベクター類の関連を概略図で示した。軍団に示した ベクター類は３種の範躊、１．遺伝子Ｂｐ４Ｃの上流領域から実質的に由来する ５を上流プロモータ領域を含有するベクター類（ｐＰＡＬＯ４２０，ＰＡＬＬ４ ２０、ＰＡＬ１４２３）、２．遺伝子Ｂｐ４Ｃからの５′上流プロモータ領域お よびイントロン配列を含有するプロモータ構築体類（ＰＡＬ１４２２．ＰＡＬ１ ４２１）、３．５°ＤＮＡ配列部分が、ゲノムクローンにおいて出現する配列に 関して逆転しているキメラ５“上流領域を含有しかつコアプロモータ構造として Ｂｐ４Ａのプロモータ断片を使用するプロモータ類（ＰＡＬ１１０７、ＰＡＬ１ １０６）、に分類されることを明記しておきたい。これらの構築体類のそれぞれ の機能が植物種によって変異できかつ大発明のある面を実施する際にこれらのプ ロモータ構築体類のいくつかを試験することが好適であることを付記しておく。 クローンＬｉＯ２よびＬ二９のプロモータ領域を利用する花粉特異的ベクター類 の構築を下記のようにして行った。Ｘ８に示した花粉特異的ベクター類の１築は 、クローンＬ４０のプロモータ領域を利用している。クローンＬ１０の転写の開 始はヌク−１チド１に局在している。Ａ　Ｔ　Ｇ　％始コドンは、ヌクレオチ（ ４５−４７に局在している。このクローンのプロモータ領域は、最初に全プロモ ータ領域および第１エクソンの１部分をカバーするクローンのＥｃｏＲＩ−Ｘ’ ：＋ａ工断片（このＸｂａ１部位は、ＤＮＡ配列においてヌクレオチド３５８で ある）をサブクローニングすることによって除去される。このサブクローン（ｐ ＰＡＩＩＯＥＸ）を次に！’−ｉ　ｎ　ＣＩＩおよびＮｄｅ　ｉによって消化し た。このＮｄｅ部位は、ヌクレオチド６０においてＡＴＧ開始コドンのすぐ上流 に局在し、モしてＨｉｎｃＩＩ部位は、ヌクレオチド番号−３９９に局在してい る。これらの２つの酵素類による消化によって、未翻訳転写リーダー配列のヌク レオチド類６２個、および５°プロモータ領域のヌクレオチド３９７傷を含有す る４５９ヌクレ万チド類のＤＮＡ断片を放出する。この断片におけるＮｄｅＩ部 位をフレノウの使用によって平滑末端とし、この断片をｐＧＥＭ４ｚのポリリン カーのＨｉ　ｎ　ｃ　ｉ工部忙中にサブクローン化した。両方向のクローンを回 収し、かつ、Ｈｉｎｃｔｌｌｌ、ｓｐｈ　Ｉ、Ｐｓｔｌ、ＨｉｎｃｉＩ、プロモ ータ−６２塩基対リーダー断片（ＮｄｅＩ平滑／Ｈｉ　ｎ　ｃ　ＩＩは、Ｈｉ　 ｎ　ｃ　ＩＴまたはＮｄｅＩのいずれによっても切断されない）、Ｘｂａｌ、Ｂ ａｍＨＩ、Ｓｍａ　Ｉ、ＫｐｎＩ、５ｓｔ１．ＥｃｏＲＩという方向に性のある 断片を含有するクローンを選択し、ｐＰＡＬＬＯ２０と命名した。さらに上流領 域を追加するために、長さおよそｌｋｂでかつこのＤＮＡ配列中において３９１ 個のＨｉ　ｎ　Ｃ１１部位のすぐ上流にあるＨ　ｉ　ｎ　ｃ　Ｈ−Ｈｉ　ｎ　ｃ 　ＩＩ断片を、Ｈｉ　ｎ　ｃ　Ｈによる消化およびこの断片のゲル溶出によって ｐＰＡＬＬｌｏＥＸから単離した。このＨｉ　ｎ　ｃ　Ｔｌ断片をｐＧＥＭ４ｚ のＳｍａＩ部位中にクローン化した。両方向の断片を含むクローン類を回収し、 下記の方向にある断片を含むクローンを選択した：）（ｉｎｄｌｌｌ、５ｐｈＩ 、ＰｓｌＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｓａｌ？、へ、５°から３”　（いずれの酵素によ っても切断されないＨｉｎｃＩＩ／Ｓｍａｌ挿入物として）へのＨｉ　ｎ　ＣＩ Ｉ断片、Ｋｐｎ　Ｉ、Ｓｓｔ　ｒ％ＥｃｏＲ１，このサブクローン（ｐＰＡＬｌ ｏＨｃ）をＫｐｎｒに≦つで消化し、フレノウの使用によって平滑天端とし、次 にｒ−ｃ　ｏ　Ｒｒによって消化した。この切断サブクローンに対して、ｐＰＡ Ｌ４０２０をＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩおよびＥｃｏＲｉによって消化することおよび このプロモータ断片を切断ｐＰＡＬｉＯＨｃに付加することによってｐＰＡＬ１ ０２０のプロモータ／未翻訳リーダー配列を付加した。結果として生成したサブ クローンは、前記２つのプロモータ断片類を結合するために使用された充填Ｋｐ ｎ工部位によってのみ未変化領域と異なるクローンＬｉＯの再構築プロモータ領 域を含有していた。このベクターは、　Ｈ１ｎ　Ｑ　ｆｌｌ　、Ｐ　Ｓ　ｔ　Ｉ 、５ｐｎＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｓａｌ王、ＸｂａＩ、ＥｌａｍＨｌ、Ｓｍａｌ、Ｋ ｐｎｌ、５ｓｔＩおよびＥＣ０ＲＩをこの順序で含んでいる。このサブクローン によって、プロモータがカセット形質転換ベクター類に３いて容易に使用できる ようにクローンＬ１０のプロモータ領域を都合良く切り出せる。この構築の概略 を、８面に示した。 ｐＰＡＬ工０２１のプロモータ領域を、下記の構築を実施することによって花粉 特異的カセット形質転換ベクターの構築のために使用した。プラスミドｐＰＡＬ １０２１を、Ｎｃｏ！およびＰｓｔｌによって消化した。このブラスミ（をフレ ノウによって処理し、かつ再結合した。この操作によって、ｐＰＡＬ１０２１内 のプロモータに対して５′であるポリリンカーの部分を有効に除去した。このプ ラスミドを、次に、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ！および５ｓｔＩによって消化し、ＰＡ Ｌ’ＯＯ１のＨｉ　ｎ　ｄ　ＩｌｌおよびＳｓｔ　Ｔ中にクローン化し、ＰＡＬ ｉ１２１を生成した。ＰＡＬ　１１２１は、クローンＬＩＯの花粉特異的プロモ ータ（およそ１．　１−１゜２ｋ）ｌ）、下記の独自部位；Ｘｂａｌ、Ｂａｍ１ ．Ｓａｍｌ、ＫｐｎＩ、Ｓｓｔ工、次にｎｏｓ　ｔｅｒを有するポリリンカーを この順序で有している。この構築をヌ８に示した。 クローンＬ１９のプロモータ領域を同様に花粉特異的ベクター類の構築のために 使用した。これらのベクター類の構築を図９に示した。クローンＬＬ９は、それ にとともに含有される単一の花粉特異的遺伝子を有している。この遺伝子におけ る転写の開始は、ＤＮＡ配列中の１位に局在している。ＡＴＧ開始コドンは、ヌ クレオチド１３６−１３８位に局在している。唯一のイントロンは、ヌクレオチ ド位１２０２−１３８７に局在しており、終止翻訳コドンは、ヌクレγチド２０ ２４−２０２６位に局在している。転写の終端は、およそヌクレオチド２０７４ 位に局在している。このクローンの全ＥｃｏＲＩ断片は、ポリリンカー中ニ局在 するＥｃｏ１１部位を用いて、ｐＧＥＭ４ｚｃ６にサブクローン化された。結果 として生成したクローンは、ｐＰＡＬ１９０１をＢａｍＨＩおよびＥＣｏＲＶに よって消化することによって単一の断片として切断され、このプロモータ領域に 対応する２１７７塩基対の断片を単離した。この断片は、ヌクレオチドー２２０ ０　（ＢａｍＨＩ）からヌクレオチド１５６　（ＥｃｏＲＶ）まで網羅する。こ のプロモータ断片は、クローンＬ１９内のプロモータの５”上流領域の２ｋｂ以 上、５′未翻訳リ一ダ配列の塩基対１３４ｆｌ！および翻訳配列の塩基対２０個 以上を含有する。この断片におけるＢａｍＨＩ部位をフレノウの使用によって平 滑末端とし、そしてＰＡＬＩ○０１中にクローン化した。この段階は、ＰＡＬｉ ＯＯＬをＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩによって切断し、この部位をフレノウの使用によ って平滑末端とし、およびこの平滑末端ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、プロモ ータがポリリンカー／ｎｏｓ　ｔｅｒポリアデニル化シグナルに関して５′から ３′であるような方向に挿入した。このベクターをＰＡＬ１９２０と命名し、こ れは、その内部に下記の順序で、５゛未翻訳リーダー配列の塩基対１３４個を含 有するクローン上１９由来プロモータ、平滑末端によって不活化された先のＨｉ 　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位を含有するポリリンカーに融合した翻訳配列の塩基対２０ 個、５ｐｈＩ、Ｐｓｔｌ、５３−１上、Ｈｉｎｃｌ、ＸＪＬＬＬ、旦」」１旦ニ ー、Ｓｍａｌ、ＫｐｎＩ、１１笠上（独自のクローニング部位にはアンダーライ ンを付けである）、ｎｏｓ　ｔｅｒポリデニル化シグナルを含有する。このベク ターは、花粉細胞中に転写されるべきＤＮＡ配列類の挿入のために都合が良い。 この構築の概略を図９に示した。 図１０において、構造的に発現された遺伝子を含有する　−ぐ　・　ＢＬＡ」」 ＬＬ旦ａ　ｎａｚ旦」、）ゲノムクローン（ＨＰＩＯＩ）の制限地図を示し、転 写配列の部分とともに５°プロモータ領域を含むこのクローンの断片を確認した 。この断片は、ｐＧＥＭ４Ｚ中において小さい２．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片を最初 にクローニングし、かつｐＧＥＭ４ｚのポリリンカーに関して示唆された方向に この断片を挿入されるサブクローンを得ることによって単離された。このクロー ンをｐＰＡＬｏｌｏｌと命名し、そして１９９０年１月２６日、アメリカンタイ ブカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ１１２３０１ＰａｒｋｌａｗＨＤｒｉｖｅ 、ＲｏｃｋｖｉＬｌｅ、ＭＤ、２０８５２．ＵＳＡ）にｐＰＡＬＯ１ｏｌ／−９ ０１１株ＤＨ５アルファ、寄託番号ＡＴＣＣ６８２１０として寄託した。このＥ 、ｃｏｌｉ株は、１ｍｌ当たりアンピシリン１００ｇを含有する標準旦、」Σλ ユ」２培地（ＬＢ）で培養した。このサブクローンｐＰＡＬＯ１０１を次にＥｃ ｏＲＩで消化し、フレノウ断片で処理し、次にＢａｍＨＩ″ｒ−消化すると、示 したようなプロモータ／転写領域を放出する。この断片をＨｉｎｃＵ−ＢａｍＨ 工切断ｐＧＥＭ４ｚにクローン化し、結果としてサブクローンＩ）ＰＡＬＩＯＩ となった。このサブクローンを、構成的プロモータを使用して花粉特異的アンチ センスＲＮＡを合成するベクター構築体におけるプロモータ配列類の単離のため に使用できる。 １１図において、ポリリシンコード遺伝子の産生を概略示した。この構築体に３ いて、クローニングベクターｐＧＥＭ４ｚをＡＴＧ開始コドンを含有する合成オ リゴヌクレオチドの受容体として使用し、これに対して、１種のヌクレオチドの みからなるポリヌクレオチドを付加した。したがって、この遺伝子は、主に１個 のコドンを有しかつポリアミノ酸から構成されているタンパク質をコードする遺 伝子である。この構築を下記のように行った。好適な開始内容でＡＴＧ開始コド ンを提供するためには、合成オリゴヌクレオチドを構築しかつＨｉｎｄｒｒｌお よび５ｐｈＩ部位の間のｐＧＥＭ４ｚ中に挿入した。このヌクレオチドは配列＝ ５’−ＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＣＡＴＧ−３’を有していた。結果として 生成したサブクローンは、故に、ＤＮＡ配列ＡＡＣＧＴ　ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡ ＴＧ　ＡＣＡ　ＴＧＣＧＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＴ（導入されたＢａｍＨＩ部位のた めの制限部位にはアンダーラインを付け、ＡＴＧ開始コドンは太い字で示した） をその５°領域に有しており、好適な開始内容のＡＴＧ開始コドンおよびこの部 位の上流にＢａｍＨＩ部位がコード配列の切断のために存在する。このサブクロ ーンをＰｓｔＩによって消化し、反応液を２つに分割し、ひとつは末端トランス フェラーゼおよびＴＴＰを用いてＴ残基類を末端につなぎ、１つは、末端トラン スフェラーゼおよびｄＡＴＰを用いてＡ残基類を末端につないだ。この２つの末 端にホモポリマーをつないだ（ｔａｉｌｅｄ）プラスミド類を混合し、フェノー ル−クロロホルムによって抽出し、エタノール沈澱および再ｗＡ濁した。このプ ラスミド混合物を、Ｓｓｔ　Ｉによって切断し、そして再連結した。二双したク ローン類は、コード鎖の上にポリＡまたはポリＴを含有するいずれかのクローン 類であった。クローン類をＢａｍＨＩによって切断し、挿入物の大きさをゲル電 気泳動によって決定し、そして、もしこのクローンがポリリシン（ポリＡ）また はポリフェニルアラニン（ｍＲＮａ中におけるポリＴ、ポリＵ）をコードするな らば、配列決定した。ポリリシンをコードし、かつ、およそ３００個のヌクレオ チドであるクローンを選択し、ｐＰＡＬｐＬｙｓと命名した。このクローンをＳ ｍａＩによって切断し、そして、普遍的翻訳ターミネータ（ファルマシアＰＬバ イオケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、モ ントリオール、カナダ）をそれに付加して５遺伝子の構築を完全とした。この構 築を図１０に示した。 図１２において、クローンＬ１９のイントロン領域に特異的なアンチセンス遺伝 子の産生および番号Ｌ１９遺伝子のイントロンを欠失したバージョンの作製図を 示した。これにおける第１段階のために、クローンＬ１９からの実質的に全てが イントロンである制限断片を単離した。この断片を、ゲノムクローン内のいくつ かの部位で切断する制限酵素ＤｄｅＩを用いて単離したが、ヌクレオチド１１８ ６および１３４８位における部位類は、実質的にイントロン配列である制限断片 を生成し、最終転写物に含まれるヌクレオチドをイントロン５°部位に１６個、 および最終転写物に含まれるヌクレオチドをイントロン３１部位に１０個しか有 していない。このＤｄｅ？断片をゲル電気泳動を用いて単離し、平滑末端とし、 かつＳｍａＩ切断ｐＧＥＭ４ｚにクローン化した。両方向におけるクローン類を 得、そして方向が、Ｈｉｎｄｍ、５ｐｈＩ、ＰｓｔＩ、５ａ１１．ＸｂａＩ、Ｂ ａｍＨＩ、（前のＳｍａＩ）、イントロンの３°末端、イントロン配列類、イン トロンの５°末端、（前のＳｍａＩ）、Ｋｐｎｌ、Ｓ、ｓｔｌ、ＥｃｏＲＩとな っているイントロン領域を含有するクローンを選択した。このクローンをｐＰＡ Ｌ。 １９１４と命名し、そしてＢａｍＨＩｇよびＳｓｔ　Ｉによって消化し、そして 、先にＢａｍＨＩおよび５ｓｔＩによって切断されたＰＡＬ１９２０中に挿入さ れ、ベクターＰＡＬ１９５４を作製した。 特異的復旧ベクターを作製するため、ｃＤＮＡクローン、１９ｃＤＮＡ　（図５ ）を下記のようにプロモータ領域に融合した。このｃＤＮＡクローンをＥｃｏＲ ＶおよびＳｍａｌによって図１１に示したように消化した。この切断ベクターに 対して、クローンＬ１９由来ＥｃｏＲＶ−９ｍａＩ断片を付加した。プロモータ の再構築５′領域３よびコード配列を含有するがしかしイントロンを欠失したコ ード配列を有するクローン類を凹成し、このコード領域のほとんどは、ｃＤＮＡ クローンから由来した。このクローンをＥｃｏＲＩによって消化し、フレノウに よって平滑末端とし、次にＳｍａＩによって消化した。全コード領域およびプロ モータ領域の１部分を示すＤＮＡ断片を単離し、ＳｍａＩにより切断されたＰＡ Ｌ１９２０中にクローン化して、プロモータ領域およびイントロンを欠失したコ ード領域の再構築を行った。このベクターをＰＡＬ１９５５と命名した。 １３図において、ア」乙ｑ１じＬデ刀２１ム：二し；ｄ二区　’Ｚ’　Ａｒｏｂ ａｃ１立り上旦ユーエ旦ユヱエ盈旦１旦旦旦りのプラスミドｐＴｉＣ５ＢのＩａ ｍＨ遺伝子を、プラスミドｐＰｃｖ３Ｌ１　（Ｋｏｎｃｚ、Ｃ，および５ｃｈｅ ｌｌ。 Ｊ、、モレキュラー・エンド・ジエネラルジエネテイクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ））（１９８６）、２０４：３８３ −３９６）由来遺伝子２領域を単離することによって得た。この領域を、Ｈｉｎ ｄｌｌおよびＡｐａｌによる消化によって単離し、ＡＴＧ５ｉ始コドンの上流の ヌクレオチドおよそ４７＠のＤＮＡ配列を含有しかつＴＡＡ終止コドンを過ぎて からのＤＮＡ配列およそ５００個のヌクレオチド類を含有する遺伝子断片を生成 する。この断片は、Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩの使用によって平滑末端 に変換され、そして、ＳｍａＩ切断ｐＧＥＭ４ｚ中に挿入された。示した方向に おける遺伝子を有するクローン類を選択し、これらのうちのひとつをｐＰＡＬ　 ＩａｍＨと命名した。このクローンをＢａｍＨＩおよび５ｓｔＩによって消化し て、そしてＢａｍＨＩ−３ｓｔｒ切断ＰＡＬ１４０２中に押入し、ＰＡＬ１４２ ４を生成した。 図１４において、Ｉぐ　・コζ　二　Ｒｉｃ’ｎ　ｃ　ｍｍｕ　ｉ　）から単離 されたりシンＡｌｌタンパク質に機能的に関連したタンパク質のコード配列類を 含有するクローン類の生産を詳細に述べる。これは、最初に止２２ニニ之／　ニ ー　Ｒｉ　ｉｎ　ｚａｎｚａｂａｒ　’　ＤＮＡ（７）ゲノムライブラリから、 標準的プロトコールを用いてベクター、ラムダｇｔｌｏ中で構築されたりシンに 相同性のゲノムクローンを単離することによって達成された。このライブラリを 、リシン遺伝子のＮ末端リーダー配列に対応するＤＮＡプローブによってスクリ ーニングした。このプローブ配列は、ＩＳ　・コ々　二　Ｒｉｃｉｎｕ　ｍｍｕ ｎｉｓ）リシン遺伝子の公表された配列（Ｈａｉｌｉｎｇら。 ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５）、Ｌ３：８０ １９−８０３３）１９８５）から得られた。リーダー配列を含有するゲノム遺伝 子を単離し、Ａ鎖の部分を単離しＲＩＣＩＢと命名した。このクローンは、プロ モータ領域、５°未翻訳領域、公表された配列のアミノ酸１９１　（ｌｌｅ）（ Ｈａｌｌｉｎｇら、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｃｉｓ　 Ｒｅ５）、１３：８０１９−８０３３）、］−９８５））まで延びるＮ末端リー ダー配列およびコード領域を含有した。公表された配列とＲＩＣＩＢとの間の差 異は、１１ｅ１９１の領域における公表されたヌクレオチド配列が（アンダーラ インを付けた１１ｅ１９１）ＡＣＧ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＧＧであり、これは、 アミノ酸Ａｒｇ　よｎＡｒｇをコードし、一方、ＲＩＣＩＢにおいてはヌクレオ チド配列はＡＣＧ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＧＧであり、これは、同一アミノ酸（Ａ ｒｇ　よよ旦　Ａｒｇ）をコードし、唯一の差は、最後のＡｒｇがＲＩＣＩＢに おいてはＣＧＧによフてコードされるのに対して、一方、公表された配列におい ては、それはＡＣＧによってコードされていることである。この１個のヌクレオ チド置換は、ＥｃｏＲＩ部位をｌｉｅ　１９１に挿入する効果を有する。クロー ンＲＩＣＩＢは、したがって、ｌｉｅ　１９１の後に存在するアミノ酸を欠失し ており、その理由としてクローンが単一のＥｃｏＲＩ断片として単離されたこと が挙げられる。リシンのこの部分欠失型は、下記のようにリシンＡＮ末端欠失体 の構築のために使用された。クローンＲＩＣＩＢをＨｉｎｃｎおよびＥｃｏＲＩ によって消化した。この断片をＥｃｏＲＩ−５ｍａＩ切断ｐＧＥＭ４ｚ中にクロ ーン化した。結果としてのクローン、Ｉ）ＰＡＬＲＩＢをＰｓｔｌ′ｉ３よびＢ ａｍＨＩによって消化した。この切断されたクローンをＥ　ｘ　ｏ　ＩＩ！ヌク レアーゼによって消化し、Ｓ１ヌクレアーゼおよびフレノウ断片によって処理し 、そして次に再連結した。欠失した５７領域の種々の部分を有するサブクローン が得られ、そしてこれらの欠失のいくつかを配列した。ひとつの欠失体をｐＰＡ Ｌ−リゾフィン（Ｒｉｄｅｆｉｎ）と命名し、これは、除去されたＮ天端リーダ ーＤＮＡ配列の大半を有し、かつ、ＤＮＡ配列が下記のようであるようにこの領 域に対して５゛のＢｉｎｄｌｌおよび５ｐｈＩ部位を有していた：ＡＡＧＣＴＴ 　ＧＣＡＴＧＣＧＣＡ　ＡＣＡ　ＴＧＧ・・−・・・・・・・・・で、この中で は、最初の６個のヌクレオチドがｐＧＥＭ４ｚ中に見られるＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｉ １１部位を、次の６個のヌクレオチドはｐＧＥＭ４ｚの５ｐｈＩ部位をコードし 、そして、続く３つのトリブレットが公表された配列（Ｈａｌｌｉｎｇら、ヌク レイツクアシズリサーチ（Ｎｕｃ　１．　Ａｃ　ｉｄｓ　Ｒｅ５）、Ｌ３：８０ １９−８０３３）１９８５）のアミノ酸、−２０゜−１９，−１８・・・・−・ ・・・（Ａｉａ　Ｔｈｅ　Ｔｒｐ）をコードする。このサブクローンは、したが って、リシンのＡ鎖す−ダー配列類の最初の１５個のアミノ酸を除去する欠失を 有している。ＡＴＧ開始コドンを好適な開始内容で提供するために、合成オリゴ ヌクレオチドを構築しＨｉｎｄｌＯおよびＳ　ｐ　ｈ　、Ｉ部位の間のサブクロ ーンに挿入した。このヌクレオチドは、配列：　５’　−ＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣ Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　Ｔ　Ｇ　−３’　を有していた。再構築さ れたクローン（ｐＰＡＬＲｉｃｔｒ）は、したがって、ＤＮＡ配列（導入された ＢａｍＨＩ部位のための制限部位にはアンダーラインをつけである）ＡＡＣＧＴ 　止ｉＡ工ＣＣＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＴＧＣＧＣＡ　ＡＣＡ　ＴＧＧを５′ 末端に有しており、好適な開始内容のＡＴＧ開始コドンおよびこのコード配列の 切断のためのＢａｍＨＩ部位があるようにして有している。クローンｐＰＡＬ　 ＲｉｃｔｒはＥｃ。 ＲＩによって消化され、フレノウによって末端を充填され、かつアルカリホスフ ァターゼによって脱リン酸化された。このベクターに対して、ファルマシアーＰ Ｌバイオケミカルズ（モントリオール、カナダ）から購入した普遍的翻訳ターミ ネータを付加し、終止コドンを提供した。このクローンからのコード領域をＢａ ｍＨＩおよびＰｖｕｌによって単離し、このコード領域およびｐ　ＯＥ　Ｍ　４ 　Ｚの小部分を放出させ、そしてこの断片を形質転換ベクター類のＢａｍＨＩお よびＳｍａＩ部位にクローン化できる。このＤＮＡ断片は、Ｃ末端部分を欠失し たりシンＡｌ１１のバージョンをコードする。このリシンＡ１１ｌのＣ末端およ びＮ末端欠失をインビトロで毒性を試験し、これらの報告では、リシンＡ鎖のＮ 末端半分がインビトロ細胞毒性のために子分であると報告されている（例えば、 ５ｕｄａｎら、ヌクレイツクアシズリサーチ（ＮｕｃＬ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５） 、１７：Ｘ７１７−１７３２．１９８９参照）。リシンＡ饋のための完全なコー ド領域を得るために、Ａｌｌの残りの合成バージョンを公表された配列を用いて 合成した。この遺伝子の合成部分はＤＮＡ配列を公表された配列のヌクレオチド １１８２まで延長し、そして、アミノ酸番号１９０−１９２のＥｃｏＲ４部位に 対してこの断片を結合させる両端においてＥｃｏＲ工部位を有していた。遺伝子 のこの再構築されたバージョンは、また、３°末端の遺伝子のＤＮＡ配列が、下 記のようであるように終止コドンの後にＢａｍＨＩ部位を有していた：ＣＣＴ　 ＣＣＡ＊　ＴＡＡ　ＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣ（ヌクレオチド１１８１を＊でマ ークした）。この配列は、アミノ酸ＰｒｏＰｒｏ停止をコードし、次にＢａｍＨ ＩおよびＥｃｏＲＩが続いており、このＥｃｏＲＩ部位は、この遺伝子の合成部 分の挿入のために使用され、合成りａｍＨＩ部位は５゛末端にもあるので、Ｂａ ｍＨＩは完全リシンＡＭ配列の切り出しのために使用される。このクローンをＩ ）ＰＡＬ　Ｒｉｃｃ。 ｍと命名した。 図１５において、ベータ・グルクロニダーゼ遺伝子活性のアンチセンスＲＮＡ阻 害の結果を、センスＧＵＳ遺伝子を含有しかつアンチセンスＧＵＳ遺伝子を含有 するベクターで再度形質転換されたトランスジェニック植物類にみられるＧＵＳ 遺伝子活性のヒストグラムで示した。ＧＵＳ活性レベルは、当初のＧＵＳ十植物 ＴＴＲ−４８中に見られたＧＵＳ活性の百分率として表現した。組織は、若い（ Ｙ）、・中くらい（Ｍ＞および老いた（０）葉から得られ、モしてＧＵＳ活性を 分光学的にアッセイした。レーン１−５は、再度形質転換された植物類ＴＴＲ− １からＴＴＲ−５からの試料であり、レーン６は、植物ＴＴＲ−４８からの試料 、レーン７は、ＴＴＲ−８８（ＴＴＲ−４８／ｐＶＵ１０１１）からの試料、お よびレーン８は、未形質転換タバコからの試料である。 日　た　゛　態 遺伝的に形質転換され成功を納めた植物種の数は、まだ潜在的に商業上関心を集 めている植物種総数の数％を示しているに過ぎないことが公知である。しかし、 形質転換された種の数が安定して増加しかつやがていかなる問題の作物に付いて も形質転換系が開発されると予測することにはそれなりの理由がある。定型的形 質転換は、最初、２種の植物科：ゝ−工　Ｓ　１ａｎａｃｅａｅ　および−り　 工　Ｂｒａ　ｉ　からの種によって達成された。形質転換されたこれらの科内か らの商業上関心を集めている種の例として、タバコ１、二　・　＜　Ｎ”　ｎｂ ｕＬ・　−トマト・１　べ　ゝコ゛・工　ゝ　−”：　Ｌｃ　ｒｉ　ｎ　ｃｕｌ ｅｎｔｕｍ　Ｍｉｌｌ　、馬鈴薯、１−・１ゝバ　ｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅ工」 ＬｑＪＤ−Ｌｌ、及びペチュニア、べ　＝−ＩＰｅｕＢｒ　ｓｉｃ　ｎａｕｓ　 Ｌ、、キャベツ、ブロッコリ、ケールなど、ｃｅａｅ））によって達成された。 最近、形質転換が、テンサイ、べ−・　て　ｌ　Ｂｅｔａ　ｖｕｌ　ａｒｕｍ　 ｓａｔｉｖｕｍ）、大豆、１ゝゝ　・マ”　Ｇｌ　ｃｉｎ（−」Ｌ久１」−及び 、アルファルファ、　パ　ゴ　ＭｅｄｉＣａ　ＯＳｍ）、＞　＜２ヱバ立ヱエ＝ 　ｓ　’　Ｆ　ｂａ　ａｅ＝Ｌｅ　ｕｍｉｎ　ｓ　ｅ　＞のような他の科の商業 上重要な種に付いて報告されている。形質転換は、また、ポプラ、ハ″″　Ｐｏ 　ｌｕｓ　ｓ　、ｌ　ｘ　５ａｌｉｃａｃｅａｅ　）およびくるみ、ぐ゛　−゛ 　・二　−１ｎｉ　ｒ　（乏ニー゛　工　Ｊｕ　ｌａｎ　ａｃｅａ　））のよう な樹木種でも達成された。 単子葉種に付いての形質転換の成果はそれほど迅速には進んでおらず、その理由 として、これらの種は、一般に、　口＜　−’　Ａ　ｒ　ｅｒ上且工り介在形質 転換に余り感受性でないことが挙げられる。しかし、特筆するだけの価値のある 進歩として、アスパラガス、　イー　・　５Ｔトウモロコシ、　・　Ｚｅ　およ びコメ、を隻ｊ二Ｕバ１”　’Ｖ　；、　工　Ｐａ　）が挙げられる。 −’　ｒ　ｂａ　ｉ　ｍ　による形質転換が、発芽中の種子を感染させ細胞培養 による再生の必要もなく達成できるという最近の発見（Ｃｈｅｅ、Ｐ、Ｐ、ら、 １９８９．プラントフイジオロジ−（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ）９１：１２ １２−１２１８）によッテ、再生困難な種に対する新しい将来が開かれている。 さらに、ＤＮＡでコーティングしたミクロプロジェクタイル類を他の方法に容易 に感受性でない植物細胞種中に移行するために粒子ガンを使用することに関して 広範囲に研究されていることも、大きな未来を示すものである。本発明は、上述 の種のいずれに付いてもまたはその他の遺伝的に形質転換されることが可能な種 に付いても実行することができると予測されている。 上記に述べた花粉特異的プロモータ類は、種　−８−Ｂｒａ　ｓ’Ｃａ−ユゑ且 旦五）の植物から単離された。上記で取り上げた植物種のそれぞれに関して、前 記プロモータを月いて、一定のＤＮＡ配列の発現を小胞子および花粉発生中の特 定期間に限定することが可能であると確信されている。公表された科学文献は、 植物遺伝子類が普遍的でありかつ植物組織特異的プロモータ断片類がそれらの機 能を他の種において保持することを明確に示している。例えば、小変肉はい乳プ ロモータ断片類は、適切な種子特異的発現をタバコにおいて付与するように機能 する（Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｊ、　ら、ＥＭＢＯジャーナル４：２７２３−２７２９ ．１９８５）およびとうもろこし〔ヨ土二−ユ１Ｌ旦））からのアルコールデヒ ドロゲナーゼプロモータは、他のプロモータ断片類とともに使用し、タバコにお いて適当な発現を付与する（Ｅｌｌｉｓ、、Ｊ、Ｇ、ら、１９８７、ＥＭＢ○ジ ャーナル、４：　２７２３−２７２９．　１９８５）。さらに、とうもろこし可 動エレメントＡｃがタバコおよび他の植物種において活性であり（Ｔａｙｌｏｒ ら、１９８９．プラントモレキュラーバイオロジー（Ｐ　ｌ　ａｎ　ｔＭｏｌ　 Ｂｉｏｌ）１３：１０９−１１８）、植物遺伝子構造及び機能の普遍性のもうひ とつの証拠を提供する。これらの例は、極めて広範の種（単子葉から双子葉まで ）において、同一プロモータ類の等しい組織特異的機能を実証し、ている。我々 独自の研究及びその他の研究から、同−科内部または父立±±に二重０ユａｎａ ＣｅａｅＬおよびスｌ之友文１．ｘ−（Ｕ　ｒ　ａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｃ　ａ　ｃ　 ｅ１旦りのような料量のより緊密に連関した種において、プロモータ機能が等し いことが示された。 しかし、発現の適当な時期またはレベルを最大化するかまたは向上させるために 本発明の面を実行するために、プロモータ機能の向上がそれぞれの植物類または 種に付いて必要であることが認識されている。したがって、異なる起源の種々の 植物における機能の改質または改良のためのプロモータ類の改質方法が、本文に 述べられている。 本発明によれば、他のハイブリダイゼーション法に勝る下記の利点が達成される 。 （ａ）ハイブリッド種子生産は労力を要さずしかも大規模で商業的に容認できる コストで達成できる。 （ｂ）ａｔ性不稔性は単純に遺伝され、かつ、自家不和合性及びＣＭＳ基準法の 有効性を制限する環境ストレスに対する応答において安定である。 （Ｃ）生産される種子は自適種子によって実質的に汚染されないであろう。 （ｄ）本システムでは、ハイブリッド種子の挙動を障害する欠陥性細胞質器官の 使用を避ける。 （ｅ）本システムで：よ、発生を極めて速くし、かつ、ハイブリッド交雑に３い て親として試験できる系統の数を増加させるであろう。その理由として、付加的 ゲノムＤＮＡの組み込みを行うことなく、形質転換されかつ植物に再生可能ない かなる植物または交雑系統にもそれを行うことができることが挙げられる。 下記の用語及び表現を本文の開示及び特許請求の範囲に使用する際には、下記に 述べる定義に従って解釈されるべきであるが、ただし、内容からし−Ｃ前記用語 及び表現をそのように限定するべきではないときを除くっ一般的用語で記載され た本発明の先の記載は、本発明に従って、雄性稔性及び雄性不稔性植物類の混合 物または復旧雄性稔性によって、雄性不稔性植物類、復旧植物類およびハイブリ ッド種子を生産するために使用できる段階を記載している。これらのさまざまな 段階は、種々の異なる操作によって達成できることが理解される。好適な操作の 下記の記載において、これらの段階を達成するための異なる方法を、開示してい る。しかし、他の変異体も当業者に明らかであろうということを考慮すべきであ る。したがって、本発明の範囲は、付属の詞求項の範囲によってのみ限定される ように意図されている。 花粉機能にとって重大である遺伝子類の単離は、種々の操作によって達成できる 。本発明の方法の１面によれば、制御が厳密に管理されている花粉発生時におけ る特定段階においてのみ発現される遺伝子類が確認される。この遺伝子類は、下 記に述べた詳細な方法に従ってクローニング法によって単離できる。確認段階は 、また、下記に記載の標準的クローニング法によって、花粉形成または機能にと って重大でありかつ１植物の花粉形成または機能において独占的に発現されるこ とが公知の一定の遺伝子が別の植物において同一の用途を有しているかどうか確 認することによって達成できる。また、ある遺伝子類は細胞機能にとって重大で ありかつ全ての生細胞型中において発現されることが公知である。これらの遺伝 子類は、これらの本質的遺伝子類に対して公表されたＤＮＡ配列類を用いること によって単離でき、その一部は、植物及び動物種において、かつ、！ｉ性不稔性 を起こす組換えＤＮＡの構築のため使用される花粉組織にのみ遺伝子発現を限定 するプロモータと関連させて、保存される。 アンチセンス遺伝子類は、種々の公知の方法のいずれによっても構築できる。 下記に詳細に述べた構築の好適な方法は、センス遺伝子の二！釦ツー・ド領域ま たはその機能的断片を切断すること、及び、プロモータ下流に前記二重ｔｌ　Ｄ 　Ｎ　Ａ分子を転写のための正常形態に関して逆転した方向に挿入することであ る。ターミネータ構造は、好適には、このアンチセンス遺伝子の末端に付加され る。前記アンチセンス遺伝子、またはその機能的断片を公知の方法に従って合成 的に作製することおよび前記配列を公知の方法によって、十分量のＲＮＡ中に好 適な時期に転写を起こすようなプロモータの下流に挿入することは本発明の範囲 内で可能である。 このアンチセンス遺伝子は１種々の公知の方法のいずれかで植物細胞中に導入で き、好適には最初に前記遺伝子を適切なベクターに挿入すること及び次に前記ベ クターを用いて前記遺伝子を植物細胞中に導入することによって行われる。形質 転換された細胞は、形質転換細胞に毒性物質に対する耐性を付与することができ るマーカー遺伝子の活性によって選択される。このようにして選択された形質転 換植物細胞は、植物構造に分化するように誘導され、これは、最終的に植物個体 を生成するであろう。また、この発明のいくつかの面は二つの異なる遺伝子類に よる植物細胞の形質転換を必要としている一方、これらの遺伝子類は、両者が同 一ベクター上に含有されることによって生理的に連結されているか、または異な るベクター上で生理的に分離していることができることを理解されたい。細胞の 形質転換は、各ベクターが独自の選択可能なマーカーを有しているのであれば、 二つのベクターによって同時に起こることもある。これとは別に、２つのベクタ ーによる形質転換が順々に起こり、第１のベクターによる形質転換後に中間再生 段階を実施する。さらに、異なる組換えＤＮＡ分子類を含有するそれぞれの植物 類の性的交雑を実施すること及び両方の組換えＤＮＡを含有する前記交雑植物類 の子孫から選択することが可能となることを理解されたい。 コストが保証されておりかつ上記に述べたように容易に維持が達成できない場合 、形質転換植物細胞は通常の方法論に従って培養で生長でき、多数の形質転換細 胞からなる細胞系統を産生ずる。多数の形質転換細胞は、前記形質転換細胞系統 から通常の方法論に従って再生でき、雄性不稔性系統を増加させかつ維持させる 。上記細胞を培養すること３よびこの細胞から形質転換細胞を再生することのた めの方法は、標準的植物組織培養ハンドブックに記載されている。プ立ン」ニー −ψぐ　−・工ゝ’−・”　’　Ｐｌａｎｔ　１ｓｓｕｅ−１ユ止−ΩｐＨＣｕ １ｔｕｒ　）、Ｇｒｅｅｎ　Ｃ，Ｅ、　、Ｓｏｍｅｒｓ、Ｄ、、Ａ、。 Ｈａｃｋｅｔｔ　Ｗ、Ｐ、、およびＢｉｅｓｂｏｅｒ、Ｄ、Ｄ、　Ｉｉ著、１９ ８７゜アランＲリス（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）社、ニューヨーク、盈ヱスニ旦 Ｘ之ｌ・ゝ・　−ゝ　−ゝゝ’　−−Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ＰＩ　Ｔ ｉｓ　ｕｅ　ｕｌｔｕｒｅ　、Ｄｏｄｄｓ、Ｊ、Ｈ，、及びＲＯｂｅｒｔｓ、Ｌ 、Ｗ、、編著、１９８５．ケンブリッジ大学プレス、または立ルｔｉｃｓ　ｏｆ 　Ｐｌａｎｔｓ）、　Ｖａｓｉｌ、１．に、、Ｓｃｏｗｃｒｏｆｔ、　ｗ、　Ｒ ，、およびＦｒｅｙ　Ｋ、Ｊ、、　編著、１９８４．アカデミツクプレス（Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、’１””−−−’　Ｈ’　ｋｏｆ Ｐｌ　ｔｃＩＬ−ｑ旦よ１ｊ」」０−＋　１−４巻、Ｅｖａｎｓ、Ｄ、Ａ、、５ ｈａｒｐ、Ｗ、Ｒ，、Ａｍｍ１ｒａｔｏ、Ｐ、Ｖ、　、及びＹａｍａｄａ、Ｙ、 ａｍ著、１９８４−１９８６．マクミラン（Ｍａ、ＣＭユ１ｌａｎ）、ニューヨ ーク、て　−口ゝ１−・　１　。 ’　−ｃ’］１ｊ上ス上ユ（Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎＡｇｒｉｃｕ ｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ）、１および２轡、Ｂａｊａｊ、　Ｙ、 　Ｐ、　Ｓ、　！著、１９８６．スプリング・フエアラーク（Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖ ｅｒｌａｇ）、Ｂｅｒｌｉｎ、または　−゛　ロバ　−：′　ｌ二τヱニ土Ｃｕ １ｔｕｒｅ−Ｈａｎｄｂｏ　ｋ　ａｎｄ　Ｄｉｒｅｃｔｏ工Ｌ　ｏｆ　ｆ、ｇｌ ｍｍｅｒｃｉ　ｌ　Ｌａｂｏｒａｔ、ｒｉｅｓ　Ｇｅｏｒｇｅ、Ｅ、Ｆ、、ａｎ ｄ　Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｐ、Ｄ、、１９８４．　イースタンプレス（Ｅａ ｓｔｅｒｎ　Ｐｒｅｓｓ）、リーディング（Ｒｅａｄｉｎｇ）。 形質転換植物細胞系統の細胞を標準的方法によって形質転換できない植物種細胞 と融合させることによって雄性不稔性植物類を産生ずることもできるであろう。 両方の植物細胞からの遺伝的成分を有する融合植物細胞系統が、得られる。組換 え遺伝子を有する融合細胞が選択でき、かつ、多くの場合、雄性不稔性形質を有 する植物細胞に再生できる。 いくつかのプロモータ類のいずれも５、このプロモータが前記遺伝子の転写を適 切な時間に及び十分量のＲＮＡ中において起こし適当な小胞子発生を阻害するな らば、組換え遺伝子の発現を制御するために使用できる。もし本発明の面がアン チセンスに関係するならば、その時には完全なターゲット遺伝子類発現の完全な 阻害が必要でなく、正常花粉形成または機能形成が阻害される点にまで低下させ る発現のみが必要である。異なる遺伝子類及びプロモータ構造の組み合わせを用 いて正常花粉発生を阻害することも可能である。アンチセンス遺伝子の発現を増 幅するために使用できるプロモータまたは方法は、アンチセンスＲＮＡの適切な 産生を確保するために有用であろう。 先にも述べたように花粉特異的プロモータを使用し花粉発生または機能にとって 重大であるセンス遺伝子を不活化する際に、花粉特異的プロモータまたは改質さ れたプロモータ構築体が遺伝子の機能をどの程度有効に阻害するかをｌズユ左旦 に予測することは困難である。この遺伝子に対して類似の発生様式を示す花粉特 異的プロモータを使用することが好適である。不活化の為にターゲットとされた センス遺伝子がいつ発現されるかを決定するために便利な方法は、興なる段階に おいて小胞子を発生するように単離すること及びこのＲＮＡをいわゆるノーザン プロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析によってターゲット遺伝子の発現 の為にこのＲＮＡを分析することである。この操作は、センス遺伝子が発現され る発生時期を正確に決定することを可能とするであろう。前記センス遺伝子を不 活化するために使用しようとしている花粉特異的プロモータの発現時期を花粉発 生中に決定するために、前記花粉特異的プロモータの発現のためのプローブとし て前１己プロモータに連結したレポータ遺伝子または天然の遺伝子を、このセン ス遺伝子の単離のために当初使用された植物類中に見られる花粉特異的プロモー タのコントロール下に用いて、類似の分析を何度も実行することが可能である。 花粉特異的プロモータが１植物から単離されかつ異なる植物種中で使用されると モータ断片がその特定の植物種中において有する正確な発生時期を決定すること である。 さらに、同一または異なる種のために意図されたものであろうと、花粉特異的プ ロモータ類の活性が前記植物中の活性を変化または変更させるように改質できる ことが理解される。予期される変化として、配列の付加または欠失、上流または 下流の配列の方向性、及びイントロンまたは花粉特異的遺伝子のコード配列の部 分の組み込みが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。上記の改質は ％発現を増加させるかまたは発生のターゲット段重に発現を制御することを向上 させるために役立つであろう。 また、アンチセンス遺伝子は、このアンチセンス遺伝子によってコードされるｍ 　ＲＮ　Ａがそうでないばあいに不活化の為にターゲットとされた本来のｍＲＮ Ａ種をハイブリダイズするかまたはそれの翻訳を阻害することができるならば、 センス遺伝子によってコードされた全ｍＲＮＡに相補性であるＲＮＡを必ずしも コードする必要はないことを理解すべきである。したがって、本文の開示及び特 許請求の範囲に使用する際に用語アンチセンス遺伝子は、その機能的断片を包含 する。 発生過程中の小胞子に特異的に発現される遺伝子類を単離するために、植物ＤＮ Ａのゲノムライブラリは、標準的方法に従って新鮮な若い葉から単離されたＤＮ Ａから構築できる。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（モレキュラークロ ーニング）、ラボラトリマニュアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ｌ　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、　、およびＳａｍｂｒ ｏｏｋｓ、Ｊ、　、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバ−（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、１９８２）および数 種の組織に由来するプローブでスクリーニングでき、その内のひとつが小胞子Ｒ ＮＡから作製される。その他のプローブ類は、小胞子で発現される遺伝子を包含 すると予測されていないであろう植物の組織中で発現した遺伝子を示すために、 異なる組織由来ＲＮＡから作製すべきである。例として、葉、根、種子、柱頭、 茎およびその他の器官のような組織が挙げられるが、それに限定されるわけでは ない。 いくつかの遺伝子類は全組織において発現され、一部は限定された数の組織中に おいてのみ発現され、多くの植物組織の比較によって、小胞子で独占的に発現さ れた遺伝子類を単離することが可能である。 小胞子ＲＮＡは、初期から後期の単一核段階にある小胞子から単離できる。他の 段階を使用することも可能であるが、小胞子の単離は、初期の発生段階において 技術的に困難であり、そして老いた細胞は、限定された核遺伝子活性を有してお り、かつ、プロモータ類は、本発明に記載されたような用途のために適切ではな いであろう。 小胞子類は、やくを除去するために芽を手でつみとることによって都合よく単離 でき、やくを次に乳鉢及びすりこぎ中で１０％シュークロース中でゆっくりと粉 砕して破壊される。この抽出物を次に４４μｍナイロンメツシュでろ過し、次に 小胞子を３０００ｘｇの遠心分離を１分間行い、採取した。ベレットとした小胞 子類を１０％シュークロース中に再懸濁し、前と同じようにろ過及びベレットと した。単離の他の方法も、Ｉ！ｌＪ様に使用できる。 小胞子以外の組織は、種々の方法によって破壊でき、そして、破壊された組織を ＲＮ　Ａ　４１１１のために使用する。モーター駆動ホモゲナイザーを用いて、 組織１ｇ当たり６ＭグアニジンＭＣ１，Ｏ，１ＭＮａ酢酸、ｐＨ６，０，Ｏ，１ Ｍベータ・メルカプトエタノールの溶液１０ｍ１によって組織を破壊することが 便利である。このホモジネートを５０００ｘｇの遠心分離によって透明とし、上 溝を６Ｍ　Ｃ８Ｃ１のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ緩衝液）溶液に層積する 。１゜Ｏ，ＯＯＯＸｇ、１５’　Ｃにおける遠心分離を１２−２０時間行い、Ｒ ＮＡをベレットとし、それをその復水に再懸濁し、０．３ＭＮａ酢酸及び２容量 のエタノールの存在下において再沈澱する。ＲＮＡは、遠心分離によってｒＭ取 し累に再懸濁する。このような方法によって得られたＲＮＡは、オリゴｄ−Ｔセ ルロースクロマトグラフィによって分画し、非ポリアデニル化ＲＮＡの全体から ポリアデニル化ｍＲＮＡを分離する。小胞子ＲＮＡは、非常に良くフィツトした モーダ駆動ガラスホモジナイザーを用いて小胞子を破壊し単離する。バックされ た小胞子類３００μｌのホモジナイズを、６Ｍグアニジン−ＭＣＩ　１ｍｌ、０ ．１）４　Ｎａ酢酸、１）Ｈｅ、　Ｏ，Ｏ，１Ｍベータ・メルカプトエタノール 中で行う。このホモジネートを５０００ｘｇで遠心分離し、そして、透明とした 上溝を６Ｍ　ＣｓＣ１のＴＥ緩衝液溶液に層積する。１００，００　ｘｇにおけ る遠心分離を一晩行い、ＲＮＡをベレットとし、その復水に再懸濁し０．３ＭＮ ａ酢酸及び２容量のエタノール中に再沈澱する。ＲＮＡ抽出の他の方法を用いて も、記載した組織からＲＮＡを得ることができる。オリゴｄ−Ｔセルロースを用 いる標準的手法を用いて、これらの総ＲＮＡ調製物からポリアデニル化ｍＲＮＡ を得る。 このｍ　ＲＮ　Ａは、検出目的のため標識する。ランダムへキサヌクレオチドブ ライマーおよびアルファー（３２Ｐ］−ａＣＴＰの存在下において、前記ｍＲＮ ＡおよびＡＭＶ逆転写酵素を用いて放射性ｃＤＮＡを作製することが便利である 。プローブを、ゲノムライブラリのクローン類含有プレートのニトロセルロース プラークリフトへのハイブリダイゼーションのために使用する。小胞子ｃＤＮＡ のみに強くハイブリダイズし、検討した他のいかなる組織由来ｃＤＮＡにハイブ リダイズしないとして確認できたクローン類を選択する。これらのクローン類は 、プラーク精製しかつＤＮＡ単離のために増殖させる。組換えＤＮＡならびにＤ ＮＡおよびＲＮＡの操作およびクローン類を増殖させ及び単離するための別の方 法は、標準的ラボラトリマニュアルｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ （−Ｅレキュラークローニング）、ラボラトリマニュアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ）、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、　、 およびＳａｍｂｒｏｏｋｓ、Ｊ、、　コールドスプリングハーバ−ラボラトリ（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨー ク、１９８２）に記載されている。 ′″ゝ　−Ｂａ１ａｎａｕ　からのＬ４．　ＬＩＯ，ＬＩＯまたはＬｉ２のゲノ ムＤＮＡ配列を用いて本発明のある面を実行する応用のため、花粉形成または機 能にとって重大なセンス遺伝子を得る（単離する）ための好適な方法は、標準的 方法（Ｇａｉｔ、Ｍ、Ｊ、Ｉ！著、（１９８４）　、オリゴヌクレオチド合成（ Ｏｌｉｇｏｎｕｌｕｃｌｅｏｔｉｄｏ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、実際的方法、１ −２２３！、ＩＲＬプレス、オクソフオード、ｔｌＫ）に従って、相同性ＤＮＡ 配列を合成的に作製し、前記配列を検出目的のため標識し、前記標識配材を　− ゝ　“　Ｂｒ　５ｉｃａ　ｎａ　ｕｓ　ゲノムライブラリを記載の方法に復って スクリーニングすることである。 一定のゲノムクローンのプロモータおよびコード領域の同定は、制限マツピング およびハイブリダイゼーション分析によって決定される。これは、小胞子ＲＮＡ から作製されたｃＤＮＡプローブ類とニトロセルロースに画定化された前記ＤＮ Ａクローン類のハイブリダイゼーションによって達成できる。コード領域及びこ のコード領域のいずれかの側に３けるＤＮＡ領域を双方ともに含む制限エンドヌ クレアーゼ断片類は、適当なベクター類中におけるサブクローニングによって単 離される。いったん＄離されれば、Ｓ１マツピング及びＤＮＡ配列決定のような 技術を用いることは、正確なコード領域及びこのサブクローン化されたＤＮＡ内 部における制限部位を得るために便利である。この分析は４遺伝子転写に関する 極性が公知であれば、この分析：ま容易に達成される。 このセンス遺伝子の転写の極性を決定するためには、それぞれの制限断片類をｐ ＧＥＭ３、ｐＧＥＭ４、またはｐＧＥＭ３ｚ、ｐＧＥＭ４ｚのような商業的に入 手できるベクター類（プロメガバイオチック（ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ 〕、マジソン、ライスコンシン、ＵＳＡ）中でサブクローンできる。これらのベ クターを用いることによって、一定のサブクローン中においてＤＮＡ二重鎖の一 方のまたは他方の鎖に相補性の単鎖ＲＮＡ　（ＲＮＳ）ブロー・ブ類を作製する ことができる。これらの鎮特異的プローブ類は、転写の極性を確立するために、 ｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。これらのプローブ類の中で、このｍＲＮＡに ハイブリダイズし、したがってそれに相補性のプローブ類を単離することができ る。 この情報を用いて、２重鎖ゲノムＤＮＡ分子のどのＤＮＡＩＪＩからセンスｍＲ ＮＡが転写されたかを明確に決定することが可能である。 プロモータＤＮＡ配列類を決定しかつ単離するために、ベクター類のｐＧＥＭシ リーズを、ハイブリダイゼーション−保護実験においてそれぞれのサブクローン 類から単一方向の配列欠失のために使用することができる。これらの実験操作の 詳細な記載は、いくつかのラボラトリハンドブック及びベクターｐＧＥＭシリー ズを供給している生産業者のテクニカルノートに見いだすことができる。これら の実験は、花粉特異的ゲノムクローン類のプロモータおよびコード領域を明確に 確立するであろう。 ｐＧＥＭベクター類においてそれぞれの欠失の配列は、製造業者のテクニカルノ ートに記載されたようにプラスミドミニブレツブスのジデオキシ配列決定法によ って決定できる。転写開始またはプロモータ領域を包含する特異的制限断片類ま たは前記プロモータ領域および転写開始の唖めて近くで欠失された欠失サブクロ ーン類は、花粉保持植物類の発生過程甲の小胞子類中においてのみ発現される遺 伝子類の構築のために選択される。通常、ｌ１ｌ）ＲＡＪ−２２１（クロンテツ クラポラトリズ（Ｃ１ｏｔｅｃｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バロアルト、 ＣＡ）中に見られるｎｏｓターミネータのようなターミネータの上流に挿入され 、そして、アンチセンスＲＮＡに転写されるべき特異的制限断片類はプロモータ 及びターミネータ配列類の間に挿入される。全構築は、配列決定３よび制限消化 の組み合わせによって確認される。このように構築されかつ確認されたアンチセ ンス遺伝子は、植物細胞形質転換のためにＴ−ＤＮＡ基準基準ベクター忙中入さ れる。 選択可能なマーカーを含有するＴ−ＤＮＡベクター類が好適である。ベクター類 、制限酵素類および使用したそれぞれの遺伝子類の選択に応じて種々の方法でア ンチセンス遺伝子が構築できることが理解される。例えば、アンチセンスＲＮＡ 〒に転写することを意図した制限断片類をＴ−ＤＮＡ基準ベクター中に挿入し、 これに対して、プロモータおよびターミネータ構造を先に付加することも便利で ある。これとは別に、先にＴ−ＤＮＡ基準ベクターに添加されたコード領域及び ターミネータの上流にプロモータ断片を挿入することも可能である。さらに、い くつかの作物においては、アンチセンス遺伝子をＴ−ＤＮＡ基準ベクターに挿入 せずむしろ直接ＤＮＡ取り込みに適したベクター中に挿入することが望ましい。 小胞子持異的プロモータ断片外のプロモータ類は、これらのプロモータ類が小胞 子類において機能するのであれば、使用でき、そして遺伝子類及びターミネータ 類の特異的制限断片類に結合できる。 外来ＤＮＡの植物間中への導入は種々の方法で達成されてきた。最も広く使用さ れかつ一般に成功を納めている方法は、　て　−１・−λ：ｊ二り乙２ｘ１　Ａ 　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ」工１ＬＴｉ　プラスミドのよう な感染性因子を外来ＤＮＡの運搬ベクターとして使用することに依存している。 他の用いられてきた方法は、直接ＤＮＡ取り込み、リポゾーム類、電気的導入（ Ｇｕｅｒｃｈｅ、Ｐ、　ら、１９８７．プラントサイエンス（Ｐｌａｎｔ　５ｃ ｉ）５２：１１１−１１６）およびマイクロインジェクション（Ｎｅｕｈａｕｓ 、Ｇ、ら、１９８７．セオレティカル・エンド・アブライドジエネテイクス（Ｔ ｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、）７５　：　３Ｏ−３８）（７）ような機械 的手段を必要としている。最近、マイクロプロジェクタイル及びガンまたはその 他の装置を用いてＤＮＡをコーティングした小金属粒子を細胞中に入れる可能性 が実質的注目を集めてきた（Ｋｌｅｉｎ、Ｔ、Ｍ、ら、１９８７．　ネーチャー （Ｎａｔｕｒｅ）３２７　：　７Ｏ−７３）、今日まで、これ及び他の機械的手 段による成功は、広くは報告されていない。 カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）（Ｈｏｗｅｌｌ、Ｓ、Ｈ，ら、１９ ８０、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０８；１２６５）およびジエミニウイル ス（Ｇｏｏｄｍａｎ、Ｒ，Ｍ、、１９８１．ジャーナル・オブ・ジエネラルヒロ ロジ−（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｉ、）５４　：　９）のベクターとしテノ使用が 提案されたが、しかし、これまでのところ最大の成功を納めた報告は、１グ旦バ ｌ−１Ａ　ｒ　ｂａｃ　ｅｒｉ　ｍ　ｓ　、）（Ｈｏｒｓｃｈ、Ｒ，Ｂ。 ら、１９８５．サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２７：１２２９−１２３１）に よる・　口＜　−’　Ａ　ｒ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　に基づく形質転換システム の使用方法は、現在、多くの異なる種に付いて記載されている。一般に、ＤＮＡ が宿主植物に移行されるがただしその後において腫瘍が形成されることはないよ うに改質された型の天然Ｔｉプラスミドを有する菌株が使用されており、選択に 用いられる選択可能なマーカーに連結した植物ゲノム中に挿入すべきＤＮＡの挿 入を伴う。バクテリアおよび植物組織類はともに培養され、外来ＤＮＡの植物細 胞中への移行を可能とし、それによって形質転換植物が選択された培地上で再生 される。いかなる数の異なる器官及び組織も、１立２友立ヱエＡ旦二旦五５ｉｃ ａｃｅａｓｅ）の構成員のために特に記載されたようにｚ１１ｌ１ｌ立り工ＡＬ Ｌユ江ｌ立工旦二１旦工り介在形質転換のためのターゲットとなることができる 。これらには、細胞薄層（Ｃｈａｒｅｓｔ、Ｐ、ら、Ｌ（Ｊ８８．セオレテイカ ル・エンド・アブライドジエネテイクス（Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、 ）７５　：４３８−４４４）、胚軸（ＤｅＢｌｏｃｋ、Ｍ、　ら、１９８９゜プ ラントフィジオロジ−（Ｐｌａｎｔ　ＰｈｙｓｉｏＬ、）９１：６９４−７０１ ））、葉ディスク（Ｆｅｌｄｍａｎ、に、Ａ、およびＭａｒｋｓ、Ｍ、Ｄ、、１ ９８６、プラントサイエンス（Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、）４７：６３−６９）、茎 （Ｆｒｙ　Ｊ、　ら、１９８７．プラントセルレポート（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ Ｒｅｐｏ’ｒｔｓ）、８：　３２１−３２５＞、子葉（Ｍｏｌｏｎｅｙ、Ｍ、Ｍ 。 ら、１９８９．プラントセルレポート（ＰＬａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ ）。 ８　：　２３Ｂ−２４２）及び胚様体（Ｎｅｕｈａｕｓ、Ｇ、　ら、１９８７． セオレテイ力ルエンドアプライドジエネテイクス（Ｔｈｅｏｒ、ＡｐｐＬ、Ｇｅ ｎｅｔ、）７５　：　３Ｏ−３６）が含まれる。しかし、数種の作物類において は、異なる組織、または異なる形質転換の方法を選択することが望ましいであろ う。 形質転換植物細胞から再生される植物を、通常は選択的因子に対する耐性を付与 する遺伝子であるマーカー遺伝子の発現のために試験する。カナマイシンおよび 抗生物質Ｇ−４１８に対する耐性を付与する頻繁に使用されている遺伝子ネオマ イシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＴ）の場合、文献に記載の技術を用 いてカナマイシンのエン監五旦ホスホリレーションによってまたはこの形質転換 植物組織からのＲＮＡのノーザンプロット解析によるＮ　Ｐ　Ｔ　Ｔｌ遺伝子を コードするｍＲＮＡの存在を試験することによって、遺伝子発現を試験する。 アンチセンス遺伝子の発現を、同一のノーザンプロット技術を用いてモニターす る。センスまたはアンチセンスＲＮＡ転写物のいずれかに対して相同な単ｊｌＲ ＮＡプローブを用いて、センス遺伝子及びアンチセンス遺伝子の発現が確保でき るように、発生過程の小胞子中における前記転写物を検出する。大きさに応じて センス及びアンチセンス遺伝子類からの転写物を分離するために、アガロースゲ ル電気泳動を用い、かつ、非変性条件下でそれを行うことが好適である。アンチ センス遺伝子類の小胞子特異的遺伝子発現を達成しようとしているときには、小 胞子および葉、根などのような小胞子以外の組織中において、アンチセンス遺伝 子類の発現を試験することが望ましく、その結果、小胞子中におけるアンチセン ス遺伝子類の組織特異的遺伝子を確認できる。 植物細胞の遺伝的要素中に安定に組み込まれたセンスまたはアンチセンス遺伝子 の存在は、また、いわゆるサザンプロット技術を用いて１認できる。この操作に ３いて、細胞性または核総ＤＮＡは、形質転換植物または植物細胞から単票され 、そして、好適には、分１ｍ（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）部位における転写のために通 常使用されるベクターを切断する制限酵素で制限され、それによって、分離した （ｄｉｓｃｒｅｅｔ）８片類を生成する。これらの分ｍｌ　（ｄｉｓｃｒｅｅｔ ）／（フタ−断片類は、標準的ゲル電気泳動またはハイブリダイゼーション技術 を用いることによって、形質転換植物または植物細胞の核または！ＤＮＡ中に検 出できる。 アンチセンス遺伝子含有植物中における小胞子の形成は、やく構造の肉眼的顕微 鏡検査によって最初にモニターされる。花の成熟が起こるに伴い、やく形成が遅 延するかまたは完全に坦害され、成熟花粉粒子が全く形成されないかまたは放出 されない。 全ての導入組換えＤＮＡ分子の活性したがって効果は植物ＤＮＡ中への組換えＤ ＮＡ分子挿入の偶然の位置によって影響を受けるので、挿入組換えＤＮＡ分子が 雄性稔性低下を起こす因子に対して植物を感受性とする度合いは、植物によって 変化する。したがって、機能的花粉粒子を産生ずる植物を選択することは必要で ある。 ハイブリッド種子の産生は１選択された雄性稔性植物類から由来する花粉によっ て形質転換雄性不稔性植物類を受粉することによって達成される。受粉は、手、 風または昆虫受粉、または雄性稔性及び雄性不稔性植物間の機械的接触などのい かなる手段でも行うことができるが、それらに限定されない。多くの植物種にお ける商業的規模でのハイブリッド種子生産のために、風または昆虫による受粉が 好適である。花粉供与のための植物の選択は、異なる植物との標準的交雑、その 後の子孫の分析及び最善の組み合わせ能力と優れた農業的特性を有する系統の選 択によって決められる。ハイブリッドにおける稔性の回復は、特定実施例に記載 の方法を用いて、達成される。 本発明は、下記の実施例によって例示されるが、ただし、限定されるわけではな い。 ！五億よ この実施例においては、アンチセンスＲＮＡを、植物中における遺伝子活性■富 のために特に使用した。ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御下にベータ・グルクロ ニダーゼ遺伝子を発現するタバコ植物を、非形質転換対照タバコ栽培種ｘ２り＜ 　ＩｉＪ、ｔ　ｃ　ｕｍ　ｃｖ、Ｄｅｌｇｏｌｄの形質転換によッテ作製した。 これを達成するため、長さ８インチ未満のタバコの葉をエタノールに５−６秒間 曝して表面殺菌した。次に、数分間、通常、５−１０分間、または、葉柄の切断 端が白くなるまで１％次亜塩素酸ナトリウムに曝し、次に滅菌精製水中で数回洗 浄した。およそ０．５から１．０平方センチメータまでの葉の部分をＴ１プラス ミド＄）ＭＰ９０を有する　−１、−ζ工・ｒ　ｕｍｅｆ　ｃ’　ｎ　ＧＶ３１ ０１とともに２日間コカルチャーし、葉条誘発培地上で二元ベクターｐＢ１１２ １．１を有するｖｉｘ　機能　−ｎｓ　（Ｋｏｎｃｚ、Ｃ，および５ｃｈｅｌｌ Ｊ、、１９８６．モレキュラー・エンド・ジェネラルジェネテイクス（Ｍｏｌ。 Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）２０４　：　３８３−３９６に記載）を提供した。こノ ヘクターは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータによって駆動されｎｏｓ　ｔｅｒによっ て終止されるＧＵＳ遺伝子を含有するＢ１ｎ１９の誘導体であり、クロンテック ラボラトリイズ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バロアルト 、Ｃａ、、・ＵＳＡから入手可能である。形質転換されたタバコ細胞類は、０． ８％寒天、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュークロース、１リツトル当たりベン チルアーデニン１ｍｇ＋　１リツトル当たりアルファナフタレン酢酸０．１ｍｇ 、（ＮＡＡ）３００μｇ／ｍｌカナマイシンおよび５００μｇ／ｍ１カルベニシ リン（本質的にＨｏｒｓｅｈら、１９８５．サイエンス、２２７　：１２２９− ４２３１に記載の通り）を含有する葉条誘発培地上で選択した。再生された葉条 は、次に２％シュークロース、５０ｇｇ／ｍｌカルベニシリンおよび０．５ｍｇ ／ｍｌのＮＡＡおよびインドール酢酸のＢ５培地からなる根誘発培地に移した。 カナマイシン上での選択の後、実質的に高い構成的レベルのＧＵＳ活性を示しか つ単一の末男配列ＣａＭＶ３５ＳプロモーターＧＵＳ−ｎｏｓ　ｔｅｒ構築体挿 入物を含有するタバコ形質転換体を選択した。この植物（ＴＴＲ−４８，ＧＵＳ ＋）を、次に、その構築を図１に示したアンチセンスＧＵＳ遺伝子を含有する二 元ベクターｒ’ＡＬ１３０２によって再度形質転換した。ＰＡＬ１３０２による ＴＴＲ−４８タバコ植物の再形質転換を伴う実験では、葉条誘発培地は２０μｇ ／ｍｉのハイグロマイシン、３００μｇ／ｍ１のカナマイシンを含有し、センス 及びアンチセンスＧＵＳ構築体の双方を含有する植物類の選択を確実とした。形 質転換体は成熟するまで生長させ、温室で自家受粉させた。 アンチセンスＧＵＳベクターＰＡＬ１３０２によるＴＴＲ−４８（ＧＵＳ＋）の 再形質転換により生じたタバコ植物の葉について、ＧＵＳ活性をアッセイした。 葉抽出物中におけるＧＵＳ活性を、分光学的にアッセイした。およそ０．５ｇの 葉組織を２ｍｌのＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＰＯ４ｐＨ７，０，１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ　β−メルカプトエタノ ール、１ｍＭ　ｐ−ニトロフェニルグルクロナイド、１００μｇ／ｍｌウシ血清 アルブミン、０．０２％アジ化ナトリウム）中でポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ）によって粉砕し、３０ａＣで６時間インキュベートし、そして反応を０．４ｍ ｌの２．５Ｍ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールの添加によっ て停止した。産生されたｐ−ニトロフェノールの量は、４１５μｍにおける吸光 度を測定することによって計算した。等量の葉抽出物を含有する停止反応物をブ ランクとして使用した。抽出物中の相対的酵素活性は、タンパク質１ｍｇ当たり 産生された１分当たりのｐ−二トロフェノールとして計算しナノモルで表現した 。 植物１０体を検査し、それらは全てＴＴＲ−４８で観察されたものと比較して、 大幅なＧＵＳ活性レベルの低下を示していた。植物５体（ＴＴＲ−１からＴＴＲ −５まで）を、ＧＵＳ遺伝子活性のアンチセンスＲＮＡ１ｉ害効果を詳細に分析 するために選択した。再形質転換されたタバコ植物類ＴＴＲ−１からＴＴＲ−５ （図１５、レーン１−５）は、検査した葉の発生段階にもかかわらず、全て実質 的から完全なまでの（レーン４）ＧＵＳ活性の低下を示した。当初のＧＵＳ十植 物ＴＴＲ−４８（図１５、レーン６）で観察された最高レベルのＧＵＳ活性をＰ ＡＬ１３０２によって再形質転換された植物類のいかなるもので見られた最大レ ベルと比較しても、ＧＵＳ活性の低下が少なくとも９０％であることが示されて いる。対照植物ＴＴＲ−４８（図１５、レーン７）で見られたＧｌｊＳ活性のレ ベルは、当初のＧＬ’Ｓ＋植物（レーン６）のものと類似であり、ＴＴＲ−４８ が受けた再形質転換および再生過程がＴＴＲ−１からＴＴＲ−５までに見られた ＧＵＳ活性の低下を担っていないことが示唆される。若い葉から得られた総タン パク質抽出物のウェスタンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析を行った 。葉タンパク質抽出のため、３よそ１００ｍｇの組織を上記に述べたＧＵＳ抽出 物０゜７ｍｌ含有１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管中で粉砕した。等量のＳＤ Ｓ　ＰＡＧＥ２Ｘ試料ロード用ｆａｌｉ液（１，３Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ ８，８，２％β−メルカプトエタノール、５０％グルセロール、５ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、０．１％ブロモフェノールブルー）を添加し、試料を室温で１５分間、イン キュベートした。この抽出物を１２；　ＯＯＯｒｐｍで２分間、遠心分離し、こ の上清を使用するまで一８０１１Ｃに凍結した。タンパク質は１０％ＳＤＳ　Ｐ ＡＧＥゲルに再溶解し、すぐに電気泳動的にニトロセルロースフィルター上に移 した。ＧＵＳタンパク質を次に、クロンテックラボラトリイズから得たウサギ抗 β−グルクロニダーゼ抗体および抗つサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合キ ット（プロメガバイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）　、マジソン 、ＷＬ　ＵＳＡ）を用い、製造業者の指示に従い、このゲル中で検出した。等量 のタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ ＤＳ　ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロース上に移し、ＧＵＳタンパク 質に特異的な抗体と交差関係させた。ウェスタンプロット上で検出されたＧＵＳ タンパク質の量は、それらがＴＴＲ−４８中におけるように高レベルの活性を示 そうが、あるいは、ＴＴＲ−３におけるように全く識別可能な活性を示さない場 合であろうが、検査したタバコ植物の全ての葉で観察されたＧＵＳ活性と良く相 関した（図１５、レーン３）。ＴＴＲ−１からＴＴＲ−５までのＧＵＳ活性の低 下は、したがって、これらの植物内部におけるＧＵＳ酵素の量が低いことに直接 的に帰すことができる。サザンブロット分析を行い、センスＧＵＳ遺伝子がＴＴ Ｒ−，１からＴＴＲ−５までにまだ存在しかつ未変性であることを確認し、３よ び、このアンチセンスＧＵＳ構築体がこれらの植物のＤＮＡ甲に正しく組み込ま れたことを確認した。 ＴＴＲ−４８中における当初のセンスＧＵＳ遺伝子の配列は、アンチセンスＧＵ Ｓ含有ベクターによる形質転換によって影響を受けないことがわかり、そして、 さらに、この分析のために選択された植物中において、アンチセンス遺伝子の１ 乃至３個のコピーがセンス遺伝子を含む植物のゲノム中に挿入されることが確か められた。また、単一の挿入されたアンチセンス遺伝子が、センス遺伝子活さの ほとんど全てに同等の低下を起こすことができることも決定された。葉の総ＲＮ Ａについてノーザンプロット分析を行い、ＴＴＲ−１からＴＴＲ−５までに観察 されたＧＵＳ酵素量の低下がそれらのＧＵＳ　ｍＲＮＡレベルに相関しているか どうかを調べた。総ＲＮＡを、２ｍｌの抽出緩衝液（６Ｍグアニジン−ＨＣｌ。 ０．１ＭＮａＡｃ　ｐＨ６，Ｏ，ｉ、Ｏ％β−メルカプトエタノール５ｇをポリ トロンを用いて１０−３０秒間粉砕することによってタバコ葉から調製し、上清 を等量の５．７Ｍ　ＣｓＣ１のＯ．ＬＭ．ＮａＣ１．１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｉ　ｐＨ７．５．１ｍＭ　ＥＤＴＡ上に層積し、再度３５．００Ｏｒｐｍで１６ 時間１５″′Ｃで遠心分離した。結果として生じたＲＮＡベレットを○。 ＬＭ　ＮａＡｃ　ｐＨ６．Ｏ，０．１％ＳＤＳに再懸濁し、そして、等量ノフエ ／ールー’７００ホルム（５０：５０、ｖ　／　ｖ　）で抽ａした。水相を、０ ．３ＭＮａＡｃに調節し、そして、ＲＮＡを２容量のエタノールで沈澱させた。 遠心分離後、このベレットを７ｏ％エタノールで洗浄し滅菌精製水に再懸濁した 。ＲＮＡ試料を、１．３％アガロースゲル中水酸化メチルＸｌＨの存在下で再溶 解し、ナイロン膜上に移した。この膜を、（３２Ｐ）ＵＴＰ標識センスまたはア ンチセンスＧＵＳ　ＲＮＡ転写物によってプローブした。これらの転写物は、ｐ ＢＩ２２１。 １のＢａｍＨｒ−Ｓｓｔｌ断片（ＧＵＳコード配列を全て含んでいる）をｐＧＥ Ｍ−４ｚのＢａｍＨＩ−Ｓｓｔ　１部位に挿入して得られたプラスミドｐＧＥＭ −ＧＵＳから作製した。プローブは、ｐＧＥＭ−ＧＵＳをＥｃｏＲＩで切断し次 にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンスＧＵＳ　ＲＮＡにハイブリダイ ズできる転写物を提供することによって、またはＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩによる 消化およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによる転写によってセンスＧ　Ｕ　Ｓ　ｍ 　Ｒ　Ｎ　Ａのみにハイブリダイズ可能なアンチセンス転写物を産生ずることに よって、作製された。放射性標識センス特異的ＧＵＳ　ＲＮＡプローブは．ＴＴ Ｒ−１からＴＴＲ−５までに見られるＧＬＩＳｍＲＮＡのレベルが当初のＧｔＪ Ｓ＋植物であるＴＴＲ−４８に見られたものよりも実質的に低いことを実証した 。予測の通り、未形質転換タバコは、ＧＵＳ転写物を有していなかった。センス ｍＲＮＡのレベルは、これらの植物中で■察されたＧＵＳタンパク質の量及び活 性と囁めて良い相関を示す。アンチセンス特異的ＧＵＳ　ＲＮＡプローブを用い たノーザンプロット分析は、アンチセンスＧＵＳ転写物の再形質転換植物類にお ける存在を実証した。ＴＴＲ−１からＴＴＲ−５までに見られたＧＵＳタンパク 質の低下量およびＧＵＳ活性は、したがって、これらの植物における低レベルの ＧＵＳｍＲＮＡに帰すことができる。低レベルのＧＵＳ　ｍＲＮＡは、常に、ア ンチセンスＧＵＳ　ｍＲＮＡの存在に関連している。これらの結果は、ターゲッ トセンス遺伝子がアンチセンスＲＮＡを用いてうまく雇富できることを明白に示 唆している。 ！１億ｌ 我々は、次に、花粉特異的アンチセンスＲＮＡを産生する構造プロモータ類の使 用に注目した。ｐＢＩ２２１由来Ｃ　ａ　Ｍ　Ｖ　３　Ｄ　Ｓプロモータを、Ｈ 　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　−ＸｂａＩｌｌ？片として単離し、Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｘ ｂａｌで先に切断されたＰＡＬＩＯ０１中にクローン化した。これによって、ｎ ｏｓ　ｔｅｒに結合したＣａＭＶ３５Ｓプロモータを有するベクターが産生され 、プロモータおよび蔓−ミネータの間に、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ、Ｋ ｐｎｌおよびＳｓｔ　Ｉ（７）ための独自の部位があった。このベクターをＰＡ Ｌ１００７と命名した．ＰＡＬＩＯ０７はＢａｍＨ　工によって消化し、そして 、この消化されたベクターに対して、アンチセンス方向のクローンＬ１６からの コード領域を含有する２、４ＫｂのＢａｍＨ工断片を添加した。このベクターを ＰＡＬ１０３５と命名し、に乞九二土１スＢｒ　’ｃ　ｎ　ｕ　の形質転換に使 用した。形質転換は、Ｍｏｌｏｎｅｙ，Ｍ．Ｍ．　ら、（プラントセルレポート （Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）（１９８９）８：　２３Ｂ−２４２ ）に記載の方法を用いるかまたは形質転換は、表面殺菌茎表皮層で実行できる。 この操作のため、１１ｚユニ土プｒａ　ｉ　ｎ　ｓ　Ｌ．ｓｓｐ．ｏｌｉｆｅｒ ａ　ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒの種子を、８インチポットの徐放性肥料”ニュートリコ ート（Ｎｕｔｒｉｃｏａｔｅ）”２ｇ／ｌを混合した”プロミックス（Ｐｒｏｍ ｉｘ）ｎ中に蒔いた。１６光日期間（自然及び人工照明を用いて）、温室で植物 を生長させた。 コカルチャーおよび再生実験のため、およそ１．５月齢の植物の先端の３つの茎 節間を使用した（すなわち、伸長した花の穂および数個の開いた花）。未変性の 茎部分をエタノール中で３０秒間および１％次亜塩素酸ナトリウム甲で１ｏ分間 表面殺菌し、その後に、殺菌精製水中で３回洗浄した。形質転換のため、盃２上 立２スに３いて機能を提供するためのＴ１プラスミドｐＭＰ９０を有する１グニ バー＋　−　＝　’：Ｉ：ゝ　Ａ　ｒｏｂ　ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅ工Ａ」二 Ｌ１旦」よ）ＧＶ３１０１及び二元ベクターＰＡＬ１１１０をＹＥＰ培地（１リ ツトル当たり酵母抽出物１０ｇｍ．ｉリットル当たりバクトベブトン１０ｍ　ｇ 　＋および１リツトル当たりＮａＣ１５ｇｍ，ｐＨ７．０からなり、１ｍ１当た り１００μｇｓのカナマイシンを二元ベクター含有菌細胞の選択のため含有する ）上で増殖させた。細胞は、２８”　Ｃで１５から２日間増殖させた。遠心分離 によって細胞を採取し、そしておよそ１０６−１０７細胞／ｍｌの密度でＭｓミ クロ及びマクロ栄養物およびＦｅ　Ｎａ−ＥＤＴＡ４０ｍｇ／ｌ　（ＢＤＨケミ カルから得た）および３％シュークロース含有Ｂ５ビタミン、ペンチルアデニン １０ｍｇ／ｌ，および０．５ｍｇ／ｌアルファナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および １８、８　ｍ　Ｍ　Ｋ　Ｎ　Ｏ　３プラス２０．６ｍＭ　ＮＨ．ＮＯ３からなる 液体ＥＬ中に再懸濁した。このＥ１培地を固体培地プレートのために使用する際 には，培地を０。 ８％寒天（シグマ）で固化した。 細胞懸濁物を滅菌ベトリ皿の底に入れ、滅菌された茎を菌懸濁物中で直接切断し た。部分を縦方向に半分に分割し、およそ５ｍｍの切片に切断した。切断された 部分を、３日間のコカルチャーの為に連続蛍光灯（６０マイクロ工インシユタイ ン／ｍ２／ｓｅｃ２）下、固体ＥＬＦ地上のろ紙デイスク上に２５１′Ｃで置い た。２−３日間のコカルチャーの後、外植体を５００μｇ／ｍｌカルベニシリン および１００μｇ／ｍｌカナマイシン（シグマ）含有固体Ｅｌ培地に移した。葉 茶が４−８週後に形成され、切片を３−４週毎にカルベニシリンおよびベカナマ イシン含有新鮮固体ＥＬ培地に移した。形成されかつ退色されなかった葉茶を切 除し、ＰＤＲ培地（Ｂ５−２％シュークロースおよびＮＡＡおよびＩＡＡ各０。 ５ｍｇ／ｌ）で発根させた。数例において、選択培地で生長した緑の非再生癒合 組織を外植体から分離し、新鮮培地に移し再生を刺激した。形質転換植物を湿度 のあるチェンバーに移し、２ないし４遍後に温室に移した。植物は１６光日期間 生長させ開花させた。クローン繁殖を用いて、植物系統を増やしかつさらに手に よる交雑及びカナマイシン含有培地における交雑植物からの芽生えの選択を行っ た。この培地は、０．８％寒天、１０分の１のＭＳ塩，１ｍ１当たり１００μｇ のベカナマイシンからなり、培地には全くシュークロースを含んでいない。表面 殺菌種子を用いた。この種子を、７０％エタノール中で数秒間洗浄し、１５分間 次亜塩素酸ナトリウム中に浸種し、次に殺菌精製水中で３！ｉ＠ｌｔ洗浄するこ とによって表面殺菌した。種子を減菌皿の寒天の表面に置き、発芽させた。アン チセンス遺伝子に連結したカナマイシン遺伝子を含有していない植物類は退色し 死亡したが、一方、アンチセンス遺伝子を有するものは、緑のままであり、その 後土壌に移し開花させた。 夾轟倒旦 この例では、我々は、ベクターＰＡ．Ｌ１００７とともに別の花粉特異的コード 領域を使用した。この場合、クローンＬ１９由来１．３に．ｂのＨ　ｉ　ｎ　ｄ 　Ｉｎ断片を単離し、平滑末端として、ｐＧＥＭ−４ｚのＳｍａＩ中にクローン 化した。このサブクローンを１）ＰＡＬ１９１４と命名し、次にＸｂａＩおよび ＳｓｔＩによって消化した。この断片をＸｂａｌ−ＳｓｔＩ切断ＰＡＬ１００７ に添加し、ＰＡＬ１３’０７と呼ばれるベクターを生成した。このベクターは、 アンチセンス方向のクローンＬ１９由来コード領域に融合したＣａＭＶ３５Ｓプ ロモータを含有している。このベクターを用いて、実施例２に記載の通り、　− ぐ　・　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａ　ｕｓ　を形質転換した。 夾箆孤丘 我々は、次に、花粉特異的アンチセンスＲＮＡを産生する誘導プロモータの使用 に注意を向けた。この例では、Ｄ．　”’　−　Ｄ．ｍ　ｌａｎｏ　ａ１立二） 　７　Ｏ　ｋ　ｄ熱ショックタンバク質プロモータの１．２ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ −Ｐｓｔｒ断片を、サブクローンｐＰＷ２２９　（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｒ．　ら 、１９７９、セル（Ｃｅｌｌ）１８：１３５９−１３７０）から単離し、Ｈ　ｉ 　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　−　Ｐ５ｔＩＱ］断ｐＧＥＭ４ｚにクローン化した。この熱 シヨツクプロモータをＨｆｎｄｌｌｌ−ＳａｍＩ断片として切断し、そして、Ｈ ｉｎｄＩＩＩ−／Ｓｍａｌ切１１ｒＰＡＬ１００１中にクローン化した。これに よって、ポリリンカーの部分及びｎｏｓｔｅｒが後続した熱シヨツクプロモータ を含有するベクター（ＰＡＬ１００９）が産生された。ＳｍａＩ部位を使用して 、クローンＬ１９由来０．３ｋｂＨｉｎｄｕｌｌ断片をクローン化し、次に、こ の断片を平滑末端とした。熱シヨツクプロモータに関してアンチセンス方向のこ の断片を含有するクローンをＰＡＬ１４０３と命名した。このベクターを用いて 、実施例２のように　−ぐ　・　Ｂｒ゛　ｎ　ｏ　を形質転換した。さらに、単 一のＥｃｏＲＩがこの構築体のｎｏｓ　ｔｅｒ末端に存在しているので、マーカ ー遺伝子をこの構築体に添加し、この遺伝子の挿入のために単一のＥｃｏＲ１部 位を用いて、ＣａＭＶ３５Ｓ駆動酵素β駆動酵素口ニダーゼを付加した。このベ クターは、形質転換を行うために便利な遺伝子をここで含んでいることを除き、 ＰＡＬ１４０３と司−であり、ＰＡＬ１４０８と命名され、実施例２に記載のよ うに１立ｚ九二±ヱスｒ’ｎａｓ　の形質転換のために使用した。 夾１斑互 本実施例は、花粉細胞中において特異的に花粉特異的アンチセンスＲＮＡを発現 する花粉特異的プロモータの使用に関する。このため、ベクターＰＡＬ１１０７ を使用して図４に記載のＣＤＮＡクローン４Ｆ由来アンチセンスＲＮＡを作製し た。このアンチセンスベクターの構築のため、ｃＤＮＡクローン４Ｆ由来Ｅｃｏ ＲＩ断片を単票し、フレノウにより平滑末端としてＰＡＬ１１０７のＳｍａ　１ 部位中にクローン化した。アンチセンス方向（制限酵素分析によって決定された ）のＣＤＮＡクローンを含有するベクターを選択した。このベクターをＰＡＬ１ １０７４Ｆと命名し、かつ、実施例２に記載のように　−’　−Ｂｒａｔｎｕｓ 　の形質転換に使用した。 東五五旦 本実施例では、ベクターＰＡＬ１１０７を使用して、実施例４記載のクローンＬ １６の２．４ｋｂ’ＥＩａｍＨＩ断片からアンチセンスＲＮＡを作製した。この アンチセンスベクターの構築のため、クローンＬＬ６田来２．４ｋｂ　ＢａｍＨ Ｉ断片を単離し、そして、ＰＡＬ１１０７のＢａｍＨＩ部位中にクローン化した 。 アンチセンス方向（ｅｌｌ限酵素分析によって決定された）のこの断片を含有す るベクターを選択した。このベクターをＰＡＬ１１０７−１８ＣＲＡＳと命名し 、かつ、実施例２に記載のように１立之】二ｊフ−Ｌ　ｒａｓ　’ｃａ　ｎａ　 ｕｓの形質転換に使用した。 裏鳳班ヱ 本実施例では、ベクターＰＡＬ１１０７を使用して実施例５記載のクローンＬ１ ９の１．３　ｋ　ｂ　Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ＋断片からのアンチセンスＲＮＡ作製 を行った。このアンチセンスベクターの構築のため、クローンＬ１９由来１．３ ｋｂ　Ｈｉｎｄ■断片を単離し、平滑末端とし、そして、ＰＡＬ１１０７のＳｍ ａＩ部位千部位口−ン化した。アンチセンス方向（制限酵素分析によって決定さ れた）のこの断片を含有するベクターを選択した。このベクターは、ＰＡＬ１１ ０７−１９ＣＲＡＳと命名し、かつ、実施例２に記載のように　−ぐ　・　Ｂｒ ａｓｓｉＵ旦ｊ」」−の形質転換に使用した。 夾五透旦 このため、ベクターＰＡＬ１１０７を使用して、面５記載のクローンＬＩＯに関 連したＣＤＮＡクローンからのアンチセンスＲＮＡを生成した。このアンチセン スベクターの構築のため、ｃＤＮＡクローンＬ１６由来ＥｃｏＲＩ断片を単離し 、そして、フレノウによって平滑末端とし、ＰＡＬＬ１０７のＳｍａＩ部位中に クローン化した。アンチセンス方向（制限酵素分析によって決定された）のＣＤ ＮＡクローンを含有するベクターを選択した。このベクターは、ＰＡＬＩＩＯ７ １０Ｇと命名し、かつ、実施例２に記載のように　−５・　ｒａｉ　ｎ　ｕ　の 形質転換に使用した。 衷ム透ｌ このため、ベクターＰＡＬＬ：ＬＯ７を使用して、メロ記載のクローンＬ１９に 関連したＣＤＮＡクローンからのアンチセンスＲＮＡを生成した。このアンチセ ンスベクターの構築のため、ｃＤＮＡクローン由来ＥｃｏＲ２ｉｌＦ片を単離し 、そして、フレノウによって平滑末端とし、ＰＡＬ１１０７のＳｍａ工部位中に クローン化した。アンチセンス方向（制限酵素分析によって決定された〉のＣＤ ＮＡクローンを含有するベクターを選択した。このベクターは、ＰＡＬＬ１０７ Ｌ９と命名し、かつ、実施例２に記載のように　−’　−Ｂｒ　ｓ　’ｃａ−１ １Ｌ且旦りの形質転換に使用した。 東１斑１旦 本実施例においては、ＬＩＯとともに含有される遺伝子に相同性のＣＤＮＡクロ ーンを用い、ベクターＰＡＬ１４２１中の花粉特異的プロモータを使用して、ア ンチセンスＲＮＡを作製した。これは、ＥｃｏＲＩによってクローニングベクタ ーからＣＤＮＡクローンを切断しこの断片をフレノウによって平滑末端とし、達 成された。この平滑末端ｃＤＮＡ断片をＰＡＬ１４２１のＳｍａＩ部位中にクロ ーン化した。両方向においてＣＤ　Ｎ　Ａ挿入物を含有するクローンを回収し、 そして、ＰＡＬ１４２１に関してアンチセンス方向にある挿入物を含有するひと つを選択して、二元ベクターＰＡＬ１４９２を形成させた。ＰＡＬ１４９１を使 用して、実施例２に記載のように　−ン　・　Ｂｓ１ａ　ｕｍを形質転換した。 亙五医よよ 本実施例においては、ベクターＰＡＬＬ１２１中の花粉特異的プロモータを用い 、ＬＩＯ内部に含有される遺伝子に相同性のＣＤＮＡクローンを使用してアンチ センスＲＮＡを生成した。ＥｃｏＲＩによってクローニングベクターからこのＣ ＤＮＡクローンを切り出しかつこの断片を平滑末端とすることによって、これを 達成した。この平滑末端ｃＤＮＡ断片をＰＡＬ１１２１のＳｍａＩ部位中にクロ ーン化した。両方向においてｃＤＮＡ挿入物を含有するクローンを回収し、そし て、ＰＡＬＬ１２１のプロモータに関してアンチセンス方向にある挿入物を含有 するひとつを選択して、二元ベクターＰＡＬ１１１０を形成させた。ＰＡＬＬｌ ｌｏを使用して、実施例２に記載のように　−ン　・　Ｂｒａ　８ｉ。 Ｌ−ユ見且旦互りを形質転換した。 ！１億１１ 本実施例においては、Ｌ１９由来花粉特異的プロモータを用い、花粉特異的アン チセンスＲＮＡを生成した。形質転換ベクターＰＡＬ１９２０をＳｍａ　Ｉ　！ こよって消化した。このＳｍａＩ部位に対して１、このクローン含有ベクターを ＥｃｏＲＩによって消化しかつその断片を平滑末端とすることによって、クロー ンＬ１０に相同性のＣＤＮＡクローンに対応するＤＮＡ断片を添加した。この平 滑末端ｃＤＮＡ断片をＰＡＬ１９２０のＳｍａＩ部位中にクローン化した。両方 向においてｃＤＮＡ挿入物を含有するクローンを回収し、そして、ＰＡＬ１９２ ０のプロモータに関してアンチセンス方向にある挿入物を含有するひとつを選択 して、二元ベクターＰＡＬ１９２１を形成させた。ＰＡＬ１９２１を使用して、 実施例２に記載のように　−ゝ　・　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａ　ｕｓ　を形質転 換した。 東五医よユ 本実施例において、アンチセンスＲＮＡをクローンＬ１９のイントロン領域に対 して特に作製し、そして、クローンＬ１９由来イントロンを欠失する特異的復旧 遺伝子を作製する。これら２つのベクター類の構築を図１２に概略した。ＰＡＬ １９５４を用いて、実施例２に記載のように　−’　−ＢｒａｓｓｉＢ且旦呈り を形質転換し、雄性不稔性系統を作製した。特異的復旧植物系統を作製するため に、ベクターＰＡＬ１９ｂ５を使用し、実施例２に記載のように　−ぐ　・　Ｂ ｒａｓｓｉｃａ　ｎａ　ｕｓ　を形質転換した。 ！五患工丘 不実施例では、我々は、クローンＨＰＩＯＩの高活性プロモータ断片を用いてク ローンＬ１９のイントロン領域に対するアンチセンスＲＮＡを合成する。この実 施例のため、図１２に詳細に示したクローンＬ１９のイントロン領域を含有する サブクローン、ｐＰＡＬ１９１４をＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＢａｍＨＩによ って消化した。クローンｐＰＡＬｉ９１４由来プロモータ断片を、Ｈｉｎｄｌｌ ｌ−ＢａｍＨ工断片として付加し、イントロンに関してアンチセンス方向にある プロモータ新月を含有するクローンを作製した。このクローンは、プロモータの 転写がＲＮＡの生成を起こすような方向でプロモータを含有しており、このＲＮ Ａの一部分はクローンＬ１９のイントロン領域に相同性のアンチセンスＲＮＡを 含有している。 このクローンをＩ）ＰＡＬ１９ＨＰと命名した。このクローンｐＰＡＬ１９ＨＰ は、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ及びＳｓｔ　Ｉによって消化し、そしてＰＡＬＬ○０ １のＨｉ　ｎ　ｄ　ｉｌｌおよびｓｓｔ　Ｉ部位を用いてベクターＰＡＬ１００ Ｉ中にクローン化して、ＰＡＬＨＰ１９を生成した。ＰＡＬＨＰ１９を使用して 、実施例２に記載のように１ラン】ニニＬプ２−０にＡ」すＬ１旦」−−１盈」 」」Ｏ−を形質転換した。ベクターＰＡＬ１９５５は、ＰＡＬＨＰＬ９を有する 植物類において稔惇復旧のために使用できることを明記すべきである。 ！１斑よｌ サブクローンｐＰＡＬＯ４２０中の花粉特異的プロモータを使用して、下記のよ うな花粉特異的プロモータの制御の下にアンチセンスＲＮＡ遺伝子を構築した。 −テ゛　ゝ　Ａｒａｂａｄ　ｓｉｓ　のポリュビキチンをコードするＤＮＡ断片 を、ユビキチン単量体タンパク質のコピーを５個有するポリュビキチン遺伝子を 含有するプラスミドから単離し、ライスコンシン大学、マジソン、Ｗｉ。 ＵＳＡから入手し、そして、Ｂｕｒｋｅら、モレキュラー・エンド・ジェネラル ジェネティクス（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、＞、印刷中に記載されている。 ポリュビキチン遺伝子のコピー５個のうち３個を含有するＢａｍＨＴ−Ｂｇｌｉ Ｉ断片を単離し、この断片を、ＰＡＬＯ４２０のポリリンカーの単一のＢａｍＨ Ｉ部位を使用することによってＩ）ＰＡＬＯ４２０中に挿入した。これによって 、ｎｏｓ　ｔｅｒポリアデニル化シグナルを後続したアンチセンス方向のユビキ チンコード配列含有ＤＮＡ断片をｆ＆ＩＩ！したクローンＬ４由来花粉特異的プ ロモータ含有プラスミドが得られた。このプロモータ／アンチセンス遺伝子構築 体をＥｃ。 ＲＩによる消化によってＰＰＡＬＯ４２０から切り出した。プロモータアンチセ ンス遺伝子含有ＥｃｏＲＩ断片をＢＩＮ１９のポリリンカーのＥｃｏＦＨ部位に 挿入し、その結果、二元形質転換ベクターＰＡＬＬ４７９が形成した６　Ｐ　Ａ Ｌ　Ｌ４７９を使用して、実施例２に記載のように１立ン友二す　Ｂ　ｒ　ａ　 ｓ　ｓ　ｉ　ｃ−１−ユ且且旦ｌ工を形質転換した。 夾五医よ旦 ベクターＰＡＬ１４７９を使用して、実施例１に記載のようにタバコを形質転換 した。 太１億１１ サブクローンｐＰＡＬＯ４２０中の花粉特異的プロモータを使用して、下記のよ うな花粉特異的アンチセンスＲＮＡ遺伝子を構築した。パインアクチンをコード するＤＮＡ断片を、Ｊ、Ｋｅｎｅｙ−Ｂｙｒｎｅ、Ｐｅｔａｗａｗａ　Ｃａｎａ ｄａから入手した。２つのクローン、Ｐａｃｌ−Ａｔ；よびＰａｃ２を得たが、 クローンＰａｃｌ−Ａについては、カナディアンジャーナル・オブ・フオレスト リリサーチ（Ｃａｎｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ）（１９８８）１８：１５９２−１６０２に記載されており、そし て第２のクローンＰａｃ２　（この配列はＰａｃｌ−Ａと極めて相同であり、か つ、そのヌクレオチド配列は公表のため提出された）。５ｐｈｌ’ｌｆｆ片は、 パインアクチンの完全コード配列を含有するＰａｃ２から単離された。この断片 は、また、小量の５′および３”ＨＩコード領域を含有している。この５ｐｈＩ 断片をｐ（３ＥＭ−４ｚの唯一の５ｐｈｒ部位中にクローン化した。このサブク ローンから、このコード領域のみを含有するＸｂａ工断片を単離し、そしてこの Ｘｂａｌ断片をｐＯＥＭ−４２の単一のＥｃｏＲＩ中にクローン化した。ポリリ ンカー中において、遺伝子の５′末端がＢａｍＨＩ部位の次に配置され、かつ遺 伝子の３゛末端がポリリンカー中の５ｓａ１１部位に隣接しているような方向を 有するクローンを選択した。このプラスミドは、ｐＰＡＬ　ＰＡＣと命名した。 アクチンコード領域をＢａｍＨＩおよび５ａｌＴによる消化によってｐＰＡＬ　 ＰＡＣから単離した。このＢａｍＨ工および５ａｌＴ断片を、ｐＰＡＩＬ’０４ ２ｃ）のポリリンカー内部に含有されるＢａｍＨＩｊ３よびＳａｌ　：　１部位 を用いて、ｐＰＡＬＯ４２中にクローン化した。これによって、ｎｏｓ　ｔｅｒ ポリアデニル化シグナルを後続したアンチセンス方向のアクチンコード領域を含 有するＤＮＡ断片を後続したクローンＬ４ＦＢ来花粉特異的プロモータ含有プラ スミドが得られた。このプロモータ／アンチセンス遺伝子構築体は、ＥｃｏｌＨ による消化によってｐＰＡＬｏ４２０から切り出した。プロモータアンチセンス 領域を含有するＥｃｏＲ１断片をＢＩＮ１９のポリリンカーのＥｃｏＲ１部位中 に挿入し、結果として二元形質転換ベクターＰＡＬ１４９８が形成されることに なった。ＰＡＬ１４９８を用いて、実施例２に記載のように　−’　、　Ｂ’ｒ ａｓｓｉ　ａ’ｎａ　ｕｍを形質転換した。 夾五忽１五 ベクターＰＡＬ１４９８を使用して、実施例１に概略したようにタバコを形質転 換した。 夾五医工旦 本実施例では、我々は、アンチセンス遺伝子がベクターＰＡＬ１１０８中におい て花粉特異的プロモータの制御下にあるという事実によって、花粉細胞中におい て特異的にハイグロマイシン耐性を阻害するアンチセンス遺伝子によって、ハイ グロマイシン耐性に先に形質転換されたタバコを形質転換する。ハイグロマイシ ン耐性の形質転換タバコは、実施例１に記載のベクターＰＡＬ１３０２を使用し て、得られた。ハイグロマイシン耐性のタバコ植物細胞の選択は、ＰＡ１１３０ ２とのコカルチャーおよび１ｍｌ当たり５０μｇのハイグロマイシンによる選択 によって行った。サザンプロット解析から、１植物においてセンスハイグロマイ シンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のコピーが５−６個存在することが実証さ れた。この植物はＴＴＲ−１２２として命名され、これは、ＰＡＬ、１１０７Ａ と呼ばれるベクターによって再形質転換した。ＰＡＬ１１０７Ａは、ＰＡＬ１３ ０２から単離した０、８ｋｂＢａｍＨＩハイグロマイシンホスホトランスフェラ ーゼ断片を付加したベクターＰＡＬＺ１０６であり、ＰＡＬＩＬ○６の花粉特異 的プロモータに関してアンチセンス方向にあるＰＡＬ１４０６中に挿入されてい る。結果として生成したベクターは、ＰＡＬ１１０７Ａと命名した。この形質転 換によって得られた植物類は葉組織中においてハイグロマイシンおよびカナマイ シンの双方に対して耐性であり、サザンプロット解析によってアンチセンス遺伝 子を含むことが示された。これらの植物類は、温室で生長させ、自家授精させた 。 これらの植物のクローン繁殖を単一植物の初期繁殖として用い、そしてこれらの クローン繁殖植物類を雄性不稔性植物系統の産生のために使用した。例えば、ア ンチセンス遺伝子のコピーを１個含みかつＴＴＲ−，２２の形質転換由来植物は 、砂土壌混合物中に植え、そして温室で生長させた。この植物をＴＴＲ−２０３ と命名する。この植物中におけるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活 性の測定から、葉、花弁、柱頭および眉ずい及び朽壁中において高レベルであり そして花粉中において極めて低レベルであることが実証された。Ｔ　Ｔ　Ｒ−１ ２２は、葉、花弁、柱頭及びやく壁中３よび花粉甲に３いて高レベルのハイグロ マイシンホスホトランスフェラーゼ活性を示した。このことは、アンチセンス遺 伝子が花粉中においてのみセンス遺伝子の発現を阻害する点において有効である ことを実証した。ノーザンプロット解析から、アンチセンス転写物の存在が特に ＴＴＲ−２０３の花粉中において確認され、かつ、センス遺伝子ｍＲＮＡが低レ ベルであることを実証した。花芽が最初に出現したとき、Ｔ　Ｔ　Ｒ−２０３は 、ハイグロマイシン溶液（２５０μｇ／ｍｌ）で１週に３回かん水し、砂土壌混 合物を全体的に飽和させた。この累やりをおよそ４週間、または主な開花がおこ るまで継続した。この期間にアンチセンス遺伝子含有植物に付いた花は、雄性不 稔性であった。 やくおよび花粉形成が阻害され、そして雄性花粉は出現しなかった。盟性稔性は 、手による受粉を雄性不稔性花の雌性部分の受粉のために使用できたので、この 処置によって影響を受けなかった。ハイグロマイシン耐性植物からの花粉をハイ ブリッド種子生産のために使用した。植物へのハイグロマイシン水やりを停止し 、工常の水やりを復活した。ハイグロマイシン水やり停止後に植物に形成した花 は、雄性稔性でかつ自殖種子を付けた。 夾五医λ旦 花粉特異的ベクターＰＡＬ、１１０７をｔ！１住不稔性稔性類の生産のために使 用した。上述の植物ＴＴＲ−１２２！、ＰＡＬ１１０７ＨＹＧＡＳと呼ハレルヘ クターによって再形質転換した。形質転換を、実施例２に記載のように行った。 ＰＡＬ１１０７ＨＹＧＡＳは、ＰＡＬ１３０２から単離した０、８ｋｂＢａｍＨ Ｉハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ断片を付加したベクターＰＡＬ工 １０７であり、ＰＡＬ１１０６の花粉特異的プロモータに関してアンチセンス方 向にあるＰＡＬ１１０８中に挿入される。結果として生成したベクターは、ＰＡ Ｌ１１０７と命名した。この形質転換によって得られた植’ＪＩＪｆｌＡは葉組 織中においてハイグロマイシンおよびカナマイシンの双方に対して耐性であり、 サザンプロット解析によってアンチセンス遺伝子を含むことが示された。これら の植物類は、温室で生長させ、自家受粉させた。これらの植物のクローン繁殖を 単一植物の初期繁殖として用い、そして、実施例１９のようにこれらのクローン 繁殖植物類を雄性不稔性植物系統の産生のために使用した。 衷五伍旦１ ａ性不稔性植物類の生産のため、ベクターＦＡＩ、ユ４１９を用いて実施例１に 概略したようにタバコを形質転換した。ベクターＰＡＬＬ４１９は、花粉特異的 プロモータに関してアンチセンス方向のＮ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ遺伝子の発現を制御す るクローンＬ４からの花粉特異的プロモータを含有する。このベクターは、また 、ｎｏｓプロモータによって駆動されたセンス方向にあるＮ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ遺伝 子の構成的変種（バージョン）を含有している。従って、このベクターは、セン ス遺伝子の発現が、花粉中で特異的に発現されるアンチセンス遺伝子の発現によ って阻害される花粉細胞を例外として、植物個体細胞中でカナマイシン耐性を付 与できる。タバコ植物類は、ベクターＰＡＬ１４１９の形質転換後に得られる。 これらの植物類は発根させ、そして花をつけさせた。植物に対して、開花時にカ ナマイシン水やりを行った。 東ｂＪｔＬｚ ベクターｐＡＬＬ４１９を使用して、実施例２に概略したように１立ｚユニ丈Ｂ ｒ　ｓ　ｉｃａ　ｎａｏｕ　を形質転換した。 Ｋ１透２ユ ベクターＰＡＬ１４１９を使用して、実施１１Ｆ！２に概略したようにペチュニ ア葉ディスクを形質転換した。 亙鳳■旦丘 本実施例では、図１４に記載した完全ソシンＡ鎖（ｐＰＡＬ　Ｒｉｃｃｏｍ）を ＢａｍＨＩ新片とし新月クターＰＡＬ１４２０中に挿入した。センス及びアンチ センス方向の双方にあるリシン遺伝子を含有するベクター類を回収した。センス 方向のりシンＡｌｌを含有するベクターを回収し、ＰＡＬ１４２０ＲＩＣと命名 した。アンチセンス方向にある遺伝子を含有するベクターをＰＡＬ１４２０ＲＩ ＣＡＳと命名した。ＰＡＬ１４２０ＲＩＣおよびＰＡＩ、１４２０ＲＩＣＡＳを 用いて、実施例２に記載のように　−ぐ　・　Ｂｒａｓｓｉ　ａ　ｎａ　ｕｌＬ の形質転換を行い、ＰＡＬ１４２０中において花粉特異的プロモータの制御下に おいてリシンＡＭ遺伝子のセンスまたはアンチセンスコピーのいずれかを有する 植物類を生成した。 罠１医ｌ互 本実施例において、面１４に記載のりシンＡ１１ｉ　（ｐＰＡＬ　Ｒｉｃｃｏｍ ）の切断バージョンをＢａｍＨＩ断片としてベクターＰＡＬ１４２０中に挿入し た。 センス及びアンチセンス方向の双方にある切断リシン遺伝子を含有するベクター 類を回収した。センス方向にあるリシンＡｌｌを含有するベクターを回収し、Ｐ ＡＬ１４２０ｔＲＩＣと命名した。アンチセンス方向にある遺伝子を含有するベ クターをＰＡＬ１４２０ｔＲＩＣＡＳと命名した。ＰＡＬ、１４２０ｔＲＩＣお よびＰＡＬ１４２０ｔＲＩＣＡＳを用いて実施例２に記載のようにに２左二±ブ スｒａｓ　ｉｃ　ｎａ　ｓ　の形質転換を行い、ＰＡＬ１４２０中において花粉 特異的プロモータの１１１ｗ下においてリシンＡＩＲ遺伝子のセンスまたはアン チセンスコピーのいずれかを有する植物類を生成した。 亙五伍λ旦 ＰＡＬＬ４２０ＲＩＣおよびＰ　Ａ　Ｌ　１４２０　ＲＩ　ＣＡ　Ｓを実施例１ のようにタバコ植物類の形質転換に使用し、ＰＡＬ１４２０中において花粉特異 的プロモータの制御下において切断リシンＡｔＪｆ遺伝子のセンスまたはアンチ センスコピーのいずれかを有する植物類を生成した。 罠五医旦ユ ベクターＩＩ　ＰＡＬ１４２０ｔＲＩＣおよびＰＡＬ１４２０ｔＲＩＣＡＳを実 施例１のようにタバコ植物類の形質転換に使用し、ＰＡＬ１４２０中において花 粉特異的プロモータの制御下において切断リシンＡＩＭ遺伝子のセンスまたはア ンチセンスコピーのいずれかを有する植物類を生成した。 Ｋ五医旦旦 本実施例では、ベクターＰＡＬ１４２３を使用して、サブクローンｐＰａｌｐＬ ｙｓに含有されるポリリシン遺伝子を発現させた。ＢａｍＨＩ消化によってコー ド領域を単離し、かつ、センス方向においてＢａｍＨＩ切断ＰＡＬ１４２３中に クローン化し、ＰＡＬ１４８７を生成した。ＰＡＬ１４８７を使用して、実施例 １のようにタバコを形質転換した。 ！五透ｌ旦 本実施例では、ベクターＰＡＬ１９２０を用いてサブクローンｐＰＡＬ　ｐＬｙ ｓ中に含有されるポリリシン遺伝子を発現した。ｐＰＡＬ　ｐＬｙｓ由来コード 通領域をＢａｍＨＩ消化によって単離し、かつ、ＢａｍＨＩ切断ＰＡＬ１９２０ 中にセンス方向にクローン化し、ＰＡＬ１９８７を生成した。ＰＡＬ１９８７を 使用して実施例１のようにタバコを形質転換した。 夾芝医旦旦 本実施例において、我々は、花粉特異的プロモータを使用して、細胞機畦及び発 生過程に破壊性のタンパク質分子、すなわち、プロテアーゼトリプシンを合成し た。トリプシンコードｃＤＮＡ配列は、５ｔｅＶｅｎＳＯｎら、ヌクレイツクア シズリサーチ（Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５）、１９８６．　工４：８３０７ −８３３０によって記載されている。ｃＤＮＡクローンｐＭＰｔ９を得、そして 、Ｎ末端アミノ酸残基が除去されトリプシンの活性プロテアーゼのみからなりか つ成熟タンパク質のＮ末端位においてメチオニン残基が活性成熟タンパク質のこ の位置に見られるイソロイシンに置換した点に３いて成熟形態と異なるタンパク 質を生成した改質トリプシン分子の生産のために使用した。これは、Ｆｏｋ工及 びＰｓｔ４によるプラスミドｐＭＰｔ９の消化およびヌクレオチド８１から８３ ５を包含し８３５の後のヌクレオチドがｃＤＮＡのクローニングのために使用さ れるＧ：Ｃテイルである断片を回収し、かつ、この断片をフレノウによって処理 し、かつ、平滑末端Ｓｍａ　工切断Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦ中にクローニングされ、 そして公表された配列のヌクレオチド８４−８６位のイソロイシンコドンをＡＴ ＴからＡＴＧに変化させる部位特異的変異のために使用される１本鎖ファージク ローンを単離し、このイソロイシンコドンのあったところに開始コドンを導入す ることによって達成された。回収された変異遺伝子は、Ｓａｌ　Ｉ及び５ｓｔｌ によって切断し、そして、ＰＡＬＬ４２１甲に挿入しＰＡＬ１４５６と命名した 。このベクターＰＡＬＬ４５８を使用し、実施例１のようにしてタバコ形質転換 に使用した。もしトリプシンインヒビターがクローンＬ１４由来プロモータを用 いて類似様式で挿入されかつ雄性親系統に形質転換されるならば、復旧遺伝子が 作製できることを明記すべきである。トリプシンインヒビターのハイブリッド中 における発現は、トリプシン酵素の活性を特に阻害する。いくつかのＣＤＮＡ配 列及びゲノムＤＮＡ配列は、大豆及び他のトリブシニンヒビターの為に見られ、 例えば、Ｊｏｆｕｋｕ、に、Ｄ、２よびＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ｒ，Ｂ、、ザ・プラ ントセル（Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ）１９８９，１：１０７９−１０９３ 参照。 東五透旦１ 不実施例に３いて、我々は、花粉特異的プロモータを使用して、花粉細胞守にお いて特異的に酵素ＩａｍＨを合成した。Ｘ酵素は、ＮＡＡをＮＡＭがら産生でき る活性を有しており、物質ＮＡＡは、発生中の花粉粒子に実質的に毒性の植物ホ ルモンとして機能し、一方、前駆体ＮＡＭは、実質的に非毒性である。この実施 例の為には、ＩａｍＨ遺伝子がベクターＰＡＬ１４１３中に押入された。■ａｍ Ｈ遺伝子は、面１２に記載のようにｐＰｃＶ３１１から単離されそしてＰＡＬｌ 、４２３のＢａｍＨＩ−Ｓｓｔ１部位中にＢａｍＨニー５ｓｔＩ断片としてクロ ーン化され、ＰＡＬ１４２４を作製した。このベクターは、ＩａｍＨ遺伝子（Ｔ −ＤＮＡ遺伝子２）を、クローンＬ４由来花粉特異的プロモータの制御下に有し ている。ＰＡＬ１４２４は、実施例１に概略したようにタバコの形質転換に使用 した。 衷ＷΣλ ベクターＰＡＬ１４２４を用いて、実施例２に概略したように１１２ユニ±プｓ ｉ　ｎａｏｕｓ）を形質転換した。 亙五勿旦１ 本実施例では、ベクターＰＡＬ１１０７を用いて組織特異的ＧＵＳ　（β−グル クロニダーゼ）酵素を産生じた。本酵素の遺伝子は、クロンテックラボラトリズ （Ｃ１ｏｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バロアルト、ＣＡ、、ＵＳＡ から入手可能である。この遺伝子をＢａｍ）（Ｉ−Ｓｓｔ　Ｉ断片としてＰＡＬ ＩＩ０７中に押入し、そして、実施例１のようにタバコの形質転換に用いた。産 生された植物類は、発生中の花粉細胞中においてのみ検品可能なＧＵＳ活性を有 しており、試験した他のいかなる組織においても有していなかった。グリホセー トのような毒性物質を結合したグルクロンＩＩＩの非毒性アナログをこれらの植 物類に通用でき、かつ、グルクロン酸から毒性部分を除去することは花粉細胞中 においてのみおこることを明記されたい。これによって、組織特異的様式で非毒 性アナログから毒性物質を生産するために使用できる酵素の例が提供される。 Ｆ工ｇｕｒｅ　１ Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ　（級之　） Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ　（ｔＬ！　１ Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ　（！ｒ、＠芝　）Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ　イ８．Ｌｉ＋ Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ　＜　８．’％、　！！　）Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ　１　級’ Ｓ　ｌ Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ　（’ｈＦｖ　Ｍ　）Ｆ’ｉｇｕｒｅ　３ａ　（含先さ） Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ　（％＃、？　１ Ｆｉｇｕｒｅ　３ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　３ｂ　（％！Ｊ　） Ｆｉｇｕｒｅ　３ｂ　Ｉ　ｔＦＩＬｔ　＋Ｆｉｇｕｒｅ　３ｂτ、２．ｆ、　７ 　）Ｆｉｇｕｒｅ　３ｃ Ｆ’１ｑｕｒｅ　３ｃ　（珪ｚ！　） Ｆｉｇｕｒｅ　３ｅ　（）、ｔ！　１ Ｆｘｇｕｒｅ　３ｅ　（％”ｓ−”−１Ｆｉｇｕｒｅ　３６ Ｆｉｇｕｒａ　３ｄ　（特ぺ　） Ｆｉｇｕｒｅ　３ｄ　（）Ｖｉ　＋ Ｆｉｇｕｒｅ　３ｄ（’＋４？　１ Ｆ’１ｑｕｒｅ　４ Ｆｉｑｕｒｅ　５ ７叶ンしｌ０ＩＦＩコーＶ４動八１すｕｌ’１−１−もｎｃ岡Ａりｏ−７のシω ｂヤヌクレズ十１−　礒ｔり１Δ Ｆλｇｕｒｅ　６ Ｆｉｇｕｒｅ　７ａ ＮＯ５ＴＥＲ Ｆ五ｑｕｒｅ　７ｂ ←ＨＩＮＤ　Ｉｌｌ　−ＰＡＬ　ｉｄｏｌＦｉｇｕｒｅ　７ｃ Ｆｉｇｕｒｅ　７ｄ ｒλｇｕｒｅ　７ｅ １　ニーｄ　ＰＡＬ　１４２１ Ｅ］Ｐ４Ｃ ］　←４Ｉ＝＝コＰＡＬＩＩ０６ Ｐ４Ａ ｒｉｇｕｒａ　８ Ｆｉｇｕｒｅ　９ Ｆｉｇｕｒｅ　１０ ５゜ ↓ＥＣＯｌ”ｊｌ、にＬＥＮＯＷ ↓ＢＡＭＨ１，デ゛１し５％覧 ５゛ ５“ Ｆｉｇｕｒｅ　１１ ＢａｗｌＨ’Ｅ　２＝４７　＆　ＬＪＩ　、　Ｓｔ４　ＩｔｘｂへＬ？・　嫡化 　フレｌつ Ｆｉｇｕｒａ　１２ ＋ＰＡＬ　１９２０ Ｆ’ｉｇｕｒｅ　１３ ａ保）、７．ｎ　７’ｏＬ−タ又丸；１１吋！−１ａ伍シ Ｆｉｇｕｒｅ　１４ ｐＰＡＬＲＩＣＴＥＲ Ｆｉｇｕｒｅ　１５ （ＴＴ（＋９％） 国際調査報告 １ｍｓ岬噂−ｈ―ａｅｅｉｃｍｍｓ　１ｍ　ＰＣＴ／ＣＡ　９０１０ＯＯ３フｍ −〜−路−−１ｗ　ｐＣτ／ＣＡ　９０１０００３フ−一１針−−ｌ＾峠−詐緘 ｋ　ＰＩ：Ｔ／Ｃ入　９０１０００３７一−Ａｍ□ｓ、　Ｐ　ＣＴ／ｅｘ　９０ １０ＯＯコア国際調査報告 Ｃ＾９０００Ｇ３７ Ｓ＾　３４２５１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物からハイブリ ッド種子を産生する方法で、 （ａ） （１）分化した植物個体に再生可能な前記花粉産生植物の植物細胞のゲノム中に 、アンチセンスＤＮＡからなり機能的花粉粒子の産生を障害しまたは機能的花粉 粒子の産生を阻害する化学的剤または生理的ストレスに対して発生過程中の花粉 粒子を感受性とする１種以上の組換えＤＮＡ配列類を押入すること、（２）前記 植物の形質転換植物細胞を得ること、（３）前記植物細胞から上記（ａ）（１） に記載の前記ＤＮＡ配列類で遺伝的に形質転換しかつ雄性不稔性であるかまたは 雄性不稔性形質を有する植物を再生すること、 によって、遺伝的に形質転換された植物を産生すること、（ｂ） （１）遺伝的形質転換植物の種子増加を促進するような方法で適切な雄性稔性植 物によって産生された花粉により段階（ａ）に記載の遺伝的形質転換植物を授精 させること、 （２）段階（ａ）に記載の前記遺伝的形質転換植物のその組織外植体を用いるク ローン繁殖または他のインビトル繁殖技術、（３）適用可能である場合には、（ ａ）に記載の雄性不稔性形質を有する遺伝的形質転換植物を自殖させること、お よび前記雄性不稔性形質に関してホモ接合性の植物を選択しおよび隔離下に自殖 させることによって前記植物を増加させること、 （４）適用可能である場合には、（ａ）に記載の雄性不稔性形質を有する遺伝的 形質転換植物のやくまたは車離した小胞子培養を実行することおよび前記雄性不 稔性形質に関してホモ接合性の植物を選択することおよび前記植物を隔離下に自 殖させることによって増加させること、によって、遺伝的形質転換植物の数を増 加させること、（ｃ）前記遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔性植物ドーナ一類 由来花粉で受粉させることによってハイブリッド交雑を行うこと、からなる方法 。 ２．段階（ａ）が、 （ａ） （１）好適には前記花粉産生植物から、前記植物中において花粉形成または機能 に重大なセンス遺伝子またはコード配列を同定しかつ単離すること、（２）分化 した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞ゲノム中に、前記植物に対して化 学的剤または生理的ストレスに対する耐性を付与する遺伝子、およびこの遺伝子 に対して連結され、 （Ａ）前記センス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲｙＡ配列に対 して全体としてまたは部分的に相補性のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、（Ｂ） 前記センス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡの転写時、また はその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物中に おいて機能するプロモータ、及び好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時にお いて終止シグナルを規定するターミネータ記列、 からなる遺伝子を挿入すること、 （３）前記植物の形質転換植物細胞を得ること、および（４）段階（ａ）（２） に記載の遺伝子で形質転換されかつ雄性不稔性である植物を前記形質転換植物か ら再生すること、によって達成され、かつ、 段階（ｂ）が、 （ｂ） （１）上記段階（ａ）（４）に記載の遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔性植物 と交雑させること、 （２）同一化学的剤または生理的ストレスを用いて、このような交雑によって産 生された種子から生長した植物から、上記段階（ａ）（２）に記載の遺伝子類を 含有していない植物を除去すること、および（３）前記化学的剤または生理的ス トレスの存在下において上記段階（ｂ）（２）で得られた植物類と数世代にわた り交雑を操り返し雄性不稔性植物類の数を増加させること、 によって達成され、かつ、 段階（ｃ）が、 （ｃ）前記遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔性植物ドーナ一類由来花粉で受粉 させることによってハイブリッド交雑を行うこと、によって、達成される請求項 １記載の方法。 ３．段階（ａ）が、 （ａ） （１）好適には前記花粉産生植物から、前記植物中において花粉形成または機能 に重大なセンス遺伝子またはコード配列を同定しかつ単離すること、（２）分化 した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞ゲノム中に、（Ａ）前記センス遺 伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコー ドするＤＮＡ配列、（Ｂ）前記センス遺伝子またはコード配列によってコードさ れたＲＮＡの転写時において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前 記植物中において機能できる誘導プロモータ、及び好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ 配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植 物細胞を得ること、および（４）段階（ａ）（２）に記載の遺伝子で形質転換さ れかつ前記インデューサによって雄性不稔性とされることができる植物を前記形 質転換植物から再生すること、 によって連成され、かつ、 段階（ｂ）が、 （ｂ） （１）上記段階（ａ）（４）に記載の遺伝的形質転換植物を関連インデューサー の不在下において生長させ雄性稔性植物を産生させ、数世代にわたってインデュ ーサーの不在下において自家授精させかつこのような植物の種子を生長させ遺伝 的形質転換植物類の数を増加させることによって遺伝的形質転換植物類の数を増 加させること、 によって達成され、かっ 段階（ｃ）が、 （ｃ）雄性不稔性植物類を産生させおよび前記雄性不稔性植物類の他家受粉を可 能とするために、前記遺伝的形質転換植物を適当な雄性稔性ドーナー系統の植物 とともに花粉形成時において関連インチューサーの存在下において生長させるこ とによってハイブリッド交雑を行うこと、によって達成される請求項１記載の方 法。 ４．段階（ａ）が、 （ａ） （１）分化した植物個体に再生可能な前記花粉形成または機能産生植物の植物細 胞ゲノム中に、同時にまたはそれぞれ、前記植物に対して化学的剤または天然ま たは人為的に誘発した生理的ストレスに対する耐性を付与するセンス遺伝子、お よび （Ａ）前記センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に対して相補性のＲＮ ＡをコードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物細胞中において 機能する花粉特異的プロモータ、及び好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時 において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること、（２）上記段階（１）に記載 の遺伝子類によって形質転換された植物の植物細胞を得ること、 （３）上記段階（１）に記載の遺伝子類で遺伝的に形質転換されかつ前記化学的 剤またはストレスによって雄性不稔性とされることができる植物を前記形質転換 植物細胞から再生させること、 によって達成され、かつ、 段階（ｂ）が、 （ｂ） （１）上記段階（ａ）（３）に記載の遺伝的形質転換植物を同一ストレスまたは 化学的剤から隔離して生長させ、自家授精植物を産生すること、（２）自家授精 を可能とすること、および、（３）前記自家授精植物の種子を数世代にわたって 同一ストレスまたは化学薬剤から隔離して生長させ、遺伝的形質転換植物類の数 を増加させること、によって達成され、かつ 段階（ｃ）が、 （ｃ）前記遺伝的形質転換植物を適当な雄性稔性ドーナー系統の植物とともに花 粉形成時において同一ストレスまたは化学的剤の存在下に生長させることによっ てバイブリッド交雑を行い、雄性不稔性植物類を産生させることおよび前記雄性 不稔性植物類の他家受粉を可能とすること、によって達成される請求項１記載の 方法。 ５．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不稔 性植物を産生する方法で、 （ａ）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子また はコード配列を好運には前記植物から同定しおよび単離すること、（ｂ）分化し た植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、（１）前記センス遺 伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコー ドするＤＮＡ配列、（２）前記センス遺伝子またはコード配列の転写時、または その頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物中にお いて機能する誘導プロモータ、及び好適には、 （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること、（ｃ）前記植物中において形 質転換植物細胞を得ること、および（ｄ）雄性不稔性である遺伝的形質転換植物 を前記形質転換植物細胞から再生すること、 の段階からなる方法。 ６．前記センス遺伝子が花粉中においてのみ発現される請求項５記載の方法。 ７．前記センス遺伝子が、図２ａに示したヌクレオチド類６００−２４３０の配 列からなる請求項２、５または６記載の方法。 ８．前記プロモータが前記センス遺伝子のプロモータである請求項２、４、５ま たは６のいずれかに記載の方法。 ９．前記プロモータが、公知の化学的または温度ストレスによって誘導できる誘 導性プロモータである請求項５または６記載の方法。 １０．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不 稔性植物を産生する方法で、 （ａ）細胞機能または発生に対して重大でかつ代謝的に応答性の細胞型において 発現されるセンス遺伝子またはコード配列を好適には前記花粉産生植物から同定 し及び単離すること、 （ｂ）植物細胞のゲノム中に、 （１）前記センス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡ配列に相 補性のＲＮＡをコードするＤＮＡを列、（２）前記センス遺伝子またはコード配 列によってコードされたＲＮＡの機能を下記ＲＮＡに阻害させる時間枠において 、前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物細胞中において機能 する花粉特異的プロモータ、及び好適には、 （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること、（ｃ）前記ＤＮＡを列によっ て遺伝的に形質転換された植物細胞を得ること、（ｄ）雄性不稔性である遺伝的 形質転換植物を前記形質転換植物細胞から再生すること、 の段階からなる方法。 １１．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物からハイブ リッド種子を産生する方法で、 （ａ） （１）細胞機能または発生に対して重大でかつ代謝的に応答性の細胞型において 発現されるセンス遺伝子またはコード配列を好適には前記花粉産生植物から同定 し及び単離すること、 （ｂ）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、化学的 剤または生理的ストレスに対する耐性を前記植物に付与する遺伝子およびこの遺 伝子に連結し （Ａ）前記センス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡ配列に相 補性のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、（Ｂ）前記センス遺伝子またはコード配 列によってコードされたＲＮＡの機能を下記ＲＮＡに阻害させる時間枠において 前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物細胞中において機能す るプロモータ、及び好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグ ナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植 物細胞を得ること、および（４）上記段階（ａ）（２）に記載の遺伝子類によっ て遺伝的に形質転換されかつ雄性不稔性である植物を前記形質転換植物細胞から 再生すること、によって、雄性不稔性植物を産生すること、および、（ｂ） （１）上記段階（ａ）（４）に記載の遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔性植物 と交雑させること、 （２）このような交雑によって産生された種子から生長した植物の間で、上記段 階（ａ）（２）に記載の遺伝子類を含有しない植物類を、化学的剤または生理的 ストレスを用いて除去すること、 （３）前記化学的剤または生理的ストレスの存在下において、上記段階（ｂ）（ ２）のようにして得られた植物類と数世代にわたって交雑を線り返し、雄性不稔 性植物類の数を増加させること、 によって、遺伝的形質転換植物類の数を増加させること、（ｃ）適切な雄性稔性 ドーナーからの花粉で前記雄性不稔性植物類を受粉させることによってハイブリ ッド交雑を行うこと、の段階からなる方法。 １２．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不 稔性柄物を産生する方法で、 （ａ）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子また はコード配列を好適には前記植物から同定しおよび単離すること、（ｂ）分化し た植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、選択薬剤に対する耐 性を前記植物に付与する遺伝子、およびこの遺伝子に連結され、（１）前記セン ス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡ配列に対して相補性のＲ ＮＡをコードするＤＮＡ配列、（２）前記センス遺伝子の転写時、またはその頃 において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物中において機 能するプロモータ、及び好適には、 （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる遺伝子またはコード配列を挿入すること、（ｃ）前記植物中において形 質転換植物細胞を得ること、および（ｄ）雄性不稔性である遺伝的形質転換植物 を前記形質転換植物細胞から再生すること、 の段階からなる方法。 １３．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物からハイブ リッド種子を産生する方法で、 （ａ） （１）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子また はコード配列を、好適には前記植物から同定しおよび単離すること、（２）分化 した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、選択薬剤に対する 耐性を前記植物に付与する遺伝子、およびこの遺伝子に連結され、（Ａ）前記セ ンス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＸＡ配列に相補性のＲＮＡ をコードするＤＮＡ配列、（Ｂ）前記センス遺伝子またはコード配列の転写時、 またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物 中において機能すプロモータ、及び好適には、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる遺伝子を挿入すること、 （３）前記植物の形質転換植物細胞を得ること、および（４）上記段階（ａ）（ ２）に記載の遺伝子類で形質転換されかつ雄性不稔性である植物を前記形質転換 植物細胞から再生すること、によって雄性不稔性植物を産生すること、および（ ｂ） （１）上記段階（ａ）（４）に記載の遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔性植物 と交雑させること、 （２）このような交雑によって産生された種子から生長した植物から、化学的剤 または生理的ストレスを用いて、上記段階（ａ）（２）に記載の遺伝子類を含有 しない植物類を除去すること、 （３）前記化学的剤または生理的ストレスの存在下において、上記段階（ｂ）（ ２）のようにして得られた植物類と数世代にわたって交雑を線り返し、雄性不稔 性植物類の数を増加させること、 によって、遺伝的形質転換植物類の数を増加させること、（ｃ）適切な雄性稔性 ドーナーからの花粉で前記雄性不稔性植物類を受粉させることによってハイブリ ッド交雑を行うこと、の段階からなる方法。 １４．段階（ｃ）で使用した前記適切な雄性稔性ドーナー類が前記化学的剤また は生理的ストレスに対して耐性である請求項１１または１３記載の方法。 １５．前記選択薬剤が除草剤である請求項２、１０、１１、１２、１３または１ ４に記載の方法。 １６．前記選択薬剤がグリホスセートまたはクロロスルフロンである請求項２、 １０、１１、１２、１３、１４または１５に記載の方法。 １７．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から、復旧 雄性稔性を有するハイブリッド種子を産生する方法で、（ａ） （１）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子また はコード配列を好適には前記植物から同定しおよび車離すること、（２）分化し た植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、（Ａ）前記センス遺 伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコー ドするＤＮＡ配列、（Ｂ）前記センス遺伝子の転写時、またはその頃において前 記ＤＸＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物中において機能する誘導 性プロモータ、及び好適には、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡを押入すること、（３）前記植物の形質転換植物細 胞を得ること、および（４）上記段階（２）に記載の前記二重鎖ＤＮＡ分子で遺 伝的に形質転換されかつ前記インチユーサによって雄性不稔性とされることがで きる植物を前記形質転換植物細胞から再生すること、 によって雄性不稔性植物を産生すること、（ｂ） （１）上記段階（ａ）（４）に記載の遺伝的形質転換植物を関連インチユーサの 不在下において生長させ雄性稔性植物を産生すること、および、（２）自家授精 を可能とすること、 （３）間連インデユサーの不在下に数世代にわたりこのような雄性稔性植物の種 子を生長させ、遺伝的に形質転換された植物類の数を増加させること、によって 、遺伝的形質転換植物類の数を増加させること、（ｃ）関連インデユーサの存在 下、前記遺伝的形質転換植物類を雄性稔性ドーナ一類の適切な系統からの花粉で 受粉させること、の段階からなる方法。 １８．前記センス遺伝子またはコード配列が花粉中においてのみ発現される請求 項１２、１３または１７記載の方法。 １９．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不 稔性植物を産生する方法で、 （ａ）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、（１） 花粉特異的プロモーター、 （２）細胞毒性分子をコードするＤＮＡ配列、および（３）前記ＤＮＡ配列の転 写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること、（ｂ）形質転換植物細胞を得 ること．および（ｃ）前記形質転換植物細胞から、雄性不稔性である遺伝的形質 転換植物細胞を再生すること、 の段階からなる方法。 ２０．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から復旧雄 性稔性を存するハイブリッド種子を産生する方法で、（ａ）分化した植物個体に 再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、化学的剤または生理的ストレスに 対する耐性を前記植物に付与する遺伝子、およびこの遺伝子に連結し、 （１）細胞毒性分子をコードするＤＮＡ配列、（２）前記ＤＮＡ配列の転写を起 こすように前記植物細胞中において機能する花粉特異的プロモータ、および （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換え二重鎖ＤＤＮＡ分子を挿入すること、（ｂ）形質転換植物細胞を 得ること、および（ｃ）前記形質転換植物細胞から、雄性不稔性である遺伝的形 質転換植物細胞を再生すること、 （ｄ） （１）上記段階（ｃ）に記載の遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔性植物と交雑 させること、 （２）このような交雑によって産生された種子から生長した植物から、上記段階 （ａ）に記載の遺伝子類を含有しない植物類を、化学的剤または生理的ストレス を用いて除去すること、 （３）前記化学的剤または生理的ストレスの存在下において、上記段階（ｄ）（ ２）のようにして得られた植物類と数世代にわたって交雑を繰り返し、雄性不稔 性植物類の数を増加させること、 によって、遺伝的形質転換植物類の数を増加させること、（ｅ）同一種から選択 した適切な雄性稔性植物の植物細胞中に、（１）前記細胞毒性分子をコードする ＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、 （２）上記段階（ｄ）（１）に記載のＤＮＡを列の転写を、段階（ａ）（１）に 規定したＤＮＡ配列の転写時、またはその頃に起こすプロモータ、（３）上記段 階（ｅ）（１）に記載のＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するタ ーミネータ配列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること、（ｆ）段階（ｄ）から形質転 換植物細胞を得ること、および（ｇ）上記段階（ｄ）に記載の前記形質転換細胞 から遺伝的に形質転換された雄性稔性植物を再生すること、 （ｈ）前記遺伝的形質転換雄性稔性植物を自家授精させ及びこの植物の種子を数 世代にわたり生長させ、遺伝的形質転換雄性稔性植物類の数を増加させることに よって復旧系統を産生すること、 （ｉ）前記雄性不稔性植物類を前記遺伝的形質転換雄性稔性植物類からの花粉で 受粉させることによってハイブリッド交雑を行うこと、の段階からなる方法。 ２１．前記花粉特異的プロモータが、図２ａのヌクレオチド類１−５９５の配列 またはその機能的断片からなる請求項２０または２４記載の方法。 ２２．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から復旧雄 性稔性形質を有する植物を産生する方法で、（ａ）分化した植物個体に再生可能 な前記植物の植物細胞を、前記植物に対して化学的剤または天然のまたは人為的 誘発ストレスに対する耐性を付与するセンス遺伝子で形質転換すること、 （ｂ）前記形質転換植物細胞から同一ストレスに対して耐性の遺伝的形質転換植 物を再生すること、 （ｃ）分化した植物個体に再生可能な前記ストレス耐性植物の植物細胞のゲノム 中に、 （１）前記センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に対して相補性のＲＮ ＡをコードするＤＸＡ配列、 （２）前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物細胞中において 機能する花粉特異的プロモータ、及び好適には、（３）前記ＤＮＡ配列の転写時 において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること、（ｄ｝形質転換植物細胞を得ること 、および（ｅ）上記段階（ａ）および段階（ｃ）に記載の遺伝子類で遺伝的に形 質転換されかつ前記化学的剤またはストレスによって雄性不稔性とされることが できる植物を前記形質転換植物細胞から再生すること、の段階からなる方法。 ２３．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類環から選択された植物から復旧雄 性稔性性を有するハイブリッド種子を産生する方法で、（ａ） （１）分化した植物個体に再生可能な前記花粉産生植物の植物細胞ゲノム中に、 同時にまたはそれぞれ、前記植物に対して化学的剤または天然または人為的に誘 発した生理的ストレスに対する耐性を付与するセンス遺伝子、および（Ａ）前記 センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードするＤ ＮＡ配列、 （Ｂ）前記ＤＮＡ配列の転写を起こすように前記植物中において機能する花粉特 異的プロモータ、及び好適には、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること、（２）上記段階（１）に記載 の遺伝子類によって形質転換された植物の植物細胞を得ること、 （３）上記段階（１）に記載の遺伝子類で形質転換されかつ前記化学的剤または ストレスによって雄性不稔性とされることができる植物を再生させること、によ って、雄性不稔性形質を有する植物を産生すること、（ｂ） （１）上記段階（ａ）（３）に記載の遺伝的形質転換植物を同一ストレスまたは 化学的剤から隔離して生長させ、自家授精植物を産生すること、（２）自家授精 を可能とすること、および、（３）前記自家授精植物の種子を数世代にわたって 同一ストレスまたは化学的剤から隔離して生長させ、遺伝的形質転換植物類の数 を増加させること、によって、遺伝的形質転換植物類の数を増加させること、（ ｃ）前記遺伝的形質転換植物を適当な雄性稔性ドーナー系統の植物とともに花粉 形成時において同一ストレスまたは化学的剤の存在下に生長させることによって ハイブリッド交雑を行い、雄性不稔性植物類を産生させることおよび前記雄性不 稔性植物類の他家受粉を可能とすること、の段階からなる方法。 ２４．前記花粉特異的プロモータが、図２ａのヌクレオチド類１−５９５の配列 またはその機能的断片からなる請求項４、２２、または２３記載の方法。 ２５．前記生理的ストレスが除草剤である請求項４、２２、２３または２４のい ずれかに記載の方法。 ２６．前記生理的ストレスがハイグロマイシンであり、かつ前記センス遺伝子が 、（１）花粉特異的プロモーター、 （２）ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの産生をコードするＤＮＡ配 列、および （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる請求項４、２２、２３または２４記載の方法。 ２７．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物からハイブ リッド種子を産生する方法で、 （ａ） （１）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子また はコード配列を好適には前記植物から同定しおよび単離すること、（２）分化し た植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、（Ａ）前記センス遺 伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコー ドするＤＮＡ配列、（Ｂ）前記センス遺伝子またはコード配列の転写時、または その頃において、前記Ｄ丼Ａ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物中に おいて機能するプロモータ、及び好適には、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子を挿入すること，（３）前記植物の形質転換植 物細胞を得ること、および（４）雄性不稔性である遺伝的形質転換植物を前記形 質転換植物細胞から再生すること、 によって雄性不稔性植物を産生すること、（ｂ）前記遺伝的形質転換植物の組織 外植体由来細胞を用いて、前記遺伝的形質転換植物のクローン繁殖によって雄性 不稔性系統を産生すること、（ｃ）前記雄性不稔性系統の植物を雄性稔性ドーナ 一類の適切な系統の植物とともに生長させ、この雄性不稔性植物の受粉を可能と すること、の段階からなる方法。 ２８．前記選択された花粉産生植物が、種ブラシカ・ナブス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）まなはブライシカ・カンベストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐ ｅｓｔｒｉｓ）の植物である請求項１から２７のいずれかに記載の方法。 ２９．前記選択された花粉産生植物がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）である請求 項１から２７のいずれかに記載の方法。 ３０．前記選択された花粉産生植物が科クンシフエラエ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ ）である請求項１から２７のいずれかに記載の方法。 ３１．前記選択された花粉産生植物が科ソラナセアエ（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ） である請求項１から２７のいずれかに記載の方法。 ３２．図２ａのヌクレオチド類１−５９５の配列またはその機能的断片からなる ＤＮＡ配列からなる花粉特異的プロモータ。 ３３． （ａ）代謝的に応答性の細胞型において、細胞機能または発生に必須である遺伝 子またはコード配列によってコードされるｍＲＮＡに相補性であるＲＮＡをコー ドするＤＮＡ配列、 （ｂ）前記遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡの機能を下記Ｒ ＮＡに阻害させる時間枠において、前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすよ うに前記植物細胞中において機能する花粉特異的プロモータ、及び好適には、（ Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列 、 からなる組換えＤＮＡ分子で形質転換された植物。 ３４． （ａ）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大であるセンス遺伝子 によってコードされるＲＮＡ配列に相補性であるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列 、（ｂ）前記センス遺伝子の転写時、またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲ ＮＡへの転写を起こすように前記植物中において機能するプロモータ、および（ ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列 、 からなる二重鎖ＤＮＡ分子で形質転換された植物。 ３５． （ａ）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大であるセンス遺伝子 によってコードされるＲＮＡ配列に相補性であるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列 、（ｂ）前記センス遺伝子による転写時、またはその頃において前記ＤＮＡ配列 のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物中において機能する誘電性ブロモ−タ 、および （ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる二重鎖ＤＮＡ分子で形質転換された植物。 ３６． （ａ）細胞毒性分子をコードする遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補 性であるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、（ｂ）花粉特異的プロモータ、および （ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる二重鎖ＤＮＡ分子で形質転換された植物。 ３７． （ａ）前記植物に対して化学的剤または天然または人為的誘発生理的ストレスに 対する耐性を付与するセンス遺伝子、および（ｂ） （１）前記センス遺伝子によってコードされるＲＮＡに相補性であるＲＮＡをコ ードするＤＮＡ配列、 （２）前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物細胞中において 機能する花粉特異的プロモータ、及び （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換え二重鎮ＤＮＡ分子で形質転換された植物。 ３８． （ａ）前記植物に対して化学的剤または生理的ストレスに対する耐性を付与する 遺伝子、およびこの遺伝子に連結し、 （ｂ） （１）花粉形成または機能に重大であるセンス遺伝子によってコードされるＲＮ Ａに相補性であるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、（２）前記センス遺伝子の転 写時、またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前 記植物細胞中において機能するプロモータ、及び（３）前記ＤＮＡ配列の転写時 において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる遺伝子で形質転換された植物。 ３９．前記ＤＮＡ配列が、前記植物の花粉組織において独占的に発現されるセン ス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードする請求項 ３４、３５または３８のいずれかに記載の植物。 ４０． （ａ）下記種子から生長した植物において花粉形成または機能に重大であるセン ス遺伝子によってコードされるＲＮＡ配列に相補性であるＲＮＡをコードするＤ ＮＡ配列、 （ｂ）前記センス遺伝子の転写時、またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮ Ａへの転写を起こすように前記植物細胞中において機能するプロモータ、及び（ ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列 、 からなる二重鎖ＤＮＡ分子を含有するハイブリッド種子。 ４１． （ａ）下記種子から発生した植物において花粉形成または機能に重大であるセン ス遺伝子によってコードされるＲＮＡ配列に相補性であるＲＮＡをコードするＤ ＮＡ配列、 （ｂ）前記センス遺伝子の転写時、またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮ Ａへの転写を起こすように前記植物中において機能する誘導性プロモータ，及び （ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる二重鎮ＤＮＡ分子を含有するハイブリッド種子。 ４２． （１）細胞毒性分子をコードするＤＮＡ配列、（２）前記ＤＮＡ配列の転写を起 こすように前記植物細胞中において機能する花粉特異的プロモータ、及び （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子，および （ａ）細胞毒性分子をコードする前記遺伝子によってコードされるＲＮＡ配列に 相補性であるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、（ｂ）細胞毒性分子をコードする 前記センス遺伝子の転写時、またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの 転写を起こすプロモータ、及び（ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグ ナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子、 を含有するハイブリッド種子。 ４３． （ａ）前記植物に対して化学的または天然または人為的誘発生理的ストレスに対 する耐性を付与するセンス遺伝子、および（ｂ） （１）前記センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性であるＲＮＡ をコードするＤＮＡ配列、 （２）前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こずように前記植物細胞中において 機能する花粉特異的プロモータ、及び （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換え二重鎖ＤＮＡ分子、 からなるＤＮＡ含有ハイブリッド種子。 ４４． （ａ）前記種子から生長した植物に対して化学的剤または生理的ストレスに対す る耐性を付与する遺伝子、およびこの遺伝子に連結し、（ｂ） （１）前記植物における花粉形成または機能に重大であるセンス遺伝子によって コードされるＲＮＡ配列に相補性であるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、（２） 前記センス遺伝子の転写時、またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの 転写を起こすように前記植物細胞中において機能するプロモータ、及び（３）前 記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる遺伝子、 からなるＤＮＡ含有ハイブリッド種子。 ４５．前記ＤＮＡ配列が、前記植物の花粉組織において独占的に発現されるセン ス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列は相補性のＲＮＡをコードする請求項 ４０、４１または４４のいずれかに記載の種子。 ４６． （ａ）細胞機能または発生に必須である遺伝子またはコード配列はよってコード されるｍＲＮＡに相補性であるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、（ｂ）前記セン ス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡの機能を下記ＲＮＡに阻 害させる時間枠において、前紀ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記 植物細胞中において機能する花粉特異的プロモータ、及び好適には、 （ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を含有するハイブリッド種子。 ４７．図２ａのヌクレオチド類１−５９５の配列またはその機能的断片からなる 花粉特異的プロモータで形質転換された植物。 ４８．図２ａのヌクレオチド類６００−２４３０の配列またはその機能的断片か らなる組換え二重鎖ＤＮＡ配列で形質転換された植物。 ４９．図２ａのヌクレオチド類６００−２４３０の配列またはその機能的断片か らなる二重鎖ＤＮＡ分子。 ５０．請求項１から３１のいずれかに記載の遺伝的形質転換細胞から産生された 細胞株。 ５１．段階（１）で使用された前記遺伝的形質転換雄性稔性植物類が、前記化学 的剤または生理的ストレスに耐性である請求項２０記載の方法。 ５２．前記植物のゲノム中に、機能性花粉粒子産生を選択的に阻害するかまたは 発生中花粉粒子を化学的剤または生理的ストレスに感受性とする花粉デーゲット 組換えＤＮＡ分子を組み込むことによる雄性不稔性植物または雄性不稔性形質を 有する植物を産生する方法。 ５３．前記花粉ターゲット組換えＤＮＡ分子が、花粉形成または機能にとって重 大である遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡからなる請求項５２記載の方法。 ５４．前記花粉ターゲット組換えＤＮＡ分子が、花粉ターゲットプロモータ及び 構成遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡからなり、前記アンチセンスＤＮＡが前 記プロモータによって制御される請求項５２記載の方法。 ５５．前記組換えＤＮＡ分子が、花粉ターゲットプロモータ及び細胞毒性である 分子または非毒性分子を細胞毒性にする分子をコードする遺伝子からなる請求項 ５２記載の方法。 ５６．前記花粉ターゲットプロモータが花粉特異的プロモータである請求項５４ または５５記載の方法。 ５７．遺伝的に形質転換された雌性親植物を適当な雄性稔性雄性親植物を交雑さ せることによるハイブリッド種子産生方法で、前記移転的形質転換雌性親植物が 、センスまたはアンチセンス遺伝子またはその両者からなり、それらは発現され たときに、花粉形成または機能に重大な組織の産生を阻害するかまたは前記組織 の機能を阻害する化学的剤または生理的ストレスに前記組織を感受性とし、前記 適切な雄性稔性雄性親植物は、雌性復旧植物として役立つことが要求されたとき に障害された遺伝子機能の補償をするかまたは前記遺伝的形質転換雌性親植物中 において花粉形成または機能に重大な組織に起こった障害を無効とする１種以上 の組換えＤＮＡ配列を含有する方法。 ５８．前記センス遺伝子が、細胞毒性分子または物質を細胞毒性とする分子の産 生をコードする請求項５７記載の方法。 ５９．前記アンチセンス遺伝子が花粉ターゲット遺伝子の機能を阻害する分子の 産生をコードする請求項５７記載の方法。 ６０．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不 稔性植物を産生する方法で、 （ａ）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子を好 適には前記植物から同定しおよび単離すること、（ｂ）分化した植物個体に再生 可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、（１）前記センス遺伝子によってコー ドされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、 （２）前記センス遺伝子の転写時、またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮ Ａへの転写を起こすように前記植物中において機能するプロモータ、及び好適に は、 （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（ｃ）前記植物中において形質転換 植物細胞を得ること、および（ｄ）雄性不稔性である遺伝的形質転換植物を前記 形質転換植物細胞から再生すること、 からなる方法。 ６１．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物からハイブ リッド種子を産生する方法で、この方法は、（ａ） （１）好適には前記花粉産生植物から、前記植物中において花粉形成または機能 に重大なセンス遺伝子を同定しかつ単離すること、（２）分化した植物個体に再 度可能な前記植物の植物細胞ゲノム中に、前記植物に対して化学的剤または生理 的ストレスに対する耐性を付与する遺伝子、およびこの遺伝子に対して連結され 、 （Ａ）前記センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコ ードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）前記センス遺伝子またはコーン配列によってコードされたＲＮＡの転写時 、またはその頃において、前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記 植物中において機能するプロモータ、及び好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転 写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる遺伝子を挿入すること、 （３）前記植物の形質転換植物細胞を得ること、および（４）段階（ａ）（２） に記載の遺伝子類で形質転換された植物を前記形質転換植物から再生すること、 によって雄性不稔性である遺伝的形質転換植物を産生すること、（ｂ） （１）遺伝的形質転換植物の組織外植体由来細胞を用いるクローン繁殖、または 他のインビトロ繁殖技術、 （２） （Ａ）上記段階（ａ）（４）に記載の遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔性植物 と交雑させること、 （Ｂ）このような交雑によって産生された種子から生長した植物から、化学的剤 または生理的ストレスを用いて、上記段階（ａ）（２）に記載の遺伝子類を含有 しない植物類を除去すること、 （Ｃ）前記化学的剤または生理的ストレスの存在下において、上記段階（ｂ）（ ２）のようにして得られた植物類と数世代にわたって交雑を繰り返し、雄性不稔 性植物類の数を増加させること、 によって、遺伝的形質転換植物類の数を増加させること、（ｃ）前記雄性不稔性 植物類を前記遺伝的形質転換雄性稔性植物類からの花粉で受粉させることによっ てハイブリッド交雑を行うこと、の段階からなる方法。 ６２．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不 稔性植物を産生する方法で、 （ａ） （１）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子およ び転写されてはいるが未翻訳の配列を、好適には前記植物から同定しおよび単離 すること、 （２）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、化学的 剤または天然のまたは人為的誘発生理的ストレスに対する耐性を前記植物に付与 する遺伝子、およびこの遺伝子に連結され、（Ａ）前記転写されてはいるが未翻 訳の配列に相補性のＤＮＡ配列、（Ｂ）発生中花粉における前記センス遺伝子の 転写時またはその頃において、前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように 前記植物中において機能するプロモータ、及び好適には、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植物細胞 を得ること、および（４）上記段階（ａ）（２）に記載の前記ＤＮＡ配列で遺伝 的に形質転換されかつ雄性不稔性である植物を前記植物細胞から再生すること、 によって雄性不稔性植物を産生すること、の段階からなる方法。 ６３．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から復旧雄 性稔性性を有するハイブリッド種子を産生する方法で、（ａ） （１）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子およ び転写されてはいるが未翻訳の配列を、好適には前記花粉産生植物から同定しお よび単離すること、 （２）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、化学的 剤または天然のまたは人為的誘発生理的ストレスに対する耐性を前記植物に付与 する遺伝子、およびこの遺伝子に連帯され、（Ａ）前記転写されてはいるが未翻 訳の配列に対して相補性のＤＮＡ配列、（Ｂ）発生中花粉における前記センス遺 伝子の転写時またはその頃において、前記ＤＮＡ配列の転写を起こすように前記 植物中において機能するプロモータ、及び好適には、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植物細胞 を得ること、および（４）上記段階（ａ）（２）に記載の前記ＤＮＡ分子で遺伝 的に形質転換されかつ雄性不稔性である植物を、前記植物細胞から再生すること 、によって雄性不稔性植物を産生すること、および（ｂ） （１）段階（ａ）に記載の前記遺伝的形質転換雄性不稔性植物の、その組織外植 体由来細胞を用いるクローン繁殖、またはその他のインビトロ繁殖技術、（２） 前記遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔性植物と交雑させること、（３）このよ うな交雑によって産生された種子から生長した植物から、上記段階（ａ）（２） に記載のＤＮＡ配列を含有しない植物類を、化学的剤または生理的ストレスを用 いて除去すること、 （４）前記化学的剤または生理的ストレスの存在下において、上記段階（ｂ）（ ３）のようにして得られた植物類と数世代にわたって上記交雑を繰り返し、雄性 不稔性植物類の数を増加させること、によって、遺伝的形質転換植物類の数を増 加させること、（ｃ） （１）分化した植物個体に再生可能な適切な雄性親植物の植物細胞のゲノム中に 、天然または人為的誘発生理的ストレスに対する耐性を付与し、（Ａ）前記アン チセンス遺伝子に相補性の領域を含有しない前記センス遺伝子の改質形態からな る組換えＤＮＡ分子、 （Ｂ）好適には前記アンチセンス遺伝子の作用時またはその頃において、前記セ ンス遺伝子の機能を復旧する時点において前記改質ＤＮＡ配列の転写を起こすよ うに前記植物中に機能するプロモータ、及び好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の 転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子に連結された遺伝子を組み込むこと、によって雄性稔 性復旧植物を産生すること、（ｄ）上記（ｂ）に記載の方式でまたは好適には前 記復旧形質に関してホモ接合性の植物を選択しかつ前記植物を隔離下の自殖によ って増加させることによって、遺伝的形質転換雄性稔往復旧植物類の数を増加さ せること、（ｅ）前記雄性不稔性植物類を前記雄性稔性復旧植物類からの花粉で 受粉させることによってハイブリッド交雑を行うこと、の段階からなる方法。 ６４．前記雄性不稔性形質を有する植物に再生可能な請求項１０記載の組換えＤ ＮＡ分子で形質転換された植物細胞。 ６５．前記雄性不稔性形質を有する請求項１０記載の組換えＤＮＡ分子で形質転 換された植物。 ６６．請求項６１記載の方法によって産生された復旧雄性稔性を有するハイブリ ッド種子。 ６７．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不 稔性形質を有する植物を産生する方法で、（ａ） （１）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子を好 適には前記花粉産生植物から同定しおよび単離すること、（２）分化した植物個 体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、（Ａ）前記センス遺伝子によ ってコードされたＲＮＡ配列に対して全体としてまたは部分的に相補性のＲＮＡ をコードするアンチセンス遺伝子、（Ｂ）前記センス遺伝子またはコード配列の 転写時またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前 記植物中において機能する誘導性プロモータ、及び好適には、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植物細胞 を得ること、および（４）上記段階（ａ）（２）に記載の前記ＤＮＡ分子で遺伝 的に形質転換されかつ前記インデユーサによって雄性不稔性とされることができ る植物を、前記形質転換植物細胞から再生すること、 によって、雄性不稔性形質を存する遺伝的形質転換織物を産生すること、の段階 からなる方法。 ６８．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から復旧稔 性を有するハイブリッド種子を産生する方法で、（ａ） （１）前記植物中において花粉形成または機能にとって重大なセンス遺伝子を好 適には前記花粉産生植物から同定しおよび単離すること、（２）分化した植物個 体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、（Ａ）前記センス遺伝子によ ってコードされたＲＮＡ配列に全体としてまたは部分的に相補性のＲＮＡをコー ドするアンチセンス遺伝子、（Ｂ）前記センス遺伝子またはコード配列の転写時 またはその頃において前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物 細胞中において機能できる誘導性プロモータ、及び好適には、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植物細胞 を得ること、および（４）上記段階（２）に記載の前記ＤＮＡ分子で遺伝子的に 形質転換されかつ前記インデユーサによって雄性不稔性とされることができる植 物を前記形質転換植物細胞から再生すること、 によって雄性不稔性形質を有する遺伝的形質転換植物を産生すること、（ｂ） （１）段階（ａ）に記載の前記遺伝的形質転換植物のその組織外構体を用いるク ローン繁殖、または値のインビトロ繁殖技術、（２）（ａ）に記載の誘導雄性不 稔性形質を有する遺伝的形質転換植物を自殖させること、前記誘導雄性不稔性形 質に関してホモ接合性の植物を選択すること及び前記植物をインデユーサーの不 在下において数世代にわたり隔離下において自殖させることによって前記植物を 増加させ、遺伝的形質転換植物の数を増加させること、 によって、遺伝的形質転換植物類の数を増加させること、（ｃ）前記インチユー サー及び適当な雄性稔性植物類の存在下において生長した前記遺伝的形質転換植 物間でハイブリッド交雑を行うこと、の段階からなる方法。 ６９．遺伝的形質換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不稔性 植物を産生する方法で、 （ａ）前記植物中において細胞機能または発生にとって重大でありかつ代謝的に 応答性の細胞型において発現されるセンス遺伝子またはコード配列を好適には前 記花粉保持植物から同定しおよび単離すること、（ｂ）植物細胞のゲノム中に、 （１）前記センス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡに相補性 のＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、 （２）前記センス遺伝子またはコード配列によってコードされたＲＮＡの機能を 下記ＲＮＡに阻害させる時間枠において、前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起 こすように前記植物細胞中において機能する花粉特異的プロモータ、及び好適に は、 （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（ｃ）前記ＤＮＡ配列によって遺伝 的に形質転換された植物細胞を得ること、（ｄ）前記形質転換植物細胞から雄性 不稔性である遺伝的形質転換細胞を再生すること、 からなる方法。 ７０．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物類からハイ ブリッド種子を産生する方法で、 （ａ） （１）細胞機能または発生にとって重大でありかつ代謝的に応答性の細胞型にお いて発現されるセンス遺伝子を好適には前記花粉産生植物から同定しおよび単離 すること、 （２）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞ゲノム中に、前記植物 に対して化学的剤または生理的ストレスに対する耐性を付与する遺伝子、および この遺伝子は連結され、 （Ａ）前記センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコ ードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）花粉機能または形成にとって重大な組織中における前記センス遺伝子の転 写時またはその頃において、前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前 記植物中において機能する花粉ターゲットプロモータ、および好適には、（Ｃ） 前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ配列を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植物細胞 を得ること、および（４）段階（ａ）（２）に記載の遺伝子類で遺伝的に形質転 換されかつ雄性不稔性である植物を、前記形質転換植物細胞から毒生すること、 によって、雄性不稔性植物を産生すること、（ｂ）遺伝的に形質転換された植物 類の数を、（１）その組織外植体を用いるクローン繁殖、または他のインビトロ 繁殖技術、（２） （Ａ）上記（ａ）（４）に記載の遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔在植物と交 雑すること （Ｂ）上記の交雑によって産生した種子から生長した植物から、同一化学的剤ま たは生理的ストレスを用いて、上記段階（ａ）（２）に記載の遺伝子類を含有し ない植物類を除去すること、および （Ｃ）前記化学的剤または生理的ストレスの存在下、上記段階（ｂ）（２）の用 にして得られた植物類と数世代にわたり上記交雑を繰り返し、雄性不稔性植物類 の数を増加させること、 によって、遺伝的形質転換植物類の数を増加させること、（ｃ）前記遺伝的形質 転換植物類および適切な雄性稔性植物類とのハイブリッド交雑を行うこと、 の段階からなる方法。 ７１．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から雄性不 稔性形質を保有する植物を産生する方法で、（ａ）前記植物に対して、化学的剤 または天然または人為的誘発生理的または化学的ストレスに対する耐在を付与す るセンス遺伝子によって、分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞を 形質転換すること、（ｂ）前記形質転換植物細胞から同一ストレスに対して耐性 である遺伝的に形質転換された植物を再生すること、 （ｃ）分化した植物個体に再生可能なストレス耐性植物の植物細胞ゲノム中に、 （１）前記センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコ ードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物中において機能 する花粉特異的プロモータ、および好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時に おいて終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（ｄ）上記段階（Ｃ）に記載の遺伝 子で形質転換された前記ストレス耐性植物の植物細胞を得ること、および （ｅ）上記段階（ａ）および（ｃ）に記載の遺伝子類で遺伝的に形質転換されか っ前記化学的剤またはストレスによって雄性不稔性とされることができる植物を 、前記形質転換植物細胞から再生すること、の段階からなる方法。 ７２．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から復旧雄 性稔性性を有するハイブリッド種子を産生する方法で、（ａ） （１）分化した植物個体に再生可能な前記花粉産生植物の植物細胞ゲノム中に、 同時にまたはそれぞれ、前記植物に対して化学的剤または天然または人為的に誘 発した生理的ストレスに対する耐性を付与するセンス遺伝子、および、（Ａ）前 記センス遺伝子によってコードされたＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードする ＤＮＡ配列、 （Ｂ）前記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物細胞中において 機能できる花粉特異的プロモータ、及び好適には、（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写 時において終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子を押入すること、（２）上記段階（１）に記載の遺伝 子類によって形質転換された植物の植物細胞を得ること、 （３）上記段階（１）に記載の遺伝子類で形質転換されかつ前記化学的剤または ストレスによって雄性不稔性とされることができる植物を再生させること、によ って雄性不稔性形質を有する植物を産生すること、（ｂ）遺伝的形質転換植物類 の数を、 （１）その組織外植体を用いるクローン繁殖、または他のインビトロ繁殖技術、 （２） （Ａ）上記段階（ａ）（４）に記載の遺伝的形質転換植物を適当な雄性稔性植物 と交雑させること、 （Ｂ）同一化学的剤または生理的ストレスを用いて、このような交雑によって産 生された種子から生長した植物から段階（ａ）（２）に記載の遺伝子を含有して いない植物を除去すること、 （Ｃ）前記化学的剤または生理的ストレスの存在下において上記の段階（ｂ）（ ２）で得られた植物類との数世代にわたる交雑を繰り返すことによって雄性不稔 性植物類の数を増加させること、 によって遺伝的形質転換植物熱の数を増加させること、（３） （Ａ）前記化学的剤または生理的ストレスによって雄性不稔性とできる（ａ）に 記載の遺伝的形質転換植物を自殖させること、およびその自殖子孫から前記雄性 不稔性形質に関してホモ接合性の植物を選択すること、（Ｂ）上記段階（ａ）（ ３）に記載の遺伝的形質転換植物を同一ストレスまたは化学的剤から隔離して生 長させ自家授精植物を産生すること、（Ｃ）自家授精を可能とすること、 （Ｄ）このような自家授精植物の種子を同一ストレスまたは化学的剤から隔離し て数世代にわたり生長させることによって、遺伝的形質転換植物の数を増加させ ること、 （Ｃ）花粉形成時において同一ストレスまたは化学的剤の存在下において生長し た前記遺伝的形質転換植物と適切な雄性稔性植物類とのハイブリッド交雑を行う こと、 の段階からなる方法。 ７３．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から選択された植物から復旧雄 性稔性を有するハイブリッド種子を産生する方法で、（ａ）分化した植物個体に 再生可能な前記花粉産生植物の植物細胞のゲノム中に、化学的剤または生理的ス トレスに対する耐性を前記植物に付与する遺伝子、およびこの遺伝子に連結し、 （１）細胞毒性分子をコードするＤＮＡ配列、（２）前記ＤＮＡ配列の転写を起 こすように前記植物細胞中において機能する花粉特異的プロモータ、および （３）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（ｂ）形質転換植物細胞を得ること 、 （ｃ）記植物細胞から、雄性不稔性である遺伝的形質転換植物細胞を再生するこ と、 （ｄ） （１）上記段階（ｃ）に記載の遺伝的形質転換植物を適切な雄性稔性植物と交雑 させるこヒ、 （２）このような交雑によって産生された種子から生長した植物から、化学的剤 または生理的ストレスを用いて、上記段階（ａ）に記載の遺伝子類を含有しない 植物類を除去すること、 （３）前記化学的剤または生理的ストレスの存在下において、上記段階（ｄ）（ ２）のようにして得られた植物類と数世代にわたって交雑を繰り返し、雄性不稔 性植物類の数を増加させること、 によって、遺伝的形質転換植物類の数を増加させること、（ｅ）同一種から選択 した適切な雄性稔性植物の植物細胞中に、化学的剤または生理的ストレスに対す る耐在を前記植物に付与する遺伝子、およびこの遺伝子に連結し、 （１）前記細胞毒性分子をコードするＲＮＡ配列に相補性のＲＮＡをコードする ＤＮＡ配列、 （２）段階（ａ）（１）に記載のＤＮＡ配列の転写時またはその頃に、上記段階 （ｅ）（１）に記載のＤＮＡ配列の転写を起こすプロモータ、（３）上記段階（ ｅ）（１）に記載のＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミ ネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（ｆ）段階（ｄ〕から形質転換植物 細胞を得ること、（ｇ）上記段階（ｄ）に記載の前記形質転換細胞から、遺伝的 に形質転換された雄性稔性植物を再生すること、 （ｈ） （１）段階（ｇ）に記載の遺伝的形質転換植物を自殖させること及びこの自殖子 孫から雄性復旧形質に関してホモ接台性の植物を選択すること、（２）前記雄性 復旧形質に関してホモ接合性の前記植物の自家授精を可能とすること、 （３）前記植物の種子を数世代にわたり生長させ、遺伝的形質転換植物類の数を 増加させること、 によって復旧系統を産生すること、 （ｉ）前記雄性不稔性植物類を前記遺伝的形質転換雄性稔性植物類からの花粉で 受粉させることによってハイブリッド交雑を行うこと、の段階からなる方法。 ７４．遺伝的に形質転換可能な花粉産生植物類種から復目雄性稔性を有するハイ ブリッド種子を産生する方法で、 （ａ） （１）分化した植物個体に再生可能な前記植物の植物細胞のゲノム中に、化学的 剤または天然または人為的誘発生理的ストレスに対する耐性を前記植物に付与す る遺伝子、及びこの遺伝子に連結し、 （Ａ）転写され翻訳されたときに細胞毒性分子または細胞毒性分子に物質を分解 する分子をコードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）発生中花粉における前記センス遺伝子の転写時またはその頃において、前 記ＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を起こすように前記植物中において機能する花粉 ターゲットプロモータ、および好適には（Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において 終止シグナルを規定するターミネータ配列、 からなる組換えＤＮＡ分子を挿入すること、（３）前記植物の形質転換植物細胞 を得ること、および（４）上記段階（ａ）（２）に記載の前記ＤＮＡ配列で遺伝 的に形質転換しかつ雄性不稔性である植物を前記植物細胞から再生すること、お よび（ｂ） （１）段階（ａ）に記載の前記遺伝的形質転換植物の、その組織外植体を用いる クローン繁殖、または他のインビトロ繁殖技術、（２） （Ａ）（ａ）に記載の遺伝的形質転換植物を同系雄在稔性植物と交雑させること 、（Ｂ）上記（ａ）（２）に記載の同一化学的剤または生理的ストレスを用いて 、このような交雑によって産生された種子から生長した植物から、段階（ａ）（ ２）に記載のＤＮＡ配列を含有していない植物を除去すること、（Ｃ）前記化学 的剤または生理的ストレスの存在下において、上記の段階（ｂ）（３）で得られ た植物類との数世代にわたる交雑を繰り返すことによって雄性不稔性植物類の数 を増加させること、 によって、遺伝的形質転換雄性不稔性植物類の数を増加させること、（Ｃ） （１）分化した植物個体に再生可能な適切な雄性親植物の植物細胞のゲノム中に 、（Ａ）前記遺伝的形質転換雌性親植物中において花粉形成または機能に重大な 組織に起きた障害を無効とする分子をコードする遺伝子、（Ｂ）（ａ）（１）に 記載のセンス遺伝子が活性である時点においてまたはその頃において、花粉形成 または機能にとって重大である前記組織中において前記遺伝子のＲＮＡへの転写 を起こすように機能するプロモータ、および好適には花粉ターゲットプロモータ 、 （Ｃ）前記ＤＮＡ配列の転写時において終止シグナルを規定するターミネータ配 列、 からなる組換えＤＮＡ配列に連結し、化学的剤または天然または人為的誘発生理 的ストレスに対する耐性を前記植物に付与する遺伝子を挿入すること、（ｄ） （１）上記段階（ｃ）に記載の復旧形質保有遺伝的形質転換植物を自殖させるこ と、及び前記復旧形質に関してホモ接合性の植物を選択することおよび隔離下の 自殖によって前記植物を増加させること、または（２）適用可能であるときには 、（ｃ）に記載の復旧形質を有する遺伝的形質転換植物のやくまたは単離した小 胞子を培養することおよび前記復旧形質に関してホモ接合性の植物を選択するこ とおよび前記植物を隔離下の自殖によって増加させること、 によって、遺伝的形質転換雄性稔性復旧植物類の数を増加させること、（ｅ）（ ａ）（２）に記載の化学的剤または生理的ストレスの存在下において（ａ）に記 載されかつ（ｂ）で増加した前記雄性不稔性植物類を、（ｃ）に記載で（ｄ）で 増加した雄性稔性復旧植物類からの花粉で受粉させることによって、ハイブリッ ド交雑を行うこと、 からなる方法。 ７５．プラスミドｐＰＡＬ０４２０。 ７６．プラスミドＰＡＬ１１０６． ７７．プラスミドＰＡＬ１１０７。 ７８．プラスミドＰＡＬ１４１９。 ７９．プラスミドＰＡＬ１４２０。 ８０．プラスミドＰＡＬ１４２１。 ８１．プラスミドＰＡＬ１４２２。 ８２．プラスミドＰＡＬ１４２３。 ８３．プラスミドＰＡＬ１９２０。 ８４．プラスミドｐＰＡＬ０１０１（ＡＴＣＣ６８２１０）。 ８５．プラスミドｐＰＡＬＨＰ１０１。 ８６．プラスミドＰＡＬ１９５４。 ８７．プラスミドＰＡＬ１９５５。 ８８．プラスミドＰＡＬ１３０２。 ８９．プラスミドｐＰＡＬ３０３。 ９０．プラスミドｐＰＡＬ３０６。 ９１．プラスミドＰＡＬ１１２１。 ９２．プラスミドｐＰＡＬ１９０１。 ９３．図に示されかつ本文の開示に記載されたような花粉特異的プロモータ構築 体類およびヌクレオチドコード配列類。 ９４．図に示されかつ本文の開示に記載されたような花粉特異的コード配列構築 体類およびヌクレオチドコード配列類。 ９５．図に示されかつ本文の開示に記載されたような構成的プロモータｐＰＡＬ ＨＰ１０１のヌクレオチドコード配列。 ９６．図に示されかつ本文の開示に実質的に記載されたような方法、および植物 細胞、およびそれから由来する植物類およびハイブリッド種子。 ９７．クローンＬ４のヌクレオチド配列１−８５８５。 ９８．ヌクレオチド類１−３０７からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ４Ａのプロ モータ領域またはその機能的断片。 ９９．ヌクレオチド類２３７−３６８からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ４Ａの 第一コード領域またはその機能的断片。 １００．ヌクレオチド類１１３３−１４２７からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ ４Ａの第２コード領域またはその機能的断片。 １０１．ヌクレオチド類３６９１−１１３２からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ ４Ａのイントロン領域またはその機能的断片。 １０２．ヌクレオチド類２３７−１４２７からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ４ Ａの転写領域またはその機能的断片。 １０３．ヌクレオチド類４５６５−６２６８からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ ４Ｃのプロモータ領域またはその機能的断片１０４．ヌクレオチド類６２９７− ６４２９からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ４Ｃの第一コード領域またはその機 能的断片。 １０５．ヌクレオチド頬７１９５−７４９０からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ ４Ｃの第二コード領域またはその機能的断片。 １０６．ヌクレオチド類６４３０−７１９４からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ ４Ｃのイントロン領域またはその機能的断片。 １０７．ヌクレオチド類６２９７−７４９０からなるクローンＬ４の遺伝子Ｂｐ ４Ｃの転写領域またはその機能的断片。 １０８．ヌクレオチド類−７８９−２８５２からなるクローンＬ１０のヌクレオ チド配列。 １０９．ヌクレオチド類−７８９−６４からなるクローンＬ１０のプロモータ領 域またはその機能的断片。 １１０．ヌクレオチド類１−３１５からなるクローンＬ１０の第一コード領域ま たはその機能的断片。 １１１．ヌクレオチド類４７５−１１３５からなるクローンＬ１０の第二コード 領域またはその機能的断片。 １１２．ヌクレオチド類１６７２−２０１１からなるクローンＬ１０の第三コー ド領域またはその機能的断片。 １１３．ヌクレオチド類３１６−４７４からなるクローンＬ１０のイントロン領 域またはその機能的断片。 １１４．ヌクレオチド類１１３６−１６７１からなるクローンＬ１０の第二イン トロン領域またはその機能的断片。 １１５．ヌクレオチド類１−２０１１からなるクローンＬ１０の転写領域または その機能的断片。 １１６．ヌクレオチド類−２０２２−２９５５からなるクローンＬ１９のヌクレ オチド配列またはその機能的断片。 １１７．ヌクレオチド類−２０２２−１３５からなるクローンＬ１９のプロモー タ領域またはその機能的断片。 １１８．ヌクレオチド類１−１２０１からなるクローンＬ１９の第一コード領域 またはその機能的断片。 １１９．ヌクレオチド頬１３３９−２０７２からなるクローンＬ１９の第二コー ド領域またはその機能的断片。 １２０．ヌクレオチド類１２０２−１３３８からなるクローンＬ１９のイントロ ン領域またはその機能的断片。 １２１．ヌクレオチド類１−２０７２からなるクローンＬ１９の転写領域または その機能的断片。 １２２．請求項７５−９２に記載のベクター類に包含されるキメラプロモータ構 薬体類を含むプロモータ構築体類。 １２３．ヌクレオチド類１−３８４からなるｃＤＮＡクローンｃＢｐ４０１のヌ クレオチド配列またはその機能的断片。 １２４．ヌクレオチド類１−３６４からなるｃＤＮＡクローンｃＢｐ４０５のヌ クレオチド配列またはその機能的断片。 １２５．ヌクレオチド類１−２９８からなるｃＤＮＡクローンｃＢｐ４０８のヌ クレオチド配列またはその機能的断片。