JPH04504500A

JPH04504500A - 雑種種子の生産

Info

Publication number: JPH04504500A
Application number: JP2502047A
Authority: JP
Inventors: ブリツジス，アイアン，ジヨージ; ブライト，シモン，ウイリアム，ジヨナサン; グリーンランド，アンドリユー，ジエームス; シユヒ，ヴオルフガング・ヴアルター
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1989-01-26
Filing date: 1990-01-26
Publication date: 1992-08-13
Also published as: CA2008700A1; DE69033957T2; EP0455665A1; AU621195B2; ZA90608B; AU4945690A; JP2001086987A; BR9007061A; GB8901677D0; ATE217022T1; EP0455665B1; CA2008700C; HU215090B; DK0455665T3; DE69033957D1; US5808034A; RO112642B1; US6172279B1; ES2176175T3; WO1990008830A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

鯉　千七！本発明は、雑種Ｍ物の生産方法に関するものである。特に５本発明（＝、作物植物の稔性の分子制御に関する。Ａ業は、人間が消費する食物の生産、人間の消費層の製品を生み已す商業的プロセス、動物用飼料の生産、工業製品の開発及びその他の目的のために多くの作物植物を利用する。このプロセスには、種子生産者から屑入された種子の農家による植付けが必然的に含まれる。？［物全体であれ、植物の種子あるいは果実であれ、作物によって作り出される産物は、収穫された後、上記のような様々な食物用途のため利用される０種子会社から種子を購入する他、農家は前年の作物から備冨しておいた一部の種子を植え戻す、しかしながら、これは通交系、または、異系交配種子として用いられる作物の場合において経済的に有益であるに過ぎない、これは、雑種強勢によって達成される生産性向上を実現するために植えられる雑種植物にとっては、経済的に有利ではない、主要な黒業領域において植え付けられる主要作物は、雑種作物として植え付けられ、農家に相当の収量増を保証する。専門の種子会社による雑種種子の生産は、高コストで複雑なプロセスである。このプロセスは、近交親系等の育種と選択を含み、組み合わせが週明であれば、環境条件に最大の適応を示すと共に最大収量の実現が可能な子孫が得られる１Ｍ種種子の生産のためにｆ＊、ＦＬの雑種種子を生み出す交配に２げる雄または雌の親として通交系刀二遍択される。大部分の作物は雌だ同体であるため、交配における雌親は、種子生産の間における自家受粉を回避するために、除雄しなけれげたもない。トクモロコ７のような自然受粉植物の場合、雌親の自家受粉を最小限にするために、特殊な植付は方式が用いられる。それには、雄として使われる植物を雌親から分離することが含まれる。これによれば、季節の終シにおいてＦＬ雑種種子を容易に分離することができる。除雄は、トウモロコシの場合に用いられているような機械的方法によシ、トマトの場合のように手作業で、あるＩＡは小麦または米の場合のように化学的方法により、また七イヨウアブラナ、テンサイ及びその他において用和合性を利用して遺伝学的方法によシ行５ことができる０これらの手法は、農業実践や植物の取扱い操作の複雑さにという点においてＡするものの、概してｆ理するのにコストがかかり、実施が′Ｍ、雑であり、またどのシステムを用いるかに応じて比較的非効率的である。この非効率性は、信性植物を種子白層のためにｇ種あるいは不稔化（ｓｔｅｒｉｌｉｓｅ）する必要があり、それが非常に広大なｆ積にりたって行われるということから生じる。従って、大規模な乏の４物体の処ｔを行う必要がある。また櫟々な処置では、農家が櫃えつげる次の世代に２いて発芽可能（ｖｉａｂｔｅ）　７！一種子を生みと＝す必要ｆｒ：　７ｒｒ　ル。本＠明の目的は、上記のような欠点を解消ないしは組成することにある。本発明によ１ば、発芽可能な花粉のバイオゲネシスを分断さぞることが可能なタンノ１り質をコード化するデイスラプタ遺伝子（ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　）と、種物遺伝子（ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　）組立て体を含む植物に対して外因性である化学的インデューサーを外部添加することによって誘導されるプロモーター配列を含む遺伝子調？塩基配列（ｇｅｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）とを含有してなる植物遺伝子組立て体が提供される。遺伝子側ｆ＠塩基配列は、上記のディスラブメタン、２り質遺伝子を制御するオはレータ、及びこのデイスラプタタンパク質遺伝子の第５レータを結合するようｌＩｌ成されたりプレッサタン・ξり質をコード化するリプしツサ遺伝子を含むものであって、それのリプレッサタンパク質の遺伝子が上記の化学誘導性のプロモーターの簡■憚下ｔ装置かれているようなものである。でた、好ましくは、本発明の遺伝子組立て体は、デイスラプタタンパク質遺伝子の発現を植物の雄花部分に制限するために、作用的に上記のディスラブメタン・５り質遺伝子に連結された雄花に＃異的彦オはレータ配列を含むものである。また、不発明に、本発明の遺伝子組立て体を組み込んだ形質転換された植物並びに細胞、原形質体、及び、種子のようｆ−植物５分を提供するものであるつ本４！明の一実施法においては、植物のゲノムへ挿入してこれに再生性の司性不捻注を与えるための下記の（ａ）〜（ｅ）よシなる組換ＤＮＡ組立て体であって、外因性の化学的インデューサーの有無によシ雄８：捻性または不稔性を選択することを可能にする組換ＤＮＡ組立て情が得られる：（＆）外因性の化学的インデューサーの！無に応答して作用する第１の遺伝子プロモーター配列、（ｂ）上記ｇｔのプロモーター配列の制帽下にシいてリプレッサタンパク質をコード化する遺伝子、（ｃ）上記のリプレッサタン・４り質に応答して作用する１はレータ配列、（ｄ）植物の雄の部分においてのみ発現可能な疼２の遺伝子プロモーター配列、（ｅ）発芽可能な花粉の生産に不可欠な植物と特江のタン・ξり質抑印しを；− ド化する遺伝子。さらに、本発明によれば、再生可能な雄ε不稔の植物であって、安定的にそのゲノムに組み込まれた形の上記組＊　Ｄ　Ｎ　Ａ組立て体を含む植物が得られる。好ましくは、上記の第１のプロモーターは、外因性の化学的インデューサーによる刺激に応答した時にリプレッサタンパク質の発現を促進するものであり、シ２：ｌ−もこれによって化宇万インデューサーがない場合をこはリプレッサタンパク質が全くオはレータと相互に作用するたつの発現をされず、従ってミ性捻性の抑制因子をコード化する遺伝子の発現を許容する一方、化学的インデューサーがある場合には、リプレッサタン・ξり質が発現されることにより、雄性稔性の抑制因子をコード化する遺伝子の発現を妨げ、こうして植物を捻性状態に再失、すなわち、回復させるプロモーターであるのが好ましい。このように、本発明の遺伝子組立て体は、いくつかの作動的に相互に連結された塩基配列（５ｅｑｕｅｎｃｅ　）を含む。これらの配列において、上記の（ａ）を説明の便宜上、「化学スイッチ」と称し、（ｂ）を「リプレッサ配列」と称し、（Ｃ）を「オはレータ」と称し、（ｄ）をＭＦＳ制ａ（すなわち雄花に特異的な制御（ｒｎａｌｅ　ｆｌｏｗｅｒ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｏｎｔ＝ｒｏｌ））と称し、（ｅ）をディスラプタ遺伝子と称する。以下、これらの各配列の基本的要素及びそれらの相互作用につｈて、添付図ｆを参照しつつ説明する。本発明は、様々な分子技術及び手法を用いて雄性不稔化される通交系の生産を可能にするものである。これらの通交系植物は、稔性の逆転（可逆性雄性不稔；ＲＭＳ）のための化学スイッチ系を必要とする。このスイッチ系の両相はメンデル形質として受け継がれる。このことは、ＲＭＳの制御された機能に必要な分子状要素（ｒｎｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｌｅ＋ｎｅ−ｎｔｓ　）を植物ケ゛ツムへ挿入することによって連取される。本発明は、育種家または栽培者がＦｌの雑種種子として生産することを望み、また適当な転換孜術が利用可能であるかあるいは利用可Ｗととなるあらゆる単子葉植物のあるいは双子葉の４物に適用することができ、特にトウモーコン、小麦、ヒマワリ、セイヨウアブラナ、トマト、及び、その他の野菜類、テンサイ、及びｉ！葉碩物やＳ花植物に通用可能である口不発明に、ＦＬの廻種種その生産に付４する作物管理コストの低減、４種種子の純度管理の容易さ、ＲＭＳ系１（ｌｉｎｅｓ）と集団（ｐｏｐｕｌａｔ　１ｏｎｓ　）の維持、及び系統と集団の間のＲＭＳのＩＥ移（ｔｒａｎｓｆｅｒ　）　等において大きな利点を！する口不発明の一応用例に訃バでは、植物の生産、特に分子工学的手法を用いて不稔化される通交系植物の生産について説明する。これらの植物は、分子Ｉｎカスケードの利用による徳性の回復を行う化学薬剤のスプレーを用いることにより徳性を回復することができ、これが分子制御カスケードの使用による徳性耳白につながフ、大願で開示する方法は、多くの個別要素で與収されて訃り、これらの要素はそれらの要素のよシ広範な応用を開示する個別の特許出ａの対象となる。Ｌ、全体のプロセス添付図ｆの図１は、「雄性不稔な」状態にコ・ける不発明のＤＮＡ組立て体のブロック図である。外因性の化学的インデューサーがない時は、化学スイッチは作動イず、リプレッサタンパク質は、リプレッサ配列によって全く発現されない。リプレッサタンパク質がない時に、万Ｒレータ配列は、選に辞Ａ罰な組織中でのディスラブメタンバク質の発現を許写し、その発現はＭＦ’Ｓ簡ｊ≦垣基配列の存在によって特異的に植物の雄部分に指向させられる。その結果、植物は雄性不稔とカリ、発芽可能な花粉を生じることができず、従って自家受粉することができない。この効果の実用価値は、意図した交配の雌を代表する前記の如き植物がその交配の意図した雄性の親の近傍に植え付けられると、意図した雄からの花粉によって授精されるということである。図２は、「雄性稔性」状態における本発明の遺伝子組立て体の作動を示す。化学的インデューサーを植物と接触させると、化学スイッチが作動して、リプレッサタンパク質を発現させる。すると、リプレッサタンパク質は、オはレータと結合し、ディスラブメタン・ξり質の発現を抑制して雄性稔性を回復させる。この遺伝子組立て体のこの作動モードの実用性は、その植物系統が将来の使用のために永伏維持することができるよう、該遺伝子組立て体を含む植物の発芽可能力花粉の生産及び自家受粉を可能にさせることである。２、化学スイッチ多数の植物プロモーターは、化学的信号を用いて誘導されるものと推７ｊ！１される。しかしながら、特定の化学薬品がこのモデルに必要な植物組織中の遺伝子発現をスイッチオンするということはほんの少数の例において実証されているだけである。特別な関心がもたれる遺伝子は、クルタチγンーｓ−トランスフェラーゼＩＪ　（Ｇ　Ｓ　Ｔ　Ｊｊ、）の２７にのサブユニットをコード化する遺伝子である。この遺伝子は、叫に植物組織の処置によって特異的に誘導さｎ、岬に化学セーフナー（ｓａｆｅｎｅｒ）を用いて約を発達させる化ｓｔ薬品処理時に誘導される。このよつなセーフナーとしては、Ｎ、Ｎ−ジアリル−２，２−ジクｃｘロアセト。アミドであるが、植物組織において改良された移動性（＋ｎｏｂｉｌ　ｉｔｙ　）　特ｅ−を示すｄ＃化合物があシ、それらの化合物はこの用途のために改善された持続性、効力、及び安全性をも有している。これらの化合物については、文献に記載がなされている。この場面においては、その他の化学的に誘導されるプロモーターを用いることが可能なことは明らかである。それらの中には、植物起源のものもあれば、真Ｍ起源のものあるいはイースト起源のものもある・本願にシいては、１Ｍ５手法に通ずるブーモーター及び化ｉ的化合物は、ＧＳＴＩＩ及びセーフナー〇場合に使用することができるものと意味される＠３、リフレツサ配列及びオはレータ配列ｇｔの実施法に２いて、本発明では、「キラー」遺伝子＠能の発現を制御するために、バクテリア起源のオはレータとそれらのりプレソサの間の元弁に特徴付けられた相互作用を利用することを提案する。バクテリア起源のりプレツブ、′＃しζｌａｃリプレッサ、または４３４、ｐ２２及び、ラムダ（１ａｒｎｂｄａ　）バクテリオファージによって使われるリプレッサは、植物細胞において発現を３御する比めに非常に効果的に用いることができる。第２の実施法において社、「疑似オはレータ」、スナわち特定のオはレータ−リプレッサ組み合わせで通常用いられるオはレータに類似しているが、同じではないオはレータを用いることが可能である。我々は、適当な選択システムをもちいることによシ、植物遺伝子において見いだされる疑似オはレータを識別する突然ＫＡ体リプレッサが発生させることができるということを実証した。植物遺伝子において見出される疑似オにレータを識別する突然変異体リプレッサの選択について以下に説明する。考えられる「キラー」遺伝子のダウン（ｄｏｗｎ　）レギュレーションのもう一つのアプローチハ、アンチセンスＲＮＡの使用である。これは、トマト果実成熟期間中に発現されたポリガラクツロナーゼのレギュレーシ５１．　ンについては効果的であることが実証されておシ、文献に説明がなされている。４、雄花に特異的な発現カセット前述したようＶζ、「キラー」遺伝子の発現は、雄花に特異的な組織（ＭＦＳ）中に生じなければならない、これらの組織は、生育中の約において見いだされる組織のこともあれば、生育中の約や花粉と関連している組織に見いだされることもある。ＭＦ　５ｆｆｉ織における遺伝子の発現を駆動するＤＮＡプロモーター配列は、様々なベクター系にクローニングされるｃＤＮＡライブラリの差動スクリーニングを通じての。ＭＦＳ組織へ発現された遺伝子の確認のために従来確立したプロト；ルを使りことによって獲得、実現されることができる。また、バクテリオファージ・ラムダ（フタ−を使うゲノミツクライブラリからこれらのＣＤＮＡ５を；−ド化する遺伝子のＪ！ｌＬ＋１のためのプロトコル、及び、ＤＮＡ４：ｘ基配列決定、及び、分析的な植物転換実験を使うそれらのプロモーター配列を特徴付けるためのプロトコルを用いても、前記のＤＮＡプロモータ配列を実現で花粉形成の抑制は、新規な「キラー」遺伝子の使用によって運放される。その用いられる「キラー」遺伝子は、花粉形成（その詳細は上記参照）の間の連符において特異に発現された時には約とそれに連合し九組嫌の細胞死、花粉母細喝、花粉とそれに連合した組織の細龜死をもたらす「中ブー」遺伝子である。そのような細店死は、花粉形成の流産、及び雄性不稔である植物を生ずる。「キラー」遺伝子の起源は、様々な自然に発生しているノースから来たものであることができる；例えば人間の細ぺ、イースト細胞、植物−相、真１ｒ！胞をノースとするものであることができ、あるいは「キラー」遺伝子は、完全に合式の遺伝子であることもでき、それを ′１ｐＩｓするＤＮＡ垣基配列の−５は自然界に存在する配列であることができ、あるいは自然界に−Ａ常は存在しない配列であることもで１、あるいはそれら岡者の混合物であることもで建る。［キラーＪｆｆｉｅ子に、ミトコンドリア代佑への影響を持つものが好まし−。その理由は、十分なエネルギー供給がａ性花粉の生者の絶対的条件であることが従来側らカ１にされているからである。しかしながら＠キラー”機能がＤＮＡ代鮒、タン／ξり質合成、及び他の新茨代庸経路のよう々他の本質的な生化学的機能を目標として効果的に働き得るよりにさせること吃考えられる。２つのそのようなりＮＡ構造は哺乳類の茶色の脂肪質組織の説共役蛋白質またはそれのに異物をコードするＤＮＡ配列から成るか、または合成の遺伝子から成るミド；ンドリア質の目標となる領域と、ミド；ンドリアの膜へのメン、＋り質の挿入を行わぜる親油性の領域（ｌｉｐｏｐｈｉＬｉｃ　ｄｏ−ｒＱ工ｉｎ）から成る。８、ＭＦＳ−／ロモーター配列及び「キラー」遺伝子より麿る発現モジニールの生産雄花に特異な遺伝子の制御の環基配列（ＭＦＳ：７ントロール）と「キラー」遺伝子とから成る発現モジニールの生産は、従来確立した分子Ｓ築技術を用いて行われる。エリート近又系における上記のモジュールの発現は、雄花に特異な組織に訃いてのみ、「キラー」遺伝子の生成物の生産を生ずる。これは、ｔＳ性不ａカ植＃Ｊを生産すること７、＠換トランスジェニック［咽は、植物のゲノム千に本発明による上記に示された遺伝子組立て体を挿入することによって４４される。植物ゲノムへの本発明の遺伝子組立て体の挿入のために採用された特異的な転換（ｔｒａｎｓｆｏ−ｒ＋ｎａｔｉｏｒ＋　）法は、不発明の本質とは別の技術に漠する。それの多数の手法が多くの文献に記載されており、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ　ｔｕ＋ｎｅｆａｃｉｅｎｓ　１１または、そのＴｉプラスミドを使りアグロインフエクシミンの技ε、ニレクトクボレーション、植物細胞やプロトプラストのマイクロインジェクション、微量投射転換、及び、花粉萱転換が挙げられるが、これらに限定されない。既知の諸方法の十分な詳細を知るには文献を参照されたい。８、不稔の反転前述の孜術及び方法を用いて不稔性の状９１こされている植物はそれ自体は究極的にはＭましいものではないことは明らかである。従って、設計的に仕組まれて作られ子状要素、すなわち回復された徳性でこれらの植物の系綻維持を可能にさせ、そしてＦｌのｉｔｈ′ａｉ種子の主意に該植物を利用させ得る分子状要素（＋ｎｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｌｅ＋ｎｅｎＶｓ　）を用いるカスケードを使うことが本発明で提案される。不稔性から徳性への反転メカニズムの設計この点で提案された反転メカニズムは、３つの個別の要素から成る： λ、化学的に切り換え可能なプロそ一ターｂ、バクテリア起源のオぼレータ配列Ｃ１荊述のオはレータと高い親和力で結合（ｂｉｎｄ　）するバクテリア起源のリプレッサ遺伝子。こ・れら３つの要素は、下記の要領で作動する。すなわち徳性の復活が必要とされる（例えば、通交系の維持用の木場プロット内の場合）とき、不稔性の植物は、化学薬品を噴霧されて徳性に転換される＠この化学薬品は、ＮＦＳ制御埴基配列中のオはレータＤＮＡ埴基配列に結合するバクテリアのリプレッサ分子の発現を化学誘発性プロモーターを介して誘導するものである。この時の結合は、「キラー」遺伝子の機能の抑制を生じさぞ、正常な花粉形成を生起させ得る。９、Ａ、ＰＬ雑種生産への応用図１は、ＲＭＳがエリート植物に使われる場合に、起こる分子的事象の概要を示す。３通りの遺伝学的シナリオは、導入された特性（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　ｔｒａｉｔ）の発現に町用可能であるが、それらの利用可能性はそれぞ入のシナリオがドミナント（ｄｏ＋ｎ１ｎａｎｔ　）な又はレセッシブ（ｒｅｃｅｓｓ−４ｖｅ　）なジーンとして慟らくように予定されているかどうかによって左右され、更に親の胞子体や配偶体の組織中に発現が生起するようにアレンジされでいるかどり刀Ａに二つでもＥ、石される。これらのシアリγ憂：、下記の表工に２２で要約される。衰　工Ｆｌ１４種の三！上表で、ＲＭＳま分悸に「キラーｉｔ云子」１Ｆ＝−発÷２優性形賃」にとけるＲ、　Ｍ　Ｓ／÷分項）にδいてＩｙイＳ！−利用することは、望ましい、そｔは、この−ＩＪ合クりおいて意味されるＦｌの雑９ｉ種子生産の間、その結果生じるハ１′ブリッドイ＝、それらの遣Ｆ、子：においてＲ２，ｔ　Ｓ　／÷か÷ ／÷のいずれがであるということ、植物（÷／÷８９する花粉生産Ｉ：提供下ることができる。こｎば、大５分の。作物に十分である（特に多量の石粉が竺まれるトフモロコシにおいて）。１宴なの（＝、　：？、；４５　ｒ、２、三種、及び、Ｏ：１種２セのようｔハイブリ、１−″の→の・７−７スのとヨＣ７チ１−１百η−スー２ができる。支配的な胞子体的な発現を使う上記の実施例において、ＰＬ；７１の交配における雌の遺伝子型ＲＭ　Ｓ　／　ＲＭＳの使用に、÷／十花粉媒介者と共に交差して遺伝子型ＲＭＳ／÷を都合よく発生させる。ｒｍｓ／÷遺伍子型は、その時第２の交配における使用のための雄性不稔な雌の親を構成する。（下表Ｉ工を参照、）本これらの笑殺においては、第１の花粉媒介者を化学スイッチで処理して雄性稔性を回復させ２゜不文Ｍ　２の花粉媒介者は近交系（３種）でも雑種（４７Ｊｌ）て例えば、ＲｋｉＳの発明（；、實種プログラム（例え）ゴ）においてまた都合よく利用される新しい近２系系統が得らｎるべきである合成の人口に、異形交配を’ｊｊｊ４２１％ｉする際１シナリオ同様のではなく制限する３及び４方伝交配の主属におけるｔ！Ｌ初の７１′クルのたのの前述の表にといて示さｎなそれらに採用されてもよい。化学スイッチ設備の次のラウンドの新しい、及び、成員された遺伝子型そ生むだめの自照ザイクルの使月。ＲＭＳ発明を促進するために使われるＤＮＡ塩基配列から得られたＤ　Ｎ　Ａ塩基配列を使う分子の響ｆ（ＲＦＬＰ分析）である都合よく使う近親交配の間のプローブとして前進するための結果がＲＭ　Ｓ系の全ての元票を保持したことを保証するために。これらの戦略は、ＲＭＳ特性を新しい生ＮＸへＥ送するために、便利な、及び、効率的な手続きを提供する。今発明は、示される（利月されてもよい様々な改分遺伍そモジニールの次の特異約の説明による説明として）。参照）よ、添付図面に行われる。

【Ｉ図１は、雄性不稔な状態における植物による本発明の遺伝子組立て体のブロック図である。図２は、雄の稔性状態における植物による大発明の遺伝子組立て体のブロック図である。図３は、下で示されたように、Ｒ２５による処置後の２３、及び、４４＃間をもたらされたルート、及び、発射における全体のＧＳＴ后動のための結果を示す３図４）＝、イソ酵’Ｊ！！ＧＳＴ　ｒ、及び、ＧＳＴ’ＥＩのクロマトグラフ分離を示す。図５は、米処理の巧組織中に存在するＧＳＴ　ｒの后特表千４−５０４５００　（７）動は、ことを示す。図６；＝、後述するＲ　２５にまる処置後のＱ　Ｓ７　ｆ　Ｔ活動の刺激を示す。図７は、結果がステムリザバー技術を使っているのを示す。図８は、スプレーによる吹き付けの結果を示す。そして、図９は、下で示された方法において発生させられた時間経過グラフである。図１０は、ベクターｐ３５ｓ１ａｃＩの組立て体を示す、　図１１は、ｐｃＧｌ、及び、ｐＣＧ２の基礎的な組立て体を示す。図１２は、トウモロコシＣＡＢプロモーターのヌクレオチド配列を示す。図１３は、プラスミドのｐＡＤ、及び、ｐｕｓ　ｌシリーズのマツプである図１４は、トウモロコシの花の特有クローンの単離のために使われるライブラリスクリーニング要領を示す。図１５は、増加している長さのトウモロコシ房から抽出された全体のＲＮＡ　（ドツトにつき４μｇ）のドツト汚れ分析を示す。図１６Ａ、Ｂ、Ｃは、現場で現れるｐ　Ｍ　Ｓ　ｌ　４アンチセンスＲＮＡプローブによるトウモロコシ小ＬＩ！テクシ冒ンの異種混合を示す。図１７は、ＭＦＳ　ｃＤＮＡクローンｐＭｓ１０のヌクレオチド、及び、推測− されたアミノ酸配列を示す。図１８は　ＭＦＳ　ＣＤＮＡクローンｐ　Ｍ　Ｓ　ｌ　４のヌクレオチド、及乙Ｊ、推２−　Ｃ：ｒ−たブミノ゛酸配Ｔ４を示す。図１９は、Ｍ　Ｆ　Ｓ　ＣＤ　Ｎ　Ａクローンｐｕｓ　１８のヌクレオチド、及び、推測−されたアミノ酸配列を示す。図２０は、りＯ−ン１０／ＣＴ８−３から９ｋｂ　ＥｃｏＦ’ｒフラグメントの制限マ・ノブである。図２１は、クローン１４／Ｌ７Ｍから９ｋｂ　Ｅｃ。ＲＩフラグメントの制限マツプである。図２２は、クローンｌ　８／ＣＴ３かも９ｋｂＥｃ。Ｒ，エフラグメントの制限マツプである。図２３は、クローンｐＭｓＬｏ−５のプラスミドマツプである図２４は、ｐＴＡＫｌ、ｐＴＡＫ２、及び　ｐ　ＴＡＫ３の組立て体を示す；図２５は、クローンｐＭｓ　１０−６０ＵＳのマツプである。図２６は、プラスミドｐｃ’ｓ　１１０−ＵＣＰ（７）？−／ブである。図２７は、プラスミドｐｃ’ｓ　ｌ　１９−ｔＪｃＰ　（図２４に現れる）からの哺乳類のＲ共役タンパク質遺ｅ予のｍ　ＲＮ　Ａ配列を示す。図、２８＋！、１ｅｕ２の生成の流れ図発現、胆汁イースト細胞株である。図２９は、付加のガラクトースの効果をＢＥＴ９の；長、及び、ＢＥＴ２７形′ ＸＥ喚細胞に示す表である。図３０は、ガラクトースの存在、または、欠如において６時間の期賀に９たるｓ　’−：ｙ’　／　Ｃａ　ｓ煤賃上で攻長さぜられたＢ、ＥＴ９（図２８Ａ）、及び、ＢＥＴ２７　（図２８Ｂ）形′ＸＥ換細胞の成長白線分析の結果を示す。図３１は、ガラクトースの存在、または、欠如において５０時間の期間にわたるｇｌｙ／ｃａｓ媒質上で成長さぜられた細胞株ＢＥＴ９におけるネズミＵＣＰの成長白線分析である。＠３２は、ガラクトースの存在、または、欠如において４５時間の期間にわたるラフィノース媒賀上で成長させられた細胞株ＢＥＴ９におけるネズミＵＣＰの成長白線分析である。図３３は、ｐＫＶ４９−ＵＣＰ、及び、ＹＩｐ５・からのプラスミドＹ’ＩＰ／ＵＣＰの組立て体を例証する。（図３２Ａ）。図３４は、プラスミドｐＧＲ２０Ｂのマツプである及びＦ＋−ＡＴＰアーゼ（図２２Ｂ）のβ−ザブユニット遺伝子をＦ化させるために使われるオリゴヌクレ７チドの配列。図３５は、ｐＫＶ４９　（図３３Ａ）、及び、ｐＫＶＡ９−ＵＣＰ　（図３３Ｂ）をプラスミドのマツプを示す。図３６は、概略的にβ−サブユニット／β−ガラクトシダーゼ融解タンパク質の組立て体を示す。図３７は、ｐＫＶ４９／ＢＬＺのプラスミドマツプである。ｌｍ３Ｂは、ｐＭｓｌｏ−５のプラスミドマツプである図３９は、ｐＢｉｎ／ＭＳＩ○−ＵＣＰのプラスミド次のパラグラフにおいて種々の遺伝子組立て体に就いて説明するが、これらの組立て体は、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　＆　Ｍａｒｉｎｅ　ＢａｃｔｅｒｉａのＮａｔ　１ｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、ＡｂｅｒｄｅｅｎＵＫに寄託されたものである。それらの寄託の日付、及び、寄託書号は次表Ｉ１１にまとめられている。表　ＩＩＩこのモジニールは、トウモロコシグルタチオン−８−トランスフ；ラーゼ（ＧＳＴ　ｒ工）遺伝子の２７ｋｄサブ、ユニットから分離された化学的に誘導される遺伝子プロモーター配列によって例示される。笑浦上発明の化学誘発性プロモーターは、挿入される植物の使用になる運命にあった組換え体遺伝子複合概念におけるプロモーター配列として。組立て体は、転換によってその時植物に挿入される。複合概念にδけるタンパク賀二ンコーディング遺伝子の発現、発明の化学的に切り換え可能なプロモーターの制御されているｇ在は、化学的インデューサーの植物への応用によって制御されてもよい。効果的なプロモーター／インデューサー化合の例は、プロモーターが前述のＧＳＴ　ＩＩプロモーターであることであり、及び、インテ・ニーす−は、Ｎ、Ｎ− ジアリル−２，２−ジクロロアセトアミド（一般名：ジクロルアミド）である、ｙ）るいはベンジル−２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）−５−チアゾール−カルボキシレート（一般名：フルラゾール）。化学的インデューサーＧＳＴＩＩ　２７ｋｄサブユニット発現の潜在的なインデューサーは下記のような化合物を含むこ、とである：１、ベンジル−２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）５−チアゾール−刀ルボキシレート；２、ナフタレン−１，８−ジカルボキシリックアンヒドライド３．２−ジクロロメチル−２−メチル−１，３−ジオキソラン；４’、１−（ジクロロアセチル）−へキサヒドロ−３，３−，８ａ−１リメチルービロール（１，２−ａ）ピリミジン−６（２Ｈ）−ｏｎｅ　：５．２，２．５−トリメチル−Ｎ−ジクコロオキサゾリンン：６．１．３−ジ丁キソランー２−ｙ１メトキシイミノ（フェニル）ベンゼンアセトニトリル：７．４．６−ジグコロ−２−フェニル−ビリミジン：８．２．２−ジクロロ−口Ｎ−アリル−Ｎ（１，３−ジオキソシノー２−メチル）］アセトアミド：９１− （シアノメトキシイミノ）ベンズアセトニトリル：１０．４’−（クロロ−２，２，２−トリプルγロアセトフニノンー〇−１，３ −ジオキソラン−２−ｙ１　メチルオキシム。１１．２．２−ジクロロ−１−（３，４−ジにドロー３−メチル−２Ｈ−１，４ −ペンズオキザジン−４−ｙ１）ニタノン：１２．３−ジクロロアセチル−２，２−ジメチルオキ丁シリジン：１３．４−メトキシ−３，３−ジメチルベンゾフニノン１４．１−シクロへモジルー４，４−ジメチル−２−（ＬＨ−１，２，４−トリアゾール−１−ｙｌ）ｐａｎｔゾリン−２−ｙ　ｌ　１ｄ＝ｎ＝）アセトアミド。１６、Ｏ，Ｏ−’、；ニチルーＯ−フェニルホスホロチτニート：１７．２．２−スビ＝シタ＝ヘシシルーＮ−ジク：：アセチルオモ、プゾリジン：１日、Ｎ−ベンジル−Ｎ−二チルージクロロアセトアミド；１９．３−クロロアセチル−４１，４−シクロヘモザノースビロ−２，２−ジメチル−１，３丁キザゾリジン：２０、スピロγキサゾリジンアセトアミド。グルタチ万ンーＳ−トランスフニラーゼ（ＧＳＴ）は、スルフヒドリル基経白のグルタチオンの共役を大きい範囲の疏水性の２を子性の化合物へ触媒的に促進する酵素族である。云役は、これらの化合物の、及び、ユニ、及び、は乳動物における！！４毒ｆ′？用、組織からの除去に帰着下る。ＧＳＴ酵紫は、トウモロコシ、小麦、モロコシ、及び、エントウを含む作＠Ｊ植物の範囲において確認された。ＧＳＴは、１から黄化したトウモロコシにおける全体の可溶性のタンパク質の２％まで百本よりなる。ＧＳＴの主要なアイソフオームは、トウモロコシ組織においてキュっている。ＧＳＴ　Ｉは、組立て体的に発現さｎ、及び、発芽前の除Ｉ剤アラクロル、及び、アトラジンと共にグルタチオンそ活用させることが可詣である。化学セーフナー（例えばＮ、Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセトアミド）に；るトウモロコシ組織の処置は、発芽前の除Ｉ剤の解毒作用に参加するＧＳＴ　Ｉの活動を上げる。コーン琺−Ｊ−−−一７１９゜牙いトウモロコシ百本の処置のために、種子は、湿っぽいろ紙上で発生させらｎた。発芽、及び、成長（１週間まで）の後でセーフナーＮ、Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセトアミド（以下に参照されるＲ２５として）は、集中（０，００３〜３０　ｐｐｍ）の１１Ｑ舌、及び、成長させられた百本を与えるために、ろ紙における不に加えられた根、及び、発射組織の収攬の前の更なる２３〜４４時間の。図３は、示されたように、処置後の２３、及び、４４Ｆ４間をもたらされたルート、及び、発射における全体のＧＳＴ后動のための結果を示し、及び、図４に、イソ酵素ＧＳＴ　工、及び、ＧＳＴ　ＩＩの分離を示す。５の８００　μｇの溶液（＝、直接、生育中の房の下方で節に注射された。摂取はその後４８〜７２時間続いた。図５はＧＳＴ　Ｉ活動のみが未処理の朽胆織に存在し、及び、示されたように、図６は処置後のＧＳＴ　ＩＩ活動のクツ激を示すことを示す。代りに、Ｒ２０の１００　ｐｐｍ溶液は、生″１ＩＩ９の房の下方で１［接、さらさｎたステムに付けられたガラスリザバーから供給さｎた。図７は、結果がステムリザバー技術を使っているのを示す。さらに、Ｒ２５は、印加された０［接、さらされた竺貰特表千４−５０４５００　（９）中の房のＬＯＯｐｐｒｒｔスプレーとして。図８は、スプレーにｉるアブ′；７ −シ１ンによるだ果を示す。双方のＧＳＴタンパク質は、約５０　ｋｄのネ１′ティｉ　ブの分子量を持つ、ようには乳動物においてトウモロコシＧＳＴは、二量＠系のである：ＧＳＴ　Ｉは、２９ｋｄの明らかに同じザブユニットを持つ一方ＧＳＴ　ｒ工は、ＧＳＴ　Ｉにおいて発見さｎたそれと同様の２９に−ｄザブニニソトのへテロダイマー、及び、小１！２７ｋ　ｄであるそれが組立て体的に発現さｎる百木桟を除いてセーフア−で処理された組織にほんの存在するザブユニットしかし、セーフナー処置によってまだ引き起こされることができる。以前にｃＤＮＡ、及び、ＧＳＴ　Ｉの２９　ｋｄサブユニットと一致する遺伝子は、クローニングされ、及び、塩基配列決定さられな。更に３分の１の２６　ｋ（ｆサブユニットと一致するｃＤＮＡ以前にトウモロコシ苗木（ＧＳＴ　Ｉ　Ｉ　Ｉ）におけるＧＳＴ活動のマイナーな成分は、クローニングされた、及び、塩ｉＩｉ配列決定された。Ｌ１Ｌ＃紫活動は、ザブストレートとしての１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を使う３４０　ｎ　ｍｌ　Ｍ　εＤ　Ｔ　Ａ、Ｏ，ＯＯｌ、Ｍ　ＣＤＮＢ、及び、０゜００２５Ｍグルタチグルタチオンれた。ｉ４中や　ミ７　研　惰　Ｉ経モ：；、０．０５二、＝　τ＝ｉｓ、ニー：Ｃ！、ペーハー７．８において均買にさｉｔ：ｏ、００１Ｍ　ＥＤＴＡ：０９００１Ｍ　ＤＴＴ：及び４°Ｃの乳棒、及び、モルタルにおける７、５％ポリビニルピロリドン及び未加工の抽出を獲得するために、３０，０００ｇで遠心分離搬にか）すもれる。未１０工の抽出からのＧＳＴアイソフｒ−ムの分離は、次のとおりに達成されな：未加工の抽出は、ＤＥＡＥセファロースコラムへ印加され、及び、０．ＯＩＭＴｒ　ｉ　ｓ、　ＨＣ１、ペーハー７．８、○、００１　Ｍ　Ｅ　Ｄ　ＴＡ、　Ｄ、Ｕ、０．００１Ｍ　ＤＴＴで洗ｅれた。　捕捉ｇれなＧＳＴは、０．３Ｍカリウム塩化物によって溶離させられた。ＧＳＴ活動そ含む留分は、結合された、及び、脱塩された（ＦＤＩＯゲルろ過コラムを使っている）。ＧＳＴ　Ｉ、及び、ＧＳＴ　ＩＩＩＩソフオームの分離（＝、嵐核ニー〇コラム上のＦＰＬＣｌ及び、ゼロによって０４，１カリウム塩化物濃縮勾配に達成された。ＧＳＴ　Ｉ、及び、ＧＳＴ　ＩＩの純粋な試料：；、ＦＰＬＣからペーハー７，３で０．０５Ｍリン酸塩緩衝液によって平衡させられるグルタチオン−８−セファロース親、和カコラムまでのＧＳＴ　Ｉ、及び、ＧＳＴ　１工の脱塩された留分を印加することによって獲得さまた。繕衝液による洗うことの後、捕捉されたＧ　Ｓ　Ｔ　ｔ：、０００５Ｍグルタチオンによってに溶離された。ＧＳＴ　Ｉ、またば、ＧＳＴ　ＩＩのＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　ＧＥ　（Ｌ　７− 　５％、３０　Ｃ１−Ｔ４アクリルアミド゛ビスアクリルアミド）は、Ｌａｅｒｒｘｍｌｉ緩衝液を含むメルカプトエタノールにおいて試料のＥ成させるアミコンセントリコン１ｏマイクロコンセントレージ直ン（可り）を使う、及び、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅで汚す純粋なＧＳＴ試料を濃縮することによって達成された。１１Ｌ１１丸Ｌウサギの免疫化を可能にするのに十分なタンパク質り＝、多数の個別の寅験から上で示されたように、分離された分離した酵素ザブユニットを共同出資することによって獲得される。２７　ｋＤ　ＧＳＴ　１１ポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲルスライスから電気溶離によるｆＡヨな等質性まで続いて純化される。坑血清は、２７ｋｄポリペプチドに対して準備をされる。ウサギの免疫化（；、主にｐｌａｙｅｒ、Ｑび、Ｗａｌｋｅｒ（１９７８年〕の方法に従って芙行される。Ｎ−π、夕ＧＳＴ　ＩＩ、または、部分豹なタンパク質分解狗開生成物の兜全な２７　ｋ（ｉザブユニットのアミン大端配列は、ＨＰＬＣによる順次的なＥｃＬｍａｎ減成、及び、次のアミノ酸分析にＪ）で決定さｆｉ７″：５二３冒Ｌ」− 経時！！験：＝、セーファー処置後のＧＳＴの発現を調デするなめに、英行された。Ｒ２５の３０ｐｐｒｒ＋、溶液は、’Ａ　”Ｉ　８　Ｚ’したづ−フナー処置に絖く嘩・テな坤賀賀渭後の３日の言い百木根、及び、組織へ印加された。試料は、上で示された酵素分析を便うＧＳＴ活動を試験された。二の寅験の結果は、図９図式的に呈示されている。Ｎ−−１全一時間経過英検は、セーフナーによる処置後の４８時間でＧＳＴ発現のピークを明らかにしな、従って、２ＣＤ　Ｎ　Ａライブラリは、セーフチー処置後の２４、及び、４８＃間で組織から抽出されたＲＮＡかも組、み立てられた。誘導手続きが成功したことを保証するために、２４時間の誘導された組織の１グラム試料は、ＧＳＴ　ＩＩのためにとられた、及び、分析された。この英検は、ＧＳＴ　ＩＩが全体のＧＳＴ活動の４５．５％を占めたので、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリを組み立てるために使われる組織が寅に１尾よく引き起こされたことを明らかにした。ダブルストランドＣＤＮＡは、ＲＮａｓ＝Ｈ，及び、大腸Ｍ　ＤＮＡ　ポリメラーゼを採用する方法シニよってオリゴ（ｉＴ−細胞ロース−精製ＲＮＡから準備をされた私シングルを一１！！憔さぜたｃＤＮＡ（Ｇｕｂ　ｌ　ｅ　ｒ、　Ｄ。び、Ｈｏｆｆｍａｒ＋、１９８３）の事前ｆｌｌ製なしの第２のストランドの合成において。・血清に＋−Ｎ　−イ　−警　：　Ｍ　７　＋％＋、０ヘニ１トウモロコシ房ＧＳＴ酵素をコード化するｃ　Ｄ　ＮＡりローンをａ認するために：ｌＩ４１されたｃ　ＤＮ　Ａライブラリからのバクテリアファージ＝−トフモ：＝シＧ　Ｓ　Ｔ　＃素皿清によりてスクリーニングされる。ｉ！にも強い信号を発生するクローンは、再び一スクリーニングされる。オ「イ　ロー　ｔ−Ｔまた　Ｎ−−１’″ｒ上で決定されたアミノ酸配列に基づいた合成のオリゴヌクレオチドの混合物は、ホスホルアミダイトの化学合成によって−ａｍをされた。オリゴヌクレオチドの５゛端部は、ラベル付された（文献において示されたように、ポリ−ヌクレオチドキナーゼを使っている）。約ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含む４０，０００フアージは、プレート上で増幅され、及び、ニトロ細胞ロースへ転送する。フィルタは、温度のオリゴヌクレオチド調査に交配させられたのから零下２〜５°Ｃ混合における最も低い融点プローブを対象としている融解温度、ちょうど、ように、ただ更に低い密度で上で示される、雑種を生んでいるセリ額が２回以上にわけて選択された、及び、再び−スクリーニングされた。ｐ　ｒ−Ｎ・”　？−嵐ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　、または、ＤＮＡ塩基配列は、部分的なタンパク賀分解剪開かも獲得されたアミノ酸配列に基づいたオリ５ゴプライマーを使う示されたライブラリから分ｍ＝ｎる〜あるいはゲノミックＤＮＡの場合り；以前に決定されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　！ｉｉ！列に基づいたプライマー。Ｎ・　ローン　、′Ｃ゛−゛　ゴ茎ｒη１丘」Ｌ配列に分離し７：０フＮ−；：、漂１の利月可詣なま術の１かそれ以上が特色でめらｎる、及び、支配される。ミ　、　−１１ λＥＭＢＬ３にクローニングされる全体のトウモロコシＤＮＡのフラグメントの現存するゲノミツクラ□′ブラリは、上で示されたように、分離されたＣＤＮＡクローンに雑種を生むクローンを分離するために使われる。あるいは、上で示さｎたＰＣＲ方法は、遺伝子フラグメントそ選択的に増幅する、及び、クローニング下るために使われてもよい。その時ＧＳＴＩＩ遺伍子、及び、それらのプロモーター配列は、分離され得る、及び、特徴付けられ得る（′ ４立した技術を使っている）、ＧＳＴＩＩプロモーター配列がトランスジニニツク植物でそれらをＧＵＳ、及び、ＣＡＴのよつなマーカ遺伝子、及び、試験を行うことにその時溶かすことによってセーフナーー引き起こされた遺伝子活動を媒介するということが論証されることができる。Ｉ　工、’　レー　′　で　オベレー　配このモジニールは、植物遺伝子発現を調整する。更に特に、モジニールを；、バクテリアの、あるいは、！！：こ低い真核起源のリプレッサ分子？用いて植物遺伝子発現？調整する１従来、作物植物種の改善）；、遺伝の交配による所望の特性の導入を包含下る。しかしながら、これらの育種技術が高度に成功するが、そｎらは、最近獲得された特性の発現ｆ−制御することの手段そ供給しない。技術における最近の前、遭は、今確認される、及び、分離されるために、植物組立て体、及び、作物の生産性、及び、＆買を決定することの１因となると遺伝子を認めている。改善の分野における主要な目的は、従って遺伝学上複雑な発達上のプロセスを操作することができることである作物パフォーマンスを改夷するために、この目的への大賀は、特異的の植物遺伝子の発現が思うままに調整さｎることを許す戦略の決定である。情況に基づいた特性の発現を制御する能力は、多くの重要なアプリケージ１ンを持つ昆虫耐性の遺伝子、開花の植物の高さ、及び、タイミングの決定、及び、植物徳性のコントロールのコントロールのような。その上、二つままにで、あるいは、下がって遺伝子そＨえるための能力は、植物生理学、または、環境を妨害せずにｘ′Ｘ的に植物遣伍学の研宛における貴重なツールであろう。現在トウモロコシのような雑種の作物のための種子の生ｌは、親植物の手、または、機械的除雄の困難な、及び、高価なプロセスを包含する自家愛吟を妨げるためにそのような除雄（しかしながら）は、多種多様な作物種さｎることができる。ＣＭ　Ｓ　＋：、花粉形１改の抑ｆｆＪに帰着する雄配偶子形成を妨害する、しかし、雌の稔世に通常影響しない、従って、「雄性不稔な」植物は、種子、他花受頂にただ起＝するその−うな橿÷そづ−、・トする二とができる。二ｎらの遺伝子の発現を８１Ｊ御する拒刀は、雄配偶子形成が高価な除雄プロセスの必要性なしの雑種の作物種子の生産において抑制されることを許すであろう−１まだ従来の育種プログラムによって雄の遺伝の改讐Ｓ−親であると認める１核生物及び真核生物における遺伝子発現のコントロールは、特異的のＤＮＡ塩基配列を持つ規定のタンパク質の相工作用に主として依存する。これらの１１作用の性質に応じて、同族語のプロモーターからの転写；；、抑えらｎてもよい、あるいは、活動的にされてもよい、冥際、いくらかのケースにおいて、同じタンパク質は、行われた接触の性質に従って転写を減少してもよい、あるいは、高めてもよい、！！に、そｎらのターゲット配列を結合するためのいくらかの規定のタンパク質の能力）；、配位子の結合によって、あるいは、特異的のタンパク質分解勇開によって調節される。そのようなメカニズムに、植物遺伝子規則のためのａｌｉ！中でも鰐導可能住そ含むために、開発さｎてもよい。最も夷く特°微行けられた規定の系は、Ｄ　Ｎ　Ａ−弓合タンバ、り賀（リプレッサ）の間の相工作用、及び、ターゲットＤ　Ｎ　Ａ塩基配列（７ベレーター）が大きい詳細において理解さスるバクテリアのそれらである。比ｆ２最も１い理解された系の共通のいくらかのファクタ）；、バクテリオファージλ、及び、４３４のリプレッサ、及び、時代タンパク質、ＬａＣＺリブレフ７、ユび、コタボライト遺伝子−后動的にされたタンパクｆ　（ＣＡＰ）を含むことを明らかにする。これらの規定のタンパク質は、結合するダイアト対称の高い＠度ヲ示す短いオペレータへの二量体、または、テトラマーとして。大部分のケースにおいてＤＮＡ−認識の！因となるｌ域単量体のオリゴマー化に関係するそれから分離している保存されたへりクスーターンーへりクス組立て体を含む。各単量体におけるこの組立て体の中の特異的のらせん認識らせんＤＮＡの主要な溝と提携させられる、そうすれば、特異的の接触がこの認識らせんのアミノ酸の間で形成され、及び、近接のＤ’ＮＡのベースが′ａ能的なリプレッサ／オペレータ錯体が形成される。そのような相工作用は、高度に特異的であり、及び、高い一親和力＃体は、非常に速い動力学によって形成される。遺伝子発現が真核生物において調整されるメカニズムの＠豫は、はるかにあまり詳述されるとはかぎらない。イースト、及び、噌乳顕の細胞において推定上の規定のタンパク質のための多数の結合部位は、プロモーター配列においてｑａ記された及びいくらかのケースにおいてタンノ炙り質責任を果たし得るまた分離された。しがしながら２．３の場合はおいてのみ１、聞いていたタンパク貫−ＤＮＡ相工作用、及び、転写がそうであるものによるメ刀二ズムが調整した分子の詳細である。植物において、遺伝子発現の規則）；、初歩のレベルのみで理解５ニーる。いくらかの規定の元素：よ、ブ＝モーター配列、及び、予備のレベルでｉｆされたいくらかの規定のタンパク質において確認された。しかしながらそのようなタンパク質Ｑ；、今なお分離されなげればならないそして包含された解明されたメカニズムの詳細。真核の規定の系（＝、更に大ｇいさまざまな組立て体、及び、複雑さの更に高い８崖を示すように、已わｎるそれらのｙＫ核相対物より。例えば、真核プロモーターからの転写のコントロールは、規定のＤ　Ｎ　Ａ　′＋持つ多くのタンパクｆｆ（おそらく数１０の７−ダで　）の相工ｆＡ″月を包含すると考えられる。更に、少なくとも３つの異なるタンパク質組立て体（ヘリクスーターンーへりクス、亜鉛−指、及び、ロイシンジッパ−）は、様々な真核の規定のファクタによってＤＮＡ−結合することの特異性に讐き込よれた。ＤＮ　Ａ−ＩＮ合タンパク質膚改するクラスのタンパク質、特性を示すそれらの倉百力結合下る遺伝子のＤＮ、八にどちらの再圧縮のでも効果を与えるためにあるい（＝、遺伝そご活動的にするぞｎらが結合する。ほかの点で）＝そのようなりＮＡ−Ｍ合タンパク賀が嵐に「リプレッサ」とこのモジニー　）しく＝、下るとバクテリアのＥ　Ｑのりブレ１ｆ遺伍子よつなる　組換え体櫨物遺伍子、及び、プロモーターである作動する植物においてリプレッザ遣１：子の発現そ動二１丁なめに、τベレータ配列との相＝；乍、用が可能であるリプレ７ザタンパク質？コード化する上記の遣云子結合された選択されたターゲット植物遺伝子ターゲットのりブレッサタンパク賀発現の発現に関して植物遺伝子が抑制されるように。上記のＤＮＡを含むｐ３５Ｓ　１　ａｃ　Ｉという名称のベクターが、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　％ａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、Ａｂｓｒｄｅｅｎ、Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍに１９８９年１２月１２日付寄託された寄託譬号ＮＣＩＢ　４００９２の大５！百株ＴＯ−２のホストに組み込んで寄託された適当な植物Ｅ換ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔ＝ｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓよつなる（前述のプラスミドに避難させている）。このモジニールの特異的の実施例において、バクテリアの１ａｃＩ丁ベレータ系は、遺伝子発現を調整する；めに、利用さｎる。ｌａｃ抑制は、イソプロビルチ万ガラクトシド（ＩＰＴＯ）、及び、他の砂糖アナログにばつで、軽減されることができる。次に、このモジニールに関する特定の例をいくつり・示九、ｇ　−−’　１　レー°′ ベクター：＝、経み二てらエニ表明する１１（工遺１′テそから〜か〜のいずれかベクターｐＪＲ１で、あるいは、緑の組織−特異的のプロモーター、トウモロコシＣＡ　Ｂプロモーターから発見された’ｍｅ要素のＣ，ａＭＶ　３５Ｓプロモーター、しかしながらバクテリアのリブレ、す植物の他の部分において発現されたあらゆる植物プロモーターから絞り出されることができる（このように植物のあらゆる特異的の一部における植物遺伝子発現のコントロールを許している）。、　へ　１　レー゛°′　げ　修正−二に一一！ノ。ｌａｃリプレッザ（ｌａｃＩａ）は、プラスミドｐＭＪＲ１５６に別層可能である。植物でこの遺伝子を発現するために、翻訳開始コドン（ＧＴＧ）ｌ：、Ａ　Ｔ　Ｇに変えられなければならなかった。更に、植物発現ベクターへのこの遺伝子のクローニングのために適当な制限酵素鍔間部位を造ることは、適切でっな、１ａｃｒの３′端部で、植物発現ベクターへの挿入のために遍轟な制限場所（ＨｉｎｄＩＩＩ、及び、Ｐｓ　ｔ　Ｉ）がある。５′端部で週嚢な制限部位を造るために、次の笑殺は、行われなければならなかった。（ａ）　Ｃｆ　ｒ　ｌ　０ｆｌＪＡ％位は、位置１３４に位置下る、ｐＭＪＲは、Ｃｆｒ　１０、及び、合成のＤＮＡフラグメントによって切断された１ａｃｌ遺伍子のＮ−末端を再ｌ１１．５する変更さｈ７に：翻訳−的なスタート・コドンＡＴＧ効ｚ５″、：翻訳関Ｓのたのの植物＝ンでン７ス配列、及び、ＢａｍＨＩ制晟部位は、ｐＪＲｌに挿入さｎた。この合成のフラグメントの配列は、以下の通りであった：１ｕｉＬ工二１ム立ＬＧＡＴＣＣ久ＡＣＡＡＴＧＧＣＴ　ＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣＧＡＴＧＴＣＧＣＡＧＡＧＴＡＴＧ　Ｇ　ＴＴＧＴＴＡＣＣＧＡ　ＴＴＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＴＣＡＴ入ＧＧＣＣＣｆｒ　１０ｐＪＲｌは、Ｂ　ａｍＨＩ　、及び、ｐＳｔｘと共に切断された。上で示された合成のフラグメント、及び、ｌａｃ工遺伝子を含むＰｓｌＩフラグメントへのＣｆｒｌＯは、原準状態の下でｃｕｔなベクターｐＪＲ１と共に結紮された。Ｍ紮ミックスは、大ＩＳＩ百　ＴＧ−２に転換された。ｋｌ換え体は、カナマイシン含有プレート上で選択された。それらは、Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列分析が特色でめった。組立て体は、ｐ３５ｓ１ａｃＩと称された。（ｂ）ＰＣＲ（ポリメラーゼチニーン度応）Ｓａｉｋｉｅｔ、ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３９によって示されたように４８７−４９１）は、保存がきいている間には、ｐ　）Ｉ　Ｊ　ＲＬ　５６に交配さぜられな。このγリボヌクレオチドの配列（＝下記の通りである。（１）遺伝子の“５′端部力・らＧＡＧＡＧＴＣＨＴＴＣへＧＧＧＴ　ＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧＴ八ＡＣＧＴＴＡＴＡＣＧ（１１）遺伝への３゛ｔ４部からＣＧＴＴＧＴ入ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＰＣＲの、度応は１．Ｊ定されたコンディジ盟ンの下で冥行された。製品は、ＢａｍＨＩ（最近導入された部位で）、及び、ｐｓｔｒと共に切断された。その結果生じるフラグメントは、ＢａｍＨＩ、及び、Ｐｓｔｌと共にカットされたｐＪＲｌにクローニングされた。組換え体は、原産のプロトコルを使う異種混合、及び、制限分析によって確認された。その結果生じるクローンの１つば、ＤＮＡ塩基配列分析が特色であった。方法（ａ）、及び、（ｂ）の双方共、同じ組立て伽を与エタ（ｐ　３５　Ｓ　ｌ　ａ　ｃ　Ｉ　ト称すｎ　ｏ　）　ｓ　Ｑ　Ｉ　Ｏ＋＝、ベクターｐ３５ｓｌａｃＩの組立て体を示す。９　′　二ロココ　口ニー　−〉　〜ｒＶ　−ロニー　− 植物におけるＬａｃリプレッサ／γベレータ系の一般的なユーティリティを示すために、我々）；、植物で誘導さｎ、る、及び、組織−特異的の１ａｃＩ発現を許す発現ベクターを組み立てな、この仕事のたのに我々シ；、義務仝）な光誘導トウモロコシ葉緑素ａ／ｂをコード化する遺伝子のプロモーターを便っなタンパク質（Ｃ，八Ｂ）３このベクターの組立て体は、ｐ３５ｓｌａｃｒにδげるＣ　ａ　Ｍ入°プ：モーターを３ウモ：＝シ０人３ブ：モーターと２１Ａすることによって達成されたこれと共に、どちらのＤ　Ｎ　Ａ塩基配列は、図１２に与えらｎるベクターｐＣＡＢ４８．Ｌで発見される。ＣａＭＶプロモーターは、ｐ３５Ｓ　１　ａｃ　１の制限によって原産状態を使うヨｃｏＲＩ、及び、ＢａｒｒｔＨＩと共に除去された。ＣＡＢプロモーターは、５ａｕ３Ａのために部分的な制限コンディションを使うＸｂａ　ｌ及び、Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａによる制限によってｐＣＡＢ４８．１から分離された。このプロモーターフラグメントは、次いでプロモーターレヌｐ３５Ｓ　１　ａＣＩに挿入さｎた。このベクター、示されなｐＣＡＢｌａｃＩは、制限マツピング、及び、Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列分析が特色であった。、ＪＷ！上で示されたベクターからの発現モジニールは、ＢＩＮ１９へ、その後、ｓ燻プロトコルに続いて薄片ディスク転換を月いて煙Ｉへ移された。プラスミドは、トリバレンタル掛シナ合わせを用いてＡ　ｇ　ｒ　Ｏｂ　ａ　Ｃｉ　ｅ　ｒ　１　ｕｍへ転送さｎ７′：。ＡｇｒＯｂＡＣｔｅｒ　ｉａはｆ！Ｉｇさｎ、薄片ディスク転換爽秋で使用された。ＢＡＢ−１ａｃ工組立て体を含むＣａＭＶ−１ａｃＩ発現モジニール、及び、３８の植物を含ｒｊ３７の植物は、ｔａｃｒの相対的な発現の−のに里生させらまた、及び、分析ぎｎた・１４クシＲ，ｆ−トーンＳ゛−二一−ケｍＥ　ａ　Ｃａ遣：ミ子、）発現：；、推とタンパク質つ＝世つ分析を用いてモニターさｎな。抽出は、虚傭をされたポリアクリルアミドゲル上で回復され、及び、百年の分析に備えてｊ傭されたタンパク質５分析Ｇ；、Ｅ換された植物のＬａｃ工遺伍子組立て体の発現を確認しな、１ａｃＩ遺伝子発現のＡなるレベルは、異なる独立した形賀Ｉ５：換によって転換された植物のたこの結果は、次のＷｌｒＶにおいて与えられる。 ’：）、　−−ト：ｆ；−へ　ａ２″ベレー　１″）〉　と９−Ｉ　Ａ″′二ニー々− とうもろこしＣＡＢプロモーターは、プラスミドｐＣＡ８４８．１で発見さｎることができ、及び、我々（＝、このプロモーターが一時的な煙！発現システムにおける、及び、安定的にの転換された植物の外来の遺伝子の発現を動か丁ことができるということが分かっな、この遺伝子従って１ａｃＩを経てコントロールを示すために、優ｎたターゲットである発現の高いレベルが試験管同でそして；た生体円で獲得されることができるので、第二に他の系（小麦、エントウ、及び、 ζ軍）かものＣＡ　Ｂプロモーター詳細に広く分析された及び文献において報告されている。公表された情報は、オペレータ挿入のための適当な部位の選択を促進する。第三にｐｃＡＢ４８．１は、とうもろこしプロモーターである及びこの系の使用である重要な本発明のａｐｐ　Ｌ　１ｃａｂ、ｉ　Ｉ　ｉ　ｔ’Ｊをとうもろこしのような嵐子葉植物に示すために小麦、大麦、及び、ト１ワモロコシ。ド　３＋ｌ：ｌニア　Ｓ　口ニー　−へ　７ベ二＝＝ムニ」Ｌ【比較的わずかな研究しか、ＣＡＢプロモーターの重要なシス作用形の元素の特徴ｆＴ（アに関しては報告ぎ１ていない、従って、Ｃ１八Ｂプロモーターに対するいくらつ・の植物遺伝子のコンセンサスの土沢の規定の元素（Ｕ’ＦＩ三５）ｔ −比較するコンビニータザーチ（；、寅行さｆｑ−た、予想さｎたように、多数の推定上のＵＲＥ　ｓは、ＣＡ　Ｂプロモーターの双方のストランドに３いて発見された。万ペレーダ挿入のための多数の潜在的な部位は、選択された。１、ＣＡＡ’ｌ’箱の５゛　：２、ＣＡＡＴとＴ　Ａ　Ｔ　Ａボックスの間：。３、ＴＡＴＡボックスの回つ；４．７ＡＴＡボツクスと転写開始点の間；５、転写開始点翻訳開始点との間。２つの方法は、ｌａｃオペレータをとうもろこしＣＡＢプロモーターに挿入するために使われた：（１）自然に発生している１１限部位への挿入選択された部位でオペレータを紹介するなめにＰＣＲを使う（２）これらの方法は、１ａｃＩオペレータを選択された部位に挿入するなめに使われた。二１工二Ｌプロモーター配列の分析は、この領域があまり多くの唯一の制限部位を含まないことを示す。しかしながら２つの部位様々なベクターへのプロモーター領域を藺嵐にリクローニングすることによって利用回路にされることがで、きる。）　−−。　−１４− 制ｆｌｓＪｙｇＰ　ｖ　ｕ　Ｉ　Ｉは、ＣＡ　Ｂ遺伝子を含ｔ）２．Ｑ。ｋｂ　ＰｓｔＩ破片の中でシングルの部位を認識する。部位は、Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　ｙｃ紫、及び、ＣＡ　Ｂプロモーターのξ写開始Ａ（ＴＳＰ）の間にある。しかしながら、ベクターｐＣＡＢ４Ｂ、１は、多数のＰｖｕ１１部位（ｐＵＣ１９以円に）そ含０′。従って（ｐｖｕＩＩ部位を欠＜）、２．８．　ｋｂ　ＰｓｔＩｉ片は、原産のクローニングベクターｐＡ’ｒ１５．３にクローニングされたｐＣＡＢＰｌを与えるために１ベレ一タ配列は、ｐｃＡＢＰ１以内に唯一のＰｖｕ　Ｉ工部位に挿入された。配列の後で、どちらのクローンが１つの、及び、縦並びのオペレータ挿入を含むかを決定することは、可會巨であった・この仕事のために必要とされた合成の相称的なｌａｃ万ベ万一レータ下で示され、及び、突然変異体オペレータに頭似している１８塩基ベア回文すなわちである８倍更に強＜　ｌａｃリプレッサーを結合する荒野−タイプの第５°−ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＴＴ−３’！ｆ：Ｉｌ　ｌ−ｒ”　−・４使わｎる方法は、次のとおりであった（ｉ）ｐＣＡＢ４８．１は、ＨｉｎｄＩＩＩと共に消化されたプロモーター領域の外で、及び、ｐＵｃ１８、及び、Ｂｇｌ！１の中で切る下流で切る唯一のＮｃｏＩｉ位の、及び、コーディング領域の甲でこれば、上流へＣＡ　Ａ　Ｔ半分の唯一の５ｐｈｚ部位によつｕ（ａｍノコでテへｌ＋＋（ｉ　１）ｐＵｃｌＢは、ＨｉｎｄＩＩＩ、及び、ＢａｍＨＩと共に消化され、及び、上の（１）からのプロモーター破片は、ｐｃＡＢＰ２を与丸るために、挿入された、ＢａｍＨＩによるｐＵｃｔｓの消化は、ｐｏｌｙｌｉｎｋｅ　ｒからシングルのＳｐｈ工場所を除去する。従って、ｐｃＡＢＰ２は、オペレータが挿入されることができる唯一の５ｐｈＩ部位を含ｒｊ。この手続きに使われるオペレータは、配列を持った５’−ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴ　Ｇ−３’３’　−ＧＴＡＣＴＡ、ＡＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＴＧＴＴＡ−５’プロモーター活動が影響されそうであるが、オペレータ配列が推定上の規定の元素にに接全く挿入されないことは、覚書にとって重要である配列が他の場所へ挿入され上で示されたように、オペレータ配列は、２つの別層可能な制限場所に挿入さｎることができる。他の部位への挿入は、他の方法論を必要とする。Ｃコドン　１　。こｎは、もたらされることができる（ＰＣＲを使っている）。唯一のＰｖｕ　Ｉ部位がＴＳＰ領域の近くにあるのでそれは、使われるサブ−無性生殖目的のための基準点としてＰＣＲ反応のための巴発厘料は、ｐ　ＣＡＢ　Ｐ　Ｌ、す１．：９ちでるるｐＡＴ　Ｌ５３　Ｃ＝先Ｂとで示さエフ：ように、組み立てられたプロモーターベクター、ｐｖｕＩＩ部位と丁−バーラップする、及び、度更を含まないオリゴヌクレオチドは、１端部から反応の下處傭テするために使われたオｌイ　レオ−゛− ＬＬＬ二二５’　−ＧＧ　ＣＡＧＣＴＧ　ＣＴＧＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＧＡＣ−３゜第２のオリゴヌクレオチドは、ＮｃｏＩｆｌＳ位と１−バーラップし、及び、下で示されたオペレータ塩基配列を含む。１　し　′　゛　−９ Σ」Ｌ立」二　主乙」ムニｎ５’−ＧＡＴＡＧ　ＣＣＡＴＧＧ　ＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＧＴｆＪ　ＡＴＴＧＴＧＡＧＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴ−ＡＴＣＡＧＡＴＣＧＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧＣ−３’Ａ　Ｉイ　レオ″に− 二二り立」−オニ二二：二り」− ５°−ＧＡＴＡＧ　ＣＣＡＴＧＧ　ＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＧ　ＡＴＴＧＴＧＡＧＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＦ’ＣＲ反応に続いて、最近合ａ　＠　ｉたＤ　Ｎ　Ａ　ｉ：、ｐ　ｙｕＩＩ、及び、ＮｃｏＩと共に割られる。破片は、その時類似して消化ざｎたｐｃＡＢｐｌまで転送する、及び、塩基配列決定さらｎる。 −Ｆ賀のり：−ニングステップをｐ　Ｃ−１−Ｂ　Ｐ　１に除去する僅かに具なるアプローチは、また使ねｎでもよい。これは、オリゴヌクレオチドを使うことを必要とする唯一のＸｂａｌが以前に概説されたオペレータヌクレオチドと共にＣＡＢプロモーターに置くγ−バラツブ、ＸｂａＩ／ＮｃｏｒによるＰＣＲＤＮ−Ａの消化は、ｐＣＧｌ、及び、ｐＣＧ２にｒＩＬ接クローニングされることができる破片に帰着する。しかしながら、ＰＣＲ反応からＮｃｏＩ破片までのＸｂａｒは、はるかに大きい前の戦略から獲得されなＮｃｏＩ破片へのＰｖｕｒＩより。 −ベ　−−− これは、もたらされる（ＰＣＲを使っている）。レ　パ− Ｘ」Ｌｌニー５’−ＣＣＣＡＡＡＣＡＧ　ＴＣＴＡＧＡ　ＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣ−３“レオ− ゛−− ＬＬＬＬ二　ヱゴ」−二ｌ− ５’−ＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧ　ＣＡＧＣＴＧ　ＣＣＴＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴ−ＡＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡ　Ｔ　Ａ　Ｇ　ＣＡ　Ｃ−Ｇ　Ｔ　ＣＡ　Ｔ　Ｃ−３し°パ− 二二ＬＬ二　工ニ辷ン：二え」− ５°−ＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧ　ＣＡＧＣＴＧ　ＣＣＴＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＣＣＴＣ，ｔＣＡＡ二二Ｈ１，−二ＩＬ −ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴ　ＡＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＴＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＣ−３’ｐ　ＣＲに＝　ッて、つＮ、！−！：、Ｘｂａ工、及び、”）　■＋＝工と共に消化され、及び、類似して消化されたＥ）　ＣＡ　ＢＰｌにクローニングされる。クローンは、再び配列が特色であり、及び、あらゆる適切なりＮＡｓは、ｘｂａｒ、及び、Ｎｃｏ　Ｉと共に消化され、及び、皮、及び、ｐＣＧ２にクローニングされる。こｎらのベクターの基礎的な組立て体は、図１１に示される。１　ｖ　″−ロニー　− 我々は、プロモーター−的な３５５のベクターがａ’ｃｔ　１ｖａｔ　ｉｎｇな配列の挿入のための優れた受容器であるということが分かった。ｌａｃオペレータに、このベクター、Ｅ）　−Ａ　−３５３に挿入されることができ、及び、いったん、挿入されれば、３５Ｓエンハンサ−は、上流でクローニングされた５゛であるｌａｃオペレータの。べＰ・た畠−２−ムに一゛（゛　−・ト涜Ｔ子エ　コントロール植物ｐ３５１ａｃＩと共に組立て体的に転換された１ａｃｒを発現する原形質体から１傭をされてもよい上で示された方法を使っている、そして、それら）よ、１ａｃｒタンパク質の発現を試験されてもよい。ターゲット遺伝子組立て体は、その時の漂準の方法、及び、プロトコルを便う厘形ｉｉｔ体に導入されてもよい、ｌｉｉ：換されない植物コ・らのｙ！、綜買ｚ：；、貫厭することができるようにコントロール、さらにコントロールは、オペレータ挿入なしのＣＡ　Ｂプロモーターのコントロールの下でＧＵＳマーカ遺伍子を発現するＭ物からのｆＪ！に形質体によフて提供さｎてもよい。キ　；費　アニコ−・Ｉ　ＰＴＧは、ｌａｃリプレッサーによって抑制を克服するために使われることができる。このようにそこへ形成されるスイッチ−的な遺伝子系。 −−′：費　子　。ｌａｃリプレ７ザー／オペレータ相工作用は、植物でマーカ遺伝子発現を異なるレベルに下へ一調整することができる。これは、そこのそれにおける重要な効果が下りの一規則の異なる程度が必要とされてもよい状況であってもよいことである。＃９、−郭′−六　°　た　−−゛　ニ　−コン　ロール現れた上で示されたように１ａｃ−リプレッサーは１、駆動されたＣＡＢプロモーターを下へ一調整することができるということぶ形質体におけるＧＵＳ発現週巖なγべに一夕揮入組立て体は、上で示された方法によって理工植物へ転送する。！！生させられた植物は、上で示された植物（構成要素のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御されているｌａｃリプレッサーを発現下る）！−発現するｔａｃｒと井に横切らｎてもよい。植物は、また組み立てろ２１．てジ郵い光誘導とうもろこしＣ１ζ３ブ：モーターの制御さｎているｔａｃｒ遣モ子を発現する。これらの植物の１ａｃＩ遺伝子の発現は、その時光誘導である。これらの植物は、１ａｃｌオペレータ挿入管含むＣａＭＶプロモーターからのＧＵＳマー刀遺伍子を含ｔ　Ｍ　’２１によって横切られてもよい。重万ペレー　ロエー　−へ　橿− 同様の技術を用いて、１人のオペレータの挿入のなめに示さｎたように、複合的オペレータば、ターゲットプロモーターに挿入されることができる。こｎは、１つの＃５所にオペレータの複合的なコピーの挿入によるものであるかもしれない或いはプロモーターの破片の結合１ベレータは、プロモーターにおける異なる位置で挿入されるこの作物ができること複合的τベレータがプロモーターにδける複合的な場所に位置するベクター。３−と１菖匡］Ｌ士− この実施例において遣ｅ−Ｆ発現を調整する方εに、位置することよりなる。以内に挿入する遺伝子に疑似オペレータ配列、及び、供給下るアミノ酸配列を待つリプレッサーをコード化する突然変異僅の規定の遺伝子疑似万ベレータに結合下る。相＝にで乍、弔している：Ｊブレッ丁−１及び、７ベレータｉ伝−ｒ！−含な細１胞（＝、プレベアリングよりする　ゴミシこよって分離していてもよい、（１）組換え体プラスミド大腸ｙｉｌａｃオヘロン（１ａｃＺ、１ａｃＹ、及び、ｌａｃ、入選１′ｒ、子そ含ｒ：）、及び（２）づブレッザータンパク質をコード化する遺伝子を含む上記のプラスミドをγルトー、；た）；、バラｍ：トロヘニルー１−チオ−β−ガラクトシダーゼの存在下でバクテリアのホスト、及び、培饗と同じに挿入する。細胞の成長宇へＪａｃ遣１ヨ子の発現は、前記のりブレッザー分子によって抑えも乙ない抑制されるのに反して細胞の成長中ヘリプレアサ／オペレータ結合発生するそのように抑制されない及び非−抑制された成長特性を展示するＢ胞を回復する。突然変異体リプレッサーは、使われてもよいが、蔽いは、外因性の潜在的な疑似オペレーターは、ｌａｃオペロンのオペレーター領域の中へ挿入されてもよい。外因性の潜在的な疑似オペレータは、なるべく植物起源である。匣利なバクテリアのホストに、大腸百である。このように、我々は、遺伝子が不活発にされることを可能にする遺伝子発現のりプレッザーを変更するための手段を持つ。疑似１ベレータは、オペレータの全体の染めらｎた対称そ維持するＤＮＡ塩基配列であるしかし異なる構成要素のベースを含Ｃもの。多くの他のもの田でもフランスの、：ＧＰＡＬ２遺伝子の既匂のＤＮＡ塩基配列、及び、プロモーター、及び、場乳類のＣ−ｍ　３／　Ｃ遺伝子のコンビエータ分析）＝、多数の可能な疑似オペレータを異なるバクテリアのリプレッサーに明らかにした。〔プラスミドｐ　Ｇ　Ａ　Ｌ　２は、ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａＬ　Ｃｏ旨ｅ　ＣＺ　Ｉ　Ｏｎ　Ｏｒ　：ｎ　Ｃｕ　５　Ｚ　ｒ　ｉ　Ｌｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎａ　Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ａ　ｂａｒｄ＝ｅｎ、英国に１９８８年１２月６日付寄託番号ＮＣＩＢ　４００８７として大腸菌株ＤＨ５ホストに組み込んで寄託されたｍｏｎｏｄｅａｒｕ、）＊コこのように、それは、可能性の高い°　ｐｓｅｕｄｏ−ｏｐｅｒａｔｏｒ’　配列が全ての遺伝子において発見されることができることである。概して疑似−オペレータは、遺伝子における適当な位置に存在するＤ　Ｎ　Ａ塩基配列である（植物遺伝子を含んでいる）リブレッザー結合が遺伝子発現の抑制に導くもので。プラスミドｐＡＤ１Ｂは、プダベスト粂約に基づご、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｒｔ　。ｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ。Ｕｒｓｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍに１９８９年１２月２１日付寄託された寄託番号ＮＣＩＢ　４００９６の大ＭＩＭ株ＤＨ３５αのホストに組み込んで寄託されたものでめある。プラスミド１）Ｐｓｉは、ブダペスト条約に基づき、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｒｘ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｉｍ１ｔｓｄ、Ａｂｅｒｄｅｓｒ＋、Ｕｎｉｊｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍに１９８９年１２月２１日付守託された寄託番号ＮＣＩＢ　４００９７の大腸菌株り三Ｓ５αの丁ス、−にｄｆ＞込んで寄託５３ものである、この手順は、タンパク質分子にまた適用できる遺伝子活動における４４加へのリードｐａｒｔ　ｉｃｕ　１ａｒｙ特異的の化学薬品に反応するリプレッザー／活性体タンパク質の選択。これらの化＃薬品のための結合トメ１′ンは、明確に特異的のタンパク質／　Ｄ　Ｎ　Ａ効果化学化合の生成を許すために選択され得る、及び、うまく操ってさせられ得る生物工学において有益である例えば外因性の化学誘導＃素のアプリケージ曹ンによる植物遺伝子の制御された規則を可能にする化学スイッチパッケージとして突然変異リプレッサー及び生体内でＸｔが持っ１ベレータに影響するＤＮＡ認識特異性をＥ更したリプレッサーが試験管内で設計されることができることを示された、手続き（その時）、その時疑似オペレータ配列の結合によって条件つきで致命的遺伝子のスイッチを切るために、珍しいリプレッザー突然度異体の能力に依存する立地に特異的なのリプレッサーは、認識することができない本発明の１寅施例は、示さｎる（説明として）（次の例に、おいて）（マツプが２つのシリーズのｐＰｓ、及び１．パッドと称されたプラスミドそ表しているのを示す添付図Ｉ、及び、変異体に関して）。我々は、リプレッザーファージ４３４に発明の選択システムそ′Ｆ４演するゆしかしながら、深刻としては、他のりプレッザーば、この選択系のために適応させられることができる。 ’ｙＸ我々は、広いＮ囲のリプレッサー−オペレータ系における突然変異体の選択のために使われることができる選択システムを設計しな。選択系は、−組のプラスミド、及び、適切な大腸菌ホストよりなる　と同様にプラスミド、及び、ホスト向きに改作された自殺サブストレート選択プロトコルその最終のフオームにおいて系は、’ｐｓｅｕｄｏ−Ｏｐｅｒａｔｏｒ’　の結合を経て条件つきで致命的遺伝子のスイッチを切るために、珍しいリプレッザー突然Ｅ異体の能力に依存する野生のタイプリプレッザーば、結合することができない下で示された選択系は、Ｂ胞の最終の人口において１記されるためにそのようなリプレッサー突然変異体の頻度を最大限にする特徴を含む。選択手続きは、大ＭｈＭの１ａｃｏｐｅｒｏｎ、及び、自殺ザブストレートｐａｒａ−ｎ　ｉ　ｔ　ｒｏｐｈｅｎｙ　ｌ　−１−，１−ｔｎｉｏ−Ｘ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓ　ｉａｅ　（ＴＰＮＰＧ）の二用に基づく。１ａｃｏｐ＝ｒｏｎ　（３遣伍子１ａｃＺ、１ａｃＹ、及び、Ｌ　ａ　ＣＡを含む））＝、ＬａｃＩリプレッサーの結合に−ってオペレータ塩基配列、１ａｃｏに制御さｎる（転写スターミ邪に、及び、ｊ　Ｉ　ＣＺ遣伍その間に＝１下る）。１ａｃＹ遺伍子生成物、乳Ｎｐｅｒｍｅａｓｅである責任のあるｃｙｔｏｓｏｔへの乳糖、及び、関連の化合物の活動的な理解のためにガラクトース、及び、グルコースを形成するためにそれらがｐ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｃｉａｓｅ　（１ａｃＺ遺伍子生成物）によってｈｙｃｌｒｏ　１ｙｓｅｄされる所で陽性の選択系ば、１　ａｃＹ遺伍子を発現する細胞の成長が選択的にＴＯＮＰＧ、または、ＴＰＮＰＧを前にして抑制されるという発見を開発するおそらく終えるその輸送に関する新陳代樹のニネルギーの浪責これらの化合物の選択性は、スクシネートが使わｎるとき、高められると示された炭素ソースとして選択の後ろの理論的基礎は、ｌａｃ遺伍子カセットのプロモーター運転発現に挿入された疑似オペレータ配列を結合するなめに、４３４のリプレッサーの能力に基づく。４３４のリプレッサー／オペレータ錯体がない時は、ｌａｃオペロンに、発現され、及び、ＴＰＮＰＧそ前・にして細胞死に帰着する。逆に１、複合体に［士して、ＬａｃＹ　ベルミーゼ（；、発現さｎない、及び、自殺ザブストレートＴ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｃ（：、細胞に入ることができない。従って（結、％）、ターゲット植物遺伝子の自然的檀果υ）ら２択ざ花な偽りの一オペレータは、５ａｌＩ部位にり＝−ニング５ｎ、ユび、ａ：（３らぜんにお：するあるアミノ酸がランダムに代用される４３４のリプレッサーをコード化する遺伝子のプールと結合される。疑似オペレータを結合することができる突然度異沼リプレッサーすなわらを発現するそれらのＥＥ胞のみ従）て１ａｃＹ発現を抑えるＴＰＮＰＧを前にして選択さ几るＬ−二ＬＬＬＬ９　ゴ　°　休　−ミ　ド　。！滋− 一連のプラスミドは、これらの爽秋における使用のなめに全農した。これらのプロトタイプは、ｐＡＤＩ８、図１８に示されるものの７１ブである。このベクターは、ｐｓｃｌｏｌ　（大腸菌に安定的に維持され、及び、低いコピー数を持つということを知らｎる）からレプリコンに基づく。ＤＮＡ結合タンパク質の過度の一発現がホストの成長への有害な影響を持ってもよいので、これば、重要であるこれがいくらかの爽秋における問題であるならば、シングル、のコピー遺伝子としてのバクテリアのゲノムへの挿入のためのバクテリ７ファージベクターにｐＡＤ１８に含まれる遺伝子＋Ｅ送することは、望ましい。ｐ、入Ｄ　Ｌ　８　ｉ；、大腸百旧胞株に８けるｍ　ａ　ｌ　ｎ　ｔ　ａ　ｉ　ｎａｎｃｅのための刀ナマイシン選択−できるマーカを持ツ＊　タｐ　Ａ　Ｄ　Ｌ　Ｓ　：：、１ａｃｏｐ＝ｒｏ：ｑを含むｌ　ａｃＺ、及び、ｌ　ａｃＹ遺伍子は、ｌａｃプロモーター／オペレータのコントロールの下で存在する。ＬａｃオペレータにＳ　ａ　１１　ｍ１限Ｈ位は、ｅｎｇｉｎｅｒｅｄさｎな４３４人のオペレータの、或いは、ｐＡＤ１８、突然変異体４３４２″ベレータ、または、選択された°ｐｓｅｕｄｏ−ｏｐｅｒａｔｏｒｓ”　の派生語における挿入のために使われるこの部位は、それが結合するために十分なりプレッサーが合成される５ｔｅｒｉｃなボウガイを通じてのＪａｃプロモーターからその部位にクローニングされるオペレータまでのｌａｃオロンの発現を妨筈しないであろうほど方法において配置された。それらのベースは、包含された接触しているＲＮＡ　ポリメラーゼではないということを知られる５ａｌＩ制隈部位に変丸られた。このように、Ｉａｃオペロン！！現は、４３４のリプレッサーのコントロールの下で操作される。荒野−タイプの４３４人のオペレータを含むｐＡＤ１８（＝、このようにこの− 遍のプラスミドのプロトタイプである。ｐ　Ａ　Ｄ　ｌ　８は、テトラザイクリン耐性の遺伝子（荒野が１ａｃＵＶ５プロモ一ター缶のコントロールの下で４３４のリプレッサー遺伝子をタイプする）を含む（発現の高いし゛ベルのなのに挿入さｎる）、。このベクター；；、ｐ　７　Ｓ　二と壬；ゴれる。さら（こ誘導体ば、下で示さｎる。他のベクターにおいて４３４のリプレッサーば、修正されたそのようなそ７′ＬＫｐｎ１．及び、Ｎｏ、ｔｌｉ（ｆｉこの鎖環に３けるネイティブのアミノ酸配列が保存さｎた、と同時に、Ｄ　Ｎ　Ａ結合らせんのどちらのす１′ドででも紹介さｎたそｈｔ′あるこのように、可能であるこの４３４リプレツサー遣伍その任意のオリゴヌクレオチドに挿入するために発現されたとき、変更されたＤＮＡ結合ドメインを発現する４３４のリプレッサー分子を発生させる自殺ザブストレートを使う選択系は、その時「疑似オペレーター」に結合するそれらの４３４の突然Ｅ異体リプレッサーの選択を許可する。いくらかの情況に３いて、これは、リプレッサー突然夏異体のｊ＃離に選択圧力をまた供給しても；い。しかしながら系それが二っているのでリプレッサー突然変異体の電離のための１ａｃＹベルミーゼの発現／抑制に依存下る。このように、オペレータ、または、リプレッサー遣伍その挿２人のためにｐＡＤ１８、及び、その誘導体に匣利なりローニング″’４Ｆ７がある。万ヘレータ；；、ｐＡＤ１８の先駆勧賞ベクター、捧（こｐＲＷ２Ｂ　３にクローニングさｎることができるからＰｓｔｌｉ片にＥｃｏＲｌを含む不ベレータに、消化されたＥＣＯ三１、及び、ＰＳ＝１に続いて４啄さｎ得る、及び、クローニングされ得るｐＡＤ１８（図１３を見る）。１つの目的（＝、上で示されたプラスミドによって運ばれたＬａｃオペロンの発現が４３４のりプレブザー／オペレータ相工ｉ’ｆｆ用によって制御さｎるであろうことを示すことであった。これを示すために３つのプラスミドは、組み立てられな中へＰＡＤ１６．１７、及び、１已によって運ばれた４３４人の７ベレータは、ｐＡＤ１５．２上で荒野 −タイプの４３４ｃ　Ｉ遺伝子と結合された各々、ｐＡ０１５．２からの大きいＸｈｏＩ／５ｓｔｌミ片（９，４ｋｂ）は、ｐＡＤ１６．１７、及び、１８からフオームプラスミドｐＰＳ２、ｐＰｓ３、及び、ｐＰｓｉまで浄化さｎた小さイＸ　ｈ　ｏ　Ｉ　／　Ｓ　ｓ　ｔ　Ｉ　破片（３，７ｂ）に純化された、及び、結紮された。各結紮かものいくらかの形質耘換細胞から分離さｎたプラスミドＤ、ＮＡＯ制限分析は、全てのｐＰＳプラスミドが予測された全体の組立て体を持つことを示した。これらのプラスミドの組立て体は、図１３に示さｎる。ｐＡＤ、及び、ｐＰＳプラスミドによって運ばれた万ベレー、夕の完全さは、配列によってチニツクされた。初のに、こしく＝、約２００の塩基−ベアＥｃｏＲｒ／？ＳｔＩ仮片を分離下ることによって達成されたｌａｃプロモーターの全て、及び、１ａｃＺ遺伍子の５ °端郁ヲ運ぶ各々のｐ　Ａ　Ｄ、及び、ｐＰＳプラスミド、及び、サブー＠性三殖がらそ工らご、ｒ二３ｒ：Ｌ；：　１８のポリリンＦ　’フルに。シングルを一座礁させたテンプレート（＝、原準のプロトコルに従って純化された、及び、塩基配列決定さらｎた。あるいは、この因雌なザブ−無性生殖手続きは、回避された（プラスミド配列を使っている）。これらの分析は、適切な１４ｍｅｒオペレータ塩基配列が全ての適切なブラスミタにδける５ａｉ１部位に存在することを示したヨｌａｃプロモーターの他の！ｇ著な特徴の存在は、また確認された。２．２ｐＰＳプラスミドは、機能的な４３４のリプレッサーをコード化する。４３４のリプレッサーを視覚化することは、ｐＡＤ１６．２、及び、ｐＰＳプラスミドによって産出した総蛋白抽出は、選択的コンディションの下で成長さぜらｎた真中の一５培養から１傭をされたポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び、ＣＯＯｍ　ａＳｓｉｅの光り輝く膏い（０２５０９色付けＦｏｌｌｏｗｆｎｇリブレッザーのサイズと一致するタンパク質に、明確に４３４ｃ　Ｉ遺伝子を含な細胞株において１．察されないであろうしかしながら、セの英検は、純化されたリプレッサーの１μｇがこの比較的無感寛な技術を用いてＣ；んの嵐に明白であることを示した。従って、″ヱ９よる牲との量に８いて４３４のりブノッ丁−そ検出下るために、少なくとも１％の全体の細胞タンパク質の発現レベルは、必要とされるであろう。まｒＳ他の同様の一ザイズで分類ざｎたタンパク質の背景は、検出を難しくする。従って、更に敏感な西洋のにじんでいる技術ば、使ねｎな。西洋のにじむことによって４３４のりブレッザーを検出することを要求された第一抗体は、純化された兜全な４３４のリプレッサーをウサギに注射することによって１傭そされな。このｐｏｌｙｃｌｏ’ｎａｌな抗血清の特異性情、示された（４３４ｃ工遺ｅ子に避難させる大Ｍ百細胞株の純化されたりプレ７サー、及び、抽出を使っている）。抗血清数個の低い希釈で、バクテリアの抽出がものタンパク質、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇする４３４リプレツサーは、検出された。しかしながら、さらにｘ、ｍ清の希釈Ｃ；、０ずが検出−できる状態を維持する４３４のリプレッサーに帰着しな１／１００００〜ｌ／２００００の希釈で１！察されつつある六大の特異性西洋のにじむことの感度この抗体製剤、及び、わざびｐｅ　ｒ　ＯＸ　ｌ　ｄ　ａ　５　ｅ　＃　３検出技術を匣う６３０ｏΔ１ａｃ４１６９の未加工の細胞抽出を”Ｓ　ｐＬ　ｋ　１　ｎ　ｇすることによフて評１＝された様々な量の純化され；リプレッサーを戸つ”ｓ　３４ＣＩ遺；＝そを含まｔい原ツ状態の下で抽出の５ｏμｇにおけるリプレッサーの５ｎｇは、容易に検出されるであろう０．０１％の全体の細胞タンパク質の発現レベルと一致するこの感度テストプラスミドを運ぶ６３ｏＯΔ１ａｃ４１６９細胞株の百の汚点における同じ第一抗体の使用；；、全てｐＡＤ１５．２、ｐＰｓｌ、ｐＰｓ２、及び、ｐＰｓ３に避難さぜる！胞が４３４のリプレッサーを合成することを最終的に示した。獲得された走置型濃度計を使うバンドの相対的な輝度の決定は、全ての４つのＭＥ胞株が４３４のりブレッザーとしての約０．４％の全体のＭＢ胞タンパク質を含むことを示しな。最終的に、戸野−タイブのオペレータ塩基配列Ｓ−結合するための４３４のリプレッサーの能力は、バクテリ不ファージ４３４ｃ　Ｉ、４３４ｖ　ｉ　ｒ、及び、λｃ工が芸能的な分析において決定された。これらのファージのライフザイクルにおいて結合のプロモーターＰｒの９のオペレータへの遺切なリプレッサーは、紀胞ｆｊ百の厚因となる遺伝子の転写を抑える従っ、て、ｃＩリプレッサーを内生−的に合成する細胞）；、既に現存するリブレフ丁−による溶菌遣１ヨ子発現の抑制による対応するファージに一つて溶菌５こ対して免疫である。のでｃＩ突然変異体ファーシリプレツアーを合成するここができζいこｎらのファージによる５染漫の溶菌発現型（；、ホスト：ａ胞におけるリプレッサーの欠如のなのに診断によるものであるｖｉｒ突然度真体ファージのＰｒオペレータは、リプレッサーとの減少したＭ相方そ持つ結果に関して内生のリプレッサーの低いレベルでば、このファージ（＝、溶菌である、一方、更に高いリプレッサー集中では、超−感染は、抑制されるということ結果のテスト細胞株によるこれらのファージをｃｒｏｓｓ−ｓｔｒｅａｋｉｎｇするｐｕｓプラスミドに避難させる細胞が４３４ｃ　Ｉ及び４３４ｖｉｒによって超−感染に対して免疫である、しかし、ｘＣＩに対して＠感であることを示す他のパッドプラスミドを運ぶ細胞株は、３フアージ全てに対して敏５でめった。これは、ｐＰＳプラスミドを運ぶＭｉ胞が機能的に７ベレータを結合することができる４３４リブレツザーすなゎちの高いレベルを合成し、及び、転写のＰｒを抑制することを明誕に示す。更に、このリブレッザー／ｆベレータ相！作用の特異性は、、４３４のリプレッサーの判カにょってＸｃ工の万ベレータを結合するために示ざｎる４３４のそｎらと異なる配列を持つＭＪ胞溶溶菌帰着する概要において全ての３　ｐＰＳプラスミド（＝、正しい胆立て体であることりこ決定した運ぶたのに４３４万ベレ一タ塩基配列？子り一部及び廐■巨：つζ４３４　ＣＩ、”ブノ、τ−そ合成する２のに２　ベ　−”　暮下で示さｎたように、ｐＡＤの人口の割合、及び、ｐＰＳプラスミド−含む細胞株は、選択に関してＳいコロニーを形崖する。更にこれらのプラスミドを含む細胞株が数ケ月の選択前な煤買に５！、持されるならば、それのに気付かれたサブーｃｕｌｔｕｒｉｎｇ必要なとき、人口におけるヨいコロニーの割合（＝、増大するこれらの白いコロニーがｔａｃｏｐｅｒｏｎの全ての一部がＥ化させられる、或いは、削除されるプラスミドを運ぶということが思われる。そのような問題を最小限にする通常の方法警；、再相合−欠陥のある細胞株を使うことである。しかしながら、Δ１ａｃ４１６９、及び、ｒ＝ｃ、化５６対立遺云子の結合ば、ＴＰＮＰＧを前にしてＢ胞テを不一生存可能にするこの存在の理白（＝つきつしない従って、注！（＝、ｒｓｃｏｍｂ　１ｎａｔｏｒｙ出央事の可倉巨性の高いソースに進路を夏えた。ｌａ、ｃ万ベロンを発現するプロモーター、及び、Ｄ　ｐ　Ｓプラスミドに８ける４３４のリプレッサー遣伍そづｌａＣプロモーターから得らｎた双方央であることがＳ：＝される従って、配列）；、非常に１！１様である間に起源配列、及び、カナマイシン−耐性の遺伝子が謀ミｎた選択主ジｔコンディションの下にな：すｎ：；ならｔいと仮定下ると、これらの配列がｌａｃオペロンの削除に帰着するであろう再結合ｐＡＤ１５．２の組立て体の間、４３４　ｃ、ｒ遺伝子は、ｌｋｂ　５ａｕ３Ａｉ片にプラスミドｐＲＰ４２から転送する。［４３４のリプレッサーリーディングフレームの停止コドンは、この破片の右手サイドのＳ　ａ　ｕ　３　入部位、従って転写−的終了が合図しないｐＡＤ１５．２運搬にクローニングされる遺伝子と同時に起こる。更に、またこの３ａｕ３Ａ破片は、ｐＢＲ３２２の残余を運ぶ（アンピシリン− 耐性遺伝子プロモーターを含んでいる）。従って、これらの問題を修正するために、上流へ、及び、下流へ４３４ＣＩコーディング配列の１０２配列双方共、変更された。領域に、トリプトファンプロモーター、及び、適切なオリゴヌクレオチドを使うコンセンサスＳｈｉｎｅ−ＤａＩｇａｒｎＯ配列と流２″Ｌ′４−さかのぼって交換さｎた。これは、プラスミド内再結合を妨げるそしてまたアンビシリ、ンー耐性遺伝子プロモーターを解任する。ｒｒｎ　Ｔｌターミネータは、４３４ｃＩ遺伍子写しを終わらせるなめに、４３４ｃＩコーディング配列の３″端部でまた導入された。その報告５ｎた２−万岡上の終了活動が４３４ｃＸの写しそ終わらでているのと；′￥、様に、ベクターにお、Ｘてセつ４Ｍ″Ｃ−開始された１対している写しからの４３４ｃ　Ｉ発現のあらゆる湿舌りを回避するので、このローー独ニしたターミネータは、選択された。０、　４　−スミＦつＴＰＴ　セ立′体万すゴヌクレ万チドは、上流でコンセンサス５ｈｉｎｅ−Ｄ　ａ　ｌ　ｇ　ａ　ｒ　ｎ　Ｏ配列（Ａ　Ｇ　Ｇ　、Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　）　５　塩ｉ５−ベアと央に荒野−タイプのｔｒｐプロモーター配列ご導入するために使われた４３４ｃＩ遺伍子翻訳−的なスタート部位のこのスペーシングは、４３４ｃＩ遺伝子の最高の翻駅−的な活動を行う。４３４ｃ　工遺田子のスタートの便利な制限部位の欠如のためにＥｃｏＲ工ば、コーディング配列の申の３３塩基−ベアを置く使われたこｎは、１リゴヌクレ万チドにおけるコーディングｆｆｍの５゛端邪の包含を必要とした。必要とされ７″：配列は、長さ１２６塩基−ペアでめつ、及び、このように４万一バーラツプしているτリゴヌクレ２チドから岨み立てもｎな。こｎ、らの万すゴヌクレ７チドのａｎｎａａ　ｌ　１　ｉ＝ｇするＦ　Ｏ！　ｌ　ＯＷ　（ｒ’、　ｇ　２　Ｐｒの１２６の塩基−ベアミ片１；、εｃｏＲＩ− 割らｎたｐＵＣｌつベクターに分離すｎた、及び、クローニングさｎたアンピシリン、及び、ＢＣＩＧそ含む媒質上の形質転換細胞の選択Ｆ　ＯＩ　Ｌ　ＯＷＬ　ｎ　ｇいくらかのヨいコロニーからのＤ　Ｎ、Ａは、塩基配列決定さられな（プラスミド配列プロトコルを便っている）これ：；、予力されたように、そうであるためのプロモーター配列の組立て体を確認した。り、−Ｔ＋２　億ｒｒｎ　Ｔｌターミネータの配列は、双方の配向における写しのためにそれを強いターミネータにする長いＡ−Ｔの豊かな領域の側ｆにある長いＧ１Ｃ０量かなステム組立て体を持つ。この配列の逆にされた度復性賀のためにそれは、挿入されたそれによって各ストランドの中の細胞ツーａｎｎｅａ　ｌ　’ｌ　ｉ　ｎ　ｇの問題を回避する４オリゴヌクレオチドを便うオリゴヌクレオチド（＝、ベアーにａｎｎｅａｌｌｅｄされた及び別々に分離され、及び、割られたＥｃｏＲＩ／Ｈｌｖ、　ｄ　ｒ　Ｉ　Ｉに結紮された結果的なダブルそ一ミーさせたＤＮＡ５アンピシリン−耐性への細胞の転換の前のｐＴＰＩ　ＤＮ、Ａ挿入されたターミネータ組立て体の配列に、確かのられた。ク　、　；暮　ミ　ド　ＱＴ　′　ｌ　Ｐ旦　でア　−　り辷ｔｒｐプロモーターの後ろにクローニング：ｆ−れるなのの４３４ｃ　Ｉ遺伝子のソースの組立て体は、プラスミドｐＲＰ４２−７６であった。静かな突然変異は、導入さｎた只然変異三反を試験１客でミうどちらのプ１′ド上ので（Ｊ　Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ　、及び、）ｌｎａｌＩＩのために制限部位そ造るたのにＸ３認識らせんのための配列コーディングのこれは、オリゴヌクレオチドの導入が続いて入るのを許丁。４３４ｃ　Ｉ遺伍子を運ぶＥｃｏＲ工／５ａｕ３Ａｉ片（役６０ｏ塩基−ベア）は、割らｎたＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩに分離された、及び、クローニングされたｐＴＰｌこれは、正確に４３４ＣＩオープンリーディングフレームを改警し、及び、翻訳−的な停止コドンは、ｓ　ａ　ｕ３Ａ／ＢｇｌＩＩ接合の中で保持される。いったん、分離されれば、ｔｒｐＰ−４３４ＣＩ−ｒｒｎＴｌ刀セットは、割られた（カセットのどちらの＃ｉ部ででも紹介されたポリリンケルにおけるＢ　ａｍＨＩ　Ｂａを使っている、及び、ｐＡＤ、及び、ｐＰＳプラスミドにおける現存４３４ｃＩ遺伝子に取って代わるために使われる）。ｐＴＲＴｌを組み立てるために使われるｔｒｐプロモーターの配列は、存在トリプトファンにおけるｔｒｐリプレッサーによって転写を抑制するために縛られる。４３．４ｃＥ遺伍子の発現が将来の仕事において制＠されてもよい（必要なら）ように、このリプレッサーのγこのの結合部位；＝、故意に保持された。しかしながら、４３４のリプレッサーの合成を都合よく許丁ために、細胞採番；、ｔ　ｒｐＲ遣伍子がそうであったもの：こδ−λて組み二てらスる（染色上から考ゴ除さｎる）、−１ロトコル、　Ｎ　を−２謬Ｔ　ＯＮ　Ｐ　Ｃ−選択プロトコル（；、計画された突然変異体リプレッサーが１ａＣＹ発現（丁なわち条件付の抑制の抑制による選択）の抑制に帰着するオペレータを突然変異体４３４に今結び付けるクローンのために選択を見込む。ＴＯＮＰＧは、１ａｃＹ　ｐｅｒｍｅａｓｅ遺仁子を発現している大腸菌Ｂ胞の成長を抑制する。シングルコピーｌ　ａｃＹ十大腸百による早期の仕事示すということこれらの細胞である最大限に敏゛惑な５００〜１０００マイクログラム／ミリリツトルのＴ　ＯＮ　Ｐ　Ｇスクシネートの！！ＬＩＪ＝の媒賀においてｌ　ａｃＹを発現しているとき、混合笑殺は、ＴＯＮＰＧがミックスされた１ａｃＹ÷／−集団の中から１ａｃＹ細胞を選択するために使われるであろうことを示した。これらの笑殺は、１ａｃＹ”、及び、１ａｃＹ−ｐＡＤプラスミドによって繰り返された。ＴＯＮＰＧ選択は、１ａｃ−削除さｎた大ＭＩＭホストにおいてただ動く。好まれなホストを＝、下で示される。選択は、液体の培養において！！シこよく動く、しかし、寒天プレートでまた働く、！！に異なるガラクトシダーゼ相轟物に熟達した１英な９間の仕事に関する選択、バラー二トロフェニルーベーターチχガラクトシド（７’　？　Ｎ　Ｐ　Ｇ＞　０　プレートに３Ｘするｑ乞Ｃ培豐、二び、ＴＰＮＰＧにおけるＴＯＮＰＧを使って、選択は、最初の人口に存在する１　ａ　ｃ　−ｐ　Ａ　Ｄプラスミドの６つの５豊富そ通常達成する。、９　゛、四−ウッド選択されたバクテリアのホストは、そのようであったに関してはＴＯＮＰＧによって選択を可能にするこれば、ホストの能力がスクシネートの最小の媒賀において成長することを要求した。この例に使われる特３＋Ｊなホストは、全体のｌａｃ、ｔベロンが削除された１つであったｌ　ａ　ｃ　Ａ　４１２９゜しかしながら、他の遺産な突然変異体ホストは、使われることができる例えば１ａｃｉ−１ｌ　ａ　ｃ　Ｙ　−ａ適当なり胞株は、細胞株Ｗ１４８５（ＣＧＳＣ６３００）誘導体から組み立てられたトランスポソンー運結さｆ’Ｌ７′ｌ：ＰＬ形形厚導入使う全体のｌａｃオペロンのために削除された。、　ＯＮ　＊（＊　−１ｌａｃ−細胞の背景の中から１ａｃｌＥｉ胞を選択するために、ＴＰＮＰＧの能力を試験するために６３００１ａＣ−及び、そのΔ１ＩＣ４１６９の培養の派生したことの混１合笑笑殺、行われた。こｎらの細胞株）；、１　ｍ　ｈ（ｊＰＴＧの存在下でミツドログ段階；で成長ミでらｎた（ヲＬ猾γベロンの発現を引き起こす−のに）、２つの培養（＝、ミックスされた様々な割合１　ｒｒＩＭ　ＸＰ　Ｔ　Ｇ　、及び、５０μｇ／ｌ　ＢＣＩＧを含む最小塩分スクシネートプレートとで遼嵩Ｘ、″希釈にめっきする前に’ｌ’　ＰＮ　Ｐ　Ｑによる、及び、Ｔ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｃ−なしの双方共。最初の笑殺は、５００＝ｇ／ミリリットルＴＰＮＰＧがほんのＬａｃ″細胞の成長を遅らせることができることを示した（２８°Ｃで４８ｈ後の小さい青いコロニーの形成をトしている）。しがしながら、この背景は、１ｍｇ／ミリリットルＴＰＮＰＣを前にして除去された（めっきされた（７ｘｌＯ”’まで）臂いコロニー（表Ｖ）を形成することができる１ａｃ−細胞のうちの何もないことに帰着している）、一方、このＴＰＮＰＧ濃縮は、１ａｃ−細胞の生活力に著しく影響しなかった。　これは、ＴＰＮＰＧ　ａｇａｉｎｓｔｌａｃ”細ａのｉい選択的なパワーを示す１ａｃＹ遺伝子がクロモソマールであるときさえも及びこのように最低僅でば、数をコピーする。この点で、更に高いコピー数、及び、従ってｐＰＳプラスミド上のｌａｃ遺伍子の増大された発現レベルは、ＴＰＮＰＧアブテーク上のエネルギーの更に大きい浪費に帰着するべきである（１　ａｃ”細胞の殺害を更に効果的にしている）。表　ＶＮ、　Ｄ、　＝定量不可能ＴＰＮＰＧ（７）ｆｉ々なｐＡＤ、及び、ｐＰｓプラ：）、ミ’ｒ：を運ぶ６３ｏＯΔＩ　ａ　ｃ　４１’　６９細胞の生存への影響は、上で示されたように、媒質上の＠養の適切な希釈にめっきすることによって試験された。２つの英検からの結果は、全てのプラスミドがＴＰＮＰＣを前にして！及び白いコロニーの形成に帰着することを明らかにした（表ＶＩ）、その不在中に更に白いコロニーは、検出されるとはかぎらなかった。表　ＶＩＮＤ＝定量不可能。既に観察されたように、ｐＡＤ全で、及び、ｐＰＳプラスミドは、４３４のリプレッサー／オペレータ相亙イ乍月の存在にかかわりないＢＣＩＧを含む媒質上で腎いコロニーを与える。おそらく従って形成された白いコロニーは、プラスミーを運ぶＢ！！に起因しなければならない効果的に与えるために、Ｆ化させられた、戒いは、削除された細胞を１ａｃ−にする。これらの白いコロニーが発圧する（はぼめっきされた細胞の１０°Ｓ）比較的低い頻度に、それを示唆する（ＴＰＮＰＧを欠く媒質上で）そｎらは、臂いコロニーの大多数の間に見つ（丁らｎない状？そ維持するであろう。　そのような臼いコロニーの細胞に−って避難ざでろスなブラスミタの分析）＝、劇乎（とで見る）を明らかにした。ｒｐｓｐａを前にして、細胞株をｐＡＤ−芽つことによって形成さｎた青いコロニーの頻度は、１０’〜１０′減少した。こｎは、抑圧されていない１　ａ　ＣＯｐ　ｅ　ｒＯｎに避難ごてる人口の大多数のＴＰＮＰＧによって殺害を表す。ｐｕｓ３を運ぶ細胞株ば、Ｔ　Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｃ−の前での同項の範囲にまた殺さｎたように既に４３４のリプレッサーがこのプラスミドにおけるｌａｃ遣伍子の転写を抑制することが不可能であるということが示されたと仮定すると、予力ざｎるであろう。しかしながら、全てのケースにおいて、残りの数の青いコロニーは、ＴＰＮＰＧを前にして獲得された（めっきされた細胞の約ＩＱ−５の頻度で）。これらのコロニーが既にＴＰＮＰＧの選択的なパワーがそれら全てがｌａｃ ”のままであると仮定すると、めっｇさｎた細胞のミ倒的多数を殺丁のに十分であるということが論証さｎたので、１ａｃＹ−交熱Ｅ異体プラスミドに避難ざぜる細胞を主として表すということが、已０れる。剪の笑殺が染色体幻にに生まれた１ａＣＹ遣伍そのたの（こ高い突然Ｆ異類！を示ざなっ゛っ２ので、プラスミド内耳結合が突然変異ｚ（７）明らかに藁い数のｊ夏因となるということが忠ｎ７′Ｌる。荊の仕事り；、２八らのプラスミドがレクリエーション細胞株における不安定性、及び、そｎの傾国があることそ示した６３００Δ１ａｃ４Ｌ６９　ｒｅｃＡ５６ｅ胞株そのような再結合をＺげる二のに便わｎるであろうもの：＝、Ｔ　７３　Ｎ　”）　Ｑ上で不一生存、可能である。しかしながら他の細胞株との鋭いコントラストにおいてｐｕｓ　１を含む細胞の圧Ｉ；ｌＩ約多数、または、ｐｕｓ２は、ＴＰＮＰＣの前に残存するわずか２−５減少つつある青いコロニーの数は、折り畳めるｐｕｓ　１のために最小であるこの低下従って、これは、ｐ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活動における強調された減少と明瞭に関連があるまたおそらくこれらのプラスミドのために既に示された１　ａｃＹ発現、、従って重要な結論は、引き巴されることができる（４３４のリプレッサー、及び、その同族語のオペレータの間の相！作用が減少することができる）Ｉａｃ遺伝子発現十分に細胞の大多数は、選択約手Ｒきがら生き歿ることを許すために。、　鉋１−１　レー。４　棒　１　し。任意の１リゴヌクレオチドの挿入による４３４リプレツサ一結合ドメインの任意の突然変異生成を容易にするためにＦ更された４３４遺伍子は、示された（Ｗｈａｒ−ｔｏｎ、及び、Ｐｔａｓｈａｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ３Ｌ６、［１；０ｌ−６０５）。４３４のリブレッザー遺伝子（；、ネイティブのアミノ酸配列！−優存している間に、Ｄ　Ｎ　、！−認識らせんのどちらのサイド上ででもＫｐｎＩ、及び、Ｎｏｔ工制限酵素對開場所を導入するため（こ、突然変異厚を与えらｒした。−塊の７リゴヌクレ１チドは、正しい粘ＩＦ−Ｅのある項五と共に今まさｎた及びＤ　Ｎ　Ａ認識アｊＶファらせんの至る所でランダムに分配された突然罠異のＦ化している頻度を含ｒｊｅこれらのオリゴ混合物ば、ＫｐｎＩ、及び、Ｎｏｔｒの粘着性のある端部の間にクローニングされたの４３４のりブレッザー遺伝子を修正した。代りに、「ダーティ万すゴ」アプローチは、Ｄ　Ｎ　Ａ結合ドメインの適切な位置の塩基置換による混ざったτリボの生成のために使われた。 °　°　１い　Ａだ　“　ｆ′オベレ一本　１−１Ｉ−雫　乙　乙１　レー自然に発生している疑似オペレータは、変更されたリプレッサーの選択のために便ねれた。この仕事のためのターゲットは、フランスの豆からのＧＰＡＬ２遺伍子、とうもろこしからの葉緑紫ａ／ｂ結合タンパク質遺伝子、及び、他のものであった。我々持つコンピュータ分析によってｉ：確認されるいくらかの潜在的な４３４疑似万ベレータは、ＧＰＡＬ２遺仔子の領域に位置するということ、ＧＰＡＬ２プロモーターのこれらのａ域は、Ｆ！！された特異性４３４リプレツサーを選択するために使ねｎな。「疑似１ベレーター」配列は、ｌ　ａ　ｃ　Ｚ　／　Ｌ　ａ　ｃ　Ｙ遺伝子を動か丁１ａｃプロモーターの−１０〜−３５領域に挿入ざｈ　７′：、汚れなオリゴのもの４３４のりブレッサー遣伍子に挿入さｎた、そうすれば、混合物は、大腸菌６３０ｏに転換され７．：、選択プロトコルは、印加さｎたそして分離されたコロニー。我々が突然変異体リプレッ７−が選択されろ二とがでミることを論［した微生物学の、及び、分−？技術を便う。リプレッサー遺伝子の特徴付けば、Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列分析によって行われ、及び、結合は、リプレッサー結合の力を決定するために研究する。要するに、本発明は、なるべくバクテリアの：ｉｌ！ｌ胞株、及び、プラスミドの選択系及び、＠感な＠殺すブストレート選択プロトコルを提供する。この選択系は、変更された特異性を示すリプレッサーを選択するために使われることができる。本発明において意味されるである供給上記の変更された特異性のリプレッサーによる有機体において遺伝子発現を制御することの、遺伝子発現のコントロールのこの方法の唯一の必要条件ターゲット遺伝子のＤＮＡ４ｓ基配列である「疑似オペレーター」の確認正常なオペレータ塩基配列と類似するＤＮＡ塩基配列である。そして選択系結合することが可能であるリプレッサーの選択を上記の「疑似τベレーター」に許可するＩ　Ｉ　１．　了　Ｌｉ　− このモジュールは、雄花を含む図１７．１８、及び、１って示されたポリ−ヌクレオチドよりなる　特異的のＤｐＡ塩基配列これと共に、明確に男性において発現されるものは、組織を花で飾る。図１７に示された遺伝子配列を含む大ｙｋ百株Ｒ１丁ストに寄託されたプラスミドｐＭＳＬＯは、１９８９年１月９日付寄託番号ＮＣＩＢ　４００９８としてＮａｔｉｏ：＝ｌａｌＣｏ二ＡｅＣ’−１０：’、ＯＡ上ｎ、’−＋５ｔｒｉａｌ　＆　Ｍａｒｉｎｅ　ＢａＣｔｅｒｉ＆に寄託されたものである。図１８に示された遺Ｆ−そ配列を含む大腸菌株ＤＨ５αホストに寄託されたプラスミドｐＭＳ　ｌ　４は、１９８９年１月９日付寄託書号ＮＣＩＢ　４００９９としてＮａ１１０ｎａＩ　Ｃ０１１ｅＣｉｌＯｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｔａｌ　＆　Ｍａｒｔｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに寄託されたものである。図１９に示された遺伝子配列を含む大ＭＷ株ＤＨ５αホストに寄託されたプラスミドｐＭｓ１４は、１９８９年１月９日付寄託番号ＮＣＩＢ　４０１００としてＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　＆　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに寄託されたものである。これらのＣＤ　Ｎ　Ａ配列のＭ離、及び、ｒＦ微行け、及び、確認するだめの分子のプローブとしてのこｎらのｃＤＮＡ配列の利用そして、対応ゲノミック配列を分離下る、以下説明する。ゲノミック配列を支持するクローン、及び、例証さｎたアプローチ、及び、技術を使うクローンの１つＱｌらのプロモーターカセットのＨｉＦｆ等しくどｎへでも印二口さｈ−でもよいのクローン。更に、レポーター遺伝子へのプロモーター融解の製剤、及び、テスト種へのこの組立て２のＥ換）よ、示さｎる。別途明！ミしない】つ、全ての楼酸損イ乍は、Ｓａ二ｂ；ｏｏＩＣ％Ｆ、ｒ　ｉ　ｔＳ　ｃｈ、及び、Ｍ　ａ　ｎｉ　ａ　ｔ　ｉ　Ｓ　、分子のＣＩ　０　ｎ　１　ｎ　ｇにおいて示された凛準手＃！きによって行わｎる：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｒ＋　１９８９年嵐誘　 −（トウモロコシの雄花において発現される遺伝子へのクローンｃＤＮＡｓに、我々は、２ｃＤＮ−Ａライブラリを組み立てた。トウモロコシにおいて、雄花は、主なステムを終わらせる房に運ばれる。ライブラリ１は、全てのトウモロコシ房からの諸工芸のＣＡＩＲＮ−Ａから準備をされた耐える遅い減数分裂巧（主として２−広告、及び、早期のｔｅｔｒａｄステージ）を持つ全ての房からの諸工芸の口Ａ］　＋ＲＮＡからの早期の減数分裂巧（早期の減数分裂前期の大部分のｍｅ　ｉ　ｏｃｙｔｅ　ｓ）、及び、ライブラリ２．６Ｕ１４ばライブラリスクリーンーニング手順を示す０、これば、唯一の早期の？ｊＩｔ数分裂Ｍ　ＦＳ　ｃＤＮＡｓ、及び、１の唯一の遅い減数分裂ｃＤＮＡｔ生み土した。クローンＰＭＳ３１２０の塩基ベアの部分的７：ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　！！動ススクリーニングプロセス；って分離さｎる続いてｊ：！われた等身丈のクローンの近くで対応するものを分離するたのの異種混合プローブとしてＰＭＳ　ｌ　８゜下表ｖ工工；＝、各々のこｎらの０フＮ人クローンのいくらかの特徴を要約したものである。早期の減数分裂ライブラリから分離さｉた５　ＭＦＳｃＤＮＡｓのｍＲＮＡ５の発現（＝、双方のいつも減数分裂房試料から分ＷｊｉされたＲＮＡにおいて検出される。これらの（Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓと一致するｆｆｌ　ＲＮ　Ａ　Ｓば、雄花に完全に特有であると（＝かキラス、及ヒ、ｉｔ片（ｐＭＳ　１０、及び、ｐＭＳ　１８）におけるかなり低いレベルで、或いは、薄片、トウモロコシの穂軸、及び、根（ｐＭｓ　１、ｐ　Ｍ　Ｓ　２、及び、ｐＭ　Ｓ　４　）表　Ｖ工Ｉにおいて検出される。一方、ｐＭＳ１４ｍＲＮＡば、遅い減数分裂ＲＮＡにおいてのみ、発見され、及び、薄片、トウモロコシの＠！粕、また、根（表Ｖｌ　ｘ＞において検出されない。ニー−ｊＬ ’＝ＤＮＡう１′ブラリ１　（剪の減数分裂）；之：；ライブラリ２から単離されたもの。２　塩基ベアにおける概略のサイズ。３　ヌクレオチドにおける概略のサイズ４　÷＝房に、及び、薄片、トウモロコシの穂軸、及び、根におけるはるかに低いレベルでノ発現。 ÷＋＝房のみにおいて、及び、葉においてはるかに低いレベルで発現。＋＋＋＝房のみにおいて発現。５　Ｅ／Ｌ＝ｍＲＮＡが早遅両方の減数分裂房からのＲＮＡ中に存在する。Ｌ　＝　ｍ　ＲＮ’　Ａが遅い減数分裂房からのＲＮ　−Ａ　＊のみに存在するゆ我々は、ドツト汚れ異種混合（図１５）を使う房開発の間のこれらのｃＤＮＡｓと一致する遺伝子の発現を調萱した。ドツト汚れ分析は、放射線ラベル−されたｐ　％ｆＳ　ｃＤＮＡｓに異種混合を従えているニトロ細胞ロースに全体のＲＮＡを結び付けることによフて発生させられ之。全てのフィルタは、１６８時間の間さらさｎたｐＭＳＩＯを除いて一７０゛Ｃで４８時間の間フィルムにざら、された、各試料における房長さ（＝、次のとδつであった：Ｚ　２ｃｍ、Ｂ＝２− ５ｃｍ、Ｃ＝５−１０ｃｍ、ＤＩ＋＋１０−１５ｃｍ、Ｅ＝１５−２０ｃｍ、Ｆ＝２０−３０　ｃｍ、及び、Ｇ　＝　２０−３０　ｃ　ｒｎ　、図１５にδげる堅圓なバー（；、各々の試料における小、抱子形成と比較して発達上のステージを示ず；　Ｆ　＞、（＝わ−？＃２数分裂、更＝減数分裂、ＩＰ＝の未熟な花粉、及び、Ｍ　Ｐ　＝４、花粉を成熟させる。早期］減数分裂ｍ　ＲＮ　Ａｓ　（ｐＭ　Ｓ　１．２．４．１０、及び、１日）は、あまりその時非常に房における開発の初のに集積しない長さにおける２センチメートル我々は、このステージの前の花の分裂組織において発現を分析しなかっな。これらのｍＲＮＡ５は、減数分裂巧ステージを騒で国歌し、その後、花粉グレンが成熟するので、低下する。ｐＭｓ１４の一方先の減数分裂ｍ　ＲＮＡは、めまつ房においてその時検出されない長さにおける５ｃｍＬかし弱の胞子形成ｌａ胞が減数分裂（図１５）に入るので、非常に増大する。早期の減数分裂ｍ　ＲＮ　ＡＳに関してま熟するように、ｐＭｓ１４　ｍＲＮＡが交熱低下するので、花粉は、巧（図１５）において集積する。こｎらのデータは、遺伝子発現の異なる一時的なコントロールがトウモロコシにおける雄花の開発の間に発生下ることを示す。コントロール早期の減数分裂ｍ　ＲＮＡｓの１槓のブ：グラムを組むおそらく非常にｌ！］槽である、しかし、外観、Ｗ積、及び、先の減数分裂ｍ　Ｒ，Ｎ　−Ａの、、ｐＭＳ１４！調整下るそ調整上著しく対称的である双方のいつも減数分裂ｒｎ　ＲＮ　Ａ　ｓ　ｌ：、成熟した花粉グレンの１積の前に発生する発達上のブコセスに従事している。それらである明誕に裂開のように巧開発の後のステージに関連していないまた、それらではない：ｉ熟した花粉に３いて其攬する二三Ｎ、屯Ｓ、までのもとの場、７へ異種混合は、トウモロコシの雄花におけるｍ　ＲＮ　Ａ　ｓ夫人の組織局部化を決定するなめに使われた。使わ几る技術は、Ｗｒｉｇｈｔ、及び、グリーンランド（１９９０年において示される：ＳＥＢ　５ｅｚｉｎａｒ　５＝ｒｉｅｓｖｏｌ　４３広告Ｎ　Ｈａｒｒｉｓ、及び、ＤＷｊ　ｌ　ｋ　ｍ　ａ　ｎによって、ケンブリッジ大学出版部、ケンブリッジ；プレス）において、示されたデータは、ｐＭＳ１４ｍＲＮＡのためのそｎである。図１６Ａ、Ｂは、ｐＭｓ１４アンチセンスＲＮＡプローブによって５ｉｔｕ　５ｉｔｕ異種混合を示す。感覚、及び、アンチセンスプローブは、ｐＭｓ１４の３００の基礎的なベア破片をベクター、ｐＢＳにザブクローニングすることによって１傭をされた。従えている放射線ラベル−されたＴ３、及び、Ｔ７の製剤によってベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、商漂）のザブラ１′ヤによって提案された方法を利用する写しを重合体−するこれらの異種混合は、２ＭＳ１４　ｍＲＮＡが開発途上の小胞子を百む胞子嚢の細胞層に位置することを示す。ｐＭＳ　１４アンチセンスプローブの異種混合は、てクシ！イにおける他の細胞に発生しない、Ｍ様に、ｐ）ｒＳ　１４！Ｆ！、寛プローブ（；、特異そつの異種混合（図工６Ｃ）を全く示さない、ｐｕｓ　１４　ｍＲＮＡのレベルがＩ！Ｌス図１５）であるとき、こｎらのセクシまン（＝、ステージの１５−２０センチメートルトウモロコシ房から作らｎな、こｎらのでクシ；ンにどいて、及び、次の英検：〜らのそｎらにおいて、異種混合は、他方ではなく１つの小さな花において巧の胞子嚢に発生する。図１８Ａ、Ｂに８いて、ｐＭｓ１４　ｒｎＲＮＡを含；ないｔａｐｅｔａｌな層が減数分裂そ受けなかった胞子形成細胞そ目む、と同時に、ｐ　Ｍ　Ｓ　１４　ｍ　ＲＮ　Ａを含ｔＪＲ子嚢層は、四集粒段階の遅い減数分裂小胞子を囲む。小芭の個々の小さな花の中のセットの朽が弁動的に発展させないことは、トウモロコシの特徴である。このように現場異種混合は、ｐＭｓ１４ｍＲＮＡの１積が組織−特異的であることを示すそして、データを確認する獲得するドツト汚れ分析（図　１５）からＰｍ５１４　ｍＲＮＡの発現は、ステージであるということ特異的のそれが最初に減数分裂細胞を囲ＴＪｔ　ａｐ　ｅ　ｔ　ｕｍにおいて検巴されるので。九りつ　１　Ｘ　惚茎「　９ｃＤＮＡクローンからのＤＮＡ、標處手続きを便うＭｌ　３ｍｐ　１８へのザブー無住生題による塩基配列分析のたののｐＭＳ　Ｉ　Ｏ，サブ−クローンのヌクレオチド配列ば、漂ま手続きそ使うｄｉｄｅｏｘｙな方法によって決定さ、ｎた。！！に、５ｅｑｕｅｎｃｅ　（商凛）方法：；、匣０れ７．：（ザブライヤによって示さ２′した方法を利用している）、クローンの領域（＝、前のゲルリーディングつ・ら獲得さｎな配列から合成ざｎた合成のオリゴヌクレ万チドと共に供給下ることによって塩基配列決定さらｎた。ラフ１Ｓングの７：！：′）に゛ヱニ：′、る万すゴヌクレ万チダ集＝は、ユニバーサルなプライマーによって使わｎるそれちと同じであった。ＭＦＳ、１３５３の塩基のＣ１ｏｎｅ　ｐ、Ｍｓｌｏの十分な長さＣＤ　Ｎ　Ａ　ｉ：、ベアになる。完全なヌクレオチド配列、及び、予測されたアミノ酸配列は、図１７に示される。配列は、ポリペプチドが！富である３７３７１　ｋｄの推論された分子量を持つ３４１のアミノ酸のポリペプチドをコード化する１０２２ヌクレオチドのオーブンのリーディングフレームを含むｇｌｙｃｉｎｅ残留物オーブンのリーディングフレームは、５゛の側面にあり、及び、３°は、各々１２９及び２０１ベースの９域を非−翻訳した。１　４　Ｎ　惚３＆１］１　勺Ｅｘａｍｐ　１　ｅ　’　２に示されたように、ヌクレ万チド配列を決定することの手続きクローンｐＭ３１４である５８１の塩基ベアの完全なＣＤＮＡにおいて完全なヌクレオチド配列、及び、推論されたアミノ酸配列は、図１８に示される配列（＝、ヌクレ万チド１かも２７８に及ぶオーブンのリーディングフレームを含む（１２７のアミノ酸のテ；分ミ）なポリペプチドをコード化している）。ポリペプチドは、アラニン、及び、ａ　ｒ　ｇ　ｌ　ｒｌ　Ｌ　ｈ”ｒ　ｅ残− 物が坤に畳重である。７−ブンのリーディングフレームは、領域２０３ヌクレオチドを非−コード化する３゛の側Ｉにある。コンセンザス処理、及び、ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔ　ｉｏｎ償号ヘモサヌクレ万チドＡ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　ｌ：、位置５４８に発生ずる九りつＶζＩ　Ｙ　−ｉ基や　−守Ｅ　Ｘ　ａ、　ｍ　ｐ　１　ｅ　２に示されたように、ヌクレ万チド配列を決定するための手続きクローンｐＭＳ　１８は、９３３のベースのにとんど等青火のＣＤＮＡである。完全な、ヌクレオチド配列、及び、推論されたアミノ酸配列は、図１９に示される。ｐＭｓ１８１；ｉ：、その３′終点に２８ヌクレ７チドそ欠く紛矢したヌクレ万チドは、クローンｐＭＪ　３に存在する万一パーラップ下るｐＭｓ　１８掛ける！！なる９１の配列ヌクレ万チドｐ　Ｍ　Ｓ　３　’ｒ；、ＣＤＮＡ　１ｎｂｒａｎｓｓＬｊ′）差動スクリーニングに；って分離された万すジアルのクローンであり、及び、ｐＭｓｉｓを分離下るたの）こ、異種１合ブ＝−ブとして纜いて便０７′Ｌな。ｐ！’ｉ　Ｓ　’−８ｉ’：、ヌクレＴチド１５１からＥｌ１３に及ぶ７−ブンのリーディングフレームを含み、及び、２５　ｋｉ　１０ｄａｒｔＯｎＳの推論された分子量を持つ２２１のアミノ酸のポリペプチドをコード化する。ポリペプチドに、ａ　ｒ　ｇ　ｌ　ｎ　１　ｍ　ｅ残留物が特に豊富である。オーブンのリーディングＧ；、各々１５０及び１２０ヌクレオチドの領域を非− コード化する５°、及び、３゛の側＝にある。立１ＯＮ・］　ンー：″　ミー　ローン　電−ＣＤＮＡと一致する遣伍テを運ぶゲラミックＤＮＡクローンｐＭＳ　Ｉ　Ｏば、ＥＭＢＬ、３相から分離されたトウモロコシＤＮＡの部分的なＭ　ｂ　Ｏ１破片のライブラリライブラリは、試験管内で１　ａｂｅ　１１　ｉｎｇしている系において合成さｎた放射線ラベル−された「長い−ｍｅｒＪプローブを用いて選別さｎた。この系よりなる　合反の１００塩基オリオヌクレ７チド（ｐＭｓｌ○の塩基位置４５２−５５１　：図１７）の５　ｍｇ合成のグラ１′マーフリゴヌクレ万チドの５００　ｒｒ、　ｇ配列−ＴＡＧＴＴＴＣＣＴ−ＣＧＧＴ粍及び長い７リゴヌクレ万チド、１．２の放！を線ラベル− された万すゴヌクレ７千と（通常３２−　ＰａＣＴ？、かつ、または、３２−　ｐ−ａｃ”ｒ？）、及び、ｖ　Ｎ　、＜　＝リメラーゼｌのＫ　Ｌ　ｅ　ｒｒ　ｏ　ｚｖフラグメント５−１０ユニツトの３′端部と共に塩基対そ形成する５反応（＝、それを除＜ＤＮ−Ａ　ｌａｂａｌｌｉｒｔｇ　Ｃ”　二ａ１己〇ニーｐ＝ｉ二三＝ｇ方ミのなのに使９れるそｎと同じである緩衝液において３０分の間３７゜Ｃで行わｎた任意のへキサヌクレγチドは、省略された５ナイロンｒＨｙｂａｊｄＪ　（商漂名）フィルタ上で固定さｎな５百万フア一ジクローン番＝、フィルタ（Ａ　ｒｒ１ｅｒｓｈａｍインターナシ；ナル）のザプライヤによって提案された前−異種混合、及び、異種混合ｔｉｋ衝液を使うこｎらの調音と共に６５°Ｃで交配させられた。フィルタは、ａ　ｘ　ＳＳＣ上で洗われた９Ｍ３１０遺二子の完全な或いは部分的な領域を含むこれらの手続き５０−６０　ＥＭＢＬ３ファージクローンを使う６５゛　Ｃの０．１パーセントＳＤＳは、獲得された完全なｐＭＳ　１０遺伍子を結合した３　ＥＭＢＬ３ファージクローン１０／ＣＴ８−１．１０／ＣＴ８−３、及び、ｌ　Ｏ／　ＣＴ　２５−３　カラ７７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ハ、ｆｌｌｌＪ　混ｕ　業’Ｆｆ＋　要によって準備をされた、及び、分析された。各々のこｎものクローンは、−ａの９Ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントそ含むと示されたｐｘｓ　１０遺牙その第３のイントロンから５′に延長する遺伝子の非−コーディング、及び、プロモーター領域。９Ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントｍこ対応−Ｐ“　ミー　を−ローン　電相ＣＤＮＡと一致する遺伝子を運ぶゲノミックＤ　Ｎ　Ａクローンそ分離する！ｌ）ＭＳ１４　２アプローチ；；、行われた最初のアブ：−チにおいてＥ　：（ａニア　ｊ　６５に３いて示された方法（；、５（百方）ファージクローンを除いて採用された完全なＣＤ　Ｎ　Ａ配列、及び、異種混合の手研き後の洗浄厳しさによってヌクリーニングさｎた１４／ＣＴＡ、及び、１４／ＣＴＤを２つの陽性のクローンに譲った第２のアプローチにおいてカットされた１２　ＫＯＥｃｏＲ１戸のＢｌｏｔｔｆｎｇによってｐＭｓ１４遺云子を運ぶたのに示されたトウモロコシｇｅｏｍｉｃなりＮ　Ａの留分カットされたＥｃｏＲ工に結紮されたライブラリを製造するためのＸｘファージＥＭＢＬ４　ＯＮＡの１７　Ｋｂ　ＤＮＡフラグメントをクローニングする上で示されたように、おおよそ２００，０００のクローン（＝、スクリーニングさｎ、及び、ｐＭｓ１４’ｉ！で雑種を生んだ１７　Ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントを結合した２つの陽性のクローン、１４／１７ｍ、及び、１４／１７Ｒは、分離された。さらに分析に関して、部分的なＭ　ｂ　ｏ　Ｉ　／　Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　３ライブラリから分離された２つの陽性のクローン３；、内部の１−７Ｋｋ）フラグメントを含むことを発見され７：５全てのクローンと共通のこの１７　Ｋｂ　ＥｃｏＲ，ｒフラグメントの部分的な制限マツプは、図２１に示ミｎる忠ユニフ′″ｌ″：″″１：対二τ二′　ミ・・　）″：ローン嵐詐ｃ　ＤＮ　Ａと一致する遺伝子を運ぶゲノミックＤ　Ｎ　Ａりローンを分Ｗ　ｉるｐＭＳ　１８Ｅｘ　ａｍｐ　ｌ　ｅ　５に８いて示された手続８番＝、採用された５百万ＥｒｒｘＢ　Ｌ　３フアージクローンに、ｐＭｓ１８の配列、位置１３３ −２２２＞から得られた「長い−ｎ’、　ｅ　ｒ」プローブに交配させられた。３″の′４足的オリゴヌクレオチドの配列は、５’　−ＧＣＣＴ　ＣＧ　Ｇ　ＣＧ　Ｃ−Ｔ　ＣＧ　Ａ　Ｃ−３°であった。ｐＭＳ　１８遺伝子を運ぶ２つのクローン、１８／ＣＴ３、及び、１８／ＣＴ２３は、このスクリーンから分離された。これらのクローンの制限マツピングは、それら双方共が遺伝子のプロモーター、及び、上流の領域のｐＭｓ　１８、及び、約４　Ｋｂのコーディング配列の５° ９！よりなる　、４．５　Ｋｂ　ＢａｍＨＩ−３ａｌｒフラグメントを含むことを示した。クローン１８／ＣＴ３の部分的な制限マツプは、７２２−　ハ　ｆＪＬ″′ｔ・　ロニー−７７′−″−の知立一体Ｘ　ｘ　Ｅ　Ｎｒ　Ｂ　Ｌ　３りＣ’−ン１０　／　ＣＴ　８−３７５’　ラノａ　ノｆブークコーンは、ｆ乍らｎた。４．５　Ｋｂ　ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲエフラグメントを；、ｐン、工Ｓ二Ｏ−２を与える−の：二、ｐ　′：ＣＬ　９にり：−ニングさｎた。２．７　Ｋ；ＯＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、ｐＭｓｌｏ−３を与えるために、ｐｕｃ　、１８にクローニングさｈ　ｆ：　５ＸｂａＩフラグメントへの１．６　Ｋｂ　ＨｉｎｄＩ！■は、ｐｍｓｌｏ−４を与えるために、ｐＵｃ１８にクローニングされた。ボ’Ｊ　メラーゼ遁類反Ｅ（ＰＣＲ）ｉ：、Ｅ）ＭＳＩＯ−３がら９３０　ｂｐフラグメントｌ！−１嗜するために使われたＰＣＲ反応のたのに、ｕｓｅｄされるプライマーは、次のとおりであフな。プライマーＥ）ＵＣ／２は、ｐｏ　ｌｙ　ｌ　ｉ　ｎｋａ　ｒ部（ｎの側ｆに位置するｐＵＣ配列に一致する。それがベース１２３、及び、１２４の間に追加のチミジン残留物を含むということを除けば、プライマー１０／９は、位置１０６−１２９からｐＭｓｌｏの配列までオ足的である。これらのプライマーの配列は、以下である。ｐ　Ｕ、Ｃ／　２　５　’　ＣＧＡＣｔｌ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’１０　／　９　５　’　４ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧ−３゜？ＣＲ反応にδげる次の拡大、Ｄ　Ｎ　Ａフラグメント；；、；造ミｎる〒ヘフランモングしているＸｂａＩ邪に及び翻訳創始者の前のＩ接、塩基へのクローン１０／ＣＴ８−３つ町ご慣塚にδ；ブるそのブレゼンミと寛仁で力る配列、已英ζこ耳現さｎるその１の新奇なり　ａｍＨＩ　！−除いて、場所は、チミジン長ｇ物の導入によって導入される。この９３０　ｂｐフラグメントは、純化されたゲルであり、及び、Ｘ！：＋ａＩ、及び、Ｂａ　ｒｎ　ＨＩと央に消化ｇｈな。それは、その時ＸｂａＩと共に以前に消化されたｐ　Ｍ　５１０−４にクローニングされ、及び、歩留りへのＢａｎＨＩば、ｐＭｓｌｏ−５をクローニングする。ｐＭｓｌｏ−５において配列は、結合されたプロモーター活動のためにＭＳＩＯ遺伝子を必要としなである度応した及びプロモーターが今あらゆる遺伍子にヒニーズがついていることができるそのようなそれを修正した翻訳開始点の前にＩｉ接、発生するＢ　ａｍＨＩ部位これら、及び、他の変態なしが発生したということが塩基配列分析によって確認された。Ｌ ■　゛貴千千　−゛　ル　ロニ　−〆レポ一　−；賃ｉ二　♂　ロニー　−解　翻″ｒ　休ｐ；ｊＳ　Ｉ　Ｏ−５（図３８）からＢａｍＨエフラグメント；での１８３０　ｂｐ　ＨｉｒｓｄＩ　Ｉ　Ｉｉ：、ｐ　Ｔ　Ａ　Ｋ１、以前にＨｍ　ｄ　工Ｉ　Ｉ、及び、ＤａｍＨｉによるガツトに結紮さｎた。ｐ　Ｔ　ＡＫ　Ｌは、２７＝櫂物転換ベクターＢｉｎ　１９（Ｂｅ　’ｓ’　ｌ　ｎ　、　二　９２ヨ　：、　ニミＥ　；　Ｎ　；　Ｃ！　Ｂ　二　ＣＡ　（二　、：　５Ｒａｓｅａｒｃｈ　１２８７１１）に基づき、及び、ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ　（ＧＵＳ）　レポーター遣云子、及び、Ｎｏｓ　３°　ターミネータ図　２４）を運ぶ。その結果生じるプラスミド（；、ｐＭｓｌｏ−６０ＵＳと称され、及び、ＭＳＩＯ遺Ｉヨ子のプロモーター、及び、ＧＵＳレポーター遺伝子の間で転写−的な遺伍子駐解を１　盲！−；い゛”ＪＢ−′起″ｒ　ヶを埠　煙亘　゛　許岨換え体ベクターｐｍｓｘｏ−６ＧＵｓＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　（ＬＢＡ４４０４）　（７）Ｅ、　Ｃｏ　ｌ　ｉ　（ＴＧ−２）から動員さｎたようにｐＲＫ２０１３にｉａさｆ６Ｅ　ＣｏＬｉ　（ＨＢＩＯｌ）を持つ仮免許プレート上のトリバレンタル仲間になることにおいてＴｒａｎｓｃｏｎｊμｇａｎｔｓは、カナマイシン（５０：、！ｇ／ｃｍ）、及び、ストレプトマイシン（５００！、ｔｇ／ｃｍ’　）を含む最小の煤買上で選択さｎな。５０、ｇ／ｃｍ’のカナマイシンを含むＬ−Ｂｒｏ：ｈ（ＯＣｍ　）　、ｉ：、シングルのＡｇｒ　Ｏｂａ　Ｃｔｅ　ｒ　ｌ　ｕ　ｍコロニーを予防接種された。一晩中培警は、１５０　ｒｐｍの震動によって３０′ｃで反長ざでらｎた。この”ｉｓ　ｌ　（５００Ｉ：ｌ　）　ｉ：、刀アマ１′シ：／　ＯＯｕｇ　／（７，）：含むＬ−Ｂ　ｒ　ＯＴ、ｈ、　ｉこ予Ｎ　ｍ種ざｉ、及び、収長ざてらｎ　ｉ＋よう：二前に使用の！ｆｉのｉａ掴−１−ｇｒｏｂａｃｔａｒ　ｉａｉ：、５分の３ｏｏｏ　ｒｐｍで系を紡ぐこと（ｍ；ってベレット−ざｎ、及乙ζ、＝しいボリュームの９億のＭ　ｕ　ｒ　Ｌ　Ｓ　ｈ、　、　ｉ　ｇ　ｅ、及び、Ｓ　ｋｏ　Ｏｇ　（ＭＳ）　Ｉこおいて懸濁さ７−した瞑買フィーダプレート）；、久のとおつに９枚の５に径ｐｈｉｒｉ皿において１傭そされた。６−ベンジル−アミノプリン（１ｒｒｒ　ｇ　／　ｉ　）　、及び、１−酢酸ナフタレン（Ｎ　Ａ　Ａ　）　（０、１二ｇ／ｌ）で補わｆ’−７’：固体のＭＳ媒質は、Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｒ：Ｌ　ｖａ、ｒ　Ｓａｍｓａｈ、懸濁液培看（１センチメートル）で−ｆｆｉ　Ｌ　ｉねれた。１９てンチメートル、及び、Ｌ　７　ＣｒＱ’）　ｋデノスク）；、表ｆに！かれた。ＥＬ″３させられた組織計１・もの全ての薄片植物Ｓ；、フィーダプレートクこｔかコーなプレート、；、ｒＮ＝ｓ　ｃｏｆ　ｉ工３４　（９％名）コ井に封そざｎ、及び、植物：長邪ま（羽るい室光＝９元の１の２．６゛Ｃ）に−晩＝卵を砲い一５フイーダブレートＤ−ちのｊ、ミ；；、１２でンチメートノシＩ径ｐ　５　ｆ、、＋　ｉ　ｆ：ｉ　に　Ａ　ｇ　；−００ａ　ＣＺ　ｅ　：　ｉ　ａ　ミ子　’ Ｌ　狂Σ　：二　】虻力ゝｎ、及び、１にぐ断ざ工な１５づンチメートルでクシジン薄片部分がフィーダプレートに戻ｃ”ｎた２ｏ分以降ζ長部屋で封をされた、及び、交換された成長余地における４８時間潜伏期の後で植物材料；；、６−ＢＡＰ（１ｒｎｇ／ｌ）、Ｎ−Ａ−Ａ（０，４ｍｇ／ｌ）、カルベニシリン（５００μｇ／ｃｍ’）、及び、カナマイシン（１００μｇ／ｃｍ）で襦われたＭ　Ｓ　３賞へ転送する（ｐｅｔｒｉ皿において）ｐｅｔｒｉ！は、封をさｎ、及び、膜長部屋へ戻った。 −Ａｇｒｏｂａｃｔｓｒｉｕｍによる接種後の３：Ａ間を始めて、発射は、外植片から除去され、及び、ｒｏＯｔｉｎｇのためのカルベニシリン（２００μｇ／ｃｍ’）、及び、カナマイシン（ＩＮ　ＯＯｔｔｇ／ｃｍ３Ｊ　）　でＭわれなＭＳ媒賀に置かれた。転換された植物は、移動後の１−２週間を定着させ７″：５根を下ろす、転換された植物は、土を含むポットへＥ送する、及び、温室において成長させられた。おおよそ植物が花で飾った移動後の１月、ｐＭＳ　１０−６０ＵＳ組立て体を含ｒＪ煙夏植物の巧は、原準手＃！ｇを使うＧＵＳ活動のなめに慣霧された。ト：ンドリアの様相そ抑制するために）（従って特！の選択ざｎた植物の十分な発現を分断ざでている）。従って我々）；、ターゲット植物組織において遺伍子発現を抑制する方法を提供する転換することを安定的によりなる　タイプの）物則し・ら全での植物；；、遣伍そ組立て体によって更生ざぜらｎてもよい経織−特異的の、或いば、開発− 特異ｎのプロモーターを運んでいるターゲット植物組織の細胞、及び、タンパク質をコード化下るディスラブタ遺伝子において作動する有能である発現されたとき前記のターゲット組織の細胞において呼′７Ｌを抑制することの細胞の死に帰着する好んで、ディスラブタ遺丁ミ子ｆ；、以下の中から選択される。（ａ）晴乳類の（通常ネズミ）茶色の脂肪質の組織からクローニングされる哨乳類の脱兵役タンパク質（ＵＣＰ（ｂ）変化させられた形のＦニーＡ　Ｔ　Ｐアーゼのβザブユニットのための遣伍子加えられる、或いは、削除さｎた配列を持つこｎらの変化が他のザブユニットと云に組み立てる能力の保持に帰着するそのようなそれしがし、Ａ　Ｔ　Ｐシンターゼとしての機會巨を妨害する三しく組み立てるなののこれらの変１！！ざｎなザブユニットの能力は、重要であるそれらの発現Ｖ志の必要とざｎｆ、：　ｐ　ｈ　ｅ　ｎ　Ｏｉ　ｙｐ　ｉ　Ｃな効果として荒野−タイプのサブ日ニットとの酵素における結合部位を巡るそｎらの競争に依存する複Ｇｉな。このように、非−機能的サブユニットを含む錯体に、ただ弱く活動的で、及び、こ１らのＲ１２に避難ざぜるミトコンドリアは、非−機能的である（ｃ）Ａｉ：、変化した合＝の形の万イノン１遣ミそＦｏ−ＡＴＰアーゼのサブユニット９をコード化する上で（ｂ）で示さｈたように、造られた突然変異（ｄ）度化させられた形のミトコンドリアの通過前−配列移動の生じることの間機能不全であるおそらくミトコンドリアへのタンパク質輸送の混乱における受容器部位のブロッキングによって（ｅ）大Ｍ［からイーストからのＸＸ−ザブユニット遺伝子、及び、ｂ６−ｇｌａｃｔｏｓ　１ｃｌａｓｅ遺伝子の間の融解を包含する遺伝子組立て体ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇな融解タンパク質の発現に帰着する好んで、プロモーターは、ｔａｐｅｔｕｍ−特異的のプロモーター、または、花粉−特異的のプロモーターであるその点で前記のディスラプタタンパク賃の発現に関して更生させられた植物が男性にあるように不稔の更に好んで、前記のｔａｐｅｔｕｍ−特異的のプロモーターは、添付図面の図１７．１８、または、１つで示された配列を持つ。本発明のこれらの遺伍子制ａＩ塩基配列の単離、及び、特抑制する方法を提供し、及び、遺伝子に基づいた植物細胞のＭ発Ｃ；、呼吸の機能を抑制するものを題み立てる。技術は、特別な細胞、または、組織の抑制が必要とされる多数の収攬における広いアプリケーションを持つ。詳芝のうちで、関二・：；、もどの場所でＥＬバー′ブ゛、′７７の生産のためのトワモロコシにおける雄稔性の抑制である。雄不捻のためのメカニズムとしてのミトコンドリアの機能の抑制の概念は、雄性不稔な発現型、及び、ミトコンドリアのｃｉｙｓｆｕｃｔｉｏｎの間の関連を示したトワモロコシ（ｃｍｓ−Ｔ）におけるＴ−タイプの細胞室の雄不稔のいくらかの前の研究から生じる。１［５的なに図の関係が今なおミトコンドリアの機能障害、及び、ｃｒｎｓＴの間で確立さｎなければならないが、証拠の１顎している団体は、その十分に機能的ミトコンドリアを提案する（特にｔａｐｅｔａｌな細胞において）木賃的であるこれは、ｍ　Ｉ　Ｃｒ　ＯＳ　ｐ　Ｏｒ　Ｏｇ　ｅ　ｎ　ｅ　Ｓ　Ｌ　Ｓの間衿；二重要であるので新陳代謝のｔ　ａｐｅ　ｔ　ａ　１な細胞に置かれる要求ミトコンドリアの数における４０−折る増加に帰着下るこのように、我々は、ｏｘｉｄａｔ　１ｖｅｒ：ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎを離すたのにミトコンドリアに作用下る多数のマイナスの只然変異を提供下る。！、！確にトウモロコシ巧組織において発現ミｎたと１、こｎらの只然変異（；、雄性不稔７′：発現型に帰着下る。提案さｎなディスラブタタンパク賀、ＵＣＰ清乳がの茶色の脂肪質のＭ’ｉａのｔ　ｈ　ｅ　ｒｍ　Ｏｇ　ｅ　ｎ　ｅ　Ｓ　ｊ　Ｓにオイて役二つ及び存在する陽子チでネルを形成する、及び、この−うにχを噴断する陽子Ｂ　！　６　ｏユニ〇　（ｈｅ？、　三ｃａｌな潜在的な差異の消散によってｏｘ、１ｄａｔｉｖｅなｐｈｏｓｐｈｏｒｙｔａｔ　ｉｏｎを離すミドコニ／トリアの内側の膜における二量体として代替は、領域が交換される空想的な遺伝子組立て体の使、用である（非−機會巨的タンパク質を造っている）。ここのターゲットタンパク賀ば、ＦＯ−ＡＴＰアーゼのＦ　１−ＡＴＰアーゼ、及び、ザブユニット９のＸ−ザブユニットである。機能的なＡ　Ｔ　Ｐアーゼ錯体のアセンブリの間、度！！された空想的ザブユニットは、特に、キメラが終わった（内生のものと比較すると発現さｎる）とき自然に発生しているサブユニットで通ｆ従事した部位を結合するために遺伝子を完成する。変更されたサブユニットと共に組み二てられるＦｌ、及び、ＦＯＡＴＰアーゼのものが弱く活動的でありそうである、或いは、非−機能的でるりそうであるので、ミトコンドリアの１１＝、分断する。植物細胞のｔｒｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎのために採用された方法は、２ｓ：発明ととりわけ密接な関係になく、及びトランスジニニツク植物ζ；、転換されたＥ胞からの耳竺によって獲得ざｎる。多数の転換手続きは、Ａｇｒｏｂａｃｔｓｒｉｕｍ　ｔｕ　ｍ　ｅ　：　ａ　Ｃｌ　ｅ　：’！　Ｓ　−、＊　ｚｉ；、その７ニプラスミドと使う土壌感染のような文献、ニレクトロポレーションから知られている植物細胞、及び、厘形質体のマイクロインジニクシ１ン、微量役＃を転換、及び、茹粉萱転換にんの２．３に！及するために参照）；、既知の方法の十分な詳細のための文献に巧われてもよい。今開発、テスト、及び、＊細胞の有機体におけるミトコンドリアの機能のディスラプタとしてのこれらの遺伝子組立て体の、イーストは、示される。こｎらの遺伝子が組み立てるものによるメカニズムは、植物細胞成長を抑制するために使われてもよく、及び、転換された植物の微分は、また示される。これらの手続きの呂的は、遺伝子の１詔、及び、ｏｐｔｉ　ｍ　ｉ　Ｓ　ａ　ｔ　ｉ　Ｏｎのなめにモデル系としてのイーストを使うことであるタンパク質を絞り出すためにミトコンドリアの機能を分断させるものを組み立てる植＠細胞は、その時そこから更生さぜられた選択さｎた組立て体、及び、全ての植物によつて転換さｎる。モジニールの特異的の冥施例は、次のＥｘａｍｐ工ａで今伊！証される。伝− である知ら几ているからレポートにおいて文献そ７″Ｌ挿入されたネズミＵＣＰ遺伝子イーストｃｏｔｉシャトルベクターは、のみＵＣＰの発現の低いレベルを与えたイースト）；、Ｓ　ａ　ＣＣｎ　ａ　ｒ　Ｏｍ　ｙＣｅ　Ｓ　Ｃｅ　ｒ　ｅ　ｖｉｓｉａｅ細胞株ＹＭ１４７であり、及び、ＵＣＰ遺伝子は、プラスミドｐＣＧＳ　１１０−ＵＣＰ上で利用可能であった。野生のタイプ遺伝子による有益な発現レベルの欠如を行う示された部位を使うネズミＵＣＰ遺伝子の度態突然度異生成は、実行された次の修正は、行われた１、ＢａｍＨＩ部位７ヌクレオチドの導入ＡＵＧ　メチオニン開始コドンへの５ °　；２、イーストコンセンサス配列ＡＴＡＡＴＧに一致させるためのＡＵＧ　メチオニン開始コドンの周辺の配列の変態；３、内部のＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　＠位のＩＩ＋除４、ＢａｍＨＩ部位ものの導入ＴＡＧ終了コドンへのヌクレオチド３゛これらの変態は、メチオニン開始コドンのイーストコンセンサス配列の導入と同様に、翻訳されないＳｏ、及び、３°ネズミＵＣＰ配列の削除に帰着する。ＧＡＬＩ○プロモーター領域を維持するプラスミドｐｃＧｓ１１０−ＱＣＰ　（プラスミドのマツプが図２６に示され、及び、、　Ｕ　ＣＰ遺伝子のｍＲＮＡ配列が図２７に示される）、及び、ネズミＵＣＰ　ｃＤＮＡからの１．９ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ　／　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉフラグメントば、Ｍ１３ｍｐ１９　ＤＮ　ＡのＥ　ｃｏ　Ｒｒ　／　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ部位にクローニングされた結果市組立て体の配列；；、三しい組立て体を保証するたのに、貢行された。示されな交然変異生瓜を置く次のとおりに３の異なるオリゴヌクレ１チドそ便うＡｍ　ｅ　ｒ　Ｓ　ｈ　ａ　ｍ　（甜１名）只然変異生成キットにおいて手えられた方向に従って貢行された：ＵＣＰ−１の野生のタイプ医然変異体ＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＣＧＡＧＣＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣ坦扛江（ＡＴＡＡＴＧ）ＧＴＧＡＧＴＴＵＣＰ−２の野生のタイプ突然変異体ＴＧＣＧＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＧＡＣＴＣ匹：工ＣＴＧＧＡＡＣＧＴＪＣＰ−３の野生のタイプ突然ｇｒ：異体ＡＣＣ，ＩＣ，ＡＴ、ＡＧＧＣＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＴＡ釘ム１Σ−ＧＡＣＴＴＧＧＡＧ万リゴヌクレ万チドすＣＰ−１は、ｆ３　ａｍＨＩ　Ｎ開邪泣（アンダーラインを引かれる）の導入とＦ［に、約メチ万ニン開始コドン発生ずるイーストコンセンサス配列（デボそつけられる）を導入するたのに使われた。万り、ゴヌクレオチドＵＣＰ−２は、内部のＢ　ａｍＨ！部位（アンダーラインを引かれる）を削除下るたのに匣ゎれた。万すゴヌクレ万チドＵＣＰ−３は、ＴＡＧがコドン（アンプーラ１′ンを引かれる）を止めた後で、即座にＢ　ａ　ｍ三ヱ場厨そ導入するなのに・夏コれた。こｎらの３つの突然度異は、０．９３　ｋｂ　Ｂａｒｒ＋−Ｈエフラグメント上で配列をコード化する全体のＵＣＰの＊離を許した。突然変異体クローンの選択の後で、修正されたＤ　Ｎ　Ａ　ｉ！、ＢａｍＨＩと共に消化さｎた。選択さｎる２ｏからの３つのクローンは、ＢａｍＨＩによる消化に関する０、９３ｋｂの挿入を行った。塩基配列決定さるの明らかにされたＵＣＰ遺伝子が正しく修正されたＵＣＰＳＩ、及び、ＵＣＰＳ４をクローニングする不必要なに化は、現れるＵＣＰ遺伍子ば、その時イースト発現プラスミドｐＫＶ４９まで転送する強いＰＧＫプロモーターのコントロールの下のＳ、ｃｅｒａｖｉｓｉａｅにおける外来の遺伝子の発現、及び、外来の遺伝子の誘導／抑制を註丁ＧａＬＬ−１０ＵＡＳニー許丁ガラクトースが放炎媒質に存在するかどうかによれば修正されたりＣＰ遺伝子を含む０．９３　ｋｂ　ＢａｍＨＩ７−ｙグメントは、ＢｇｌＩＩ制限場所ｉ：ｐＫＶ４９にクローニングさｎた（組立て体ｐＫＶ４９ −ＵＣＰに帰責している）６１）！、ＣＶ４９〜ＵＣＰ組立て体を持つイーストのＥ換ａ）適切な酵母百株の開発ｐｋｖ４ｇ〜ＵＣＰのためのレシビニントのために我々が適切ｔマーカを運ぶイースト細胞株を必要とした組立で体Ｅｚ、及び、考：Ｋ　丁６　Ｇ　−Ａ　Ｌ　Ｌ　−’＝　ＯＵ　Ａ　ｓ３．賀からの遺伝子発現の誘導炭素、及び、エネルギーソース（ＧＡＬ、１、Ｇ　Ａ　Ｌ　２　）としてのｇｌａｃｔＯ９ｅ：別層することができないそのような細胞株（；、イースト細胞株ＹＭ、１４７、及び、５Ｆ７４７と仲間になることによって発生させらｒした、ウラシルを含む最小のプレート上の二倍体の選択の後でコロニーは、媒質ｅｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇすることへ転送する。その結果生じる胞子は、特徴付けらｎつつある（図２８）その結果生じるイーストコロニーの前のＹＤＰプレート上で成長さぜられな。２の新しいイースト細胞株ＢＥＴ９　（ｕｒａ３、ｔｒｐｌｌ、１ｅｕ２、ｈｉｓ３、ｇａｌｌ）、及び、ＢＥ２７　（ｕｒａ３、ｔｒｐｌ、１８１１２ｇａ　１１）を；、分離さｎな双方共の基づいなＰｋＶ４９によるＥ換に還轟である組立て体。ｂ）酵母（イースト）転換イーストＥ胞ａＢＥＴ９、及ヒ、Ｂ　Ｅ　２７　ｉ：、ｐＫＶ９、及ヒ、ｐＫＶ４９−’ＵＣＰ　ＤＮＡと共にＥ’Ａｇｔｔた：形質転換細胞は、選択され、及び、制限マツピングを幀えているプラスミド単離によってチェックさまた（適切なａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃな選択（レウ）ソミウている）各々の４の異なる形賀Ｅ　ｊｌＡ　ａ　ｍ　Ｂ　Ｅ　Ｔ　９　／　ｐ　Ｋ　Ｖ　４９、ＢＥＴ９／ｐＫＶ４９−ＵＣＦ、ＢＥ２７／ｐＫＶ４９、及び、３　Ｅ　２７　／　ｐ　Ｋ−ｙ″４９−　Ｕ　ＣＦ　）　’：’：’　ラ’：’ｊ　シンクルのコロニーである懸濁するにおいて存在にそしてまたガラクトースの久四に様々な炭素ソース図２９）を含むｐｌａｔｉｒ＋ｇな媒質で汚される前の不稔の水これらのプレートテスト図　２９）がらの結果は、使われる炭素ソースのうちの２．３上でそｎを示したガラクトース及びｐＫＶ４９−ＵＣＰ組立て体の存在（＝、その結果生じるイーストコロニーの更に貧しい成長に帰着した成長の遅延への更に大きい影＠Ｉｔ、双方のｐＫＶ４９−ＵＣＰ形質Ｅ換細胞のためのｇｌａＣｔＯ８ｅを含むグリセロール／ｃａｓａｍｉｎｏ　（ｇｌｙ／ｃａｓ）媒質によってｗＬ察された。ＵＣＰ遺伝子を欠く形′ＸＥ換細胞〜或いはガラクトースによって引き起こされる、同じレーｂ″Ｃ−成長したようにＥ：換されないＢＥＴ９、及び、ＢＥ２７紀胞株成長曲線分析ｐｌａｔｉｎｇなテストがガラクトースのある所でのｇｌ　ｙ／Ｃａ　Ｓ媒質上でｐＫＶ４９−ＵＣＰ形賀Ｅ　Ａ　４６１　’ｍの貧しい成長を示したので、液体の培養における成長白線せ析は、成長欠陥の大きさを更に正確に決定するなめに、売行さｎた。図３０における結果は、めっきテストの結果を代用下る及び示すということどちらもだげｐＫＶ４９−ＵＣＰＤ　Ｎ　Ａ　、まＺ　Ｌ、ガラクトースの存在は、イースト拍、抱反長＝へのあら：ｐる影響を芽つのに子分である、−万、双方云の存在は、成長ｆ／厳しく遍らぜる組立て体ｐｃｃｓ　Ｌ　１０−ＵＣＰと共に転換された。・−スト細胞株ＹＭ１４７を使う我々の最初の結果が電要を成長欠陥をガラクトースのある所での試験された炭素ソースのうちの少しも全く示さなかったので、ＵＣＰ遺伍その変態、かつ、また）＝、異なるベクター（ｐＫＶ４９）の使用が目に見える成長欠陥に帰着したと、テ、ねれるであろう。分析、または、ＵＣＰ発現成長白線分析がＢＥ２７、及び、ＢＥＴＱ形賀Ｅ換Ｅｌ胞図　３０）の間の検出 −できる差異を示さなかったので、次の笑殺におけるＢＥＴ９形質転換細胞を使うことがただ決定された。ガラクトースの存在、及び、欠如におけるｇｌｙ／ｃａＳ媒′ｉＬ双方共上の反復成長分析は、ＢＥＴＱ形賞転換細胞と共に売行さｎた。培養（＝、４７時間が以前に図　３１）観察さｎ７′−同じ成長曲線特性が繰り返ざｎたことを保証するたのに、ミ長することを許された。その２時細胞：；、収攬され、トータル細胞タンパク質は、分Ｄ　”　ｎ、及び、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって１０％ポリアクリルアミドゲルにｆｒ　ａ　Ｃｔ　ｌ　Ｏｎ　ａ　ｊ　ｅ　ｄ　＠　ｌ”−ｒ＝（復製；こδいて）。一組のｆ　ｒａｃ　ｔ　ｉ　ｏｎａｖ−され２タンパク質タンパク質の＝；−いニーディングを保証するｔのに、Ｃ，ＯＯ：’：’。ａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅで汚ざｎたもう一方のセットの闇にナイロン膜へ転送する及びネズミＵＣＰ抗体を使う分析を西洋の５乙にさらした西洋の汚れは、２つの主な特徴を示した１）ＢＥＴ９／ｐＫＶ４９−ＵＣＰ形質転換細胞、及び、ＶＹ　ｌ　４７／ｐＣＧＳ　１１０−ＵＣＰ形賀Ｅ：換細胞の間のＵＣＰ発現の比較レベルは、ＵＣＰ発現が約５０−１００を増大したことを明らかにする我々の変態の結果としての折り目２〕またガラクトースのある所でのｇｆｙ／ｃａｓｇｆ上で成長させられたとき、欠陥のある成長を示すイースト形賞転換細胞は、本貫的な量のＵＣＰを発現する。である結ぶからこれらの結果ということＵＣＰ遺伍子の変態、かつ、または、ｐＫＶ４９ベクターへのその次のクローニングｐｃＧｓ１１０−ＵＣＰと共に初めに検出されたレベルと比較してＵＣＰ発現の増大されたレベルに帰着した組立て体成長白線分析は、ＵＣＰの発現があるコンディジ目ンの下で成長させらｎなイースト細胞の崖長率への影ｇを搾つこ、とそ示す。今までのところでは、我々は、ＵＣＰ発現の１大ミｎだレベルがイースト細胞成長＝に関して持つ特異的の効果を確認することができなかった、し乃１し、予備の店果（＝、ミトコンドリアの欠陥そ豐き込む。ガラクトースの存在、；た：；、久＝においてζ長し一３ＥＴ９形賃ｓｌ：換Ｅｌ胞のラフィノース媒質（Ｇａｌ規則に影響するべきでない酵素−的な炭素ソース）において冥行された成長曲線分析ＵＣＰ遺伝子及びガラクトースの存在が成長ｚ図　３２）への影響を持たないことを示すこれらの成長曲線の間に収攬された細胞から分離されたタンパク賃の西洋の汚れ分析は、ＵＣＰ発現のレベルがガラクトースのめる所でのｇｌｙ／ｃａｓ媒質において成長させらｎた：５胞において発見されたそれらと同様であると明らかにする。力口えられたガラクトースなしで成長しなりＥＴ９／ｐＫＶ４９−ＵＣＰ形質転換細胞において検出されたＵＣＰは、おそらくラフィノースの加水分解による媒賀にリリースざｎだガラクトース残留物が濃口である或いはａＵｔＯｃｌａＶｉｎｇすることの間のこれらの観測は、酵票−的な炭素ソース（ｏｘｉｄａｔｉｖｅなｐｈｏｓｐｈｏｒｙｔａｔ　ｉｏｎの必要条件なし）上で成長させられたイースト細胞におけるＵＣＰの存在が細胞成長１への影響を持たないことを示す、−万、Ｕ、ＣＦ’に発現するｇ　ｌ　ｙ／ｃ　ａｓＥＥ賞（非−ｆｅｒｒｈｅｎｔａｂ　［ｅ炭素ソース）上で成長するＥ胞（＝、欠陥のある！長？示す。イースト細胞に８けるＵＣＰの：ｊ！所ネズミＵＣＰは、茶色のＥＷ肪賀の組織のミトコンドリアの内側の漠のメジで一：、″ζ分である。内側の漠において発見された多くの他のポリペプチドと異りそれば、ｃ　ｌ　＝ａｖａｂ　１　ｅな１号配列を含まないタンパク賀のアミノ酸配列の中で内部でコード化さｎつつあるｔａｒｇｓｔ　ｉｒｑｇしている清報状々の結果が発現さｎたＵＣＰが効果を持っていることを示すのでイースト細胞成長のレート、そして、それイースト細胞において発現されたタンパク賀の正確な＃ｈ所を決定するために、重要である全体のミトコンドリアのタンパク質の最初の西洋の汚れ分析は、ＵＣＰがｐＫＶ４９−ＵＣＰ形賀耘換転換細胞ってミトコンドリアの留分に位置するために発現されるのを示す。次のミトコンドリアの分別は、ＵＣＰの大多数がイーストミトコンドリアの内側のＦｘｇｊ分に位置することを明らかにした。いくらかのＵＣＰが更に内側の一膜スペースに位置するように思われるが、このｉｊ　６ｆｉは、多分いくらかの内側の漠留分を持つこの留分の汚染が厚因である。ｌ！ｌｓの結果は、イースト細胞ミトコンドリアから複雑なＦｌ、−ＡＴＰアーゼのＸ−ザブユニットの場Ｍによって獲得された。内側の膜の成分であるＸ−サブユニット）；、我々のインター−膜スペース製剤においてまた検出される。しＤ１シながらこｎらの結果）；、ネズミＵＣＰの田のｔａｒｇ＝：ｉ、′：ｇ二でいる１報、ヅターデソ、−；二÷分でゐろことそ示すそれが機能下るであろうイーストミトコンドリアの内側の膜へのＵＣＰ不−刀グラタンバク買ＵＣＰ写し分析ＲＮ　Ａ　Ｖ、、多数の：ｉ長ヨ線夷験から分離さｎた以前に記述した我々に、ＵＣＰ発現のパターンがＵＣＰ写し１号に郵って反映される力１どうかそ決定するために、現在上の汚れ分析を貢行している。ＵＣＰ発現に関するコピー数の効果イースト２　ｕｍがらの複写の起源を含むシでトルベクター″ｆ持つイーストＭ胞の転換ｐＫＶ４９−ＵＣＰのようなサークルは、細胞につき約４０−５０部に存在するこれらのプラスミドに帰着下る従ってプラスミドによって運ばれたあらゆる外来の遺伝子）；、比Ｖ的高く同じに；在するコピー数外来のタンパク賃の発現に帰着してもよい更に高いレベルでより低いコピー力に存在する遺伝子のなめに見らｎるであろう我々それ？統合下ることによって’ＵＣＰ遺ミ子のコピー数を下げることそ従って試みた遺伍学上安定したｓｉｎｇ＋、ｅ−ｃｏｐｙ形質Ｅ換細胞に帰着下るシングルの場ル〒のイース′、−染色体に公り”ｙ−ＹＩｐ５Ｗ　３３）ｆ：、ｕ　ｒ　ａ　３遺（Ｅ−Ｆ−ｆ６運ぶｉｎｔｅｇ：”ａｔ　ｉｒｒｇイーストベクターである。−′−ストクこおいて自治 −的に′ＦｊＬ巳することは、できない。ＰＧＫブ＝モーター、ＪＡ、１．、：、、、　。、、ゐこオ、−７、いミＵＣＰ遣Ｃ云子を含むｐＫＶ４９　ＵＣＰからの１，８ｋＬ＋　ＥｃｏＲＩ／ｓａｌエフラグメント番；、ＹＩｐ５ＤＮＡのＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｓ　ＡＬ　Ｉ部位にクローニングざｎ階結果北なプラスミドＵＩ？＝ＵＣＰ図　３３）は、制限酵素マツピングによってＵＣ？遣伍子が正しく挿入さｎたことを保証するためにチニツクされた。Ｙ　Ｉ　Ｐ−ＵＣＰプラスミドは、制限酵素ＥＣＯＲＶ（ｗｈｉｃｈ　ｖ　ｃｖｔｓ　ｉｎ　ｔｈｓ　ｍ１ｄｄｌｅｏｆ　ｔｈｅ　ｔＪＲＡ３　ｇｅｎｅ［３３）と共にカットされ、及び、Ｊｉｎｅａｒｊｓ−されたＹＩＰ／Ｕ’ＣＰ　ＤＮＡは、イースト細胞ラインＢＥＴ９、及び、ＢＥ２７：転換するたのに使２’：ｌ　２’Ｌ　；３形賀Ｅ換ｌＥｉ、Ｚは、ワラシルプロト−トロフィーのこのの、及び、７−１０日２形ｊｊ　Ｅ換細胞後のセレクテノングによって各細胞ラインから最小のプレート上で初のに選３す（”　ＦＬ　Ｔ：Ｙ　Ｐ　Ｄプレート（非−選択的な）で筋をっ（アられた形質Ｆ、換細胞は、その時非−遍択的媒賀上の成長の４の配列した期間に支配さｎた。各々の７リジアルの４形Ｘ　Ｅ喚芝胞子らの１００のコ＝ニー１；、非−１択的な（Ｙ　Ｄ　？　）そしてまた選択ｎな瞑貫（最小の植物÷＊ｕｒａ）でのっきざｎたその時レブリカであった。全ての二二ニー；；、し゛三Ａ３遣；ヨそ（ｉｌｌミ学’＋　ＴＪ　（：　Ｐ遣伍子図３３）と：ＪＬ給される）がイースト細胞染色体に統合さｎたことを示す選択的な媒質上で成長した。Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡは、各々の４形’Ｘ　Ｅ　Ａ細胞から分離さｎな（制限酵素ＥｃｏＲＩと共に消化される、及び、０，０８％ａｇａｒｏｓｅゲルにｆｒａｃｔｉｏ、ｎａｔｅｄされる）。会頭されたＵＣＰプローブを使う肩の汚れ分析は、ＵＣＰ遺伍子が全ての４形質ｆ：換細胞のイースト染色体に存在することを示した。ネズミＵＣＰ抗体を使う西洋の汚ｎ分析は、これらの形質転換細胞におけるＵＣＰ発現のレベルを示す。ガラクトースのある所で成長させられたこれらの形質と換細胞の成長曲縁分析は、そｎもがミトコンドリアの矢引３Ｆ　ｉ　ｘ　ＡＴ　Ｐ　ＡＳ　ＥのＸ−ザブユニットのＦ態我々がミトコンドリアの＠能に影響するｌ　ｎ　ｔｒ　ＯＱ　ｕｃ　ｉ　ｎ　ｇ　ｆ：突然Ｋ　Ａ　；ｉ−で乗った第２のアプローチ発現された。とき、１′−ストがＡＴＰの巨崖？妨害すると予：ｊ、１されるであろう機能的なミトコンドリアのタンパク質の示さｎた度態であるこのアプローチに選ばれたタンパク貫（＝、ＦＸ−ｒへＴＰアーゼ錯体のＸ−サブユニットである。 −′−ス、・：＜−アブユニ７８遣モ子のＤＮＡ塩基配列；；、知られており、及び、遺伝子；；、我々の研究室９１８）に独立してクローニングされた、及び、塩基配列決定さられな。ターミアルのものが踏み土ずＡＴＰシンターゼ触媒作月のｏｘｉｄａｔ　ｉｖｅなｐｈｏｓｐｈｏｒｙ　ｌａｔ　ｉ。ｎ　ＦｌのＦｘＡＴＰアーゼ邪分ば、斧、ｂｘ、Ｃｘ、ｄｘ、及び、元配偶者と称された５つの異なるポリペプチドのアセンブリである。Ｅ、Ｃｏ１１からのＦＩＡＴＰアーゼのｘＩ−サブユニットのＦ態に関するＰａｒｓｏｎａｇｅ他によって寅行された英検は、ＡＴＰ合成及び加水分解の触媒作用にとって非常に重要であるように思われるＸ−ザブユニットの特異的のアミノ酸残留物を確認した。特に２つの突然度異は、Ｆｌ−ＡＴＰアーゼのメジマーな組立て体上の動揺を引き起こさずに非常に損なわｎた触媒作用に帰着すると示された。これらの突然変異の１つ起因するから位置の触媒のｎｕｃｌｅｏｔ　ｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇＧＩ域において発生する強く保存された１ｙｓｉｎｅ残留物をＦえる１５５〜１　、ｇｌｕｔａｍｉｎｓ残留物時間もう一方の突然変異は、位置２０９にメチγニン践留物を変えること乃１らロイシン残留物ごとまで起因しなこれらの突然変異の双方共、Ｆｌにおける触媒のＣ００ｐ　ｅ　ｒ　ａ　ｊ　ｌ　Ｖ　Ｉ　Ｚ　ｙから必要とｇ　ｈ　７′：確認−約な変化の防止によってそ２ｔらの効果とス：；丁２のに、！；１と、を複雑なＦｌ−ＡＴＰアーゼへのこれらの変化させらｎたＸ−サブユニットタンパク賀のアセンブリが影響されないので、その時、イーストにおけるＸ−ザブユニットの閏様の突然Ｅ異体がＦＬ−ＡＴＰアーゼへのアセンブリを競うであろうということが考えらｎた。同じＦＬ−ＡＴＰアーゼにおける双野−タイブのそしてまた変化させられたＸ− サブユニットを持つことの結果がおそら＜　Ａ　Ｔ　Ｐ生産における減少に帰着する損なわｎた触媒作用、及び、遅らせられた細胞成長に帰着するであろうということが考えられた。多種多様なソースからのＦ　１−ＡＴＰアーゼのＸ−ザブユニットは、示されたそばへ高度に、Ｅ、　Ｃｏ！ｉからのそれによるＳ　ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ　ｘ −サブユニットアミノ酸配列のアミノ酸配列、及び、比較で保存されるＰ　ａ　ｒ　Ｓ　Ｏｎ　ａ　ｇ　ｅ他によってＰｉ媒の活動にとって非常に重要であるなめに示された’　３’　Ｓ　ｉ　ｎｅ、及び、メチオニン長ｇ物がｉ＝さｎることをＦｉｉｌＸする。Ｉｙｓｉｎ＝、及び、メチオニン残留物に関してイーストｘ−７ブユニツト上で各々位！１９６、及び、２５３で発二する配列図　３４）ＳＤＭを冥行するなめにイーストがらの荒野−タイプのＸ−サブユニット遺伝子がプラスミドｐＯＲ２０８から分離ざｎたＭｌ　３ｍｐ　’、９にクローニング５ｎた己ＣＯＲ：　／　Ｂ　ａ二五：フラグメンごとして２つの変化させられたＸ−サブユニット遺伝子；；、組み立てられた゛突然度異体ＢＢ１は、Ｍｅｔ２５５及び突然夏異体ＢＢ２がｇ　ｌ　ｕ　ｔ　ａ　ｍ　１　ｎ　ｅ突然度異図　３４）にｉｙｓ　ｉｎｅのみ待つ、と同時に、各々１ｓｏｌｓｕｃｉｎｅ、及び、ｇｌｕｔａｍｉｎｅに変丸られりＬｙｓ１９６を井つ。不必要な突然変異なしで正しい突然変異生放に＠証するたのの塩基配列分析Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ変化さぜらｎたＸ−サブユニット遺ｆ＋は、ＥｃｏＲｒ／８ａｍＨＩ揖要によってｒｒ１ｐ１９から除去された遺伍そを含むフラグメントは、その時鈍く−終えられ、及び、消化されたＢＧＩＩＩに結紮された以前に鈍く−終えられなｐＫＶ４９図　３５）我々は、ｐＫＶ４９　ｐＫＶ４９−ＢＢｌ、及び、ｐＫＶ４９−ＢＢ２＞にクローニングさｎるＸ−サブユニット遺伝子を双方共度化させたそして、双方のこれらの組立て体によってイースト細胞株ＢＥＴ９を転換した双方の変化させら＊　ｆ：　ｘ−ザブユニット形質ｆ：換日胞からの成長曲線、及び、プレート成長（；、形質転換細胞が同時に、変化させられたＸ−ザブユニット遺伝子による細胞株ＢＥＴ９の転換に関して、遣伍子浬乱は、Ｘ−サブユニットを合成することがでξない旧胞株Ｂ　Ｅ　Ｔ　９の誘導体を組み二てるたのに便２’）　２’−ても；い。結果市細胞株は、従ってそれがグルコースのよう７．：酵素−的な炭素ソース上で疑いなく維持できるが、非−ｆａｒｍｅｈｔａｂｌｅ炭素ソース上で成長す炭素ソースミない。形質転換細胞を、ｊＩ定し従えている変化さぜられなＸ−サブユニット遺伍子を持つプラスミドによるこの細胞株の転換に、非−ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅａ素ソー　ス上ｆ７）　ｍ長持性である五更されたＸ−ザブユニットがｏｘｉｄａｔｉＶｓなｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：支持することができないことを示す例４融解タンパク質ミトコンドリアの機能を選択的に不ヂにさせるなのの代瞥戦略は、融解タンパク質の発現であるどちらにでも帰着する貧しい或いはイースト細胞成長なしこのプロジエクトから選択されな候Ｍ看融屏タンパク賀ば、大腸菌から大部分のｓ−ｇａｌａｃｔＯ３１ｄａｓｅまで溶かされたイーストＡ　Ｔ　Ｐシンターゼχ−サブユニットのＮ−ターミナルａ域を含み、及び、遺伝÷融解図　、３６）によって組み立てられた。このＸ　−Ｓ　ｕ　ｂ　ｕ　ｒ’、　Ｌ　ｉ　／　Ｘ　−ｇ　ａ　ｌ　ａ　ＣＣＯＳ　；　ｄａｓｅ融解タンパク賀に、既にイーストミドコンドリア９２１）の内側の漠に的を絞らｎると示され、及び、この融にタンパクＴＬそ絞り８丁細胞１；、非−ｆ　ｅ　ｒ　ｉＴ！　ｅ　ｎ　ＥａＯｉａス素ソース二で、と長することができな−）ように思われる。Ｈ５タンパク質のある所でミトコンドリアの漠の１ｒａｎ　Ｓ　ｄ　ｕ　ＣＬ　ｎ　ｇ　している−？〒バシティ３２−Ｐ−ＡＴＰ２換反応によって測定さｎたように融にタンパク質がない時１：　ｊＪＪ定されたそれのわずか９％である今までのところでは、この説明のメカニズム）；、ｐ　５　ｇルなかっな、しかし、遣伍子融屏は、内側の漠に閉じ込められる状態になるタンパク質を生むと考えられ、及び、呼吸の成長に不可欠なｆｕｎｃｔ　ｉｏｎ　（ｓ）を妨害プラスミドｐＧＲ２０Ｓ　Ａ　Ｔ　ＰシンターゼＸ−サブユニット道伍子図　３４）をコード化するイーストＡ　Ｔ　Ｐ　２Ｄ　Ｎ　Ａを含むＥｃｏＲＩプラスＸ−サブユニットタンパク質の最初の３５０のアミノ酸のための１．ｌｋｂフラグメントコーディングのリリースに帰着するＢ　ａ　ｍ　Ｈ工と共に消化されたｐＭｔＴＲＬ７２０は、基づいたｐＵＣ８であるＥ　ＣＯＲ１／ＮａｒＩフラグメント図　３６）の中に含液れるＬａｃｊ遺伝子を含むプラスミドｐＭ　Ｕ　Ｆ−１７２０（Ｂ　３６　Ａ　）のＥｃｏＲ１／Ｂａ二Ｈ１部位へのイーストＸ−ザブユニットタンパク質の！！初の３５０のアミノ酸のｋめの１ｌｋｂ　ＥｃｏＰ−ｒ／Ｂａｒｒ＋、Ｅ（ｌ　ＤＮＡフラグメントコーディングのクローニング：；、：（−丁ブニニノ′−の３巴○のアミノ酸Ｃ賀Ｃ不−フレーム融解、及び、全体の（最初の８つのアミノ酸そ引いて）ＬａＺタンパク５Ｌ図　３６）に帰着下る。全２のχ−５ｕｂｕｎｉ＝／ＬａｃＺ遣伍子ｅ　ｆｉｇ　；：１．組立て休ｐ　Ｍ　Ｕ　Ｐ−１７２０−Ｂ　Ｌ　２図　３６）にお：する４３ｋｂ　ＥｃｏＲＥ／Ｎａｒｌフラグメントに今含ま７′ＬＬこの４．３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＮａｒＩフラグメントに、現７Ｅ　ｐ　Ｋ　ｖ　４９−　Ｂ　Ｌ　Ｚに帰着下るｐＫＶ４９ベクターにクローニングされつつある組立て体図　３７）イースト細胞株ＢＥＴ９、及び、ＢＥ２７を転換するために使２−）ｎることができる及び示すミトコンドリアの抑制と一致しているガラクトース成長只ム１によって引’Ｗ　２こされたとき、起こるということ例５Ｍ５ＩＯ遣伍子、及び、ＵＣＰ遺伍その間のブ：モーター融解の組立て体ｐ　Ｍ　Ｓ　１０から３　ａ　ｍ　Ｈｌフラグメントまでの１８３０ｂｐ　ＨｉｎｄＥＩ工ｉ：、Ｈｉｒｘｄｒ　Ｉ　１．及び、Ｂａｍ、五１と云に以前にカットさｎた２元植物耘喚ベクターＢ１ｎ１９にだ紮ざｎたつＦＸ　紮Ｆ　Ｏｌ　ｌ　ＯＷｌ　ｎ　ｇ　ＦＡ果的プラスミド：；、Ｂａ、、、９１と六にコツトざｎ、及び、ン［ＳｉＯ遣にそブ＝モーター、及び、ＵＣＰ遣伍その間で融解を組み：てるたのに、プラスミー″から：）”：Ｃ？　Ｂａ二五二フラグメン（を９３０　ｂ、ｐ＋、：ｐＵＣ／ＵＣＰ　（ｓ　ｐＵＣ１９ｃ　。ｎｔｙａｉｒ＋ｉｎｂｇの誘導体ＢａｍＨ１場所にクローニングさｎる疹二されたＵＣＰ遺伝子）結紮した最終的に、ベクターｐ　ＴＡ　Ｋ　１からの２５０　ｂｐ　Ｓｓ　ｔ　１−ＥｃｏＲ１フラグメントとしての獲得ざｎたｎｏｓ　３° 　ターミネータ（よ、以前にＭＳＩＯ−ＵＣＰｆｆｌ立て体へのｐｂ　Ｉｉｇａｔｅｄであった（ＳｓｔＩ、及び、ＥｃｏＲｌと≠にカットされる）。その結果生じるプラスミドは、ｐＢ　ｉ　ｎ／ＭＳ　Ｉ　０−ＵＣＰ図　３９）と称され、及び、ＭＳＩＯプロモーター、ＵＣＰ遺伍子を含む設置された間にｎｏｓ　３　ターミネータ発現カセットあちこちへ効率的転換を理工細胞に許すＡｇ　ｒ　Ｏｂ　ａ　Ｃｔｅ　ｒ　ｌ　ｕｎ　Ｔ−ＤＮＡの境界配列例６ｐＢｆｎ／ＭＳＩ○の更に這い遺伍子組立て体を持つ煙草植物のＶ、換組換え体ベクターｐＢ　ｌ　ｒｒ　／　Ｍ　Ｓ　ｉ　０−ＵＣＰ　＋：、、ｐｌＫ２０１３に避難すせるＥ、　Ｃｏ１１（ＨＢｌｏｉ）と井、に仮光許プレート上のトリバレンタル仲間になる二とにおけるＡｇｒ　Ｏｂａ　Ｃｔｅ　ｒ　ｊ　１．Ｊ　ｒＴｌ　：　ｕ　ｍ　ｅ　ｉ　’ｃ　ｉｅｒ＋ｓ　（ＬＢＡ４４０４）のＥ、Ｃｏ１１（ＴＧ−２）　ｖｌら動員ざｎた。Ｔｒａｎｓｃｏｎｊ、＝ｇａｎｔｓｉ：、カナマイシン（５０＝ｇ／ｃ二′）、１び、ストレプトマイシン（５００μｇ　／　ｃ　ｒｎ　）を含ｔＪＲ小の媒質上で選択された。５０　ｇ／ａｍ’　のカナマイシンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（５ｃｍ）は、シングルのＡｇｒＯｂａＣｔ　ｅ　ｒ　ｉ　ｕｒｒ！コロニーを予防接種された。一晩中培養は、１５０　ｒｐｍで震動することに−って３０’ｃで成長さぜらｎた。この’！！（５００ｕｌ）は、カナマイシン（５０ｕ　ｇ／ｃｍ）を含むＬ−Ｂｒｏｔｈに予防接種され、及び、故長ざぜられた以前と同様に使用の前の亘ｉ−Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａは、５分の３０００　ｒｐｍで糸を紡ぐことによってベレット−され、及び、等しいポリニームの液体のＭ　ｕ　ｒ　ａ　ｓ　ｈ　ｉｇ　ｅ、及び、Ｓｋ○Ｏｇ（＆ｉＳ）において懸濁された瞑質フィーダプレート）；、次のとδつに９センチメートルＩ径ｐｅｔｒｉ皿において！１ＩＩＩＮをされた。６−ｂｅｎｚｙｌ”ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ　（ｌ　ｍｇ／ｌ）、及び、１−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃ＝ｔ　ｉＣ酸（ＮＡＡ）（０，１ｍｇ／ｌ）で補ねｈ　ｆ：　’ａ　体のＭＳｇ賀は、Ｎ　Ｉ　ＣＯｉ　ｌ　ａ　ｎ　ａ　ｔａ　ｂ　ａ　ＣＵ　Ｔｒ　Ｖｌ　９センチメートル、及び、１７ｃｍろ耘デ・・スフは、表土に置かれた。組ｋｇ培警の成長した植物からの全ての薄片は、フィーダプレートに！かｎ　７ ’＋　１１プレート９；、ｒＮｅｓｃｏｆ　ｉ　１ｍＪ　（商凛名）と共に封をさｎ、及び、植物成長部屋（明るい蛍光性の光の下の２６’　Ｃ）に−晩中抱かれた。フィーダプレートからの薄片は、１２センチメートルＩ径ｐ　ｅ　ｉ　ｒ　１皿にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ懸濁壇に置かれ、及び、１に切断された１、５センチメートルセクシ！ン薄片部分がフィーダプレートに戻された２Ｑ分以降成長部屋で封をされた、及び、交換された成長余地における４８時間潜伏期の後で植物材料（；、６−ＢＡＰ　（１’ｍｇ／ｌ）、ＮＡＡ　（０，１ｍｇ／ｌ）、ｃａｒｂｅｎｉｃｉ　１１　ｉｎ　（５００μｇ／ｃｍ’）、及び、カナマイシン（１００μｇ　／　ｃ　ｍ　）で遺われたＭＳ媒賀へ転送する、ｐｅｔｒｉ皿は、封をさ４、及び、成長部屋に戻された（ｐｅｔｒｉ皿において）Ａｏｒｏｂａｃｔｅｉｒｉｕｍによる接種後の３週間を始めて、！！射は、外植片から除去され、及び、ｒｏｏｔ　ｉｎｇのためのｃａｒｂｅｎｔｃｊｌｌｉｎ　（２００μｇ／ｃｍ）、及び、カナマイシン（「１１００＝／ｃｍ」）、で補われたＭＳ媒質に置かれた。Ｅ換された植物Ｇ！、−移動後の１−２週間を定着させた。根を下ろすＦｏ　ｌ　Ｌ　ｏｗ　ｉ　ｎ　ｇＥ’Ａｇれな植物）；１．：を含υ ポットへ転送する、及び、１室において５長ざぜらＱ　７＋おおよそ植物が花で飾った移動後の１月ｐＢ　ｉ　ｎ／ＭＳ　Ｌ　Ｏ−υＣＰ組立て体を含む煙軍植物の朽であるＲＮＡ試料の北のにじむことによってＵＣＰ遺伝子の発現のたのに分析された及び決定さｎたπ粉開発へのＵＣＰ発現の影響ＲＥＳＴＯＲＡＢＬΣＭＡＬＥ　ＳＴＥＲＩＬＩＴＹＦＩＣｙ　３゜ＦＩＣｙ、４゜ＧＳＴ　ＦＲＯＭ　ＭＡＩＺＥ　ＲＯＯＴＳ　ＴＲＥＡＴＥＤ　ＷＩＴＨＲ２５ＧＳＴＩ＝０９°１０叶ＴＯＴＡＬ　ＳＯＬ　ＰＲＯＴＦＩＮＧＳＴＩＩ　：　２・５°／、　ＯＦ　ＴＯＴＡＬ　ＳＱＬ　ＰＲＯＴＦＩＮ［ＵＳＩＮＧ　ＤＡＴＡ　ＦＲＯＭ　ＭＯ２ＥＲ（ＭＯＮＳＡＮＴＯＩＩＣＤＮ日　Ｃ０ＮＶＥＲＴＥＤ　ｕｍｏｌｅｓ／ｍｉｎ／ｇ　ｆｒｅｓｈ　ｗｅｉｇｈｔ（コ鵞−一驚Ｎ− ３ＥＱＩＪＥＮＣＥ　ＯＦ　Ｔｌ（Ｅ　Ｘｂａエ　−Ｎｃｏ工　ＣＡＢ　ＰＲＯＭ０ＴＥＲＦＲＡＧＭＥＮＴ。京　：　Ｐｏ５ｓｉｂｌｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　５ｔａｒｔ　５ｉｔｅｓ。４３４　Ｒ？ＲＥＳＳＯＲＧＥＮＥｐＡＤＬ５ユ　ｐＡＤ１４　Ｇ、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、τα−ＣＮ潤@０ＰＥＲＡＴＯＲＩｓＯＬＡＴＩＯＮＯＦｃＤＮＡＣＬＯＮＥＳＷｈｏｌｓ　ｍａｌｚｓｓ　ｔａｓｍｓｌｏｏｏｏ　ｐＢＲ３２２ｃｌａｎｇｓａｏｓｓ　ｈｙｂｒｊｄｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｓρＭＳＩ、　ｐＭｓ２，２ＭＳ４　ｐＭｓ１４ｐＭｓ１０．　ｐＭ８１１１ｅｉ丁゛− ｐＭｓＩ　Ｉ６・　為９ＭＳ２爽膏）、・−！ｐＭｓＩ０轡・・・・轡− ｐＭｓ１４Ｆ″−」（（１９Ｍ５１Ｂ＊＊ａａａＦＩＧ、　１５゜ＦＩＧ　７６Ａ。ＦＩＧ、　７６Ｂ。ＦＩＧ　７６Ｃ１ＦＩＧ、７７゜ＦＩＧ、　７７ＦＩＧ、　１７人入ＡＦＩｏ、　７８゜ＦＩＧ、　１８゜ＦＩＧ　７９゜ＦＩＧ、７９゜ｅｕａ）　− Ｃ１ｏｎｅ　ｐＭｓｌｏ−５゜ＦＩＧ、２４゜５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐＴＡＫｌ　、　ｐＴＡＫ２．　ｐＴＡＫ３ＦＩＧ、２７ＬＳＩ　Ｃｆ１６ＣＧＬＩＩＪｕｃｕ　ｒａｕ６Ｃｃｕｊａ　品心ＬＣＡｕ　ハ謔Ｉ獣繻２０Ｉ　ＣＣＡＡＡＧＬＣＩＪ　ＣＣｕ１ＣＡ１ｉＡＬＣ（ＪＡ６ＧＬＸｉ−Ａ１６スシｉａ！ＬＩＬＣ乙−！ＪＡＣｕ＾ｕｕ２５１　＾５ＧＬＩＡ−＾嬬６黛仄Ｗ沁−Ｃひ匡λ℃鉱閃１砿μ編に緬晶酩４０１　１Ｊ：λむ縞ａ込μらμに３χｊαｆ囚鳴鋪ん１υ調礒にズ―く講４７０１　〜にυ１ＣＣＡＣＡ　ＬＫ号献＾込ム砿饅工ヱ品＝Ｗ山に国ぽ調を匡υ１０６１　１ｉＡｃ臨× ムＱ％１２６Ｃａ＆Ｃｆｆｌ　＆６ＡＬｌｓＣｕＡＭ　ＣＪ−ｗ１鋪＋０５１　ＣＬＣＣｕＡＬｌｌＪＣｕ　＋＋６６ｃｕｃｃｕＡＬＩ　ｋｖｉμらクムα込駄＾蟻にコ驕α人蟻１１０１　１ｉｉＡＡＡＬｃＡｆ＆ｌｉＹＭｌ＆７（ａＪ　Ｘ　５Ｆ７Ａ７　（（［１壷ｇａｌ　、ｈｉｓ　、ｔｒｐ、ｌｅｕ　、ｕｒａ　１ｕｒａ　５ｅｌｅｃｔｉｏｒｌ壷ｄｉｐｌｏｉｄｓ　５ｐｏｒｕｌａｔｅｄ番會５ｔｒａｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｔｒｐ７　ｔｅｕ、　ｕｒａ７．ｇａに−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｃｒｏｓｓｅｄ　ｗｉｔｈｓｔｒａｉｎｓ　ＫＹ１１７　ａｎｄ　ＫＹｌｌａ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｒｍｎｅ　ｗｈｉｃｈ　ｇａｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｒｅ唐■■ 番５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｍｅｄｉｕｍ旺Ｔ９（ａｌ　ＢＥ２７（（１１ｈｉｓ＆、ｕｒａ３．ｔｒｐｌ、　１ｅｕ２゜ｇａｌｌ　ｕｒａ３　、　ｔｒｐｌ、　［ｅｕ、　ｇａｌｌＦ／Ｇ、２θ、　［１ｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　１ｅｕ２．　ｇａｌｌ　ｙｅａｓｔ　ｓｔｒａｉｎＴｉｍｅ　（ｈｏｕｒｓ　）Ｂ。Ｏｌｉｇｏ　Ｂｌ昌宕七磯冶廃王ｂｅｔｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｌｏｅ−Ｚ）−１ｉｎｄｌｌｌ　ＢａｍＨＩ　Ｂａｍ＋−１ｔ　５ｓｔｌ　ＥｃｏＲ１手続補正書彷幻平成４年５月１１日

Claims

【特許請求の範囲】１、発芽可能な花粉のバイオゲネシスを分断させることが可能なタンパク質をコード化するデイスラブダ遺伝子と、植物遺伝子組立て体を含む植物に対して外因性である化学的インデューサーを外部添加することによって誘導されるプロモーター配列を含む遺伝子調節塩基配列とを含有してなる植物遺伝子組立て体。２．上記遺伝子読師塩基配列が、上記ディスラプタ遺伝子を制御するオペレータ塩基配列と、デイスラブダ遺伝子オペレータと相互に作用すると共に、デイスラブダタンパク質の発現を抑制するのに適合するリプレッサタンパク質をコード化するリプレッサ遺伝子とを含み、上記のリプレッサタンパク質遺伝子が化学的に誘導されるプロモーターによって調整される請求項１に記載の植物遺伝子組立て体。３．植物の雄花部分に対するデイスラブダタンパク質遺伝子の発現を制限するために上記のデイスラブダタンパク質遺伝子に対して作動的に連結された雄花に特異的なプロモーター塩基配列を含む請求項１または２に記載の植物遺伝子組立て体。４．（ａ）外因性の化学的インデューサーの有無に応答して作用する第１の遺伝子プロモーター塩基配列と、（ｂ）上記第１のプロモーター塩基配列の制御下においてリプレッサタンパク質をコード化する遺伝子と、（ｃ）リプレッサタンパク質遺伝子によって発現された上記のリプレッサタンパク質に応答して作用するオペレータ塩基配列と、（ｄ）植物の雄性部分においてのみ発現可能な雄花に特異的な遺伝子プロモーター塩基配列と、（ｅ）発芽可能な花粉のバイオゲネシスを分断させることが可能なデイスラブダタンパク質をコード化する遺伝子と、とを含有してなる遺伝子組立体であって、植物中における上記外因性の化学的インデューサーの有無によって雄性稔性または不稔性の選択を行うことを可能にせしめる請求項１、２または３に記載の植物遺伝子組立て体。５．上記の化学的に誘導される遺伝子プロモーター塩基配列が、トウモロコシのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＩＩ）遺伝子から分離された２７ｋｄのサブユニットである請求項及至のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。６．上記の化学的に誘導される遺伝子プロモーターのためのインデューサーがＮ，Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセトアミド、またはベンジル−２−クロロ −４−（トリフルオロメチル）−５−チアゾールカルボキシレートである請求項及至のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。７．上記インデューサーがＮ．Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセトアミドである請求項６に記載の植物遺伝子組立て体。８．上記ディスラプタ遺伝子が、哺乳類の脱共役タンパク質（ＵＣＰ）遺伝子である請求項１及至７のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。９．上記ディスラプタ遺伝子が、他のサブユニットと結合するがＡＴＰシンターゼとしての機能を妨害する能力が保持されるように塩基配列が加えられるかまたは除去されているＦ１−ＡＴＰアーゼのβ−サブユニットの突然変異形の遺伝子である請求項１及至７のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。１０．上記のディスラプタ遺伝子が、Ｆｏ−ＡＴＰアーゼのサブユニット９をコード化するｏｌｉｌ遺伝子の突然変異した合成形である請求項１及至７のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。１１．上記のディスラプタ遺伝子が、転換（ｔｒａｎｓｆｅｒ）時に機能不全となってミトコンドリアに対してタンパク質の輸送の分断を惹起するミトコンドリアの転位先行塩基配列（ｔｒａｎｓｉｔｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の突然変異形である請求項１及至７のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。１２．上記ディスラプタ遺伝子が、イーストからのβ−サブユニット遺伝子と大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子との間でフージョン（ｆｕｓｉｏｎ）を有し、分断作用をもつフージョンタンパク質の発現をもたらす遺伝子組立て体である請求項１及至７のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。１３．上記リプレッサ遺伝子が、化学的に誘導されるプロモーターの制御下にあるＤＮＡ−結合タンパク質遺伝子であり、コード化されたＤＮＡ結合タンパク質遺伝子が、ディスラプタ遺伝子と関連するオペレータ塩基配列との相互作用が可能である請求項及至のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。１４．上記ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子が、ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の発現時にデイスラブダ遺伝子によるタンパク質の発現が抑制されるように、リプレッサタンパク質をコード化する請求項１３記載の植物遺伝子組立て体。１５．上記ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子及び上記オペレータが共に非植物起源のものである請求項１２または１３に記載の植物遺伝子組立て体。１６．上記ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子及び上記オペレータが共に、バクテリア起源のものである請求項１５記載の植物遺伝子組立て体。１７．上記リプレッサ遺伝子及びオペレータが、大腸菌のｌａｃＩ遺伝子から誘導されるものである請求項１６に記載の植物遺伝子組立て体。１８．上記リプレッサ及びオペレータは、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍに１９８９年１２月１２日付寄託された寄託番号ＮＣＩＢ４００９２の大腸菌株ＴＧ−２のホストに組み込んで寄託されたｐ３５ＳｌａｃＩという名称のプラスミドから分離されるものである請求項１７に記載の植物遺伝子組立て体。１９．上記ディスラプタ遺伝子オペレータが疑似オペレータ配列であり、上記リプレッサ遺伝子が、疑似オペレータに結合するアミノ酸前列を持つリプレッサをコード化する突然変異体調節遺伝子である請求項及至のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。２０．上記の雄花に特異的な塩基配列が添付図面の図１５に示されるポリヌクレオチドであり、該ヌクレオチドが雄花組織または遺伝子コードの退縮（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により許容されるその変異体中で明確に発現されるものである請求項３及至１９のいずれか１項記載の植物遺伝子組立て体。２１．上記の雄花に特異的な塩基配列が、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに１９８９年１月９日付、寄託番号ＮＣＩＢ４００９０として大腸菌株Ｒ１ホストに組み込んで寄託されたプラスミドｐＭＳＩＯから分離されるものである請求項２０に記載の植物遺伝子組立て体。２２．上記の雄花に特異的な塩基配列及びデイスラブダ遺伝子が、添付図面の図３９に示す組立て体を持つｐＢｉｎ／ＭＳＩＯ−ＵＣＰという名称のプラスミドから分離されるものである請求項２１または２２に記載の植物遺伝子組立て体。２３．上記の雄花に特異的な塩基配列が添付図面の図１６に示されるポリヌクレオチドであり、該ヌクレオチドが雄花組織または遺伝子コードの退縮により許容されるその変異体中で明確に発現されるものである請求項３及至１９のいずれか１に項記載の植物遺伝子組立て体。２４．上記の雄花に特異的な遺伝子が、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに１９８９年１月９日付、寄託番号ＮＣＩＢ４００９９として大腸菌株ＤＨＳＸホストに組み込んで寄託されたプラスミドｐＭＳ１４から分離されるものである請求項２３に記載の植物遺伝子組立て体。２５．上記の雄花に特異的な塩基配列が添付図面の図１７に示されるポリヌクレオチドであり、該ヌクレオチドが雄花組織または遺伝子コードの退縮により許容されるその変異体中で明確に発現されるものである請求項３及至１９のいずれか１項に記載の植物遺伝子組立て体。２６．上記の雄花に特異的な塩基配列が、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに１９８９年１月９日付寄託番号ＮＣＩＢ４０１００として大腸菌株Ｒ１ホストに組み込んで寄託されたプラスミドｐＭＳ１８から分離されるものである請求項２５に記載の植物遺伝子組立て体。２７．前記請求項のいずれかに記載の組立て体を組み込んだ形質転換された植物並びに細胞、原形質体、及び、種子のような転換された植物、及び、植物部分。２８．再生可能な雄性不稔性の植物であって、該植物が転換によりそのゲノム中に安定的に組み込まれた形で請求項及至のいずれか１項に記載の組換え体植物遺伝子組立て体を含むものである再生可能な雄性不稔性の植物。２９．双子葉植物である請求項２７または２８に記載の植物または植物部分。３０．単子葉植物である請求項２７または２８に記載の植物または植物部分。