JPH04504656A - ボルデテラワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ボルデテラワクチン 余朋ぶりと！ 本発明は、一般的にワクチン組成物およびその投与の方法に関する。より詳細に は、本発明は、ボルデテラ付着抗原、およびボルデテラ感染に対する免疫を刺激 するのに用いられる他の外膜タンパク質に関する。

λ吸二茸ｌ ボルデテラ属は、Ｌ凹ｒｔｕｓｓｉｓ　（百日咳菌）　、Ｂ、　匹Ｊ１旺ｔｕｓ ｓｉｓ　（バラ百日咳菌）　、Ｂ、　肛匹殖ｎ肛■旦（気管支敗血症菌）、およ びＢ、　ａｖ工胆の４つの種で構成されている。Ｂ、　ａｖｉ■　は、シチメン チョウおよびニワトリの上部気道疾患を引き起こす。この疾患は、ヒトの百日咳 菌感染およびパラ百日咳菌感染と同様であり（２１，２３，３７，３８）、また 気管支敗血症菌によって引き起こされるブタの鼻炎にも似ている。Ｂ、　ａｖｉ ｕｍ感染は、子供の百日咳で見られる症状を鳥類において引き起こす（２６）。

従って、感染の５〜７日後、鳥類にうつ症、食欲減退、体重減少、鳴らしく咳） 、湿性う音、外界孔における粘液蓄積、呼吸困難、および変声がおこる（３．１ ８．２１．３４．３７）。若い鳥は感染に高度に感受性であり、成長している鳥 は抵抗力がある（３６）。病状は２週間から数カ月間続き得（７，３４）、そし てウィルス、細菌、および菌類の病原体による二次的呼吸性感染が病的状態と死 亡の主な原因となる（３．４．１７．２１．３４）。

従って、この疾病は飼育産業に経済的な損失を引き起こす。

今日まで、Ｂ、　ａｖｉｕｍに対する普遍的に効果的であることが知られている ワクチンは存在しない。

ボルデテラ属のすべての種は、繊毛のある気管の上皮細胞に対して、特異的な親 和性を有する（２．４１．５）。これらの細胞は、細菌の標的となる唯一の細胞 である。Ｂ、　ａｖ工徂は、百日咳菌に感染したヒトやハムスターで見られるの と同様の組織病理学的変化を気管にもたらす（２，３，１７，１８，１９，１２ ，３３，３４）。細菌が繊毛のある気管の上皮細胞付着し、コロニーを形成した 後、Ｂ、　ａｖ±ｄに感染した鳥、および百日咳菌に感染したハムスターの気管 は、気管の表面の不整、粘液蓄積、白血球浸潤、および繊毛性の気管の細胞の漸 減を示す。

すべてのボルデテラ属が気管の上皮細胞に付着するため、すべてのボルデテラ属 の種に共通の表面構造が、おそらく付着に関連しており、そしてワクチン中の有 用な抗原であり得る。百日咳菌の付着に関係しているタンパク質にはフィラメン ト型血球凝集素（ＦＨＡ）、凝集原（ふさ状であり得るかまたはあり得ない）、 および百日咳毒（ＰＴ）が含まれる。

（一般的な総説として例えば４４．９を参照のこと）。ＦＨＡ−およびＰＴ−の 百日咳菌変異体は、ヒト繊毛性気管上皮細胞への付着性に欠け、ＦＨＡに対する 抗体は、インビトロの細胞アッセイにおいて、百日咳菌が種々の細胞に付着する のを妨害する（４２）。しかしながら、ＦＨＡ−の細胞は、ＨｅＬａ細胞によく 結合しく４６）、そしてフィラメント型血球凝集素を欠く百日咳菌変異体は、未 成熟マウスの鼻控内に感染したとき、野生型の毒性百日咳菌に比べた場合、毒性 が減少することはない（４５）。さらに、気管支敗血症菌、パラ百日咳菌、およ びＢ、　ａｖ上徂は、百日咳毒を産生ぜず（２ｏ）、ソＬｒＢ、ａｖ力胆と気管 支敗血症菌のほとんどの株がＦＨＡを産生じない。

ボルデテラ菌の付着における凝集原の役割についても議論の分かれるところであ る。百日咳菌の凝集原２．３、および６は、フィムブリエ抗原である（総説は４ ４を参照のこと）。

タイプ２のフィムブリエに対するモノクローナル抗体は、類似の血清型がベロ細 胞に付着するのを阻害する（１６）。一方、凝集原１および２の抗体は、百日咳 菌がＨｅＬａ細胞に付着するのを阻害する（３５．３２）。これに対して、フィ ムブリエを欠く百日咳菌は、繊毛のないＷｉＤｒ（４３）およびヒト繊毛性細胞 に付着し得る。さらにフィムブリエのある株のうち付着性を欠くものもある（４ ２）。

フィムブリエはまた、Ｂ、　ａｖ力徂の表面にも存在する。百８咳菌と同様、Ｌ 鉦上徂のフィムブリエは、付着に関係していることが提案されている。フィムブ リエに対する抗体は、Ｂ。

とｌ４がシチメンチョウの気管の外植片に付着するのを妨害するからである（２ ２）。しかし、Ｂ、　ａｖｉｕｍのフィムブリエが媒介する付着に対する確定的 な証拠は示されていない。従って、細菌が繊毛性の気管上皮細胞に付着する際に 関係する特定のタンパク質の確認については混乱が生じる。

おそらく、独立して作用し得るか、あるいは付加的な方法で作用し得る付着抗原 が幾らか存在している。もし独立しているならば、変異による１つの付着性の除 去は、付着を妨げない。もし付加的ならば、変異による１つの付着抗原の除去が 、その付着性の相対的な重要度に比例して付着力が減少する。どちらの場合でも 、その付着性に対する抗体は、抗体−抗原相互作用の立体的な性質によって、付 着を妨害し得る。

この立体的な性質は、その他の付着物が、これらの持つレセプターと相互作用す るのを妨げる。

Ｔｎ劇のトランスポゾン変異は、細菌の細胞の表面タンパク質の確認に用い得る 。Ｔｎ吐旦の、ある遺伝子への転位（２７）は、野生型のタンパクのＮ末端の部 分とアルカリホスファターゼとの融合タンパクを生じ、これに伴って、挿入の下 流の配列の発現がなくなる。これらの融合タンパクは、野生型のタンパク質に特 異的な部位に位置する（２７）。従って、Ｔｎ圓が外膜のタンパク質、ベリブラ スムタンパク質、あるいは分泌タンパク質の為の遺伝子内に挿入された場合、ア ルカリホスファターゼ活性が細菌細胞の表面に発現する（２７）。Ｅ、　ｃｏｌ ｉ、内においては、コロニーを変法Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔのモツブス培地にプレー トした場合に表れる青色によって簡単に確認できる。この培地には、色原体のア ルカリホスファターゼ基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−ホ スフェート＝ｐ−）ルイジン塩（Ｘ　Ｐ）を唯一のリン酸塩として含んでいる。

細胞質膜の外側に存在するアルカリホスファターゼのみが活性を示す。従って、 細胞質のタンパク質のための遺伝子に挿入があっても、青色のコロニーは生じな い。このようにＴｎ匝旦変異導入は、細菌の表面に位置すべきコロニー形成抗原 （すなわち、付着抗原）を確認する効果的な手段を提供する。しかしこのような Ｔｎ劇融合は、遺伝子を不活性化し得、そしてその遺伝子が細菌の生命維持に必 須のタンパク質をコードする場合、トランスポゾン挿入変異体はな（なる。ボル デテラ属の種はホスファターゼを欠いているため、Ｔｎ匡変異導入は、ボルデテ ラに対するワクチンに使用するコロニー形成抗原を確認するための信頼できる方 法に用い得る。

付着物とは限らない他の外膜タンパク質もまたボルデテラ感染の処置あるいは予 防に用い得る。特にこれらのタンパク質、あるいはその抗体は、コロニー形成抗 原が、そのレセプターに付着するのを防ぎ得、それによって感染を防ぐ。

ここに記載されているように、ボルデテラ外膜タンパク質の粗抽出物に対する抗 体を用いることによって、ボルデテラ外膜タンパク質および推定の付着抗原もま た確認し得る。これらの抗体は、遺伝子ライブラリーのスクリーニングに用い、 抗体と反応するタンパク質を産生じているクローンの確認をし得る。

無毒性の微生物はワクチン組成物のキャリアーとして用いられている。これらの 株は、細菌が実質的に宿主内で生存できなくなるような変異の導入によって発達 してきた。すなわち、これらの無毒性の株は、宿主内で、障害あるいは疾病の状 態を引き起こすような、方法であるいは期間で生存しない。

このような変異体は、共通して所有している係属出願中の、１９８８年１０月３ 日出願の第２５１，３０４号、およびＣｕｒｔｉｓｓ　ａｎｄ　Ｋｅｌｌｙ　（ １３）に開示されている。これらは本明細書に参考として援用されている。

代表的には、細菌のアデニルシクラーゼ（ＡＴＰピロリン酸リアーゼ（環化）Ｅ Ｃ４，６，１，１）　（辺）、およびサイクリックＡＭＰレセプタータンパク質 （臼１）を合成する能力に障害をもたらす欠失変異を有するＳａｌｍｏｎｅｌｌ ａの種の変異体である。β−アスパラギン酸セミアルデヒド（田）をコードする 遺伝子に点変異あるいは欠失がある変異体もまた開発されている。この酵素は、 メソ−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）合成経路中で見いだされる。ＤＡＰは、細 菌の細胞壁に形と堅さを与えるペプチドグリカンの必須成分である。−変異を持 つ細菌は、注意深く制御された実験室の環境でのみ生存し得る。従って、ａｓｄ 　（Ａｓｄ”ベクター）および関連の抗原をフードする組換えベクターは、Ａｓ ｄ−キャリアー細胞の中に入れ得る。所望の抗原をコードする細胞のみが生存す る。キャリアー無毒性微生物をボルデテラ種の外膜抗原を投与するのに用いると 、ボルデテラ感染の疾病に有効なワクチンが得られる。

余］ｊ」」丞 本発明は、ボルデテラの種が気管上皮細胞に付着するのに重要なコロニー形成抗 原および外膜タンパク質の、同定および単離に基づいている。この抗原は種々の 感染から被験体を保護するワクチン組成物に用い得る。さらに、組換えＤＮＡ技 術を用いて、ワクチン組成物を産生じ得る。これらの発見に基づいて、本発明は いくつかの実施態様をとり得る。

ある実施態様では、本発明は、精製したボルデテラの種の外膜タンパク質に向け られる。他の態様では、その精製外膜タンパク質はＢ、　ａｖｉｕｍ由来である 。

他の実施態様では、本発明は、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウ ェスタンイムノプロット分析によって決定した分子量２１キロダルトンのタンパ ク質、３７キロダルトンのタンパク質、４０キロダルトンのタンパク質、４３キ ロダルトンのタンパク質、４６キロダルトンのタンパク質、および５０キロダル トンのタンパク質からなる群から選択される精製したＢ、　ａｙ±ｄのタンパク 質に同けられる。

更に別の実施態様では、本発明は、ボルデテラの種の１種あるいはそれ以上の外 膜タンパク質を薬学的に許容し得る賦形剤に調合したものを含むワクチン組成物 に向けられる。

他の実施態様では、ワクチン組成物は、ＳＤＳポリアクリアミドゲル電気泳動お よびウェスタンイムノプロット分析によって決定した分子量２１キロダルトンの タンパク質、３７キロダルトンのタンパク質、４０キロダルトンのタンパク質、 ４３キロダルトンのタンパク質、４６キロダルトンのタンパク質、および５０キ ロダルトンのタンパク質からなる群から選択される、Ｂ、　ａｖ上組タンパク質 を１種あるいはそれ以上を含む。この１種あるいはそれ以上のタンパク質は、薬 学的に許容し得る賦形剤に調合される。

本発明の更に他の実施態様では、ワクチン組成物は、分子量約４６キロダルトン のＢ、　ａｖ力徂の付着抗原を含む。この抗原は、Ｓ、　Ｗカ門ユＵの無毒性の 誘導体の中で発現する。この誘導体は、機能性のアデニルシクラーゼ、機能性の サイクリックＡＭＰレセプタータンパク質、および機能性のβ−アスパラギン酸 セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを、実質的に産生できない。無毒性の誘導体は 、β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼあるいはその機能性の断 片をコードする遺伝子、および付着抗原をコードする遺伝子を持つベクターを含 んでいる。

他の実施態様では、本発明は、１種あるいはそれ以上のＬａｖｉｕｍノタンパク 質を含むワクチン組成物に向けられる。このタンパク質は、ＳＤＳポリアクリア ミドゲル電気泳動およびウェスタンイムノプロット分析によって決定した分子量 ２１キロダルトンのタンパク質、３７キロダルトンのタンパク質、４０キロダル トンのタンパク質、４３キロダルトンのタンパク質、４６キロダルトンのタンパ ク質、および５０キロダルトンのタンパク質からなる群から選択される。これら のタンパク質は、辷止助二且ｒｉｕｍの無毒性の誘導体の中で発現される。この 誘導体は、機能性のアデニルシクラーゼ、機能性のサイクリックＡＭＰレセプタ ータンパク質、および機能性のβ−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ ーゼを、実質的に産生できない。無毒性の誘導体は、β−アスパラギン酸セミア ルデヒドデヒドロゲナーゼあるいはその機能性の断片をコードする遺伝子、およ び付着抗原をコードする遺伝子を、１種あるいはそれ以上のＢ、　ａｖｉｕｍタ ンパク質をコードする１種あるいはそれ以上の遺伝子に連結して持つベクターを 含んでいる。

他の実施態様では、本発明は、を椎動物被験体における上部呼吸性疾患を予防す るか、あるいは改善する方法に同けられる。この方法は、薬学的に許容し得る賦 形剤に調合したボルデテラの種の外膜タンパク質を含むワクチン組成物を、有効 量被験体に投与する工程を含む。好ましい実施態様では、このタンパク質は、Ｌ υｉｕｍ由来であり、ワクチン組成物を投与する被験体は、ニワトリである。

更に別の実施態様では、本発明は、病原性微生物の無毒性誘導体を含む、ボルデ テラの種の外膜タンパク質の発現のためのキャリアー微生物に回けられる。この 誘導体は、機能性のアデニルシクラーゼ、機能性のサイクリックＡＭＰレセフタ ータンパク質を実質的に産生できず、一方外膜タンパク質をコードする組換え遺 伝子を発現し得る。

更に別の実施態様では、本発明は、４６キロダルトンの分子量を持つ、Ｂ、　ａ ｖｉｕｍ付着抗原の発現のためのキャリアー微生物に向けられる。この微生物に は、Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍの無毒性の誘導体も含まれる。この無毒性の誘導 体は、機能性のアデニルシクラーゼ、機能性のサイクリックＡＭＰレセプタータ ンパク質、および機能性のβ−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ を、実質的に産生できない。キャリアー微生物は、β−アスパラギン酸セミアル デヒドデヒドロゲナーゼあるいはその機能性の断片をコードする遺伝子および付 着抗原をコードする遺伝子を持つベクターを含有している。

他の実施態様では、本発明は、β４廊」のタンパク質の発現のためのキャリアー 微生物に向けられる。このタンパク質は、ＳＤＳポリアクリアミドゲル電気泳動 およびウェスタンイムノプロット分析によって決定した分子量２１キロダルトン のタンパク質、３７キロダルトンのタンパク質、４０キロダルトンのタンパク質 、４３キロダルトンのタンパク質、４６キロダルトンのタンパク質、および５０ キロダルトンのタンパク質からなる群から選択される。キャリアー微生物は、Ｓ 、　立付オｌ±Ｕの無毒性の誘導体を包含する。この誘導体は、機能性のアデニ ルシクラーゼ、機能性のサイクリックＡＭＰレセプタータンパク質、および機能 性のβ−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを、実質的に産生でき ナイ。

コノキャリアー微生物は、β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ あるいはその機能性の断片をコードする遺伝子を、１種あるいはそれ以上のＬａ ｖｉｕｍのタンパク質をコードする１種あるいはそれ以上の遺伝子に連結させて 含むベクターを有している。

別の実施態様では、本発明は、以下のａ、ｂを含む発現カセットを包含するＤＮ Ａ構築物に向けられる：（ａ）少なくとも１つの、ボルデテラの種の外膜タンパ ク質、あるいはＢ、　ａｖｌ徂の外膜タンパク質のエピトープを含むポリペプチ ドのＤＮＡコーディング配列；　および（ｂ）コーディング配列に作動可能に連 結した制御配列であって、それによって、コーディング配列が宿主細胞内で転写 および翻訳され得、そしてＤＮＡコーディング配列あるいは制御配列のうち、少 なくとも１つが宿主細胞とは異種である、制御配列。

本発明のさらに別の実施態様では、これらのタンパク質を組換え手法によって産 生ずる方法、そしてこれらの外膜タンパク質に特異的な、精製したポリクローナ ル抗体およびモノクローナル抗体が開示されている。

本発明の別の実施態様は、当業者は容易に実施できる。

の　なＭＢ 図１は、ＸｈｏｌＤＮＡ断片をｐＹＡ２４０２のＸｈｏ　Ｉ制限酵素部位にクロ ーニングした制限地図を示している。Ｂ＝ＢａｍＨ１；　Ｂｇ□１１１；　Ｃ１ ａ＝Ｃｌａｌ；　Ｅ＝ＥｃｏＲ１；　Ｈ＝Ｈｉｎ旧ＩＩ；　５ａｌ＝Ｓａｌｌ： 　５＝Ｓｓｔｌ；　Ｐ＝Ｐｓｔｌ；　Ｘ；Ｘｈｏｌ；　Ｘｂ−犯ｒａ　ｔ　；　 乙Ｚ＝８．　ａｖｉｕｍ　ＧＯＢＬ１２４由来のＤＮＡ；　ｌ　ｌ　＝　ｐＹＡ ２４０２からの切断断片であり、Ｂｇｌｌ＋で切断したｐＣＰ１３とライゲーシ ョンさせている。考えられる複製開始点は２つある。

図２は、ｐＹＡ２９２であり、Ａｓｄ”ベクターの十分な特徴を示している。

図８は、Ｂ、　ａｖ±この変異体およびもとの株から得た細菌の溶解物のイムノ プロット解析の結果を示している。レーンＡは５ＴＬ３８９タンパク質のプロフ ィールである。レーンＢは、５ＴＬ２５８のタンパク質のプロフィールを示して いる。レーンＣは、５ＴＬ１５７のタンパク質のプロフィールを示している。レ ーンＤは、５ＴＬ６のタンパク質のプロフィールを示している。レーンＥは、親 株のＧＯＢＬ１２４のプロフィールを示している。レーンＦは、分子量の標準を 示している。

図４は、ＧＯＢＬ１２４のＤＮＡの挿入を有するコスミドｐｃＰ１３を含有する Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＬＥ３９２のクローン体からの細菌溶解物のイムノプロットの 結果を示している。レーンＡは、ＬＥ３９２ノタンハク質のプロフィールを示し ている。レーンＢは、非付着性の変Ｘ体から単離されたプローブとは反応しない 挿入物を有する、ｐｃＰ１３のクローンを含む［、Ｅ３９２のタンパク質のプロ フィールを示している。レーンＣは、フスミドｐＹＡ２４０２を有するＬＥ３９ ２のプロフィールを示している。レーンＤ、Ｅ、およびＦは、非付着性の変異体 から単離されたプローブと反応する組換え挿入物を有するＬＥ３９２株のタンパ ク質のプロフィールを示している。最後のレーンは、分子量の標準を示している 。

図５は、非付着性変異体５ＴＬ２５８の電子顕微鏡写真である。

細菌の周囲に繊毛がみられ、鞭毛の一部も示されている（拡大　Ｘ　３０，００ ０）　。

図６は、Ｂ、　ａｖｉｕｍの外膜タンパク質を発現しているＥ、　ｃｏｌｉ　Ｌ Ｅ３９２のクローン体からの細菌溶解物をイムノプロット解析した結果を示して いる。菌溶解物は、Ｂ、ａｖ±組の外膜タン、ｆり質の粗抽出物に対する抗体で プローブした。レーン１は、分子量の標準を示している。レーン２は、Ｂ、　ａ ｖ士徂のＧＯＢＬＩ２４のプロフィールを示している。レーン３〜８は、それぞ れコスミドｐＹＡ２３２０、ｐＹＡ２３３７、ｐＹＡ２３３８、ｐＹＡ２３３９ 、ｐＹＡ２３２６、およびｐＹＡ２３２９を有するＬＥ３９２のタンパク質のプ ロフィールを示している。レーン９は、分子量の標準を示している。

図７は、Ｂ、　ａｖｉｔ徂に感染したシチメンチョウの回復期の血清でプローブ した細菌の溶解物のイムノプロット解析の結果を示している。レーン１は、Ｂ、 　ａｖ工岨のＧＯＢＬＬ２４のタンパク質のプロフィールを示している。レーン ２〜４は、それぞれコスミドｐＹＡ２３２０、ｐＹＡ２３３３、およびｐＹＡ２ ３２９を有するＬＥ３９２のタンパク質のプロフィールを示している。レーン５ は、分子量の標準を示している。

図８は、２１キロダルトンのタンパク質に特有のＬ■山徂のＢａｍＨｌからＰｓ ｔｌまでの６ｋｌ）の断片を含む、プラスミドｐＹＡ２３３６の特徴を十分に示 した地図である。

図９は、Ｂ、　ａｖｉｕｍの外膜タンパク質の粗抽出物に対する抗体でプローブ した細菌の溶解物のイムノプロット解析の結果を示シている。レーン１は、Ｂ、 ａｖｉｕｍ　ＧＯＢＬＬ２４ノ９７　／’　り質のプロフィールを示している。

　レーン２は、コスミドｐＹＡ２３２０を有するＬＥ３９２のタンパク質のプロ フィールを示している。

レーン３および４は、それぞれＥ、　ｃｏｌｉ　ｃｈｉ６０９７および鉦−肛吐 Ｃ罎工ｕｍ　ｃｈｉ３９８７であり、共にｐＹＡ２３３６を有している菌のプロ フィールを示している。レーン５および６は、それぞれＬｃｏｌｔ　ｃｈｉ６０ ９７およびｓ、　」Ｌ吐且土ｕｍ　ｃｈｉ３９８７であり、共にｐＹＡ２９２を 有している菌のプロフィールを示している。

日の−　な８ロ 本発明の実施に当たっては、特に指示しない限り、同業者の技術の範囲内にある 、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術 を用いる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉ ａｔｉｓらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｆｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２）；　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（１９８５）　 Ｖｏｌｓ、　ＩおよびＩＩ、　Ｄ、　Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒｍ集：Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（１９８４）、Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ ら編集：Ｐｅｒｂａｌ、Ｂ、、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（１９８４）；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（シリーズ）　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　 Ｉｎｃ、　；　Ｖｅｃｔｏｒｓ：　Ａ　５ｕｒｖｅｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅｓ　（１９ ８７）、Ｒ，Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら編集、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ；　お よびＭｉｌｌｅｒ、Ｊ、Ｈ，ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　（１９７２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。

ここで既出、および以下に述べられている全ての特許、特許出願、および刊行物 は、本明細書で完全に参考として援用される。

Ａ、■ 用語「抗原」は、１あるいはそれ以上のエピトープを含ミ、宿主の免疫系を刺激 して、分泌性、体液性、および／または細胞質性の抗原特異的反応をもたらす分 子のことをいう。本用語はまた、「免疫原」と互換性がある。

用語「ハブテン」は、１あるいはそれ以上のエピトープを含み、それ自体では宿 主の免疫系を刺激して、分泌性、体液性、および／または細胞質性の抗原特異的 反応をもたらさない、分子のことをいう。

用語「エピトープ」は、抗原あるいはハブテン上の部位を指し、その部位に特異 的な抗体分子が結合する。この用語はまた、「抗原決定基」あるいは「抗原決定 部位」と互換性がある。エピトープは通常立体構造を認識するのに必要な３個の アミノ酸を含み、より普通には、５個のアミノ酸を含み、最も普通には、８〜１ ０個のアミノ酸を含む。

組成物あるいはワクチンに対する「免疫学的な反応」は、宿主内で、関係する組 成物あるいはワクチンに対する細胞性免疫反応および／または抗体媒介免疫反応 が発達することである。通常、このような反応は、関係する組成物あるいはワク チンに含まれる１つあるいは複数の抗原に特異的に向けられる、被験体が産生ず る抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞毒 性Ｔ細胞で構成される。

用語「ワクチン組成物」は、将来の害に対する保護を提供するために、生命体の 免疫系を刺激する物質のことを意味する。用語「免疫感作」は、連続して高レベ ルの抗体免疫反応および／または細胞性免疫反応を誘導するプロセスを言う。

この反応においては、Ｔリンパ球は、生物の中で作用する病原体および／または 他の活性化細胞（例えば食細胞）を殺し得る。このプロセスは、生物が既に病原 体あるいは抗原に曝されている時、それらに対して同けられる。用語「免疫系」 は、例えばインターフェロンの産生のような、単細胞生物の異物の存在に対する 反応をも含み得る。しかしながら本明細書においては、この用語は、多細胞生物 が、その生物の細胞あるいは細胞外液に侵入する免疫原性物質に対して抗体を産 生ずる解剖学的な特徴および機構に限ることとする。このようにして産生された 抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧあるいはＭのようないずれかの免疫学的 クラスに属し得る。

特に関係があるのは、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生を刺激するワクチンで ある。免疫グロブリンＡは、定温動物の分泌系によって産生される基本的な免疫 グロブリンだからである。抗原に対する免疫反応は、よく研究されており広範囲 で報告されている。免疫学の調査は、Ｂａｒｒｅｔｔ、　Ｊａｍｅｓ　Ｔ、、　 Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　：第４版、Ｃ，Ｖ、　Ｍｏ５ｂｙ 　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ（１９８３）に報告されている。鳥類は粘膜の免疫消化管と関連しているリ ンパ系組織（ＧＡＬＴあるいはバイアー斑と呼ばれている）、気管支と関連して いるリンパ系組織（ＢＡＬＴ）　、および眼球の側面および後部中央に位置する ハルダー腺からなる。

これらの組織に対する抗原の存在は、関わるＢ細胞が、体の分泌性の組織や腺に 増殖し散布する引金となり、最終的に分泌性のＩｇＡ　（Ｓ［ｇＡ）が産生され る（６．１０．２５．２８．４７．１５．３０．３１）。ＳＩｇＡは、粘膜の表 面にコロニーを形成し、それを通過する特異的な表面抗原のコロニー形成、およ び侵入を妨害するのに役立つ（３９，４８）。

「を椎動物」は、を椎亜門の全てのメンバーのことであり、魚類、両性類、爬虫 類、鳥類、および哺乳類を含む、を索動物量の基本的な門である。そのすべては 、セグメント状の骨のあるいは軟骨のを柱に特徴がある。すべてのを椎動物は機 能性の免疫系を持ち、抗体を産生ずることによって、抗原に反応する。

「家禽」とは、雄鶏および雌鶏のような、飼育された、野生の、および猟用の鳥 を意味し、ニワトリ、シチメンチョウ、およびその他のキシ類の鳥、そして他の 鳥の種を含む。この定義ではすべての年齢の鳥を包含する。

「微生物の無毒性の誘導体」とは、特定の無毒性の微生物で処置した宿主におい て、実質的に疾病を引き起こし得ない生物を意味する。無毒性とは、その属ある いは種の微生物が病原体として機能し得ないことを意味するものではなく、用い られる特定の微生物が、処置される特定の動物に関して無毒性であることを意味 する。この微生物は、通常病原性である属あるいは種にさえ属し得るが、無毒性 の株に属していなければならない。無毒性の株は、対応する毒性で病原性の株に 通常関連している疾病の一連の症状を引き起こし得ない。

本明細書の用語「微生物」は、細菌、原性動物、および単細胞の菌類を包含する 。

「キャリアー微生物」は、上記に定義した無毒性の微生物で、外膜付着抗原、あ るいはボルデテラの種由来の外膜タンパク質のような、関連するタンパク質をコ ードする組換え遺伝子を含み、そして発現する。

「外膜付着抗原」は、細菌の細胞の外膜に位置し、そして病原性の細菌が標的細 胞に付着することに関わる抗原である。

ボルデテラの種においては、標的宿主細胞は、気管の上皮細胞である。このよう な付着抗原の具体例は、Ｂ、　ａｖｉｕｍで見いだされる分子量約４６キロダル トンのタンパク質である。本明細書で定義される用語「外膜タンパク質」は、実 施例の部分で述べる工程によって、Ｂ、　ａｖ士胆から単離された外膜タンパク 質の粗抽出物に対する抗体と反応し得るタンパク質である。これらの外膜タンパ ク質は、限定するわけではないが、ＳＤＳゲル電気泳動および後に述べるように 決定した２１キロダルトンのタンパク質、３７キロダルトンのタンパク質、４０ キロダルトンのタンパク質、４３キロダルトンのタンノくり質、４６キロダルト ンのタンパク質、および５０キロダルトンのタンパク質を含む。外膜付着抗原も また、定義から外膜タンパク質である。外膜タンパク質は、付着抗原であり得る 場合とあり得ない場合とがある。これらのタンパク質に対する抗原は、直接ボル デテラの感染を防ぎ得る。あるいはこれらのタンパク質、あるいはそれに対する 抗体は、これらの抗原が細胞表面のレセプターに付着するのを妨害することで、 コロニー形成抗原の効果を阻害し得る。

「精製タンパク質あるいは抗原」は、他の物質を実質的に含まないものである。

例えば、タンパク質Ａは、Ｂが他の細胞成分およびタンパク質である時、Ｂを実 質的に含まず、従って、全Ａ＋Ｂの少なくとも３０％重量のＡが存在するとき精 製されている。好ましくは、Ａは全Ａ＋Ｂの存在の少なくとも５０％重量を含み 、より好ましくは、少なくとも７５％重量であり、最も好ましくは、９０〜９５ ％あるいは９９％重量である。「精製した」とは、しかしタンパク質がそれによ って得られる方法を意味しない。従って、精製したタンパク質は、組換え技術に よって生産された、合成して生産された、あるいは天然にそのタンパク質が見い だされる生物から直接単離されるタンパク質であり得る。

「ポリペプチド」とは、最も広い意味で用いられている。

すなわち、ペプチド結合で連結しているすべてのアミノ酸のポリマー（ジペプチ ドあるいはそれ以上）である。従って、用語「ポリペプチド」は、タンパク質、 オリゴペプチド、タンパク質断片、アナログ、変異体、および融合タンパク質な どを包含する。この用語は、本来のタンパク質および組換え体のタンパク質を含 む。

「本来の」タンパク質あるいはポリペプチドは、天然源から回収したタンパク質 あるいはポリペプチドを指す。従って、用語「本来のボルデテラタンパク質ある いはポリペプチド」は、天然のボルデテラタンパク質およびその断片を含む。

「組換えの」ポリペプチドは、組換え遺伝子から発現したポリペプチドをいう。

すなわち所望のポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ構築物で形質転換した細 胞から生産される。

「組換え遺伝子」は、共に結合していることが天然には見いだされない大きいポ リヌクレオチド分子内にある、ポリヌクレオチドセグメントと同一と見なし得る 。

「レプリコン」はすべての遺伝的なエレメント（例えば、プラスミド、クロモシ ーム、ウィルス）であり、インビボでＤＮＡ複製の自律的な単位として機能する 。すなわち自身の制御のもとで複製し得る。

「ベクター」は、プラスミド、ファージ、あるいはコスミドのようなレプリコン であり、これに他のＤＮＡセグメントが結合し得、結合したセグメントの複製が なされる。

ＤＮＡ　ｒコーディング配列」は、インビボで適当な制御配列のもとに配置した とき、転写されそして翻訳されるＤＮＡ配列である。コーディング配列の画境界 は、５°（アミン）末端の開始コドンおよび３°（カルボキシ）末端の翻訳終止 コドンによって決められる。コーディング配列は、限定しないが、原核生物の配 列、真核性ｍＲＮＡから得たｃ　ＤＮＡ、真核性（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来 のゲノムＤＮＡ配列、および合成りＮＡをも含み得る。転写終止配列は、通常コ ーディング配列の３′側に位置する。

「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そして下流 （３°方回）のコーディング配列の転写を開始するＤＮＡ調節領域である。本発 明を定義する目的で、プロモーター配列は、コーディング配列の翻訳開始コドン （ＡＴＧ）にその３”末端が結合しており、そして上流（５“方向）には、バッ クより検出てきるレベルで転写を開始するのに必要最小限の数の塩基あるいはエ レメントを含むものとする。プロモーター配列の中には、転写開始部位が見いだ される（ヌクレアーゼＳ１のマツピングで便宜的に定義される）。プロモーター 配列の中には、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コン センサス配列）も見いだされる。常にではないが真核生物のプロモーターは、“ ＴＡＴＡ”ボックスおよび′°キャットパボ・７クスを含んでいる。

原核生物のプロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャ インーダルガーノ配列を含んでＩ、Ｘる。

ＤＮＡ　ｒ制御配列」は、プロモーター配列、リボ・ノーム結合部位、ポリアデ ニル化シグナル、転写終止シグナル、上流調節ドメイン、およびエンハンサーな どをひとまとめにした用語である。これらは、ひとまとまりで宿主細胞中でコー ディング配列の転写および翻訳を提供する。

コーディング配列は、細胞内で制御配列に「作動可能に連結」するか、あるいは 制御配列の「制御のらとに」ある。この時ＲＮＡポリメラーゼはプロモーター配 列（こ結合し、そしてコーディング配列をｍＲＮＡに転写する。ｍＲＮＡは次１ こ、コーディング配列によってコードされたポリペプチドに翻訳される。

微生物を示す「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」および他のこのよう な用語は、互換可能に用いられ、組換え体のベクターあるいは他の運搬ＤＮＡの 受容用として用い得るかあるいは用いられている細胞のことを示し、形質移入さ れたもとの細胞の子孫を含む。偶然の変異導入や人為的な変異導入のために、単 一の親細胞の子孫が、必ずしもゲノムあるいは全ＤＮＡ補体においてもとの親と 完全に同一ではあり得ないことは理解されている。親細胞の子孫には、例えば必 須の酵素をコードする本来の遺伝子の、所望の遺伝子産物をコードする構造遺伝 子に連結したクローン化遺伝子への置換のような、関連した性質によって特徴づ けられる、親細胞と十分類似している細胞が含まれる。

「クローン」は、１つの細胞、あるいは細胞分裂による共通の親に由来する細胞 集団である。「細胞系」は、幾世代にも渡ってインビトロで安定的に成長し得る もとの細胞のクローンである。

「遺伝子ライブラリー」とは、クローン化遺伝子の収集したものであり、一般的 に特定の種由来の遺伝子の多くか、あるいはすべてを含んでいる。ライブラリー は、ＤＮＡを選択した制限酵素で処理し、その断片を適当なベクターにクローニ ングして作成される。遺伝子ライブラリーは、関連の生物由来のＤＮＡの相同な 配列を用いて捜索し得、ライブラリーの中の所望の遺伝子を有するクローンを確 認する。

ＤＮＡ構築物の「異種の」領域は、天然には、別の分子と結合していることが見 いだされている他のＤＮＡ分子の中にある、あるいは結合しているＤＮＡと同一 のセグメントである。従って、異種の領域が細菌の遺伝子をコードするとき、そ の遺伝子は通常、由来の細菌のゲノム中では、細菌の遺伝子の両脇に隣接してい ないＤＮＡに接している。異種コーディング配列の他の例は、コーディング配列 自身が天然には見いだされないような構築物である（例えば、天然の遺伝子とは 異なるコドンを持つ合成配列）。本明細書においては、対立変異あるいは天然に 起こる変異は、ＤＮＡの異種領域を生じない。　本明細書の用語「形質転換」は 、宿主細胞に外来性のポリヌクレオチドを挿入することを言う。用いられる挿入 の方法は、例えば直接の取り込み、形質移入、あるいは接合等があり、どの方法 であっても構わない。外来性のポリペプチドは、プラスミドとして保持され得る か、あるいは宿主のゲノムに組み込まれ得る。

Ｂ、二股五呈方広 本発明は、ボルデテラ誘導性疾患に対するワクチンに利用できる、ボルデテラ　 ｓｐｐ、の外膜付着タンパク質、および外膜タンパク質を含むＬａｖｉｕｍ由来 の粗抽出物に対する抗体と反応し得るタンパク質の発見を含む。付着タンパク質 は、細菌の外膜上に存在するため、Ｔｎ劇を用いたトランスポゾン変異導入は、 本発明の抗原の確認の方法を提供する。Ｔｎｐｉ！ＱＡは、後に詳述するように Ｅ、　ｃｏｌｉの供与体と接合させることによって、ボルデテラ細胞に導入し得 る。Ｔｎ匹がボルデテラの染色体に移されたとき、カナマイシン耐性が常に付与 され、そしてＴｎ劇が細胞質膜を通過するタンパク質をコードする遺伝子に挿入 した場合、アルカリホスファターゼが産生され得る。アルカリホスファターゼは 通常、ボルデテラ　ｓｐｐ、にはない。従って、トランスポゾン誘導変異体は、 カナマイシン含有培地上で選択し得、そしてアルカリホスファターゼ遺伝子の発 現は、培地中に含まれる、色原体基質の５−ブロモ−４−クロｏ−３−インドー ル−ｐ−トルイジンリン酸塩（ＸＰ）の加水分解によって検出し得る。変異株は 、ニワトリおよびシチメンチョウの気管軟骨を用いたインビトロのアッセイにお ける、気管上皮細胞に付着する能力でスクリーニングされ得る。付着性および非 付着性の両方の株を用いたコロニー形成もまた、後に述べるように種々の株を適 当な動物に接種することによって、インビボで研究され得る。

付与された付着性を有する変異株由来の染色体ＤＮＡは、従来の制限酵素を用い て部分消化され得る。制限断片はアガロースゲルを用いて分離され得る。Ｔｎ匝 臥は、およそ７．５ｋｔ）の長さであるため、７．５ｋｂより長い断片は、ゲル から切り取り、電気的に抽出法で回収し、適当に消化したプラスミドにライゲー ションして入れる（後述参照）。Ｅ、　ｃｏｌｔは、これらの構築物を用いて形 質転換し得、カナマイシン耐性を示すコロニーを選択し得た。変異体から単離し たＤＮＡを含有するプラスミドは、野生型のボルデテラの種から作成された遺伝 子ライブラリー中の付着遺伝子の存在を検出するプローブとして用い得る。

ウェスタンイムノプロットは、変異体および野生型の株の細菌の溶解物、そして 実施例の部分で述べるように確認を行った付着抗原について行い得る。これらの タンパク質は、従来の方法を用いて単離され得る。

様々なボルデテラの種に由来する外膜付着タンパク質は、お互いに相同性が高い ようである。従って、このようなタンパク質をコードする遺伝子を担うＴｎ吐妨 の断片を含むプラスミドは、他の同様な付着タンパク質のボルデテラの種のスク リーニングに有用で有り得る。さらに１つのボルデテラの外膜付着抗原に対して 作られたポリクローナル抗体（後に詳述）は、他のボルデテラの種由来の外膜付 着抗原と交差反応し得る。

さらに、ボルデテラ外膜タンパク質の粗調製物は、抗体を作るために用いられ、 その抗体は、組換え体の発現のスクリーニングに用い得る。従って、これらの抗 体と反応し得るタンパク質を発現しているクローン体は、確認され得、そしてこ れらのタンパク質はさらに前述のように、特徴づけられ、そして気管上皮細胞に 付着する能力についてテストされる。

これらのタンパク質はまた、付着抗原に類似している。

単離されたタンパク質は、当業者に公知の種々の方法のうちいずれかで配列決定 され得る。例えば、目的のタンパク質のアミノ酸配列は、エドマン分解法の繰り 返しのサイクル、続いてＨＰＬＣによるアミノ酸分析によって、精製タンパク質 から決定され得る。アミノ酸配列決定の他の方法もまた、当業者に知られている 。

前述のように決定したアミノ酸配列は、オリゴヌクレオチドプローブの設計に用 い得る。このプローブは、決定したアミノ酸配列部分のコドンを含み、目的のタ ンパク質をコードする遺伝子をＤＮＡライブラリーからスクリーニングするのに 用い得る。オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡライブラリーおよび核酸の ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングは、当業者には周知であ る。例えば、ＤＮＡＣｌｏｎｆｎｇ：　ｖｏｌ、　１．　前出；　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ ｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、前出；　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、　前出参 照。

（以下余白） 最初に、ＤＮＡライブラリーを調製する。ライブラリーはボルデテラ　ｓｐｐ由 来のゲノムＤＮＡからなり得る。ライブラリーが構築されると、そのライブラリ ーをプローブするオリゴヌクレオチドが調製され、外膜タンパク質をコードする 遺伝子を単離するのに用いられる。オリゴヌクレオチドはいずれの適当な方法に よってでも合成される。選択された特定の配列は、目的のボルデテラ抗原の知ら れたアミノ酸配列をコードするコドンに対応するように選択される。遺伝子コ゛ −ドは縮重するので、タンパク質の特定の領域をコードする、考えられるヌクレ オチド配列の全て、あるいは理にかなった数をカバーする数個のオリゴヌクレオ チドを合成する必要がしばしばある。従って、プローブのちととなる領域を選択 するときには、コドンが高度に縮重しているアミノ酸を含まない領域が一般に好 まれる。ある条件下では、当業者には、かなす長いプローブ、および／または対 応する核酸配列に高程度の重複部分を有するアミノ酸配列の領域を含むプローブ が、特に、この長いおよび／または重複領域が目指すタンパク質を強く特徴づけ ている場合、調製するのに好ましいことが解る。１回のハブダイゼーション実験 で、遺伝子の異なる領域の２個のプローブ（あるいはプローブのセット）を用い るのが好ましい。自動オリゴヌクレオチド合成は、比較的多（の大きいファミリ ーのプローブの調製物を作成してきた。用いられるプローブの実際の長さは重要 ではなく、一般には当分野では約１４から２０塩基対のプローブが効果的である と認識されている。さらに長い、約２５から約６０塩基対のプローブも用いられ る。

選択されたオリゴヌクレオチドプローブは、標準工程による、放射性ヌクレオチ ドあるいはビオチンのようなマーカーで標識される。標識されたプローブのセン トは、次にスクジーニンングの工程に用いられる。この工程は、標準法によって 、ライブラリーからの単離された一本鎖ＤＮＡに一本鎖（ＳＳ）をハイブリダイ ズさせることからなる。プローブの長さ、プローブがライブラリーとして同じ種 由来であるどうか、または進化的に近い種かあるいは遠い種であるかどうかのよ うな幾つかの要素によって、緊縮なあるいはゆるやかなハイブリダイゼーション の条件が選択され得る。適切な条件の選択は、当分野の技術の範囲内である。一 般的には前出のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを参照 。基本的に必要なのは、選択的なハイブリダイゼーションがおこるように、ハイ ブリダイゼーションの条件が十分に緊縮であることである。すなわち、ハイブリ ダイゼーションは、非特異的結合に反して、十分な程度の核酸の相同性（例えば 、少な（とも約７５％）による。

スクリーンされたライブラリーからのクローンが、ポジティブのハイブリダイゼ ーションによって同定されると、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって、 特定のライブラリー挿入物が所望のタンパク質に対する遺伝子を含んでいること が確認され得る。

あるいは、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、クローンではなく合成 的に調製され得る。ＤＮＡ配列は、特定のボルデテラのアミノ酸配列に対する適 切なコドンによって設計され得る。一般に、配列が発現に用いられる場合には、 目的とされる宿主に対する好ましいコドンが選択される。完全配列は、標準法に よって調製された重なるオリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全なコ ーディング配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９ ８１）　２９２＋７５６；　Ｎａｍｂａｉｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４） 　２２３：１２９９；　Ｊａｙら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８４）　２ ５９：６３１１を参照。

所望のタンパク質に対するコーディング配列が調製されるか、あるいは単離され ると、任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローン化され得る。当分野に おいて多くのクローニングベクターが知られていて、適切なりローニングベクタ ーの選択は自在である。クローニングのための組換えＤＮＡベクター、および形 質転換され得る宿主細胞の例には；バクテイオファージλ（Ｅ、　Ｃｏ１１）　 、ｐＢＲ３２２（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　、ｐＡＣＹＣ１？？　（Ｅ、刈旦）　、ｐ ＫＴ２３０　（グラム陰性細菌）　、Ｉ）ＧＶ１１０６　（グラム陰性細菌）　 、ｐＬＡＦＲｌ　（グラム陰性細菌）　、ｐＭＥ２９０　（Ｅ。

ｃｏｌｉでないグラム陰性細菌）　、ｐ）ＩＶ１４　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　オヨヒ ■虹１１ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、ｐＢＤ９　（Ｂａｃｊｌｌｕｓ）　、ｐ ｌＪ６１　（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅ ｓ）　、ＹＩｐ５　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ）　、ＹＣｐ１９　（Ｓａｃ ｃ造二二匹巨）およびウシ乳頭腫ウィルス（哺乳動物細胞）が含まれる。一般に は、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ｖｏｌｓ、Ｉ　＆　ＩＩ、上記；Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、Ｔら、上Ｍｅ　；　Ｐｅｒｂａｌ、　Ｂ、　、上記を参照。

対象のボルデテラの外膜タンパク質のコーディング配列は、プロモーター、リポ ソーム結合部位（細菌の発現のため）および必要に応じてオペレーターの制御（ 本明細書ではひとまとめにして「制御」エレメントとした）のらとに配置され得 るので、タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、この発現構築物を含むベクター によって形質転換された宿主内で、ＲＮＡに転写される。コーディング配列は、 シグナルペプチドあるいはリーダー配列を含み得るかあるいは含み得ない。本発 明の全長ボルデテラタンパク質は、例えば天然のボルデテラプロモーター、ある いはｔａｃまたはｔｒｐプロモーターのようなグラム陰性細菌で機能する他の公 知のプロモーターを用いて発現され得る。

キャリアー微生物中に存在する場合には、通常外膜抗原は、免疫された宿主のイ ンビボ発現のみを可能にするプロモーターの制御のもとに発現される。しかし、 このタンパク質の大量生産が望まれる場合には、意図されている受領体の外に、 制御配列に加えて、宿主細胞の生育に関して、細菌の抗原の配列の発現を調節す る、調節配列を加えることが望ましい。

調節配列は当業者には公知であって、例としては、調節物質の存在も含めて、化 学的あるいは物理的な刺激に反応して、遺伝子の発現のオンあるいはオフをひき おこすものが含まれる。調節エレメントの他のタイプは、エンハンサー配列のよ うに、ベクター内に存在し得る。対象のタンノくり質は、さらに融合タンパク質 の形態で発現され得て、異種のアミノ酸配列が融合タンパク質のＮ末端に発現さ れる。例えば、米国特許第４．４３１．７３９号、第４．４２５．４３７号を参 照。

発現ベクターが構築されて、特定のコーディング配列ハ、適当な制御配列ととも にベクターに配置される。そのコーディング配列の制御配列に関する位置と向き は、コーディング配列が制御配列の「制御」のらとに転写されるようになされる （すなわち、制御配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼは、コーディ ング配列を転写する）。対象の特定の抗原をコードする配列の改変はこの目的を 達成するのに望まれ得る。例えば、ある場合には、制御配列に適切な方向で結合 し得るために配列を改変する必要があり得る。すなわち、リーディングフレーム を保持するためにである。制御配列および他の調節配列は、上記のクローニング ベクターのようなベクターに挿入される前にコーディング配列とライゲーション され得る。あるいは、コーディング配列は、すでに制御配列および適切な制限酵 素部位を含む発現ベクターに直接にクローン化され得る。

ある場合には、宿主生物からのポリペプチドの分泌、もしあるなら、次に続く分 泌シグナルの切断をおこすリーダー配列の付加も望み得る。リーダー配列は、翻 訳後のプロ、セ。

シンクにおいて細菌宿主によって除き得る。米国特許第４，４３１、７３９号、 第４．４２５．４３７号、第４．３３８．３９７号を参照。さらに対象の抗原の 変異体あるいはアナログの生産も所望し得る。変異体あるいはアナログは、抗原 をコードする配列の部分の欠損、配列の挿入、および／または配列内の１個ある いはそれ以上のヌクレオチドの置換によって調製され得る。例えば、宿主を免疫 するのに用いられるタンパク質は、ヘルパー細胞を刺激するエピトープおよびサ プレッサー細胞を刺激するエピトープを含み得る。従って、これらのヌクレオチ ドの欠損あるいは改変は望まれる。部位特異的変異導入のような、ヌクレオチド 配列の改変のための方法は当分野では公知である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、 　Ｔ、ら、前述；　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｖｏｌｓ、　ｌ　＆　ＩＩ、前 述；　ＮｕｃＩｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ＨｙｂｒｃｄｉｚａＬｉｏｎ、前述を参照。

多くの原核細胞発現ベクターは当分野には公知である。例えば、米国特許第４． ４４０．８５９号、第４，４３６．８１５号、第４．４３１．７４０号、第４， ４３１．７３９号、第４．４２８．９４１号、第４．４２５，４３７号、４，４ １８、１４９号、第４．４１１．９９４号、第４．３６６、２４６号、第４．３ ４２．８３２号を参照。ざらに、英国特許出願ＧＢ　２．１２１．０５４号、Ｇ Ｂ　２．００８，１２３号、ＧＢ　２，００７，６７５号および欧州特許出願第 １０３．３９５号を参照。

発現系および選択された宿主によって、本発明のタンパク質は、対象のタンパク 質が発現される条件下に、上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞 を増殖させて生産され得る。次に、特定のボルデテラのタンパク質が宿主細胞か ら単離されて精製され得る。その発現系が増殖培地中にタンパク質を分泌する場 合は、そのタンパク質は培地から直接精製される。タンパク質がペリプラズムに 移っている場合は、当分野では公知の冷浸透シヨツクによって培地に放出され得 る。タンパク質が分泌されていない場合、あるいはべりプラズマに移っていない 場合には、細胞溶解物から単離される。

適切な増殖条件の選択、および回収の方法は当分野の技術の範囲内である。

本発明の抗原は、さらに、当分野には公知のタンパク質精製の標準工程によって 、ボルデテラ培養物から単離され得る。

例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　 ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（１９８７）第２版、　Ｒ，に、　５ｃｏｐｅｓ　 （編）を参照。このような技術には、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換 クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグ ラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびその他の電気泳動法、遠心 分離、透析そして沈降が含まれる。

本発明の抗原は、さらに既知のアミノ酸配列あるいは対象の遺伝子のＤＮＡ配列 由来のアミノ酸配列を用いて、固相ペプチド合成のような化学的合成によって生 産され得る。このような方法は当分野では公知である。ペプチドの化学的合成は 、問題の抗原の小さな断片が対象の被験体に免疫学的応答を生じ得る場合に好ま しい。

本発明のタンパク質あるいはそれらの断片は、ポリクローナルおよびモノクロー ナル両者の抗体の生産に用いられ得る。

ポリクローナル抗体が所望の場合には、選択された鳥類あるいは哺乳類（例えば 、ニワトリ、シチメンチョウ、マウス、ウサギ、ヤギウマなど）が、本発明の抗 原またはその断片、あるいは変異抗原によって免疫される。免疫された動物由来 の血清は公知の方法で回収され処理される。対象のタンパク質に対するポリクロ ーナル抗体を含む血清が、他の抗原に対する抗体を含んでいる場合は、そのホゾ クローナル抗体ハ、公知の方法を用いて、イムノアフィニティークロマトグラフ ィーによって精製され得る。

本発明のタンパク質およびその断片に対するモノクローナル抗体もまた、当業者 によって容易に生産され得る。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体作成の 一般的な方法論は公知である。不死化抗体生産細胞系が、細胞融合によって、お よび腫瘍形成りＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、あるいはＥｐｓＬｅｉｎ −Ｂａｒｒウィルスによる形質導入のような他の技術によってつくられ得る。例 えば、５ｃｈｒｅｉｅｒ、　Ｍ、ら、Ｈｙｂｒｉｄ。

ｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９８０）：Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎ ｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄ ｏｍａｓ　（１９８１）；　Ｋｅｎｎｅｔｔら、Ｍｏｎｏｃ　１ｏｎａ　ＩＡｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ　（１９８０）を参照。さらに、米国特許第４，３４１，７６ １号、第４，３９９，１２１号、第４，４２７．７８３号、第４，４４４．８８ ７号、第４．４５２．５７０号、第４．４６６．９１７号、第４，４７２，５０ ０号、第４．４９１．６３２号および第４．４９３．８９０号を参照。対象の抗 原に対して生産されたモノクローナル抗体、あるいはその断片のパネルは、種々 の特性、すなわちイソタイプあるいはエピトープ親和性などによってスクリーン され得る。モノクローナル抗体は、その抗体に対する抗原のイムノアフィニティ ー技術による精製に有用である。

上記のように生産された本発明の外膜タンパク質は、ボルデテラが誘発する疾患 に対して被験体に免疫するのに用いられ得る。無毒性のキャリアー微生物は、本 発明の抗原を投与するのに用いられ得る。適当なキャリアー微生物が、ＧＡＬＴ およびＢＡＬＴ細胞内に侵入し、増殖し得るので、この投与の方法は特に適切で ある。ＢＡＬＴあるいはＧＡＬＴへの抗原の配送は、一般的な分泌免疫応答、お よび上記のような体液性および細胞性免疫応答を引き出す。

目的のタンパク質に対する遺伝子を含む組換えプラスミドは、標的の宿主で長期 間生存するのに必要な遺伝子の変異を含む細菌のいくつかの無毒性の株の一つに 導入され得る。上記ノ旦二Ｌｉ、ｃｒ且およびａｓｄ変異体が特に有用であるが 、しかし、さらに他の無毒性微生物も本発明によってその使用が見いだされる。

Ａｓｄ−変異体が用いられる場合、対象の付着抗原は、付着抗原および蓮の両者 をコードするベクターを用いてキャリアー微生物に移される。従って、目的の付 着抗原を含むキャリアー微生物のみが生存し、これらの微生物は次の使用に選択 され得る。図２に、目的の抗原をコードする遺伝子がクローン化され得るベクタ ーである、ｐＹＡ２９２　Ａｓｄ”のマツプを示す。次に、このベクターはＡ＋ 、ｄ−キャリアー微生物に移され得る。目的の抗原をフードする組換え遺伝子の 発現は、■遺伝子に結合する制御配列に依存し得る。この結合は、ベクターでの ２つの遺伝子の方回によって決まり、例えば両方の遺伝子が同じ制御エレメント 、すなわち同じプロモーターおよびオペレーターの制御のもとに有り得る。この ような性質を有するベクターの構築方法は、当分野では組換えＤＮＡ技術を用い るのが知られており、係属特許出願第２５１．３０４号にさらに議論されている 。

有用な無毒性の微生物には、Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａおよびＥ、　ｃｏｌｉ−Ｓ ａ１ｍｏｎｅｌｌａハイブリッドの変異誘導体が含まれる。しがし、これに限定 はされない。好ましい微生物には、Ｌ９Ｊ工堕ユニ践ユ。

鵠蛙江のようなＳａｌｍｏｎｅｌ　ｉａ属がある。辷江付］且区岨およびＳ、　 ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの無毒性の誘導体が、多くの宿主で広く使用サレる。辷 註旦旦肛■、辷匹■吐…および辷ａｒｉｚｏｎａの無毒性の誘導体は鳥種を免疫 するのに特に有用である。ＬｔＤＬｈｉｒｔｕｒｉｕｍ、　Ｓ、　ｔｌΣ＋ｉお 、Ｊ：びＬｕｎ」１■はヒトに用いるのに好ましい。Ｓ、　ｃｈｏｌｅｒａｅｓ ｕｉｓはブタに、Ｓ、　ｄｕｂｌｉｎはウシに用いるのに好ましい。これらのＳ ａｌｍｏｎｅｌｌａの無毒性の株はＧＡＬＴおよびＢＡ　ＬＴでコロニー化し得 る。これらは何週間も持続するが、宿主生物に対して病原性はない。このような 変異体の創造は、係属出願第２５１．３０４号、およびＣｕｒｔｉｓｓおよびＫ ｅｌｌｙ　（ｉａ）に記載されている。

ＧＡＬＴあるいはＢＡＬＴの好ましい応答を刺激するために、その微生物あるい は遺伝子産物の導入は、経口投与、鼻腔内投与、胃内挿管、あるいはアエロゾル の形態でエアサック接種（トリのみに）および気管内接種などによって直接に腸 または気管支にされるのが好ましい。ワクチンの他の投与方法には、静脈内注射 、筋肉内注射、あるいは皮下注射がさらに可能であり、そして、主に下記にさら に記載するように、第二の免疫応答を刺激するのに用いられる。

鳥類への特に有用な投与様式は、飲料水を介するものである。従って、対象のボ ルデテラ外膜抗原を発現するキャリアー微生物が、直接に動物に与えられる水に 入れられ得る。インオポ投与が、鳥類がふ化する前（一般には約１８日である） に、その卵に接種することによりなされ得る。

一般に、ボルデテラ抗原を発現するキャリアー微生物が、ヒトあるいは他の哺乳 類に投与されるとき、当分野には公知の適当なゼラチン様の物質で被覆またはカ プセルに入れられる。

一旦キャリアー微生物が動物に入ると、抗原は動物の免疫系に使えるようになる 必要がある。このことは、そのキャリアー微生物が死で、抗原分子が放出されて なされ得る。むろん、細胞溶解せずにベリプラズマの内容物を放出する無毒性の 「漏れ」を用いることもさらに可能である。あるいは、キャリアー細胞によって 、その細胞が死滅する前に外の環境に対して用い得る抗原の製造を制御する遺伝 子が選択され得る。

被験体はさらに、キャリアー微生物をともなわないで、対象のタンパク質あるい はその断片、またはそのアナログの投与によって、本発明の抗原によって免疫さ れ得る。その断片あるいはアナログが用いられる場合は、免疫系と相互作用して それに対して、および構造的に似たエピトープに対して、被験体を免疫する１ま たはそれ以上のエピトープのアミノ酸配列を含む。免疫化の前に、特定のボルデ テラタンパク質、あるいはそのタンパク質のアナログ、あるいはそのタンパク質 の特定の断片の免疫原性を高めることが望ましい。このことは、当業者には公知 の数種の方法によって完成され得る。

例えば、抗原性のペプチドは、キャリアーに連結されて投与され得る。例えば、 断片は巨大分子キャリアーに結合され得る。適当なキャリアーには、典型的には 大きい、ゆっくり代謝される巨大分子、例えば、タンパク質；セファロース、ア ガロース、およびセルロースビーズなどのような多糖類；ポリグルタミン酸、お よびポリリシンなどのような多量体アミノン酸；アミノ酸コポリマー；および不 活性ウィルス粒子がある。特に有用なタンパク質基質には、キーボールリンペ。

トヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、Ｅ。

ｃｏｌｉの熱不安定前のβサブユニトあるいはフレ５毒ｃ７）βサブユニット、 および当分野では公知の他のタンパク質がある。

タンパク質基質は天然型で用いられるか、あるいはその官能基が、例えばリシン 残基のサクシニル化あるいはＣｙｓ−チオラクトンによる反応によって改変され 得る。さらに、例えばアミ７基の、２−イミノチオランまたは３−（４−ジチオ ビワジル）プロピオネートのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応に よってスルフヒドリル基がキャリアー（あるいは抗原）に取り込まれ得る。適当 なキャリアーはさらに、ペプチドの付着のためにスペースアーム（例えば、ヘキ サメチレンジアミンあるいは他の同じ大きさの二官能性分子）を取り込むように 改変され得る。

さらに、ボルデテラ抗原（あるいはその複合体）は、キャリアー微生物なしに投 与されるときは、中性あるいは塩の形態でワクチン組成物に調剤され得る。薬学 的に許容し得る塩は、酸付加塩（活性ポリペプチドの遊離アミン基によっテ形成 される）および塩酸またはリン酸のような無機酸；あるいは酢酸、シュウ酸、シ ュセ牛酸、マンデル酸およびこのような有機酸によって形成される。遊離のカル ボキシル基から形成される塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシ ウム、あるいは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリ メチルアミン、２−エチルアミンエタノール、ヒスチジン、およびプロ力インの ような有機塩基から形成され得る。

典型的には、抗原は、無毒性キャリアーなしに用いられるときは、エアロゾルと してまたは鼻腔内に投与される。哺乳類の被験体の鼻腔内用の調剤は、通常、鼻 腔内の粘膜を炎症を起こさせず、かつ繊毛機能をみださない賦形剤を含む。水、 生理食塩水または他の公知の物質などの希釈剤が、本発明に用いられえる。鼻薬 の調剤はさらに、限定はされないがクロロブタノールおよびベンズアルコニウム クロライドのような保存剤も含み得る。鼻粘膜で目的のタンパク質の吸着を増す ために界面活性剤も存在し得る。

病原性古来の遺伝子産物の注入がさらに、先の経口、鼻腔内、胃内、あるいはア エロゾルによる免疫化と組み合わせて用いられ得る。病原由来の遺伝子産物に対 する分泌免疫系が、一旦ＧＡＬＴおよびＢＡＬＴのリンパ細胞を刺激するために 病原由来遺伝子産物を発現するキャリアー微生物による免疫化によって感作され ると、このような非経口的免疫化は、ブウスターとして分泌免疫応答発現を促進 するために行われる。促進された応答は、第二応答、ブウスタ一応答あるいは追 憶応答として知られていて、結果として宿主の免疫防御を引き延ばす。

ブウスター免疫化は、有用な結果で、何度も繰り返され得る。

ワクチンがブウスター用などに注入用に調製されるとき、溶液あるいは懸濁液に され得る。溶液にあるいは懸濁液に適する固形形態、液体賦形剤は注入の前に調 製され得る。この調製物は乳化され得るか、あるいはリポソーム賦形剤に活性成 分がカプセル化され得る。活性な免疫原性成分は、薬学的に許容し得、その活性 成分と調和する賦形剤を含む賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤には、 水、生理食塩水、デ牛ストロース、グリセロール、エタノールなどのような、お よび、それらの組み合わせなどがある。さらに、所望ならば、加湿剤または乳化 剤、ｐＨ緩衝剤、あるいはワクチンの効果を促進するアジュバントなどのような 補助物質を少量含み得る。アジュバントには、例えば、ムラミルジペプチド、ア ビリジン、水酸化アルミニウム、油脂、サポニンおよび当分野に公知の他の物質 が含まれ得る。このような投与形態の実際の方法は、当業者には公知であるか、 あるいは明かである０例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ 、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ、　１５ｔｈ　ｅｄ、、１９７５を参照。投与される 組成物あるいは調剤物は、いずれにしても、処置される被験体において所望され る免疫状態に達するために適したタンパク質量を含む。

投与されるべき抗原の量は、処置される被験体、被験体の抗体を合成する免疫系 の能力、および所望される防御の程度に依存する。効果的な使用量は、定石の確 立されたカーブによって、当業者は、容易に確立し得る。被験体は、少なくとも １回、特定の抗原またはその断片、あるいはそのアナログを、キャリアー微生物 を伴ってかあるいは伴わない投与によって、免疫される。キャリアー微生物を用 いる典型的な使用量は、免疫される被験体当たりＩ　Ｘ　１０’〜ｌ×１０１１ １組換え無毒性細菌である。無毒性微生物を伴わないタンパク質を用いるワクチ ンの最初の使用量は０．００１〜ｌ　ｍ　ｇ抗原／体重ｋｇである。さらに、被 験体は、ボルデテラｓｐｐ、に対する免疫状態を保つために要求されるように、 増量的に、あるいは多量に投与され得る。

上記の開示では、一般的に本発明を述べた。さらに完全な理解は、次の明細書の 実施例によって得られる。実施例は、例を提供することを目的とし、本発明の範 囲をいかなる方法においても制限することを意図していない。

本発Ｕの　に　な菌株の 次の菌株の生物学的に純粋な培養物は、メリーランド州、ロックビル、バークロ ーンドライブ１２３０１のアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されてい る。示されている受託番号は、生存試験後に付与されて、必要な料金は支払っで ある。米国特許法施行規則１．１４および米国特許法１２２条に従い、特許庁長 官により権利を与えられた者は、特許出願が係属している間、その培養物を入手 することが可能である。出願に基づく特許が許可されると、上記培養物の公衆に 対する入手の制限は最終的に撤廃される。

さらに、この命名された寄託物は、寄託日から３０年間、あるいは寄託物の分譲 の請求のあった最終の日から５年間；または米国特許の存続期間；のいずれか最 長の期間の間保持される。培養物が死滅するか不測の事故により破壊されたり、 あるいはプラスミド含有法のとき、プラスミドが脱落した場合には、同一の分類 学上の種類の生存している培養物と差し換えられる。

（以下余白） ｃｈｉ４０６４　１ｑ８１矩ワＦ；７１５日　５３６４Ｂｃｈｉ４０７２　１’ １８’ｙ　俸ｔｏ　阿６日　６７５３ＢｐＹＡ２４０２ ｉｎ　ｃｈｉ１５１２１　１９８４Ｂら目２８８　６７９２１ｐＹＡ２：！２６ ｉｎ　ＬＥ３９２　τＣｌ９０１４３月２２日　−一一一−ｐＹＡ２］３３ ｉｎ　ＬＥ　３９２　１１ＪＯＢ　３月２２ヨ　−一−−−ｐＹＡ２３３Ｂ ｉｎ　ＬＥ　３９２　１ＱｑＯ斗３’ＭＺＺ日　−一一一一（ふ・へ千、余１５ ） Ｃ，ｕ １、社ｌ」≦１汰 他に注意書のあるものを除いて、次の材料と方法が用いられた。

細菌株、培地およびベクター Ｂ、　ａｖｉｕｍ　ＧＯＢＬ１２４は、Ｙ、Ｍ、　５ａｉｆ（ＯＨ）から得た１ ９７株かう単離された。この株はシチメンチョウの雛に有毒であって、ギニアビ ッグの赤血球細胞に付着し、基質の酸化アルカリ化によってＢ、　ａｖ±」と同 定された。ＧＯＢＬＬ２４は、最高付着（１）のためのインビトロ付着アッセイ の前に、１５％の繊維素除去したヒツジの血を添加したＢｏｒｄｅ　ｔ　−Ｇｅ ｎ　ｇｏｕ寒天（ＢＧＢ寒天）、または脳心臓融合培地（ＢＨＩ）で３７°Ｃで ２４時間増殖させた。

ＧＯＢＬＬ２４は、種々のベクターで用いられる染色体ＤＮＡ源である。Ｅ、　 ｃｏｌｊ　株はＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％ｊｔ［抽出物、０．５％Ｎ ａＣｌ５０．１％グルコース、■、５％寒天）で増殖した。培地に適当な抗生物 質を添加した。自殺ベクターｐＲ７７３３はＴｎ劇を有するｐＪＭ７０３．１ｉ ７）誘導体（２９）であって、Ｊ、Ｊ、　Ｍｅｋａｌａｎｏｓによってその供与 体り吐株５Ｍ１０−ラムダーピアに提供された（２９）。コスミドｐＹＡ２３２ ９は、ｐＵｃＤ２由来のスペクチノマイシン耐性を与える、１．８ｋｂの５ａｃ ｌ−ロホＩ消化されたＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理のＤＮＡ１１片を、劫ユＩ消 化されたクレノー処理のｐｃＰ１３にライゲージコンすることによって構築され た。

肱−生 ニコラスシチメンチョウの受精卵をＣａｒｇｉ　１１．　Ｉｎｃ、　、　Ｅｌｇ ｉｎ、　ＭＯｌから得た。そして、ホワイトレグホンニワトリの受精卵を５ＰＡ ＦＡＳ、夏ｎｃ、、Ｒｏａｎｏｋｅ、ＩＬから得た。それらをＮｏ、２１　Ｈｕ ｍｉｄａｉｒｅ　１ｎｃｕｂａｔｏｒでふ化するまでインキュベートした。

試薬 試薬は池に記載のないものは、Ｓｉｇｍａ、ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯから得た 。Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ寒天、およびＬＢ培地とＢＨＩ培地との試薬はＤ ｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍ＋、から得た。

ヒツジの血液はＢｒｏｗｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｔｏｐｅｋａ、ＫＳ 、から得た。制限酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼは１ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　１ｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ　ＣＴ から得て、業者の推薦に従って用いた。ワサビパーオキシダーゼ結合ヤギ抗シチ メンチョウィムノグロブリンは、ＩＣＮ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　 Ｌｉ５ｌｅ、ＩＬから得た。

Ｂ、　ａｖｉｕｍ　タンパク　に・　る　を　むポリクローナ区１竺二上血遺 ポリクローナルラビット血清は、ニューシーラントホワイトラビットに、精製し たＢ、ａｖｉ＋徂ＧＯＢＬ１２４の外膜タンパク質を皮下注射することによって 得られる。Ｂ、　ａｖｉｕｍ　ＧＯＢＬ１２４の外膜タンパク質は、Ｒａｐｐら （４９）の方法を多少変化させた方法にしたがって調製した。Ｂ、　ａｖｉｔ徂 ＧＯＢＬ１２４は、１リツターの５５Ｍ−３培地中、９．　９　ｘ　１０”７ｍ 　ｌの力価になるまで３７°Ｃで一晩、振とう培養した。細胞を沈澱させ、５０ ｍ１のｐＨ７，５のＰＢＳに再懸濁し、そしてＨｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌ ｔｒａｓｏｎｉｃｓ　Ｉｎｃ、　Ｍｏｄｅｌ　Ｗ１８５Ｄの超音波細胞粉砕機で 超音波処理した。処理は、それぞれ５０％の出力で４０ワツトにセットし、５分 間ずつ４回バーストした。超音波処理物は、そレソレノハーストの開、水上で５ 分間ずつインキュベートした。この細胞の破片を、４°Ｃにて２０分間２０００ Ｘｇで沈澱させた。上清液を除去し、そして膜は、５Ｓ３４０−夕−を用いて４ ℃にて１時間、１９．００Ｏｒｐｍ　で遠心分離し、沈澱させた。沈澱物を５ｍ ｌのｐＨ７，５のＰＢＳに再懸濁し、タンパク質の濃度を４ｍｇタンパク質／　 ｍ　ｌとした。ｐＨ７，５のＰＢＳ中の２％ラウリルサルコシンナトリウムを１ 容、懸濁した膜に加え、１％ラウリルサルコシンナトリウムを得た。得られた溶 液を室温で３０分間攪拌し、不溶性の外膜タンパク質を、５Ｓ３４０−ターを用 いて１時間、１９゜０００で沈澱させた。沈澱したタンパク質は、２　ｍ　ｌの ｐＨ７，５のＰＢＳに懸濁し、そしてタンパク質の濃度を２．５ｍｇタンパク質 ／　ｍ　ｌとした。

ラビットは、等量の完全フロインドアジュバント中の５゜ＯＨ２の精製外膜タン パク質（ＯＭＰ）ｆｉ製物で皮下的に免疫した。２週間後、ラビットを等量の不 完全フロインドアジュバント中の、５００μｇのＯＭＰ調製物で皮下的に追加免 疫した。ラビットから少量採血し、得られた血清を、後に示すように、Ｌ■ｌ胆 の外膜タンパク質を産生するＥ、　ｃｏｌｉの組換え体の検出に用いた。ラビッ トを、不完全フロインドアジュバント中の５００ｎｇのＯＭ　Ｐ調製物で定期的 に追加免疫し、多量の血液を採取しく４０ｍ１）、そして血清を集めた。

血清は、−２０’Ｃで凍結するか、あるいは等量の１００％グリセロールと混合 し、−２０’Ｃて保存した。

口復　のシチメンチョウの　） 生後４日目のニコラスシチメンチョウ（Ｎｉｃｈｏｌａｓ　ｔｕｒｋｅｙ）のひ なを、生後３００日目、Ｂ、　ａｖｉｕｍ　ＧＯＢＬＬ２４に感染しているシチ メンチョウ（このシチメンチョウは、生後２日目から感染していた）に曝して接 触感染させた。曝した４０日後に７チメンチヨウのひなに麻酔して全血を採取し 、回復期の血清を得た。この血清は、回復期のシチメンチョウの血清と反応する タンパク質を産生するＥ、　ｃｏｌｉのクローンを確認するために用いた。ある いはＢ、　ａｖｉｕｍに対する抗血清を、生後１日目のシチメンチョウに１．５ Ｘ１０７個の細菌を鼻腔内に感染させ、感染後１力月後に採血をすることによっ て、生産した。

ウェスタンイムノプロット 全ての細菌の細胞をサンプル緩衝液（ｐＨ６，８の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ ０％グリセロ−）１１％ＳＤＳ、１％２−β−メルカプトエタノール、０．０１ ％ブロモフェニルブルー）内で熱することによって変性させた。そして、Ｌａｅ ｍｍｌｉ（２４）に述べられているように、ドデシル硫酸ナトリウム−１０％ポ リアクリルアミドゲルで電気泳動した。確立された方法（４０）を用いてゲルを ニトロセルロースに移した。

フィルターを緩衝液Ａ（５０ｍＭ）リス、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，３％つ／血清 アルブミン、ｐＨ８）に浸し、回復期のンチメンチョウの抗り粒」」血清、ある いはＢ、　ａｖｉｕｍ外膜タンパク質に対する抗体と共にインキュベートし、緩 衝液Ａで洗浄し、ワサビのパーオキシダーゼに結合したヤギ抗シチメンチョウ免 疫グロブリンと共にインキュベートし、そして４゜クロロ−１−ナフトールとと もにディベロップした。

２、　Ｂ、　ａｖｉｕｍのパ５導入 Ｂｒａｄｌｅｙら（８）のプレート法によって、Ｔｎ凹をｐＲＴ７３３の供与体 であるＥ、　ｃｏｌｉの５Ｍｌ０−ラムダ−ピア株と接合させて、Ｂ、　ａｖｉ ｔ徂中に移動させた。４時間後、細菌を２５μｇ　／　ｍ　１のテトラサイクリ ン、１５０μｇ　／　ｍ　ｌのストレプトマイシン、７５μｇ　／　ｍ　１のカ ナマイシン、およびアルカリホスファターゼの色素原基質である５−ブロモ−４ −クロロ−３−インドールリン酸塩を添加したＢＨＩ寒天上に撒いた。３７°Ｃ で５日後、３．　ａｖｉｕｍの青いコロニーを集めた。アルカリホスファターゼ 活性は、酵素が外膜タンパク質中あるいは細胞のペリプラズム中に位置するとき のみ発現し得るため、モして区遺伝子のプロモーター配列およびシグナル配列が 、Ｔｎ呂の中ではないために、青色のコロニーは、内部でＢ、　ａｖｉ肥の運び 出されるタンパク質のプロモーター配列およびシグナル配列とフレームが一致し て、凹の移動および融合が起こっているものである。

約０．　２％のトランス接合個体が青色であり、従って、細菌の外膜、あるいは べりプラズムに位置するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター配列およ びシグナル配列に結び付いた劇を有している。全部で４８７個の青色のクローン 体が幾つかの別々の実験で集められた。

なので、Ｔｎ餞妨誘発の変異体のこれろの細胞への付着能力について、以下のア ッセイを用いてスクリーニングした。気管を、無菌で１退部のニワトリあるいは シチメンチョウから取り出し、２ｍｍの長さの環に切断した。ＢＧＢ寒天上で増 殖し、１ｍｌの緩衝液Ｂ　（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，２，５ｍＭＫＣｌ、１０　 ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ０４ｐ）１７．　４）中で懸濁した５ｘｌＯ９のＬ■士組細菌 を、次いで、この環を５回、緩衝液Ｂで洗浄し、付着してＩ、１な（１細菌を取 り除いた。次いで、この気管の環を５分間、１００μｌの緩衝液Ｂ中の１％のＴ ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中で、３７°Ｃで、回転ホイール（３０ｒｐｍ）上でイ ンキュベートすることにより、付着している細菌を回収した。次いで、この懸濁 した細菌を段階希釈溶液を、Ｂ旧寒天中にプレートし、２４時間３７°Ｃでイン キュベートして、付着性細菌の数を測定した。このア・ツセイを、各々の株につ いて３回行った。

４、インビボコロニー≦ 上記の方法により選択された親株および非付着性変異体を、インビボでもテスト した。テストは、５羽の１日齢のシチメンチョウに、鼻腔内的に、それぞれ、１ ．５ｘｌＯ７か、あるいは、１．５ｘｌＯ９のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の各 々の株を接種して行った。２週間後、このンチメンチョウをＣＯ３による窒息に より殺し、気管を無菌で取り除き、３ｍｌの緩衝液Ｂ中で、ＤｕＰｏｎｔ、　Ｗ ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥのＯＭＮ　ｌミキサを用いてホモジナイズした。次 いで、希釈液を、２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび１５０μｇ／ｍ　ｌ のストレプトマイシンを含有するＢＨ寒天上にプレートした。

野生型株、ならびに、ＳＴＬ　６．１６７．２５８、および、３８９という名称 の４つの非付着性（Ａｄｈ−）の変異体の分離された気管の環への付着について 、結果を表１に示す。他のＴｎ匡発生変異体は、この野生型株と同様の付着効率 を示した。

表１に、シチメンチョウがそれらの同じ株に感染した結果も示ス。１．５ｘｌＯ ７ＣＦＵをシチメンチョウに与えた場合、変異体は、そのシチメンチョウから再 分離されなかったが、元の接種材料が１．　５　ｘ　１０９ＣＦＵの場合、１つ を除いて全ての変異体から細菌が再分離された。これらの回収された細菌は、気 管の環への付着性についてのインビトロアッセイにおいて、野生型の株と同様に 付着性であった。

（以下余白） 表土 生型およびＴｎｈｏＡ　発Ｂ、ａｖｉｕｍパ　体による、　およびコロニーヅ 接種後２週間の気管から 株Ｎｏ、表現型　気管の環　回収されたＣＦＵ　（対数）ｂ接種材料　接種材料 ＧＯＢＬ１２４野生型　１００　８．４±０．５　８．７±０．３ＳＴＬ６　Ａ ｄｈ−０１０，１±Ｉ　ＮＤｄＮＤＳＴＬ１６７　Ａｄｈ−７，６±１．７　Ｎ Ｄｄ８．７±０．４゜５ＴＬ２５８　Ａｄｈ−８，８＋　１．４　ＮＤｄ３．７ ＋　０．３’５ＴＬ３８９　Ａｄｈ−０，９±ＯＪ　ＮＤｄ８．０±０．３・ａ リン酸緩衝液中の５　ｘ　１０　’　ＣＦＵを、３０分間３７℃で、１週齢のシ チメンチョウからの気管の環とともにインキュベートした。洗浄後、まだ付着し ている細菌を、この気管を１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００でインキュベートす ること（こより、回収した。

測定を３回行った。

ｂ取り出され、粉砕された気管、および、数えられた細菌。

’Ａｄｈ−：非付着性表現型。

ｄＮＤ：検出されず。

ｅ７チメンチヨウから回収された細菌は、気管の環にコロニー形成するのに優れ ていた。

５．１五肌監■遺ｉ広 この変異体および野生型の細菌の繊毛について、電子顕微鏡検査法を用いて調べ た。−滴のＢ）ＩＩ増殖細菌を、３００メツシユのＦｏｒｍｖａｒコートした銅 グリッドにおとし、１分間靜置した。このグリッドを、３滴の水滴で洗浄し、余 分の水を濾紙で除去し、このグリッドを空気乾燥させた。次いで、このグリッド を２％の酢酸ウラニル（Ｕｒａｃ）で３０秒間覆い、次いで、０．２％のＵｒａ ｃで洗浄した。余分の液体を濾紙で除去し、このグリッドを空気乾燥させた。こ の細菌の標本を、日立Ｈ−６００透過型電子顕微鏡を用いて調べた。この４つの 非付着性変異体および野生型法は、まさに同様であった。より正確には、繊毛お よびべん毛は、表５に変異体５ＴＬ２５８が示されるように、容易に見られ得る 。これにより、不活化タンパク質は、おそらくピリンではない。

６．４６キロダルトンの　・着タンパク　の己ａ、ＴｎｈＯＡ挿入の　に　して いるＤＮＡ配ダ（のクローニング。Ｔｎ吐旦挿入は、カナマイシン耐性で遺伝子 を標識する。

このように、カナマイシン耐性は、Ｔｎ匣挿入を含むクローンを選択するために 用いられ得る。Ｌυ±＋ｍ　Ｔｎ４誘発変異体由来の染色体ＤＮＡを、５ａｕ３ Ａで部分消化して、その断片を、アガロースゲル上でサイズ別に分離した。Ｔ呼 損状は、長さ約７．５キロベース（ｋｂ）であるので、より大きな断片をクロー ニングすることにより、周りのＢ、　ａｖｉｕｍＤＮＡは、カナマイシン耐性の ために選択されるクローン中に確実に含まれる。標準方法を用いて、１０から２ ０ｋｂの大きさの断片を、ゲルから切断し、電気的溶出によりアガロースから回 収し、Ｂａｍ旧消化したプラスミドｐＡｃＹｃ１８４　（５９）にライゲージコ ンして入れた。Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯｌをこれらのライゲーションしたプラ スミドで形質転換し、そして、カナマイシン耐性コロニーを選択しから４０％の ショ糖勾配で、大きさにより分離した。次いで、１３から２７ｋｂの大きさの断 片を、Ｘｈｏｌで切断したコスミドｐｃＰ１３　（１４）にライゲーションした 。ｐｃｐ　１３は、１染色体当り５から８の比較的低いコピー数を有する、広い 宿主範囲のコスミドクローニングベクターである。得られたライゲーション体を 、λインビトロパッケージング抽出物を用いて、ファージ粒子中にパッケージン グした（Ｐａｃｋａｇｅｎｅ”、　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｍａｄｉ ｓｏｎ、　Ｗｌ）　ｏ　このパッケージングされたコスミドを、Ｅ、　ｃｏｌｉ 　ＬＥ３９２に２０分間３７℃で吸着させ、ＬＢブロスを加え、この細菌培養物 を１５μｇ／ｍ　ｌのテトラサイタリンを添加したＬＢプレート上にまく前に、 ４５分間インキュベートした。

この変異体から分離されたＤＮＡを含むプラスミドは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍ Ｄのインビトロニソクトランスレーンヨンキットを用いて、ニックトランスレー ションにより３２ｐ標識し、野生型株由来の遺伝子挿入物を含むＥ、　ｃｏｌｉ クローンを検出するためのライブラリーを用いたインサイチュコロニーハイブリ ダイゼーションアッセイにおいてプローブとして用いられた。特に、ｐＡｃＹｃ Ｌ８４における各々の変異体由来のＴｎ吐妨変異配列をクローニングすることに より得られた４つのプローブは、Ｅ、　ｃｏｌｉ中の野生型Ｌ■ｉｕｍのコスミ ドライブラリーを用いてハイブリダイゼーションするために用いられた。この４ つのプローブは、同様のコスミドクローンと反応した。これらの全てのコスミド は、図１にその地図が描かれている、１７．６ｋｂのＸｈｏｌ　ＤＮＡ断片を共 通に有していた。これらのｐｃＰ１３クローンの１つを、ｐＹＡ２４０２変異体 から失われた付着タンパク質を同定するために、この変異体および親株由来の細 菌の溶解産物に対して、上記の方法で、イムノプロット分析を行った。野生型Ｂ 、　ａｖｉｕｍ株により産生される４６キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質ハ 、図３に示すように、４つの変異体中で明かに失われている。一方、図４は、こ のタンパク質が、プラスミドｐＹＡ２４０２により特徴づけられるライブラリー から分離された関連コスミドクローンを有するＥ、　ｃｏｌｉ　ＬＥ３９２中に 発現することを示す。

ボルデテラの種由来のＤＮＡは、高程度の相同性を有する。さらに、Ｂ、　ａｙ ｌ徂により引き起こされる鳥類の鼻気管炎は、生理病理学的に、百日咳菌、およ びパラ百日咳菌によりヒトに引き起こされる百日咳、ならびに、気管支敗血症菌 により引き起こされるブタの萎縮性鼻気管炎と類似している。従って、これら全 ての種は、Ｌυ」１中で同定される４６キロダルトンの付着タンパク質と同等で あるか、あるいは、類似している毒性因子を有するようである。

この因子、あるいは他の関連抗原をコードする遺伝子は、Ｂ、　ａｖｉｕｍから クローンされた付着遺伝子の内部の部分を用いた、その染色体ＤＮＡのサインブ ロノトノ＼イブリダイゼーンヨンを用いて、他のボルデテラ種において研究され 得る。上記のように、ｆ３．３ｖｉｕｍ付着に対して育成された免疫血清は、関 連タンパク質の産生を調べるためにウェスタンイムノプロットにおいて用いられ 得る。類似の付着が見られる場合、これらのタンパク質に対する抗体の存在は、 百日咳にかかってｌ、Ａた回復期のヒト由来の血清、および、萎縮性鼻炎にかか つていたブタ由来の血清において調べられ得る。これらの抗原は、種々のボルデ テラ種に免疫性を付与するために、ワクチン組成物において用いられ得る。

ａ、　Ｅ、　ｃｏｌｉにおける３、　ａｖｉｕｍｉ伝　ライブラリーの　築染色 体ＤＮＡを、）ｌｕｌｌらの方法（５０）により、Ｂ、　ａｖｉｕｍ　ＧＯＢＬ １２４から単離した。Ｂ、ａｖｉｕｍ　ＧＯＢＬＬ２４　ＤＮＡを、５ａｕ３ａ 、　Ｈｉｎｄｌｌあるいは、Ｘｈｏｌ生成りＮＡ断片を、ライゲーションのため に選択した。サイズ分画した、５ａｕ３ａ消化Ｂ、　ａｖ±ｔｍ　ＤＮＡを、シ ュ旧消化コスミドｐＹＡ２３２９　ＤＮＡに、一方、サイズ分画した、Ｈｉｎｄ ｌｌｌおよび抛１消化Ｂ、　ａｙ±ｔｍ　ＤＮＡを、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＸｈ ｏｌ消化ｐＣＰ１３　ＤＮＡに、それぞれライゲーションして入れた。このライ ゲーションしたＤＮＡを、プロメガからのパソケジーンλ頭部および尾部タンパ ク質中にパッケージングし、プロメガのプロトコルを用いて、Ｅ、　ｃｏｌｉ　 ＬＥ３９２中に形質移入した。組換えＬｃｏｌｔクローンを、（ｐｃＦ’ｌ　３ ベクターを有する組換えコスミドを選択するために）５０μｇ／ｍｌのテトラサ イクリンか、あるいは、（、ｐＹＡ２３２９ベクターを有する組換えコスミドを 選択するために）５０μｇ／ｍ　１のスペクチノマイシンを含有するＬＢ寒寒天 上シフメンチョウ　゛　と　応　るタンパク　を　るＥ、　ｃｏｌｉ組　えコス ミドクローンの６　組換えＥ、　ｃｏｌｔクローンのＢ、　ａｖ力徂外膜タンパ ク質に対する抗体との反応性、および、Ｂ、　ａｖｉｕｍに感染したシチメンチ ョウ由来の回復期の血清との反応について、コロニーイムノプロットアッセイに よりテストした。簡潔に説明すると、組換えＥ、　ｃｏｌｉクローンを、５０μ ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢＢ天上にプレートした。コロニーを、ニ トロセルロース濾紙でブロノトシ、発煙クロロホルムとの接触により溶解し、４ 時間、Ｂ、　ａｖｉｕｍ外膜タンパク質に対するウサギの抗体と反応させた。洗 浄後、残留する一次抗体を除去し、その溶解した組換えクローンを含む濾紙を、 ４時間から５時間、ＩＣＮ由来のワサビのペルオキシダーゼで標識したヤキ抗ウ サギＩｇＧ（アフイニテイで精製された）と反応させた。インキニヘーンヨンの 後、このニトロセルロースフィルターを、４−クロロ−１−ナフトール基質とデ ィベロップさせ、その結果を写真に取った。

回復期のシチメンチョウの血清を、−次抗体として用い、Ｋａｐｐｅｌ由来のワ サビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗シチメンチョウＩｇＧ抗体を二次抗体と して用いた以外は、同等のプロトコルを、回復期のシチメンチョウの血清と反応 する１３．　ａｖｉｕｍ７ンバク質を産生ずるＥ、　ｃｏｌｉ組換えクローンの 同定のために用いた。

ｃ、Ｅ、　ｃｏｌｉ組換えクローンにより　生されるＢ、　ａｖｉｕｍタンパク 　のウェスタンイムノプロット。　コロニーイム／プロットアッセイによるＥ、 　ｃｏｌｉ　ＬＥ３９２クローンの初回の同定後、陽性Ｅ、　ｃｏｌｉクローン を、材料および方法に記載されているように、ニトロセルロース紙への電気移入 による煮沸全細胞タンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動およびウェ スタンイムノプロット分析により、分析した。５つの組換えコスミドクローンが Ｂ、　ａｖｉｕｍ外膜タン外膜タンク質に対する抗体との反応性により同定され た（図６）。これらのＥ、　ｃｏｌｉ　ＬＥ３９２クローンの１つを、迦１で作 成したコスミドライブラリーから単離した。このクローンは、２１キロダルトン のタンパク質を産生じ、このプラスミドを、ｐＹＡ２３２０と名付けた。組換え クローンｐＹＡ２３２６を、Ｈｉｎｄｌｌ１作成コスミド作成ジスミドライブラ リー４０キロダルトンのタンパク質を特定した。ｐＹＡ２３３７．　Ｉ）ＹＡ２ ３３８．　および、ｐＹＡ２３３９と名付けられた、これらの組換えクローンは 、５ａｕ３ａ作成コスミドライブラリーから単離され、ＬＥ３９２中に、各々、 ３７キロダルトン、４３キロダルトン、および、４６キロダルトンタンパク質を 発現した。

回復期のシチメンチョウの血清と反応するＬＥ３９２中の５０キロダルトンのタ ンパク質を発現する、５ａｕ３ａ作成ライブラリー由来の１つの組換えコスミド クローンを同定し、ｐＹＡ２３３３と名付けた（図７）。　これらのタンパク質 の気管細胞への付着性について、実施例Ｃ，３に記載のようにテストし、それら が外膜付着タンパク質であるかどうかをさらに測定し得た。

ｄ、コスミドクローンＹＡ２３２０の、性イ・け。　ｐＹＡ２３２０　ＤＮＡを 分離し、もυＨ１−Ｐｓｔｌで消化し、貼徂旧−ｂユＩ消化ｐＹＡ２３２９にラ イゲーションして入れ、その組換え体をＥ、　ｃｏｌｔ　ＬＥ３９２に形質転換 した。形質転換体を、Ｂ、　ａｖｉｕｍ　ＯＭＰｓに対する抗体を用いてコロニ ーイム／プロットアッセイにより、スクリーニングし、２１キロダルトンのタン パク質を産生するＥ、　ｃｏｌｉサブクローンを同定した。１つの形質転換体が 、コロニーイム／プロットアッセイにより同定され、制限エンドヌクレアーゼ分 析により、ｐＹＡ２３３２と名付けられたこの組換えクローンが、６ｋｂのＢａ ｍ旧−Ｐｓｔｌ　ＤＮＡ断片を含むことがわかった。ｐＹＡ２３３２を含むＬＥ ３９２由来の全細胞タンパク質をウェスタンイムノプロットすることにより、こ のクローンが２１キロダルトンのタンパク質を産生ずることがわかった。この情 報により、その６ｋｂノＢａｍＨｒ−Ｐｓ　ｔ　ｌ　ＤＮＡ断片が２１キロダル トンのタンパク質ノ全遺伝子をコードすることがわかり、その遺伝子のＥ、　ｃ ｏｌｉにおける発現がそのクローンされた遺伝子のプロモーターにより指示され ることが示唆される。制限エンドヌクレアーゼ遺伝地図作成と、次の操作のため に、この６ｋｂのＢａｍＨ＋−Ｐｓｔｌ断片を、同様に消化されたｐＵＣ８−Ｉ 　ＤＮＡにライゲーションして入れ、Ｅ、　ｃｏｌｉＪＭ１０９中に形質転換し た。このＥ、　ｃｏｌｉクローンを、ｐＹＡ２３４０と名付けた。ｐＹＡ２３４ ０由来のプラスミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ遺伝地図を、上記のＭａｎ 　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓらに記載のように作成した。

８、　Ｅ、　ｃｏｌｉ組　えクローンの維、Ｂ、　ａｖｉｕｍｖ膜タンパク質に 対する抗体との反応性により、あるいは、Ｌ■士徂外膜タンパク質由来の回復期 の血清との反応性により同定された、Ｂ、　ａｖｉｕｍタンパク質を産生ずるＬ ｃｏｌｉ組換えクローンを一７０℃で以下のように貯蔵した。旦、ｃｏｌｉクロ ーンを、適当な抗生物質を含むＬＢ中で、３７°Ｃで一晩増殖させ、等量の８０ ％の水中グリセロールと混合し、−７０’Ｃで凍結させた。

９、　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの組　えワクチン株の生Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　工 は、各々、アデニル酸ンクラーゼおよびＣＡＭＰレセプタータンパク質をコード する１および■上遺伝子の欠失により無毒性にされ得る。これらの２つのタンパ ク質は、多数のカタボライトの移動および損傷に関する多数の遺伝子およびオペ ロンの転写のために必要である。さらに、β−アスパラギン酸セミアルデヒドデ ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（匡遺伝子）は、削除され得る。この酵素は 、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）　、すなわち、細菌の細胞壁の成分の合成にお いて用いられる。ＤＡＰを合成できない変異体は、ＤＡＰの少ない培地では生存 できない。いくつかのこれらの欠失変異を含むＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ株がつく られている。共にＣｕｒｔｉｓｓ　ａｎｄ　Ｋｅｌｌｙ　（１３）、および、現 在係属中の出願第２５１．３０４号に記載の株Ｃｈｉ４０６４およびｃｈｉ４０ ７２が、とくに有用である。ｃｈｉ４０６４は、１日齢のニワトリには無毒性で あることが示され、数週間で腸壁にコロニー形成し得る。

このようなＧＡＬＴにコロニー形成する株は、いくつかの粘膜の表面で、クロー ンされた抗原に対して分泌免疫グロブリンＡ　（ＳｌｇＡ）を産生じて、全身性 免疫反応を生じることも示した。

Ｌ■二徂付着抗原を無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌ　ｌａ株中に導入するために、この 抗原は、標準方法を用いて、Ａｓｄ“ベクターであるｐＹＡ２９２中にクローン され得る。このベクターは、現在係属中の出願第２５１．３０４号に記載され、 図２に示される。このベクターは、記載の無毒性株ｃｈｉ４０７２中に導入され 得る。

１０．２１キロダルトンの　、を発　るＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａのえワクチン株 の　！ ｐＹＡ２３３２由来の６ｋｂ醜ユ旧−里Ｉ　Ｂ、肛士徂ＤＮＡ断片をジ旦旧−Ｐ ｓｔｌ消化ｐＹＡ２９２にライゲーションして入れ、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｃｈｉ６ ０９７中に形質転換した。ｐＹＡ２３３６と名付けられた組換えプラスミドＤＮ Ａ　（図８）を含む、得られた形質転換体は、Ｂ、　ａｙ工胆ＯＭＰｓに対する 抗体を用いるウェスタンイムノプロット分析により分析すると、２１キロダルト ンのタンパク質を産生ずることがわかった。単離されたｐＹＡ２３３６　ＤＮＡ を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　皿ｉｍｕｒｊｕｍ　ｃｈｉ３７３０中に形質転換し た。ｃｈｉ３７３０　（ｐＹＡ２３３６）と名付けられた、得られた形質転換体 は、上記のように、ウェスタンイムノプロット分析により分析すると、２１キロ ダルトンのタンパク質を産生ずることもわかった（図９）。対数増殖期のｃｈｉ ３７３０　（ｐＹＡ２３３６）にバクテリオファージＰ２２旧ｉｎｔを、０．０ １の感染多重度で、Ｄａｖｉｓ、　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｒｏｔｈ、　Ａ ｄｖａｎｅｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に記載のように感染させる ことにより、バクテリオファージＰ２２　ＨＴｉｎｔ溶解産物を産生じた。この 感染細菌を１２から１５時間増殖し、クロロホルムで溶解し、細胞の残骸を除去 するために遠心分離した後、このバクテリオファージ溶解産物を収穫し、力価を 測定した。上記で作成したＰ２２旧匡溶解産物を用いて、０，５の感染多重度で 対数増殖期の細胞を感染させ、Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ　ｃｈｉ３９８７を形 質導入し、続いて、ＬＢ寒天上の形質導入体を選択した。形質導入体は、Ｂ、　 ａｖｉｕｍ　ＯＭＰＳに対する抗体を用いるウェスタンイムノプロット分析の分 析で、２１キロダルトンのタンパク質を産生ずることがわかったＣ、９およびＣ １１０に記載の組換えＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株は、以下のように、ニワトリおよ びシチメンチョウに免疫を付与するために用いられ得る。１日齢から３日齢の雌 シチメンチョウを、経口的および鼻腔内的に、飲み水に組換え無毒性微生物を含 ませることにより免疫化する。血清および呼吸性分泌をモニターし、抗体反応の 型［１ｇＹ　（ＩｇＧ、　７Ｓ　Ｉｇ）、　ＩｇＭ、および、ＩｇＡ　（ＩｇＢ ）］および量を測定する。免疫化および非免疫化の、ニワトリのひなおよびシチ メンチョウのひなを、重量減少について比較し、ワクチンの起こり得る副作用を モニターする。さらに、ニワトリのひなおよびシチメンチョウのひなに、１０９ の毒性のＬ■ｉｕｍを鼻腔内に接種することによるか、あるいは、感染したトリ との接触により、抗原投与する。抗原投与されたニワトリのひなおよびシチメン チョウのひなを、病気について観察し、検死し、この感染中の抗原投与した生物 の力価量における気管組織の損傷および変化について調べる。

Ｂ、　ａｖ工岨に対する粘膜免疫反応が、非常に若いニワトリおよびシチメンチ ョウを守るのに不十分であるなら、飼育雌ニワトリは、Ｂ、　ａｖ工正視外膜抗 原発現する無毒性Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａで免疫化され、母体の抗体の卵による転 移を可能にし得る。このような処置により、その若いニワトリあるいはシチメン チョウのひなが成長するうちに、Ｂ、　ａｖ工徂に対する免疫が増強される。同 様の組換えキャリアを用いた防御的経口免疫化を、成熟の間に行うこともできる 。

このように、ボルデテラ外膜抗原、これらの抗原を含むワクチン、および、それ を投与する方法が開示されている。本発明の好ましい実施態様は、いくぶん詳細 に記載されているが、添付の請求の範囲により定義されるように、本発明の意向 および範囲から逸脱することなく、明かな改変をし得ることがわかる。

（以下余白） ３１υ【 ２　Ａｒｐ、　Ｌ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｅｔ　Ｐａｔｈｏｌ　（１９８７ ）　２４：４１１−４１８゜１４　Ｄａｒｚｉｎｓ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、 Ｊ　Ｂａｃｔ　（１９８４）　１５９．ｌ：９−１７゜ＦＩＧ、　２ ＾　ＢＣＯＥＦ ＢＣＯＥＦ −ＩＥＩＯｋＤ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ −　４８．５ ＦＩＧ　７ ＦＩＧ、　８ ４８．５−　− ＦＩＧ、　９ 国際調査報告 国際調査報告　−ｍａａｌ　Ａｓ、、、＋、、ＩＩ。ＰＣＴ／ＵＳ９゜／（１１ ６８９国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．精製ボルデテラｓｐｐ．（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｓｐｐ）外膜タンパク質 。
2. ２．精製Ｂ．ａｖｉｕｍ外膜タンパク質。
3. ３．前記タンパク質の分子量が約２１キロダルトン，３７キロダルトン、４０キ ロダルトン、４３キロダルトン、４６キロダルトンあるいは５０キロダルトンで ある、請求項１あるいは２に記載の、タンパク質。
4. ４．薬学的に許容し得る賦形剤に調剤されたボルデテラｓｐｐ．の外膜タンパク 質を１種あるいはそれ以上含む、ワクチン組成物。
5. ５．１種あるいはそれ以上のＢ．ａｖｉｕｍのタンパク質を含むワクチン組成物 であって、タンパク質は、分子量２１キロダルトン、３７キロダルトン、４０キ ロダルトン、４３キロダルトン、４６キロダルトンあるいは５０キロダルトンを もち、該１種あるいはそれ以上のタンパク質が、薬学的に許容し得る賦形剤に調 剤されている、ワクチン組成物。
6. ６．請求項４に記載のワクチン組成物であって、機能性のアデニルシクラーゼお よび機能性のサイクリックＡＭＰレセプタータンパク質を実質的に生産できない 無毒性の細菌、あるいは機能性のアデニルシクラーゼ、機能性のサイクリックＡ ＭＰレセプタータンパク質、およびさらに機能性βアスパラギン酸セミアルデヒ ドデヒドロゲナーゼを生産できない細菌をさらに含有し、 そして該微生物が、前記１種またはそれ以上の外膜タンパク質をコードする１種 またはそれ以上の遺伝子に結合された、βアスパラギン酸セミアルデヒドデヒド ロゲナーゼ、あるいはその機能性の断片をコードする遺伝子を有するベクターを 含有する、ワクチン組成物。
7. ７．前記無毒性の微生物が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属の一員である、請求項６に 記載のワクチン組成物。
8. ８．家禽の上部気道疾患を予防あるいは改善する方法であって、請求項４、５、 ６あるいは７のいずれかに記載のワクチン組成物を該家禽に有効量投与すること を含む、方法。
9. ９．病原性微生物の無毒性の誘導体を有する、ボルデテラの種の外膜タンパク質 の発現のためのキャリアー微生物であって、該誘導体が実質的に機能性アデニル シクラーゼおよび機能性サイクリックＡＭＰレセプタータンパク質を生産し得ず 、一方該外膜タンパク質をコードする組換え遺伝子を発現し得る、キャリアー微 生物。
10. １０．請求項９に記載のキャリアー微生物であって、前記微生物が、さらに機能 性のβアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを実質的に生産し得ず、 そして前記組換え遺伝子が、前記外膜タンパク質をコードする遺伝子に結合した 、βアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼあるいは機能性のその断片 をコードする遺伝子を有するベクターを用いて、該キャリアー微生物に導入され る、キャリアー微生物。
11. １１．前記外膜タンパク質がＢ．ａｖｉｕｍ由来である、請求項１０に記載のキ ャリアー微生物。
12. １２．分子量が２１キロダルトン、３７キロダルトン、４０キロダルトン、４３ キロダルトン、４６キロダルトン、あるいは５０キロダルトンのＢ．ａｖｉｕｍ タンパク質の発現のためのキャリアー微生物であって、 該微生物が病原性微生物の無毒性の誘導体を有し、該誘導体が、機能性のアデニ ルシクラーゼ、機能性のサイクリックＡＭＰレセプタータンパク質、および機能 性のβアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを実質的に生産し得ず、 該キャリアー微生物が、１種あるいはそれ以上のＢ．ａｖｉｕｍタンパク質をコ ードする１種あるいはそれ以上の遺伝子に結合している、βアスパラギン酸セミ アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを有している、 キャリアー微生物。
13. １３．前記微生物がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属の一員である、請求項９、１０、１ １あるいは１２のいずれかに記載のキャリアー微生物。
14. １４．前記微生物がｃｈｉ４０６４（ＡＴＣＣ５３６４８）である、請求項９に 記載のキャリアー微生物。
15. １５．前記微生物がｃｈｉ４０７２（ＡＴＣＣ６７５３８）あるいはｃｈｉ６９ ８７（ＡＴＣＣ）である、請求項１０に記載のキャリアー微生物。
16. １６．次の（ａ）および（ｂ）を含む発現カセットを有するＤＮＡ構築物： （ａ）ボルデテラｓｐ．の外膜タンパク質の少なくとも１個のエビトープ、ある いはＢ．ａｖｉｕｍの外膜タンパク質の少なくとも１個のエピトープを含むポリ ペプチドのＤＮＡコーディング配列；および （ｂ）該コーディング配列に作動可能に結合された制御配列であって、それによ って、該コーディング配列が宿主細胞で転写および翻訳され得、そして、該ＤＮ Ａコーディング配列あるいは該制御配列の少なくとも１つが宿主細胞に対して異 種である、制御配列。
17. １７．請求項１６に記載のＤＮＡ構築物によって安定に形質転換された宿主細胞 。
18. １８．以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、組換えポリペプチドを生産する 方法： （ａ）請求項１７に記載の宿主細胞集団を提供する工程；および （ｂ）前記発現カセットにコードされたポリペプチドが発現される条件下に、該 細胞集団を増殖する工程。
19. １９．ボルデテラｓｐ．の外膜タンパク質あるいはＢ．ａｖｉｕｍの外膜タンパ ク質に対して特異的な精製ポリクローナル抗体。
20. ２０．ボルデテラｓｐ．の外膜タンパク質あるいはＢ．ａｖｉｕｍの外膜タンパ ク質に対して特異的なモノクローナル抗体。