JPH08187093A

JPH08187093A - パスツレラの抗原の製造方法

Info

Publication number: JPH08187093A
Application number: JP7192990A
Authority: JP
Inventors: Conlon Jennifer Anne Rice; ジェニファー・アン・ライス・コンロン; John A Walker; ジョン・エイ・ウォーカー
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 1996-07-23
Also published as: EP0694560A2; NZ272660A; AU2723795A; BR9503493A; EP0694560A3

Abstract

(57)【要約】【課題】制御された培養条件下でのパスツレラ・ムル
トシダ（Ｐ.multocida）に関連した特異的抗原の生成、
および特異的抗原の生成の監視におけるかかる条件の使
用を提供すること。【解決手段】パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.multocid
a）に感染した生物学的試料を準備し；好適な条件下、
培地中で該生物学的試料を培養し；好適な段階において
該培養物から抗原を収穫し；次いで、所望により、パス
ツレラ・ムルトシダに関連した抗原を精製し同定するこ
とを特徴とする、パスツレラ・ムルトシダ種または関連
種の少なくとも１種の抗原の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、制御された培養条
件下でのパスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.multocida）に関
連した特異的抗原の生成、および特異的抗原の生成の監
視におけるかかる条件の使用に関する。本発明は、好ま
しくは培養上清由来の抗原に関する。最も好ましくは、
本発明は、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.multocida）の
培養の培養上清からの抗原の同定および精製に関する。
また、本発明はこれらの抗原、および寄生体および特に
細菌からのいくつかの防御的および診断的な抗原および
抗体の検出および精製におけるかかる抗原の使用に関す
る。特に、本発明は、細菌科パスツレラ（Ｐasteurella
e）、好ましくはパスツレラ・ムルトシダ（Ｐasteurell
a multocida）、最も好ましくはパスツレラ・ムルトシ
ダ（Ｐasteurella multocida）Ａ：３型における抗原の
同定および精製に関する。また、本発明は、ワクチンに
おけるおよび診断目的のための検定における抗原の使用
に関する。本発明のワクチンは本発明に従い製造された
抗原を有する。好ましくは、該ワクチンは、制御された
条件下での細菌増殖、より好ましくは鉄制限培養条件下
での増殖の培養の培養上清由来の抗原に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従来
技術において、家畜を含む動物の寄生的、細菌的および
他の感染症を予防するためのワクチンの開発にかなりの
労力が注がれてきた。しかしながら、真核および原核生
物における外来産物の大量生産の関連技術が著しく進歩
しているにもかかわらず、過去５年間においてはこの目
的に向かっての進歩はほとんど達成されていない。例え
ば、動物に感染する重要な病原体中の抗原の同定が、依
然として、ワクチンの生成に対する主な障害となってい
る。疾患を予防するために、感染性微生物を取り込んだ
細菌ワクチンが使用されており、さまざまな結果が得ら
れている。実地研究および実験的試用からの証拠は、表
面抗原のみが提示されている細菌ワクチンを用いる予防
接種の逆効果を示唆している。不活性化全細胞細菌ワク
チンで予防接種された動物はしばしば、予防注射されて
いない動物より高い疾患頻度およびより重篤な死後病変
を示す。

【０００３】肺パスツレラ症は、野生動物および家畜動
物双方の広範にみられる重要な疾患である。該疾患はし
ばしば、環境因子およびパスツレラ・ムルトシダ（Ｐas
teurella multocida）およびパスツレラ・ヘモリチカ
（Ｐasteurella haemolytica）のような微生物因子の相
互作用による。商業目的のための動物の飼育において、
これらの生物は動物の死亡の重要な原因となり得る。ウ
シでは、「船積熱」肺炎が飼育場のウシの病気および死
亡の主要原因である（マーチン（Ｍartin）ら、１９８
０）。船積熱の発生にはいくつかの呼吸ウイルスおよび
細菌が関与しているが、該パスツレラ（Ｐasteurella）
が原因因子であると報告されている。これらのグラム陰
性の非運動性、発酵性通性嫌気性球桿菌または桿菌は、
主として、外見上健康な動物および時にはヒトの口およ
び上部呼吸上皮上の寄生生活に順応した動物病原体であ
る（アレン（Ａllen）ら、１９９１）。感染は通常、詰
め込み過ぎ、冷え、輸送または介入性感染のようなスト
レスの結果として起こる。したがって、獣医学において
パスツレラ症は主に病理学上および経済的に重要であ
る。

【０００４】肺パスツレラ症に対する抗ロイコトキシン
免疫のためのワクチンにおいて使用されているロイコト
キシンを遊離させるために、パスツレラ・ヘモリチカ
（Ｐasteurella haemolytica）が培養されている（米国
特許第５１６５９２４号）。しかし、ピー・ヘモリチカ
（Ｐ.haemolytica）と違い、パスツレラ・ムルトシダ
（Ｐ.multocida）はロイコトキシンを産生しない。この
生物の病原因子についてはほとんど知られていない。パ
スツレラ・ムルトシダ（Ｐasteurella multocida）は、
家禽コレラの原因として広く研究されており、その後、
ウサギ敗血症、ブタ斑、ウシ肺炎および出血性敗血症に
関連していることが確認されている。血清または血液を
加えた人工培地上の増殖が最もよく達成されており、血
液寒天上の出血がなくマッコンキー寒天上で増殖しない
ことによりパスツレラ・ヘモリチカ（Ｐasteurella hae
molytica）のような他の主要種から区別される。該生物
を区別するために５個の血清群および１６個の体血清型
が確認されている。莢膜血清群は典型的には血球凝集素
試験により確認され、一方、体抗原はゲル拡散沈殿試験
により確認されるかもしれない。これら５個の血清型は
莢膜多糖抗原に基づいており、これを表１に略述する。

【０００５】

【表１】

【０００６】一般に、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐaste
urella multocida）Ａ型および時にはＤ型が、イヌ、ネ
コ、ヤギ、ヒツジおよびウシを含むいくつかの動物の細
菌性肺炎に関連しており、数個の体血清型が各種におい
て単離されている。飼育場のウシにおける肺パスツレラ
症は、Ａ⁷型も提示されているかもしれないが、典型的
にはＡ³型（莢膜群Ａ、菌体抗原３）による。該疾患
は、化膿性気管支炎およびフィブリンの排出がほとんど
又は全くない気管支肺炎により病理学的に特徴づけられ
る。この疾患は、該微生物の接種、例えば気管内接種に
より実験的に再現されるかもしれない。生（チェンガッ
パ（Ｃhengappa）ら（１９８９））または熱死（ウィジ
ェワルダナ（Ｗijewardana）およびサザランド（Ｓuthe
rland））のいずれかの全パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.
multocida）よりなるワクチンを試験して、これらの全
ワクチンによりパスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.multocid
a）によるさらなる感染に対するある型の防御が得られ
ることが示されている。しかしながら、これらのワクチ
ンは、この生物の疾患予防にほとんど影響を与えていな
い。

【０００７】生ワクチンにおいては、防御作用の増強は
細菌性抗原の防御によると仮定された。細菌ワクチンを
得るために生物を殺すことは、重要であるかもしれない
抗原の量および型の喪失につながる。しかし、防御作用
の増強に関連した抗原は全く確認されていない。有効な
生ワクチンは、より有効な単一抗原ワクチンにおいて有
用な無傷のおよびおそらく防御的な抗原源を与えるかも
しれないが、家畜業においては生ワクチンの使用は困難
である。なぜなら、予防的抗菌療法が一般に用いられて
おり、生ワクチンの生存度が問題となるであろうからで
ある。また、全細胞ワクチンは、潜在的に有害な生体外
抗原をワクチン製剤中に導入する。単一の抗原ワクチ
ン、または公知含有物を有するワクチンは、免疫応答の
調節能を非常に高める。

【０００８】パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.multocida）
の、インビボでウシトランスフェリンから鉄を獲得する
能力が示されている（オグナリウォ（Ｏgunnariwo）
ら、１９９１）。鉄調節タンパク質（ＩＲＰＳ）がパス
ツレラ・ムルトシダ（Ｐ.multocida）の血清型について
記載されており、鉄調節条件下で誘導されたＩＰＲＳで
予防接種された免疫−回復子羊においてこれらのタンパ
ク質に対する抗体が見いだされている（ギルモア（Ｇil
more）ら、１９９１）。パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.m
ultocida）感染中の鉄の獲得についてはほとんど知られ
ていないが、抗体および補体によるパスツレラ・ムルト
シダ（Ｐ.multocida）細胞死は、細菌増殖のための鉄の
利用により避けられる。また、ウサギにパスツレラ・ム
ルトシダ（Ｐ.multocida）を実験的に感染させると、パ
スツレラ症に対する協同的宿主防御の一部として血漿鉄
濃度および熱が減少する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、パスツレラ・
ムルトシダに感染した生物学的試料を準備し；好適な条
件下、培地中で生物学的試料を培養し；好適な段階にお
いて該培養物から抗原を収穫し；次いで、所望により、
パスツレラ・ムルトシダに関連した抗原を精製し同定す
ることを包含する、パスツレラ・ムルトシダ種または関
連種の少なくとも１種の抗原の製造方法を提供するもの
である。

【００１０】パスツレラ・ムルトシダは、血清群または
体性血清型のいずれか１種由来であってよい。好ましく
は、血清群は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ型のいずれ
か１つ、より好ましくは、ＡまたはＤ型、最も好ましく
はＡ型である。体性血清型はいかなる血清型であっても
よいが、肺のパスツレラ症に関しては、最も好ましくは
Ａ³型である。

【００１１】上記方法に従って製造された抗原を用い
て、パスツレラまたは好ましくはパスツレラ・ムルトシ
ダに感染した動物における抗原のさらなる検出のための
抗体および抗体プローブを同定し製造してもよい。

【００１２】パスツレラ・ムルトシダに感染した生物学
的試料は、いかなる精製レベルのパスツレラ・ムルトシ
ダ細菌培養物であってもよい。好ましくは、パスツレラ
・ムルトシダの純粋培養物である。それゆえ、本発明の
さらなる態様において、パスツレラ・ムルトシダのコロ
ニーを準備し；コロニーからパスツレラ・ムルトシダ細
胞を単離し；コロニーからの細胞を、好適な条件下、培
地中で培養し；好適な増殖段階において培養物から抗原
を収穫し；次いで、所望により、パスツレラ・ムルトシ
ダに関連した抗原を精製し同定することを包含する、パ
スツレラ・ムルトシダ種または関連種の少なくとも１種
の抗原を製造する方法が提供される。

【００１３】細胞の培養は、パスツレラ・ムルトシダの
増殖を誘導するに適した条件下における何回かの継代培
養を必要とする。細胞増殖の条件は、生物学的試料また
は必要とされる細菌の増殖についての標準的条件であっ
てよい。パスツレラ・ムルトシダの培養に関して、コロ
ニーに何らかの適当な増殖培地、好ましくは血液寒天プ
レートを与えてもよい。

【００１４】当業者にとり使用可能ないかなる知られた
方法によっても、コロニーからの細胞の単離を行うこと
ができる。

【００１５】パスツレラ・ムルトシダ細菌の培養を、細
胞の増殖を誘導するのに適したいかなる培地中において
も行うことができる。好ましくは、増殖培地は最少細菌
増殖培地であり、より好ましくは、ＢＨＩＢ（脳・心臓
浸出ブロス）またはＢＨＩＢ含有培地ある。最も好まし
くは、培地の混合物であり、好ましくは、ＢＨＩＢとＲ
ＰＭＩ１６４０との混合物である。好ましくは、シュー
クロース、グルコースまたは血清のごとき栄養源を培養
物に補足する。最も好ましくは、培養物にシュークロー
スを補足する。

【００１６】コロニーからの細胞の増殖のための条件
は、パスツレラ・ムルトシダが増殖し、抗原を発現する
に十分で適当なものであろう。上記のごとく、パスツレ
ラ・ムルトシダは、疾病の進行の間に鉄を獲得する能力
を有している。鉄のレベルは、宿主防御機構に対するパ
スツレラ・ムルトシダの反応に影響するものであってよ
い。よって、好ましくは、増殖培地は、パスツレラ・ム
ルトシダの鉄捕捉系を刺激する低濃度の鉄を含有するも
のである。

【００１７】したがって、本発明のもう１つの態様にお
いて、パスツレラ・ムルトシダに感染した生物学的試料
を準備し；好適な培地中、鉄調節培養条件下で生物学的
試料を培養し；好適な段階において培養物から抗原を収
穫し；次いで、所望により、パスツレラ・ムルトシダに
関連した抗原を精製し同定することからなる、パスツレ
ラ・ムルトシダ種または関連種の少なくとも１種の抗原
を製造する方法が提供される。

【００１８】高濃度または低濃度の鉄を含有する培地に
より、鉄調節培養条件を提供してよいが、鉄濃度が、増
殖および抗原の発現を妨害するような高濃度もしくは低
濃度であってはならない。鉄の調節を、生物学的試料の
培養中のいずれの時点において行ってもよい。鉄の調節
を、培養の全段階または収穫前の培養の段階において行
ってもよい。

【００１９】したがって、本発明のさらなる態様におい
て、パスツレラ・ムルトシダに感染した生物学的試料を
準備し；好適な培地中、鉄制限培養条件下、生物学的試
料を培養し；好適な段階において培養物から抗原を収穫
し；次いで、所望により、パスツレラ・ムルトシダに関
連した抗原を同定し精製することからなる、パスツレラ
・ムルトシダ種または関連種の少なくとも１種の抗原を
製造する方法が提供される。

【００２０】低濃度の鉄の添加により、またはキレート
化剤の添加により、鉄濃度の制限をコントロールしても
よい。好ましくは、キレート化剤は、トランスフェリ
ン、フェリチン、フェロドキシン、ＥＤＴＡ、ＥＤＤＡ
またはジピリジルのごとき鉄キレート化剤であろう。好
ましくは、鉄キレート化剤は２，２’ジピリジルであ
る。

【００２１】抗原を、培養期間中のいかなる時点におい
ても収穫することができる。培養をモニターして、抗原
を収穫する適当な段階を決定してもよい。収穫の最適時
を確認するいかなる方法によっても、その段階を決定す
ることができる。ワクチン用の抗原の単離における培養
上清収穫の最適時は、十分な増殖が起こって十分な蛋白
および抗原を産生する場合には、好ましくは、パスツレ
ラ・ムルトシダの活性な対数増殖期であり、より好まし
くは、対数増殖期の初期ないし中期である。かかるレベ
ルを得るためには、少なくとも１回の対数増殖期が必要
である。

【００２２】培地中での増殖は十分に変化しうるもので
あり、収穫が行われる細菌増殖期間の特別な時点を特定
するよりもむしろ、細菌の増殖の決定要因の特徴をモニ
ターしなければならないことが見いだされている。本発
明の好ましい具体例によれば、通常の決定要因は、光学
密度またはコロニー形成単位／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍｌ）の
測定値である。好ましくは、光学密度を波長５２５ｎｍ
において測定する。接種されたパスツレラ・ムルトシダ
の新鮮培養物において、５２５ｎｍにおいて測定される
光学密度は、０．０１ないし０．０３の範囲、好ましく
は０．０２ないし０．０３の範囲である。十分な蛋白お
よび抗原を産生するためには、細胞は、少なくとも１
回、好ましくは２回の対数増殖を経なければならない
が、過剰に回数が多い場合には、増殖が活性な対数期を
越えてしまい、収穫ができなくなる。

【００２３】いったんこの段階に到達し、収穫される場
合には、好ましくは、光学密度は約０.２ないし０.４の
範囲、より好ましくは、約０.２５ないし０.３５の範囲
であり、最も好ましくは、約０.２８ないし０.３２の範
囲である。

【００２４】培養物を遠心分離して上清と細胞または細
菌を分離することにより抗原の収穫を行ってもよい。培
養物における抗原の収穫は、培養上清ならびに細胞中の
抗原の収穫を包含する。抗原を含んだ上清液を培地から
収穫した後、収穫した液体から適当なワクチンを調製し
てもよい。さらにそのうえ、活性な対数増殖期間中の上
清の収穫は、生物のインビボ増殖に近似している。

【００２５】収穫時に、液体を加工して外来物質を除去
する。例えば、収穫した液体をさらに遠心分離し、濾過
して、細胞、細胞壁断片、所望でない代謝物等をはじめ
とするすべての固体を除去し、それにより無細胞で相対
的にエンドトキシン不含の液体を得てもよい。かくし
て、ワクチンが投与された場合、グラム陰性細菌パスツ
レラ・ムルトシダの細胞壁中のエンドトキシンの存在に
よるかかる性質のワクチンに付随する重要な問題である
過敏症様反応の可能性は最小となる。この生物は厚い細
胞壁および莢膜を有するため、莢膜下に捕捉された抗原
が、ワクチン中に存在する細胞壁を伴わずに放出され
る。

【００２６】抗原の単離およびワクチンの調製に関し、
当業者に知られた種々の適当な方法が使用可能であるこ
とが理解される。適当な方法の決定は、調製されるべき
製品の性質および商業化の規模に依存する。

【００２７】抗原を濃縮するために、上清または細胞を
いかなる方法で処理してもよい。これには、濾過、エバ
ポレーション、濃縮または凍結乾燥が包含される。

【００２８】そのようにして収穫された培養上清または
細胞中の抗原を、濃縮して、あるいは濃縮せずに、精製
された液体としてこの段階で使用してワクチンを調製し
てもよい。かかるワクチンを用いてモノクローナルまた
はポリクローナル抗体をはじめとする抗体を生起させて
もよく、あるいはネイティブな抗原の代わりに使用する
組み換え蛋白抗原を構築してもよく、また、抗原のみを
分離し、精製し、単離し、特徴づけてもよい。抗原を、
診断アッセイおよびパスツレラ・ムルトシダによる感染
を検出するためのキットに使用してもよく、あるいはか
かる抗原の産生を誘導するのに有効な培養条件をモニタ
ーするためのパラメーターとして用いてもよい。

【００２９】ゲルクロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィーおよびＳＤＳアクリルアミドゲルを
含む電気泳動またはクロマトグラフィー法の使用をはじ
めとするいかなる既知の慣用的手段により抗原を分離し
精製してもよい。

【００３０】ウェスタンブロット法、免疫沈降アッセ
イ、放射免疫アッセイまたは酵素結合免疫アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）もしくは免疫蛍光アッセイを包含するいかな
る適当なアッセイ法を用いても培地中に含まれる抗原を
検出することができる。細菌に感染した動物由来の抗体
プローブを用いて抗原を検出してもよい。細菌を接種す
ることにより動物を感染させてもよく、あるいは自然感
染により感染させてもよい。

【００３１】抗体プローブが、細菌を接種された、ある
いは自然に細菌に感染した動物から得たれた感染血清由
来のものであってもよく、また、抗体プローブが、感染
動物の生物学的試料の培養上清由来のものであってもよ
い。

【００３２】生物学的試料はいかなる適当な形態であっ
てもよい。生物学的試料はパスツレラ・ムルトシダに感
染した動物由来のものであってよい。生物学的試料は、
感染動物の組織、器官、血清または血漿をはじめとする
血液、リンパ液もしくはリンパ節由来のものであってよ
い。生物学的試料を、感染動物のいかなる部分から採取
してもよい。しかしながら、感染部位またはある種の疾
病において形成されうる障害部分もしくはリンパ節のご
とき感染部位または障害に近接した部分から試料を採取
するのが好ましい。好ましくは、肝臓リンパ節、第４胃
のリンパ節、腸間膜リンパ節または肺のリンパ節から採
取することができる。

【００３３】生物学的試料を、いかなる時点においても
動物から採取してよいが、好ましくは、動物が感染して
からまもなく、あるいは動物が本発明の徴候を表した時
点で試料を採取する。

【００３４】より好ましくは、オーストラリア特許第６
４０３６４号記載の方法で抗体プローブを製造する。参
照によりその全開示を本明細書に取り入れる。この特許
には、疾病の病因に関連した抗原を同定するのに有効な
抗体プローブの開発が記載されている。該方法は、パス
ツレラ・ムルトシダ抗原に対する抗体プローブの開発に
適用できる。該方法は、該特許においてＣＡＢ（センタ
ー・フォー・アニマル・バイオテクノロジー（centre f
or Ａnimal Ｂiotechnology)）法として知られている。

【００３５】したがって、好ましい態様において、本発
明は、パスツレラ・ムルトシダのコロニーを準備し；コ
ロニーからパスツレラ・ムルトシダの細胞を単離し；適
当な条件下、培地中でコロニーからの細胞を培養し；増
殖の好適な段階において培養物から抗原を収穫し；次い
で、パスツレラ・ムルトシダ抗体プローブまたは機能的
等価物を用いてパスツレラ・ムルトシダに関連した抗原
を精製し同定することを包含する、パスツレラ・ムルト
シダ種または関連種の少なくとも１種の抗原を製造する
方法を提供する。

【００３６】さらなる好ましい態様において、本発明
は、パスツレラ・ムルトシダのコロニーを準備し；コロ
ニーからパスツレラ・ムルトシダ細胞を単離し；好適な
培地中、鉄調節培養条件下でコロニーからの細胞を培養
し；好適な段階において培養物から抗原を収穫し；次い
で、パスツレラ・ムルトシダに感染した動物由来のパス
ツレラ・ムルトシダ抗体プローブまたは機能的等価物を
用いてパスツレラ・ムルトシダに関連した抗原を精製し
同定することを包含する、パスツレラ・ムルトシダ種ま
たは関連種の少なくとも１種の抗原を製造する方法を提
供する。

【００３７】本発明のさらなる好ましい態様において、
パスツレラ・ムルトシダのコロニーを準備し；コロニー
からパスツレラ・ムルトシダ細胞を単離し；好適な培地
中、鉄制限培養条件下においてコロニーからの細胞を培
養し；好適な段階において、培養物から抗原を収穫し；
次いで、ＣＡＢ法により開発されたパスツレラ・ムルト
シダ抗体プローブまたは機能的等価物を用いてパスツレ
ラ・ムルトシダに関連した抗原を同定し精製することを
包含する、パスツレラ・ムルトシダ種または関連種の少
なくとも１種の抗原を製造する方法が提供される。

【００３８】したがって、本発明のさらなる態様は、約
６０Ｋ、４０〜４２Ｋ、３５Ｋおよび１４Ｋの範囲の分
子量を有するパスツレラ・ムルトシダに関連した抗原性
蛋白を提供する。

【００３９】そのようにして得られた抗原を、蛋白に結
合する適当な固体支持体、例えばＣＮＢｒ活性化セファ
ロース４Ｂ（Ｓepharose ４Ｂ）（ファーマシア(Ｐharm
acia)）、アフィゲル（Ａffigel）（バイオラッド(Ｂio
Rad)）または他のアフィニティークロマトグラフィー支
持体に結合させてもよい。

【００４０】したがって、本発明の好ましい態様におい
て、上記方法により製造されるパスツレラ・ムルトシダ
に関連した抗原を準備し；該抗原を固体支持体に固定化
し；該固定化抗原をパスツレラ・ムルトシダに対する抗
体を含有する試料に供し、抗体と抗原を反応させ、結合
させ；未反応試料を除去し；次いで、結合した抗体を該
抗原から溶離することを包含する、パスツレラ・ムルト
シダに関連した抗原に対する抗体を製造するためのさら
なる方法が提供される。

【００４１】アフィニティークロマトグラフィーによる
感染動物由来の複合血清試料または免疫細胞の培養上清
からの特定の抗体の分画および精製に、固定化抗原を適
用することができる。細菌パスツレラ・ムルトシダに感
染した動物の血清から血清試料を得てもよい。

【００４２】固定化抗原に抗体を結合した後、未結合巨
大分子の種は、例えば、１.５ＭＮaＣlを含有する緩衝
液で固体支持体から洗浄することができる。次いで、抗
原は、例えば、０.５−３.０Ｍチオシアン酸ナトリウム
などのカオトロピンイオンを含有する低または高ｐＨ緩
衝液などでアフィニティカラムから溶離することができ
る。

【００４３】したがって、本発明は、前記方法によって
製造されるパスツレラ・ムルトシダの抗原に対する抗体
を提供することである。

【００４４】単離または配置された抗原は、モノクロー
ナル抗体の調製において使用される。モノクローナル抗
体は、前記疾患の受動的治療の基礎を形成する。

【００４５】さらなる態様において、本発明は、パスツ
レラ・ムルトシダ種および関連のある種に対する前記定
義の防御抗原またはそのフラグメントに対するモノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体を提供するものであ
る。

【００４６】抗体は、該防御抗原またはそのフラグメン
トに対する抗体を産生する能力を有する、パスツレラ・
ムルトシダに対する抗原で免疫化された動物から得られ
たＢ細胞および骨髄腫細胞を準備し；該Ｂ細胞を骨髄腫
細胞と融合させ；これにより形成されたハイブリドーマ
を増殖させ；該ハイブリドーマによって産生された抗体
を収穫することからなる方法によって製造される。

【００４７】抗原を同定する場合、分子生物学または化
学技術、例えばクローニング技術は、この抗原の無制限
の量を生産するために使用されるか、別法としては、ワ
クチンを製造するための手段として同定された抗原の種
々のフラグメントに対応する合成ペプチドを使用する。

【００４８】したがって、本発明は、好ましくは、パス
ツレラ・ムルトシダ種または関連のある種の試料から誘
導されたゲノムライブラリーおよび前記抗体；または前
記のようなモノクローナル抗体またはその誘導体；また
は前記抗体プローブからなる群から選択される対応する
抗体を準備し；ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライ
ブラリーから合成ポリペプチドを発生させ；該抗体プロ
ーブで合成ポリペプチドをプローブし；次いで、これに
より検出された合成抗原性ポリペプチドを単離すること
を特徴とする、パスツレラ・ムルトシダ種および関連の
ある種に関連する合成抗原性ポリペプチドの製造方法を
提供するものである。

【００４９】ゲノムライブラリーを使用してもよい。ゲ
ノムライブラリーは、原核宿主（例えば、細菌）または
真核宿主（例えば、哺乳動物細胞）におけるＤＮＡのク
ローンの転写および次なる発現を可能にする好適な発現
ベクター中に組み込まれてもよい。ライブラリーをスク
リーニングするためのプローブは、好ましくは、（ｉ）同定および精製された抗原の全アミノ酸配列の断
片に基づく合成オリゴペプチドプローブ；（ｉｉ）同定された抗原のアミノ酸配列データに対応す
る合成ペプチドに基づく抗体；（ｉｉｉ）培地から得られた抗体；（ｉｖ）同定および精製された抗原に対して産生された
モノクローナルまたはポリクローナル抗体；および（ｖ）例えば、ワード（Ｗard）ら［１９８９、ネイチ
ャー（Ｎature）２４１、第５４４頁〜第５４６頁］に
よって開示されたような、抗原に対する特異性を有する
組換えまたは合成モノクローナル抗体またはポリペプチ
ドから選択される。

【００５０】単離された抗体は、パスツレラ・ムルトシ
ダによる次なる感染に対するワクチンとして有効な、ま
たは、以下に記載の診断アッセイにおいて使用される防
御抗原である。

【００５１】さらに、本発明は、パスツレラ・ムルトシ
ダまたは関連微生物；または、その機能的に活性な類似
体、突然変異体、誘導体またはフラグメントからの約６
０Ｋ、４０−４２Ｋ、３５Ｋまたは１４Ｋ防御抗原をコ
ードする核酸配列を提供するものでもある。

【００５２】したがって、本発明は、パスツレラ・ムル
トシダ細胞のコロニーを準備し；該コロニーからパスツ
レラ・ムルトシダ細胞を単離し；好適な培地中、鉄制限
培養条件下でコロニーからの細胞を培養し；好適な段階
で培養から防御抗原を収穫し；次いで、所望により、パ
スツレラ・ムルトシダに関連する抗原を同定し精製する
ことを特徴とするパスツレラ・ムルトシダ種または関連
のある種の少なくとも１種の抗原の製造方法を含む方法
によって製造されたパスツレラ・ムルトシダ種または関
連のある種に対する防御抗原を提供するものである。

【００５３】したがって、さらに好ましくは、本発明
は、前記概略記載の方法によって製造されたパスツレラ
・ムルトシダ感染症に対する防御抗原またはその抗体誘
導フラグメントを提供するものである。好ましくは、抗
原は、ほぼ、約６０Ｋ、約４０〜４２Ｋ、約３５Ｋおよ
び約１４Ｋの範囲の分子量を有する抗原から選択され
る。抗原は、細菌の他の種および菌株中に存在してもよ
い。

【００５４】組換えタンパク抗原は、防御抗原として細
菌から抽出される天然抗原の代わりに使用されると理解
される。

【００５５】さらにまた、かかる抗原は、多価ワクチン
中に、他の抗原、またはそのフラグメント、例えば、パ
スツレラ・ヘモリチカの培養から単離された抗原と組み
合わせて、船積熱を治療することもできる。かかる抗原
は、米国特許第５,０５５,４００号および第５,１６５,
９２４号に開示されている方法に従って得られる。

【００５６】防御エピトープを含有する抗原のフラグメ
ントおよび防御エピトープを含有する合成ペプチドは、
ワクチンおよび診断試験ならびにこれらの試験を取り込
んだキットにおいて全天然または組換え分子と置換され
る。

【００５７】抗原は、パスツレラ・ムルトシダの他の種
中に存在してもよく、かくして、示された病原によって
引き起こされるものに加えて、他の疾患の予防接種およ
び診断において有用である。

【００５８】さらに、本発明は、前記方法によって製造
される少なくとも１種の防御抗原の有効量を動物に投与
することからなる、動物におけるパスツレラ・ムルトシ
ダ種および関連のある種によって引き起こされる感染の
予防方法を提供するものである。

【００５９】好ましくは、防御抗原は、パスツレラ・ム
ルトシダＡ型、および、好ましくは、パスツレラ・ムル
トシダＡ³型から誘導された抗原である。

【００６０】さらに、本発明は、前記の少なくとも１種
の防御抗原の有効量を動物に投与することからなる、パ
スツレラ・ムルトシダ種および関連のある種によって引
き起こされる感染の治療方法を提供するものである。

【００６１】さらに、これらの抗原に対して生じた抗体
は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれも、
診断試験または免疫予防剤として使用されると解され
る。

【００６２】さらに、前記のように産生された防御抗原
に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の治
療有効量を動物に投与することからなる、動物における
パスツレラ・ムルトシダ種および関連のある種によって
引き起こされる感染症の治療方法を提供するものでもあ
る。

【００６３】さらに、本発明は、医薬的に許容される担
体中にパスツレラ・ムルトシダ種および関連のある種か
らの少なくとも１種の抗原の予防有効量を含むことから
なるワクチン組成物を提供するものである。

【００６４】本発明は、獣医学的に許容される担体中に
前記防御抗原に対する少なくとも１種のモノクローナル
またはポリクローナル抗体の治療有効量を含むことから
なるワクチンまたは獣医学的組成物を提供するものであ
る。

【００６５】本発明のワクチンまたは獣医学的組成物
は、経口投与されてもよ、あるいは、（例えば、筋肉
内、皮下、皮内または静脈内注射によって）非経口投与
されてもよい。

【００６６】必要とされる量は、活性成分の抗原性によ
って変化し、存在するワクチンの典型的な免疫応答を誘
発するのに充分な量が必要なだけである。

【００６７】反応実験は、必要とされる量を簡単に確立
する。ワクチンまたは獣医学的組成物の典型的な初期投
与量は、体重１ｋｇ当たり活性成分約０.００１〜１ｍ
ｇである。防御の所望のレベルを与えるために必要に応
じて投与速度が増加し、多投与が使用される。

【００６８】本発明のワクチンまたは獣医学的組成物
は、さらに、獣医学的に許容される担体、その希釈剤ま
たは賦形剤を含んでもよい。好ましくは、活性成分は、
担体に懸濁または溶解される。担体は、動物に対して無
毒性であり、活性成分に適合し易い固体または溶媒であ
る。好適な担体としては、生理学的濃度またはその近辺
の濃度の通常生理食塩水および他の無毒性塩などの液体
担体、またはタルクおよびシュークロースなどの固体担
体が挙げられる。所望により、アジュバント、例えば、
完全または不完全フロイントアジュバント、ムノキニン
（キール（Ｑuil）Ａ）、ＮＶＡ（カルボポル（Ｃarbo
pol））または免疫調節剤、例えば、サイトキニンを添
加して、抗原の抗原性を増強させてもよい。気管を介し
て投与するために使用する場合、ワクチンは、好適に
は、エーロゾルの形態で存在する。

【００６９】さらにまた、本発明は、前記のように同定
および精製されたパスツレラ・ムルトシダに対する診断
用抗原またはそのフラグメントを含む診断アッセイキッ
トを提供するものである。

【００７０】診断キットは、パスツレラ・ムルトシダ種
または関連のある種によって引き起こされる動物におけ
る感染の検出のために使用される。

【００７１】診断アッセイキットは、診断アッセイと共
に利用される。診断アッセイは、ウエスタンブロット技
術を含む。診断アッセイは、診断イムノアッセイであ
る。イムノアッセイは、免疫沈殿アッセイ、放射性アム
ノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、免疫蛍光アッセ
イまたは化学発光アッセイである。

【００７２】本明細書に記載する技術は、パスツレラ・
ムルトシダの培養における培養条件をモニターする手段
として使用してもよい。抗原の発現は、微生物に対して
存在する培養条件の反映である。抗原産生のレベルをモ
ニターすることによって、産生を生じる微生物に対して
存在する培養条件または特異的な抗原の産生速度を推論
することができる。

【００７３】したがって、本発明は、パスツレラ・ムル
トシダの培養試料を得；次いで、パスツレラ・ムルトシ
ダの抗原をモニターすることからなるパスツレラ・ムル
トシダの培養中における培養条件のモニターリング方法
を提供するものである。

【００７４】抗原は、パスツレラ・ムルトシダの抗原で
ある。好ましくは、ある培養条件下で反応性である抗原
であり、より好ましくは、鉄調節条件下、より好ましく
は、鉄制限条件下で、細菌によって生じた抗原である。
好ましくは、抗原は、約６０ＫＤ、４０〜４２Ｋ、３５
Ｋまたは１４Ｋ分子量の抗原を含む鉄制限条件下で産生
したパスツレラ・ムルトシダのいずれか１種である。

【００７５】抗原のモニターリングは、抗体、モノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体または検出剤分子で標
識されるかまたはコンジュゲートされる抗体プローブの
使用を含む検出手段による。

【００７６】逆に、培養条件の測定によって、生産され
た抗原のタイプを予想することができる。故に、培養条
件は、抗原産生を反映する。

【００７７】したがって、本発明は、パスツレラ・ムル
トシダの培養試料を入手し；次いで、培養条件をモニタ
ーすることからなる抗原産生のモニターリング方法を提
供するものである。

【００７８】また、抗原は、培養条件に依存して、種々
の速度で産生される。故に、もう１種の抗原と比較して
少なくとも１種の抗原の測定は、培養条件を反映する。
逆に、培養条件の測定は、もう１種の抗原と比較して抗
原についての産生のレベルに対する洞察を与えることが
できる。

【００７９】したがって、本発明は、パスツレラ・ムル
トシダの少なくとも１種の抗原のレベルを測定し、次い
で、該レヘルを同様の培養条件下でパスツレラ・ムルト
シダの少なくとも１種の他の抗原のレベルと比較するこ
とからなる培養条件のモニターリング方法を提供するも
のである。

【００８０】本発明は、少なくとも１種の抗原の産生を
測定し、次いで、抗原の産生を比較して、同様の条件下
で産生したもう１種の抗原のレベルを推測することから
なる抗原産生のモニターリング方法を提供するものであ
る。

【００８１】以下に図面について簡単に説明する。

【００８２】図１は、パスツレラ・ムルトシダの増殖を
表す図である。（ａ）は、経時的に光学密度を測定した
増殖を表す増殖曲線である。光学密度を５２５ｎｍにお
いて測定した。（ｂ）は、経時的にＣＦＵ／ｍｌを測定
した増殖を表す増殖曲線である。対数増殖は１２０分な
いし２２０分の間に得られた。

【００８３】図２は、パスツレラ・ムルトシダ培養上清
ならびに免疫されたウシ血清および／または抗原スクリ
ーニング上清を伴う細胞のスクリーニングを示す図であ
る。動物１９および２５の示されたリンパ節の培養物か
ら上清を得た。

【００８４】図３は、パスツレラ・ムルトシダ培養上清
ならびに免疫されたウシ血清および抗原スクリーニング
上清を伴う細胞のスクリーニングを示す図である。動物
１９、１５および２０の示されたリンパ節の培養物から
上清を得た。

【００８５】図４は、パスツレラ・ムルトシダ培養上清
ならびに免疫されたウシ血清および抗原スクリーニング
上清を伴う細胞のスクリーニングを示す図である。動物
４および１３のＣＡＢ法による示されたリンパ節から上
清を得た。

【００８６】本発明は、以下の実施例を参照してより完
全に説明される。しかしながら、以下の記載は、単なる
説明であり、いずれの場合も前記本発明の一般性につい
て制限を与えるものではない。

【００８７】

【実施例】

実施例１１．１パスツレラ・ムルトシダ（Ｐasteurella multo
cida）培養および抗原生成

【００８８】１．１．１培養１日目に、３７℃で一夜増殖させたパスツレラ・ムルト
シダ（Ｐ.multocida）の血液寒天平板からの数個のコロ
ニーを、ブレーンハートインフュージョンブロス(ＢＨ
ＩＢ）の２５０mlに接種し、３７℃で１００ＲＰＭで６
時間インキュベートする。上記６時間の後、鉄キレート
化剤培地中のパスツレラ・ムルトシダ（P. multocida）
の培養のために、１Ｌフラスコ中の新しい培養をつく
る。１Ｌフラスコに、２５０mlの１０％ショ糖ストック
溶液、２,２'−ジピリジルの２.５μl ３００mＭストッ
ク溶液（７０％エタノールから調製）、１０mlのＢＨＩ
Ｂ培養、および４６５mlのＲＰＭＩ−１６４０を加え
る。該フラスコを３７℃、１００ＲＰＭで一夜インキュ
ベートする。該培養の２日目に、該１Ｌ培養を２Ｌ発酵
槽または４Ｌフラスコにスケールアップする。これに上
記培養（鉄制限条件下の１Ｌ培養）の２〜３％、１００
mlの１０％ショ糖ストック溶液。１０μlの２,２'−ジ
ピリジルの３００mＭストック溶液およびＲＰＭＩ−１
６４０の２０００mlを加える。

【００８９】ついで、この培養を４Ｌフラスコ中３７
℃、１００ＲＰＭで、または発酵槽中３７℃、３００Ｒ
ＰＭの撹拌速度で一夜インキュベートする。出発ＯＤ
₅₂₅は０.０１〜０.０３の範囲である。５２５mＭで光学
密度を監視し、３〜３.５時間後、図１に示すとおり該
生物が少なくとも１回の対数増殖を経てＯＤ₅₂₅が０.２
８〜０.３２の範囲にある時に該培養を収穫する。つい
で、該培養を遠心管（５００ml）に移し、９５００ＲＰ
Ｍ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心管から得られた
上清を０.２２μmフィルターで濾過した。この段階で該
細胞を細胞ペレットとして集めて細胞溶解液を調製す
る。使用前の５〜１０分間、透析管をddＨ₂Ｏに浸し
た。ついで４℃で２日間にわたり、その間にddＨ₂Ｏを
変化させながら、２０リットルのddＨ₂Ｏに対し上清を
透析する。この期間の後、上清を集め、凍結乾燥前に全
容量を測定する。

【００９０】凍結乾燥された上清を滅菌水に再懸濁して
いずれかの所望の濃度にした。１０００mlの凍結乾燥上
清を１０mlに再懸濁して１００×濃縮調製物を得た。つ
いで、種々のアジュバントと混合することにより、この
調製物をワクチンとして用いる。この調製物は、ジピリ
ジルのような鉄キレート化剤を加えることにより鉄制限
を課した鉄制限条件存在下の培養に応答して生成した抗
原を提示する。また、ＲＰＭＩおよびショ糖のみである
鉄制限のない培養からの上清を集める。また、ゲル上ま
たはワクチン中での使用のための抗原源を提供するため
に、公知の技術により細胞懸濁液および溶解液を調製し
てもよい。

【００９１】実施例２抗原プローブの調製２.１免疫を得るための子牛の攻撃／予防接種種々の用量のパスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.multocida）
を子牛に接種する。これは０日目から開始し、以下の表
２に略述するとおり、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.mul
tocida）を１０⁵（低用量）、２.５×１０⁷（中用量）
および／または１０^8-10（高用量）および／または実施
例１に略述したとおりに得られるパスツレラ・ムルトシ
ダ（Ｐ.multocida）培養上清（予防接種）を用いて行
う。表２に記載の日数の後、高用量または中用量のパス
ツレラ・ムルトシダ（Ｐ.multocida）で該動物をさらに
攻撃する。攻撃の３〜４日後、該動物を犠牲にし、肺お
よびリンパ節を取り出し、２.２で略述するとおりＣＡ
Ｂ技術により加工して抗原スクリーニング上清を得る。
また、実施例３と同様にして培養上清をスクリーニング
するために感染動物からの血清を集める。約４０日目お
よび６６日目にすべての動物にチルミコシン（Ｔilmico
sin)(ミコチル（micotil）、６ml皮下）を与える。

【００９２】

【表２】

【００９３】２．２抗原スクリーニング上清を得るた
めのウシ・リンパ節の処理（ＣＡＢ技法）（ａ）試薬

【００９４】

【表３】

【００９５】培地処方増殖培地ＤＭＥＭ− ５００ｍｌ１０％ＦＣＳ（ＨＩ）− ５０ml グルタミン− ５ml Ｐen／Ｓtrep− １０ml ２−ＭＥ− ストック溶液１００μl 洗浄培地ＤＭＥＭ− ５００ml グルタミン− ５ml Ｐen／Ｓtrep− １０ml ２−ＭＥ− ストック溶液１００μl

【００９６】（ｂ）肺の処理滅菌条件下で肺を摘出し、氷上に移す。肺をＰＢＳで洗
浄し、切開用滅菌トレイに乗せる。気管支および縦隔リ
ンパ節を同定し、位置選定を行って切開する。該節を切
開し、洗浄培地を入れた容器中に貯蔵し、氷上に置く。
約５ないし６個のリンパ節を通常得る。この段階で、病
変肺の断片もまた保持し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡを入れた容
器中に貯蔵し、氷上に置く。

【００９７】（ｃ）リンパ節の処理リンパ節を該容器から無菌状態で取り出し、ペトリ皿に
置く。該リンパ節に付着した脂肪層を滅菌鉗子および鋏
で除去する。ついで、該リンパ節を切開し、ストレーナ
ーを通して細断し、細胞を取り出す。細胞を洗浄し、１
２００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離に付す。上清を
除去し、細胞を増殖培地に再懸濁させる。

【００９８】（ｄ）肺組織の処理肺組織を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡで洗浄してフラッシュさせ
る。肺を切開し、ＰＢＳでシーブを通して細断する。細
胞を１２００ＲＰＭ、４℃で１０分間洗浄し、上清を除
去し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡに再懸濁させる。該細胞を再懸
濁および遠心分離（１２００ＲＰＭ、４℃、１０分間）
を繰り返すことにより３ないし４回、無菌洗浄する。つ
いで、細胞を増殖培地（４０ml）に再懸濁させ、氷上に
貯蔵する。

【００９９】（ｅ）組織培養フラスコの調製細胞を血球計で計数し、５ｘ１０⁸個細胞／mlで増殖培
地に再懸濁させる。組織培養フラスコを５ｘ１０⁶個細
胞／ml増殖培地で７５cm²フラスコでは総容量５０mlま
たは２５cm²フラスコでは１０mlまで接種する。細胞を
３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートする。インキュベ
ートから３ないし４日経過後、細胞を３０００ＲＰＭで
１５分間収集する。上清を収集し、−２０℃で貯蔵す
る。これが抗原スクリーニング上清またはＣＡＢワクチ
ンである。

【０１００】実施例３３．１パスツレラ・ムルトシダ培養上清および細胞
中の抗原の同定実施例１にて調製した培養上清および細胞溶解液を１２
％分離ゲルおよび４％スタッキングゲルを用いるＳＤＳ
−ＰＡＧＥ操作に付す。ニトロセルロース膜をメタノー
ル中に浸した後、タンパク質を該膜上に移す。ついで、
該膜を５００ｍＰＰＢＳ、５００μｌＦＣＳおよび２
５０ｍＰツィーン（Tween）−２０を含有するブロック
緩衝液中に１時間インキュベートする。

【０１０１】該膜を抗原スクリーニング上清またはＣＡ
Ｂワクチン［実施例２．２］あるいは感染動物の血清の
１／２０希釈液（２ｍｌ）中に３時間インキュベート
し、ついでブロック緩衝液中に３回洗浄する。ついで、
膜をヤギ抗−ウシアルカリ性ホスファターゼ接合抗体の
１／２０００希釈液と共に１時間インキュベートし、つ
づいてブロック緩衝液中に２回、炭酸塩緩衝液中に１回
洗浄する。基質を加えてバンド検出について色相を顕色
する。

【０１０２】

【表４】

【０１０３】図２は、パスツレラ・ムルトシダ上清（実
施例１）およびジピリジルの存在下にて増殖させ、ウシ
１９番および２５番からＣＡＢ技法により得られた抗原
スクリーニング上清または血清でスクリーンしたパスツ
レラ・ムルトシダ細胞（実施例１）のウェスタン・ブロ
ットを示す。第１（左側）の帯は血清で、残りの帯は個
々のリンパ節または肺組織（ＬＬＯ）からの抗原スクリ
ーニング上清でプローブされる。

【０１０４】同定された抗原を標識化する；１＝６０ｋ
ＤＡ、２＝４０−４２ｋＤＡ、３＝３５ｋＤＡ、４−１
４ｋＤＡ。

【０１０５】図３は、パスツレラ・ムルトシダ上清（実
施例１）およびジピリジルの存在下にて増殖させ、ウシ
１５番、１９番および２０番からＣＡＢ技法により得ら
れた抗原スクリーニング上清または血清でスクリーンし
たパスツレラ・ムルトシダ細胞（実施例１）のウェスタ
ン・ブロットを示す。第１（左側）の帯は血清で、残り
の帯は個々のリンパ節または肺組織（ＬＬＯ）からの抗
原スクリーニング上清でプローブされる。

【０１０６】同定された抗原を標識化する；１＝６０ｋ
ＤＡ、２＝４０−４２ｋＤＡ、３＝３５ｋＤＡ、４−１
４ｋＤＡ。

【０１０７】図４は、パスツレラ・ムルトシダ上清（実
施例１）およびジピリジルの存在下にて増殖させ、ウシ
４番および１３番からＣＡＢ技法により得られた抗原ス
クリーニング上清または血清でスクリーンしたパスツレ
ラ・ムルトシダ細胞（実施例１）のウェスタン・ブロッ
トを示す。第１（左側）の帯は血清で、残りの帯は個々
のリンパ節または肺組織（ＬＬＯ）からの抗原スクリー
ニング上清でプローブされる。

【０１０８】同定された抗原を標識化する；１＝６０ｋ
ＤＡ、２＝４０−４２ｋＤＡ、３＝３５ｋＤＡ、４−１
４ｋＤＡ。

【０１０９】３．２ＣＡＢワクチン技法の結果１．４０−４２ｋＤ抗原は、上清および全細胞抗原の
両方で一致し、かつ最も強く同定される抗原である。

【０１１０】２．さらに別のいくつかの抗原が同定さ
れている。特に、細胞および上清中、−６０ｋＤ抗原
が、および上清中、−１４ｋＤの低分子量の曇り（smea
r）が多くの動物にて強く認識されている。１４ｋＤ抗
原はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で十分に分解せず、ポリサッカ
リドまたはＬＰＳが充填されていてもよい。他の抗原
（３５ｋＤ）が限定された数の明確に応答している動物
でほとんど一致することなく同定されている。

【０１１１】３．３要約以下の３種の抗原を同定する：（i）細胞および培養上清中に見られる４２ｋＤ抗原、
（ii）細胞および培養上清中に見られる−６０ｋＤ抗
原、（iii）培養上清中に優勢的に見られる−１４ｋＤ
抗原。また、数頭のウシにて３５ｋＤでの副の抗原が認
識されている。

【０１１２】実施例４４．１上清のワクチンとして効果培養上清より調製したワクチンを実施例１に従って調製
し、動物をワクチン接種し、微生物で攻撃した。

【０１１３】

【表５】

【０１１４】

【表６】

【０１１５】同列にある異なる上つき文字で示す最小二
乗平均は有意に異なる（ｐ＜０.００６）群１− ピー・ムルトシダ菌抽出物− ２０ｘ濃度群２− ピー・ムルトシダ菌抽出物− １２.５ｘ濃度群３− ピー・ムルトシダ菌抽出物− ７.５ｘ濃度

【０１１６】

【表７】

【０１１７】ａ，ｂ同列にある異なる上つき文字で示
す最小二乗平均は有意に異なる（ｐ＜０.０２）対照：ＰＢＳ−２用量、２ml／用量ＩＭ、０日および
２１日（３週間の間隔）ピー・ムルトシダ：パスツレラ・ムルトシダ実験ワクチ
ン、２用量、２ml／用量ＩＭ、０日および２１日(３週
間の間隔)(キレート化剤不在) ピー・ムルトシダ＋Ｃ：パスツレラ・ムルトシダ＋キレー
ト化剤の実験ワクチン、２ml／用量ＩＭ、０日および
２１日（３週間の間隔）

【０１１８】

【表８】

【０１１９】同列にある異なる上つき文字で示す最小二
乗平均は有意に異なる（ｐ＜０.０２）群１− ピー・ムルトシダ菌抽出物− ２０ｘ濃度群２− ピー・ムルトシダ菌抽出物− １２.５ｘ濃度群３− ピー・ムルトシダ菌抽出物− ７.５ｘ濃度

【０１２０】

【表９】

【０１２１】同列にある異なる上つき文字で示す最小二
乗平均は有意に異なる（ｐ＜０.０００１）ワクチン接種体＝ピー・ヘモリティカ・トキソイド／ピ
ー・ムルトシダ菌抽出物−２０ｘ濃度

【０１２２】最後に、種々の修飾および／または変形、
例えば、本明細書の記載に基づく弱毒化ワクチンの調製
は、前記した本発明の意図する範囲を逸脱することなく
行いうることが分かるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）は、経時的に光学密度を測定したパス
ツレラ・ムルトシダの増殖を表す増殖曲線を示すグラフ
であり、（ｂ）は、経時的にＣＦＵ／ｍｌを測定したパ
スツレラ・ムルトシダの増殖を表す増殖曲線を示すグラ
フである。

【図２】パスツレラ・ムルトシダ培養上清ならびに免
疫されたウシ血清および／または抗原スクリーニング上
清を伴う細胞のスクリーニングを示すウエスタン・ブロ
ットの結果を表す図である。

【図３】パスツレラ・ムルトシダ培養上清ならびに免
疫されたウシ血清および抗原スクリーニング上清を伴う
細胞のスクリーニングを示すウエスタン・ブロットの結
果を表す図である。

【図４】パスツレラ・ムルトシダ培養上清ならびに免
疫されたウシ血清および抗原スクリーニング上清を伴う
細胞のスクリーニングを示すウエスタン・ブロットの結
果を表す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＤＲ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者ジョン・エイ・ウォーカーオーストラリア3103ビクトリア、バルウィン、クラファム・ストリート26番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ.multocid
a）に感染した生物学的試料を準備し；好適な条件下、
培地中で該生物学的試料を培養し；好適な段階において
該培養物から抗原を収穫し；次いで、所望により、パスツレラ・ムルトシダに関連した抗原を
精製し同定することを特徴とする、パスツレラ・ムルト
シダ種または関連種の少なくとも１種の抗原の製造方
法。
【請求項２】生物学的試料がパスツレラ・ムルトシダ
のコロニーから単離されたパスツレラ・ムルトシダの細
胞を含む請求項１記載のパスツレラ・ムルトシダ種また
は関連種の少なくとも１種の抗原の製造方法。
【請求項３】細胞のコロニーが、好適な培地中、鉄制
御培養条件下で培養される請求項２記載のパスツレラ・
ムルトシダ種または関連種の少なくとも１種の抗原の製
造方法。
【請求項４】細胞のコロニーが、好適な培地中、鉄制
限培養条件下で培養される請求項３記載のパスツレラ・
ムルトシダ種または関連種の少なくとも１種の抗原の製
造方法。
【請求項５】培地が鉄制限培養条件を与えるように鉄
キレート化剤を含有する請求項４記載の製造方法。
【請求項６】鉄キレート化剤がジピリジルである請求
項５記載の製造方法。
【請求項７】ジピリジルが２,２'−ジピリジルである
請求項６記載の製造方法。
【請求項８】抗原を収穫するための好適な段階が５２
５ｎｍで培養の光学密度を測定することによって測定さ
れる請求項４記載の製造方法。
【請求項９】収穫するための好適な段階が、細胞のコ
ロニーの、培地への接種以降に少なくとも１回の対数増
殖期が生じた段階で生じる請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】収穫時に測定された５２５ｎｍでの光
学密度が０.２〜０.４の範囲である請求項９記載の製造
方法。
【請求項１１】光学密度が約０.２５〜０.３５の範囲
である請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】光学密度が約０.２８〜０.３５の範囲
である請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】抗原が培養の上清から収穫される請求
項４記載の製造方法。
【請求項１４】抗原が培養の細胞から収穫される請求
項４記載の製造方法。
【請求項１５】さらに、感染動物から誘導された抗体
プローブを使用する抗原を同定し精製する工程を含む請
求項４記載の製造方法。
【請求項１６】抗体プローブがＣＡＢ技術を使用して
誘導される請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】抗体プローブが感染動物の血清から誘
導される請求項１５記載の製造方法。
【請求項１８】請求項１記載の方法により製造された
パスツレラ・ムルトシダに関連した抗原。
【請求項１９】請求項２記載の方法により製造された
パスツレラ・ムルトシダに関連した抗原。
【請求項２０】請求項３記載の方法により製造された
パスツレラ・ムルトシダに関連した抗原。
【請求項２１】請求項４記載の方法により製造された
パスツレラ・ムルトシダに関連した抗原。
【請求項２２】約６０Ｋ、４０−４２Ｋ、３５Ｋまた
は１４Ｋの範囲の分子量を有するこれらの抗原からなる
群から選択される請求項１８記載のパスツレラ・ムルト
シダに関連した抗原。
【請求項２３】請求項２１記載のパスツレラ・ムルト
シダに関連した少なくとも１種の抗原を含有することを
特徴とする抗原調製物。
【請求項２４】請求項４記載の方法によって製造され
たパスツレラ・ムルトシダに関連した抗原を準備し；固
体支持体上に該抗原を固定化し；該固定化抗原を、パス
ツレラ・ムルトシダに対する抗体を含有する試料に付
し、次いで、該抗体および抗原を反応させ、結合させ；
未反応試料を除去し；次いで、該抗原から結合抗体を溶離することを特徴とするパスツ
レラ・ムルトシダに関連した抗原に対する抗体の製造方
法。
【請求項２５】請求項２４記載の製造方法によって製
造されたパスツレラ・ムルトシダに対する抗体。
【請求項２６】請求項４記載の方法によって製造され
た抗原に対する抗体を製造する能力を有し、パスツレラ
・ムルトシダに対する抗原で免疫化された動物から得ら
れたＢ細胞またはそのフラグメントおよび骨髄腫細胞を
準備し；該Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させ；これにより
形成されたハイブリドーマを増殖させ；次いで、該ハイブリドーマによって産生された抗体を収穫するこ
とを特徴とする方法によって製造されたパスツレラ・ム
ルトシダ種または関連種の抗原に対するモノクローナル
もしくはポリクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２７】請求項２６記載のモノクローナル抗
体。
【請求項２８】パスツレラ・ムルトシダ種または関連
種の試料から誘導されたゲノムライブラリーおよび請求
項２５記載の抗体、または請求項２７記載のモノクロー
ナル抗体、またはＣＡＢ技術によって製造された抗体プ
ローブからなる群から選択される対応する抗体を準備
し；ゲノムライブラリーから合成ポリペプチドを発生さ
せ；該抗体、モノクローナル抗体または抗体プローブで
合成ポリペプチドをプローブし；次いで、これにより検出された合成抗原性ポリペプチドを単離す
ることを特徴とする、パスツレラ・ムルトシダ種および
関連種に関連した合成抗原性ポリペプチドの製造方法。
【請求項２９】パスツレラ・ムルトシダ細胞のコロニ
ーを準備し；好適な培地中、鉄制限培養条件下で細胞の
コロニーを培養し；好適な段階で培養から防御抗原を収
穫し；次いで、所望により、パスツレラ・ムルトシダに関連した抗原を
同定し精製することを特徴とする、パスツレラ・ムルト
シダ種または関連種に対する防御抗原の製造方法。
【請求項３０】培地が鉄制限培養条件を与えるために
鉄キレート化剤を含有する請求項２９記載の製造方法。
【請求項３１】鉄キレート化剤がジピリジルである請
求項３０記載の製造方法。
【請求項３２】ジピリジルが２,２−ジピリジルであ
る請求項３１記載の製造方法。
【請求項３３】抗原を収穫するための好適な段階が５
２５ｎｍで培養の光学密度を測定することによって測定
される請求項２９記載の製造方法。
【請求項３４】収穫するための好適な場が、細胞のコ
ロニーの、培地への接種以降に少なくとも１回の対数増
殖期が生じた段階で生じる請求項２９記載の製造方法。
【請求項３５】５２５ｎｍでの光学密度が０.２〜０.
４の範囲である請求項３３記載の製造方法。
【請求項３６】光学密度が約０.２５〜０.３５の範囲
である請求項３５記載の製造方法。
【請求項３７】光学密度が約０.２８〜０.３５の範囲
である請求項３５記載の製造方法。
【請求項３８】抗原が培養の上清から収穫される請求
項２９記載の製造方法。
【請求項３９】抗原が培養の細胞から収穫される請求
項２９記載の製造方法。
【請求項４０】さらに、感染動物から誘導された抗体
プローブを使用して抗原を同定し精製する工程を含む請
求項２９記載の製造方法。
【請求項４１】抗体プローブがＣＡＢ技術を使用して
誘導される請求項４０記載の製造方法。
【請求項４２】抗体プローブが感染動物の血清から誘
導される請求項４０記載の製造方法。
【請求項４３】パスツレラ・ムルトシダ細胞のコロニ
ーを準備し；好適な培地中、鉄制限培養条件下で細胞の
コロニーを培養し；好適な段階で培養から防御抗原を収
穫し；次いで、所望により、パスツレラ・ムルトシダに関連した抗原を
同定し精製することを特徴とする製造方法によって製造
されたパスツレラ・ムルトシダ種または関連種に対する
防御抗原。
【請求項４４】約６０Ｋ、４０−４２Ｋ、３５Ｋまた
は１４Ｋの範囲の分子量を有するこれらの抗原からなる
群から選択される請求項４３記載の防御抗原。
【請求項４５】請求項４３記載のパスツレラ・ムルト
シダに関連した少なくとも１種の抗原を含むことを特徴
とする防御抗原調製物。
【請求項４６】請求項４３記載の少なくとも１種の防
御抗原の有効量を動物に投与することを特徴とする動物
におけるパスツレラ・ムルトシダ種および関連種に起因
する感染の予防方法。
【請求項４７】請求項４３記載の少なくとも１種の防
御抗原の有効量を動物に投与することを特徴とするパス
ツレラ・ムルトシダ種および関連種に起因する感染の治
療方法。
【請求項４８】請求項２６記載のモノクローナルまた
はポリクローナル抗体の治療有効量を動物に投与するこ
とを特徴とする動物におけるパスツレラ・ムルトシダ種
および関連種に起因する感染の治療方法。
【請求項４９】医薬的に許容される担体において請求
項４３記載の少なくとも１種の防御抗原の有効量を含有
するワクチン組成物。
【請求項５０】医薬的または獣医学的に許容される担
体中に請求項２６記載の少なくとも１種のモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体の治療有効量を含有するこ
とを特徴とするワクチンまたは獣医学的組成物。
【請求項５１】パスツレラ・ムルトシダ細胞のコロニ
ーを準備し、好適な培地中、鉄制限培養条件下で細胞のコロニーを培
養し、好適な段階で培養から抗原を収穫し、得られた上清からの細胞を含む固体を分離して、実質的
に無エンドトキシンである抗原のパスツレラ・ムルトシ
ダ無細胞溶液を得ることによって製造されたパスツレラ
・ムルトシダに対して特異的な無毒性不活性抗原の防御
量；および医薬的に許容される担体または希釈剤からな
ることを特徴とする動物における肺パスツレラ症に対し
て有効な無細胞ワクチン。
【請求項５２】上清が、使用のために、凍結乾燥され
るか、または、好適には濃縮される請求項５１記載のワ
クチン。
【請求項５３】担体が薬理学的に好都合な補助剤を含
む請求項５１記載のワクチン。
【請求項５４】パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐ．ｈａｅ
ｍｏｌｙｔｉｃａ）に対して特異的な抗原の防御量を含
有する請求項５１記載のワクチン。
【請求項５５】請求項５１記載のワクチンの防御量を
動物に投与することを特徴とする肺パスツレラ症に対す
る動物の予防接種方法。
【請求項５６】３〜３.５時間の範囲の期間、鉄制限
培地中、５２５ｎｍの波長で測定された約０.０１〜０.
０３の光学密度を有するパスツレラ・ムルトシダの接種
物を培養して、抗原を製造し、周期的に、培地の光学密度を測定し、該培地中で抗原の最適濃度が産生された場合、細胞の対
数増殖期を示す、５２５ｎｍの波長で測定された約０.
２８〜０.３２の光学密度についての値を検出した後、
得られた培養からサイトトキシンを含有する上清を分離
し、得られた上清から細胞を含む固体を分離して、実質的に
無エンドトキシンである抗原のパスツレラ・ムルトシダ
無細胞溶液を得ることによって製造されたパスツレラ・
ムルトシダに対して特異的な無毒性不活性抗原の防御
量；および医薬的に許容される担体または希釈剤からな
ることを特徴とする動物における肺パスツレラ症に対し
て有効な無細胞ワクチン。
【請求項５７】必要とする動物に請求項５６記載の無
細胞ワクチンの防御量を投与することを特徴とする肺パ
スツレラ症に対する動物の予防接種方法。
【請求項５８】請求項４記載の製造方法によって製造
されたパスツレラ・ムルトシダに対する抗原またはその
フラグメントを含有することを特徴とするキット。
【請求項５９】請求項４記載の製造方法によって製造
されたパスツレラ・ムルトシダに対する抗原またはフラ
グメントを含有することを特徴とする診断アッセイキッ
ト。
【請求項６０】パスツレラ・ムルトシダの培養試料を
得；次いで、パスツレラ・ムルトシダの抗原をモニターすることを特
徴とするパスツレラ・ムルトシダの培養における培養条
件のモニターリング方法。
【請求項６１】抗原のモニターリングが請求項２５記
載の抗体、請求項２７記載のモノクローナル抗体または
ＣＡＢ技術によって製造される抗体プローブによる検出
によって行われる請求項６０記載のモニターリング方
法。
【請求項６２】抗原が請求項２２記載の抗原である請
求項６０記載のモニターリング方法。
【請求項６３】パスツレラ・ムルトシダの少なくとも
１種の抗原のレベルを測定し、次いで、該レベルを、同
様の培養条件下でのパスツレラ・ムルトシダの少なくと
も１種の他の抗原のレベルと比較することを特徴とする
培養条件のモニターリング方法。
【請求項６４】パスツレラ・ムルトシダの培養試料を
得；次いで、該培養条件をモニターすることを特徴とするパスツレラ
・ムルトシダの培養における抗原産生のモニターリング
方法。
【請求項６５】培養中の鉄制限のレベルがモニターさ
れるパスツレラ・ムルトシダの培養における抗原産生の
モニターリング方法。
【請求項６６】パスツレラ・ムルトシダの少なくとも
１種の抗原の産生を測定し、次いで、該抗原の産生を比
較して、同様の培養条件下で産生された他の抗原の抗原
産生を推測することを特徴とするパスツレラ・ムルトシ
ダの培養における抗原産生のモニターリング方法。