JPH04504659A - トリグリセリドの製造方法およびトリグリセリド組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トリグリセリドの製造方法および トリグリセリド組成物 技術分野 本発明は、分子内に少なくとも１個の長鎖脂肪酸（例えばポリ不飽和酸）を有す るトリグリセリドの製造方法に関する。

また、本発明はトリグリセリド分子内に高含量の多不飽和脂肪酸を有するトリグ リセリド組成物に関する。

背景技術 多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）　、例えばエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）＄よび ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、有用な医薬的効果を有し更に過去１０年来、 高含量のこれらの酸、特に分子内に三種のこれらの酸を有する高含量のトリグリ セリド組成物を製造する方法に多くの注目が向けられてきている。

遊離脂肪酸又は低級アルキル（例えばメチルもしくはエチル）エステルの形態に あるＰＵＦＡは、高純度で入手可能であり更に高含量のＰＵＦＡを有するトリグ リセリドを調製するため用いられている。

従って、特開昭６１−４３１４３　（日清製粉（株）等）およびヨーロッパ特許 ３００，８４４　（Ｒ，Ｆ、アザ−等）には低級アルキルＰＵＦＡエステルとト リアセチンもしくはトリブチリンとの化学的エステル交換が記載されている。ナ トリウムメトキシドが触媒として用いられ、更に反応中に生じた低級アルキルア セテートもしくはブチレートを除去するため真空が用いられた。前者は、９０％ のＰＵＦＡ含量を有するトリグリセリドの製造を述べている。

特開昭６１−２４６１４６　にスイ製薬）は、ＰＵＦＡ遊離酸のハロゲン化およ びその後のＰＵＦＡアシルクロリドとグリセリンとの反応を述べている。第一の 工程は、塩化オキサリルを用い６５〜９０℃で４時間行い、次いで第二の工程は 、キノリンもしくはピリジンの存在下、クロロホルム中数時間還流下で行われた 。

上記のプロセスは、取扱いに特別な注意を要する高い反応性試剤を用い、これら の反応性試剤は不安定なＰＵＦＡアシル基の一部と反応し、更に各々の場合の生 成反応混合物は複雑な精製を特徴とする 特開昭６２−９１１８８　（日清オイル）は、天然の形態にあるか又は弱塩基性 アニオン交換樹脂上に固定化された位置特異性リパーゼを用い、グリセロールと ＰＵＦＡ遊離酸から、ＰＵＦＡグリセリドをリパーゼ触媒作用で製造する技術を 開示する。水の添加が必要であることが述べられている。反応させ次いで未反応 の脂肪酸を除去した後、グリセリド混合物は多くて８６％のトリグリセリドおよ び少なくとも１４％のジグリセリドおよびモノグリセリドを含有していた。生成 物は、多くて８５％の多不飽和脂肪酸および少なくとも１５％の他の脂肪酸を含 有していた。

本発明の目的は、取り扱いに注意を必要とする試剤の使用を避けながら、低含量 のモノグリセリドおよびトリグリセリドを有する直鎮脂肪酸のトリグリセリドを 製造するための簡単なプロセスを提供することにある。

発明の開示 本発明によれば、本発明の目的は長鎖遊離酸又はその低級アルキルエステルと短 鎖の酸のトリグリセリドとのリパーゼ触媒化エステル交換により達成される。短 鎖の遊離酸又はその低級アルキルエステルは反応中に形成され、そしてその比較 的に高い揮発性を利用することは蒸発により同時に除去される。

従って、本発明は分子内に少なくとも１種の０８＋長鎮脂肪酸を有するトリグリ セリドの製造方法に関し、この方法はリパーゼの存在下、対応する長鎖遊離脂肪 酸又はそのＣ３〜Ｃ４低級アルキルエステルと分子内に１種又はそれ以上の０２ 〜Ｃ６短鎮脂肪酸を有するトリグリセリドとをエステル交換し次いで反応中に短 鎖遊離酸又はその低級アルキルエステルを蒸発除去することを特徴とする。

本発明はまたトリグリセリド組成物に関し、この組成物はトリグリセリド分子中 の脂肪酸の少なくとも９５重量％（好ましくは少なくとも９８％）が多不飽和の 炭素数８〜２２個を有する酸であることを特徴とする特 発明の詳細な説明 長鎖脂肪酸 本発明方法は、Ｃ１□。の脂肪酸の導入に対して良好に適合している。と言うの は、反応剤遊離酸又はエステルは極めて低揮発性でありこのため損失が無視し得 るからである。特に、本プロセスはモノ不飽和（例えばオレイン酸）、シネ飽和 （例えばリノール酸）又はリルン酸、ＥＰＡ又はＤＨＡのような多不飽和（三個 以上の二重結合）のＣｔａ〜Ｃ２□脂肪酸を導入するために用いることができる 。本プロセスにおいて用いられる穏和な条件のため、これらの感受性の高い酸か ら副生成物の発生を著るしく避けることができる。

従って、本発明のプロセスは反応剤混合物を用いることによりそのような高含量 の酸を有するトリグリセリド組成物を製造するために用いることができ、該混合 物において遊離酸又は低級アルキルエステルは、少なくとも９０％、好ましくは 少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の１種以上のそのような酸 又はそのエステルを含んでなる。このようにして、全ての３個の位置にそのよう な酸を有するトリグリセリドを高収率で製造することが可能となる。この点に関 し、驚くべきことに、純粋なＥＰＡ又はＤＨＡが特に早く導入されることが見出 された。

好ましくは、長鎖脂肪酸反応剤は遊離脂肪酸、メチルもしくはエチルエステルで あり、この場合生成短鎖の酸又はエステルは極めて揮発性でありかつ容易に除去 される。長鎖脂肪酸又はエステルは、公知方法により調製でき、さらに幾つかは 高純度で商業的に入手可能であり、例えば出光石油化学（株）販売の純度９９％ の遊離酸およびエチルエステルとしてのＥＰＡおよびＤＨＡである。

短鎖脂肪酸 反応剤トリグリセリド中に存在する短鎖の酸は、生成物の揮発性の故に好ましく は酢酸又は酪酸である。分子内に３個の短鎖の酸を有するトリグリセリド、特に トリブチリン又はトリアセチンを用いるのが特に好ましい。

リパーゼ 位置特異性（１，３−特異性）又は非特異性トリバーゼが使用できる。もしも長 鎖のアシルをトリグリセリドの全ての３個の位置に導入したい場合、速やかな反 応を達成するため、非特異性リパーゼを用いることが特に好都合である。リパー ゼは、使用温度および使用反応時間で十分な安定性を有する必要がある。

非特異性リパーゼの例は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）株由来のリパーゼ゛、特 にＣ，アンタルクチ力（Ｃ，ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）　リパーゼ゛（ＷＯ８８１ ０２７７５、以下、参考のため本明細書中で記載）およびＣ，ルゴザ（Ｃ，ｒｕ ｇｏｓａ）　（またＣ、シリンドラセア（Ｃ。

ｃｙ　１１ｎｄｒａｃｅａ）として知られる）由来のリパーゼである。該文献中 に記載されるＣ、アン、タルクチ力（Ｃ０ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）のリパーゼＡ およびリパーゼＢの双方を含有するリパーゼ調製品を用いることが特に好ましい 。

特異的リパーゼの例は、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）　、特にＨ４および組換 体フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）　リパーゼ（ＢＰ　３０５．２１６）およびム ：ｌ−ＪＬ／　（Ｍｕｃｏｒ）　リパーゼ（ＨＰ　１４０．５４２）である。

固定化リパーゼは、エステル交換に対し一般に最も有効である。幾つかの固定化 リパーゼは、活性化のため幾分かの水分含量を必要とする。反応剤および反応条 件に応じ、蒸発により水が除去される。これを補償するため、反応中に水を加え るか又は段階的に固定化リパーゼを加えることが必要である。

適当な固定化方法の例は、Ｗｏ　８９１０２９１６に従い、アクリルタイプの粒 状のマクロポーラス吸着剤（すなわち、非イオン性）樹脂上にリパーゼを吸着さ せる例である。

使用できるリパーゼ調製の例は、ノボノルディスク社（ＮＯＶＯＮｏｒｄｉｓｋ 　Ａ／　Ｓ　）販売のＳ　Ｐ　３８２　（Ｗｏ　８９１０２９１．６に従い固定 化されたＣ、アンタルクチ力（Ｃ１ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＡお よびＢの混合物）である。

反応条件 リパーゼの適当な量は、固定化リパーゼの使用の場合、一般に反応混合物の０． ５〜１０　ＢＩＤ／ｇ　（典型的には１〜５ＢＩ［Ｊ／ｇ）の範囲内にあり（８ １０＝Ｂａｔｃｈ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎυ旧ｔ　バッチエ ステル交換単位、Ｗｏ　８９１０６２７８参照）、そのま＼（非固定化）リパー ゼの使用の場合、オイル１ｇ当たり５０〜５００　ＬＵ　（ＬＵ＝Ｌｉｐａｓｅ 　Ｕｎｉｔ　、リパーゼ単位）の範囲内にある。

化学量的割合又は適度に過剰の（例えば０〜５０％、特に０〜２０％）長鎖脂肪 酸反応剤の二種の反応剤を用いることが好ましい。更に、トリグリ七リド分子中 の少なくとも７０％（特に７０％、更に特に９５以上、例えば９８％以上）の短 鎖の酸が、長鎖の酸と置換されるまで反応を継続させるのが好ましい。これによ り長鎖脂肪酸のトリグリセリドを高収率でかつ高純度で調製することが可能とな る。

本プロセスにおいて、一般にｐＨ緩衝剤又は有機溶剤を用いることは不必要であ る。

反応および蒸発に対し、一般に４０〜８０℃、特に６０〜８０℃の温度が好まし い。反応時間は、一般に７２時間未満である。

揮発性の酸又はエステルの除去 揮発性脂肪酸（エステル）の蒸発による除去は、撹拌タンクから連続的に行うこ とができる。反応剤は、回分式に、又は半回分式にあるい又連続式に添加される 。リパーゼは固定化でき更に再使用できる。

別に、反応は２工程又はそれ以上の工程で生じ、更に蒸発は工程間で行うことが できる。各プロセスの工程は撹拌タンク内で行うことができ、あるい又固定化リ パーゼは固定床中で連続的に使用できる。

蒸発は、真空下、例えば２００Ｐａ特に２０Ｐａ未満の下で最も好都合に行われ る。

実施例 例１〜４ ２０〜８５％　ＥＰＡ／ＤＨＡ含有のトリグリセリドの調定化リパーゼ（ノボノ ルディスクＡ／Ｓ販売の５Ｐ−３８２：活性度約３０　Ｂ１１１／ｇ；０．８２ 〜０．８６ｇ；１０％湿分含量）を、種々の組成の脂肪酸エチルエステル含量（ １９，８ミリモル）およびトリブチリン（アルドリッチ社市販、９８〜９９％； ６．６ミＵモル）の混合物に以下に記載するように添加した。混合物を、０　、 　１　ｍｍＨｇの連続的真空下、磁気撹拌器の熱プレート上で穏やかに撹拌した 。揮発性の酪酸エチル生成物を液体窒素で冷却したトラップに連続的に凝縮し、 これは分離でき更に真空を乾燥窒素又はアルゴン雰囲気で置換することにより反 応を離すことによりプロセス中で規則的に釈量することができる。７２時間後、 反応を中断し、ヘキサンを加え、酵素を濾過法により分離した。回転蒸発器で真 空下ヘキサンを除去した後、粗製反応生成物を得た。滴定により指示される如く 加水分解が最小程度に生じていることが見出されたが、この滴定は生成物の１％ 未満の遊離脂肪酸含量を示し更にイアトロスキャン（Ｉａｔｒｏｓｃａｎ）の研 究により確立された。生成物は残りのエチルエステルから遊離にされ更にペンタ ン又はヘキサン中に１０％エーテルを有する溶離剤を用い調製高速流体クロマト グラフィー（ＨＰＬＣ）を用イて精製し、イアトロスキャンの研究により確立さ れる如き１００％純粋なトリグリセリドを得た。細ガスクロマトグラフィー（Ｇ ＬＣ）分析によれば、各々の場合天然のエチルエステルと殆ど同一の脂肪酸組成 物を示した。補捉された成分のエチルブラレートの特性は核磁気共鳴（ＮＭＲ） により確立された。水分の発生は殆どあるい又全く認められなかった。

重量測定からトリブチリンへの脂肪酸の導入％を計算するため次の式を用いた： 導入％＝０．８６７Ｘ　［酪酸エチルの重量／トリブチリンの重量ｌＸ１００％ これは次の式から誘導された： 導入％＝１／３　［補捉された酪酸エチルの当量数／用いたトリブチリンの当量 数］　Ｘ１００弼 ＝１／３　［酪酸エチルの重量／酪酸エチルの分子量〕／〔トリブチリンの重量 ／トリブチリンの分子量〕×１００％＝１／３　［酪酸エチルの重量／トリブチ リンの重量〕Ｘ〔トリブチリンの分子量／酪酸エチルの分子量］　Ｘ１００弼＝ １／３　［酪酸エチルの重量／トリブチリンの重量〕×［３０２，４／１１６． ２’］　ｘ１００％＝０．８６７Ｘ酪酸エチルの重量／トリブチリンの重量〕× １００％ 次の結果を得た： 例１　例２　例３　例４ ＥＰＡ　（％）　１０　２９　３８　５５ＤＨＡ　（％）　１０　３０　２８　 ３３導入（％）Ｉ２４時間 最小　８０　８１　８２　８７ 最大　８３　８５　８６　９１ 導入（％）０４８時間 最小　９０　８６　９０　９１ 最大　９３　９０　９４　９５ 導入（％）１７２時間 最小　９２　９２　９４　９３ 最大　９６　９６　９７　９７ ※　導入は、補捉された生成物の質量測定により決定した。

最小の導入は、全ての湿分が固定されたリパーゼから脱出されたものとの仮定に 基づいた。

これらの結果は、以下の内容を示している。すなわち、高含量のＰＵＦＡを用い た脂肪酸の本質的に完全な導入は、化学量的割合の反応剤を用い、トリブチリン により可能である。

例５ ９９％のＥＰＡを含有するトリグリセリドの調製固定化リパーゼ５Ｐ３８２　（ ０，６５ｇ；１０％湿分）を、トリブチリン（アルドリッチから入手９９％；１ ．４８ｇ。

４．８９ミリモル）および９９％　ＥＰＡエチルエステルコンセントレート　（ 分子量３３０．５ｇ１モル；４．８７ｇ。

１４．７ミｌＪモル）の混合物に添加した。混合物を、０．５〜０　、　１　ｍ ｍｔ（ｇの連続的真空下、磁気撹拌器の熱プレート上６５℃で穏やかに撹拌した 。揮発性酪酸エチル生成物を液体窒素で冷却したトラップに連続的に凝縮し、こ れは分離でき更に真空を乾燥窒素又はアルゴン雰囲気で置換することにより反応 を離すことによりプロセス中で規則的に釈量することができる。７２時間後、反 応を中断し、ヘキサンを加え、酵素を濾過法により分離した。回転蒸発器で真空 下ヘキサンを除去した後、粗製反応生成物を得た（４．４３ｇ、９５％）。

滴定により指示される如く加水分解が最小程度に生じていることが見出されたが 、この滴定は生成物の１％未満の遊離脂肪酸含量を示し更にイアトロスキャン（ Ｉ　ａｔｒｏｓｃａｎ）の研究により確立された。重量測定により９５〜９８％ の導入が判明し、イアトロスキャンの研究により９７％の導入およびＮＭＲ分析 により９５％の導入が判明した。生成物は残りのエチルエステルから遊離にされ 更にヘキサン中に１０％エーテルを有する溶離剤を用い調製高速流体クロマトグ ラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製し、イアトロスキャンの研究により確立され る如き１００％純粋なトリグリセリドを得た（３．８０ｇ、８６％の回収率、全 収率の８２％に相当）。

ＮＭＲ分析法は、トリグリセリド中に残存する極微量の酪酸を有する極めて純粋 な物質を示す。［２５０ＭＨ２’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）　：６５．４１−５． ２６（ｍ、　３１Ｈ，Ｈ，＝Ｃ−Ｈａｎｄ　−ＣＨ，−ＣＨＣＨ２）、４．３０ 　（ｄｄ、　Ｊ＝１１．９０Ｈｚ、　Ｊ＝４．３４Ｈｚ、　２）１．　ＣＨ２− ＣＨ−ＣＨ−−）、　４．１４　（ｄｄ、　Ｊ＝１１．９０Ｈｚ、　Ｊ＝５．９ ３Ｈｚ、　２Ｈ。

ＣＨ２ＣＨＣＨ２）、２．９０　２．７８　（ｍ、２４Ｈ，＝ＣＣＨ２−Ｃ＝） 、　２−３３（ｔ、　Ｊ＝７．３４Ｈｚ、２Ｈ，ｏｏｃ　Ｃ１（ｚ　＞、　２． ３２（ｔ、　Ｊ−７Ｊ６Ｈｚ、４Ｈ，ＱＣＣＨ２）、２．１５　２．０１　（ｍ 、　１２Ｈ，ＣＬ−Ｃ１（２−Ｃ＝）、１．７５−１．６１軸、　６１（、＝Ｃ Ｉ（−ＣＩ（、−（１：１（３）、および０．９７ｐｐｍ（ｔ、　Ｊ＝７．５２ Ｈｚ、　９１１．　ＣＬ）、”ＣＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　：δ１７２．９（ｓ） 、１７２．６（ｓ）、１３２，０（ｄ）、１２１９（ｄ）、１２８．７（ｄ）、 １２８．５（ｄ）、１２８．２（ｄ）、１２８．１（ｄ）、１２８．１（ｄ）、 １２８．０（ｄ）、１２７．８（ｄ）。

１２７．０（ｄ）、　６８．９（ｄ）、　６２．Ｈｔ）、　３３．５（ｔ）、　 ３：１３（ｔ）、　２６．４（ｔ）。

２５．６（ｔ）、　２５．６（ｔ）、　２５．５（ｔ）、　２４．７（ｔ）、　 ２４．７（ｔ）、　２４．６（ｔ、）。

２０、５　（ｔ）および１４．２ｐｐｍ（ｑ）、　Ｈ（ニート液体）：　ｖ、、 Ｘ３０２０（ｖｓ。

Ｃ＝ＣＩ（）、　２９７０（ｓ、　ＣＨ３）、　２９３５（ｓ、　Ｃｌ２）、　 ２８７５（Ｓ、　ＣＨ３）。

２８５０（ｗ、　ＣＨ２）、　１７４５（ｖｓ、　Ｃ＝０）および１６４５ｃｍ −’　（ｍｓ、　Ｃ＝Ｃ）、　３次の結果を得た： ＊　導入は捕捉された生成物の質量測定により決定した。最小の導入は、全ての 湿分が固定化リパーゼから脱出したものとの仮定に基づいた。

例６ ９９％ＤＨＡ含有トリグリセリドの調製固定化リパーゼ５Ｐ３８２　（０，６５ ｇ：１０％湿分）を、トリブチリン（アルドリッチから入手９９％；１．３８ｇ 。

４．５６ミリモル）および９９％　ＤＨＡエチルエステルコンセントレート（分 子量３５６．６ｇ１モル；４．８７ｇ。

１３．６ミＵモル）の混合物に添加した。混合物を、０．５〜０　、　１　ｍｍ Ｈｇの連続的真空下、磁気撹拌器の熱プレート上６５℃で穏やかに撹拌した。、 揮発性酪酸エチル生成物を液体窒素で冷却したトラップに連続的に凝縮し、これ は分離でき更に真空を乾燥窒素又はアルゴン雰囲気で置換することにより反応を 離すことによりプロセス中で規則的に釈量することができる。７２時間後、反応 を中断し、ヘキサンを加え、酵素を濾過法により分離した。回転蒸発器で真空下 へキサンを除去した後、粗製反応生成物を得た＜４．４０ｇ、９４％）。

滴定により指示される如く加水分解が最小程度に生じていることが見出されたが 、この滴定は生成物の約１％の遊離脂肪酸含量（１，２％）を示し更にイアトロ スキャン（Ｉａｔｒｏｓｃａｎ）の研究により確立された。重量測定により９５ 〜９９％の導入が判明し、イアトロスキャンの研究により９６％の導入が判明し たがＮＭＲ分析では９４％の導入が判明した。生成物は残りのエチルエステルか ら遊離にされ更にヘキサン中に１０％エーテルを有する溶離剤を用い調製高速流 体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製し、イアトロスキャンの研究に より確立される如き１００％純粋なトリグリセリドを得た（３．５６ｇ、８１％ の回収率、全収率の７６％に相当）。

ＮＭＲ分析法は、トリグリセリド中に残存する極微量の酪酸を有する極めて純粋 な物質を示す。［２５０Ｍｌ（２’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１，）　：δ５．４４−５ ．２５　（ｍ、　３７８．　＝Ｃ−Ｈａｎｄ−ＣＨ２−ＣＩＣｌ（−）、　４． ３０　（ｄｄ、　Ｊ＝１１．９０Ｈｚ、　Ｊ＝４．３６Ｈｚ、　２Ｈ，ＣＨ２− Ｃ８−ＣＨ２−）、　４．１５　（ｄｄ、　Ｊ＝１１．９０Ｈｚ、　Ｊ＝５，８ ９ｔｌｚ、　２Ｈ。

−ＣＬ　−ＣＨ−ＣＨ２−）、２．９０−２．７９　（ｍ、　３０Ｈ，＝Ｃ−Ｃ ）１２−Ｃ＝）、２．３９−２．３８　（［１１，Ａ２Ｂ２．１２８．−ＣＨ− ＣＨ２−Ｃｌ２−Ｃｏｏｌ）。

２．１３−２．０２（ｍ、　６Ｈ，＝ＣＩ（−ＣＨ２，−ＣＨ５）、　ａｎｄ　 ０．９７ｐｐｍ（ｔ、　Ｊ＝７．５３Ｈｚ、　９Ｈ，ＣＬ）、　′３Ｃ，ＮＭＲ （ＣＩＣｌ３）　：δ１７２．５　（ｓ）　、　１７２．１（ｓ）、　１３１０ （ｄ）、　１２９．５（ｄ）、　１２８．５（ｄ）、　１２８．３（ｄ）、　１ ２８．３（ｄ）。

１２８．２（ｄ）、　１２８．２（ｄ）、　１２８．０（ｄ）、　１２７．９（ ｄ）、　１２７−８（ｄ）、　１２７．６（ｄ）、　１２’ＡＯ（ｄ）、　６９ ．０（ｄ）、　６２．２（ｔ）、　３４．０（ｔ）、　３３．８（ｔ）、　２５ ．６（ｔ）、　２５．６（ｔ）、　２５．６（ｔ）、　２５．６（ｔ）、　２５ ．５（ｔ）、　２２．６（ｔ）、　２０．５（ｔ）および１４．２ｐｐｍ（ｑ） 、　ＩＲ（−一ト液体）：　ｖ＝、、　３０２０（ｖｓ、　Ｃ＝Ｃ−１１）、　 ２９７０（ｓ、　ＣＬ）、　２９３０（ｓ、　Ｃｌ２）、　２８７０（Ｓ、　Ｃ Ｈ３）、　２８５０（ｗ。

ＣＬ）、　１７５０（ｖｓ、　Ｃ＝０）および１６５０ｃｍ−’（ｍｓ、　Ｃ＝ Ｃ）、　］次の結果を得た： ８　７７　８１　７Ｂ ※　導入は、捕捉された生成物の質量測定により決定された。

最小の導入は、全ての湿分が固定化リパーゼから脱出したものとの仮定に基づい た。

例７ リパーゼの再使用によるトリグリセリドの調製固定化リパーゼ（例１〜４におけ る如きもの；８．２５ｇ）を、トリブチリン（２０，０ｇ；６６．１ミリモルお よびたら肝油のエチルエステル（９％　ＥＰＡ＄よび９％　ＤＨＡ；分子量３１ ３．１ｇ１モル；６２．Ｉｇ；１９９ミリモル）の混合物に添加した。混合物を 、０　、　１　ｍｍＨｇの連続的真空下６５℃で穏やかに撹拌した。揮発性酪酸 エチル生成物を、液体窒素で冷却したトラップに凝縮し、これを反応の進行中に 規則的に釈量した。７２時間後、反応を中断し次いでリノで−ゼを、乾燥窒素の もと、焼結ガラスフィルタープレートおよび窒素に対するインレット／アウトレ ・ント並びに口過を助成するための真空ライン（これはテフロン製のキー栓によ り制御されている）を備えた圧力均一化漏斗を用いた濾過法により有機溶剤を用 いることなく直接分離した。オイルは、更に分析用に集められた。

固定化リパーゼは、反応容器に再導入された。同固定化リパーゼを再使用し、こ れを４回くり返した。

次の結果を得た： 本　７２時間後、捕捉された生成物の質量分析により決定木本　湿分を有しない リパーゼに対する結果例８ トリアセチンを用いるＥＰＡ／ＤＨＡ）リグリセリドの調毀 例１の手順をくり返した。但し、トリブチリンの代りにトリアセチンを用い、更 に１０％の過剰のエチルエステルを用いた。水分が急速に出るのが確認された。

従って導入の計算のために、存在する全ての水分は捕捉された重童内に含まれて いるものと仮定した。４５時間後、７２％の導入が観察され、更に６９時間後８ ３％の導入が観察された。

結果は、以下の内容を示している。すなわち、高程度の導入がトリアセチンで達 成されたが、水分は逃げ出す傾向にある（恐らく、酢酸エチルとの共沸混合物の 形成に因る。従って、リパーゼの段階的添加は酵素の失活（水分損失のため）に 対して補償するのに好都合である）。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年１０月１８日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．分子内に少なくとも１種のＣ８＋長鎖脂肪酸を有するトリグリセリドの製造 方法であって、リパーゼの存在下、長鎖遊離脂肪酸類はそのＣ１〜Ｃ４低級アル キルエステルと分子内に１種又はそれ以上のＣ２〜Ｃ６短鎖脂肪酸を有するトリ グリセリドとをエステル交換し次いで反応中に短鎖遊離酸類はその低級アルキル エステルを蒸発除去することを特徴とする、前記製造方法。
2. ２．長鎖脂肪酸がＣ１２＋、好ましくはモノ−、ジ−もしくは多不飽和Ｃ１８〜 ２２の脂肪酸であり、更に最も好ましくはエイコサペンタエン酸又はドデカサン ヘキサエン酸である、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．当初存在する遊離酸又は低級アルキルエステルが、少なくとも９０％、好ま しくは９５％、最も好ましくは９８％の１種以上の長鎖の酸又はそのエステルで ある、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
4. ４．分子内に３個の長鎖脂肪酸を有するトリグリセリドを製造するための請求の 範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。
5. ５．トリグリセリド分子内に短鎖脂肪酸に関して長鎖脂肪酸又はエステルの０〜 ５０％（好ましくは０〜２０％）の過剰の化学量論的割合を用いる請求の範囲第 １〜４項のいずれかに記載の方法。
6. ６．トリグリセリド内の少なくとも７０重量％、好ましくは少なくとも９０％、 より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の短鎖の酸 が置換されるまで反応を継続する、請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．反応剤トリグリセリドが、分子内に三個の短鎖の酸を有し、更に好ましくは トリブチリン又はトリアセチンである、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載 の方法。
8. ８．反応剤遊離酸又はエステルが、遊離脂肪酸又はメチルもしくはエチルエステ ルである、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。
9. ９．リパーゼが、位置特異性であり、更に好ましくはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ）、最も好ましくはＣ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）の菌株か ら由来するものである、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の方法。
10. １０．リパーゼが固定化された形態であり、好ましくはアクリルタイプの粒状の マクロポーラス吸着剤樹脂上に吸着させることにより固定されている、請求の範 囲第１〜９項のいずれかに記載の方法。
11. １１．酸エステルの除去が、真空下、好ましくは１ｍｍＨｇ未満でかつ好ましく は４０〜８０℃で行なわれる、請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の方法 。
12. １２．トリグリセリド分子中の少なくとも９０重量（好ましくは少なくとも９８ ％）の脂肪酸が多不飽和Ｃ１８〜２２である、トリグリセリド組成物。
13. １３．多不飽和酸がエイコサペンタエン酸もしくはドデカサンヘキサエン酸又は これらの混合物である、請求の範囲第１２項記載の組成物。