JPH04505010A - 免疫調節障害の処置のための薬剤生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫調節障害の処置のための薬剤生成物技術分野 本発明は、特に免疫調節障害の処置に有用な薬剤生成物、及びこのような生成物 の製造及び使用に関する。特に、本発明は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する抗体 を包含する生成物に関する。

背景技術 サイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ− γ）が代表的なものであるが、免疫反応を構成する細胞相互作用網に重要な調節 役割を果たすものとして知られている。例えば、これらは免疫能細胞を炎症箇所 へ導き、免疫反応を増幅する作用に関与し、この場合主要組織適合複合体（ＭＨ Ｃ）抗原かキーとなる役割を果たす。

ＩＮＦ−γは、広範囲の免疫調節効果をもたらすことカ知うレテイる。これは、 Ｔ細胞（ｒｓｓｅｋｕｔｚ、　Ｔ、Ｂ、等。

Ｊ、（ｍｍｕｎｏｌ　１９８８．　ｌ　４０　二２９８９）及び大食細胞（Ｎａ ｔｈａｎ、　Ｃ，Ｆ、等、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、１９８６．　３ ±５；６）の化学走性移動及び活性化を仲介し、天然キラー（ｋＨｌｅｒ）細胞 、単核細胞、細胞毒性Ｔ細胞及び多形核ロイコサイトの細胞毒活性を増大させる （　Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ。

Ｉｍｎ＋ｕｏｏｌ　１９８４．　１４：５２）生体内でも（Ｍｏｍｂｕｒｇ。

Ｆｏ等、　Ｏｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９８６．上６：５５１；Ｓｔｅ ｉｎｉｇｅｒ、　Ｂ、等、　Ｔｒａｎｓｐｌ、　Ｐｒｏｃ、　１９８７．　Ｘ［ Ｘ（５）：４３２２）殆ど全ての型の細胞にＭＨＣクラスＩ及び■抗原の表現を 増大させ、そしてＴＮＦのような他のサイトカインに対する受容体のより新しい 合成を誘起するＩＦＮ−γと同様に、ＴＮＦは、循環顆粒球、単球及びリンパ球 の内皮細胞への付着に関して、Ｉ　ＣＡＭ−１のような抗原構造の表現を増加さ せる（Ｐｏｂｅｒ、　Ｊ、Ｓ、等。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９８６．１３７．１８９３）ｏ更に、ＴＮＦは内皮細胞 に対して直接的細胞毒性作用を及ぼしく５ａｔｏ、　Ｎ、等、Ｊ、Ｎ、Ｃ，ｒ、 １９８６．７６＋１１１３）：ＭＨＣクラスエ及び■両抗原の表現に対する調節 作用に関与する（Ｃｏｌｌｉｎｓ、　Ｔ、等、ＰＮＡＳ　１９８５．　−８３： ４４６）。

上記ＭＨＣ抗原は、宿主が非自己組織を排除しようとする免疫反応の進展と増大 に臨界的な役割を果たすことが知られている（例えば、Ｍｉｌｔｏｎ、　Ａ、Ｄ 、等、　Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ　１９８５．１６１：９８を参照）。従って、ＩＮＦ−γ又はＴＮＦに特 異的な抗体は、自己又は非自己組織の拒絶が、例えば、自己免疫疾患又は臓器移 植拒否反応において起こる免疫調節障害の処置に有用であると期待してもよいで あろう。

ＩＮＦ−γ及びＴＮＦに対する抗体は既知であり、これらの抗体は組み合わせた ものが開示されている（　５ａｎｄｒｕ、　Ｇ、等、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、 （１９８９）　４８．　５４１１）。この引例は、腫瘍細胞成長を刺激するよう な単核細胞誘起因子を研究するために計画された生体外試験について記載するも のである。同引例には、抗−Ｉｆｎγ及び抗−ＴＮＦが一緒に投与された時の腫 瘍細胞成長に対する相乗的な促進効果が記載されている。従って、この論文は、 組合せ抗体が療法には有用でないことを示唆するものである。更に、この論文に は該抗体が免疫調節障害の治療に有用である可能性を示唆するものは存在してい ない。

発明の開示 ＩＦＮ−γ又はＴＮＦに特異的な抗体が免疫調節障害の治療に有用であろうとい う期待が持たれていたにもかかられす、アカゲザルの皮膚移植モデルを用いた試 験において本発明者らが見出したところによると、皮膚移植に先立った該動物へ の抗−ＩＦＮ−γ抗体の投与は、移植された皮膚の生存に認識できるほどの効果 は有していなかった。同様に抗−ＴＮＦ抗体のみの投与も移植された皮膚の生存 を延長させるものではない。しかしながら、本発明者らが見出したことは、驚く べきことに、抗−ＩＦＮ−γ抗体と抗−ＴＮＦ抗体とを一緒に投与すると、移植 皮生存期間が延長される結果になり、本発明者らはこれを用いて免疫調節障害の 治療に対する手段を開発してきたのであった。

従って、本発明の実施態様の一つによれば、腫瘍壊死因子に対する抗体及びイン ターフェロン−γに対する抗体を共同処方物として含有し、治療に、特に免疫機 能障害の治療に、同時に個別的に用いるかあるいは直列的に用いるための薬剤生 成物が提供される。この薬剤生成物は、例えばこれらの抗体を任意に薬剤的に許 容の賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に混合して含んでもよい。この薬剤生成物は 人体に投与するのに好適なものであることが好ましい。

本明細書中で使用される術語である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とは、特にヒトＴＮ Ｆ、そして特には、ヒトα−ＴＮＦであることを意味するものである。同様に、 本明細書中で使用される術語であるインターフェロン−γ（［’Ｎ−γ）も特に ヒトＩＦＮ−γであることを意味するものである。

本明細書中で使用される術語である免疫調節障害とは、臓器又は組織移植後の拒 絶反応（例えば皮膚移植の拒否反応）事例又は自己免疫疾患、例えば甲状腺炎の ような臓器に特有な疾患又はリュウマチ様関節炎のような臓器に特有できない疾 患を包括するものと理解すべきである。

腫瘍壊死因子に対する抗体（以後抗−ＴＮＦ抗体と称する）及びインターフェロ ン　ガンマに対する抗体（以後抗−ＩＦＮ−γ抗体と称する）は、各々抗体全体 でも、抗体フラグメントでもよい。抗体フラグメントには例えば全抗体の蛋白分 解分割によって誘導されたフラグメント、例えばＦ　（ａｂ’　）ｚ　、Ｆａｂ ’又はＦａｂ７ラグメント、又は組替えＤＮＡ法によって得られたフラグメント 、例えば（国際特許出願Ｎｏ、　ＷＯ８９１０２４６５に記載のような）Ｆｖフ ラグメントが挙げられる。

各抗−ＴＮＦ又は抗−ＩＦＮ−γ抗体又は抗体フラグメントは、一般に免疫グロ ブリンのクラスに属するものとしてよい。従って、例えば、これは免疫グロブリ ンＭ抗体又は、特に、免疫グロブリンＧ抗体であって差し支えない。抗体又はフ ラグメントは、動物、例えば哺乳動物由来で、例えばネズミ、ラット又はヒト由 来のものでよい。天然の抗体又はそのフラグメント、又は所望ならば組替え抗体 又は抗体フラグメント、すなわち組替えＤＮＡ法を用いて生成された抗体又は抗 体フラグメントでも差し支えない。

特定的な組替え抗体又は抗体フラグメントとしては以下のものが挙げられる。（ １）抗体結合部位を育しているもので、少なくともその一部分が異なる抗体から 誘導されるもの、例えば抗体の−う（ネズミ由来のものでよい）の超可変領域又 は相補性決定領域が第二の異なる抗体（ヒト由来のものでよい）の可変枠に移植 されたちの（欧州特許明細書Ｎｏ、２３９４００に記載のような）、（２）非− Ｆｖ配列が別の異なる抗体（ヒト由来のものでよい）からの非−Ｆｖ配列によっ て置換された組替え抗体又はフラグメント（欧州特許明細書ＮＯ，１７１４９６ ゜Ｎｏ、１７３４９４及びＮｏ、ｌ９４２７６に記載のような）、又は（３）実 質的に天然免疫グロブリンの構造を有する組替え抗体又はフラグメントであるか 、蝶番領域が天然免疫グロブリンに見出されるものとは異なる数のシスティン残 基を有しているか、あるいは組替え抗体又はフラグメントの表面ポケットにある 一つ又はそれ以上のシスティン残基が天然免疫グロブリンに存在する別のアミノ 酸残基の箇所にあるもの（それぞれ、国際特許出願Ｎｏ。

ＷＯ３９１０１７８２及びＮｏ、　ＷＯ８９１０１９７４に記載のような）。

抗体又は抗体フラグメントは、多特異性でもよいが、腫瘍壊死因子又はインター フェロンγに対しては単一特異性であるのが好ましい。この抗体又はフラグメン トは、多クローン性でもよいが、又は単一クローン性由来であるのが好ましい。

し、適当な精製及び／又は濃縮後所望の多クローン性抗−ＴＮＦ又は抗−ＩＦＮ −γ抗体を（例えば、親和性媒体として固定化ＴＮＦ又はＩＦＮ−γを用いるア フィニフィクロマトグラフィによって）得ることができる。別法としては、ＴＮ Ｆ又はＩＦＮ−γを注射した宿主から牌球又はリンパ球を回収し、例えばＫｏｈ ｌｅｒ等、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

１ｍｍｕｎｏ１．６．　’５１１　（１９７６）の方法を用いて不死化し、得ら れた細胞を分離し、常法に従って単一の遺伝ラインを産生ずる単りローン性抗− ＴＮＦ又は抗−ＩＦＮ、−γ抗体を得ることができる。

抗体フラグメントは、常法を用いて、例えば全抗体の酵素消化を、例えばペプシ ン（Ｐａｒｈａｍ、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　１３＋、２８９５．（１９８３ ））又はパパイン（Ｌａｍｏｙｉａｎｄ　Ｎ１５ｏｎｏｆｆ、　Ｊ、　Ｉｍ＋ｎ ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、、５６．　２３５　。

（１９８３））で行うことにより生産することができる。

組替え抗−ＴＮＦ及び抗−ＩＦＮ−γ抗体を生産することが所望ならば、例えば 前記の特許明細書に記載の方法を用いてこれらを生産することができる。

実施態様の幾つかにおいては、本発明に係る薬剤生成物に他の活性成分を含有さ せても差し支えない。

本発明に係る薬剤生成物は、投与に好適などんな形状でも差し支えなく、特に非 経口投与、例えば注射又は点滴に好適な形態となろう。非経口投与に好適な処方 物としては、両抗体又は各抗体の油性又は水性ベヒクル中の懸濁液、溶液、又は 乳化液を含むが、任意に処方剤、例えば懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤を含 有させてもよい。別法としては、抗体を粉状としておき、使用する前に好適なベ ヒクル、例えば発、熱物質を含ま５ない無菌の水を用いて再構成することも可能 である。この薬剤生成物は、例えば皮膚移植の部位に局所投与するように処方す ることもできる。

本発明に係る生成物に存在する各抗体の量は、一般に該生成物の使用目的に依存 するであろうが、処置すべき免疫調節障害、投与のルート、及び患１者の年令、 性及び状態のような因子によって変化することもあり得よう。

従って、各抗体の正確な量は、各処置体制が始まる前に常法に従って経験的に決 定する必要があり得る。しかしながら、一般には各抗体は、０．１〜５■／　ｋ ｇ　／　ｄａｙの範囲、例えば約１〜約２■／　ｋｇ　／　ｄａｙの用量で投与 することができる。各投与抗体の相対的量は、例えば約ｌ：ｌ〜約ｌＱ２の範囲 の重量比で変わり得る。

本発明に係る生成物は、予防的にもあるいは免疫調節障害が起こった後にも投与 することができる。つまり、例えば、本生成物の投与は、臓器又は組織移植の前 にも、あるいは免疫ｌ１ｗＩ障害が起こった後にも、そしてその後も必要なだけ 長期間継続することもできる。

本発明の更に別の実施態様によれば、上記の抗−ＴＮＦ抗体及び抗−ＩＦＮ−γ 抗体の、免疫調節障害の治療に使用する薬剤生成物の製造への使用が提供される 。

例えば、抗−ＴＮＦ抗体及び抗−ＩＦＮ−γ抗体を併用調製物として配合するこ とにより、同時に個別的もしくは直列的使用目的に本薬剤生成物を製造すること かてきる。別法としては、抗−ＴＮＦ抗体、抗−ｆＦＮ−γ抗体及び、任意に、 薬剤として許容される賦形剤、希釈剤又は担体を混合することによって本薬剤生 成物を製造することもできる。

さらに別の実施態様においては、本発明は抗−ＴＮＦ抗体及び抗−ｒＦＮ−γ抗 体の有効量を対象に投与することを含む、ヒトまたは動物対象（好ましくはヒト ）の治療法を提供する。

発明の実施形態 以下は本発明を例示目的のみで説明するものである。

本発明者らは、アカゲザルにおける皮膚移植研究を行い、ヒト組み替えＩＦＮ− γ及びヒト組み替えＴＮＦ−（ＭＡｂｔ）　、ＭＤＩ及び６１Ｅ７１の免疫抑制 潜在能力を検討してきた（Ｍｅｉｄｅ、　Ｐ、Ｈ，等、　Ｊ、　ｌ＋＋ｍｕｎｏ １．　Ｍｅｔｈ霊長類における研究は、ＭＤＩ及び６１Ｅ７１がそれぞれアカゲ ザルのＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αと相互反応性であるので行った。更に、アカゲ ザルはヒトに対して緊密な系統発生論的関係があり、しかもアカゲザルの免疫系 統はヒトのそれに極めて近接した類似性を示すので、当結果を人間の状況に延長 しても信頼性がある筈である。

材料及び方法 ｌ）動物 アカゲザル（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ）は、バーレム型養殖システムを用 いて、ＲｉｊｓｗｉｊｋのＴＮＯ霊長類センターで誕生、育成したものである。

このサルは全て、年齢２〜４才で、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）白血球抗原（Ｒ ｈＬＡ）−Ａ、−Ｂ、及び−ＤＲ位置型であった（Ｖｒｅｅｓｅｉｊｋ　Ｗ。

Ｖａｎ等、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、　ｌ　９７７．　９　：　１７ 　；　ＲｏｇｅｒＪ、　Ｈ，等、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｇｅｎ　ｌ　９８０．　 ７　：　３３３）。

２）生体内処置に使用のｍＡｂ 生体内処置に使用の単クローン性抗体（ｍ　Ａ　ｂ　亨）は、ＭＤＩ、６１Ｅ７ １及びＨ２Ｏ２−１，６と称゛されるものであった。ＭＤＩ（ネズミＩｇＧ１） は、組み替えヒトＩＦＮ−γ（Ｍｅｉｄｅ等上述）に対して産生したが、天然由 来のアカゲザルＩＦＮ−γの生物学的活性を完全に中和することが立証された０ ６１Ｅ７１　（ネズミｒｇｃｚ）は組み替えヒトＴＮＦ　−ａ　（Ｃｏｌｌｆｎ ｓ等上述）に対して産生じたが、これもアカゲザルＴＮＦ−αを効果的に中和す ることが立証された。Ｈ２Ｏ２−１，６は、無関係の特異性を育するネズミ抗− ヒトｍＡｂｃｒｇＧ□）であり、アカゲザル抗原とは反応性を育していない。抗 体は全て硫酸アンモニウム沈降（５０％飽和）によって腹水から精製された）。

ＭＤＩ及び６１Ｅ７１も蛋白Ａへの吸着によって精製された。生体内投与に先立 ってｍＡｂは全て２０．０００ｘｇで２０分間超遠心分離にかけ、微細空孔濾過 （０，２２μＭ）によって滅菌を行った。

３）皮膚移植 非免疫の、相互関連のないサルの間で植皮を交換した。

提供者と受容者とは、ＭＭＣ抗原（共にクラスＩ（ＲｈＬＡ−Ａ及び−Ｂ）及び クラスＩｔ　（ＲｈＬＡ−ＤＲ））が異なったものである。約２０１１径の植皮 二枚を提供者の腹部から取り、皮下組織を取り除いた後に受容者の背部に移植し た。植皮は縫糸で固定し、その部位を動かないようにする特殊の包帯を用い、植 皮に圧力をかけておいた。５日後から、包帯を短時間開けたり閉じたりして隔日 に植皮を点検した。移植後９日後に包帯を完全に取り去った。その後では、植皮 を二日二回検査し、全拒絶反応が観察されるまでその状態を記録した。大出血が 起こり、かさぶたが植皮全体にわたって形成した時点を植皮生存期間の終点と判 定した（　Ｂａ１ｎｅｒ、　Ｈ。

Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　１９６９．８　：　２０６）　。

４）実験群 皮膚移植実験は、五つの異なった実験群から形成された。群Ｉにおいては、動物 １０匹は処置を受けないものＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　１９８０．　３ ０　：　Ｉ　９６）。

群■においては動物は、Ｈ２Ｏ２−１，６を投与された。この群においては植皮 受容者はＲｈＬＡ−Ａ又は−Ｂ抗原の一つのみが異なった。群■の結果は既に発 表されている（Ｎｏｏｉｊ、　Ｆ、Ｊ、Ｍ、等、　Ｏｕｒ　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、１９８７．１７：１０８９）。群■及び■においては、動物はＭＤＩか８１ Ｅ７１を投与された。群Ｖの動物はＭＤＩ用量を用いた。受容者は、皮膚移植の 一日前の一１日から数えて１０日の間静脈内ポーラス注射として日量１．３■／ ｋｇのＭＤＩ、２．０■／ｋｇの６１Ｅ７１又はｉ、ｏ■／ｋｇのＨ２Ｏ２−１ ０６を投与された。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡによって決定された。フレキシブル９６−ウェルアッセイ板（Ｆ ａｌｃｏｎ　３９１１．０ｘｎａｒｄ、　ＣＡ）を、５μｇ／−の濃度２５μｍ アフィニチイ精製ヤギ抗−マウスＩ　ｇ　Ｇ　（Ｐｅｔ−Ｆｒｅｅｚｅ　Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｒｏｇｅｒｓ、　ＡＲ）で（ＰＢＳ、　ＲＩ　Ａ−ｇｒａ ｄｅ、Ｓｉｇｍａ　）で室温で３０分間上養板を３７°Ｃで２時間培養した。洗 浄後、上記板を引き続いて３７℃で２時間培養した。この際、２５μｌのアフィ ニティ精製及びペルオキシダーゼ標識のヤギ抗−マウスＩ　ｇ　Ｇ　（Ｐｅａ− Ｆｒｅｅｚｅ）を用いた。更にもう一段階洗浄した後でＰＢＳにＯ−フェニレン ジアミン（Ｋｏｄａｋ。

Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）　２　＊／−及び０．０３％ＨｔＯｔを含有する 、基質溶液５０μｌを添加した。２　Ｎ　Ｈｔ　Ｓ　Ｏ４２５μｌを添加して呈 色を停止させた。この培養板を４９２ｎｍで読示した（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕ ｌｔｉｓｋａｎ　ＰＬＵＳ　ＭＫ［Ｉ。

Ｍｅ　Ｌｅａｎ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａ　）　ｏ循環ｍＡｂの量の定量化には、既 知の濃度のＭＤＩ及び６１Ｅ７１の較正曲線を用いた。

６）サルー抗−マウスＩｇＧ抗体の決定Ｏμ■）の１０倍希釈液をウェル毎に添 加した。よく洗Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　）でインキュベートした。この板を展 開してセクション５）に記載のように読示した。対照標準よりもＭＤＩ又は６１ Ｅ７１に対して顕著に高濃度の抗−マウスＩｇＧ抗体を依然として示した最後の １０倍希釈液は試料の滴定量として取った。

７）組織学的研究 生検材料は、手術後一定の間隔で群■及びＶの同種異系の植皮から取った。３ｍ ”の生検スタンスで切除後円筒形の厚い皮膚は長手方向に半分に切断した。半分 はホルマリン緩衝液に漬け、ヘマトキシリン及びアゾフロキン染色部分について 組織学研究のために常法に従って処理した。並行免疫組織化学研究のためにもう 一つの半分をイソペンタン（−７０℃）中で急速冷凍した。６μｍの厚さの低温 部分を切断し、空気乾燥し、アセトンに漬け、使用するまで一７０℃に貯えた。

インキュベージ１ンは、間接免疫ペルオキシダーゼ染色法を用いて行った。

簡単に言えば、切断片を室温で１５分間融解し、ＰＢＳで洗い、次に室温で６０ 分間ｍＡｂでインキュベートする。切断片は再び洗い、その後大根ペルオキシダ ーゼ結合ウサギ抗−マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ。

Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ　）で３０分間インキュベートする。

ものであった。ゆすいだ後、共役結合は、ＰＢＳ中の０．５■／ｙｄの３，３． −ジアミノベンジジン　テトラヒドロクロリド（Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｏ＋ｉａ、 　ＦＲＧ　）及び０．０３％のＨ＝Ｏ！溶液で可視化された。切断片は洗浄し、 メイヤーへマドキシリンで一分間対比染色し、脱水し、最後にマリノール（Ｍａ ｌｉｎｏｌ）（ＣｈｒｏＩＩｌａ　ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、にｏｎｇｅｎ。

ＰＲＧ）で包埋した。

以下の抗体を免疫組織学染色に使用した。すなわち、ＭＨＣクラス■抗原に特異 的なＷ　６　／　３２　（５ｅｒｏｔｅｃ。

Ｂｌａｃｋｈｏｒｎ、　ＧＯ）　、ＭＨＣクラスＩ［−ＤＲ抗原及びＣＤＩにそ れぞれ特異的な抗−ＨＬＡ−ＤＲ及び抗−Ｌｅｕ６で、ランゲルハンス細胞に存 在するもの（両者とも Ｂｅｃｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、　 ＵＳＡから購入）、ＣＤ２に特異的なｍＡｂ　Ｔ　ｌ　１　（ＤＡＫＯ−Ｔ　ｌ 　ｌ。

Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）で、パンＴ細胞マーカーとして全ての アカゲザルＴ細胞に存在するもの、ＣＤＪ＋細胞に特異的な０ＫＴ４及びＯＫ　 Ｔ　４　Ａ　（Ｏｒｔｈ。

Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｃｏ、、Ｒａｒｉｔａｎ、　ＮＪ　）の混合 物及びＣＤａ＋細胞に特異的な０Ｍ９の各抗体である。０Ｍ９はアカゲザルリン バ球に対して産生され、ＴＮＯ霊長類センター（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ、　Ｔｈｅ　 Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　）で製造された。

他のｍＡｂは全てヒト特異性であるが、アカゲザルのものに相互反応性である。

対照標準インキュベートにおいては霊長類抗体は除外した。

て小胞口内炎ビールス（Ｖ　Ｓ　Ｖ）を用いるＨＥｐ−２細胞の細胞変性抑制ア ッセイで半定量的に評価したイーグル媒体（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ、　Ｕ、に、　）　１００　μｍ中に９６ウエル（ｗｅｌＩ）マイクロ滴定板 にウェル当たりを添加し、インキュベージタンを２４時間継続した。その後で、 ｖＳｖ溶液１００μｌを添加し、同じような条件下でインキュベーションを更に ４８時間継続した。細胞の死は、０．５％クリスタルバイオレット染色を用いて モニターした。

アカゲザルのＩＦＮ−γとのＭＤＩの中和活性の相互反応性は、コンカバリンＡ による刺激後アカゲザルの末梢血液単核細胞からの天然由来ＩＦＮ−γを用いて 上に記載のものと同じバイオアッセイで決定されてきた。−中和単位（ｎ’ｓ’ ）とは、既に記載のようなＩＦＮ−γによって誘起された抗ウィルス活性の一単 位を中和することが可能な純粋の抗−ＩＦＮ−ｇ　ｍＡｂ　（ＭＤＩ）の量ミＷ ＥＨＩ　１６４クローン１３線維肉腫細胞の細胞死を測定することによるバイオ アッセイで測定した（Ｅｓｐｅｖｉｋ　Ｔ、等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　（１９８６）　。

９５：９９）。簡単にいえば、ＷＥＨＩ　１６４細胞を、ｌＯ％ＦＣＳ含有のＲ ＰＭＩ１００μ！中に９６−ウエ添加し、湿潤ＣＯ□培養器中で２４時ｆ！１ｆ ３７℃でインキュベートした。その後で細胞の死をテトラゾリウム塩法（Ｈａｎ ｓｅｎ、　Ｍ、８．等、Ｊ、１１１＋１０ｕ１１１）ｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９ ８９．　Ｉ　９活性の相互反応性は、エンドトキシン（ＬＰＳ　Ｅｃｏｌｉ　０ ５５　：　Ｂ　５．　Ｓｉｇｍａ　）による刺激後アカゲザルの末梢血液単核細 胞からの天然由来ＴＮＦを用いて同じアッセイで決定した。６１Ｅ７１の中和容 量は、天然由来のアヵゲザルＴＮＦ３ｎｇのバイオ活性を１００倍減少させる純 ＩｇＧの量であると定義した。

結果 ｌ）皮膚の同種異系移植片の生存に対するｍＡｂ処置の効果 未処置の対照標準動物は、平均移植片生存時間（ＭＳＴ）８．３＋／−０，７日 であった（表１）。

ＭＳＴは無関係なｍＡｂ　Ｈ２Ｏ２−１，６の投与によってもあるいはＭＤＩに よっても延長されなかった。これらの群のＭＳＴ値はそれぞれ８．２と９．５日 であった。６１Ｅ７１単独で処置された動物より成る群においては、未処理の対 照標準群と比較して、観察された移植片生存時間の延長（ＭＳＴ＝　１０日）は 極く控えめで、それほと存意なものでなかった。しかし、ＭＤＩと６１Ｅ７１と を組み合わせたものを予防処置（群■）した場合は、ＭＳＴ１２．３日（マンー ホイットニーＵ試験ｐ＜０．０５）と移植片の生存時間は有意に延長した。

表　１ １ＦＮ−ｇ及びＴＮＦ−αに特異的なｍＡｂで処理されたアカゲザルの場合の皮 膚の同種異系移植片の生存時間９、９．９．９ ＩＩ　Ｈ２Ｏ２−１，６”　８．８，８．５ＩＩＩ　ＭＤＩ　［ＦＮ−γ　９， ９ ＩＶ　６１Ｅ７１　ＴＮＦ−α　１０．１０Ｖ　ＭＤＩ及び６１Ｅ７１　［ＦＮ −γ　１０ｖ５．１２．１３．！及びＴＮＦ−α　１３．５ １　単クローン性抗体（ｍＡｂ）処置は皮膚移植前１日から開始し、１０日間連 続した。

”　Ｈ２Ｏ２−１，６は無関係のネズミ［ｇＧ２ａ単クローり性抗ように維持す るに十分な量であった。濃度は、ＥＬＩＳＡで測定した場合、移植後９日の間３ ５ｎｇ／ｄ〜３８０μｇ／ｍｌの範囲であった。術後１２日には、濃度は全て検 知限界以下であった。ｍＡｂ濃度には異なった群の間における存意な差は観察さ れなかった。

これらの結果から明らかなことは、Ｍ、ＤＩ及び６１Ｅ７１を併用した場合に免 疫抑制効果が増大するということは、ｍ　Ａ’ｂが別々に投与された群に対比し てこれらのｍＡｂが循環中により長くバイオアベイラビリティ−を維持するとい う理由では説明しきれないというこしでである。更に、皮膚移植処置を受けた全 ての受容者の場合、抗−マウス−抗体の同じ程度の滴定量は、術後９日から検出 することができていた。従って、群■、■及び７間の前述のＭＳＴの相違は、注 入ネズミ抗体に対する免疫反応性の差であったとはいえない。

３）一般組織学 群■及びＶのサルの移植皮膚について組織学的研究が行われた。移＃ｆ後５日に おいて、群■の同種異系移植片については全て脈管周囲のリンパ球湿潤が明視さ れた。

−例を除いて、両方のｍＡｂを処置されたサルの群（群Ｖ）の移植片には、術後 ５日には拒絶反応は認められなかったし、認められた場合でも極く微小の兆候で あった。

移植後９日、群■においてはリンパ球及び大食細胞様細胞の湿潤は移植皮全体に わたってより一層拡散した。

毛細管の破壊及び静脈内皮の腫れが存在するようになった。しかし、群Ｖにおい ては、リンパ球の湿潤は局所的性質を帯びたままであった。毛細管破壊はそれほ ど著しくなく、静脈もまた損傷を受けていなかった。群Ｖのサルの一匹の移植片 は、移植後７日にすでに静脈変化の兆候を示していたが、移植術後９日でも移植 拒絶反応は、群■の移植片と同程度に穏やかであった。

完全な拒絶後は、移植皮膚には全て皮膚の上皮層の壊死及びかさぶたの形成が見 られた。

総括すると、一般に群Ｖの移植片には、群■の移植片より少なくとも２日遅くリ ンパ球及び大食細胞様細胞の浸潤があった。

４）免疫組織学 術後５Ｂ、群■及びＶの同種異系皮膚生検材料にきわめて少量の免疫染色リンパ 球か見出された。外皮及び真皮の支質は、ＭＨＣクラスエ及び■抗原に特異的な ｍＡｂと殆ど反応せず、そして少量のランゲルハンス細胞はｍＡｂ抗−Ｌｅｕ６ で染色された。

術後９日、群■において脈管内皮を含む乳頭及び網様真皮にあるすべての既存構 造及び浸潤液は、ＭＨＣクラスＩ及びＩ［−ＤＲ抗原の極めて強い表出を示した 。ランゲルハンス細胞は強く染色された。浸潤液の８０％以上は、Ｔｌｌ＋細胞 でできていた。これらＴ細胞の５％以下が０ＫＴ４及び４Ａに対して陽性であり 、ＣＤＪ＋細胞は拒絶反応がひどく起こった時にはほとんど全く存在しなかった ことを暗示している。細胞は殆ど全てＧ　Ｍ　９で染色されたが、これはＣＤａ 十表視表現型義する。同様な変化は、術後９日に群Ｖサルの一匹の植皮に見出さ れた。群■の動物の他の全ての植皮においては、既存構造のＭＨＣクラスＩ及び ■抗原表現はこの時点ては顕著ではなかった。浸潤は脈管周囲の局所に止まって おり、各浸潤液の５０〜６０％がＴｌｌに対して陽性であった。

ＣＤ４＋　：　ＣＤＢ＋細胞の比は、群■と同じ＜ＣＤ８＋細胞のほうが優位に あった。

完全な拒絶反応の後では、外皮及び乳頭真皮は壊死状馨で、真皮の残余構造のＭ ＨＣクラス！及びＩ抗原に対する染色強度は減少した。

従ってこれらの免疫組織学実験によって確認されることは、抗体を併用して用い るとＭＨＣクラスＩ及び■抗植、ｍＡｂの投与又は同種異系植皮の拒絶などと相 関量同種異系植皮拒絶部位にこれらリンフ才力インが存在することを反映するも のではなく、植皮部位に直接的に、例えば局所投与によって投与することが好適 であろうということである。

補正書の翻訳文提出書帽峠４８４＆ノ８）　ｔｉ平成　３　都　９　月　９　日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．同時に個別的あるいは直列的に療法に使用する併用調製物としての、腫瘍壊 死因子に対する抗体（抗−ＴＮＦ抗体）及びインターフェロン−γに対する抗体 （抗−ＩＦＮ−γ抗体）を含む薬剤生成物。
2. ２．該調製物が、免疫調節障害の療法に使用される請求の範囲第１項記載の薬剤 生成物。
3. ３．該調製物が、自己免疫疾患又は臓器もしくは組織移植拒絶反応の療法に使用 される請求の範囲第１項又は第２項記載の薬剤生成物。
4. ４．抗−ＴＮＦ抗体、抗−ＩＦＮ−γ抗体及び、任意に、薬剤的に許容の賦形剤 、希釈剤又は担体を、混合物の形で含む前記請求の範囲のいずれか一つに記載の 薬剤生成物。
5. ５．免疫調節障害の療法に使用される薬剤生成物の製造の際におけるＴＮＦに対 する抗体及びインターフェロン−γに対する抗体の使用。
6. ６．免疫調節障害が自己免疫疾患又は臓器もしくは組織移植拒絶反応である請求 の範囲第５項記載の使用。
7. ７．療法に使用の薬剤生成物の製造法において、該方法が抗−ＴＮＦ抗体及び抗 −ＩＦＮ−γ抗体を同時に個別的あるいは直列的に使用する併用調製物として配 置することを包む薬剤生成物の製造法。
8. ８．抗−ＴＮＦ抗体、抗−ＩＦＮ−γ抗体及び、任意に、薬剤的に許容の賦形剤 、希釈剤又は担体を混合することを包む請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載 の薬剤生成物の製造法。
9. ９．ヒト又は動物対象の免疫調節障害の処置の方法において、該方法が該対象に 抗−ＴＮＦ抗体及び抗−ＩＦＮ−γ抗体を投与することを含む免疫調節障害の処 置法。
10. １０．抗−ＴＮＦ抗体がヒトＴＮＦ−αに対する抗体である前記請求の範囲のい ずれか一つに記載の生成物、方法、又は使用。