JPH08511015A - 治療用抗体断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片を患者に投与することを含む、中和が有益な患者におけるＴＮＦαの中和方法。患者としては、敗血症性ショックもしくは敗血症性ショックの徴候を示す者が適切である。Ｆａｂ断片が、ポリクローナルＩｇＧから得られたものであれば好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 治療用抗体断片 本発明は、治療における免疫グロブリンＦａｂ断片の使用に関する。 抗体は、微生物または外部の高分子に対する免疫反応の一部として形成される 。これらは免疫グロブリン（Ｉｇ）であって、症状の悪化の診断、モニタリング 、予防および治療用に広く臨床的に使用されている。 全ての抗体分子を形成する基本ユニットが、Ｐｏｒｔｅｒ（１９５９）Bioche m J．73，119-126によって、特定のタンパク質分解酵素を用いて解明された。最 も重要な免疫グロブリンであるＩｇＧは、二本の重鎖と二本の軽鎖を備え、重鎖 はジスルフィド結合によりそのヒンジ領域で対をなしている。上記結合のパパイ ンによる切断により、図１に示されるように、二つの抗体結合断片（Ｆａｂ）と クリスタリン断片（Ｆｃ）が放出される。ヒンジ部下方のペプシンでの切断によ り、図１に示すように、少し小さいＦｃ断片と二つの結合部位を備えた一つのＦ （ａｂ’）₂断片になる。各Ｆａｂ断片は、軽鎖と一部の重鎖の両方を備え、微 生物または外部の高分子に対する特異的結合に重要な配列を含む。Ｆｃは、二つ の重鎖の残余からなり、これに相補的なマクロファージおよび多形核白血球細胞 が結合可能な部位である。二つの重鎖（軽鎖ではない）は、抗体の各クラス、す なわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥで異なる。ＩｇＧは、濃度の点で主 要な循環する免疫グロブリンである。これは、単一の基本的な免疫グロブリンユ ニットからなり、特徴として、その特異的抗原に対する高い親和性を備えている 。さらに詳細な抗体の構造および機能については、Roitt（1991 Essential Immu nology，7th Edition，B1ackwell Scientific Publications，Oxfordに記載され ている。 微生物病原体は、可溶性の毒素を放出することにより有害な影響を引き起こす 。これらは、ジフテリアおよびテタヌスバチルス属によって放出される神経性外 毒素およびグラム陰性菌の細胞壁からのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）およびグ ラム陽性の生物からのペプチドグリカン等の種々の内毒素を含む。１８９０年に 、von Behringは、可溶性抗原に対する外因性の抗体が治療的価値を有すること 、すなわち、ジフテリアによる子供の死が、ジフテリアトキソイドで高度免疫さ れたウマの血清の全身性投与によって減少したことを示した。類似した試みが、 テタヌス患者でも成功した。受動免疫化は、１９８４年にCalmetteおよび他の研 究者によって、ヘビにかまれた人にも急速に広がった。 敗血症性ショック症候群（septic shock syndrome）の発達には、細胞レベル （例えば、内皮細胞における酸化窒素シンターゼ）において、イニシエーター（ ＬＰＳ等）、メディエーター（ＴＮＦα、ＩＬ- １およびＩＬ- ６を含む）およ びエフェクターが含まれる。全てのイニシエーターとメディエーターは、抗原と なる可能性があり、これらの高分子に対する抗体は、敗血症性ショックの予防お よび治療に使用することができる。いくつかのグループは、成功の度合いは異な るが、ＬＰＳに対するポリクローナル抗体（ＰｃＡｂ）またはモノクローナル抗 体（ＭｃＡｂ）を用いた。同時に、ＴＮＦαに対するＰｃＡｂによって、ＢＡＬ Ｂ／Ｃマウスにおけるこのサイトカインの致死効果が妨げられることが示された （Beutleら（1985）Science 229，869-871）。Traceyとその同業者（（1987）Na ture 330，662-664）により、ヒヒにおける細菌試験（チャレンジ）の１時間前 に与えられた、ＴＮＦαに対するＭｃＡｂが、器官損傷に対して部分的な保護を 示し、二時間前に与えた場合には、より完全に保護することが示された。言い換 えれば、抗ＴＮＦα ＭｃＡｂが予防的に用いられた。 いくつかのグループが、通常はウサギにおいて、ＬＰＳおよびＴＮＦに対する ＰｃＡｂを生成し、敗血症性ショックの動物モデルでその効果を示した。また、 ＬＰＳに対するＰｃＡｂがヒトで生成され、使用も成功した（Zieglerら（1982 ）New Engl．J．Med．307，1225-1230）。ヒト抗体の使用は、アレルギー性の併 発症の危険を避けるものであるが、ウイルスの混入（ＨＩＶおよび肝炎）の可能 性 を含む、倫理的かつロジスティック等の理由から広い適用が妨げられる。それゆ え、ほとんどのグループは、ＭｃＡＢの生成に労力をつぎ込んでいる。ＭｃＡｂ は、例えば、均一であることや、多くの場合に、他のタンパクから抗体を分離す るためにプロテインＡまたはプロテインＧとのアフィニティークロマトグラフィ ーによるダウンストリーム処理（down-stream processing）が比較的単純である こと等の多くの利点を与える。 敗血症性ショックに対する治療の開発に関わるどのグループも、特異的なＦａ ｂ断片を調製または使用していない。またどのグループも、ショックの臨床的発 現後に、敗血症性ショックの患者を治療するのに抗ＴＮＦ Ｆａｂ断片を使用す ることを示していない。発明の要約 我々は、ＴＮＦαに反応するＦａｂ断片の投与が、“敗血症性ショック”症状 の患者に有益であることをヒトで証明した。 実施例でより詳細に記載するように、ＴＮＦαに対するポリクローナル抗体か ら得られたＦａｂ断片が、ＴＮＦαに対する完全なＩｇＧよりも、ＴＮＦの影響 を減少させるのにより効果的であることを予期せず見いだした。 しかして、本発明の一つの態様は、ＴＮＦαに反応するＦａｂ断片を患者に投 与することを含む、ＴＮＦαの中和から利益を得る患者におけるＴＮＦαの中和 方法を提供する。 患者としては、敗血症性ショックもしくは敗血症性ショックの症状を有する者 が適切である。しかして、本発明の更なる態様は、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片を患者に投与することを含む、患者における敗血症性ショックもしく は敗血症性ショック症状の予防または改善方法を提供する。 Ｆａｂ断片は、当該技術分野でよく知られた、実施例に開示した方法で、ＴＮ Ｆαに反応する実質的に純粋なＩｇＧから生成することができる。 本発明の更なる態様は、薬剤中に使用するための、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片を提供する。 本発明の更なる態様は、ＴＮＦαの中和から利益を得る患者の治療用薬剤の製 造における、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片の使用を提供する。 ＩｇＧ Ｆａｂ断片が、ポリクローナル抗血清から得られたものであればさら に好ましい。ポリクローナル抗血清（ポリクローナルＩｇＧを含む）は、ヒツジ 、ヤギ、ウマ等を免疫することによって得られる。哺乳動物としては、スクレー ピーおよび人獣共通伝染病ウイルスを有していないヒツジが好ましい。ＴＮＦα に反応する、ポリクローナルヒツジＩｇＧから得られたＦａｂ断片の調製方法を 、実施例に記載する。 ＴＮＦαに反応するＦａｂ断片は、循環するＴＮＦαのレベルの増加に特徴を 有する症状の治療に使用できる。このような症状としては、例えば敗血症性ショ ック等のショック、および、腫瘍治療の状況における過剰のＴＮＦαを含む。敗 血症性ショックは、特にグラム陰性菌の感染等の細菌感染後および敗血症中に起 こる。また、ショックは、事故または外科手術後の外傷も含める。更なる使用は 、国際特許ＷＯ８９／０８４６０号に記載された抗リンパ球抗体治療に関連した 治療、および欧州特許第３５５０６７号に記載されたガンの化学療法に関連した 治療を含む。 ヒトリンパ球に対するラプリン（laprine）またはウマのポリクローナル抗体 の静脈注射が、急性腎臓同種移植片拒絶反応（aute renal allograft rejection ）の治療を助けるのに非常に効果的であることがわかっている。このような生成 物 は、依然として使用されている。Ortho Pharmaceutical Coは、臨床試験の後、 腎臓移植後の移植片拒絶反応防止を補助するために、マウスのモノクローナル抗 体、ＯＫＴ３を慣例的に使用することに対して、１９８６年にＦＤＡからライセ ンスを許可された。この生成物は、腎臓、肝臓および心臓移植後の急性拒絶反応 の治療に極端に効果的であることを示し、ＯＫＴ３は、ライセンスが許可された モノクローナル抗体をベースとした治療生成物（monoclonal-based therapeutic product）のみを残している。 ＯＫＴ３は、全ての成熟Ｔリンパ球上に見られるＣＤ-３複合体に特異的に結 合する。通常、ＣＤ-３は、抗原認識と細胞刺激に関係し、この両方は、マウス 抗体の存在による立体障害のために妨げられる。 モノクローナル抗体ＯＫＴ３を発現するハイブリドーマは、America Type Cul ture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852 USA、加 入番号ATCC CRL8001から得られる。これは、ＩｇＧ２ａイソタイプであり、ヒト ヘルパーＴ細胞サブセットに反応する。ハイブリドーマおよび抗体は、参照とし てここに取り込まれた米国特許第４３８１２９５号に引用される。ＯＫＴ３を用 いた治療法は、参照としてここに取り込んだOrtho Study Group（1985）N．Engl ．J．Med．313，337-342に記載されている。 しかしながら、このような抗Ｔリンパ球治療により、疑う余地のない利益とと もに副作用が生じる。ポリクローナル抗リンパ球グロブリンの最初の注入とそれ に次ぐＯＫＴ３の最初の注射の間に、実際に全ての患者がひどい徴候および症状 を経験する。これらは、少なくとも９０％の被験者における発熱、頭痛、悪心お よび嘔吐、下痢、全身的な倦怠感および極端な疲労、呼吸困難、筋肉痛および頻 拍を含む。数人の患者では、急性肺水腫が引き起こされた。治療の第二期では、 副作用は最小限であり、以下の期間では全く現れなかった。 このような臨床的な発現は、ＴＮＦの注入後または敗血症性ショックに見られ るものに類似している。抗リンパ球グロブリンの注入は、インターロイキン-１ ベータ（ＩＬ-１β）が測定可能ではないが、循環するＴＮＦを検出不可能なレ ベルから１１１〜７３１ｎｇ／Ｌの値まで顕著に増加させることを示した。ＴＮ Ｆにおけるこの増加は、密接に発熱を伴う（３８．４〜４０．４℃）。 本発明の目的は、ＯＫＴ３または抗リンパ球グロブリン処置後のショック様症 状を減少することである。 しかして、一つの好ましい実施態様では、例えば腎臓移植における急性拒絶反 応を減少するために、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片、もしくは機能的 に同等のポリクローナル抗血清を、モノクローナル抗体ＯＫＴ３が与えられた患 者を治療するために使用する。ＴＮＦαに反応するＩｇＧまたはＦａｂ断片は、 ＯＫＴ３または機能的に同等の抗体で処置した際のショック様副作用を減少させ る。 スピロヘータである回帰熱ボレリアによって引き起こされるラウス-ボーン再 発性熱（Louse-borne relapsing fever）（ＬＢＲＦ）は、今世紀にヨーロッパ 、アフリカおよび中東で大規模に流行したが、現在はエチオピア高地の固有の地 域に限定されている。流行中は、未治療の死亡率は４０％を超えたが、ペニシリ ン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールおよびエリスロマイシンを含む抗 生物質を用いて５％未満まで減少した。臨床的治療は、恐ろしく、かつ、時には 致死のヤーリッシュ-ヘルクスハイマー反応（ＪＨＲ）を誘発する抗生物質の使 用によってのみ成される。静脈のテトラサイクリンは、予想通り処置から約１時 間以内に開始される、典型的な“内毒素”または“ショック”反応（Warrellら （1970）Clin．Sci．39，123-145）である硬直、潮紅および解熱期の三段階から なる反応を引き起こす。患者は、潮紅段階早期における熱の、またはショックの ピークにおける超高熱、もしくは潮紅／解熱段階における急性の心筋の不全を伴 って、この反応の間に死ぬことがある。 Negussieと彼の同僚（（1992）J．Exp．Med．175，1203-1207）は、ＪＨＲ中 に、ＴＮＦαと、それに次いでＩＬ-６およびＩＬ-８が爆発的に放出されること を証明した。 しかして、さらなる実施態様では、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片を 、ヤーリッシュ-ヘルクスハイマー反応で示されたような敗血症性ショックの徴 候を有する患者を治療するために用いる。 このＪＨＲは、適切にラウス-ボーン再発性熱の抗生物質処置に関連する。 ＪＨＲまたは類似反応は、梅毒、ティック-ボーン再発性熱、ヴァンサンアン ギナ、そ毒熱（rat-bite fever）、レプトスピラ症、フランベジア、ブルセラ症 およびアフリカトリパノソーマ症を含む、種々の他の寄生性かつ侵害性生物疾患 の抗生物質処置に関することが知られている。 実施例に記載したような抗ＴＮＦ Ｆａｂを用いたＬＢＲＦの抗生物質処置に 係る徴候の処置は、ＪＨＲもしくは上記疾患の抗生物質処置に係る類似反応を処 置するために用いられることが認識される。 ラウス-ボーン再発性熱のＪＨＲは、抗ＴＮＦαインターベンション（interve ntion）の臨床試験用の倫理的なモデルを提供することが認識され、ＪＨＲにお けるＴＮＦαのレベルが増加することがよく知られている。 本発明の更なる態様は、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片および生理学 的に許容できるキャリアーを有する薬学的組成物を提供する。 一般に、ＩｇＧ Ｆａｂ断片は、患者のＴＮＦαを中和したいときはいつでも 使用できる。投与される量は、患者の体重および状態を参考に決定されるが、典 型的に、２００-２０００ｍｇの特異的抗ＴＮＦａ Ｆａｂ断片が、成人に、２ ない し３日以上投与される。 慣例的に、Ｆａｂ断片がポリクローナル抗血清から得られ、アフィニティー精 製がされていない場合には、約２０ｍｇ／ｋｇの特異的抗ＴＮＦα Ｆａｂを含 有する１２０ｍｇ／ｋｇの全Ｆａｂが投与される。 Ｆａｂ断片が実質的に純粋で、発熱原性でないことが好ましい。Ｆａｂ断片は 、陽イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー等 のクロマトグラフィー技術を用いて実質的に精製することができる。 本発明のＩｇＧ Ｆａｂ断片またはその製剤は、非経口的（例えば、静脈内、 皮下あるいは筋内）注射を含む通常の全身性の方法で投与することができる。こ の処置は、一回の投与もしくはある期間をおいて複数回の投与からなる。 本発明のＩｇＧ Ｆａｂ断片は、単独で投与することもできるが、一つ以上の 使用可能なキャリアーを備えた薬学的な製剤とすることが好ましい。このキャリ アーは、Ｆａｂ断片に適しており、被投与者にとって有害ではないという意味で “使用可能”でなければならない。 ＩｇＧ Ｆａｂ断片の製剤は、都合良く単位投与形態とされ、薬学においてよ く知られた方法で調製することができる。このような方法は、ＩｇＧ Ｆａｂ断 片と、一つ以上の補助成分からなるキャリアーとを組み合わせる段階を含む。一 般に、この製剤は、一様かつ密接に活性成分と液体キャリアーとを組み合わせる ことによって調製される。 非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、バッファー、静菌薬、およびこの製 剤を被投与者の血液と等張にする溶質を含有することができる水性および非水性 の無菌の注射液；および懸濁剤と増粘剤を含む水性および非水性の無菌の懸濁液 を含む。製剤は、密封されたアンプルおよびバイアル等の単位投与もしくは多数 回投与用容器で提供することができ、例えば直ちに使用できる注射用の水等の無 菌液体キャリアーの添加のみを必要とする冷凍乾燥条件（凍結乾燥）で保存する ことができる。即席の注射液および懸濁液を調製することができる。好ましい単 位投与製剤は、活性成分の日々の投与量または単位、日々の副投与（sub-dose） またはその適切な画分を含むものである。 本発明を、以下の実施例および図面を参照して記載する。 図１は、抗体分子の構造を示す図である。 図２は、ヒツジにおける肺動脈圧およびリンパ液の流れに対する完全な抗ＴＮ Ｆα抗体の効果を示す。 図３は、マウスにおけるリポポリサッカリド誘発致死に対する抗ＴＮＦα Ｆ ａｂ断片の効果を示す。 図４は、Ｌ９２９細胞に抗ＴＮＦα ＩｇＧまたはＦａｂとＴＮＦαとを共在 させた場合の効果を示す。 図５は、ＴＮＦαを処置してから２時間後に抗ＴＮＦα ＩｇＧまたはＦａｂ 断片を適用した場合の効果を示す。 図６は、ＴＮＦαを処置してから４時間後に抗ＴＮＦα ＩｇＧまたはＦａｂ 断片を適用した場合の効果を示す。 図７は、最初の温度が正常である場合の、患者の体温に対する抗ＴＮＦα Ｆ ａｂ断片または食塩水の影響を示す。 図８は、最初の温度を高くした場合の、患者の体温に対する抗ＴＮＦα Ｆａ ｂ 断片または食塩水の影響を示す。 図９は、食塩水、対照のＦａｂもしくは抗ＴＮＦα Ｆａｂで処理された患者 におけるＴＮＦαピークレベルを示す。 実施例１：ヒッジを免疫するためのＴＮＦα免疫原の調製 手順 活性なＴＮＦα免疫原を含むバイアルの調製 バイアルは、新規で、塵がなく、バイアルに免疫原が付着することを前もって 防止するためにシアリナーティング流体（sialinating fluid）で４８時間処理 されるべきである。新鮮なシアリナーティング液は、２４時間ごとに作製する必 要がある。 シアリナーティングは、以下の方法で行われる。 ａ） ドラフトチャンバー内で、バイアルを金属のトレーに並べる。 ｂ） 製造元の説明に従ってシアリナーティング溶液を作製する。０．１％溶液 に希釈する。０．２％溶液は、９９部の水に対して１部のＡＱＵＡＳＩＬ（商品 名）とすることによって成される。絶え間なく攪拌する。その溶液にバイアルを 浸す。次いで、最低でも２４時間風乾する。 ＴＮＦαを４℃での保存状態から移し、少なくとも３０分間室温で平衡化させ る。 全体の群の一ヶ月ごとの免疫化用のＴＮＦαの全量を、天秤を用いて無菌の１ ５０ｍｌのＳｔｅｒｉｌｉｎ（商品名）フラスコに量り分けた。必要な計算は、 以下の“免疫原調製に係る計算”に記載する。これは、以下に記載した計算にお いてＥとして表される。調製した残りの免疫原は、保存して後日に使用すること ができる。 この免疫原を、０．９％食塩水に溶かす。この溶液を、最低でも３０分間エン ドオーバーエンドローテーション（end-over-end rotation）で混合する。用い た食塩水の量は、以下の記載のＦである。 調製された免疫原溶液を、無菌のピペットおよびＰｉｐｅｔｔｅｍａｎ（商品 名）装置を用いてバイアルに分注する。 免疫原調製に係る計算 各バイアルは、ヒツジ３頭分に十分な免疫原を含むべきである。それゆえ、免 疫化用のヒツジの全体数（Ａ）を３で割り、次の整数に繰り上げる。 Ａ／３＝Ｂ 例えば、４９／３＝１６．３３であるから１７ 量り分けられるＴＮＦαの量は、各ヒツジ当たりに必要とされる免疫原の量（ Ｃ）をかけた３Ｂである。 （３ ｘ Ｂ）Ｃ＝Ｄ 例えば、調製した免疫化の投与量が各ヒツジ当たり８０μｇなら、（３ ｘ １ ７）８０＝４０８０μｇ＝４．０８ｍｇ 一つごとに異なる、塩内容物に対するＴＮＦαの量は、免疫原を量り分ける際 に考慮しなければならない。 （Ｄ／供給物質におけるＴＮＦαのパーセント）１００＝Ｅ 例えば、提供物質が９５％の塩と５％のＴＮＦαを含有する場合には、（４．０ ８／５）１００＝８１．６ｍｇ 量り分けられた免疫原を、使用されるバイアルの数と４をかけて計算された適 切な量の０．９％食塩水に溶かす。各バイアルは、４ｍｌの食塩水を含むべきで ある。 Ｂ ｘ ４＝Ｆ 例えば、１７ ｘ ４＝６８ｍｌ 実施例２：免疫化、抗ＴＮＦαヒツジのサンプルおよび採血のプロトコール この表は、ＴＮＦαに対して免疫されたヒツジを得るための、免疫化の投与量 、採血量および個々のサンプルもしくは貯蔵されたサンプルの処理に関する年間 の隔週計画を示す。 免疫化の前に各動物からサンプルをとる。このレベルが、各ヒツジのバックグ ラウンドのレベルである。 以下の定義を用いる。 Ｉ ：最初の免疫化 Ｒ＃ ：最初の免疫化後の再免疫化の数 サンプル：力価を評価するための各動物からの５-１０ｍｌの血液サンプル 採血 ：体重のｋｇ当たりに得られた１０ｍｌの血液 ＩＳ ：個々の性能を評価するための個々のサンプル Ｐ ：全ての個体からの採血の貯蔵 実施例３：部分精製されたＩｇＧからの抗ＴＮＦα Ｆａｂ断片の調製 ヒツジを、投与反応の研究に基づいて選択され、かつ実施例１および２に記載 されたようなｒｈＴＮＦαの量で、一連の計画に従って免疫した。適当な循環す る特異的抗体レベルが得られたら（少なくとも３ｇ／Ｌ）、ヒツジから無菌かつ 発熱物質のないガラス瓶に採血する；回転瓶技術により凝固を促進し、瓶を遠心 し、血清を層流キャビネットで吸引により回収し、０．２μｍの濾過にかけ、− ２０℃に保存する。細菌および発熱物質の混入が防止され、この生成物を厳格に 品質管理する。 他の動物からの抗血清を貯蔵し、アルブミンを含む他の多くの血清タンパク質 から分離するために、２５℃で免疫グロブリンを硫酸ナトリウムで沈殿させた。 ＩｇＧクラスの抗体を広範に含むその免疫グロブリンを、無菌の硫酸ナトリウム で洗浄し、食塩水に再度懸濁した。 パパイン処理：次の段階は、システインおよびＥＤＴＡで活性化されたパパイン を用いてＦａｂおよびＦｃに抗体を切断することである。これは、完全なＩｇＧ を確実に切断する条件下で行う。クリスタリンＦｃは、遠心により除去する。パ パイン切断および遠心後の上清は、以下を含む。（１）注目の可溶性抗原に対す る特異的なＦａｂ；（２）多数の別のエピトープに対する非特異的なＦａｂであ って治療には価値がないもの；（３）少量のタンパク質（アルブミンを含む）と 他の混入物；および（４）不活性化したパパイン。 アフィニティークロマトグラフィー： アフィニティー精製． ヒト腫瘍壊死ファクター（human tumor necrosis facto r）（抗ＴＮＦ）Ｆａｂ断片のアフィニティー精製は、ｒＴＮＦα（組換えヒト ＴＮＦα）が結合した架橋結合したアガロース（セファロース）媒体を用いて行 う。ｒＴＮＦαの媒体への結合は、イソ-ウレア（iso-urea）結合が用いられる 。 アガロース-ｒＴＮＦαアフィニティーカラムマトリックスの作製 材料 臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（Pharmacia，Uppsala，Sweden） ｒＴＮＦα（R/D Systems Minneapolis，USA） ＢＰＧアフイニティーカラム容器（Pharmacia） 大きなガラス焼結漏斗 ブフナーフラスコ 真空ポンプ ガラス棒 ナルゲンボトル（Nalgene bottle） バッファーおよび溶液 全てのバッファーは、無菌かつ発熱物質が無いものでなければならない（ＳＯ Ｐ０．２、治療用製品のための無菌、発熱物質の無いバッファーの調製参照）。 塩酸（１ｍＭ）２００ｍｌ／ｇ）氷冷） 塩化ナトリウム（０．５Ｍ）を含む炭酸水素ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ８．３ ） エタノールアミン（１．０Ｍ、ｐＨ８．０） 塩化ナトリウム（０．５Ｍ）を含む酢酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ４．０） 手順． 治療用製品のためのカラムを作製する際に、全ての工程をクラス１００ 条件における層流下で行い、全ての装置は無菌かつ発熱物質の無いものとするべ きである。 ゲルの膨潤および洗浄：必要量の冷凍乾燥されたセファロースパウダーをプラス チックのナルゲンボトルに量り分け、ＨＣｌ（氷冷）に懸濁する。ゲルがすぐに 膨潤し、同じ液体（２００ｍｌ／ｇ（ゲル））で、焼結されたガラスフィルター 上で１５分間洗浄する。この溶液を、いくつかの分割量に添加し、最後の分割量 の後にひび割れが表面に現れるまでゲルを乾燥させる。 リガンドの結合：ＴＮＦリガンド（５ｍｇ／ｇ（用いられるゲル））を、プラス チックナルゲンボトル中の炭酸水素ナトリウムバッファー（０．１Ｍ，ｐＨ８． ３、７ｍｌ／ｇ（用いられるゲル））に溶解する。溶解させた後、分注量（全体 の０．２５％）をとり、リガンド溶液を底から跳ね上げないように注意しながら 、風乾したゲルを添加する。この混合物を、４℃で一晩、エンドオーバーエンド で循環させる。 ゲルの活性基のブロッキング：一晩結合させた後、このゲル溶液をガラス焼結漏 斗に移し、リガンド溶液を吸引し回収する。次いで、このゲルを２００ｍｌのエ タノールアミンで洗浄する。全ての洗浄物を回収する。 次いで、このゲルをエタノールアミン（１．０Ｍ、ｐＨ８．０）を含有するナ ルゲンボトルに移し、この混合物を上述のように一晩循環させる。 ゲルの洗浄：ブロックされたゲルを焼結漏斗に移し、エタノールアミン溶液を吸 い上げ、回収する。このゲルを結合バッファー（重炭酸塩）、酢酸塩バッファー 、次いで二度目の結合バッファーで洗浄する。 このゲルを、カラム容器に移して収容し、食塩水（０．９％）を通して洗浄す る。 結合効率を、洗浄におけるタンパク質の量を測定することによって決定し、こ れを最初のリガンド溶液分注量と比較する。 各材料が完了した後で、かつ、全体のＦａｂ切断溶液の最初の添加の前に、カ ラムをグアニジニウムヒドロクロリド（６．０Ｍ）を用いて殺菌する。 このＦａｂ溶液は、１８℃で、最低でも２時間、１ｍｌ／分の流速で循環させ る。 アフィニティー支持体からのｒＴＮＦα抗毒素Ｆａｂの放出 支持体に結合したヒツジのｒＴＮＦα Ｆａｂ断片を、グリシン（１０ｍＭ） ｐＨ２．５）でカラムを洗浄することによって遊離させる。流出液を、クエン酸 塩バッファー（０．６Ｍ、ｐＨ８．０：２．５％の終濃度）に回収し、ナルゲン 、２リッター使い捨て回収ボトルに保存する。サンプルをＱＣ試験（ＧＦ ＦＰ ＬＣ、ｐＨ、タンパク質濃度、無菌性およびＬＡＬ試験）に用いる。 アフィニティーカラムを、リン酸バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）を用い て、流出液のｐＨが約５．５になるまで再度平衡化する。次いで、このカラムを 、次のサイクル用に調製するために食塩水（０．９％）で平衡化する。 付加的もしくは選択的に、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いることがで きる。 陽イオン交換クロマトグラフィー 全体のＦａｂ溶液（酢酸アンモニウムバッファー）を、ほとんどのＦａｂ（＞ ８０％）が結合するような陽イオン交換カラム（将来的にはより弱く結合するカ ラムに変わるが、現在のところＢｉｏＲａｄ ＭａｃｒｏＰｒｅｐ Ｓ）に添加 する。生成物を殺菌し、プリオンまたはウイルスによる混入を防止するために、 このカラムおよびこれに結合したＦａｂを、３カラム容量のバッファー（酢酸ア ンモニウム、ｐＨ４．０）で洗浄する。 洗浄後、結合した全体のＦａｂを、塩化ナトリウム（０．５Ｍ）を含有するア プリケーションバッファーでカラムを洗浄することにより溶出させる。次いで、 酢酸アンモニウムバッファーを除くために溶出されたＦａｂを限外ろ過および食 塩水で洗浄し、必要に応じて濃縮し、無菌のプラスチックトランスファーバッグ に収容する。このバッグは、充填装置に直接連結することができる。この生成物 を、最後に濾過し、充填かつ最終的に充填し、凍結乾燥する。 このイオン交換カラムは、水酸化ナトリウム（１．０Ｍ）を用いて使用の合間 に滅菌し、次いで次回のサイクルの準備のために酢酸アンモニウムバッファーで 再度平衡化する。 実施例４：ヒツジ抗ＴＮＦα ＩｇＧの生物学的効果 完全な、アフィニティー精製されていない抗体と、敗血症性ショックのヒツジ モデルとを用いた研究の結果を、図２に示す。この抗体は、ヒツジの抗ＴＮＦα ＩｇＧを与えない対照のグループで見られる肺動脈圧の上昇および肺のリンパ 液の流れの上昇を部分的に妨げた。 実施例５：マウスにおけるヒツジ抗ＴＮＦα Ｆａｂ断片の生物学的効果 特異的なヒッジ抗ＴＮＦα Ｆａｂを、致死量の内毒素を注射したマウスに用 いた研究の結果を図３に示す。内毒素のみを与えたマウスの９０％が、４日まで に死亡した。この値は、特定のＦａｂを２ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ投与 することにより、それぞれ８０％および３０％まで減少した。 実施例６：ＴＮＦの細胞毒性効果に対する抗ＴＮＦα ＩｇＧおよび抗ＴＮＦα Ｆａｂ断片の保護効果の比較 Ｌ９２９細胞でＴＮＦαの細胞毒性に対する抗ＴＮＦα ＩｇＧおよび抗ＴＮ Ｆα Ｆａｂの保護効果を調べた。単離された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し た場合、培地に１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを添加することにより、これらの細胞 が破壊された（図４に示した光学密度の下降によって証明される）。同時に、１ ００μｇ／ｍｌのＩｇＧまたはＦａｂを添加することにより、ＴＮＦに結合およ び中和することにより細胞がかなり保護された。ＩｇＧの方が、Ｆａｂよりわず かに優れていた。 図５および特に図６は、全体として予期せぬ結果を示した。抗体の添加をＴＮ Ｆの添加後２または４時間遅らせた場合には、Ｆａｂが、完全なＩｇＧより顕著 に保護的であった。実際に、特異的なＦａｂの添加の遅延は、保護効果を増幅す るらしい。 この結果は、敗血症性ショックにおけるＴＮＦの増加後２もしくは４時間遅ら せて投与すれば、Ｆａｂ断片をｉｎ ｖｉｖｏでも使用できることを示すもので あると考えられる。 実施例７：ラウス-ボーン再発性熱の抗生物質処理後におけるヤーリッシュ-ヘル クスハイマー反応（ＪＨＲ）を防止または改善するための抗ＴＮＦα Ｆａｂ断 片使用の臨床試験 アフリカ、中東およびヨーロッパでは全国的に流行であったが、エチオピアは 、ラウス-ボーン再発性熱（ＬＢＲＦ）の固有の地域を残している。ある流行病 では未治療の致死率が５０％を超えるが、抗生物質処置は回帰熱ボレリアスピロ ヘータを除き再発を防止するのに効果的であるものの、古典的な内毒素反応に似 たヤーリッシュ- ヘルクスハイマー反応（ＪＨＲ）という生命的な危険性がある 。ＪＨＲは、腫瘍壊死ファクター（ＴＮＦ）、ＩＬ-６およびＩＬ-８の爆発的な 放出を伴う。新規のヒツジポリクローナルＦａｂ抗ＴＮＦ抗体の任意に二重結合 が調節された試験を、Addis AbabaでＬＢＲＦの４９人の患者で行った。ペニシ リンで 処理される前の３０分間に、特異的抗ＴＮＦ Ｆａｂ（２０人の患者）、対照の Ｆａｂ（１９人）もしくは等張食塩水（１０人）の静脈注射を患者に行った。Ｊ ＨＲの硬直等の臨床的な徴候は、対照の２６／２９と比べて特異的Ｆａｂが与え られた１０／２０に観察された（ｐ＜０．０１）。対照のグループと比較して、 ＪＨＲにおける体温、心拍および収縮期のＢＰは、抗ＴＮＦ処理されたグループ ではかなり低かった（それぞれｐ＜０．０１、＜０．０００１、＜０．０１）。 近所のブラックライオン病院（B1ack Lion Hospital）または診療所に来る患 者を、血液の膜にボレリアスピロヘータが観察された場合にこの研究に募集した 。 除外基準 １．子供（１２歳未満） ２．妊婦 ３．老人（６０歳より高齢）または、例えば低血圧、明らかな黄疸、深刻なるい そうおよび栄養失調の他の徴候、深刻な出血傾向、発疹チフス、活性な肺結核も しくは肺硬化の症状、昏睡状態、髄膜炎、心臓、呼吸の昏睡および羽ばたき振せ ん、最近の発作履歴および焦点の神経学的徴候等の他の急性疾患のひどい臨床的 な徴候のあるかなり衰弱した患者 ４．持続した激しい硬直、低血圧もしくは高熱、および他の自発的反応の徴候（ “発症”）のある患者 ５．他の抗生物質が与えられている患者 病院の承認、調査および治療に同意を示す患者だけをこの研究に募集した。 ベースライン情報（Baseline information） 症状の継続期間および範囲を含む臨床履歴および身体検査の結果を標準的なプ ロフォーマ（ｐｒｏ ｆｏｒｍａ）に記録した。 調査 ポリテトラフルオロエチレンカニューレを肘前の静脈に装着し、３ウェイタッ プで固定し、ヘパリン化した食塩水で開存させておいた。ベースライン血液サン プルを、ミクロヘマトクリット（microhaematocrit）、全体の白血球細胞数（Ｗ ＢＣ）スピロヘータ数、ビリルビン、肝臓の酵素類、クレアチニンまたは尿素用 に採血した。血液の培養は、関連する細菌の感染（特に腸チフス）を検出するよ うに構成された。 最低でも３０人かつ最大でも５０人の患者を、任意に、ポリクローナル抗ＴＮ Ｆ ヒツジ免疫グロブリンＦａｂ断片（ＡＴＮＦ Ｆａｂ）もしくは同様に見え るプラシーボ（対照のＦａｂ）で静脈に処置する。１０人の患者は、等張食塩水 のみを受けた。 研究の早朝、患者はベッドに安静に寝かせられた。直腸電子体温計のプローブ を挿入した。血圧、脈拍および呼吸の速さを記録した。 処置 ベースライン直腸温度が、３０分間以上０．５℃より大きく変動しなかった患 者において、１００ｍｌのＡＴＮＦ Ｆａｂまたは対照のＦａｂ（注射用の水１ ０ｍｌに溶けた冷凍乾燥された全体のＦａｂの４ｘ１．５ｇのバイアルの内容物 と等張食塩水で１００ｍｌまで希釈された）もしくは１００ｍｌの等張食塩水を ３０分以上かけてゆっくりした静脈注射によって注射した。全体の免疫グロブリ ンＦａｂのこの投与量は、２０ｍｇの特異的抗ＴＮＦ Ｆａｂを含んだ約１２０ ｍｇ／ｋｇの投与量に相当する。 この３０分の注射が完了したら、６０００００ユニットのプロカインペニシリ ンを用いた標準的な抗生物質処置を、必要であれば二つの部分の間の分けられた 前の大腿に筋肉内注射によって与えた。 評価 直腸温度、血圧、脈拍、呼吸の速さおよび症状を、以下の時間（０＝ペニシリ ン処置）：−６０、−４５、−３０、０、１５、３０、４５、６０、７５、９０ 、１０５、１２０、１５０、１８０分；４、８、および２４時間に記録した。 患者は、一貫して、飲むことが許されていた。 激しいＪＨＲは、ペニシリン処理後６０−９０分で起こることが予想された。 材料と方法 臨床試験に用いたＴＮＦ特異的ヒツジ全Ｆａｂを調製するために、以下の方法 を使用した。 免疫原： ＴＮＦα抗毒素は、ヒト組換えＴＮＦα（ｈｒＴＮＦα）を用いてヒツジを免 疫化することによって作製されたヒツジのＦａｂである。ｈｒＴＮＦαは、ヒト ＴＮＦに対する市販されたｃＤＮＡ（British Biotechnologyのものを商業的に 利用できる）の配列に基づいた配列を備えた合成遺伝子を発現することによりＥ ．ｃｏｌｉで産生される。組換えタンパク質は、約１７．５ｋＤの分子量を有し 、９７％以上の純度に精製される。各ロットごとの免疫原は、ヒツジに注射する 前に、純度、分子量および細胞毒性活性が調べられた。後者は、Ｌ９２９マウス の接続組織細胞の検定を用いて評価される。 （i）免疫化 １０頭の雌ヒツジのグループを、６ヶ所で皮下に免疫化した。免疫化は、ｈｒ ＴＮＦαの減少する投与量で行われ、フロイント完全または不完全アジュバント と混合され、実施例１および２に概説したプロトコールに従う。ヒツジは、月毎 に免疫化される。 （ii）サンプリングおよび採血 免疫化して２週間後に、ヒツジは、頸静脈を介してサンプル（５ｍｌ）もしく は採血（５００−７００ｍｌ）された。血液は、無菌で発熱物質のない瓶に移さ れ、凝結（５ｍｌのサンプルの場合）もしくは凝結を開始および促進するために ゆっくりと回転（採血の場合）させた。凝結物（血餅）を遠心し、血清（上清） を殺菌（０．２２μｍ）フィルターを介して吸引し、ガンマ線を放射したプラス チックバッグに移した。 （iii）サンプル／採血の評価 最初の免疫化から６および２２週後、群の各ヒツジの抗体力価を単純な酵素結 合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価した。 ＴＮＦαを固体相免疫測定プレート（９６ウェル）に高いｐＨ（９．６）で結 合させ、増加する希釈の血清とインキュベートした。血清中のｈｒＴＮＦα特異 的抗体はプレートに結合し、次いで結合しなかった抗体を洗浄した。次いで、ヒ ツジの免疫グロブリンに対しロバで産生された、酵素（ホースラディッシュペル オキシダーゼ、ＨＲＰ）が結合する第二の抗体を添加した。適切な基質の存在下 では、ＨＲＰは、色素形成反応を触媒し、その生成物はヒツジ血清における抗体 の濃度に比例する。１／３００００より大きい力価の採血は、１０頭のヒツジの 血清貯蔵物を成すために後で合わせられる。この力価を成さないヒツジは、群か ら外した。 ２２週のサンプルの後では、個々のヒツジは、評価しなかった。 （iv）血清貯蔵物の評価 無菌性および外毒素の試験を、製品に使用されるように、無菌であり、かつ、 １．２５Ｅｕ／ｍｌ未満を含まなければならない各血清貯蔵物に行った。 貯蔵、および全ての後の作製段階は、クラス１００の条件（class 100 condit ions）で行った。 貯蔵物は、月ごとに、ＥＬＩＳＡで力価を、また小規模のアフィニティー精製 を用いてその特異的抗体の濃度を評価した。この技術は、ｈｒＴＮＦα特異的Ｉ ｇＧの選択的濃度を備えた、小量（１ｇ）のｈｒＴＮＦα-セファロースアフィ ニティーカラムにおける免疫血清の通過を含む。これらのＩｇＧを溶出し、その 濃度を決定した。 貯蔵物は、製品に使用される少なくとも２ｇ／ｌの特異的抗体を含有しなけれ ばならない。 （iv）免疫グロブリン精製 血清免疫グロブリン画分を、塩沈降により他の非治療的な血清タンパク質から 分離する。 簡潔に述べると、硫酸ナトリウム（ＵＳＰグレード３６％、２５℃アピロジェ ニック（apyrogenic）および無菌）を、１５分以上、２５℃を維持しながら貯蔵 された血清と混合する。この工程による沈降物を、遠心によりペレット化し、上 清を吸引する。このペレットを、無菌濾過したリン酸ナトリウム溶液（１８％） で二度洗浄し、洗浄毎に遠心して沈降物を濃縮する。最終のペレットを、無菌の 等張（０．９％）食塩水に再度懸濁し、無菌（０．２μｍ）濾過する。 無菌性、内毒素の純度および力価の評価を、以下の方法によって、この段階で 行った。 （i）ＵＳＰ無菌性試験（７日間生育フリー（7 days growth free）） （ii）ＬＡＬゲル凝結内毒素試験（The LAL gel clot endotoxin test） （iii）ゲル濾過（ＧＦ）ＦＰＬＣ （iv）未処理血清と比較したＥＬＩＳＡ検定 未処理の血清の８５％以上の純度および８５％以上の力価を備えたサンプルを 、Ｆａｂの産生に使用した。この段階における免疫グロブリンの濃度は、２８０ ｎｍでの光学密度測定によって判断すると（ＩｇＧ、１％２８０ｎｍでは、吸光 係数が１５であることを使用して）、約２５ｇ／ｌであった。 （v）酵素による切断 免疫グロブリンのＦａｂ断片は、精製された免疫グロブリンと植物酵素パパイ ンとをインキュベートすることによって調製され、この酵素そのものは、切断後 に切断混合物から酵素を除くことができる固体相マトリックスに結合される。 この酵素マトリックスは、還元剤であるシステインとＥＤＴＡ（酵素活性を維 持するため）の存在下でＩｇＧ調製物に添加され、切断を２４時間、３７℃で行 うことができる。この後、この反応を、溶液から固定された酵素を除き、大量の ヨードアセトアミドブロッキング剤を添加する必要性を除く、混合物の遠心によ って終結させる。次いで、この溶液を１０ｋＤのポリスルホンウルトラフィルタ ー（０．４５μｍのガラス繊維プレフィルターを含む）を通して限外濾過し、全 ての微量なシステイン、ＥＤＴＡおよびＦｃ断片を除去するために１０ボリュー ムの食塩水（０．９％、無菌、アピロジェニック（apyrogenic））で洗浄する。 洗浄工程により、塩混入レベルが確実に２ｐｐｍ以下となった。 無菌、アピロジェニックなＦａｂを、最後に０．２２μｍの滅菌フィルターを 介して濾過した。品質評価のためにこの段階でサンプルを除去し、切断の効率を 調べるためにＧＦ ＦＰＬＣに再度添加し、切断段階でｈｒＴＮＦα結合能力が 失われないことを保証するために小規模のアフィニティー精製も行った。無菌性 およびＬＡＬ試験も、この段階で分光学的に濃度決定して行った。この段階にお けるＦａｂの濃度は、約６０ｇ／ｌであった。 Ｆａｂへの完全な切断を示し（すなわち、完全なＩｇＧが存在しない）、元の 血清の結合能の少なくとも８５％を維持した、無菌の、アピロジェニック（＜１ ０Ｅｕ／ｍｌ）なサンプルは、充愼に適していると考えられる。 （vi）充填 ３０ｍｌの、中性のホウケイ酸塩ガラスバイアルを、６．０ｇのＦａｂ溶液で 満たし、ブチルゴム冷凍乾燥栓を用いてキャップした。このバイアルを−７０℃ で最低でも３０分間冷凍し、次いで無菌の冷凍乾燥ユニットに移した。このバイ アルを最低でも４８時間乾燥させ、真空で密封した。 バイアルは、注射用（１０ｍｌ）に水で戻される。 以下の試験を、乾燥したＦａｂに行った。 （ａ）完全なＵＳＰ無菌性およびＬＡＬ並びにウサギ発熱物質内毒素試験 （ｂ）μＫｊｅｌｄａｈｌ窒素分析を用いた戻されたバイアルのタンパク質濃度 （ｃ）残余水分 （ｄ）ＧＦＦＰＬＣによる純度 （ｅ）Ｌ９２９細胞の細胞毒性検定を用いたｈｒＴＮＦα中和能力 ＯＣ試験 以下の試験を行った。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ 純度を調べるための高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）。 無菌性。 発熱物質のためのリムルス変形細胞溶解（Limulus Amoebocyte Lysate）（Ｌ ＡＬ）試験。 ｉｎ ｖｉｖｏ 発熱物質のためのウサギにおける試験。 マウスおよびモルモットにおける急性の毒性。 全ての一回分から、任意にダブルブラインド試験に使用した。 白血球細胞の数 全てのＷＢＣを、血球計測チャンバーを用いて計測した。 スピロヘータ 血液の膜をライト染色（Wright'ｓ stain）で染色し、光学顕微鏡で調べた。 サイトカイン ＴＮＦα、ＩＬ-１β、ＩＬ-８およびＩＬ-６を免疫定量法で測定した。 これらのサイトカイン用の免疫放射検定キットは、Medgenix Diagnostics SA ，B-6220 Fleurus，Belgiumから購入された。 結果 １． 患者が対照である食塩水を与えられた場合に、深刻な臨床的な反応が見ら れた。時間が０のところでペニシリンを与えた後にスピロヘータが減少すること に続いて、温度が１０７°Ｆになるほど呼吸が速くなった。 ２． 研究に入るときには正常な体温であった二人の患者に処置を行った。食塩 水が与えられた患者は、熱の上昇に至ったが、抗ＴＮＦα Ｆａｂが与えられた 患者では、温度は一定のままであった（図７）。 ３． 研究に入るときには高温であった二人の患者に処置を行った。食塩水が与 えられた患者の体温は上昇して急激に正常に戻り、抗ＴＮＦα Ｆａｂが与えら れた患者の体温は上昇が防がれた（図８）。 ４． 研究５９。対照の食塩水が与えられた患者におけるサイトカインレベル（ ＩＬ-６、ＴＮＦα、ＩＬ-８およびＩＬ-１β）は、-３０時間から０時間（０＝ ペニシリン処理）の間にレベルの変化が見られなかった。ほとんどの患者では、 レベルは４時間でピークを迎えた。 研究０２７。対照のＦａｂが与えられた患者におけるサイトカインレベルは、 -３０時間から０時間（０＝ペニシリン処理）の間にレベルの変化が見られなか った。レベルピークは４時間であった。 研究００４。抗ＴＮＦα Ｆａｂが与えられた患者におけるサイトカインレベ ル。鋭いコントラストのＴＮＦαレベルは、-３０時間から０時間（０＝ペニシ リン処理）の間に急激に低下した。他のサイトカインレベルは、最初のレベルの ままであるか、非常に低いピークを示した。 図９は、抗ＴＮＦα Ｆａｂまたは対照のＦａｂで処置された患者におけるＴ ＮＦαピークレベルの平均値を、食塩水の場合の平均値と比較して示している。 また、表２は、ＩＬ-８とＩＬ-６に関する同様のデータを示す。 表３は、食塩水の対照またはＦａｂの対照もしくは抗ＴＮＦα Ｆａｂで処置 された患者におけるヤーリッシュ-ヘルクスハイマー反応の結果を示している。 ２＋（並の）および３＋（深刻な反応）は、抗ＴＮＦα Ｆａｂを処置した後に は見られなかった。ＪＨＲ、硬直等の臨床的な徴候は、２６／２９の対照と比較 して、特異的抗ＴＮＦ Ｆａｂが与えられた１０／２０に見られた（ｐ＜０．０ １）。対照のグループと比較して、ＪＨＲにおける体温、心拍および収縮期の血 圧は、抗ＴＮＦ処理されたグループではかなり低かった（それぞれｐ＜０．０１ 、＜０．０００１、＜０．０１）。 実施例８：抗ＴＮＦα Ｆａｂ断片を用いたＯＫＴ３処置を受けた患者の処置 ＯＫＴ３は、親ハイブリドーマの種のロットから得られる（American Type Cu lture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852-1776，USAか ら利用できるＡＴＣＣ ＣＲＬ８００１）。この免疫グロブリンは、腹水から精 製され、調製される。ＯＫＴ３を用いた治療法は、Ortho Study Group（1985）N ．Engl．J．Med．313，337-342に記載されている。 ＯＫＴ３を用いた治療方法は、カダベリック（cadaveric）腎臓移植の拒絶反 応を有する患者に、静脈内に２〜４分のコースで５ｍｇを注射し、かつ、これを １０もしくは１４日間繰り返すことである（全体で５０または７０ｍｇのマウス モノクローナル抗体に相当する）。［ポリクローナル抗Ｔリンパ球抗血清（アフ ィニティー精製されていないもの）も静脈内に注入することができるが、長期間 （約６時間）で非常に高い投与量（１００〜３００ｍｇ）である。また、この注 入も１０〜１５日間毎日行う必要がある。］ ＯＫＴ３の最初の注入の間に、実際に各患者が、少なくとも９０％の被験者に おける発熱、頭痛、悪心および嘔吐を含む徴候および症状を示した。 実施例３または７に記載したように、Ｆａｂ断片を調製した。内在性のＴＮＦ レベルは、１μｇ／ｌまたはそれ未満であり、細胞外流体区分に制限される（約 １５ｌ）。増大したＴＮＦレベルの影響およびＯＫＴ３処置によって誘発された ショックの徴候を改善するために、５ｍｇまたは１０ｍｇの抗ＴＮＦα Ｆａｂ 断片の投与を、ＯＫＴ３の最初の投与と同時に与える。ＯＫＴ３および抗ＴＮＦ α Ｆａｂ断片で処置する前に、患者に、一日当たりに１．０ｍｇ／ｋｇのプレ ドニソンおよび１４２ｍｇ／ｋｇのアザチオプリン等の通常の免疫抑制剤を与え る。ＯＫＴ３および抗ＴＮＦα Ｆａｂ断片での処置を開始した後、患者に一日 当たりに０．６ｍｇ／ｋｇのプレドニソンおよび３０ｍｇ／ｋｇのアザチオプリ ンを与える。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年６月５日 【補正内容】 請求の範囲 １． ポリクローナルＩｇＧから得られた、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ 断片を患者に投与することを含む、中和が有益な患者におけるＴＮＦαの中和方 法。 ２． 患者が敗血症性ショックもしくは敗血症性ショックの徴候を示す、請求項 １記載の方法。 ３． ポリクローナルＩｇＧから得られた、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ 断片を患者に投与することを含む、患者における敗血症性ショックもしくは敗血 症性ショックの徴候の予防または改善方法。 ４． 敗血症性ショックの徴候が、モノクローナル抗体ＯＫＴ３もしくは機能的 に同等の抗体の投与によって引き起こされた、請求項２または３記載の方法。 ５． 敗血症性ショックの徴候が、ヤーリッシュ-ヘルクスハイマー反応によっ て引き起こされた、請求項２または３記載の方法。 ６． 薬剤に使用するための、ＴＮＦαに反応するポリクローナルＩｇＧから得 られたＩｇＧ Ｆａｂ断片。 ７． ＴＮＦαの中和に有益な患者を処置するための薬品における、ＴＮＦαに 反応するポリクローナルＩｇＧから得られたＩｇＧ Ｆａｂ断片の使用。 ８． 患者が敗血症性ショックもしくは敗血症性ショックの徴候を示す、請求項 ７記載の使用。 ９． ポリクローナルＩｇＧから得られた、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ 断 片および生理学的に寛容できるキャリアーを含む薬学的組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ランドン，ジョン イギリス国 ＥＣ１Ａ ７ＢＥ ロンドン ウエスト スミスフィールド エスティ ー バーソロミューズ ホスピタル メデ ィカル カレッジ デパートメント オブ リプロダクティヴ フィズィオロジー セラピューティク アンティボディーズ インク（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片を患者に投与することを含む、中 和が有益な患者におけるＴＮＦαの中和方法。 ２． Ｆａｂ断片がポリクローナルＩｇＧから得られた、請求項１記載の方法。 ３． 患者が敗血症性ショックもしくは敗血症性ショックの徴候を示す、請求項 １または２記載の方法。 ４． ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片を患者に投与することを含む、患 者における敗血症性ショックもしくは敗血症性ショックの徴候の予防または改善 方法。 ５． Ｆａｂ断片がポリクローナルＩｇＧから得られた、請求項４記載の方法。 ６． 敗血症性ショックの徴候が、モノクローナル抗体ＯＫＴ３もしくは機能的 に同等の抗体の投与によって引き起こされた、請求項３または６記載の方法。 ７． 敗血症性ショックの徴候が、ヤーリッシュ- ヘルクスハイマー反応によっ て引き起こされた、請求項３または６記載の方法。 ８． 薬剤に使用するための、ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片。 ９． Ｆａｂ断片がポリクローナルＩｇＧから得られた、請求項８記載のＩｇＧ 断片。 １０． ＴＮＦαの中和に有益な患者を処置するための薬品における、ＴＮＦα に反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片の使用。 １１． 患者が敗血症性ショックもしくは敗血症性ショックの徴候を示す、請求 項１０記載の使用。 １２． ＩｇＧ Ｆａｂ断片がポリクローナルＩｇＧから得られた、請求項１０ 記載の使用。 １３． ＴＮＦαに反応するＩｇＧ Ｆａｂ断片および生理学的に寛容できるキ ャリアーを含む薬学的組成物。 １４． Ｆａｂ断片がポリクローナルＩｇＧから得られた、請求項１３記載の薬 学的組成物。