JPH04505019A

JPH04505019A - ガンマインターフェロンのポリペプチド性阻害剤

Info

Publication number: JPH04505019A
Application number: JP2515231A
Authority: JP
Inventors: イングラム，リチャード; リ，フン・ブイ; ラマナトハン，ラタ
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1989-10-23
Filing date: 1990-10-19
Publication date: 1992-09-03
Also published as: EP0497867A1; US5632988A; CA2070416A1; AU6643690A; WO1991005799A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ガンマ　イン　−フェロンのボ１ペプチド生皿■！員ガンマ　インターフェロンは活性化されたヘルパーＴ細胞（その最も特徴的な活性の一つはマクロファージにおけるＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現の上方制御である）、成ｑＢ細胞およびＴ細胞により産生されるサイトカインである。クラスＩＩ抗原の発現は抗原提示細胞の証明となる。ガンマ　インターフェロンはまた上皮細胞、線維芽細胞、星状膠細胞、肉皮細胞および平滑筋細胞のような本来抗原提示細胞ではない細胞中のクラスＩＩ抗原の発現を上方制御することも知られている。これらの細胞型におけるクラスＩＩ抗原の上方制御はしばしば自己免疫疾患の進展と相関している。

ガンマ　インターフェロンが細胞にその影響力を働かせる機構は未知であるが、それが特定の細胞レセプターに結合することは知られている（　Ｌａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｌ＋ｎｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　９　：　３９３　（１９８８））　、　Ａｇｕｅｔ　ａｔ　ａｔ、、　（Ｃｅｌｌ　５５　：　２７３@（１９８８）　）はガンマ　インターフェロン　レセプターの遺伝子をクローン化し配列決定した。

配列から演鐸されるコードされた蛋白質の分子量はヒト胎盤から最近単離されたガンマ　インターフェロン　レセプターの分子量（Ｃａｌｄｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　４８３７　（１９８８）］と一致している。

ガンマ　インターフェロンは特定の細胞レセプターで働き、自己免疫疾患に関係しているので、そのようなインターフェロンのその細胞レセプターへの結合を阻害できる薬剤は治療面で有益であるであろう。

！■凶！約本発明はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＧＩｎを含む新規ポリペプチドを提供する。特に、本発明は：Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ。

Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ− Ｇｉｎ。

Ａｒｇ−Ｍｅ　ｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅ　ｔ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇ　ｉｎ、およびＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−＾ｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｈ４ｓ−＾１ａ−Ｖａｌから成る群から選択される新規ポリペプチドを提供する。

本発明はさらに、ガンマ　インターフェロンに対するレセプターを持つ細胞と（ａ）　プロタミンまたはその塩；ら）ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（Ｃ）　ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄｌ　アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチド（ポリペプチドまたは蛋白質は４℃でダウジ細胞に対するｌｆｆ１Ｓｉ−組換えヒトガンマ　インターフェロンの特異的結合の阻害において約２５μ阿またはそれ未満のＫｉを持っている）からなる群より選択される有効量のポリペプチドまたは蛋白質を接触させることを含むガンマ　インターフェロンの細胞レセプターへの結合を阻害するための方法を提供する。

本発明のポリペプチドおよび蛋白質はガンマ　インターフェロンのその細胞レセプターへの結合を阻害するので、抗ウイルス効果およびクラスＩＩ主要組織適合抗原の誘導のごときそのようなインターフェロンの生物効果もまた阻害する。

それ故本発明は抗ウイルス応答を産み出すことによりガンマ　インターフェロンに応答可能な細胞と、（ａ）　プロタミンまたはその塩；ら）ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（Ｃ）　ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（イ）アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量のポリペプチドまたは蛋白質を接触させることを含むガンマ　インターフェロンの抗ウイルス効果を阻害するための方法を提供する。

本発明はまたさらに、クラスＩＩ主要組織適合抗原の発現の誘発によりガンマィンターフエロンへ応答可能な細胞と、（ａ）　プロタミンまたはその塩； Φ）ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（Ｃ）ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）　アミノ酸配列＾ｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量のポリペプチドまたは蛋白質を接触させることを含むガンマ　インターフェロン誘発クラス■【主要組織適合抗原発現を阻害する方法を提供する。

本発明のポリペプチドおよび方法はイン　ビトロにおいて種々の細胞型へのガンマ　インターフェロン結合の機構の研究およびそのような結合のアゴニストまたは他のアンタゴニストのスクリーニングに有用である。それらはまた力゛ンマインターフェロンにより開始されると信じられている自己免疫疾患のごとき病的状態の処置（治原）に有用である可能性を存する。

凹二呈里工脱亘本発明は添付の図を参照することにより、より容易に理解できるであろう、ここで、り四角）による阻害をグラフで表わしたものである。特異的に結合された放射活特異的に結合された放射活性のパーセントがポリペプチド濃度の関数として示さに対してのサケ　プロタミン硫酸塩による阻害をグラフで表わしたものであり、特異的に結合された放射活性のパーセントがプロタミン硫酸塩濃度の間数として示されている。

図４は＋３５１−組換えヒト　ガンマ　インターフェロンのダウジ細胞への結合に対しての合成ポリペプチドによる阻害をグラフで示したものであり、特異的に結合された放射活性のパーセントがポリペプチド濃度の関数として示されている。

ポリペプチドは＾１ａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ− Ａｒｇ−Ｍｅ　ｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａ@ｌａ− ＾ｒｇ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ− Ａｌａ−Ｖａｌのアミノ酸配列を持っていた。

図５は脳心筋炎ウィルスに感染したヒト二倍体色皮細胞における組換えヒトガンマ　インターフェロンＤの抗ウイルス効果に対しての図４の説明文に記載されているポリペプチドによる阻害をグラフ的に表わしたものである。細胞変性効果（ＣＰＥ　）が０．１ｓＭ濃度のポリペプチド存在下（上の曲線）および不在下（下の曲線）でのインターフェロン濃度の関数として示されている。

図６は脳心筋炎ウィルスに感染したヒト二倍体色皮細胞における組換えヒトガンマ　インターフェロンＤの抗ウイルス効果に対してのアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎを持つ合成ポリペプチドによる阻害をグラフ的に表わしたものである。細胞変性効果（ＣＰＥ　）は一定量（１５０９Ｍ）のインターフェロン濃度存在下でのポリペプチド濃度の関数として示されている。

図７はＭ換えヒト　ガンマ　インターフェロンＤによるＣ０ＬＯ−２０５細胞でのクラスＩＩ主要＆ｌＩ！適合抗原の誘導に対する図６の説明文に記載したポリペプチドによる阻害をグラフ的に表わしたものである。パーセント阻害は一定濃度（６３ｐＭ）のインターフェロン存在下、ポリペプチド濃度の関数として示されている。

図８は組換えヒト　ガンマ　インターフェロンＤによるＣ０ＬＯ−２０５細胞でのクラス！！主要組織適合抗原の誘導に対する図６の説明文に記載したポリペプチドの影響をグラフ的に表わしたものである。　ＥＬＩＳＡ抗原測定（４０５ｎ −での吸光度）が５０μｌ’４度のポリペプチド存在下（下の曲線）および不在下（上の曲線）で、インターフェロンの濃度の関数として示されている。

発皿■説所ここに引用されているすべての参照文献はそっくりそのまま引例として含まれている。記載されているすべてのアミノ酸は通常の約束に従いアミノ末端が左でカルボキシ末端が右である。

組換えヒト　ガンマ　インターフェロンの特異的阻害剤の研究の過程において、驚く二七に、ガンマ　インターフェロンのその細胞レセプターへの結合に対し、多くのポリペプチドおよび蛋白質が強力な阻害剤であることが見い出された。これらのポリペプチドのアンタボ−スト様作用は、本発明のポリペプチドおよび蛋白質、　１１１１１１換えヒト　ガンマ　インターフェロンおよびそのようなインターフェロンの特異的レセプターを持つ細胞を用いる放射リガンド−レセプターアッセイ系において示された。

インターフェロン結合のこの阻害は特異的である：同一のポリペプチドおよび蛋白質は、ヒト顆粒球／マクロファージ　コロニー刺激因子（Ｇｌｌｌ−Ｃ３Ｆ　）またはインターロイキン−４のそれらのレセプターへの結合を放射リガンド− レセプターアッセイ系において示さなかった。

ガンマ　インターフェロンは抗ウィルス活性を持っている（即ち、ウィルス−誘発細胞変性効果から細胞を保護する）、それはまた前章球からプリーマクロファージへの成熟分化の強力な誘発剤でもある。ガンマ　インターフェロンの抗つきる（Ｒｕｂｉｒ＋５ｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　１７　：　７５５　（１９８１）　）　、ガンマ　インターフェロンの分化誘発活性は前単球系細胞株においてのヒト組織適合性複合体のフレームワーク抗原（肚＾−０Ｒ）の表面発現をインターフェロンが誘発するアッセイにおし１て示すことができる（Ｋｅｌｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏ１．１３２　：　２４０　（１９８４））　。

本発明のポリペプチドおよび蛋白質は以下に記載する放射レセプター結合アッセイにおいて細胞レセプターへの１１％１−１［換えヒト　ガンマ　インターフェロンの結合が強く阻害される濃度では上記の両方のアッセイ系において完全に不活性であった。

本発明はガンマ　インターフェロン阻害剤の３つの基本的なカテゴリーを含んでいる：（１）プロタミンおよびその塩、（２）リジンおよび／またはアルギニンまたはグルタミン酸および／またはアスパラギン酸を含む高度に荷電した同種または異種ポリペプチドおよび（３）アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎを含むポリペプチド。

プロタミンは比較的低分子量の強い塩基性蛋白質であり、核酸に付随しており、魚の成熟精子細胞から装置に得ることができる。プロタミンのいくつかの例としてはサケからのサルミン、ニンンからのクルベインおよびチゴウザメからのスツリンが挙げられる。サルミンが以下で例示のために使用されているが、すべてのプロタミンが本発明の方法において使用することができる。

プロタミンは市販品として入手可能であるかまたは既知の方法を用いて容易に調製できる。サルミンは例えばＳｉｇｍａ　ＣｈｅＩｌｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯから購入できる。その強い塩基性のため、プロタミンはしばしば塩化物、リン酸塩、硫酸塩または他の塩として提供される。プロタミンｇ酸塩が以下の実施例で使用された。

阻害剤の第二のカテゴリーは以下のポリ（Ｄ−リジン）、ポリ（Ｌ−リジン）およびポリ　（Ｌグルタミン酸ｉ）により例示される。同種ポリマーが例示の目的で使用されたが、リジンおよびアルギニンの両方またはグルタミン酸およびアスパラギン酸の両方を無作為にまたは前もって定めた順序で含んでいる異種ポリマーもまた同様に使用することができる。アミノ酸残基のＤおよびＬ異性体の両方、またはその混合物も使用できる。大きさは重大な問題ではない。約３，８６３から約６６．０００ダルトンの範囲のポリペプチドが以下に例示されているが、約３０００から約１００．０００ダルトンまたはそれ以上の酸性または塩基性ポリペプチドも使用できる。

多くの種類の同種および異種ポリペプチドがＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。

間のごとき供給源から市販品として入手可能である。もしくは、常法を用いて合成でき、ゲル濾過または他の方法を用いて大きさで分画できる。

阻害剤の第３．のカテゴリーは研究の途中で偶然発見されたもので、ニワトリ平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ（？ＩＬＣに）のカルモジュリン結合領域の亜配列［Ｋｅｍｐｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、　２６２　：　２５４２　（１９８７）　）に対応するアミノ酸配列である。

しかしながら、本発明において決定的であるのはこ孔らのポリペプチド内のＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎｌｎ列配列ることを理解しなければならない、　ＭＬＣＫの他の残基に対応する残基は必須ではない。

以下に示したごとく、亜配列のアミノ末端アルギニン残基をリジンに置換すると亜配列を含むポリペプチドの阻害能力が著しく減少した。別のポリペプチドにおいてグルタミン残基がアラニン残基に！き換えられたり、またはトリプトファン残基がアラニン残基に１き換えられた場合に同様な不利な効果が観察された。

４°Ｃでダウジ細胞への１！Ｓ■−組換えヒト　ガンマ　インターフェロンの特異的結合の阻害において約２５μＨまたはそれ未満のＫｉを持っている限り、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎｌｎ列配列む任意のポリペプチドが本発明で使用できる。ポリペプチドは５から約３０のアミノ酸残基を含むことができる０機能的にＫｉの制限を満足する限り、より長いポリペプチドもまた本発明で企図される。

本発明のポリペプチドが、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好酸球、平滑筋細胞、前骨髄球、マクロファージ、赤芽球、単球および顆粒球のごときガンマ　インターフェロンレセプターを持つ細胞へ結合するように強制されなければならない、ダウジ細胞は単に与えられたポリペプチドが適切なＫｉ値を持っているかどうかを迅速に決定するのに使用できる都合の良い容易に入手可能な細胞株である。他の細胞株もまたこの決定を行うのに使用できる０例えばＵ−９３７ヒト組織球リンパ腫株（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９３）を用いても本質的に同じＫｉ値が得られている。

ポリペプチドは排除面相合成、部分固相法、分画濃縮または古典的溶液合成のような適当な方法により合成される。ポリペプチＦ４訃ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（Ｊ、Ａ■、ＣｈｅｔＳｏｃ、８５　：　２１４９　（１９６３）　）により記載されているような固相ペプチド合成により好適に製造される０合成はアルファーアミノ末端が保護されているアミノ酸で実施される。ポリペプチドの組立ての間に起こる望まれない化学反応を妨げるため、不安定な側鎖を持つ三官能基アミノ酸もまた適当な基で保護される。アルファーアミノ保護基は続いての反応をアミノ末端で起こすのを可能にするため選択的に除去される。アルファーアミノ保護基を除去するための条件は側鎖保護基を除去しない。

アルファーアミノ保護基は段階的ポリペプチド合成の分野で有用であると知られているものである。アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基〔例えば、ヘンシルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、１換ベンジルオキシカルボニルおよび９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）　）　、脂肪族ウレタン保護基〔例えば、Ｌ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロへキンルオキシ力ルボニル〕およびアルキル型保Ｍ基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が含まれる。

好適な保護基はＢｏｃである。Ｔｙｒのための好適な側鎖保護基ば２．６−ジクロロベンジルである。Ａｓｐのための側鎖保護基にはベンジル、２．６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびシクロヘキシルが含まれる。　Ａｓｐの好適な側鎖保護基はシクロヘキシルである。　ＴｈｒおよびＳｅｒのための側鎖保護基にはア七チル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２．　６−）；クロロベンジルおよびＣｂｚが含まれる。　ＴｈｒおよびＳｅｔのための好適な保ＤＩ基はベンジルである。Ａｒｇのための側鎖保護基にはニトロ、Ｔｏｓ　、　Ｃｂｚ　、アダマンチルオキシカルボニルおよびＢｏｃが含まれる。　Ａｒｇのための好適な保護基はＴｏｓである。

Ｌｙｓの側鎖アミノ基はＣｂｚ　、２−ＣＩ　−Ｃｂｚ　、　ＴｏｓまたはＢｏｃで保護されるであろう、　Ｌｙｓに対しては２−Ｃ１−Ｃｂｚ基が好適な保護基である。

選択された側鎖保護基は結合反応の間無傷で残っていなくてはならず、アミノ末端保護基の脱保護の間または結合条件の間に除去されてはならない、側鎖保護基は合成完了後、完成したポリペプチドを変化させない反応条件を用いて除去可能でなければならない。

面相合成はカルボキシ末端からアルファーアミノ保護（側鎖保：１）アミノ酸を適当な固体支持体へ結合させることにより通常実施される。クロロメチルまたはヒドロキシメチル樹脂へ結合された場合、エステル結合が形成され、生したポリペプチドはＣ末端に遊離のカルボキシル基を持つであろう、もしくは、ベンジルヒドリルアミンまたはｐ−メチルベンジルヒドリルアミン樹脂が使用された場合、アミド結合が形成され、生じるポリペプチドはＣ末端にカルボキサミド基を持つであろう、これらの樹脂は市販品として入手可能であり、その調製はＳｔｅｗａｒｔ　ａｔ虹、、により記載されている、“固相ペプチド合成”　（２版）　、Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｓｉｃａｌＣｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＴＬ、　１９８４　。

ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　、Ｎ、　Ｎ’　−ジイソプロピルカルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾールを含む各種の活性化剤を用い、必要に応し側鎖がおよびアルファーアミノ基が保護されているＣ末端アミノ酸がベンズヒドリルアミン樹脂へ結合される。樹脂支持体への結合に続いて、ジオキサン中０“から２５°Ｃの間の温度でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＨＣＩを用いてアルファーアミノ保護基が除去される。メチオニン（Ｎｅｔ）導入後は起こる可能性があるＳ−アルキル化を抑制するためにＴＦＡにジメチルスルフィドを添加する。アルファーアミノ保護基を除去後、所望の配列を得るために残りの保護アミノ酸が必要とされる順序で段階的に結合される。

ＤＣＣ、Ｎ、　Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１ −イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム　へキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）およびＤＣＣ−ヒドロキシヘンシトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含む種々の活性化剤が結合反応に使用できる。各々の保護されたアミノ酸は過剰に（＞２．０当量）使用され、結合反応は通常Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ　）またはＤＭＦ　、　ｃｏｚｃｌ□またはその混合物中で実施される。結合反応の完了の程度は各々の段階で例えばＫａｉｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ＋　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、３４：５９５　（１９７０）、゛により記載されているようなニンヒドリン反応によりモニターされる。不完全な結合が観察された場合、結合反応は反復される。結合反応は市販品として入手可能な機器により自動的に実行できる。

所望のポリペプチドを完全に組立てた後、ポリペプチド−樹脂は液体１（Ｆのごとき試薬で１−２時間、Ｏ′Ｃにて切断する（それにより樹脂からポリペプチドが切断され、すべての側鎖保護基が除去される）、切断の間に生じるカチオンでポリペプチド中に存在するアミノ酸残基のアルキル化を起こさせないため液体ＯＦと共にアニソールのごとき捕捉剤が通常使用される。ポリペプチド−樹脂は必要に応じて切断に先立ってＴＦＡ　／ジチオエタンにより脱保護されてもよい。

固体支持体上での側鎖と側鎖の環化は酸性アミノ酸（例えばＡｓｐ）および塩基性アミノ酸（例えばＬｙｓ）の側鎖官能基の選択的切断を可能にする直交保護スキームの使用を必要とする。Ａｓｐの側鎖のための９−フルオレニルメチル（Ｆｗ）保護基およびＬｙｓの側鎖のための９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基がこの目的のために使用できる。これらの場合、Ｂｏｃ− 保護ポリペプチド−樹脂の側鎖保護基はＤＭＦ中ピ中ソペリジンり選択的に除去される。固体支持体上の環化はＤＣＣ、ＤＣＣ／ＨＯＢｔまたはＢＧＰを含む種々の活性化試薬を用いて達成される。ＨＦ反応は前に記載したごとく環化ポリペプチド−樹脂に対して実施される。

組換え体ＤＮＡ方法論もまたポリペプチドの製造に使用できる。既知の遺伝コード（与えられた宿主生物体でのより効果的な発現のために必要に応じ尾を付けられる）が所望のアミノ酸配列をコードしているオリゴヌクレオチドの合成に使用できる。　Ｍｅｔｔｅｕｃｃｉ　ｅｔ　ａｌ、（Ｊ、Ａ（Ｃｈｅｔ　Ｓａｃ、　ＩＱ、ｌ　：　３１８５　（１９８１）　）のホスホラミダイト固体支持法または他の既知の方法がそのような合成に使用できる。得られるオリゴヌクレオチドは適当なベクター内へ挿入でき、両立できる宿主生物体中で発現できる。

本発明のポリペプチドはＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、向流分配または他の既知の方法により精製できる。

Ａｒｇ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎを含んでいる与えられたポリペプチドが本発明に包含されるかどうかは、以下に記載するダウジ細胞放射リガンドーレセプターアッセイ系を用いる日常的実験により容易に決定できる。この系で使用できる組換えヒトガンマ　インターフェロンは市販品として例えばＧｅｎｚｙｍｅ　Ｃａｒｐ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡから入手可能である。そのようなインターフェロンは、例えばラクトペルオキシダーゼ法（Ｄａｖｉｄ　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４１　：　１０１４　（１９７４）　］またはＢａ１ｋａｎ　ｅｔ　ａｌA＋（Ｂｉａｃｈｅｍ、　Ｊ、　１３３　：　５２９　（１９７３）　）の方法を使用してヨウ素−１２５で容易に標識できる。

有効量の１つまたはそれ以上の本発明のポリペプチドおよび蛍白質またはその薬学的に受容可能な塩および生理学的に受容可能な担体を含む医薬組成物が調製できる。そのような担体は当業者にはよ（知られている。ポリペプチドおよび蛋白質は直接または組成物の形で、例えば自己免疫疾患またはガンマ　インターフェロンにより開始される他の疾患で苦しんでいるヒト患者に投与できる。

特定の情況のための本発明のポリペプチドまたは蛋白質の適切な用量は当業者により決定される。一般的には、最適量を越えないより少ない用量で処置が開始される。その後、情況下最適の効果に達するまで少量ずつ用量を増加させる。都合上、全日用量を分割して、必要に応じ一日の間一部ずつ投与してもよい。

本発明のポリペプチドおよび蛍白質およびその薬学的に受容可能な塩の投与量および頻度は、年齢、情況および、患者の大きさおよび処置されている徴候（群）の激しさのごとき因子を考えに入れて付添う臨床医の判断に従って調整されるであろう。

叉−施一倒特に指定しないかぎり、以下の固体混合物中の固体、液体中の液体および液体中の固体は各々−ｔ／ｗｔ、ｖｏｌ／ｖａｔおよびｗｔ／ｖｏｌに基づいて与えられているパーセントである。

ボ！ペブチ゛・　。

各々約１２．９４６．３，８６３　オ、にヒ６６．０００タル）　７ノ分子１ヲ持ッホ’Ｊ　（Ｄ　−’Ｊ　’；　７）、ポリ（Ｌ−リジン）およびポリ（Ｌ− グルタミン酸）およびサルミンはＳｉｇ＋＊ａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯから購入された。

以下の合成ポリペプチドが＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３０Ａシンセサイザーおよび自動化された固相ペプチド合成技術を用いる固相自動ペプチド合成により製造された： ΔＢ≧を山≧上工旦コ１ｎに記ｎ　（１１すＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ− Ａｌａ−−−−−（ＩＶ）Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ− Ａｌａ−６８≧１輩♀」シ」ヒエαとｍ　（Ｖ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ　（Ｖｌ）Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ　（ＶｌすポリペプチドはＲａ１ｎｉｎ　Ｄｙｎａｓａｘ＠　Ｃ８カラムを用いｏ、ｉ％トリフルオロ酢酸により所望のポリペプチドの存在がモニターされた。

単離されたポリペプチドの構造はエドマン分解（Ｈｅｗｒｃｋ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｍ、　釘溪：　７９９０　（１９８１）　）およびアミノ酸分析［ＨＰ＾５ｉｎｏ　Ｑｕａｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ、出版物番号第１２−５９５４−８９０８、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、　Ｗａｌｄｒｏｕｎ、　ＦＧＲ）により各々Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｇａｓ　Ｐｈａｓｅ　５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ　（モデル４７０Ａ）およびＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　Ａｍ１ｎｏｑｕａｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて確認された。すべてのポリペプチド濃度はアミノ酸分析データから計算された。

便宜上、前記のポリペプチドはこれから各々の後に挿入されたローマ数字で参照されるであろう、上に示した各々のポリペプチドのアミノ酸配列内にＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ配列部分がもし存在していれば下線が引かれている。

ヒト　”ガンマ　イン　−フエロンの　組換えヒト　ガンマ　インターフェロンは米国特許第４，７５１，０７８号に記載されているごとく大腸菌溶菌物から精製されたが、そのようなインターフェロンはＧｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、＋　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡのごとき供給源から市販品として入手可能である。

使用されたインターフェロンのアミノ酸配列はＧｒａｙ　ｅｔ　ａＬ＋により記載されているインターフェロンＣＮａｔｕｒｅ　２９５　：　５０３　（１９８２）　）の残基４−１４１の配列に対応している。

インターフェロンは本質的にＢｏｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、により記載されているごとく［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　ｌｐ　：　５２９　（１９７３））　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ＋　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ、か轤■ １ｆＳｌポルトン−ハンター試薬を用いてヨウ素−１２５で標識した。簡単に記すと、無水ヘンガン中の２ｍＣ１（２，０ＯＯＣｉ／ミリモル）のポルトン−ハンター試薬（Ｎｅ−Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ　）を緩かな窒素の流れで乾燥させた。５０μｇの５０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，０に溶解した５マイクログラムのガンマインターフェロンを反応容器に添加した。反応は室温に２時間放置して進行させ、その後未反応のポルトン−ハンター試薬は５０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８，０中の１Ｍグリシン５０μＩで失活させた。

０゜２５％ゼラチンを含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４で平衡化させた１（ｌｄのＰＤ−１０セファデックスＣ−２５ｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）中のゲルが過により放射性ヨウ素化蛋白質を未反応の標識試薬から分離した。標識されたインターフェロンは完全な抗ウィルス活性を保持しており（ｓｘｔｏｓ位／■；前記Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、の方法で決定）　、Ｃａ１ｖｏ　ｅｔａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅ（Ｊ、２１２　：　２５９　（１９８３）、により記載されているような自己１換分析により決定された２４００Ｃｉ／ミリモルの比放射活性を持っていた。

ウジ　へのＩｚＳＩ−゛ヒト　ガンマ　イン　−フェロンの績企■阻害ダウジ細胞はプルキットリンパ腫患者から誘導されたよく特徴付けられているＢリンパ芽球細胞株であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシランがら受人番号＾ＴＣＣＣＣＬ　２１３として入手可能である。

レセプターアッセイは２００．０００ｃｐ−の標識インターフェロンを含む１ｍの結合培地（ＲＰＭｌ　１６４０培地、ｌＯ％ウシ胎児血清０．０２％アジ化ナトリウム）に６Ｘ１０’ダウジ細胞を加えた標準混合物を用いた。非特異的結合を決定するため対照はさらに１μｇの非標識インターフェロンを含んでいた。アッセイは種々の量の阻害を起こす可能性のあるポリペプチドまたは蛋白質を含むまたは含まない０．１ｍの結合培地を標準混合物に添加し、合併した混合物を４ ℃で２時間インキュベートすることにより実施された。

インキュベーシヨンに続いて、４℃にて３０秒間１３．ＯＯＯＸｇで遠心分離して細胞をベレント化し、上澄液を廃棄した。細胞を４℃にて標識されたインターフェロンを含まない０．２　ｄの新鮮な結合培地に再懸濁し、その後特異的に結合していない残りの標識インターフェロンを除くためにジブチルフタラードおよびジオクチルフタラード（１，１（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）混合物０．２　ｍ）の層を通して細胞を１３．ＯＯＯＸｇで２分間遠心分離した。阻害定数（Ｋｉ）はＣｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、の方法（ＢｉｏｃｈｅｔＫｉ＝ＩＣｓ。

式中［Ｌ］　はリガンド濃度であり、ＩＣ，。は結合を５０％減少させるのにａ・要とされた阻害剤の濃度である。

４°Ｃでのダウジ細胞への１２Ｓ１−組換えヒト　ガンマ　インターフェロンの結合は飽和でき、高い親和性レセプターの単一の群に一致する平衡結合特性を示した。　５ｃａｔｃｈａｒｄ　（Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　５］、：　６６０　（１９４９）　）により定義されたごとき平衡解離定数（Ｋｄ）および全レセプター濃度（Ｂ＋＊ａｘ）は以下のとおりであった：Ｋｄ＝７．７　Ｘｌ０−”ＭＢｍａｘ−４，Ｉ　Ｘｌ０−”ＭＢｍａｘから推定される細胞当りのレセプター数は細胞当り３．７９９レセプターであった。

５μｈｆ１１度のポリペプチド！　Ｃ前を参照）の存在下での標識インターフェロンの平衡結合のスキャッチード分析はＫｄの著しい増加を示したが一方Ｂｏｒａｘは本質的に影響されずに残った。これらの結果は拮抗型の阻害と一致していた。

得られた結果のいくつかは図１−４にグラフとして示されている。ポリ（Ｄ−リジン）およびポリ（Ｌ−リジン）の両方が標識されたインターフェロンの結合の強い拮抗阻害剤であったことが見い出される（図１）。ポリ（Ｄ−リジン）およびポリ（！、−リジン）のＫｉ値は各々０．１９およびＩＩｕｌ′Ｉであった。

同様の強い阻害がポリ（Ｌ−グルタミン酸）（図２）およびプロタミン硫酸塩（図３）に示されており、その、にｉ［は各々０．２９および１．１μ阿であることが観察された０図４はポリペプチドＩによる類似の強い結合阻害を示している。

本発明の多数の合成ポリペプチド（そのすべてがＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ配列を表−−１ム　ポリペプチドによる゛ウジ　への１２５１−　えヒト　ガンマ　イン　−フエロンの　人の表１のデータはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎペンタペプチドそれ自身（ＩＩＩ）がダウジ細胞への標識インターフェロンの結合の非常に有効な阻害剤であることを示している。他のアミノ酸残基がこのペンタペプチドのアミノ末端（ＩＶまたは■）またはアミノおよびカルボキシ末端の両方（ ■およびＩｆ）に結合されていても観察されたＫｉにはほとんど影響を与えていない。

本発明のポリペプチドのペンタペプチド亜配列の重要性をさらに示すために、他のポリペプチドが合成された（その中で亜配列は存在しないかまたは改変されている）。これらのポリペプチドは同じ方法により試験され、結果は表２に示さＫｉに・　るベン　ペプチド　■の　たは　゛のＶＴＩＩ　１８０表２のデータはペンタペプチドのトリプトファンのアラニン（Ｖｌ）への、アミノ末端のアルギニンのリジン（Ｖｌｌｌ）への、またはグルタミンのアラニン（ＩＸ）への置換は著しくＫｉ値を高くしていることを示している。ペンタペプチド配列をポリペプチドから完全になくした場合（ＶＩＥおよびＸ）も同様の結果が観察された。

ガンマ　イン　−フエロンの　六　の　１本発明のポリペプチドおよび蛋白質によるガンマ　インターフェロンのその細胞レセプターへの結合の阻害が生物的効果を産み出すことを示すために、２つの代表的なポリペプチドの作用が２つのインターフェロン一応答性生物系において観察された。

拭基方止び損惣ヒト二倍体色皮細胞の保存培養物を回転瓶（８５０ｃｍ”）内の１０％熱不活性化ウシつ児血清を補給したアール塩入り最小必須培地（培地Ａ）中で増殖させ維持した。

培養物は一週間ごとに単層培養物をトリプシン処理し、細胞は１：２で継代培養を行って日常的に継代した。抗ウイルスアッセイにおいて使用するには、細胞をトリプシン処理して貯蔵回転瓶から培地へ移し、３．５　ＸＩＯ’　ＩＩ胞／ｄの＠濁液を作った。

感染ベロ細胞から調製された脳心筋炎（ＥＭＣ）ウィルス貯蔵物（ＡＴＣＣＶＲ −１２９）は包皮細胞の感染に使用された。感染ベロ細胞からの上清液を採取し、力価検定し、１ｌＩｉずつに分配し、アッセイに使用するまで一８０℃で貯蔵した。

約４Ｘ１０’単位／ｌ１ｇの比活性を持つ組換えヒト　ガンマ　インターフェロンＤは常法を用い形質転換させた大腸菌から調製された。

ヒト悪性腺腫から誘導されたＣＱＬＱ−２０５細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８３）がクラスＨ主要組織適合抗原（ＨＬＡ−ＤＲ）のインターフェロンによる誘導を測定するために使用された。細胞上の抗原の存在はマウス　モノクローナル　抗−ＨＬＡ−ＯＲ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ〜Ｄｉｃｋｔｎｓｏｎカタログ番号７３６０　）をベルオキシターゼー標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ　）により検出された。

２．２′−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐａｒｒｙ　Ｌａｂｓ、＋　Ｉｎｃ−＋　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＯ）を用いる着色生成物が分光学的に４０５０− で測定された。

ウィルス゛　の対照培地Ａ、一定の濃度のポリペプチド番号【の存在下での組換えヒト　ガンマ　インターフェロンＤの培地Ａでの種々の希釈液、または一定濃度のインターフェロンの存在下でのポリペプチド番号Ｉ［■の培地Ａによる種々の希釈液を総量で０．１ｄピペツトで採り９６−ウェル平底マイクロタイターのウェル内へ入れた。

培地Ａ中のヒト２倍体包皮細胞の懸濁液の一部（０，Ｌ＋ｄ、３．５　ＸＩＯ’ 細胞／Ｗ１）をマイクロタイタープレー−のウェルへ測りとって入れ、プレートを３７”Ｃｉ　５％Ｃｏｔにて４時間インキュベートした。このインキュベーションに続いて上清液を除去し、細胞はバンクの培地で洗浄した後２％ウシ胎児血清を補給したイーグルＭＥＦＩ中３７”Ｃにて２時間インキュベートした。

ＥＭＣウィルスは０．０１５ｐｆｕ／細胞の濃度で０．０５−の培地Ａで添加され、細胞はウィルスおよび細胞のみを含んでいるウェルにおいて最高の細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されるまでさらに３７°Ｃにてインキュベートされた（典型的には約１６−１８時間）。

この時点ですべてウェルから培地が吸い取られ廃棄された。

クリスタル　バイオレット染色液（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　［、ｏｕｉｓ、　ＭＯ；０．４８５％の水性溶液（３，２％ホルムアルデヒドおよび３２．３％　９５１エタノール）〕の０．０２５−０．０５ｍを各々のウェルに添加し、プレートは色発色のために３０分間放置した。染色液を除去し、ウェルは少くとも３回蒸留水で洗浄し、その後蛍光観察器の助けをかりてＣＰＨについてプレートを評点した。

０から４のスケールで半定量的にＣＰＨにグレードを付けた。グレードＯＣＰＥはクリスタル　バイオレフトでの細胞染色により測定された細胞溶菌が完全にないことに対応し、グレード４　ＣＰＥは全細胞の溶菌に対応し、染色されない。

そのようなアッセイの結果が図５に示されており、下の曲線から１　、２００ｐＭのインターフェロン単独の濃度で完全に細胞を保護していることが観察される；　３０ｐＭの濃度ではグレード２　ＣＰＥであった。しかしながら０．ＬｗＭのポリペプチド■存在下では同じインターフェロン濃度は細胞に対し実質的に少ない保護しか与えなかった（上の曲線）、ポリペプチド存在下１，２００および３０ｐＭのインターフェロン濃度で各々グレードＩおよび４のＣＰＥであった。

１５０ｐＭの一定１度のインターフェロンを使用し、ポリペプチド［Ｊ［の蟹を変化させたアッセイの結果が図６に示されている。１０μＨのペプチド存在下でのみインターフェロンによる細胞の完全な保護がみられた。しかしながら、ポリペプチド濃度をｌＯから１０５μＨに増加させるにつれてＣＰＥは着実に増加し、最高濃度でグレード４に到達した。

虱鼾朋４１［躬１害ガンマ　インターフェロンによるｎｕ−ｏＲ誘導のためのＢｉｏ−ＥＬＩＳＡアッセイは本質的にはＧｉｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、により記載されているごと＜　（Ｊ、　Ｉ軸ｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ。

月！５　：　１０３　（１９８９）　）実施された。簡単に記すと、Ｃ０ＬＯ− ２０５細胞をＴ−７５フラスコ中１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭｒ　１６４０培地（培養培地）でコンフルエントまで増殖させる。細胞をトリプシン処理し、ウェル当り５Ｘ１０’細胞の密度で０．１ａｄの培養培地と９６−ウェル組織培養プレートに播種した。５％ｃｏ！インキュベーター中３７℃にて一夜インキエベーシッンして細胞をウェルに付着させた。

対照培養培地、固定した濃度のポリペプチドＩＩＩの存在下での岨換えヒト　ガンマ　インターフェロンＤの培養培地による種々の希釈液または固定した濃度のインターフェロン存在下でのポリペプチドＩＩＩの培養培地による種々の希釈液を０．１ｍの容量でウェルへ添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。

インキュベージ５ンに続いて、各々のウェルがら培地を除き、ウェルは３回培養培地で洗浄した。　ｏ−ｉ　ｇの培養培地をウェルに添加し、プレートは１８時間３７℃でインキュベートして、細胞に結合されたインターフェロンにより発現される１１ＬＡ−ＤＲ抗原の誘導を起こさせる。

つｓル；ｆｒｏ、２　ａｆｃＤ　’Ｊ　ンａｌｔｌ衝塩ｆｇＷｉ　（ＰＢＳ；　０．０２Ｍ！Ｊ　７酸ナトリウム、Ｏ，１５ＭへＮａＣｌ、ρｌ（７，４）で洗浄した後水冷無水エタノールで２分間固定した。アルコールを除去し、ウェルを１１！０．２ａｉのＰＢＳで洗浄した。５０マイクロリツトルのマウスモノクロナール抗１１ＬＡ−Ｄ１１抗体の１：５０希釈液を各々のウェルに添加し、プレートは室温にて１時間インキュベートした。

過剰の試薬は０．２　ｄのＰＢＳで３回ウェルを洗浄することにより除去し、その後０．１ｄのベルオキシターゼー標識ヤギ抗−マウスＩｇＧの１　：　５０００８釈液が各々のウェルに添加された。プレートは室温で１時間インキュベートした。前のごとく各々のウェルを３度ＰＢＳで洗浄後ＡＢＴＳの添加し室温で５ −１０分間色を発現させた。

ＥＬＩＳＡプレート読み取り器を用いて４０５ｎ−の吸光度を測定した。

ポリペプチドＩＩＩによるＣ０ＬＯ−２５細胞でのガンマ　インターフェロン誘導■ＬＡ−ＯＲ発現の阻害を測定するためのアッセイの結果が図７に示されている。ポリペプチドの濃度を４から１１５μＨに増加させると一定濃度（６３ｐＭ）のインターフェロン濃度による抗原誘導の阻害が累進的に大きくなることを見ることができた。

図８はポリペプチドＩＩＩによる同様の阻害を示している。図８のデータは細胞を種々の組換えヒト　ガンマ　インターフェロンＤ単独（上の曲線）で、または５０ｔＩＭのポリペプチドＩＩＩの存在下で処理することにより得られたものである。

ポリペプチドの効果はインターフェロン用量一応答曲線を右側へ移行させ、最高の誘導を産み出すには約１０倍高いインターフェロン濃度が必要とされた。

当業者には明らかになるであろうが、本発明の多（の改変および変形が本発明の精神および範囲から離れることなくなされる。ここに説明した特定の実施１！様は例示のみのために与えたものであり、本発明は請求の範囲の条項によってのみ制限されるべきである。

Ｆｉｇ、　７「リベプ子白糧Ｉ艷　９ＪＭ）Ｆｉｇ、　２ホ０すメゾ子腔う浦■曾　９Ｊ功プロタ′ミン石む坩窒ＩＬＣｔｒ’＞つ、濃度（ＪＩＭ）Ｆｉｇ、　５（ｉＩＦ−Ｄ　＃　ｉｆ　（ＰＭ）Ｆｉｇ、　６Ｆ棒、７１工勺べ°７°テド１１１の１Ｐ艷　（ＪＪＭ）Ｇ−ｒ　Ｆ　−Ｄり速度（ｐＭ）手続補正書平成　４年　４月２３日 ”ＦＦＪ’ｉ’ＪＬＩｇ　Ｐｉ！　ＲＭ　Ｒ１１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ９０１０５９０８２、発明の名称ガンマ　インターフェロンのポリペプチド性阻害剤３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所名　称　シエリング・コーポレーション５、補正の対象請求の範囲（別紙）、　（υ　請＄１７）範囲８以１”（７）Ｊ　Ｉｔ）補′Ｅｔ−ｓ。

ｒ　ｌ　、　Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ。

Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−１，ｙｓ−Ｔｒｐ −Ｇｉｎ。

Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｎｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ− Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ、およびＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ− Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−旧５−Ａｌａ−Ｖａｌから成る群より選択されるポリペプチド。

２、ガンマ　インターフェロンのレセプターを持つ細胞と：（ａ）　プロタミンまたはその塩；わ）　ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（Ｃ）　ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド：および（ｄ）　アミノ酸配列＾ｒｇ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量のポリペプチドまたは蛍白質（ポリペプチドまたは蛋白質は４°Ｃにてダうジ細胞への１２５１−組換えヒト　ガンマインターフェロンの特異的結合の阻害において約２５μＨまたはそれ未満のＫｉを持っている）と接触させることを含む、細胞レセプターへのガンマインターフェロンの結合の阻害方法。

主、抗ウイルス応答を示すことによりガンマ　インターフェロンに応答できる細胞を、（ａ）　プロタミンまたはその塩；［有］）　ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（Ｃ）　ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）　アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量のポリペプチドまたは蛋白質と接触させることを含む、ガンマインターフェロンの抗ウイルス効果の阻害方法。

土、クラスＩＩ主要組織適合抗原の発現を誘発することによりガンマ　インターフェロンに応答できる細胞を、（ａ）　プロタミンまたはその塩；［有］）　ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（Ｃ）　ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）　アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量のポリペプチドまたは蛍白質と接触させることを含む、ガンマインターフェロン誘発クラスＩＩ主要組織適合抗原発現の阻害方法。

工、生理学的に受容可能な担体および：（ａ）　プロタミンまたはその塩；（ｂ）　ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（Ｃ）　ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）　アミノ酸配列Ａｒｇ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量の１つまたはそれ以上のポリペプチドまたは蛋白質を含む、ガンマ　インターフェロンにより開始される自己免疫疾患または他の疾患治療用医薬組成物。

旦、生理学的に受容可能な担体および：（ａ）　プロタミンまたはその塩；（ｂ）　ポリリジン、ポリアルギニンまたはそのような残基の混合物を含むポリペプチド；（Ｃ）　ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそのような残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）　アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量の１つまたはそれ以上のポリペプチドまたは蛋白質を混合するこトラ含む、ガンマ　インターフェロンにより開始される自己免疫疾患または他の疾患治療用医薬組成物の製造方法。１　ヶよ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．【配列があります】および【配列があります】から成る群より選択されるポリペプチド。
２．ガンマインターフェロンのレセプターを持つ細胞と：（ａ）プロクミンまたはその塩；（ｂ）ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（ｃ）ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量のポリペプチドまたは蛋白質（ポリペプチドまたは蛋白質は４℃にてダウジ細胞への１２５Ｉ−組換えヒトガンマインターフェロンの特異的結合の阻害において約２５μＭまたはそれ未満のＫｉを持っている）と接触させることを含む、細胞レセプターへのガンマインターフェロンの結合の阻害方法。
３．プロタミン塩がサケプロタミン硫酸塩である、請求項２に記載の方法。
４．ポリペプチドが約１２，９４６ダルトンの分子量を持つポリ（Ｄ−リジン）である、請求項２に記載の方法。
５．ポリペプチドが約３，８６３ダルトンの分子量を持つポリ（Ｌ−リジン）である、請求項２に記載の方法。
６．ポリペプチドが約６６，０００ダルトンの分子量を持つポリ（Ｌ−グルタミン酸）である、請求項２に記載の方法。
７．ポリペプチドが【配列があります】および【配列があります】からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
８．抗ウイルス応答を示すことによりガンマインターフェロンに応答できる細胞を、（ａ）プロタミンまたはその塩；（ｂ）ポリリジン、ポリアルギニンまたはそのような残基の混合物を含むポリペプチド；（ｃ）ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）アミノ酸配列【配列があります】および５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量のポリペプチドまたは蛋白質と接触させることを含む、ガンマインターフェロンの抗ウイルス効果の阻害方法。
９．クラスＩＩ主要組織適合抗原の発現を誘発することによりガンマインターフェロンに応答できる細胞を、（ａ）プロタミンまたはその塩；（ｂ）ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（ｃ）ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量のポリペプチドまたは蛋白質と接触させることを含む、ガンマインターフェロン誘発クラスＩＩ主要組織適合抗原発現の阻害方法。
１０．生理学的に受容可能な担体および：（ａ）プロタミンまたはその塩；（ｂ）ポリリジン、ポリアルギニンまたはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；（ｃ）ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそれらの残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量の１つまたはそれ以上のポリペプチドまたは蛋白質を含む、ガンマインターフェロンにより開始される自己免疫疾患または他の疾患治療用医薬組成物。
１１．生理学的に受容可能な担体および：（ａ）プロタミンまたはその塩；（ｂ）ポリリジン、ポリアルギニンまたはそのような残基の混合物を含むポリペプチド；（ｃ）ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはそのような残基の混合物を含むポリペプチド；および（ｄ）アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎおよび５から約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択される有効量の１つまたはそれ以上のポリペプチドまたは蛋白質を混合することを含む、ガンマインターフェロンにより開始される自己免疫疾患または他の疾患治療用医薬組成物の製造方法。