JPH05506247A - ヒトγインターフェロンのアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトγインターフェロンのアンタゴニスト魚里Ω麓員 γインターフェロンは、抗ウィルス活性、抗増殖活性および免疫変調活性を示す 活性ヘルパーＴｍ胞によって生産されるタンパク質である。γインターフェロン の抗ウィルス活性および抗増殖活性は大いに抑制的であり、一方、免疫変調活性 は主として種々の免疫機能の刺激によって発現されるが、免疫機能の阻害が生じ ることも知られている。

γインターフェロンが細胞に対してその作用を及ぼす機序は理解されていないが 、それが特定の細胞性受容体に対して結合するということは知られているＵラン ガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　９：３９３（１ ９８８ンコ、アギュート（Ａｇｕｅｊ）らＩＣｅ　Ｉ　Ｉ　旦旦：　２７３　（ １９８８）］は、γインターフェロン受容体に間する遺伝子をクローン化し且つ 配列（ＣａＩ　ｄｅｒｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ　旦インターフェロンは、更に、多発性硬化症（ＭＳ）にかかつている脳およ びを髄Ｓに関係しているので、このようなインターフェロンがその細胞性受容体 に対して結合するのを阻害することができる薬剖は治療的に有用であろう。

穴型のＡ！ 部分配列から成る群より選択される１種類またはそれ以上のアミノ酸部分配列を 含む新規のポリペプチドを提供する。好ましくは、ポリペプチドは最大４ｏ個ま で、更に好ましくは、最大３５個までのアミノ酸残基を含む。

双方の部分配列を含むある種のポリペプチドにおいて、その部分配列は１〜約２ ０ｍのアミノＭ残基を有するペプチドリンカ−によって隔てられている。双方の 部分配列を含む他のポリペ１チドにおいて、その部分配列はジスルフィド橋によ って結合した２種類の別個のポリペプチド中にある。

本発明は、更に、最大５０ａＩまで、好ましくは最大４０個まで、そして更に好 ましくは最大３５個までのアミノ酸残基を有し且つ配列番号１によって定義され た配列のアミノ酸残基１５〜２１および１３２〜１３７によって定義された部分 配列から成る群より選択される１種類またはそれ以上のアミノ酸部分配列を含む ポリペプチドに対する抗体であって、該ポリペプチドおよびヒトγインターフェ ロンに対して特異的に結合し且つこのようなインターフェロンの細胞性受容体に 対する結合を阻害する能力を特徴とする上記の抗体を提供する。

更にまた、本発明は、上述の抗体に対する抗イデイオタイプ抗体を提供する。

これらの抗イデイオタイプ抗体は、更に、ヒトγインターフェロンの細胞性受容 体に対する結合を阻害する。

本発明の抗体はいずれら、抗血清からの多クローン性抗体かまたは単クローン性 抗体であることができる。このような抗体およびヒトに適応された（ｈｕｍａｎ ｊ　ｚｅｄ）かさもなければ工学処理された抗体から製造された結合性フラグメ ントも本発明の一部分である。

更に、前述のポリペプチドおよび抗体を用いてこの種のインターフェロンの線接 触させることを含む。

もう一つの方法は、ヒトγインターフェロンに対して並びに最大５０個まで、び １３２〜１３７によって定義された部分配列から成る群より選択される１種類ま たはそれ以上のアミノ酸部分配列を含むポリペプチドに対して特異的に結合す大 川および池のγインターフエロンアンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニ ングに有用である。

凶耐びＩ喰羞朋 本発明は、添付の図面を論及することによって一層容易に理解することができ対 する１２５Ｉ−標識ヒトγインターフェロンＤの結合の阻害を示すグラフであ数 として示す。

図３は、組換え体ヒトγインターフェロンＤによるＣ０ＬＯ−２０５細胞上での クラスＩＩ主要組ｍ適合牲抗原の誘導の、配列番号１０によって定義されたアミ ノ酸配列を有するポリペプチドによる＠害を示すグラフである。＠害％は、一定 の１５０ｐＭＪ度のインターフェロンの存在下におけるポリペプチド濃度の間数 として示される。

飛μ眩１友叩 アミン末端であり且つ右側がカルボキシル末端である。標準的な三文字略語を配 列中のアミノ酸残基に関して用いる（３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，目１．８２２）、本明細 書中で用いられるｒＡｉｂ、は、２−または３−アミノイソ酪酸を表わす。

ヒトγインターフェロンの特異的阻害剤を探求する過程において、意外にも、受 容体検定システムにおいて実証された４本発明はこのようなポリペプチドを提供 する。

本発明は、更に、ヒトγインターフェロンの細胞性受容体に対する結合を、エロ ン自体を模擬することにより、受容体に対する結合に間してそれと競合すること によって阻害する抗体を提供する。結果として、それらはインターフェロン実質 的に同一の配列を有し且つ（ｂ）天然のγインターフェロンに共通している生物 学的活性を有するタンパク質を意味する。

便宜上、下記に記述されるポリペ１チドのアミノ酸配列は、配列番号１によって 定義された成熟しトγインターフェロンのアミノ酸配列中の残基の対応する配列 に間して記載することがあり、１はアミノ末端のシスティン残基であり且っ１４ ６はカルボキシル末端のグルタミン残基等である。

アミノ酸配列の実質的同一性とは、配列番号Ｉによって定義された配列と比較さ れた別のγインターフェロンの配列が、生物学的活性を実質的に損なわない１か 所またはそれ以上のアミノ酸の変化（欠失、付加、置換）によって同一であるか または興なるということを意味する９例えば、配列番号１によって定義されたイ ンターフェロンの最初の３個のアミノ末端残基（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）を欠 いているγインターフェロンＤは、本発明の文脈において実質的に同一である。

このようなアミノ末端残基を欠いており、そして更に、カルボキシル末端での微 小不均一性を示す天然のヒトγインターフェロンら同機である［スイーリク（Ｓ ｅｅｌｉｇ）ら、旦土ｏｃ江ｅｍ土旦エニヱ　２ヱ：１９８１　（１９８８）］ 前記に説明したように、本発明のポリペプチドは、配列番号１によって定義され た配列のアミノ酸残基１５〜２１および１３２〜１３７によって定義された部分 配列から成る群より選択される１種類またはそれ以上のアミノ酸部分配列を含む 、好ましいポリペプチドは双方を含む、これらの２種類の部分配列は、ヒトγイ ンターフェロンの受容体結合性および／または生物学的活性にともかく関与して いると考えられるこのようなインターフェロンの重要な「コア領域」を含む。

ポリペプチドは、これらのコア領域に加えて、ヒトγインターフェロンのコア領 域に隣接する残基の配列に対応する配列を有するアミノ酸残基を含む追加のフラ ンキング配列を含むことかできる。

例えば、配列番号１０によって定義されたアミノ酸配列を有する好ましいポリペ プチドは２Ｎ票の部分配列を含み、その一方は配列番号１のアミノ＃残基１３〜 ２９の配列によって定義される。このポリペプチドのもう一方の部分配列は配列 番号１のアミノ酸残基１３０〜１３８の配列によって定義される。

本発明のポリペプチドが双方のコア領域を含む場合（追加のフランキング配列を 含むまたは含まない）、その領域は２種類の方法の一方において互いに接近する 。好ましい実施９様において、それらは介在リンカーベグチドによるペプチド結 合で共有結合する。このリンカーベグチドは、１〜約２０個のアミノ酸残基、好 ましくは、約３〜約８ＢＪの残基を含むことができる。リンカ−ペプチドに選択 されたアミノ酸残基は、一般的に知られている２２種類のアミノ酸のいずれから も無作為に選択されることができるが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｌｅｕおよび １１ｅから成る群より選択されたアミノ酸残基が無作為配列リンカ−において用 いるのに好適である。

無作為に選択されたアミノ酸残基の代わりに、リンカ−ペプチドは、２種類のコ ア領域間のヒトγインターフェロンに４在する残基の部分配列の配列に対応する 配列を膚する１〜約２０個、好ましくは約３〜約８個の残基を含むことができる ０例えば、配列番号１０によって定義された好ましい実施Ｗｓ様において、２種 類の領域は、配列番号１の残基１１１〜１１８の配列に対応する配列を有するペ プチドリンカ−によって結合している。

分子に柔軟性を与えるリンカ−ペプチドを提供して、インターフェロン配列に関 係する領域が、完全なヒトγインタフェロンにおける対応する配列の空間的関係 に近い空間的関係を有することができるようにする。当然ながら、この目的をア ミノ酸残基以外の単位を含むリンカ−によって達成することもできるということ は当業者に理解される０例えば、アフィニティークロマトグラフィーにおいて一 般的に用いられた多数の周知のリンカ−は、そのリンカ−の柔軟性および長さが ポリペプチドリンカ−のそれらと同機である限りにおいて用いることかできる。

このような機能的に同等の別のリンカ−は、分子のポリペプチドセグメントに対 して既知の方法によって結合させることができる。

前述のポリペプチドにおけるコア領域（追加のフランキング配列を含むまたは含 まない）の順序は必須ではない、ヒトγインターフェロンのアミノ末端領域に位 置した領域は、ポリペプチドのアミン末端であるかまたは逆であることかできる が、前者の配置が好適である。

コア領域の一方または双方を有する若干の好ましいポリペプチドは、配列表にお いて配列番号２．３および１０によって定義されたアミノ酸配列を有する。

別の実施態様において、２種類コア領域（追加のフランキング配列を含むまたは 含まない）は、それぞれが一方のコア領域を含む２種類のポリペプチドを用いる ことによって接近することができる。これは、コア領域の外側の領域のポリペプ チドのそれぞれにシスティン残基を組込み且つジスルフィド結合によってポリペ プチドを結合することによって達成される。

本明細書中で用いられる「ポリペプチド」という用語は、コア領域がリンカ−ペ プチドによって接近する実施態様および２種類のポリペ１チド鎖がジスルフィド 橋によって結合している実施態様双方を意味すると定義される。

本発明のポリペプチドは、成熟しトγインターフェロン中の残基の総数と比較し て比較的少数のアミノ酸残基のみを有するが、それにもかかわらず、それらは完 全なインターフェロンの細胞性受容体に対する結合の特異的競合ｍ宵剤である。

、１２５ 下記に示したよつに、　■標識ヒトγインターフェロンＤのダウディＭｉ胞に対 する特異的結合の８０％程度はこのようなポリペプチドによって阻止することが できる。

本発明のポリペプチドが、γインターフエロン受容体を有する細胞、例えば、Ｂ ４１１１胞、Ｔｒｉｌｌ胞、好酸球、平滑筋細胞、前骨髄球、マクロファージ、 赤血球、単球および顆粒球のいずれにも結合するということは強調される必要が ある。バーキットリンパ腫患者由来の十分に特徴付けられたＢリンパ芽球細胞系 であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｔｙｐｅ識γインターフェロンの細胞性受容体に対する結合の阻害を実証する。

＃！の細胞系、例えば、Ｕ−９３７ヒトＭｌｉ球リンパ腫系（ＡＴＣＣＣＲＬ１ ５９３）もこの目的に用いることかできる。

ポリペプチドは適当な方法によって、例えば、排他的固相合成法、部分的固相法 、フラグメント縮合または古典的溶液合成法によって合成される。好ましくは、 ポリペプチドはメリフィールド（Ｍｅｒｒｉ　ｆｉｅ　Ｉｄ＞　、Ｊ、Ａｍ、Ｃ ｈｅｍ。

Ｓｏｃ、８５　：　２１４９　（１９６３）に記載の固相ペプチド合成法によっ て製造される０合成は、αアミノ末端が保護されているアミノ酸を用いて行われ る。更に、不安定な側鎖を有する三官能性アミノ酸を適当な基で保護して、ポリ ペプチドの組み立ての際に望ましくない化学反応が生じないようにする。αアミ ノ保護基は選択的に除去されて、次の反応をアミン末端で生じさせる。αアミノ ｇＡ護基の除去に関する条件は側鎖保護基を除去しないものである。

αアミノ保護基は、逐次的ポリペプチド合成の技術において有用であることが知 られているものである。アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセ チル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基Ｃ例えば、ベンジルオキシカルボニ ル（ＣｂｚＬ置換ベンジルオキシカルボニルおよび９−フルオレニルメチルオキ シカルボニル（Ｆｍｏｃ）ｊ、脂肪族ウレタン保護基（例えば、ｔ−ブチルオキ シカルボニル（Ｂｏｃ）、イン１０ビルオキシカルボニル、シクロへキシルオキ シカルボニル）およびアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチ ルンがある。好ましい保護基はＢｏｃである。Ｔｙｒのための側鎖保護基として は、テトラヒドロピラニル、第三ブチル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、４−Ｂ ｒ−Ｃｂｚおよび２，６−ジクロロベンジルがある。Ｔｙｒのための好ましい側 鎖保護基は２．６−ジクロロベンジルである。Ａｓｐのための側鎖保護基として は、ベンジル、２．６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびシクロヘキシ ルがある。Ａｓｐのための好ましい側鎖保護基はシクロヘキシルである。Ｔｈｒ およびＳｅｒのための側鎖保護基としては、アセチル、ベンゾイル、トリチル、 テトラヒドロピラニル、ベンジル、２．６−ジクロロベンジルおよびＣｂｚがあ る。ＴｈｒおよびＳｅｒのための好ましい保護基はベンジルである。Ａｒｇのた めのＩＰＩｇ保護基としては、ニトロ、Ｔｏｓ、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカ ルボニルおよびＢｏｃがある。Ａｒｇのための好ましい保護基はＴｏｓである。

Ｌｙｓの側鎖アミノ基はＣｂｚ、２−ＣＩ−Ｃｂｚ、ＴｏｓまたはＢｏｃで保護 することができる。基２−ＣＩ−ＣｂｚはＬｙｓのための好ましい保護基である 。

選択された＠饋保護基はカップリングの際にそのままの状態でなければならない し、しかもアミン末端保Ｍ基の脱保護の際にまたはがｙブリング条件の際に除去 されてはならない、更に、側！Ｉ保護基は、合成が完了した際に完成ポリペプチ ドを変化させない反応条件を用いて除去しつる必要がある。

固相合成法は、通常、αアミノが保護された（側鎖が保護された）アミノ酸を適 当な固体支持体に結合させることによってカルボキシ末端から行われる。エステ ル結合は、クロロメチルまたはヒドロキシメチル樹脂に対する結合が行われたと きに形成され、得られたポリペプチドはＣ末端に遊離カルボキシル基を有する。

或いは、ベンズヒドリルアミンまたはＰ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を用 いる場合、アミド結合が形成され、得られたポリペプチドはＣ末端にカルボキサ ミド基を有する。これらの樹脂は商業的に入手可能であり、そしてそれらの製法 はステユワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、［固相ペプチド合成法（ＳｏｌｉｄＰｈ ａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）」　（第２版）、ピアス・ケミ カル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）−０ｙクフオー ド、ＩＬ、１９８４に記載゛されな。

必要ならば側鎖が、そしてαアミノ基か保護されたＣ末端アミノ酸を、ジシクロ ヘキシル力ｌレボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミ ドルアミン樹脂に結合させる．樹脂支持体への結合に続いて、トリフルオロ酢酸 （ＴＦＡ）またはジオキサン中ＨＣＩを０〜２５℃の温度で用いてαアミノｌｌ ｉ！護基を除去する．メチオニン（Ｍｅｔ）の導入後に硫化ジメチルをＴＦＡに 加えて、可能なＳアルキル化を抑制する．αアミノ保護基の除去後に、残りの保 護されたアミノ酸を、望ましい配列を得るのに必要な順序で逐次的に結合させる 。

種々の活性化剤をカップリング反応に用いることかでき、ＤＣＣ．Ｎ，Ｎ’　− ジイソプロピルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリ ス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム−へキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ） およびＤＣＣ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）かある、保護された アミノ酸それぞれを過剰（〉２．○当ｊｌ）に用い、そして通常、Ｎ−メチルピ ロリドン（ＮＭＰ）中またはＤＭＦ．ＣＨ２ＣＩ２若しくはそれらの混合物中に おいて力・ｙ１リングを行う．カブプリング反応の完了の程度は各段階で、例え ば、カイザー（Ｋａｆｓｅｒ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：　５９５ 　（１９７０）に記載のニンヒドリン反応によって監視される．不完全な力・ｙ プリングが見出される場合、カップリング反応を繰り返す．カブプリング反応は 商業的に入手可能な機器を用いて自動的に行うことができる。

望ましいポリペプチドの完全な組み立て後に、ポリペプチド−樹脂を、液体ＨＦ なとの試薬を用いて０℃で１〜２時間分裂させ、ポリペプチドを樹脂がら分裂さ せ且つ側鎖保護基を全部除去する．通常、アニソールなどの掃去剤を液体ＨＦと 一緒に用いて、分裂の際に生成された陽イオンかポリペプチド中に存在するアミ ノ酸残基をアルキル化しないようにする．ポリペプチド−樹脂は、所望ならば分 裂の前にＴＦＡ／ジチオエタンを用いて脱保護することができる。

固体支持体上でのｌＩｌｌ鎖対側鎖の環状化には、酸性アミノ酸（例えば、Ａｓ ｐ）および塩基性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）の選択的分裂を可能にする直交保 護スキームを用いる必要がある．Ａｓｐのｆｌｌ！ｌ鎖のための９−フルオレニ ルメチル（Ｆｍ）保護基およびＬｙｓの側鎖のための９−フルオレニルメチルオ キシカルボニル（Ｆｍｏｃ）（ｊｉ．護基はこの目的に用いることができる．こ れらの場合、Ｂｏｃで保護さ？Ｌ，Ｑポリペプチドー樹脂のｌｌｌｌｆｆ保護基 はＤＭＦ中ピ中ソペリジンって選択的に除去される．環状化は、ｒｌｉＪ本支持 体上においてＤＣＣ，ＤＣＣ／ＨＯＢｔまたはＢＯＰを含む種々の活性化剤を用 いて達成される．ＨＦ反応は、前記に記載の環状化ポリペプチド−樹脂上で行わ れる。

組換え体ＤＮＡ方法論もポリペプチドを製造するのに用いることができる．与え られた宿主生物での一層有効な発現に所望ならば、製造された既知の遺伝コード を用いて、望ましいアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成するこ とができる．マテユーシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃ　ｉ　）らＣＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ．１０３：３１８５　（１９８１）］のホスホルアミダイト固体支持体法 、ヨー（Ｙｏｏ）ら［Ｊ．Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ．７６４　：１７０７８　（１ ９８９）］の方法または池の周知の方法をこのような合成に用いることができる ．得られたオリゴヌクレオチドは適当なベクターに挿入し且つ適合した宿主生物 において発現させることができる。

本発明のポリペプチドは、高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換 および分配クロマトグラフィー、向流分配または池の既知の方法を用いて精製す ることかできる。

抗体は、本発明のポリペプチドに対して鋲４！法を用いて製造することかできる 。

本明細書中で用いられるＦ抗＃Ｊという用語は、多クローン性抗体および単クロ ーン性抗体双方を意味する。

多クローン性抗体は、宿主動物、％Ｉえば、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、マ ウス等をポリペプチドの１種類で免疫することによって生産することができる。

好ましくは、最初の注射後に１回またはそれ以上のブースター注射を行って抗体 力価を増大させる．次に、被験動物から血液を抜き取り、そして血清を調製し且 つエンザイムリンクドイムノソルベントアｙセイ（エライザ（ＥＬｒＳＡ））な どの標準法によりポリペプチドを抗原として用いてスクリーンする。

好ましくは、ポリペプチドの免疫原性を、アジュバントとの組合わせによってお よび／または免疫感作の前に一層大型に変換することによって増大させる。

動物のワクチン注射に適当なアジュバントとしては、制限されないが、アジュバ ント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）６５　（ピーナツ油、モノオレイン酸マンニドおよび モノステアリン敢アルミニウム含有）：フロイント完全または不完全アジュバン ト：無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウ バン；界面活性荊、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リンレ シチン、ジメチルジオクタデシル−アンモニウム臭化物、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシ ル−Ｎ’　、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシ ヘキサデシルグリセロールおよびプルロニソクボリオール：ポリアニオン、例え ば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸およびカルボボール ：べ１チド、例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン ：並びに油エマルジョンがある．ポリペプチドは、更に、リポソームまたは他の 微粒子担体中への組込み後に投与することかできる。

ポリペプチドの免疫原性は、更に、免疫原性担体分子（すなわち、本発明のポリ ペプチドか共有結合することができる、宿主動物において免疫応答を独立して引 き出す性質を有する巨大分子）への架橋によってまたは結合によって増大させる ことができる．担体分子への架橋または共役は、小型のポリペプチドがハプテン （抗体に対して特異的に結合することができるが、抗体産生を引き出すことかて ′きない分子、すなわち、それらは免疫原性ではない）として作用することがあ るので必要であることかある。このようなポリペプチドの免疫原性担体分子に対 する共役は、「担体効果Ｊとして一般的に知られていることによってフラグメン トを免疫原性にする。

適当な担体分子としては、例えば、タンパク質および天然または合成ポリマー性 化合物、例えば、ポリペプチド、！１１、リボ多糖等がある．有用な担体は、モ レイン（Ｍｏｒｅｉｎｌら、Ｎａｔｕｒｅ　３０旦：４５７（１９８４ンに記載 されたキル（Ｑｕｉｌ）Ａと称するグリコシドである．タンパク質担体分子は特 に好適であり、制限されないが、スカシガイのヘモシアニンおよび需乳動物血清 タンパク質、例えば、ヒト若しくはウシγグロブリン、ヒト、ウシ若しくはウサ ギ血清アルブミンまたはこのようなタンパク質のメチル化若しくは他の誘導体が ある．＠のタンパク質担体は当業者に明らかである．好ましくは、不可欠ではな いか、タンパク質担体は、ポリペプチドに対する抗体を引き出すための宿主動物 とは無関係のものである。

担体分子に対する共有結合は当該技術分野において周知の方法を用いて行うこと かでき、その正確な選択は用いられる担体分子の性質によって指示される．免疫 原性担体分子がタンパク質である場合、本発明のポリペプチドは、例えば、ジシ クロへキシルカルボジイミドまたはグルタルアルデヒドなどの水溶性カルボジイ ミドを用いて結合することかできる。

これらのようなカブブリング剤は、更に、別個の担体分子を用いることなくポリ ペプチドをそれ自体に架橋するのに用いることができる．このような凝集体への 架橋ら免疫原性を増大させることができる。

このようにして免疫された被験動物から生じた血清は直接用いることができる。

或いは、標準法、例えば、プラズマフェレシスまたは固定化プロティンＡなどの ＩＧｇ特異的吸４ｌ１剤を用いる吸着クロマトグラフィーを用いてＩｇＧ画分を 血清から分離することができる。

単クローン性抗体は、例えば、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）ら［Ｎａｔｕｒｅ次に 、これらの細胞を骨＠＠細胞に融合させるために、免疫された被験動物から合に 適している。これらの体細胞は、感作動物のリンパ節、膵臓および末梢血液イン （Ｍｉ　ｌ５ｔｅｉｎ＞、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：　５１１　（１９ ７多数の骨髄１１＃Ｉ胞系を触合ｍ胞ハイブリッドの産生に用いることができ、 例えば、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３／ＮＳｌ−Ａｇ４　１（ＮＳ　１）、Ｓｐ２ １０−Ａｇ１４および５１９４１５．ＸＸＯ，Ｂｕ、１がある。４１［１胞系Ｐ ３Ｘ６３−Ａｇ８およびＮＳ−１は、コーラ−およびミルスタインによって記載 された［Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．６　＋　５１１　（１９７６）］、シ シェフタら［Ｎａｔｕｒｅ　２ヱ６：２６９　＜１９７８１］は、骨髄腫系Ｓｐ ２１０Ａｇ１４を発育させた。系３１９４１５．ＸＸＯ，Ｂｕ、１はトロープリ ッジ＜Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ）によって報告された：Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４ ８：３１３　（１９７９）　コ。

抗体産生牌ｍまなはリンパ節細胞および骨髄腫細胞のハイブリッドを生じる方法 は、体４ＩＨ胞をｔｆｌｌｌ細胞と一緒に１０：１の比率で（比率は約２０：１ 〜約１：１に変更することかできるが）それぞれ、細胞膜の融合を促進する１種 類または複数の薬剤（化学的、ウィルス性または電気的）の存在下において混合 することを行う、融合方法はコーラ−およびミルスタイン、上記、シェフター（ Ｇｅｆｔｅｒ）ら［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、３：２３１（１９ ７７）］およびフォルクら［Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４２：２２０（１９８２）］によ って記載された。これらの研究者によって用いられた融合促進剤はセンダイ（Ｓ ｅｎｄａｉ）ウィルスおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であった。

産生ハイフリドーマを池の得られた融合細胞ハイブリッドの中から検出する手段 施例においては、ヒボキサンチンホスホリボシルトランスフェラーセを欠いたで きる興なる遺伝的欠失（薬剤感受性等）を有する骨−＠ＷＡｆｔ胞の使用も可能 であγインターフエロン抗原決定基に特異的な抗体に向けられている。このよう な抗イデイオタイプ抗体は、元の抗原決定基を模擬するかまたは同様に作用する （例えば、レーガン（Ｒｅａｇａｎ）らの米国特許第４，７３１．２３７号明組 書を参照されたい）、γインターフエロン自体と同様に、これらの抗体はγイン ターフエロン受容体に対して特異的に且つ直接的に結合すると考えられる。

このような抗イデイオタイプ抗体は、本発明のポリベズチドに対する抗体（多ク ローン性または単クローン性）を被験動物にワクチン注射することによって調製 される。それらは、前記に記載したように、全多クローン性抗血清としてまたは それらのＩｇＧ若しくは他の両分として、或いはクローン化されたバイブリドス トン、ＭＡから商業的に入手可能である。このようなインターフェロンは、例が できる。更に、抗体は、ヴエアホイエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら［５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３９＋１５３４＜１９８８）コ、ライヒマン（ＲｅｉｃｈｍａｎｎＪら ［Ｎａｔｕｒｅ　ユニ２：３２３　（１９８８）　］およびジョーンズ（Ｊｏｎ ｅｓ）ら［Ｎａｔｕｒｅ　３２工：　５２２　（１９８６ン］によって記載され たように「ヒトに適応（ｈｕｍａｎｆ　ｚｅｄｌ　Ｊすることができる。

本発明の１種類またはそれ以上のポリペプチドまたは抗体の有効量および生理的 に許容しうる担体を含む薬剤組成物を製造することができる。このような担体は 当業者に周知である。ポリペプチドおよびタンパク質は、自己免疫疾患、ＭＳま たはγインターフェロンによって媒介された別の疾患に苦しむヒトの患者に対し て直接的にまたは組成物の形で投与することができる。

特定の状況に適当な投与量の本発明のポリペプチドまたは抗体の投与は当該技術 の範囲内である。概して、治療は、最適よりも少ない少量の投与量で開始する。

次に、周囲状況下において最適効果に達するまで、投与量を小さい増加量で増加 させる０便宜上、所望ならば全日用量を分割し且つ当日中に少量ずつ投与するこ とができる。

本発明のポリペプチドおよびタンパク質並びに薬学的に許容しうるそれらの塩の 投与量および回数は、担当臨床医の判断にしたがって、患者の年齢、症状および 体格並びに？ｔ３療される１種類またはＮ数の症状の苛酷さなどの因子を考慮し て調節される。

８１１列 特に断らない限り、固体混合物中の固体、液体中の液体および液体中の固体に関 して以下に与えられた百分率は、それぞれ、重量／重量、容量／容量および重量 ／容量基準である。

ヱとぶｊ１立 タンパク質の決定は、ローリ−（Ｌｏｗｒｙｌら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

ポリペプチドおよびタンパク質゛ 成熟しトγインターフェロンＡの種々の領域に対応するアミノ酸配列を有するポ リペプチドを、メリア４−ルド［Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８５：　２１４ ９　＜１９６３）］の面相法を用いて合成した。ｔ−ブチルオキシカルボニルア ミノ保護基、対称無水物およびアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐ　Ｉ　ｉ 　ｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３ＯＡ型固相ペプチド合成機を用いた。保護基 の除去に続いて、フッ化水素を用いてポリペ１チドを樹脂から分裂させた。ＦＭ 脂からの分裂後に回収された￥’Ｉ製ポリペプチドを、レイニン・グイナマクス （Ｒａｉｎｉｎ　Ｄｙｎａｍａｘ■）Ｃ−助ラム（粒度Ｌ２ｔｔ、細孔度３００ オングストローム、４．６Ｘ２５０ｍｍｌでの逆相高速液体クロマトグラフィー によって分析した。

この方法において、下記のポリペプチドを製造した。

Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｑ−５ｅｒ−Ｇｌｒ−Ｍｅｔ：　ｆ１３２−０７；　配列 番号３　）Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＴｙニーＶａＬ −ＬｙＳ　ｔ＝−９；配列播号４） Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−；、ｘｈ−Ｌａｕ −Ｌｖｓ−Ｌｙｓ−τニー；−Ｐｈａ−Ａｓｎ　＋Ａｓｐ　？−１９；　配列番 号５　）Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ− Ｇｌｕ−５ｓ　ｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｃｙｓ　ｆ３４−４７　 Ｃｙｓ：　ｉ’ｉＱ＠号８）Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ　−工１ ｅ−Ｈ１ｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ｇｉｎ　−１／ａ　ニーＭｅｅ−Ａｌ ａ−Ｇｌｕ　（ｌｏ８−１２２；　配列番号９）上記に示した各ポリペプチドの 配列に、その配列が基いている対応するヒトγインターフェロンＡ！１基（配列 番号１を委照されたい）および配列表においてポリペプチドに与えられた対応す る配列番号か括弧にいれて続く、ある場合においては、示したように、配列か追 加のアミノ酸残基を含むということに留意された組換え体ヒトγインターフェロ ンＡおよびＤを、本質的には米国特許第４，７５１．０７８号明細書に記載され たように、形質転換した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）から製造し且つ精製した。

抗血清り敷抹 量を等量の完全フロインドアジュバントで乳化し、そしてニューシーラントホワ イト（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ）ウサギ（ハーゼルト７−ラプズ（ Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｌａｂｓ））に陵内注射した（注射部位当りＯ，１ｍ１）。

不完全フロインドアジュバント中にポリペプチドを約０．２５〜０．５ｍｇ含む ブースター注射を、ポリペプチドおよびγインターフェロンを抗原として用いる 血清試料のエライザ分析によって判断した場合の必要に応じて約４週間をおいて る吸着によって商業的に精製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動Ｅレ ムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、Ｎａｔｕｒｅ　２２ヱ：　６８０　（１９７０）コに よる分析は、このようにして得られた抗体調製試料が９５％純度のＩｇＧである といパニ−（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、セント・ルイス、ＭＯ ＋０．５ｍｌで腹腔内に感作して６日後に、リン酸Ｍ衝溶液１２５μｌおよび完 全フロインドアジュバント１２５μｍ中のＩｇＧタンパク質８７μｇを用いて同 −峰路によって免疫した。５０％不完全フロインドアジュバント中のタンパク質 的５０μｇの追加免疫を、エライザ分析に基いて、必要に応じて約２〜３ａ間を おいて与えた。

ウサギ抗血清のエライザ分析は室温で行った。９６ウ工ル微量滴定プレート（タ ンク（Ｎｕｎｃ））に、ウェル当９１００μ！中の抗原０．２５μｇを用いて室 温で１時間被覆しな、プレートを、０．０５％トウイーン（１ｗ６ｅｎ）２０＜ ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を含むトリスＭａｌ溶液（ＴＢ Ｓ）、ｐＨ７，５で５回洗浄した。プレートを１％ウシ血清アルブミンで１時間 ブロックし、ＴＢＳで５回洗浄し、そして再度ＴＢＳで５回洗浄した。

洗浄したプレートのウェルを、試験される抗血清で１時間被覆し、ＴＢＳで５回 洗浄し、そして西洋ワサビ大根のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ２． ５ｍｇで被覆した。１時間のインキュベーションの後、７レートをＴＢＳて′５ 回洗浄し、そして２，２′−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６− スルホン酸）（ＡＢＴＳ）かまたは３．３’　、５．５′−テトラメチルベンジ ジン（ＴＭＢ）および過酸化水素を各ウェルに加えることによって展開させた。

１０分後に硫酸（ＴＭＢに対して）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＡＢＴＳに 対して）を含む溶液を加えることによって発色を止め、そして試料を、モレキュ ラー・デバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）エライザリーダーを 用いて、ＡＢＴＳおよびＴＭＢに対してそれぞれ４０５および４５０　ｎｍｔ− 読み取った。

マウス血清のエライザ分析は、ペルオキシダーゼｆＩ識ヤギ抗マウスＩｇＧを検 出試薬として用いることを除き本質的に同一の方法で行った。

ヒト鰯　え体γインターフェロンの　−組換え体ヒトγインターフェロンＤを、 本質的に米国特許第４，７５１．０７８号明細書に記載されたように大腸菌ｆＩ 薗濯から精製して等質性にしたか、同様のインターフェロンはジェンザイム・コ ーポレーション、ボストン、ＭＡなどの製造元から商業的に入手可能である。

インターフェロンを、本質的にはポルトンら［Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１３３：５ ２９　（１９７３＞］によって記載されたように、ニュー・イングランド・ヌク レア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）−ボストン、ＭＡからの１２ ５、ポルトン・ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）試薬を用いてヨウ素− １２５で標識した。簡単には、無水ベンゼン中のポルトン・ノ＼ンター試薬にニ ュー・イングランド・ヌクレア、ボストン、ＭＡ）２ｍＣｉ　（２２００Ｃｉ／ ミリモル）を穏やかな窒素流によって乾燥させた。５０ｍＭリン酸ナトリウムＭ 衝液ｐＨ８，０の５０μｍ中に溶解したγインターフエロン５マイクログラムを 反応容器に加えた６反応を室温で２時間進行させた後、未反応ポルトン・ノ１ン ター試薬を、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８，０中の１Ｍグリシン５０μｌで 急冷した。

放射性ヨウ素化タンパク質を、０．５％セラチンを含む０．０５Ｍリン酸ナトリ ウム緩衝液ＰＨ７，２で平衡させたＰＤ−１０セフアゾ・ｌクスＧ−２５■カラ ム（ファーマシア・エルケイビー・バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａ ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｌｏｌｇｙ）−ピス力タウエイ、ＮＪ）１０ｍｌ中で のゲル濾過によって未反応標識試薬から分離した。同一の緩衝液を用いてカラム を展開させた８両分１ｍｌを集め、そしてアリコートをγカウンターで計数した 。

標識タンパク質はカラム空隙容量（３〜４ｍ１）において溶離されたか、未反応 試薬は後で溶離された（６〜ｌ’３ｍ１）。

典型的に、＃識インターフェロンの比放射能は５０〜２００μＣ／μｇである。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に続いてオートラジオグラフィーによる 分析は、標識タンパク質が、非標識γインターフェロンの場合と本質的に同一の 移動度で単一バンドとして移動することを示した。

１２５Ｉ　〜ヒトγインターフェロンＤのタウディ細　に・する結合の阻害ダウ ディ細胞原培養物を、ペニシリン１００単位／ｍ１、ストレプトマイシン１００ μｇ／ｍｌ、２ｍＭグルタミンおよび２０％熱失活ウシつ児血清を含むＲＰＭ１ １６４０培地中で増殖させた８℃胞をＴ−７５フラスコ（５０ｍｌ／７ラスコ） 中で増殖させ、４Ｘ１０５個細胞／ｍ＋で播種し、そして２日間をおいて分割し た（または２．５Ｘ１０″）個細胞／ｍｌで播種して週末の間３日間増殖させた ）、培養物は増殖の間４℃で保持された。

細胞を４℃において３００Ｘｇで３分間の遠心分離によって検定用に集めた。

消耗した培地は捨て、そして細胞ベレットを水冷結合Ｍ衝液（ＲＰＭ１１６４０ ．１０％熱失活ウシつ児血清、１５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、０．０２％アジ化ナトリ ウム）中に懸濁させた０℃胞を血球計数器によって計数し、生存率をトリバンブ ルー排除％によって決定し［Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ：ＡＰｒ ａｃｔｊ、ｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、、１９８６．Ｒ，１，フレッシュニー（ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）（監修）、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、ＬＴＤ、７６〜７ ７頁コ、そして細胞を冷結合緩衝液中に２ｘ１０６個細胞／ｍｌで懸濁させた。

結合検定は、サスチット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ＞１．５ｍｌスクリューカップコニ カルチューブを用いる１ｍｌ容量中のポリペプチドおよびウサギ抗血清で行った 。成分全部を冷結合緩衝液中で稀釈し且つ下記の順序で加えた。

未知試料（または対照結合緩衝液のみ）４５０μｍ１２５１＠ｔｌ＝ｒインター ７エ０７Ｄ　（１０”ｃｐｍ）５０μｍ細胞懸濁液（生育しうる細胞１０６個） ５００μｌ更に、タンパク質１μｇを含む非標識γインターフェロンＡ溶液１０ μｍを若干の対照チューブに加えて、標識インターフェロンによる非特異的結合 濃度を決定しな、この放射能量を全部の放射能測定値から減じた。

成分全部を各チューブに加えた後、チューブに盆をし、手短に逆さにして内面全 体を湿潤させ、そして低温室中においてアダムス・ヌテーター（ＡｄａｍｓＮｕ ｔａｔｏｒ■）ロンキングプラットホーム上で２時間インキュベートした。

このインキュベーションに続いて、いずれの細胞も除去しないように注意して、 上澄み液を各チューブから吸引した。

水冷結合Ｍ衝液１００μＩを各チューブに加え、そしてベレ・ｙトをギルソン・ ビプトマン（Ｇｉｌｓｏｎ　Ｐｉｐｅｔｍａｎ■）２００μ＋を用し１て懸濁さ せ且つアルミニウム遠心分離ランク中に固定されたサステヅト６００μｍコニカ ルチューブ中のＰＢＳ中水冷５％スクロース４００μｍの上に注意深く置いた。

試料を４℃において１．ＯＯＯＸｇで５分間遠心分離した。

細胞を失わないように注意深く上澄み液を吸引し、そしてチューブを、γカウン ター使用に適当な１２Ｘ７５ｍｍチューブに移した。

ポリペプチドによる結合阻害 配列番号２および配列番号３によって定義されたアミノ酸配列を有するボ１ペプ チドを前記に記載の受容体結合検定において試験して、その結果を図１ｃこ示し た。

識ヒトγインターフェロンＤの結合を阻害したことが分かる。前者のボ１ノベブ チドはよつ強力な競合阻害剤であり、０．１４５および１．４５μＭの濃度でそ れぞれ約１５および３５％の結合阻害を示した。

抜色によ五値皇阻宣 前述のポリペプチド全部に対して製造されたウサギ多クローン性抗血清の、ポリ ペプチドおよびヒトγインターフェロンＡに対して結合し且つダウディ細胞Ｇ二 対するヒトγインターフェロンＤの特異的結合を阻害する能力を試験して、その 結果を表１に示した。

ポリペプチド　１２５Ｉ−インター　特異的ポリ　γ−インターフェロン８結合 阻害％は、任意の阻害剤不在において１２５Ｉ、識ヒトγインターフェロンＤに よって示された特異的結合の百分率として表わされる。

６陽件の結合反応（＋）は、反応が前記のバ・ツクグラウンドの０，１５光学濃 度（０，Ｄ、）単位より大きいエライザの結果として定義された０表示＋／−は 、表Ｉのデータは、成熟しトγインターフェロンＡの残基７〜１９（付加された Ｎ末端アスパラギン酸残基を有する）、１２３〜１３７および５〜２１／１３２ 〜１．３８（３個の架橋グリシン残基を有する）の配列に対応するアミノ酸配列 を有するポリペプチド（それぞれポリペプチド配列番号５．７および２）に対す る抗体か、ダウディ細胞受容体に対する標識インターフェロンの特異的結合の全 、部のアンタゴニストであったということを示す、３種類のこれらの抗血清はい ずれも、エライザによって示されたように、それらを産生させたポリペプチドお よびγインターフェロンＡ双方に対して特異的に結合した抗体を含んでいた。ポ リペプチド１３２〜１３７（ポリペプチド配列番号３）に対しては１、おそらく それが免疫原性であるには小さすぎて担体分子に結合しなかったので、抗体は産 生されなかった。

ウサギ免疫前血清は、全ての検定において完全に非反応性であった０図２に示し たように、配列番号２によって定義されたポリペプチドに対する抗血清は、イン キュベーション混合物１ｍｌ当り約２５μ■を上回る血清濃度でダウディ細胞に 対する標識γインターフェロンＤの特異的結合をほぼ完全に阻止した。約５０％ の結合阻害か僅か１μＩ／ｍｌのこの抗血清濃度で観察された。

更に、配列番号２によって定義されたポリペプチドに対するｒｇＧ抗体画分を用 いて製造された抗イディオタイグ抗血清は、表ＩＩに示したように、有意の受容 体結合阻害を実証した。

表ＩＩ イブイオタイブ　血゛によるダウディ細　に対する第一回　１６ 第一回　３１ 第一回　３８ 第二回　４４ 不されだアークは、前記に記載したように免疫したマウスから最初の注射の１６ 週間後（第一回採血）およびその１７週間後（第二回採血）に採取された抗血清 と用いて得られた結果である。３頭のマウスの第二回採血をプールして、示され た結果を生じた。

うるダウディ細胞１．５Ｘ１０６個と一緒にインキュベートした結果である。デ ータは、抗イデイオタイプ抗血清の＠客能力が、免疫感作の過程が進行するにし たがって増大した（すなわち、第二回採血か第−口よりも強かった）ことを示す 。

γインターフェロンの生物学自作用の阻害本発明のポリペプチドか生物学的作用 も生じるということを実証するために、代表的なポリペプチドの作用をインター フェロン応答性生物学的システムにおいて観察した。

区墓証よび歿薦 約５Ｘ１０６単位／ｍｇの比活性を育する超換え体ヒトγインターフェロンＤを 、形質転換した大ＭＪ菌から標準法を用いて製造した。

ヒト腺癌由来のｃＯＬｏ−２０５ＭＢ胞（ＡＴＣＣＣＬＬ２２２＞を用いて、ク ラスＩＩ主要組ｍａ合性抗原（ＨＬＡ−ＤＲ）のインターフェロンによる誘導を 測定した。細胞上の抗原の存在は、ペルオキシテート標識ヤギ抗マウスＩｇＧと 結合したマウス単りローン性抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ベクｌ−ン・ディキンソン（ Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）カタログ番号７３６０）を用いるエンザイ ムリンクドイムノソルベントアッセイ（エライザ〉によって検出された。２゜２ ′−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン＃）（ＡＢＴＳ ；キルケガード・アンド・べり−・ラブダ・インコーホレーテッド（Ｋｉｒｋｅ ｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｓ、、Ｉｎｃ、）、ガイサーズバーグ、Ｍ Ｄ）を用いて生じた色を分光光度計によって４０５　ｎｍで測定した。

ＨＬＡ−ＤＲλ導の阻害 γインターフェロンによるＨＬＡ−ＤＲ誘導のバイオ−エライザ検定法は、本質 的にはギプソン＜Ｇｉｂｓｏｎｌら［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、１２５： １０３　（１９８９＞］によって記載されたように行った。簡単には、Ｃ０ＬＯ −２０５４８］胞を、Ｔ−７５フラスコ中において１０％ウシ胎児血清を含むＲ Ｐ　Ｍ　１１６４０培地（培養液）中で密集するように増殖させた。細胞をトリ プシン処理し且つ９６ウ工ル組織培養グレート中において培養液０．１ｍｌ中の ウェル当すラ 少なくとも１０　個細胞の密度で播種した。５％Ｃ０２インキユベーター中にお いて３７℃で一晩中インキユベーションすることによってＭＢＩ＠をウェルに結 合させた。

一定の１５ＯｐＭａ度のインターフェロンの存在下における対照培養液および配 列番号１０によって定義されたポリペプチドの培養液中各種稀釈液をウェルに対 してＯ，１ｍｌ容量で加え且つ３７℃で１時間インキュベートした。

このインキュベーシヨンに続いて、培地を各ウェルから除去し、そしてウェルを 培養液で３回洗浄した。培養液のアアリコート（０，１ｍ１）をウェルに加え、 そしてプレートを３７°Ｃで４８時間インキュベートして、細胞に対して結合し たインターフェロンによるＨＬＡ−ＤＲ抗原発現の誘導を可能にした。

ウェルをリン酸ＭＷＲ溶Ｈ（ＰＢＳ　；　０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．１ ５Ｍ−ＮａＣ１、ｐＨ７，４）０．２ｍ’ｌで洗浄した後、水冷無水エチルアル コールで２分間固定した。アルコールを除去し、そしてウェルをＰＢＳｏ、２ｍ ｌで１回洗浄した０次に、マウス単りローン性抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の０．５％ウ シ血清アルブミン含有ＰＢＳ中１：５０稀釈液５マイクロリツトルを各ウェルに 加え、そしてプレートを室温で１時間インキュベートした。

ウェルをＰＢＳｏ、２ｍｌで３回洗浄することによって過剰の試薬を除去した後 、ペルオキシダーゼｌｉｌ識ヤギ抗マウスＩｇＧの１：５，０００稀釈液０．１ ｍｌを各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。前と同 様に各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、室温で５〜１０分間のＡＢＴＳの添加 によって発色させた。吸光度をエライザプレートリーダーを用いて４０５ｎｍ″ ′Ｃ測定した。

配列番号１０によって定義されたポリペプチドによりＣ０ＬＯ−２０５４ｆ［ｌ ｌ１１においてγインターフェロンに誘導された）（ＬＡ−ＤＲ発現の阻害を測 定する検定の結果を図３に示す、そこで、７〜１００μＭへのポリペプチドの増 加濃度が、一定の１５０ｐＭ濃度のインターフェロンによる抗Ｍ誘導の阻害を漸 進的に一層大きくしたことが分かる。

本発明の多くの修正および変更は、当業者に明らかであるように、その精神およ び範囲を逸脱することなく行うことができる０本明細書中に記載した具体的な実 施４ｇ様は単に実施例として提供されるものであり、本発明は請求の範囲によっ てのみ制限されるものである。

配列表 （１）一般情報： （１）土願人ニスイー’）−ｙり・ゲイル（Ｓｅｅ　ｌ　ｉ　ｇ、Ｇａｉ　Ｉ　 ）Ｆ。

（ｉｔ）発明の名称：ヒトγインターフェロンのアンタゴニスト（ｉｉｉ）配列 の数：１０ （ｔｖ）宛先： （Ａ）住所：シュリング・プラウ・コーポレーション（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌ ｏｕｇｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｂ）地区、ワ７−ジラルダ・ファームズ （Ｏｎｅ　ＧｉｒａｌｄａＦａｒｍｓ） （Ｃ）車名：マディソン （Ｄ）州名：ニュー・シャーシー （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号：　０７９４０ （Ｖ）コンピューター読取り形式： （Ａ）中型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータｍ：アングル・マプキント・ｙシュ（Ａｐｐｌ−ｅＶＬａｃ 　ｉ　ｎｔｏｓｈ） （Ｃ）操作システム：マツキントラシュ６．Ｏ１う（Ｄ＞ソフトウェア：マイク ロソフトワード（ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷｏｒｄ）４．０ＯＢ （ｖｉ）現行８膨資料： （Ａ）８紗番号： （Ｂ）出罪日： （Ｃ）分ｇｉ： （ｖｉｉ）現行出紗責科： （Ａ）出願番号：ＵＳ○７／う８９１０６（Ｂ）出彰日：１９９０年９月２７日 （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：デュラク・ノーマン（Ｄｕ　ｌａｋ、Ｎｏｒｍａｎ）（（Ｂ）登録 番号：３１，６０８ （Ｃ）照会／事件整理番号：ＪＢＯ１５１Ｋ（ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話：　２０１−８２２−７３７５（Ｂ）ファクシミリ：　２０１−８２ ２−７０３９（Ｃ）テレックス：　２１９Ｉ６５ （２〉配列番号；１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ４１４６アミノ酸 ＣＢ＞種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｔ）分子種＃：へ１チド （ｘｉ）配列種類：配列番号：１ Ｃｙｓ　ｈ７ｒ　ＣｙコＧｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ｔｙｒ　ＶａｌＬｙｓ　ＧＬ ｕ　ａ↓ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＣ，−５ＬＯ１５ τｙｒ　Ｐｈ＠　入ｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＨＬｓ　５ａｒ　入ｓｐ　Ｖａｌ　 Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｅ　Ｌａｕ　ＰｈａＬｅｕ　ＧＬｙ　Ｘ Ｌ＠Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ｓａｔ　Ａｓ ｐ＾ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌ＊　Ｍ＠Ｃ３５、４Ｑ　鴫５ Ｇユｎ５ｅｘＧｌｎＸ１ａＶａ上５９：ＰｈｅＴｙｔＰｈｅＬｙｓＬ４ｕＰｈ峨 Ｌｙｓ入５ｎＰｈ龜Ｌｙｓ＾ｓｐ　入ｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｋｌｅ　Ｇｉｎ　 Ｌｙｓ　Ｓｅｅ　ＶａＬ　ＧＬｕ　丁ｈｒ　Ｈａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　５ ａｃ６５　７０　’７５　８０ 人ｓｎ　ＶａＬ　Ｌｙｓ　Ｐｈ噛　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　５ｅｒ　入ｓｎ　Ｌｙｓ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｚｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　ＧｌｕＬｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ｔ ｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓａｔ　Ｖａｌ　Ｔｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ｋｓｎ　Ｖ ａＬ　Ｇｌｎ　＾ｒ９　ＬＹ！　ＡＬｌｌｏｏ　１０５　１１０ ！Ｌ會　ＨＬｓ　ＧＬｕ　Ｌａｕ　Ｋｌｅ　ＧＬｎ　ＶａＬ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ｌａｕ　５ｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｘ１１５　Ｌ２０　１ ２５ τｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｚｇ　Ｓａｔ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　 Ｌａｕ　Ｐｈｅ　入ｘｑ　ＧＬｙ　＾ｔｑ　＾【９　＾１１１コ０　１３５　１ ４０ （２）配列番号＝２の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直ｔＩｉ状 （１ｉ）分子Ｎ類：ペプチド （ｘｉ）配列種類：配列番号＝２ ＬＹＭ　ＬＹＭ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　入ｓｎ　Ａｌａ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　入ｔｑ　Ｌｙｓ　入：ｇ　Ｓａ＝　Ｇｉｎ　Ｍａｔ（２）配列番号：３ の情報： （Ｎ配列の特徴： （Ａ＞長さ：６アミノ酸 （Ｂ）Ｎｕ二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｆ）分子Ｎ類：ペプチド （ｘｉ）配列種類：配列番号＝３ ＾ｔｑ　Ｌｙｓ　ｐｒｑ　Ｓｏ：　Ｇｉｎ　Ｍｌ！ｌ：（２）配列番号−４の情 報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ＜ｔｉン分子種票：べ１チド （ｘｊ）配列種類：配列番号：４ Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐ：ｏ　ｒｙｒ　ＶａＬ　Ｌｙｓ（ ２）配列番号：５の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （Ｉｎ分子種類：ペプチド （ｘｉ）配列種ｗＬ：配列番号＝５ ＾ｓｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　のｕ　入３ｎ　Ｌ＠ｕ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ｐｈｅ　Ａ３ｎ（２）配列番号＝６の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５アミノ酸 ＣＢＩＮ類ニアミニア ミノ酸トポロジー：直ｇ状 ＜ｉｔ＞分子種類：へ１チド （ｘｉ）配列種類：配列番号：６ Ｌａｕ　Ｋｌｅ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｍａｃ　ｆｉ、１ａ　ＧＸｕ　Ｌｅｕ　Ｓ＠ ｔ　ｌｏ　人ｌａ　入１ａ　Ｌｙｓ　τれｒ　Ｇａｙ（２）配列番号ニアの情報 ： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）種類；アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直錆状 （ｉｉ＞分子種類；ペプチド （ｘｉ＞配列種類：配列番号ニア ′Ｌａｕ　Ｓ＠ｔ　Ｐｒｏ　八ｌａ　Ａよａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ 　八ｘｑ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　５ｅｒ　Ｇｉｎ　？’、ａ−Ｌ５　ＩＱ　Ｉａ （２）配列番号＝８の情報： （１）配列の特徴二′ （Ａ）長さ＝１５アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー＝ｉ［原状 （Ｘｌ）分子Ｎ類；ペプチド （ｘｉ）配列種類：配列番号＝８ Ｇｌｙ　ｒｉｇ　Ｌ＠ＩＪＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ＧＬｕ　 Ｓａｔ＾ｓｐ＾ｒｑ　Ｌｙｓ　！工＊　Ｃｙｓｌ　５　１０　１５ （２）配列番号：９の情報： （ｉ）配列の特徴： ＜Ａ）長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子種′ｇｉ＝ペプチド ＜ｘｌ＞配列種類：配列番号＝９　７ （２）配列番号：１０の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：３２アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：！鎮状 （ｉｆ）分子種類：ペプチド （ｘｌ）配列種類：配列番号＝１０ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈ＊　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｓａｒ　 ＾Ｓ２　νれ　へ二１　＾３Ｐ　入！ｎ　クユｙ　：；、４人１ａ　工１＊　Ｈ ｉｓ　ＧＩＪ　Ｌａｕ　ｒｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａ＝ｇ　Ｌｙｓ　Ａ ｔｑ　Ｓｔ：　Ｇｉｉ　＝、＝−ニジ−２０２５！０ ポリペプチド濃度　（μＭ） ＦＩＧ、２ 要約書 る。

手続補正帯 平成　５年　３バエ６日 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０６７７１ 、発明の名称 ヒトγインターフェロンのアンタゴニスト３、補正をする者 名称　シエリング・コーポレーション ５、補正の対象 請求の範囲 特表千５−５０６２４７　（１１） （別紙） （１）請求の範囲を下記の通り補正する。

ｒｌｌｌｌ大側０個のアミノ酸残基を有し且つ配列番号１によって定義された配 列のアミノ酸残基１５〜２１および１３２〜１３７によって定義された部分配列 から成る群より選択される１種類またはそれ以上のアミノ酸部分配列を含むポリ ペプチド。

２、配列番号２、配列番号３または配列番号１０によって定義されたアミノ酸配 列を有する請求項１に記載のポリペプチド。

３、請求項１まなは２のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する抗体または 抗体結合性フラグメント。

４、請求項３に記載の抗体に対する抗イデイオタイプ抗体または抗体結合性フラ グメント。

５、ヒトγインターフェロンに対する受容体を有する細胞と、請求項１若しくは ２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３に記載の抗体若しくは結合性 フラグメントまたは請求項４に記載の抗イデイオタイプ抗体若しくは結合性フラ グメントの有効量とを接触させることを含む、細胞性受容体に対するヒトγイン ターフェロンの結合を阻害する方法。

６、生理的に許容しつる担体と、請求項１若しくは２のいずれか１項に記載のポ リペプチド、請求項３に記載の抗体若しくは結合性フラグメントまたは請求項４ に記載の抗イデイオタイプ抗体若しくは結合性フラグメントの有効量とを含む、 γインターフェロンによって媒介された疾患を治療するための薬剤組成物。

ヱ、生理的に許容しうる担体と、請求項１若しくは２のいずれか１項に記載のポ リペプチド、請求項３に記載の抗体若しくは結合性フラグメントまなは請求項４ に記載の抗イデイオタイプ抗体若しくは結合性フラグメントの有効量とを混合す ること含む、γインターフェロンによって媒介された疾患を治療するための薬剤 組成物を製造する方法、ｊ　以　上 国際調査報告 ・・−一一龜−ｍｎ−ｍ−，ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０６７７１国際調査報告 ρＣＴ／ＵＳ　９１１０６７７１ ：：ｌ；；；ｚ；；ニアニーｚ−ａ：；；Ｑ　二；；：ｌ；；７：：：：：＃： 二：：：Ｗ二＝＝　；；ｅ＋ｍ　ｃｉ＋ｍ　Ｉｓ　ｌｈ＊　刀|”ｅ３°ｉ７’ ｔ’ｃｉ７４Ｔ””””　”’“ｐ　ｒｇＨｎＴｈｅＩ＋＋＋ｓｅ＊＋＊Ｐ蒙＋ ＋ｐ＋６＋１１（＃ＩＩｌ＊ｅａｗマ１１１ｍ＃Ｉｅｌ＋ｈｅ＋ｅｓｓ＋’＋＋ ｃｗ＋＋ｎｗＲｉｃガ参ｆ■{＋ｗｒｍｙ瞥１ｗ＊＊１６１＋ｓ彎ｗ＋ｖｅｔ＊ ｓｌｉＭＩｏｒ＋＋−１１−

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．最大５０個までのアミノ酸残基を有し且つ配列番号１によって定義された配 列のアミノ酸残基１５〜２１および１３２〜１３７によって定義された部分配列 から成る群より選択される１種類またはそれ以上のアミノ酸部分配列を含むポリ ペプチド。
2. ２．配列番号２、配列番号３または配列番号１０によって定義されたアミノ酸配 列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
3. ３．請求項１または２のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する抗体または 抗体結合性フラグメント。
4. ４．請求項３に記載の抗体に対する抗イディオタイプ抗体または抗体結合性フラ グメント。
5. ５．ヒトγインターフェロンに対する受容体を有する細胞と、請求項１若しくは ２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３に記載の抗体若しくは結合性 フラグメントまたは請求項４に記載の抗イディオタイプ抗体若しくは結合性フラ グメントの有効量とを接触させることを含む、細胞性受容体に対するヒトγイン ターフェロンの結合を阻害する方法。
6. ６．生理的に許容しうる担体と、請求項１若しくは２のいずれか１項に記載のポ リペプチド、請求項３に記載の抗体若しくは結合性フラグメントまたは請求項４ に記載の抗イディオタイプ抗体若しくは結合性フラグメントの有効量とを含む、 γインターフェロンによって媒介された疾患を治療するための薬剤組成物。
7. ７．γインターフェロンによって媒介された疾患を治療するための薬剤の製造に 対する、請求項１若しくは２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３に 記載の抗体若しくは結合性フラグメントまたは請求項４に記載の抗イディオタイ プ抗体若しくは結合性フラグメントの使用。
8. ８．生理的に許容しうる担体と、請求項１若しくは２のいずれか１項に記載のポ リペプチド、請求項３に記載の抗体若しくは結合性フラグメントまたは請求項４ に記載の抗イディオタイプ抗体若しくは結合性フラグメントの有効量とを混合す ること含む、γインターフェロンによって媒介された疾患を治療するための薬剤 組成物を製造する方法。
9. ９．γインターフェロンによって媒介された疾患の治療に対する、請求項１若し くは２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３に記載の抗体若しくは結 合性フラグメントまたは請求項４に記載の抗イディオタイプ抗体若しくは結合性 フラグメントの使用。
10. １０．γインターフェロンによって媒介された疾患に苦しむ患者に対して、請求 項１若しくは２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３に記載の抗体若 しくは結合性フラグメントまたは請求項４に記載の抗イディオタイプ抗体若しく は結合性フラグメントの有効量を投与することを含む、該疾患を治療する方法。