JPH04505098A - アジプシンと補体ｄ活性を有する組換え蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アジプシンと　Ｄ　する　え 又１」」Ｉ乞仕就 本出願はアメリカ合衆国特許出願第０３４．２０３号（１９８７年４月２日出願 ）の一部継続出願である。

１人立更 本発明は動物並びに人の新陳代謝制御及び感染制御に関わるものである。特に、 補体り活性を有するセリンプロテアーゼを利用した脂肪性新陳代謝の制御に関わ るものである。

ＸｊＬ！Ｌ左 ネズミモデルの肥満はネズミにおける肥満と不適正レベルのセリンプロテアーゼ （アジプシン）との関わりを暗示している。この蛋白質はアジポシト（ａｄｉｐ ｏｃｙｔｅＳ）内で合成分泌され、この蛋白質をコードするｍＲＮＡの合成はア ジポシトに特有であるかに思われる（ズサラクケー　エム他の１９８５年版ジエ ー　モル　セル　ビオル　５：４１９）。脂肪性組織内のアジプシンｍＲＮＡと アジプシン蛋白質のレベルは血液内に循環するアジプシン蛋白質のレベル同様に 肥満動物において低下する。

さらには、フライヤー　ジエー　ニス他の１９８７年版サイエンス　２３７　： 　４０５−４０８に記述されているごとく、脂肪性組織内の過多アジプシンｍＲ ＮＡは通常のネズミの断食期間中にストレプトシトシン誘導インシュリン欠陥に よる糖尿病の症状にて増加するが、Ｉ＼イ、＜−グリセミブク（ｈｙｐｅｒｇｔ ｙｃｅｍｉｃ）でグルコースの連続的注入により誘導される肥大した脂肪性置体 に伴うノ１イパーインシュリネミブク（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉｃ）な 状態、及び遺伝的肥満なネズミの精神的負担状況において減少することを示した 。肥満が新生ネズミへのモノソジウム（ｍｏｎｏｓｏｄ　ｉｕｍ）グルタミン酸 塩注射投与により誘導されたときには、アシプシンｍＲＮＡは減少することをも 示した。しかしながら、アジプシン発現レベルは単に過剰な餌を投与しただけの 通常ネズミ肥満モデルにおいては変化しなかった。アジポシト内のアジプシンｍ ＲＮＡレベルと血清内のアジプシン蛋白質レベル両方のネズミの肥満、並びに人 の肥満に対する関連性はＰＣＴ出願公告番号ＷＯ３８１０７６８１号において開 示されている。

ネズミシステムにおける遺伝子配列化アジプシンはクロン化されコードされてき た。クック　ケー　ニス他の１９８５年版ブロク　ナショナル　アカデミ−サイ エンスニー　ニス　ニー　８２　：　６４８０−６４８４は分化過程において少 なくとも１００倍に誘導され、トリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼ等 の種々なセリンプロテアーゼに対して実質的同族関係を有する２８ｋｄの蛋白質 をコードするｍＲＮＡに雑種化するところのアジポシトを分化するネズミの３Ｔ ３からｃＤＮＡクロンのための配列を得た。しかしながら、その蛋白質はグリコ シレートされた３７ｋｄ及び４４ｋ　ｄの形態で生成されるように思われる。こ の蛋白質をコードするゲノム配列もまた考案され（ミン　エイチ　ワイ他の１９ ８６年版ニュークレイクアシド　リサーチ　１４　：　８８７９−８８９１＞、 その蛋白質は脂肪性組織と座骨神経により分泌循環されることが示されたくクブ ク　ケー　ニス他の１９８７年版サイエンス　２３７　：　４０２−４０４　） 　。

配列化の回復にも拘らずネズミの蛋白質は組換え技術では生成されず、純粋形態 でも得られなかった。

また、この補体系はセリンプロテアーゼに関わることが知られており、セリンプ ロテアーゼ補体蛋白質りの完全アミノ酸配列は単離蛋白質に−マン　エム　ニー 他の１９８４年版バイオケミストリー　２３　：　２４８２−２４８６）により 決定されてきた。補体系は複雑な相互作用配列による２０の蛋白質であり、主と してアンチゲン／抗体相互作用、特にそのＣ１ｑサブコンポーネントを経由した ＩｇＧと１ｇＭクラスのイムノグロブリンに対するＣＩ蛋白質の結合により活性 化される（１９８６年版バイオ　エッセイ　４　二２４９−２５３　）。その補 体カスケード活性化の結果は侵入微生物ホストの破壊に関連があるものと見られ るが、化膿及び、時には関節炎のごとき症状にも関連性を有する。

補体カスケードの免疫系活性部分に加えて、セリンプロテアーゼ、すなわち補体 りが関与しているＩＩＩ経路が存在するへこの系においては、アルファ系鎖のＣ ３（１２０ｋｄ）はＣ３ａ　（９ｋｄ　）及びＣ３ｂを得るべく加水分解されて 、Ｃ３ｂ８を得るべく蛋白質Ｂに組み入れられ、さらにＣ３ｂＢｂを得るべく補 体要素（ｆａｃｔｅｒ）Ｄの触媒を通して加水分解される。Ｃ３ｂＢｂはこの循 環を継続するために０３の加水分解の触媒として作用する。Ｃ３ａ及びＣ３ｂの 両方ともアジポシトあるいは脂肪性新陳代謝に関連する他の細胞と直接的に反応 するかもしれない。さらに、Ｃ３ｂは同様に相互作用をするＣ５ａ及びＢａのご とき追加要素を得るために人為操作可能でもある。

ネズミのアジプシン遺伝子が得られており、想定されるアミノ酸配列からデザイ ンされた合成ペプチドはネズミにおける循環アジプシンと抗体反応をする抗体を 得るのに便利に使用されているが、その人の遺伝子は得られておらず、人のアジ プシンと相互反応（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）する合成ペプチドに対して もネズミの抗体は生成されていない。よって、ネズミの新陳代謝に関して獲得さ れた考察は本発明以前は人の系においてはその利用は不可能であった。さらに、 純粋なネズミの蛋白質は未だに入手されていなかった。本発明はアジプシンのエ ネルギー制御機能と補体要素りのマクロファージ溶解の増進機能の両方を有する 人の蛋白質をコードするＤＮＡを提供するものである。本発明はまた純粋なネズ ミのアジプシンをも提供するものである。

アジプシン活性と補体り活性間のネクサス（ｎｅｘｕＳ）は提唱されてはいなか った。もつとも、１９８７年の９月１８日から２１日にかけて開催された第１２ 回国際補体ワークショップでの要旨説明において、モール　ジエーイー他は補体 りのための部分的ｃＤＮＡクロンを報告し、コンピユータ化されたサーチに供さ れたとき、ネズミのアジプシンについて報告された配列に対する進化的関連の可 能性を明らかにした。すなわち、アジプシンｍＲＮＡに対して補体であるｃ　Ｄ ＮＡはアジポシト分化中に誘導されるというものであった。

セリンプロテアーゼは一般的に高程度な同族関係を有するので、同族関係だけで は必ずしもアジプシンと補体りの分析物における活性が共有されるという結論に 結び付くものではない。本発明はこの蛋白質に対するこれらの二重活性を確立す る。

主尻立兄丞 本発明は人に対して有効なネズミ系におけるアジプシンの利用の可能性に関わる 発見並びに結論を成す方法及び材料を提供するものであり、それらは純化された 組換えネズミアジプシンを提供し、エネルギー制御と補体系を関連付けるもので ある。本発明は遺伝子配列、ペピチド、抗体、及び人、並びに他の哺乳類におけ る肥満の処方及び制御を可能とするそれらの側層方法を提供し、さらにこれらの 哺乳類をバクテリア類、ウィルス類及び腫瘍細胞から防御する方法を提供するも のである。

従って、ある意味においては、本発明はアジプシンと補体り活性を有する人の蛋 白質をコードするＤＮＡの配列に向けられたものである。この蛋白質をコードす るＤＮＡが両方の活性をコードすることは驚くべきことであり、アジプシン及び 補体りは同類関係を有するが相互反応を起こさないと予期されるセリンプロテア ーゼである。

他の観点においては、本発明は人あるいはネズミのアジプシン／補体りを生産す る能力のある発現系、その為の方法、この発現系により変換された細胞、組換え により生成された蛋白質、及び活性要素としての人の蛋白質を包含する薬学的組 成物に関与するものである。またその他の観点では、本発明はアジプシン／補体 りの蛋白質の特定の免疫性部分と、この蛋白質と免疫反応をする抗体と（あるい は）これらの部分を代表する合成ペプチドに関与するものである。

本発明はまた、本発明の抗体と免疫反応をする血液中あるいは脂肪性組織中の蛋 白質のレベルを測定、あるいは脂肪性細胞中のｍＲＮＡレベルを測定することに より、人あるいは他の哺乳類の肥満を新陳代謝的に制御する処方手段、及び純化 された人の蛋白質を包含する薬学的成分を使用した肥満あるいは感染を治療する 方法に関与している。

さらに、本発明は（：３ａ、Ｂａあるいはｃ　５　ａ　ｓあるいはそれらの部分 のごとき補体り活性により直接的あるいは間接的にその存在が仲介される別の補 体経路の構成要素を使用した肥満の制御に関与している。

の　な二重 第１表はネズミのアジプシン配列化ｃ　ＤＮＡを示し、５′及び３′部分検知を 得るのに使用される完全なシグナル配列及び制限サイトの位置を含むものである 。

第２表は人のアジプシンをコードするクロンｐｈｇ３１の挿入のためのＤＮＡと 導かれるアミノ酸配列を示す。

第３表はｐｈｇ３１によりコードされたアミノ酸配列と補体りの蛋白質から決定 されたアミノ酸配列の比較を示す。

第４表はリーダーを完成し、３′の未翻訳区域を短縮するための改定ｐｈｇ３１ 配列を示す。

第５表はタック他により報告されたネズミのｃＤＮＡの配列を示す。（インフラ ） 第６表は補体りの活性を表示するネズミアジプシンの性能を示す。

第７表はｂｏｂＣＡＴ：　ｈｇ３１／４０とｐＬＥＮ：ｈｇ３１／４０の図、及 びそれらの成分あるいはプレカーサー用の特定関連コード配列を示す。

日を　する 八〇　のアジプシン／Ｄ 本発明は治療において使用する十分な量のアジプシン及び補体り活性を有する純 粋な人の蛋白質を生成し、治療のための抗体を得る手段を提供するものであり、 純化されたその蛋白質はモノスペシフィック（ｍｏｎｏｓｐｅｃ　ｉ　ｆｉｃ） な抗体生成を促す。平常より低いこの蛋ξ質の血清適定濃度は一般的に新陳代謝 障害であり、その新陳代謝障害は肥満に通じる。脂肪性組織内のアジプシンレベ ルもまたこれら個々において低下する。さらに、この蛋白質をコードするＤＮＡ に雑種化（ｈｙｂｒｉｄｉＺｅ）するｍＲＮＡのレベルはこれら個々においては 低下する。よって、この種の肥満は食べ過ぎによるものと区別することが可能で ある。

本発明の人の蛋白質をコードするＤＮＡは、検知薬としてのネズミのアジプシン 蛋白質をコードするｃ　ＤＮＡを使用して人の神経こうしゅｃＤＮＡライブラリ ーから単離した形態で回収される。アジプシン−配列化ｍＲＮＡはまた脂肪性組 織内で発見され、本発明人により決定されたごとく、マクロファージ抽出物の形 態で発見される。それはまたここにおいて開示された配列に基づいて標準的合成 技術を利用して生成することができる。「単離した形態」とは言及されているＤ ＮＡが通常においてそれに伴うＤＮＡを含有しないで得られることを意味する。

勿論、追加的ＤＮＡはコード配列に括られた未翻訳の配列、あるいは標準遺伝工 学技術を利用して都い化されてきたコード配列には通常において関連しない制御 配列のごとき成分内に存在するかも知れない。端的にいえば、「単離した形態」 というのは単にクレームされたＤＮＡはその自然な環境に存在するのではな（、 その元の細胞から獲得されたＤＮＡの混合物の一要素でもないということである 。

本発明のＤＮＡはアジプシン及び補体りの両特徴を有する人の蛋白質をコードす るが、本明細書中では人のアジプシン／Ｄとする。人の蛋白質の「アジプシン活 性ｊとは、第４表に成熟したアジプシンとして示されるアミノ酸配列を有する蛋 白質に対してレイズされ、それと反応する抗体と反応する蛋白質の能力を意味す る。この蛋白質はバクテリア、哺乳類細胞、酵母菌あるいは種々な他の宿主内で 組換え生成される。さらに、第４表の蛋白質配列の部分（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ） は示されている完全アミノ酸配列の人　゛のアジプシン／Ｄとクロス反応する抗 体をレイズするのに使用することができ、一般的にこれらの抗体は定義されたア ジプシン／Ｄクラスの構成成分と反応する。しかしながら、これらのサブフラグ メント抗体に関して、特にアミノ酸配列における変換が異なるエピトープ（ｅｐ ｌｔｏｐｅＳ）をもたらす結果につながるときには、いくらかの例外が存在する かもしれない。ネズミの蛋白質の「アジプシン活性」とは第１表のｃＤＮＡによ りコードされた対応するネズミの蛋白質に関わり上述されたごとくの抗体と反応 する能力を意味する。

「補体り活性」とは実施例７において記述された標準補体分析物における純化さ れて活性化されたＣ３の存在での補体経路の純化された人（あるいはネズミ）の ファクターＢの分裂を生じさせる蛋白質の能力を意味する。第４表の成熟したア ジプシン／補体り蛋白質をコードするＤＮＡによりコードされた蛋白質は本発明 の好適実施り１である。しかしながら、同時に本発明の範囲に属するのは前記表 のものと多少異なるがこの蛋白質のアジプシンと補体り活性を維持するアミノ酸 配列の蛋白質である、特に、その蛋白質は第４表の成熟したアジプシン／Ｄとし て示されている蛋白質に対し６０％以上同一源であり、できれば８０％以上が同 −源であり、さらに望ましいのは９０％以上が同−源であることである。さらに 特に望ましくは、第４表に示されるものの自然状態において突然変異種であるＤ ＮＡの配列によりコードされているアジプシンと補体りを有する蛋白質である。

そのような突然変移種は時々発生し、単離が可能であり、検知物とし厳しい環境 下で第４表のどと（のＤＮＡ配列を使用してコードすることができる。なぜなら 、一般的に突然変移は遺伝子の数か所においてのみ発生するからである。

人のアジプシン蛋白質白質をコードするＤＮＡはエネルギー新陳代謝の検知物と してのアジプシンをコードするｍＲＮＡのレベルを測定し、あるいはこの蛋白質 の低い生成レベルを有する個々の遺伝子における異常を検知する検知器として有 効である。

Ｂ＝皿１虫滅。

アジプシンと補体り活性と共に蛋白質をコードしているＤＮＡ配列は人（あるい はネズミ）のアジプシン／Ｄが細胞内あるいは分泌された蛋白質として組換え生 成されるように変更することができる。分泌を促すには、望ましい蛋白質をコー ドするＤＮＡは、遺伝子が発現されたとき成熟した蛋白質とシグナル配列が人為 的に結合する生成のために選択された組換え宿主細胞において人為的なシグナル 配列をコードする配列に融合される。「人為的に結合Ｊとは成分の機能が同−源 に保存されるように同−源化することを意味する。このように、本実施例におい ては、「人為的に結合された」シグナル配列は成熟形態の分泌を促すように成熟 した蛋白質に加えられるものである。

蛋白質を組換え生成するには、アジプシン／補体り配列化配列は発現系に組み込 まれるが、その系が制御配列が機能的であるとところの宿主に変換されるとき、 コード配列の発現を実行することができる制御配列と人為的に結合できる。「制 御配列」とは遺伝子の発現を得るのに必要、あるいは望ましいＤＮＡを意味し、 そのような制御配列は常にプロモータと、しばしば配列を終了させる転写と、オ ペレータあるいはエンハンサ−のごとき発現を規制する制御要素と、リボゾーム 結合サイト（ｓｉｔｅａ）あるいはＣＡＰサイトのごとき翻訳に有用なｍＲＮＡ 部に転写される配列を含む。発現系の制御要素の特徴は選択された宿主細胞の機 能であると理解される。

以下記載の説明において、第３表の回収遺伝子はバクテリア及び哺乳類の細胞中 で発現を可能とするように変更され、組換え蛋白質が獲得される。本発明の蛋白 質をコードするＤＮＡの生成可能性はバクテリア、酵母菌、哺乳類細胞、菌類細 胞、昆虫細胞及び、あまり便利ではないが植物細胞等積々な宿主において発現を 可能とする。種々なタイプの宿主用の適当なプロモータの種類は考察可能であり 、選択肢は多様である。たとえば、バクテリア内のｔｒｐあるいはペニシリナー ゼプロモータ、酵母菌内の糖分解経路と関連性を有するプロモータ、昆虫あるい は哺乳類細胞中のウィルスプロモータ、及び植物内の植物隆起プロモータ等であ る。以上から理解可能なごとく、望ましい蛋白質は細胞内あるいは分泌される溶 融蛋白質あるいは成熟した蛋白質として発現可能である。また、成熟した蛋白質 が細胞内蛋白質として生成されるならば、メットの残滓は分子のいくらかあるい は全体に存在するかもしれない。よって、示されるいかなる配列もＮ−ターミナ ル　メブトを含む可能性があることは理解されることである。しかしながら、こ れは分泌された蛋白質内では不変には存在しない。

組換え細胞により生成された蛋白質は蛋白質が単離される媒体物に適した標準純 化工程を利用して純化される。

ｃｏ裏且ｉ 単離あるいは部分的に純化された形態の人のアジプシン／Ｄ蛋白質は種々な利用 力を有している。ネズミの蛋白質も人あるいは他の哺乳類系においての治療に対 して有用な抗体を得るのに同様な使用可が存在する。

益皇止 たとえば、人のアジプシン／Ｄあるいは組換えネズミのアジプシン／Ｄにレイズ された抗体は、対象物を新陳代謝により引き起こされた肥満にプレディスボーズ するようにその対象物のエネルギー新陳代謝が異常に歪められているかどうかを 決定するための診断具として使用可能である。

そのような個人は通常の食事摂取のみにも拘らず肥満である。しかしながら、食 事習慣は調査が困難であるので、実験室試験による新陳代謝的疾患の診断はこの エネルギー使用異常が存在するか否かを判断するのにより確実な方法である。ネ ズミモデルに対しても同様に、異常エネルギー新陳代謝の症状を有する人及び他 の哺乳類は血清中に低レベルのアジプシン（及び脂肪組織中のアジプシン配列化 ｍＲＮＡ）を示す。

このように、一つの診断上の取り組みにおいて本発明の蛋白質を人あるいは他の 哺乳類のアジプシンと遺伝反応が可能な抗血清を生成する免疫体として使用する ことができる。また、抗体は、ペピチド免疫を行うために、もし望むならばキー ホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙ ａｎｉｎ）のような中性モイエティ、あるいは適当な血清アルブミンに対して、 ５ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒ。

−５ｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（第４表の残滓５９−７１ ）あるいはＩ　１ｅ−Ｖａ　ｌ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ ｒｇ−Ｐｒｏ−１−Ａｓｎ−Ｈｌｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒ第４表の残滓１３０ −１４３）のごとき特定のペプチドサブ配列を使用して適当に共役させて免疫法 により生成することができる。

これらのペプチドは説明のために使用したものであるが、抗遺伝的ペプチドは、 クック　ケー　ニス他の１９８７年版サイエンス　２３７　：　４０２−４０４ 、グリア　ジェーの１９８１年版ジェー　モル　バイオロジー　１５３：１０２ ７、及びストラウド　アール　エム他の１９７１年版コールド　スプリング　ハ ーバ−シンポジウム　３６：１２５記載のごと（の蛋白質の表面域を識別するの にセリンプロテアーゼの一般的に知られた３次元配置を利用することで本発明に より誘導された人の蛋白質のアミノ酸配列に基づきデザインが可能である。この 目的に叶うネズミのアジプシンの７ラグメントのデザインはクック　ケー　ニス 他の１９８５年版ブロク　ナショナル　アカデミ−サイエンス　ニーニスニー　 ８２　：　６４８０に掲載されているが、これらのネズミのフラグメントにレイ ズされた抗体は人のアジプシン／Ｄとは遺伝的反応をしない。よって、遺伝反応 をする区域を予想するために標準的技術を使用し、さらに３次元構造の知識を活 用し、適したフラグメントはコードされた特定の蛋白質用として決定される。

イミュノグロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌ　ｉｎ）生産細胞をイモータラ イズすることにより得られる高い滴定濃度の抗血清あるいはモノクロナル（ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｌ）な薬剤になりうろこのようにして得られた抗体薬剤は、アジ プシン欠陥タイプの肥満の診察において有用である。実験の実施にあたり、対象 物の血清あるいはプラズマを抗体と反応させ、抗体のアジプシンとの特定な相互 反応は適当なラベリングにより検知される。同様な試験は生検された脂肪性組織 を使用して行われ、それは同質化され、標準遺伝分析法により試験され、ＳＤＳ サンプル緩衝剤に抽出され、ウェスタンプロット（ｂｌｏｔ）に供される。

多種なプロトコールが本分野の通常の技術者にとり遺伝分析及びその方法におい て可能である。たとえば、生成された抗体は微小適定井戸（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅ ｒ　ｗｅｌｌ）のような固形の表面に付着させることができ、プラズマ、血清あ るいは同質化した組織はその井戸に加えられて非結合成分は洗い流される。井戸 に結合したアジプシンの存在は、たとえば、放射性同位元素、蛍光性部分、酵素 あるいは発色団のような検知可能なラベルによりラベルされる抗血清の第２サン プルを使用して検知される。もしくは、本発明により多量のアジプシンが生成可 能であるので、コンペティション分析が可能であり、試験に付されるべきサンプ ル中のアジプシンは支持された抗体に結合したラベルされているアジプシンとコ ンピートする。

フライアー他により１９８７年版サイエンス　２３７：４０５−４０８において 記述され、ネズミの蛋白質の７ラグメントを利用して生成されるネズミの抗体は 人のアジプシンとは相互反応をしない。しかし、標準ネズミのアジプシンに対し てレイズされた抗体は第３表のごとくに成人のアジプシン／Ｄと確実に相互反応 を起こす。

また、ｃＤＮＡあるいはゲノムから回収された人のアジプシン／Ｄをコードする ＤＮＡは肥満の対象体における新陳代謝障害を判断する方法としてｍＲＮＡ脂肪 性組織をコードする適切なアジプシンのレベルを診断する検知薬として使用可能 である。そのようなパイプリダイズされた検知の条件はスピーゲルマン　エム他 の１９８３年版ジェーバイオロジー　ケミカル　２５８　：　１００８３に記述 されている。この方法においては検知薬は任意な投与により放射性ラベル化され 、レーザー密度計測により自動Ｘ線写真がスキャンされる。他のラベル方法も使 用が可能である。さらに、ｃＤＮＡあるいはゲノムのＤＮＡの部分の配列を有す る部分的ｃＤＮＡあるいは合成オリゴメリック（ｏｌ　Ｉｇｏｍｅｒ　ｉｃ）検 知もまた使用可能である。

狛」１丸 組換え用宿主の培養物から純化された組換え用人のアジプシン／Ｄは人及び他の 哺乳類のアジプシン障害に伴う肥満の治療において治療法として使用できる好都 合な量の形態にすることが可能である。投与の望ましい形態は注射による（でき ればＩＶ、ＬかしなからＩＭ、脂肪組織内への皮下注射及びＩＰが使用可能）も のであり、その蛋白質は緩衝剤中あるいはハング溶液またはリンゲル溶液中のご とき懸濁液あるいは溶液形態の投与に適した手段で形成されるか、あるいは使用 を望むとき、溶液内で使用される固形で生成される。または、スローな投与装置 、たとえば、鼻からの投与、あるいは皮膚通過剤等のトランスメンブレン（ｔｒ ａｎｓｎｏｅｏｎｂｒａｎｅ）結合剤の使用により系統的な投与が可能である。

もちろん、投与量は患者の容体と医師の判断による。適正な投与量レベルは血液 内の蛋白質のレベルをだいたい通常の値であるｌｕｇ／ｍｌの辺りに維持するよ うに定義されている。投与量は対象の障害の程度と投与された蛋白質が消費され る能力による。１ｖ投与については１００ｕｇ−１００ｕ　ｇの範囲が適当であ る。脂肪組織への注射投与量は１０ｕ　ｇ−５ｍｇである。障害を除去するたた めに蛋白質は連続的あるいは半連続的に投与され、インシュリンの場合と同様に その投与量は患者により調整する。補体りとアジプシン活性のネクサスに鑑みて 、補体りの活性の結果形成される仲介物もまたアジプシンレベルにより管理され た新陳代謝状態の規制に有効である。たとえば、既知の配列の約７０−アミノ酸 ペプチドであるＣ５ａ及びＣ３ａは補体カスケードの補体りを基にした別経路の 操作により形成される仲介物である。さらに、３０ｋｄ蛋白質である８ａはＣ３ ｂＢが補体りにより細胞溶解されるときに放出される。これらの仲介物はいつで も入手可能であり、肥満の治療及び他のエネルギー関連新陳代謝機能用アジプシ ン／Ｄに関しての上述のものと同様に投与可能である。補体り活性の直接的ある いは間接的な結果である補体別経路に関わる他の仲介物はちまた使用できる。多 くの仲介物はアナフィラトキシン（ａｎａｐｈｙＪａｔｏｘｉｎｓ）であるので 全ての場合においてこれらの仲介物のサブフラグメントの使用は望ましいもので ある。

補体りの別経路はマクロファージで悪性のバクテリア、寄生虫及びウィルス等の 感染系物質、さらにまた腫瘍などを含む望まれない物体を溶解させるところのフ ァクターの発生に関与する。よって、本発明の蛋白質を含有する薬学的成分は感 染病を治療あるいは防止するのに効果的であ、　リ、特に補体カスケードの補体 り別技により直接的に制御されるバクテリア系感染病に効果的である。補体りに 欠陥のある人はウィルス系伝染病に対しては通常の抵抗力を有するがバクテリア 系感染病にはかかりやすいことは周知である。しかしながら、補体りは種々な望 ましくない物体のマクロファージ仲介による溶解を発生させるのに役立つので、 本発明の蛋白質は一般的に好ましくないこれらの物体を除去するのに有用である 。この使用においては、投与の望ましい形態は標準結合剤中において血清中に約 １　ｕ　ｇ／ｍ１である通常の循環レベルの約１−５倍の静脈注射である。

さらに、免疫集合体をオプソナイズ（ｏｐｓｏｎｆｚｅ）する補体系の能力に鑑 みて、本発明の蛋白質等の補体系の刺激剤は紅斑性狼そう及びリュウマチ性関節 炎のような自己免疫性の病気を治療するのに有用である。これらの病気は補体カ スケードの古典的部分により発生する溶解に関連を有する生まれながらの組織に 対して形成される免疫集合体に関与している。補体り活性と追加的蛋白質との別 通路の刺激はこれらの好ましくない免疫集合体を除去するのに助けとなる。

肥満の治療において述べたように、補体り活性を利用するように投与されるとき には、この蛋白質は系統的に投与される。たとえば、静脈注射、筋肉注射、腹膜 注射、あるいは鼻内の投与等の他の形態の系統的投与、または、怪我のごとき部 分的感染病の場合には局部的投与もまた採用できる。

以下の実施例は説明のためのものであり、本発明を限定爽ｌ丘上 アジプシン　コー゛する　のｃＤＮＡ 人の神経こうしゅの逆転写であるＡＴＣＣＨＴＢ１３８を代表するラムダ−ｇｔ ｌｌライブラリーはカリフォルニア州のパロアルトのクロンチック社から入手で きる。元の細胞ラインは７６オのコーカサス出身の男性から単離され、ハイポテ トラプロイド（ｈｙｐｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ）である線維母細胞のような細胞 を与える分子フィルム（ｍｏｎｏｆａｙｅｒ　）として育成された。［ｔｌｌラ イブラリーから１５０万のプラークがナイロンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ− Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）上に二重に移され、摂氏４２度にて３０％のホルムアミド、 ５ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハ−ト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　’　ｓ）でネズミアジプシ ン検知薬で雑種化された。フィルターは摂氏５０度にて２ＸＳＳＣ，０，１％Ｓ ＤＳで洗われた。検知薬はネズミｃＤＮＡの５’ＢａｍＨＩ／５ｔｕ１７ラグメ ントであり、第１図表で示すごとく、この配列の３’５ｔｕｌ／ＢａｍＨＩの７ ラグメントであった。

両検知薬に対してハイブリダイズされた３つの攻撃的プラークは配列分析により 特徴付けられ、ｐｈｇ２６、ｐｈｇ３１及びｏｈｇ４０を得るためにｐＵＣ９あ るいはｐＢＲ３２２にサブクロン（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ）された０第２表におい てｐｈｇ３１（ｐＵＣ９にクロンされた）約１．１ｋｂの挿入物が示される。こ のフラグメントは熟成された蛋白質の完全アミノ酸配列をコードし、Ｎ−ターミ ナル配列のｌ１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ・・・・・・・・・・・・、及び殆 どのシグナル配列と共に表において１の符号が付されたアミノ酸として示される その位置から始まる。

第３表においては、ネズミのアジプシンｃＤＮＡと補体りの出版されたアミノ酸 配列にハイブリダイズすることにより得られるｐｈｇ３１挿入物の遺伝子により コードされた蛋白質のアミノ酸配列の比較がなされている。不一致な箇所は補体 り蛋白質内の配列エラーによるものと思われる。これらの蛋白質には全くグリコ シレージョンサイトｔ’ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔ＋ｏｎ　５ｉｔｅｓ）はない。

叉ＪＬ［ｉ ベクトルの生 ｐｔＢ３１内の挿入物は３゛未翻訳部分を切り取り、しぐなる配列を完成するよ うに修正がなされた。ｏｈｇ４０（ＤＩ３Ｒ３２Ｑにクロン化）の、より短い３ ゛未未翻訳列はｐｈｇ３１／’４０を得るため、ｐｈｇ４０の３’Ｐｓｔ１／Ｅ ｃＯＲＩ７ラグメントとＤｈｇ３１の５’ＥｃｏＲ１／Ｐｓｔｌフラグメントを 括ることでｐｈｇ３１のものと交換された。より短い３゛配列との結果的に得ら れる挿入物は第４表において示されている。ｐｈｇ４０はｐＵＣ９というよりも ｐ　ＢＲ３２２のＥｃｏＲ１サイトへのクロン化により得られたので、交換され た部分は３゛端部のほんの少し上流の含有ｐＢＲ３２２Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉサ イトを包含している。

第４表において示される５′シグナル配列は第２表のＮｏｔｌサイトでの挿入物 を分裂させ、合成オリゴニュークレオチドと共に８４表のＢａｍＨＩサイトに延 長させることで合成オリゴニュークレオチド（ｏｌ　ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅｓ）を使用して完成された。シグナルを構成するのに使用されるオリゴは周知 のネズミシグナル配列に対する分析を基にしてデザインされ、その結果は表中に 示されている。

ｐｈｇ３１／４０の修正挿入物は哺乳類の発現ベクトル０ＬＥＨに括ることによ り発現系を構成するのに使用された。ｐＬＥＮの構成は以下に述べられている。

ｐｈｇ３１／４０からの摘出及びＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ１分裂 ｐＬＥＮへ括った後の終了挿入は第４表に示されている。これで挿入されたフラ グメントを金属チオネイン（ｍｅｔａＪｌｏｔｈｉｏｎｅｌｎ）プロモータと５ ｖ４０エンハンサ−の制御下に置き、・ＭＴ−１１遺伝子の含有に起因する重金 属の追加による増幅を提供する。終了ベクトルはｐＬＥＮ：ｈｇ３１／４０とす る。

ネズミのアジプシン用のアナロガスペクトルを構成するために第５表（クック　 ケー　ニス他の１９８５年版ブロク　ナショナル　アカデミ−サイエンス　ニー ニスニー８２　：　６４８０−６４８４で開示）のネズミｃＤＮＡがＭｂｏｌで 消化された。以下のオリゴはアジプシンの最初の１１のアミノ酸を再生成し、Ｂ ａｍＨＩサイトを提供するために５′の端部上に括られた。

ＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡ　ＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＧＣ ＴＣＴＧ−Ｇ　ＴＧＧＴＧＧＴ　ＡＣＧＴＧＴＣＧＡＧ　ＧＣＡＣＡＴＧＡＡＧ 　ＣＡＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＴＡＧ以下のオリゴはアジプシンのカルボキシルタ ーミナル１１のアミノ酸を再生成するために３゛の端部に括られ、ポリリンカー （ｐｏｌｙｌ　１ｎｋｅｒ）の配列及びＢａｍＨＩサイトを提供する。

ＧＡＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＧ　ＧＴＡＡＣＡＴＧＡＣＡＴＣＣＴ ＧＡＧＧＧＣＴＴＴＴＧ　ＴＡＧＴＧＴＴＴＡＣＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧ　ＴＡＧ ＧＡＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ　ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＧＧ ＧＣＣＣＴＴＡＡＧＡＴＡＣＧ　ＡＣＣＴ＾再生成されたアジプシンｃＤＮＡは ｐＬＥＮ：ＭｕＡｄ／Ｄを得るためにＢａｍＨ［消化ｐＬＥＮに括られた。

バクテリア発現ベクトルは包含された蛋白質のコード配列を置換するためにベク トルｐｃｈＮＦ１０９に成熟した人及びネズミの蛋白質配列化ＤＮＡをコードす るＤＮＡを溶融することで得られる。

ｏｃｈＮＦ１０９の構造は以下に述べられている。人のアジプシン７／Ｄの構造 はＥｃｏＲＩ／′５ｔｙｒフラグメントをｐｈｇ３１／４０から単離させ、この フラグメントを３゛の端部でリンカ−（ｌｉｎｋｅｒ）を使用することによりＥ ｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ分裂ＣｈＮＦ１０９に挿入することで得られる 。人のアジプシン／Ｄ　ＤＮＡを挿入するためにはｐｈｇ３１−４０はＥｃｏＲ ｌとｓｔｙ＋で消化され、ｐｃｈＮＦ　１０９はＥｃｏＲＩとＨｉ　ｎ　、ｄ　 Ｉ！Ｉで消化される。ＥｃｏＲ［の消化はｐＵＣ８から取り出されたポリリンカ ー（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）内のＥｃｏＲＩサイトでｐｈｇ３１／４０を分裂さ せる。ｓｔｙ＋サイトはリンカ−を使用してベクトルのＨｉｎｄｌｌｌサイトに 適応される。

５’　ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＴＧＣＣＧＧ　ＧＧＣＣＴＧ　Ａ　３’３’　ＣＣＡＣ Ｇ　ＧＣＣＣＣＧ　ＧＡＣＴＴＣＧＡ　５’ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｒｒｌでのｆ ）ＣｈＮＦ１０９の消化はＣＡＴ配列のアミノ酸７４−２１０．及び全てのＡＮ Ｆコード配列を除去する（以下参照）。終了ベクトルはｂｏｂＣＡＴ　：　ｈｇ ３１／４０とする。

対応するネズミのベクトルを得るためにｐＬＥＮ：ＭｕＡｄ／ＤはＢａｌ！及び Ｍｂｏｌで消化された。以下記載のオリゴは４アミノターミナルアミノ酸を再生 成し、ＥｃｏＲＩサイトを供給するために５゛の端部に括られた。

ＡＡＴＴＣＡＴＴＣＴ　ＧＧＧ ＧＴＡＡＧＡ　ＣＣＣ 以下記載のオリゴはカルボキシターミナル１１のアミノ酸を再生成し、転写ター ミナルシグナルとＨｉｎｄｌｌｌサイトを提供するために３゛端部に括られた。

ＧＡＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＧ　ＧＴＡＡＣＡＴＧＡＣＡＴＣＣＴ ＧＡＣＴＴＴＴＧ　ＴＡＧＴＧＴＴＴＡＣＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧ　ＴＡＧＧＡＣ ＴＴＣＧ　Ａ得られるネズミの配列はｂｏｂＣＡＴ：ＭｕＡｄ／Ｄを得るために ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄｌｌＩ消化ｐｃｈＮＦＩＯ９に括られた。

ｌヱベ久上水 バクテリアベクトル ｂｏｂＣＡＴ発現系であるｐｃｈＮＦ１０９を提供する宿主ベクトルは以下のご と（に生成できる。このベクトルはクロラムフェニコールアセチル転移酵素（Ｃ ＡＴ　）用のコドン及びＣＡＴ配列とのリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ 　ｆｒａｍｅ）における遺伝子の挿入用ＥｃｏＲ１とＨｉｎｄｌ［Ｉクロンサイ ト、及び異なる蛋白質用の配列用挿入物を包含する。ｐｃｈＮＦ１０９はエンド プロテイナーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｇｌｕ−Ｃ蛋白質加水分解分 断サイトを含む２４１アミノ酸ＣＡＴ−ｈＡＮＦハイブリッド蛋白質をコードす る。ＤＮＡ及びＣＡＴとｈＡＮＦの配列化されたアミノ酸配列は第７表に示され る。はとんどのＣＡＴ遺伝子（アミノ酸１−２１０）はリンカ−配列（５のアミ ノ酸）を通じてｈＡＮＦ　（１０２−１２６）遺伝子と分裂サイト（２６のアミ ノ酸）にインフレーム（１ｎ−ｆ　ｒａｍｅ）添加された。このベクトルはプラ スミドｐＴｒｏ２３３．１）ＣＡＴ２１及びｐｈＮＦ７５から構成され、プラズ ミドバブクボーンとそれぞれｔｒｐプロモーターオペレータ、ＣＡＴ遺伝子、ｈ ＡＮＦ’（１０２−１２６）遺伝子及び分裂サイトに供給される。

プラスミドｏＴｒｃ＋２３３はＷ○８７１０６５８８において記載されている。

プラスミドＤＣＡＴ２１はｔｒｐプロモーターオペレータの制御下、ｐＴｒｏ２ ３３にＣＡＴ遺伝子（アルドン及びパブネックの１９７９年版　２８２二８６４ −８６９のトランスポソン（ｔ　ｒａｎｓｐｏｓ。

ｎ）Ｔｎ９から）を挿入することで構成される。プラスミドｐＡＬ１３ＡＴｃＡ Ｔ（１９８７年９月１１日米国特許出願共係属中出願番号第０９５，７４２号に 開示されているＴｎ９ｎ９含有プラスミドＮｄｅｌとＨｉｎｄｌｌｒにより消化 され、ＣＡＴ遺伝子（Ｎｄｅｌサイトでコードされた開始Ｍｅｔ残滓と）を包含 するおよそ７５０ｂｏのＮ゛ｄｅｌ−Ｈｉｎｄｌｌ１７ラグメントはアガロース （ａｇａｒｏｓｅ）ゲルを使用して純化される。ＣＡＴ遺伝子はＴ４　ＤＮＡリ ガセ（ｌｉｇａｓｅ）を使用してＮｄｅｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌ消化ｐＴｒｐ２３３ と括られ、得られるプラスミドρＣＡＴ２１はＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１から 単離する。

プラスミドｐｈＮＦ７５は蛋白質加水分解分裂サイトのプラスミドｐＢｇａｌ（ シャイン他の１９８０年版ネーチャー　２８５−４５６　）後の合成ｈＡＮＰ遺 伝子の挿入により構築される。８つのオリゴデオキシリボニュークレオチド（ｏ ｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　）はエンドプロテイナー ゼＧｌｕ−Ｃ分裂すイト後に合成ｈＡＮＦ（１０６−１２６）遺伝子に組み入れ られる。その合成遺伝子はＭａｍＨＩ消化ｏＴｒｐ２３３に括られる。ｈＡＮＰ 遺伝子ｐｈＮＦ７３の３′端部での隣接するＨｉｎｄｌｒｒ、ＢａｒｎＨｒ及び ＥｃｏＲ１サイトを提供する方位の挿入物とのプラスミドはＨｉｎｄｌ［ＩとＰ ｖｕ　Ｉ　Ｉでの消化により発生するフラグメントのサイズにより認証される。

プラスミドｐ　ｈＮＦ７３はＥｃｏＲＩにより消化され、ｈＡＮＰ遺伝子はポリ アクリルアミドゲル電気泳動を利用して純化され、遺伝子はＤｈＮＦ７５を得る ためにＥｃｏＲＩ消化ｐＢｇａｌに括られる。

ｐｃｈＮＦ１０９はＣＡＴ、ｈＡＮＦ及び蛋白質加水分解分裂サイトを含むＤＮ Ａフラグメントとリンカ−配列をプラスミドｐＴｒｐ２３３に挿入することで構 成される。

プラスミドｐｈＮＦ７５はＥｃｏＲＩとＨｔｎｄｌｌｌで消化され、ｈＡＮＦを 含む約８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｆｎｄｌｌｌフラグメントはポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を利用して純化され、ｐｈＮＦ８７を得るためにＥｃ。

Ｒ１／Ｈｉｎｄｌｌｌ消化ｐＴ’ｒ　ｐ２３３に括られる。ｐＣＡＴ２１は５ｅ ａｌで消化され、ＢａｍＨＩ合成リンカ−（，５’　−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’ 　）はプラントターミニ（ｂｌｕｎｔ　ｔｅｒｍｉｎｉ）に取り付けられる。指 付物はＢａｍＨＩで消化され、約７４０ｂｏのＢａｍＨＩフラグメントはアガロ ースゲル電気泳動にて純化される。

Ｂａｍ）１１カセツト及びＢａｍＨ１消化プラズミドｏｈＮＦ８７はｈＡＮＦ遺 伝子に引き継がれるところの、インフレームでエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ 分裂サイトに溶融されたＣＡＴ遺伝子を有したｐｃｈＮＦ１０９を得るために括 られる。

（ＬＪヒ（とＬ上 宿主プラスミドｐＬＥＮはＭＴ−Ｉ＋プロモータの上流のＳＶ４０エンハンサ− と人の成長ホルモンと関連する約６００ｂｏの３゛未開訳区域ターミネーション 配列を包含している。

ＭＴ−１１：プラスミドｐＨ５ＩはｈＭＴ−［１遺伝子の−７６５の位置におけ るＨｉｎｃｌｌｌｌサイトからベース＋７０の位置のＢａｍＨＩ分裂サイトまで の範囲にわたるｐ８４Ｈ（カリシ　エム他の１９８２年版ネーチャー２９９　： 　２９７−３０２）からの８４０ｂｐのｈＭＴ−ＩＩセクエンスを含む。プラス ミドｏ８４ＨはＢａｍＨＩと完全消化され、ターミナルニュークレオチドを除去 するためエクソニュークリアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｂａｌ−３１で処 理される。望ましい８４０ｂｐＨｉｎｄｌＩＩ／プラントフラグメントはＨｉｎ ｄｌｌｌとＨｉｎｃＩＩＩ消化に供されていたｐＵＣ８（ビエイラ　ジェー他の １９８２年版ゲン　１９　：　２５９−２６８　）に括られる。括られた混合物 はＥ、Ｃｏ１１　ＨＢＩＯＩに変換されてＡ　ｍ　ｐＲとなり、ｐＨ３ｌとして いる候補（ｃａｎｄｉｄａｔｅ）プラスミドは単離され、ヂデオキシ（ｄｉｄｅ ｏｘｙ）配列することにより配列される。ｐＨ３ｌは好都合な制御サイトを包含 するポリリンカーの上流のｈＭＴ−Ｉ＋制御配列を包含する。

ｈＧＨタ　−　ミ　゛、−シ　ン　グ ｈＧＨをコードするゲノム配列はｏ２．６−３（プツト他の１９８１年版ニュー クレイツク　アシド　レス　１９：３７１９）から第１エキソン（ｅｘｏｎ）の ５′単部で切断することになるＢａｍＨｌ、及びファンクショナル遺伝子の３′ を切断するＥｃＯＲＩとの消化により単離され、ポリアクリルアミドゲル純化さ れた。単離したフラグメントはＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒｌ消化ｐ ｓ１に括られ、括られた混合物はＥ、Ｃｏ１１　ＭＣ１０６１に変換されＡｍｐ Ｒになった。成功した変換物は制限分析によりスクリーンされ、ｐＭＴ−ｈＧＨ ｇである望ましいプラスミドを包含する変種はさらに多量のプラスミドＤＮＡを 生成するために増殖された。

エンハンサー：ＭＴ−１１プロモータ及びｈＧＨからの３゛未未翻訳列と人為的 操作可能に結合したＳＶ４０エンハンサ−を包含する一対の宿主発現ベクトルは ＮＤＭＴ−ｂＧＨｇのＭＴ−１１プロモ一タ配列に先立って１１２０ｂｐＳＶ４ ０　ＤＮＡ７ラグメントをＨｉｎｄｌｌｌに挿入することで構成される。ＳＶ４ ０　ＤＮＡフラグメントは転写のＳＶ４０オリジンにまで及び、ニュークレオチ ド５１７１からニュークレオチド５２４３（オロジンで）までを含み、複写され た７２ｂｐはニュークレチド１０７から２５０を繰り返し、レー）（ｌａｔｅ） ウィルス系ｍＲＮＡの５′端部を包含するオリジン側のニュークレオチド１０４ ６にまで及ぶ。このＨｉｎｄｌｌｌｌ１２０ｂｐ７ラグメントはＳＶ４０　ＤＮ Ａ（パックマン　ニー　アール他の１９８１年版　ページ７９９から８４１　ニ ューヨーク　コールド　スプリング　ハーバ−研究所のＤＮＡチューマーウィル ス　第２版（チュー　ツース　版））から得られ、増殖のためにｏ　ＢＲ３２２ にクロンされる。

クロンベクトルはＨｉｎｄｒｌ［で切断され、１１００ｂ１）ＳＶ４０　ＤＮＡ フラグメントはゲル電気泳動により単離され、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化、ＣＩＰ処理 ＤＭＴ−ｈＧＨｇに括られる。得られるベクトルのｐｈＧＨｇ−５Ｖ（９）とｏ ｈＧＨｇ−５Ｖ（１０）はＭＴ−１１プ０％−９に先立ち逆の方位でフラグメン トを包含する。ｐ　ｈ　Ｇ　Ｈｇ−３Ｖ（９）においてエンハンサ−は５　’　 ｍＲＮＡ開始サイトから約１６００ｂｐであり、逆方位においては５’ｍＲＮＡ 開始サイトから約９８０ｂ　ｏである。両方位は人為的操作可能であるが、エン ハンサ−配列が開始サイトの基部であるときその方位はより高いレベルの発現を 提供する。エンハンサ−２５０−４００ｂｏを転写開始の上流に置くプリージョ ンが最善であると考えられる。

ＬＥＮＯ”’　：ｐｈＧＨｇ−５Ｖ（１０）はＳｍａ　Ｉで消化され、ＢａｍＨ Ｉリンカ−はＳｍａ　Ｉサイトに括られる。ベクトルはＢａｍＨ［（成長ホルモ ン遺伝子を取り除く）で消化され、レリゲートされ、ｐＬＥＮを放出する。ｐＬ ＥＮはポリアゾニレ−ジョン（ｏｏｌｙａｄｅｎｙｔａｔｉｏｎ）サイト、５Ｖ ４Ｑエンハンサ−及びＭＴ−Ｉ＋プロモータを包含する約６００ｂｐの成長ホル モン３″未關訳区域を包含する。

裏１丘ｌ ′ズミと　のアジプシン／　ＤをコードヒＤＮＡの全組換え蛋白質は選択手段と してのｐＳＶ−Ｎｅｏと共にＣＨＯ細胞内にネズミのアジプシン／′Ｄ発現ベク トルＯＬ。

ＥＮ：ＭｕＡｃｊ／Ｃをトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅ（ｊｉｎｇ）するこ とにより得られた。選択された細胞は高細胞カウント（ｃｏｕｎｔ）に培養され 、メタロチオネインプロモータは亜鉛イオンの追加により誘導された。

ＣＨＯ細胞内で生成されたネズミのアジプシン／Ｄ蛋白質は以下のごとくの調整 された媒体物から純化された。

３．５リツトルの調整された媒体物は摂氏４度で固体硫酸アンモニウムで５０％ 飽和にされ、９０分間６．５００９で回転させられた。浮揚物はチーズクロスで デカントされ固体硫酸アンモニウムで飽和状態にされた。その後６゜５００　ｇ にて２時間回転され、浮揚物は注意深く取り除かれた。赤い沈殿物は全体で６０ ｍ１．１００ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７，５内で再懸濁され、 その３×４リツトルに対して徹底透析された。

そのサンプルは微粒子を除去するために１５分間３．０００ｇで回転され、１０ ０ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　Ｓ、ＤＨ７，５で平衡された４０ｍ　 ｌコラムのＣｏｎＡセファローズ（Ｓｉ　ｇｍａ　）に適用された。そのコラム は７０−スルー（ｆ　ｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）（約２００ｍ１）内で検知されな い程度に緩衝材で洗浄する。そのコラムは１００ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔ ｒ　ｉｓ、ｐＨ７，５内で０．５Ｍアルファメチルマノシト（ｍｅｔｈｙｌｍａ ｎｎｏｓｉｄｅ）で溶離された。組換え蛋白質を包含する分留物は５ＤＳ−ＰＡ ＧＥで放棄され、シルバーステイニング（ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）で 可視化された。コレクト（ｃｏｒｒｅｃｔ）Ｍ、Ｗ、の蛋白質を包含している分 留物はプールされ、２０ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒ　ｆ　ｓ、ＤＨ７，５ で徹底透析すｔＬ　ｆ：。

透析された蛋白質は３．０００ｇで１５分間回転させられ、１ｍ１／分の流速で ウォーター（ｗａｔｅｒｓ）ＤＥ−４１８ＰＬＣコラムに適用された。コラムは ２０［ｎＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ７，５でＡ２８ｏ＜０． ０１まで洗浄された。その後コラムは０−３５％　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，５の直線的４０分勾配の１ｍｌ／分で溶離された。蛋白質 のピークは約１２−１６％高濃度塩溶媒で溶離する。

望ましい蛋白質内の分留物はＰＡＧＥにより決定された。

同様に、人の蛋白質配列ベクトルｐＬＥＮ：　ｔＢ３１／４０はｐＳＶ−Ｎｅｏ と共にＣＨＯにトランスフェクトされ、ＭＴ−１プロモータを活性化する条件下 で培養された。分泌された蛋白質はほぼ本明細書中のネズミにおける説明通りに 純化することができるが、レクチン親和コラムは人の蛋白質に対して不適当であ り、人の蛋白質はグリコシレージョンサイトを包含せず、レクチンに関して親和 性を与えるカルボヒトレートサイドチェイン（Ｓ　１ｄｅｃｈａｉｎｓ）を有し ない。よって、ＣｏｎＡコラムの代わりに人の蛋白質と免疫反応する抗体を使用 して親和コラムが使用可能になる。さらには、ニーマン　エム　ニー他の１９８ ４年版　バイオケミストリー　２３　：　２４８２−２４８６（ｓｕｐｒａ）記 載の人の補体りを純化するのに使用される方法が使用可能である。

バクテリア発現にはｂｏｂＣＡＴ：　ｈｇ３１／４０とｂｏ　ｂ　ＣＡ　Ｔ　： 　Ｍ　ｕ　Ａ　ｄ　／　ＤベクトルがＭＭ２９４細胞に変換され、ｔｒｐプロモ ータはＩＡＡの追加により誘導される。インクルージヨンボディ（ｉｎｃｌｕｓ ｉｏｎ　ｂ。

ｄｙ）は単離され、溶融蛋白質は標準技術を使用してインクルージヨンボディか ら単離される。

メ」１別」２ 菰生玖１炭 人のアジプシン／Ｄと免疫反応する抗体はうさぎの標準免疫プロトコールを使用 し、抗血清を回収することで生成できる。さらに、免疫動物からの抗体−分泌細 胞は組換えにより生成された人の蛋白質と免疫反応をする抗体用にスクリーンさ れるハイブリドマ（ｈｙｂｒ　ｉｄｏｍａｓ）を生成する溶融技術を使用してイ モータライズすることができる。人のアジプシン／Ｄと免疫反応する抗体は上述 のごとくにして、組換えにより生成されたネズミあるいは人のアジプシン／Ｃと の免疫作用あるいは人の蛋白質のある特定のフラグメントとの免疫作用により生 成され得る。

失１丘旦 血皇五寒 実施例３のごとくに生成された人のアジプシン／Ｄは静脈注入用５　ｍ　ｇ／　 ｍ　１の濃度でｐＨ７，４の生理塩水内で融解される。

裏ｌ史且 血パ中のアジプシンの゛定 アジプシン障害によるエネルギーバランスに問題があるされた組換えによって生 成された蛋白質を使用してコンペティション分析物によりこの蛋白質の存在確認 分析にかけられる。測定された量のラベルされた人のアジプシン／Ｄは実施例４ のごと（に生成された抗体で処理され、抗体−結合分留物は蛋白質Ａセファロー ズへの吸着により生成される。

浮遊物内に残る放射能レベルは血清内のアジプシンレベルと反対に変化する。絶 対量は標準曲線との比較で決定される。

裏ｌ叉り ねずみアジプシンの　Ｄ 補体りを似たネズミのアジプシンの能力は純化され程よく活性化されたＣ３（ア ルファサブユニット１２０ｋｄ１ベータサブユニツト８０ｋｄ）の存在下で、純 化された人のファクターＢ（９３ｋｃりがＢｂ（６３ｋｄ）とＢａ（３０ｋｄ） へ分裂するのをモニターしてインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）分析物内で試験さ れた。反応は３０ｕ１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，３，７５ｍＭ　ＮａＣ１１ １ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇＣ１２、摂氏３７度にて行われた。Ｉｏｎｇの補体ファクター Ｄあるいは不ズミアジプシンはテストサンプルに追加された。３ｕｌの各反応混 合物は１０％のポリアクリルアミド　ＳＤＳゲルに供給され、シルバースティン された。結果は第５表に示されている。Ｄあるいはアジプシンを添加し、Ｃ３の 存在下でＢはＢｂ及びＢａに分裂した。図表において、 レーン（ｌａｎｅ）１はサイズマーカー（ｓｉｚｅｍａｒｋｅｒｓ）を包含する 。

レーン２は１０ｎｑの組換え早ズミアジプシンを包含するが、量が少ないので可 視ではない。

レーン３は１１００ｎのファクターＤを包含する。

レーン４は１５０ｎｇのＣ３を包含する。

レーン５は１５０ｎｇのファクターＢを包含する。

レーン６はＣ３とファクターＢを包含する。

レーン７はファクターＢとＤを包含する。

レーン８はファクターＢとアジプシンを包含する。

レーン９はＣ３とＤを包含する。　“ レーン１０はＣ３とアジプシンを包含する。

レーン１１及び１２は３０分から２時間培養されたＣ３とＢとＤを包含する。

レーン１３及び１４は３０分から２時間培養されたＣ３とＢとアジプシンを包含 する。

ＣＴＣＡＧ（、Ｇ入入　ＡＣＡ　ＡＧＡ　ＧＡ（ＡｃＧ　ＴＧＧ　ＣＴＣＡＣＡ 　＾τＡ　ＡＡ？　ＧＣＡ　ＴＧＣ＾丁ＣＴＧ−硯、ｒ　ＪＶ慴ｌ Ａ丁Ｇ　ＧＣＧ　ＴＣＣＧＴＣｃＡＧ　ＣＴＣＡＡＩ：　ＧＧＣＧＣＧ　ＣＡｃ 　ＣＴＧ　ＴＧＣＧＣＡ　ＧＧＣＧＴＣＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧbＣ。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １。アジプシン及び補体Ｄ活性を有する人の蛋白質をコードする単離形態の組換 えＤＮＡ配列。 ２。前記蛋白質は、第３表において成熟した蛋白質をコードするものとして示さ れるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、あるいは自然発生的突然変異ＤＮ Ａ配列を有することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ配列。 ３。前記蛋白質と人為的に操作して結合させることができる前記人の蛋白質と固 有に関連するシグナル配列をコードする上流ＤＮＡ配列をさらに含むことを特徴 とする請求項１記載のＤＮＡ配列。 ４。前記シグナル配列が第３表のコドン−１からコドン−２４でなるコドンによ りコードされていることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ配列。 ５。組換え発現系であって、制御配列に人為的に操作して結合させることができ るアジプシンと補体Ｄ活性を有する人の蛋白質をコードするＤＮＡ配列からなり 、宿主細胞に変換されるときその発現系は前記蛋白質配列化ＤＮＡ配列の発現実 行を可能にすることを特徴とする組換え発現系。 ６。請求項５記載の発現系で変換される組換え宿主細胞。 ７。哺乳類である請求項６記載の組換え宿主細胞。 ８。酵母菌類である請求項６記載の組換え宿主細胞。 ９。バクテリア類である請求項６記載の組換え宿主細胞。 １０。人の蛋白質を生成する方法であって、蛋白質配列化ＤＮＡの発現のための 条件下で請求項６記載の細胞を培養することからなるアジプシンと補体Ｄ活性を 有し、前記細胞培養物から前記蛋白質を回収することを特徴とする人の蛋白質を 生成する方法。 １１。請求項１０記載の方法により生成されるアジプシンと補体Ｄ活性を有する 人の蛋白質。 １２。組換え発現系であって、制御配列と人為的に操作して結合させることがで きるアジプシンと補体Ｄ活性を有するネズミの蛋白質をコードするＤＮＡからな り、宿主細胞に変換されるとき前記発現系は前記蛋白質配列化ＤＮＡの発現実施 を可能とすることを特徴とする組換え発現系。 １３。請求項１２記載の発現系で変換された組換え宿主細胞。 １４。ネズミの蛋白質を生成する方法であって、前記蛋白質配列化ＤＮＡの発現 のための条件下で請求項１３記載の細胞を培養することからなるアジプシンと補 体Ｄ活性を有し、前記細胞培養物から前記蛋白質を回収することを特徴とするネ ズミの蛋白質を生成する方法。 １５。請求項１４記載の方法により生成されるアジプシンと補体Ｄ活性を有する ネズミの蛋白質。 １６。人における純粋なアジプシンと補体Ｄ活性を有する蛋白質。 １７。第４表におき成熟した蛋白質をコードするものとして示されるＤＮＡによ りコードされるアミノ酸配列、あるいは自然発生的突然変異ＤＮＡ配列を有する ことを特徴とする請求項１６記載の蛋白質。 １８。少なくとも１種類の薬学的に許容な結合剤との混合物において活性成分と して請求項１６記載の蛋白質からなることを特徴とする薬剤。 １９。静脈投与用に適応されていることを特徴とする請求項１８記載の薬剤。 ２０。皮下投与用に適応されていることを特徴とする請求項１８記載の薬剤。 ２１。筋肉投与用に適応されていることを特徴とする請求項１８記載の薬剤。 ２２。鼻内投与用に適応されていることを特徴とする請求項１８記載の薬剤。 ２３。請求項１６記載の蛋白質と免疫反応することを特徴とする抗体調合剤。 ２４。哺乳類対象においてアジプシンあるいは補体Ｄ欠陥を診断する方法であっ て、請求項２３記載の抗体と前記哺乳類対象のプラズマ、血清あるいは脂肪組織 を接触させ、前記血清あるいはプラズマとの前記抗体の結合を検知することから なることを特徴とする哺乳類対象においてアジプシンあるいは補体Ｄ欠陥を診断 する方法。 ２５。哺乳類対象においてアジプシン欠陥を治療する方法であって、そのような 治療を必要とする対象に対し請求項１６記載の蛋白質あるいは薬剤を投与するこ とからなることを特徴とする哺乳類対象においてアジプシン欠陥を治療する方法 。 ２６。前記哺乳類が人であることを特徴とする請求項２５記載の方法。 ２７。マクロファージにより溶解される悪性物に対し哺乳類を防御する方法であ って、そのような治療を必要とする対象に対し請求項１６記載の蛋白質あるいは 薬剤の適量を投与することからなることを特徴とするマクロファージにより溶解 される悪性物に対し哺乳類を防御する方法。 ２８。前記悪性物がバクテリア類、寄生虫類、ウイルス類及び悪性腫瘍組織から なるグループより選択されることを特徴とする請求項２７記載の方法。 ２９。前記哺乳類が人であることを特徴とする請求項２７記載の方法。 ３０。哺乳類対象において肥満を制御する方法であって、そのような治療を必要 とする対象に請求項１６記載の蛋白質あるいは薬剤の適量を投与することからな ることを特徴とする哺乳類対象において肥満を制御する方法。 ３１。前記哺乳類が人であることを特徴とする請求項３０記載の方法。 ３２。哺乳動物における肥満を制御する方法であって、そのような肥満の制御を 必要とする対象に対して別経路においての補体Ｄ活性の直接的あるいは間接的な 産物である蛋白質の適量を投与することからなることを特徴とする哺乳動物にお ける肥溝を制御する方法。 ３３。前記哺乳動物は人であることを特徴とする請求項３２記載の方法。 ３４。前記蛋白質はＣ３ａ、Ｃ５ａ及びＢａからなるグループより選択されるこ とを特徴とする請求項３２記載の方法。