JPH05503512A - 白血球接着阻害因子としての［ａｌａ ｉｌ―８］↓７↓７ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は白血球接着阻害因子として作用するポリペプチドの単離および特徴づけ 、抗炎症剤としてのそれらの使用、および白血球が媒介する血管内皮および／ま たは基礎組織の損傷が起こる臨床的指標のための治療薬としてのそれらの使用に 関する。 発明の背景 血管内皮細胞は急性および炎症性反応に関与する。この反応の著しい特徴は、末 梢血液からの好中球の選択的な初期流入である。循環および骨髄好中球は伝染性 物質に対して迅速に結集し活性化され細菌、ウィルスまたは他の侵入性寄生生物 などの外来性侵入物が皮膚または粘膜を透過すると、炎症反応が配備される。こ れは、周辺の血管の拡張、血管透過性の増大、単核細胞および好中球が血管壁を 通過して移動することなどを特徴とする。血管外遊出の第１段階には白血球と血 管内皮との接着相互作用が関与し、これは白血球が炎症部位のみに局在化するこ とを可能にするよう制御されていなければならない。 最近の研究によって、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（Ｔ　 Ｎ　Ｆ　）、グラム陰性菌内毒素（リボ多糖）などのいくつかの炎症性サイトカ インが血管内皮に対して試験管内で直接作用し、血液白血球および関連する白血 球細胞株（ＨＬ−６０およびＵ９３７）に対する内皮血液細胞の接着性を増大さ せることが立証されている。 ヒトおよび動物組織の研究は、同様の内皮活性化過程が生体内の種々の炎症性疾 患過程で起こることを示している。 内皮細胞または他の細胞に結合した後、好中球は数種の機構を通して損傷効果を 発揮し得る。刺激に対して好中球は毒性酸素代謝物、数多くのプロテアーゼ類、 およびホスホリパーゼ産物を生産し、放出するが、これらの物質はすべて血管運 動の変化、内皮損傷および血管統合性の損失をもたらし得る。好中球接着性の増 大は、好中球が媒介する損傷を導く一連の事象の重要な初期段階である。接着性 の増大は、内皮または他の細胞に対する好中球の接着および／または好中球凝集 をもたらす。 したがって白血球接着の阻害は潜在的に、炎症性疾患過程を治療的に干渉する際 に中心的な重要性を有する。白血球接着は通常は望ましいものであるが、器官移 植拒絶、組織移植体拒絶、アレルギー性反応、自己免疫疾患、リウマトイド関節 炎、敗血症性ショック、成人呼吸障害症候群（Ａ　ＲＤ　Ｓ　）、糸球体腎炎、 およびその他の組織または器官特異型急性および慢性炎症などを含む、免疫およ び非免疫炎症性疾患過程にも関与する。さらに虚血−再潅流の状況において、白 血球接着は微細血管閉塞、組織損傷および死をもたらし得る。 本発明は好中球機能の強力な変調因子である組成物に関する。これらの組成物は 、好中球が媒介する内皮および他の組織損傷における保護的薬剤としてのこれら の組成物の使用を支持する、重要な抗炎症特性を有している。 関連する技術の説明 この防御系に関する優れた総説が、１ｓｅｎ、　Ｈ，Ｗ、　、　Ｎ；Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌｏｇｙ。 第３版、　Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ（ １９！ＩＱ）、　２９０−２９５頁および３８１−４１８頁に記述されている。 ＳｃｈｍｉｄおよびＷｅｉｓｓｍａｎ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３９：２５０（ １９８７）は、スタフィロコッカル・エンテロトキシンＡによって末梢ヒト血液 白血球中に誘導される遺伝子に対応する２つのＣＤＮＡクローンのコード配列に ついて記述している。 ５ｔｒｅｉｔｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：１４６７（１９８９）は、ヒト 内皮細胞が単核細胞由来のＮ　ＣＦと分子的および物理的特徴が一致する好中球 走化性因子（ＮＣＦ）を分泌し得ることを開示している。 Ｖａｒａｎｉ等ルａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　５０：２０２（１９８ ８）は、腫瘍壊死因子によるラット肺動脈内皮細胞の予備処理が、直接的には細 胞毒ではないが、活性化したヒト好中球による致死に対するそれらの感受性を激 しく増大させることを示している。 Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ等、　Ｐｒｏｃ、　ｌ１ａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８”ｌ　：９２３３（１９８７）は、単核細胞由来の好中球走化性因 子（ＭＤＮＣＦ）の均一状態への精製を報告している。ＭＤＮＣＦは炎症性刺激 によって放出され、好中球を引き付ける選択的能力を有するが、単核細胞には作 用しない。 Ｌａｒｓｅｎ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：１４６４（１９８９）は、１９７８ 球走化性因子（ＴＣＰ）が、好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ−１）でもある好 中球走化性因子と生物学的および生化学的に同一であると思われることを報告し ている。 上記の文献のいくつかを含む一連の報文は、ＳｃｈｍｉｄおよびＷｅｉｓｓｍａ ｎか同定した上記の遺伝子（３１０Ｃ）からのポリペプチド産物について記述し ている（例えば、５ｔｒｅｉｔｅｒ等、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ等、およびＬａｒｓ ｅｎ等）。このポリペプチド産物の一次構造が同定された時、主要な分子種が、 セリン残基で始まる７２アミノ酸長であることがゎがった。一方、アラニン残基 で始まるＮＨ，末端が延長された７７残基型を含有する少量の分子種（本明細書 では以降、［ＡＩａ　ＩＬ−８］ｔ、と呼ぶ）が数例で存在することが示された 。この７２アミノ酸残基は数種の異なる名前で同定されたが、幾人かの研究者ら によって″インターロイキン８（ＩＬ−８）”と−１つ用語が適用されるように なった（Ｌａｒｓｅｎ等、前掲：５ｈｒｏｅｄｅｒ等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　５ｌ ｅｄ、　１７０：８４７（１９８’ｊ）　：Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ等。 Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４　：　１０４５（１９８９））。 （１）これまでに同定されたＪＬ−８の生物学的活性がすべて、このポリペプチ ドが炎症促進能力において機能することを示したこと、および（２）ＩＬ−８の 長鎖型（特に上記の７７残基型：Ａｌａ　ＩＬ−８ニア７）が、これまでに精製 されておらず、またその活性も明らかにされていないこと、は注目に値する。 発明の要約 好中球機能の強力な変調因子である新規ポリペプチド［＾１ａＩＬ−８］　、、 を提供する。このポリペプチドはインターロイキン−１（Ｉｎ。 −１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、または細菌内毒素（ＬＰＳ）で活性化された 内皮細胞によって分泌される。このポリペプチド因子およびこれに関連する組成 物は抗炎症薬としての用途を有する。本因子のアミノ酸配列およびヌクレオチド 配列ならびにその組換え生産法および医薬的使用法を提供する。 図面の説明 図１　：　：ＡＩａ　ＩＬ−８］７７（＊から始まる）およびＩＬ−８（矢印か ら始まる）をコードするヌクレオチド配列。 図２：炎症媒介物質（メディエータ−）を注射した皮肉部位への好中球の浸潤の ε、４１ａ　ＩＬＪ１７７による阻害（実施例１０を参照のこと）。 図３：ウサギ心筋虚血モデルにおける髄ベルオキシターゼ活性の１Ａｌａ　ＩＬ −８二、７による阻害。Ｌ、Ｖ、：左心室；Ａ、Ｒ，：危険状態、梗塞・梗塞さ れた領域。左右の欄はそれぞれ［Ａｌａ　ＩＬ−８３７７て処理した動物および 対照動物から得たデータを表している（実施例１１を参照のこと）。 図４　：　［Ａｌａ　ＩＬ−８］ｔ７（Ａ欄）またはｒＬ−８（Ｂ欄）によって 媒介される、Ｉ　Ｌ−１で活性化した内皮に対する好中球接着の阻害（実施例Ｉ ３を参照のこと）。 図５ニトロンビンおよびトリプシン（ｔ　ＰＡまたはウロキナーゼは作用しない ）による［Ａｌａ　ＩＬＪ］ｔ７の■Ｌ−８への変換。［Ａｌａ　ＩＬ−８コ、 ７の電気泳動移動度がトロンビンまたはトリプシン処理の後で増大していること に注意すること。プロテアーゼとのインキュベーションは３７°Ｃで３０分間行 った（実施例４を参照のこと）。 図６：好中球による”’　Ｉ　−［ＡＩａ　ＩＬ−８コ、７の内在化。ｌ！Ｓ　 ｌ　−［Ａｌａ　ＩＬ−８’７７（５ｎｇ／　ｍｌ）をヒト好中球（１０’好中 球／点）と共に３７°Ｃて種々の時間インキコベートした。次にＰＭＮを微量遠 心機中で沈降（２００Ｏｒｐｍ、２分間）させることによって結合培地を除去し 、ＯＩＭグリシン−ＨＣＩ（ｐＨ２，７）または培地中４℃で１０分間インキュ ベートした。ＰＮＭを微量遠心機で沈降させ（１３０００ＲＰＭ；３分間）、そ の酸性上清または培地を取り出した。酸性上清とペレット試料の両方に５ＤＳ− ＰＡＧＥ試料緩衝液を直ちに加えた。これらの試料に結合している放射活性をガ ンマ計数器で測定し、放射性標識されたタンパク質をＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ゲル電気泳動によって分割し、オートラジオグラフィーにかけた（Ｃ）。好中球 に結合した酸安定および金目Ｊ−Ｉ　Ｌ−８をインキュベーション時間の関数と してプロットした（Ａ）。好中球に結合した酸耐性ＩＬ−８を好中球に結合した 全［、−８に対する率（％）として表し、インキュベーション時間の関数として プロットした（Ｂ）。 図７　：　Ｍｏｎｏ　Ｓカチオン交換カラムによる［Ａｌａ　ＩＬ−８］ｙｔと ［Ｓｅｒ　ＩＬ−ｇＥ、、のクロマトグラフィー分割。非還元分画のＴｒｉｓ／ 　Ｔｒｉｃｉｎｅ’＋’　ル系中ての電気泳動は、ＪＡＩａ　ＩＬ−１１にｔ７ （分画３０〜３７のビー幻および、’Ｓｅｒ　ＩＬ−８］７ｔ（分画２７および ２Ｂのピーク）のクロマトグラフィー分割を示している（実施例３を参照のこと ）。 図８　：　ｇ、４１ａ　ＩＬ−８二ｔ７は、ＩＬ利で活性化された内皮に対する 好中球の接着を阻害するが、リンパ球または単核細胞の接着を阻害しない（実施 例１３を参照のこと）。 図９　二［ＡＩａ　ＩＬ−８１７７は、ＩＬ−１で４．２４、または４８時間刺 激したＨＥＣに対する好中球の接着を阻害する（実施例１３を参照のこと）。 図１０　：　（Ａ）Ｉ　Ｌ−１で活性化したＨＥＣで調整した培地由来の白血球 接着阻害因子（ＬＡＩ）活性の精製。Ｍｏｎｏ　Ｓカラム（５）がら集めた分画 を１＝８の最終希釈率で３回検定した（６）。破線はＮａＣ１４度勾配を示して いる。３回の代表的実験の１つ。（Ｂ）ＩＬ−１で活性化したＨＥＣへの好中球 の接着に対する、集めた分画２８〜３１の濃度依存的効果（平均値±ＳＤ、ｎ＝ ３）。２回の代表的実験の１つ。（Ｃ）集めた分画２８〜３１の銀染色ＳＤＳゲ ル（７）。（実施例１を参照のこと）。 図１１＝ブラウンリー（Ｂｒｏｗｎ　１ｅｅ）　ＲＰ　Ｃ−８逆相ＨＰＬＣカラ ムから溶出した、大腸菌で発現したＵＡｌａ　ＩＬ−８Ｊｔ７の光学密度２８０ 　ｎＭプロフィル（特性図）。最終精製段階　凹型アセトニトリル勾配プロフィ ルを示す。Ｙ軸：２８０ｎＭにおけるＯ、Ｄ、、Ｘ軸：分。（実施例５を参照の こと）。 図１２二大腸ｍ（黒丸）および哺乳類２９３細胞（白丸）中で発現した［Ａｌａ 　ＩＬＪ］７．（Ａ欄）およびＩＬ−８（Ｂ欄）の相対的ＬＡＩ活性。（実施ｆ ！ＡＪ５を参照のこと）。 特定の態様の説明 〔ＡＩａ　ＩＬ−１１１１ｔｔポリペプチド：供給源、単離および構造本発明の ポリペプチドはＩＬ−８のＮ〜末端延長型ならびにその誘導体および類縁体であ る。このポリペプチドを［Ａｌａ　ＩＬ−８］７７と命名した。このポリペプチ ドは活性化されたヒト内皮細胞から分泌される主要ＩＬ−８種として同定されて おり、そのような活性化培養から入手できる。具体的には、サイトカイン、イン ターロイキン−１（１Ｌ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および細菌内毒素 （ＬＰＳ）が培養ヒト内皮細胞（ＨＥ　Ｃ）に直接作用することによって、［Ａ Ｉａ　ＩＬ−８１９，の発現および分泌が誘導される。 ［Ａｌａ　ＩＬ４ｉ７７を生産するために、ヒト内皮細胞を栄養培地中で生育さ せ、適切な誘導物質で処理することができる。上記のように、これらの誘導物質 にはＩＬ−ＩＳＴＮＦ、ＬＰＳなどが含まれる。 充分な時間（通常８〜２４時開）誘導物質で処理した後、活性化したＨＥＣ単層 に対する好中球接着の阻害（白血球接着阻害（ＬＡＩ））を生物検定として用い る連続的なイオン交換および逆相高性能液体クロマトグラフィーによって、その ＨＥＣＩＩ製培地から［Ａｌａ　ＩＬ−８］７７を単離することができる。［Ａ ｌａ　ＩＬ−８］７ｔポリペプチドはクロマトグラフィーによって［Ｓｅｒ　Ｉ Ｌ−８］？−から分離することができる（図７）。 ［ＡＩａ　ＩＬ−８）ｔ７に対する［Ｓｅｔ　ＩＬ−８（ｔｙの比率は、これら のポリペプチドの培養供給源およびインキュベーション時間に依存して変化する 。 一般に［ｓｅｒ　ＩＬ−８］ｔｙは内皮細胞由来の物質から少量成分として検出 され、８時間調整培地から得た［ｓｅｒ　ｌ　Ｌ−ｇ１７　ｔ／　［Ａｌａ　Ｉ Ｌ−８］７７の約５％〜約１５％（通常的７％）、２４時間調整培地から得た場 合は約１０％〜約３０％（ｉ！！常約２０％）を構成する。対照的に、単核白血 球由来の物質、’Ｓｅｔ　１１．８ニアｚは主要型として検出され、一般にｌｌ ：ｓｅｒ　ＩＬ−８ｒ７２／　ＪＡＩａ　ＩＬ−８１７７ポリペプチドの約６０ ％〜１００％を占める。 組換え′ＬＡＩａ　ＩＬ−８ニア７は哺乳類細胞中で発現可能であり、天然の内 皮ｊＡｌａ　ｔＬ−８３ｔｒについて記述された方法で精製できる。さらに組換 え［Ａｌａ　ＩＬ−８］ｔ、を転換した細菌供給源、例えば大腸菌から得ること もできる。この場合、ユビキチンーメチオニルー［Ａｌａ　ＩＬ−８］、、融合 タンパク質をフードするプラスミドで大腸菌細胞をトランスフェクションし、こ の融合タンパク質を単離し、ＣＮＢｒ処理によって切断し、天然の［ＡＩａ　Ｉ Ｌ−８］７７を単離するために使用するイオン交換および逆相高性能液体クロマ トグラフィー操作と同様の操作によって［Ａｌａ　ＩＬ−４］　、□を精製する 。 本発明のポリペプチドは８〜１２キロダルトン（ｋＤ）（特にゲル電気泳動で決 定した場合は１０ｋＤ）の分子量を有することを特徴とする。［Ａｌａ　＋ｔ、 −ｇ］７ｔの配列を図１に示す。 天然の内皮由来ＩＬ−８のアミノ酸配列は、少なくとも口Ａｌａ　ＩＬ−８Ｘ、 ７およびＪＳｅｒ　Ｉｌ、　８Ｅ−の混合物であると同定されている。本発明は 、実質的にＪＳｅｒ　ＩＬ−８コ９．を含有しない精製ＪＡｌａ　ＩＬ−８］７ ？を提供する。治療的により優れた生産物を得るためにはこれらの分子のいずれ かの改変（修飾）体や誘導体が望ましいてあろうことは認められる。 これらの誘導体は、具体的には当該技術分野で既知の方法による「Ａｌａ　ＩＬ −８］７７ボリベブチドの改変体を包含する。 望ましい修飾は、その分子が白血球接着を阻害する能力を増大させ、生物学的半 減期を増大させ、炎症の部位にその活性を集中させるように作用し、および／ま たはその分子の望ましくない副作用を除去または軽減し得る。 ［Ａｌａ　ＩＬ−８］７７の特徴 本発明者らのインビトロ（試験管内）およびインビボ（生体内）研究は、ＩＡＩ ａ　ＩＬ　８］７７が、好中球の血管外遊出および好中球が媒介する組織損傷の 阻害剤としての用途を有することを示している。したがって、ウサギに静脈内ポ ーラス投与した［Ａｌａ　ＩＬ−８］ｔ７は、種々の炎症媒介物質のいずれかを 注射した皮肉部位に対する好中球の補充を減少させる（図２）。さらにウサギ心 筋虚血／再潅流モデルにおいて、［Ａｌａ　ＩＬ−８３７７を静脈内ポーラス投 与すると、患部組織中の梗塞サイズおよび髄ベルオキシターゼ活性か減少する（ 図３）。 本発明者らの実験は、Ｃ３ｅｒ　ＩＬ−８ｊ７２がＥＡＩａ　ＩＬ−８３７，よ り大きなインビトロ白血球接着阻害活性を有することを示している（図４）。し かし文献は［Ｓｅｒ　ＩＬ−８］７ｔが、ＩＬ−８の全身性投与を妨げ得る潜在 的に有害な活性（好中球の脱顆粒化およびスーパーオ牛シト生産を引き起こす活 性：　５ｈｒｏｅｄｅｒ等、　Ｊ、　Ｉｆｆｉｍｕｎｏｌ、　１３９：３４７３ （１９８７）　；　Ｐｅｖｅｒｉ等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６７：１ ５４７（１９８８））を有することを示している。しかし、［ＡＩａ　ＩＬ−８ ］、、は位置５および６にアルギニル−セリル残基を含有している。本発明者ら はトロンビンがこの位置で「ＡＩａ　ＩＬ−８］、、を効果的に切断して［Ｓｅ ｒ　ＩＬ〜８］７．を与えることを明らかにした（図５）。文献は、炎症を起こ した内皮か凝固促進特性を発揮することを示している。したかって、炎症を起こ した内皮と［ＡＩａ　ＩＬ−８］ｔ□との接触は、全身的な［Ｓｅｒ　ＩＬ−８ １７ｙへの暴露がもたらす望ましくない副作用を避ける一方で、目的の作用部位 （炎症部位）でより強力なＬＡＩであるＪＳｅｒ　ＩＬ−８，７，を潜在的に生 成させ得る。［ＡＩａ　ＩＬ−Ｂコ、７の改変型は、炎症部位でより活性な型に 変換される増大した能力を有し得る。 本発明者らのデータは、好中球の表面に結合した際に、電気泳動移動度からＩＬ −８であると甲われる、より低分子星の分子種にＥＡＩａ　ＩＬ−８］７７が変 換されることを明らかにしている（図６）。ＩＬ−８は好中球によって内在化さ れるが、［Ａｌａ　ＩＬＪ（７７は内在化されない（図６）。このことは、［Ａ Ｉａ　ＩＬ−８１，７が、内在化した［Ｓｅｒ　ＩＬ−８コ７．リガンド（配位 子）によって伝達される信号がもたらすいくつかの潜在的に有害な活性を切断前 には持たないであろうこと、および／または、切断までは、好中球が媒介するク リアランスに対して［ＡＩａ　ＩＬＪ］ｔｔが耐性であろうことを示唆している 。この点に関連して、［Ａｌａ　ＩＬ−８］７７のいくつかの切断不能型変異体 は、減少した望ましくない副作用または増大した循環半減期、あるいはその両者 を示し得る。 本発明は実質的に純粋なｆＡｌａ　＋ｔ、−ｇ１７７を規定する。実質的に純粋 な調製物を、主に［Ａｌａ　ＩＬ−８１，、ポリペプチドを含有し、５％より少 ない夾ＩＩＬ−８ポリペプチドを伴うものと定義する。 ［Ａｌａ　ＩＬ−８１７ｔは、Ｉ　Ｌ−１て活性化された内皮に対する好中球の 接着を、約０．３ｎ！以下で検出できる程度に減少させ、約１〜約３０Ｍで半最 犬に減少させ、約５〜約１０ｎＭで最大に減少させる（図４）。 さらに［Ａｌａ　＋ｔ、−ｇＬ７およびＩＬ−８は約ｌＯ〜約５０ｎＭで、好中 球が媒介する、サイトカインで活性化された内皮への損傷を阻害する（データは 示していない）。 上述のように、本発明のポリペプチドは治療薬として特有の用途を有する。本発 明のポリペプチドは、他の提案されている抗炎症剤に対して利点を有する。［Ａ Ｉａ　ＩＬＪ］−ｔおよびＩＬ−８は活性化された内皮に対する好中球の結合を 阻害するが、これらは内皮に対する他の白血球（例えば、単核細胞、リンパ球） の結合に影響を与えない（図８）。したがって、これらのポリペプチドを長期間 にわたって治療的に投与しても、免疫機能を損なうことはないであろう。さらに 、［Ａｌａ　ＩＬ−８〕ｔ７はサイトカインで活性化された内皮または炎症を起 こした内皮に対する好中球の接着を著しく減少させるが、非活性化内皮に対する 好中球の低基礎レベルの接着には影響を与えない（データは示していない）。即 ち、活性化された内皮か特異的に襟的にされるのに対して、好中球と内皮の正常 な相互作用が妨害されるという証拠はない。 ｊ：Ａｌａ　ＩＬ−８Ｉ７７またはＩＬ−８の白血球接着阻害作用は、特定の接 着受容体の発現に依存しない（実施例１３および図９を参照のこと）。 このことは、これまでに潜在的な抗炎症剤として提案されてきた種々の抗接着受 容体モノクローナル抗体と全く対照的である。したがって、時間の経過に沿って （例えば急性炎症が慢性段階に進行するとき）異なる型の内皮細胞受容体が好中 球接着を媒介するので、ＩＬ−８ポリペプチドはより効果的な阻害剤である。 本発明のポリペプチドは、成人呼吸障害症候群、敗血症性ショック、脈管炎、心 臓および他の生命維持に必須の器官における虚血再潅流損傷、および血管内皮ま たは他の組織に対する白血球（好中球）依存性の損傷が起こる他の炎症性疾患過 程の治療に有用であり得る。 これらは心臓発作の治療、具体的には心臓発作後に好中球が媒介する損傷から心 筋を保護するための特有の用途を有し得る。 ＥＳｅｒ　ＩＬ−８１ｔｔの用途 上記のように、過去に［Ｓｅｒ　ＩＬ−８ｉｔｔは炎症を促進すると同定されて いた。具体的には、単核細胞由来の好中球走化性因子（ＭＤＮＣＦ）は炎症性刺 激によって放出され、好中球を引き付ける選択的能力を有するが、単核細胞には 作用しないので、この因子は白血球特異的炎症応答の潜在的媒介物質であると報 告されていた。（ＹｏＳｈｉｍｕｒａ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：９２３３−９２３７（１９８７）を参照のこ と）。 この因子について報告されたアミノ酸配列は本質的にＥＳｅｒ　ＩＬ−８コｔｔ と同じである。しかし、白血球接着阻害活性が精製されたこの分子に起因すると 考えられたことはなかった。したがって本発明は、抗炎症剤としての、ならびに 、白血球が媒介する血管内皮または池のｌ１ｆｌ織の損傷か起こる臨床的指環の ための治療薬としての、精製した、あるいは組換え一５ｅｒ　ＩＬ−８１ｔｔま たはその誘導体の使用を包含する。 上記のように、［Ｓｅｒ　ＩＬ−８］ｙ＊は［Ａｌａ　ＩＬ−８１７７よりも大 きいインビトロ白血球接着阻害活性を有する。実際、相対的活性を比較すると、 活性化された内皮に対する好中球接着を阻害することに関して、［Ｓｅｒ　ＩＬ −８３２，はＥＡＩａ　１１．、−ｇ２，７よりも約１０倍活性であることがわ かる。 したがって、：Ｓｅｒ　ＩＬ−８］ｔｚは強力な白血球接着阻害剤が必要である ところ（例えば炎症の特定の部位、あるいは器官または組織移植の部位）に使用 することができる。 同時係属出願：出願番号０７／２３２２４（１９８８年８月１５日出願）および 出願番号０７／４４２７８６（１９８９年１１月２９日出願）は、内皮由来の白 血球接着阻害因子＜ＬＡＩＤＣ後に出願した出願において内皮由来のＩＬ−８と 命名された）を開示している。内皮由来のＩＬ−８は［ＡＩａ　１１．−８７． □および［Ｓｅｒ　ＩＬ−８：Ｌｘポリペプチドの混合物からなる。実質的に純 粋な構成成分の単離は本発明まで不可能であった。 天然内皮由来ＩＬ−８の調製物は、サイトカインで活性化された内皮培養物に対 する単核細胞および好中球の接着を両方とも阻害するが、組換えヒト［ＡＩａ　 ＩＬ−８］、ｔおよび［Ｓｅｒ　ＩＬ−８］ｔ２分子は単核細胞またはリンパ球 の接着を阻害しない。これは、組換え分子の高度に選択的な活性か好中球接着に 限定されていることを示唆している。 したかって、本発明の組換えポリペプチドは高選択的治療薬として示される。即 ち、本発明の組換えポリペプチドは好中球依存性の炎症過程および／または好中 球が媒介する組織損傷において特有の用途を有する。 以下に議論する３Ｓｅｒ　ＩＬ−８３７７ポリペプチドの改変（修飾）法、変異 法、生産法および投与法か’、Ｓｅｒ　ＩＬ−ｇ３？ｊに適用できることは認め られる。 ［Ｓｅｒ　ＩＬ−８］７＊および［Ａｌａ　ＩＬ−８］？？ポリペプチドは共に 、好中球が媒介する損傷からの保護を提供する。この保護作用が単に接着阻害そ のものだけの表現ではないであろうことを注記する。したがって、本発明は特定 の機構による制約を受けない。 Ｄ　Ｎ　Ａの特徴づけ 本発明のポリペプチドのヌクレオチド配列を単離するためにはいくつかの方法が 利用可能である。アミノ酸配列が既知であるから、対応するＤ　Ｎ　Ａ配列を単 離するためのゲノムライブラリーのスクリーニングに使用するために、Ｄ　Ｎ　 Ａプローブをそのアミノ酸配列をもとにして構築することができる。同じＤＮＡ プローブを、後述の実験項に明示するように、血液リンパ球ｃＤＮＡライブラリ ー、具体的にはホルボールエステルで誘導したヒト末梢血液リンパ球ｃＤ　。 ＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することもできる。別法とし て、ＤＮＡ断片を適切な発現ベクター中に挿入し、白血球接着および阻害活性を 検定することもてきる。さらに、図１のＤＮＡ配列を用いて、［Ａｌａ　ＩＬ− ８Ｆ７７をコードする遺伝子またはｃＤＮＡの存在を検出するためのプローブを 作成することもできる。このプローブは、図１中の約１２〜１００個の連続した ヌクレオチドを含有し得る。このプローブは１４〜５０ヌクレオチドを含有する ことがより好ましく、最もこのましくは１６〜４ｏヌクレオチドを含有する。 Ｍｅｓｓｉｎｇ等（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８１）　９：３０９） の方法を用いるＤＮＡ配列分析によって、Ｉ　Ｌ−８ポリペプチドをフードする ヌクレオチド配列が明らかになった（図１）。 このヌクレオチド配列が削除、付加または変異によって変更を受け得ることは認 められる。したがってこのＤＮＡ配列の誘導体は、その配列が［Ａｌａ　ＩＬ− ８３７ｔの白血球接着阻害活性を伴うポリペプチドをコードする限り本発明に包 含される。 タンパク質の修飾 １、［Ａｌａ　ＩＬ−８］７７とは、図１のアミノ酸配列を有するもともとヒト 内皮細胞由来のポリペプチドならびに天然の［Ａｌａ　ＩＬ−８１７７に対応す る生物学的活性を有するその類縁体および変種である。この用語は、内皮細胞に 対する白血球の接着を阻害するか、もしくは好中球が媒介する損傷から内皮細胞 を保護する、［Ｓｅｒ　ＩＬ−８］、ｔまたはその変種のＮ−末端延長型を包含 する。 より具体的には、［ＡＩａ　ＩＬ４］ｔ７の類縁体または変種という用語を、天 然の［Ａｌａ　ＩＬ−８，−，７のアミノ酸配列または他の性質が共有結合的に 、あるいは非共有結合的に修飾（改変）されている分子と定義する。したかって 、変種は（β−メルカプトエタノールやジチオスレイトールなどの還元剤の非存 在下で実施する５ＤＳ−ＰＡＧＥで決定した場合に）約１０ｋＤの分子量を有し てもよいし、有さなくてもよい。 アミノ酸配列変種には、図１の配列の対立遺伝子的関連体のみならず、その予め 決定された変異体も含まれる。一般にアミノ酸配列変種は、図１の天然の−Ａｌ ａ　ＩＬ−８３７ｔのアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％の相同性を有 し、より典型的には少なくとも約９０％の相同性を有する。これ以降ＪＡｌａ　 ＩＬ−８］７７という用語は、他のものが適切でない限り、その天然の配列また は変種型のどちらかを意味する。 したがって、図１に記載したヒ）　［Ａｌａ　ＩＬ−８］７７アミノ酸配列を有 する［Ａｌａ　ＩＬ−８］７ｔ、ウシ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネズミ、ネ コ［Ａｌａ　ＩＬ−８］７７などの他の種由来の類似の［Ａｌａ　ＩＬ−８］７ ｔタンパク質、およびこれらの［Ａｌａ　ＩＬ−８Ｊｔ７分子の生物学的に活性 なアミノ酸配列変種（アレル、およびその生物学的活性を示すインビトロで作成 された［Ａｌａ　ＩＬ−８″、、７タンパク質の共有結合誘導体を含む）は本発 明の範囲に包含される。 ｇＡＩａ　ＩＬ−８コ、７の修飾（改変）　：　［Ａｌａ　ＩＬ−１？７の誘導 体およびアミノ酸配列変種は、本明細書の他の項に説明する治療的用途に関連す るその生物学的活性ゆえに、ならびに抗＝Ａｌａ　ＩＬ−８Ｌ７抗体に結合する その能力ゆえに、有用である。後者の特徴を有する誘導体および変種は、その誘 導体および変種がその治療的生物学的活性を維持しているか否かにかかわらず、 抗体を精製する際に有用であり、あるいは標識した場合は、ｒＡｌａ　＋ｔ、− ａ］ｔ７の免疫検定における試薬として有用である。［Ａｌａ　ＩＬＪ］ｔｔに 対して特異的であるが、［Ｓｅｒ　ＩＬ−８］ｔｔに対する親和性を有さない抗 体は、これらの関連ポリペプチドを区別および／または分離するために便利に使 用できる。 生化学的科学分野で知られている方法によって［Ａｌａ　ＩＬＪ］ｔ７を検出可 能な標識で標識することができる。想定される検出可能な標識には、放射性同位 体、酵素、発蛍光団、安定遊離基および金属イオンが含まれる。 ａ、共有結合修飾 ［Ａｌａ　＋ｔ、Ｊ７１分子の共有結合修飾は本発明の範囲に包含される。 約７７残基までを有する変種：ＡＩａ　ＩＬ−８］７７断片はインビトロ合成に よって便利に製造できる。このような修飾は、精製したタンパク質または粗タン パク質の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖または末端残基と反応し得る有機誘 導体化試薬と反応させることによって、その分子中に導入できる。得られた共有 結合誘導体は、生物学的活性にとって重要な残基の同定を目指す計画において有 用である。 最も一般的にはンステイニル残基をクロロ酢酸またはクロロアセタミドなどのα −ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させることによって、カルボ キシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。またシステイニル残基 は、プロモトリフルオロアセトン、α−プロモーβ−（５−イミドジイル）プロ ピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２ −ピリジル・ジスルフィド、メチル・２−ピリジル・ジスルフィド、ｐ−クロロ メルクリベンゾエート、２−クロロノルクリ−４−ニトロフエ／−ル、またはク ロロ−７−ニドロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても 誘導体化される。 ヒスチジル残基は、ｐ　Ｈ５，５〜７．０におけるジエチルピロカ−ボネートと の反応によって誘導体化する。なぜならこの試薬はヒスチジル側鎖に対して比較 的特異的たからである。ｐ−ブロモフェナシル・プロミドも有用であり、この反 応は０．ＩＭカコジル酸ナトリウム中ｐＨ６，０で行うことが好ましい。 リンニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸無水物または池のカルボン酸無 水物と反応させる。これらの試薬による誘導体化は、リンニル残基の電荷を反転 させる効果を有する。α−アミノを含有する残基を誘導体化するための他の適切 な試薬には、ピコリンイミド酸メチルなとのイミドエステル類、ビリドキサルリ ン酸、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、０ −メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびトランスアミナーゼが触媒 するグリオキシレートとの反応が含まれる。 アルギニル残基は１または数種の従来試薬との反応ｊこよって修飾される。これ らの試薬には、フェニルグリオキサール、２．３−ブタンジオン、１．２−シク ロヘキサンジオン、およびニンヒドリンか含まれる。アルギニン残基の誘導体化 は、グアニジン官能基のｐＫ６が高いので、その反応をアルカリ性条件下で実行 する必要がある。 さらに、これらの試薬はアルギニンのε−アミ７基と同様に、リジンの基とも反 応し得る。 チロシル残基の特異的修飾は、チロシル残基中に分光測定標識を導入する特別な 目的で、芳香族ンア゛ノニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によっ て実行できる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロ メタンが、それぞれ０−アセチルチロノル種および３−ニトロ誘導体の形成に用 いられる。放射性免疫検定に用いるための標識タンパク質を調製するためには、 １！５■または＋３１　■を用いてチロシル残基をヨウ素化する。この場合上述 のクロラミンＴ法が適している。 カルボ牛シル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロへ牛／ル ー３−（２−モルホルニルー（４−エチル）カルボジイミドまたはｌ−エチル− ３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボ ジイミド類（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾される。 さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によ って、アスパラ牛ニルおよびグルタミル残基に変換される。 二官能性試薬による誘導体化は、抗［Ａｌａ　ＩＬ−８″Ｊ７７抗体を精製する ための方法に使用する非水溶性支持マトリックスまたは表面に二ＡｌａＩＬ−８ Ｉ、、を架橋するた妙に有用である。一般的に使用される架橋試薬には、例えば １，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類（例えば４−アジドサリチル酸とのエ ステル）、ジスクシンイミジルエステル類を含むホモ二官能性イミドエステル類 （例：３．３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオ不一ト））、およびビ ス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド類が含まれる 。メチル−３−Ｃ（ｐ−アジドフェニル）ジチオコプロビオイミデートなどの誘 導体化試薬は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化中間体を与える。別法と して、米国特許第３９６９２８７号、同第３６９１０１６号、同第４１９５１２ ８号、同第４２４７６４２号、同第４２２９５３７号、および同第４３３０４４ ０号に記述されている反応性基質と、臭化／アン活性化炭化水素などの活性な非 水溶性マトリ。 クスを、タンパク質の固定化に使用する。 グルタミニルおよびアスパラギニル残基はしばしば対応するグルタミルおよびア スパルチル残基に脱アミド化される。あるいはこれらの残基を温和な酸性条件下 で悦アミド化する。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲に包含される。 他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニ ル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側 鎖のα−アミ７基のメチル化（Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔ ｉｅｓ、　（Ｗ、■、　Ｆｒｅｅ■ ａｎ　＆　Ｃｏ、、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、　７９−８６頁（１９８３ 乃、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびある場合には、Ｃ−末端カルボキシル 基のアミド化が含まれる。 ｂ、ＤＮＡの変異 ：Ａｌａ　ＩＬ−８］ｔ、のアミノ酸配列変種を、図１に示したＤＮＡに変異を 導入することによって製造することもできる。このような変種には、例えば、図 １に示したアミノ酸配列かるの欠失（削除）、図１に示したアミノ酸配列内での 残基の挿入または置換が含まれる。最終構築物が望ましい活性を有する限り、削 除、挿入および置換のとのような組み合わせを用いて最終構築物を作成してもよ い。当然、変種をコードするＤＮＡ中に導入される変異は、その配列を読み枠外 に置いてはならず、また二次ＲＮ　Ａ構造をもたらすかも知れない相Ｗ！４領域 を生み出さないことが好ましい（Ｅ　Ｐ　７５４４４　Ａを参照のこと）。 （以下余白） 遺伝子レベルでは、通常はニＡ］ａ　ＩＬ−ｇ二？７をコードするＤＮＡ中のヌ クレオチドの部位特異的変異によって変種をコードするＤＮＡを作成しいその後 そのＤＮＡを組換え細胞培養中で発現させることによって、これらの変種を製造 する。変種は典型的には天然の類縁体と同質の生物学的活性を示す。 アミノ酸配列を導入する部位は予め決定するが、変異そのものを予め決定する必 要はない。例えばある部位における変異の成果を最適化するために、標的コドン または領域で無作為変異法を実行し、発現した［Ａｌａ、　ＩＬＪ］７．変種を 目的の活性の最適な組み合わせに関してスクリーニングすることができる。既知 の配列を有するＤＮＡ中の予め決定した部位に置換変異を導入するための技術は よく知られており、例えば部位特異的変異導入法である。 本発明に従う１Ａｌａ　ＩＬ−８］７７変種の製造を、既に調製した変種または このタンパク質の非変異型をコードするＤＮＡの部位特異的変異導入によって達 成することが好ましい。部位特異的変異導入法は、欠失接合部を横切ってその両 側で安定な二本鎖を形成するに足る充分な大きさと配列を有するプライマー配列 を得るために充分な数の隣接ヌクレオチドと共に目的の変異のＤＮＡ配列をコー ドする特殊なオリゴヌクレオチド配列を使用することによって、コＡＩａ　ＩＬ −８１ｔ□変種の生産を可能にする。典型的には、プライマーは、変更する配列 の接合部の両側に約５〜１０残基を有する約２０〜２５ヌクレオチド長であるこ とが好ましい。一般に部位特異的変異導入法の技術は、Ａｄｅｌｍａｎ等、　Ｄ ＮＡ、　２：ｔ８３（１９８３）（この資料の開示は本明細書の一部を構成する ）などの刊行物によって例示されるように、当該技術分野でよく知られている。 理解されるであろうが、部位特異的変異導入技術は典型的には、−不備および二 本鎖型の両形態で存在するファージベクターを使用する。部位特異的変異導入法 に有用な代表的なベクターには、例えばＭｅｓｓｉｎｇ等、Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅ ｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａ ｎｄＲｅｃｏｍｂｉｎａｔ　ＤＮＡ、　Ａ、　ＷａｌｔｏｎＷ、　Ｅｌｓｅｖｉ ｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８１）（この資料の開示は本明細書の一部を 構成する）か開示しているＭ１３ファージなどのベクターが含まれる。これらの ファージは市販されており、その使用は当業者一般によく知ちれている。別法と して、−不備ファー／複製起点を含有するブラスミトヘクター（Ｖｅｉｒａ等、 　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ。 １、　、１５３：３（１９８７））を使用して一本鎖ＤＮＡを得ることもてきる 。 一般に、本発明に従う部位特異的変異導入は、まず課題のタンパク質をコードす るＤＮＡ配列をその配り１１内に含有する一不備ヘクターを得ることによって行 う。目的の変異配列を保持するヌクレオチドブライマーを、一般に合成的に、例 えばＣｒｅａ等、　Ｐｒｏｃ、　＋１ａｔ１．＾ｃａｄＳｃｉ、（ＵＳＡ）　７ ５：５７６５（１９７８）の方法によって調製する。次にこのプライマーを一不 備タンパク質配列含有ベクターとアニーリングさせ、大腸菌ポリメラーゼＩクレ ノー断片などのＤＮＡ重合酵素を作用させることによって変異保持鎖の合成を完 結させる。したがって、１本の鎖が元来の非変異配列をコードし、第２の鎖が目 的の変異を有するヘテロ二本鎖が形成される。次にこのヘテロ二本鎖ベクターを 用いてＪＭＩ　０１細胞などの適切な細胞を形質転換し、変異配列配置を保持す る組換えベクターを含有するクローンを選択する。 このようなりローンを選択した後、変異したタンパク質領域を取り出し、タンパ ク質生産に適したベクター（一般的に適切な宿主の形質転換に使用し得る型の発 現ベクター）中に入れることができる。 Ｃ変異の型 アミノ酸配列欠失（削除）は一般に約１〜３０残基にわたり、より好ましくは１ 〜１０残基、典型的には連続的である。「Ａｌａ　ｒＬ−８］７７ノ変異は、そ のＮ−末端中あるいはこのポリペプチドの［Ｓｅｔ　ＩＬ−８］７、部分に存在 することができる。 アミノ酸配列挿入には、１残基から本質的に無制限の長さのポリペプチドまでの アミノ末：４Ａ融合および／またはカルボ牛シル末端融合、および１または複数 アミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入（即ち、成！ＡＵＡＩａ　Ｉ Ｌ−８Ｊ、□配列内への挿入）は一般に約１〜１０残基におよび、より好ましく は１〜５、最も好ましくは１〜３である。末端挿入の例には、成熟ｇＡＩａ　Ｉ Ｌ−Ｂ″Ｊ？？の組換え宿主からの分泌を促進するための、［ＡＩａ　ｌｔ、− ｇニア７分子のＮ−末端に対する異種Ｎ−末末端ダグナル配列融合が含まれる。 第３の変種群は、ＩＡＩａ　ＩＬ−８１７７分子中の少なくとも１つ（好ましく は１つたけ）のアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されてい る変種である。トロンビンによるタンパク加水分解に対する耐性を「Ａｌａ　Ｉ Ｌ〜８］７．に付与し、それによってより安定なＵＡｌａ　ＩＬ−８，１７を類 縁体を作成するために、アルギニン５および／またはセリン６を他のアミノ酸で 置換することは、その−例である。ＩＡＩａＩＬ−８Ｌ７のアルギニン５をトロ ンビンまたは他のプロテアーゼによる切断に対して感受性でない別のアミノ酸で 置換すると、得られるポリペプチドは［Ｓｅｒ　ＩＬ−８］、ｔに対する拮抗剤 （アンタゴニスト）として適している。アルギニン５を置換するためにはどのア ミノ酸を用いてもよい。しかしそのアミノ酸側鎖に正電荷を持たないものが好ま しい。［ＡＩａ　ＩＬ−８］７７分子の特徴を精密に変動させることを望む場合 は、次の表１に従ってこのような置換を行うことが好ましい。 （以下余白） Ａｌａ（Ａ）　ｇｌｙ；ｓｅｒ Ａｒｇ（Ｒ）　１ｙｓ Ａｓｎ（Ｎ）　ｇｌｎ；ｈｉｓ Ｇｉｎ（Ｑ）　ａｓｎ Ｇｌｕｔ：Ｅ）　ａｓｐ Ｇｌｙ（Ｇ）　ａｌａ；ｐｒ。 Ｈｉｓ（Ｈ）　ａｓｎ；ｇｉｎ　 Ｌｙｓ（Ｋ）　ａｒｇ；ｇｌｎ；ｇｌｕ？＼／丁ｅｔ（Ｍ）　ｌｅｕ；　ｔｙｒ ；　ｉ　ＩｅＰｈｅ（Ｆ）　ｍｅｔ；Ｉｅｕ；ｔｙｒＴｙｒ（Ｙ）　ｔｒｐ；ｐ ｈｅ Ｖａ　Ｉ（Ｖ）　ｉ　ｌｅ　：　ｌｅｕ機能または免疫学的同一性の本質的な変 化は、表１の置換より保存性の少ない置換を選択することによって、即ち、（ａ ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造（例えばンートまたはラセン立体配座） 、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（Ｃ）側鎖の嵩高 さ、の維持に対する効果かより有意に異なる残基を選択することによって起こる 。一般的にｔＡＩａ　ＩＬ−Ｊ７ｔの性質に最も大きな変化をもたらすと考えら れる置換は次の置換であろう　（ａ）グリノンおよび／またはプロリン（Ｐ）を 別のアミノ酸で置換するか、もしくは削除するか、あるいは挿入する。（ｂ）親 水性残基（例　セリルまたはスレオニル）で（を）疎水性残基（例、ロイノル、 イソロインル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）を（で）置換する。 （Ｃ）システィン残基で（を）他の残基を（で）置換する；（ｄ）正荷電側鎖を 有する残基（例：リジル、アルギニルまたはヒスチジル）で（を）負荷電残基（ 例：グルタミルまたはアスパルチル）を（で）置換する；もしくは、（ｅ）嵩高 い側鎖を有する残基（例：フェニルアラニン）で（を）そのような側鎖をもたな い残基（例ニゲリシン）を（で）置換する。 はとんどの削除、挿入、そして特に置換は、［Ａｌａ　ＩＬ−８］７７分子の性 質に極端な変化をもたらさないと予期される。しかし置換、削除または挿入を行 う前にその正確な効果を予測することが困難な場合、その効果が定型のスクリー ニング法で評価されることを当業者は理解するであろう。例えば典型的な場合、 天然のＣＡＩａ　ＩＬ−８３ｔ、コード核酸への部位特異的変異導入、組換え細 胞培養中でのその変種核酸の発現、および任、意に、例えば（少なくとも１つの 残存免疫エピトープにその変種を結合させることによってその変種を吸収するた めの）ウサキ・ポリクローナル抗［Ａｌａ　ＩＬ−８ｊ、７カラムでの免疫アフ ィニティー吸着によるか、もしくはその変種の活性の生物検定による、その細胞 培養からの精製によって変種を製造する。 ［Ａｌａ　ＩＬ　８Ｅｒ７は二量体に会合し得るので（Ｃ１ｏｒｅ等、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１ｇ９［１７（１９ｇ９乃、ｌまたは両方の サブユニ、トが変種であるヘテロニ量体およびホモ二量体を提供することは本発 明の範囲に包含される。両サブユニットが変種である場合、アミノ酸配列中の変 化は各サブユニット鎖に関して同じであってもよいし、異なっていてもよい。ヘ テロニ量体は、両サブユニットをコードするＤＮＡで宿主細胞を同時形質転換し 、必要ならば目的のへテロニ量体を精製するか、あるいは各サブユニ９．トを別 個に合成し、それらを（例えば、尿素、塩酸グアニジンなどのカオトロピック試 薬ての処理によって）解離させ、解離したサブユニットを混合し、次いでカオト ロピ、り試薬を透析除去することによってサブユニットを再会合させることによ って、容易に生産できる。 次に、細胞溶解液または精製した’−Ａｌａ　ＩＬ−８］７７変種の活性を、目 的の特徴に適したスクリーニング検定法でスクリーニングする。例えばある抗体 に対する親和性などのＪＡｌａ　ＩＬ−８］？７分子の免疫学的特徴の変化を、 競争型免疫検定法で測定する。候補変異体による抗炎症活性また炎症促進活性の 増大または抑制に関する変化を、適切な検定法で測定する。酸化還元安定性、熱 安定性、疎水性、タンパク加水分解減成に対する感受性、担体との会合傾向、あ るいは多量体への会合傾向などのタンパク質の性質の変化は、当業者によく知ら れた方法で検定する。 ３、［Ａｌａ　ＩＬ−８］？、の発現および製剤化本ポリペプチドは、適切な発 現ベクター（例えばｐＢＲ３２２またはその銹導体ｐＲＫ５）中に、対応するＤ ＮＡを挿入することによって組換え的に生産できる。プラスミドｐＲＫ５につい ては欧州特許公開番号０３０’？　２４７に詳細に議論されている。得られたプ ラスミドを用いて、原核または真核の細胞培養をトランスフェクションする。真 咳細抱の１例はヒト２９３細泡である。発現のための原核細胞の１例は大腸菌で ある。トランスフェクション法にはカル／ラム沈殿法または池の当該技術分野で 既知の利用可能な方法か含まれる。 天然または組換えＩＡｌａ　ＩＬ−８Ｌ７７の好ましい単離法では、カルホ牛ジ メチルセルロールまたはセファロース、ファスト・フローＳ−セファロースある いはＭｏｎｏ　Ｓ（ファルマシア）などの樹脂を用いるカチオン・イオン交換ク ロマトグラフィーを使用する。［ＡＩａ　＋ｔ、−ｇ］ｔＪたは［Ｓｅｒ　ＩＬ −８］、ｔのクロマトグラフィーは、８より高いｐＨで、より好ましくは８５よ り高いｐＨで実行する。 ［Ａｌａ　ＩＬ−８］？？または［Ａｌａ　ＩＬＪコ７．の好ましい製造法では 、メチオニンを接合部としてアミ／末端にユビキチンを融合したアミ／末端融合 タンパク質を使用する。この融合タンパク質をコードするＤＮＡを組換え発現系 に用いる。ユビキチンの分離は臭化シアンを用いて実行する。 本発明の化合物がインビボまたはインビトロの両方で、種々の方法で使用できる ことは認められる。抗体は米国特許第４５７１１６号およびこれに引用された文 献に記述されている方法なとの従来法で製造できる。 医薬的に有用な組成物を調製するための既知の方法に従って、本発明のポリペプ チドを医薬的組成物中に製剤化することができる。 この方法で、ポリペプチドを医薬的に許容される担体賦形剤との混合物中に混合 する。適切な賦形剤およびその製剤は、他のヒトタンパク質（例、ヒト血清アル ブミン）を含めて、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ（第１６版、　０ｓｏｌ、＾、　ｆｉ、　Ｍａｃｋ、　Ｅ ａｓｔｏｎ、　Ｐ＾（１９８０））に記述されている。効果的な投与に適した医 薬的に許容される組成物を形成するために、これらの組成物は治療的に有効な鳳 （炎症を減少させる量、または白血球接着を阻害する鳳）の本発明のポリペプチ ドを、適量の担体賦形剤と共に含有するであろう。白血球接着阻害量および炎症 減少量はインビボ薬理研究およびインビトロ細胞接着検定によって決定できる。 本ポリペプチドを、静脈内投与に適した治療用滅菌医薬組成物として製剤化する ことができる。この製品は、適切な担体または希釈の添加によって再構成して使 用するための凍結乾燥形態でもよいし、あるいは水性溶液の形態でもよい。 本発明に従って凍結乾燥製品を再構成するために、生理的状態を近似するために 一般に知られている物質を含有していてもよい滅菌希釈剤を使用することができ る。この方法で、滅菌希釈剤は生理学的に許容されるｐＨにするための緩衝化試 薬（例えば塩化ナトリウム、食塩水、リン酸緩衝化食塩水）および／または他の 生理学的に許容され（および／または）使用に際し安全な物質を含有し得る。 水性溶液として使用する場合、本医薬組成物はそのほとんどが、凍結乾燥製品の 再構成に関して上述したものと同じ物質の多くを含有するであろう。 本発明の方法に有用なポリペプチドを、例えば注射用滅菌懸濁剤、あるいは特定 の組織部位に誘導するための、炎症関連細胞表面構造に対する抗体を伴う封入剤 などの形態で使用することができる。例えばＢｅｖｉｌａｃｑｕａ等、　ＰＮＡ Ｓ　ＵＳＡ　８４：９２３Ｂ−９２４２（１９８７）　：　Ｃｏｔｒａｎ等、　 Ｊ、　ＥｘｐＷｅｄ、　１６４：６６１−６６６（１９８６）などを全類のこと 。本ポリペプチドを炎症部位（例えば炎症を起こした関節、炎症の特異的部位） に直接注射するか、あるいは組織移植の周辺領域中に直接注射することもできる 。 （１）アスピリン、アセトアミ／フェン、イブプロフェンまたはグルココルチコ イドなどの抗炎症性化合物：（２）腫瘍壊死因子、変態成長因子−β、インター フェロンα、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、あるいはＩＣＡＭ またはＥＬＡＭなどの免疫系細胞に認められる表面受容体またはそのリガンドに 対する抗体などの免疫抑制化合物；（３ン組織ブラスミ／−ゲン活性化因子、ウ ロキナーゼまたはエミナーゼなどの血栓溶解性化合物；あるいは、（４）ヘパリ ンおよびアルガトロバンなどの抗血栓化合物；と組み合わせて［Ａｌａ　ＩＬ− ８］ｔ７を使用することができる。 本発明のポリペプチドを抗炎症剤として受容者に投与する場合、例えば局部的に 、動脈内に、腹腔内に、静脈内に、胸膜内に、眼内に注射によって、皮下に、な どの方法で投与できる。注射による投与には、連続的注入および単一または複数 のポーラスが含まれる。 本発明のポリペプチドの投与量は投与法、他の活性化合物の同時使用、受容者の 大きさ、炎症の型と広がりなどに伴って変化するであろう。一般的には、約１ｎ Ｍ〜約１０ｎＭ、Ｍ通は約５ｎＭの血゛中ポリペプチド有効Ｊｌｌｆｆｉを得る のに充分な投与量で本ボッペプチドを投与するであろう。目的の血中濃度を得る のに必要なポリペプチドの投与量は薬物動態学的研究によって決定できる。 作用の持続時間を制御するために、追加の医薬的方法を使用することができる。 制御された放出調製物は、本ポリペプチドを錯化するかあるいは吸収するための ポリマーを使用することによって達成できる。制御された送達は、適切な巨大分 子（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ポリピロリドン、エチレ ンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、あるい は硫酸プロタミン）、巨大分子の適切な濃度、および組み込み法を選択すること によって達成できる。この方法で、ポリペプチドの放出か制御できる。 制御された放出調製物による作用の持続時間を制御するのに有用な考え得るもう １つの方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロケル、ボワ（乳酸）、また はエチレンビニルアセテート共重合体の粒子中に本ポリペプチドを組み込むこと である。 別法として、本ポリペプチドをポリマー粒子中に組み込む代わりに、これらの物 質を、例えばコアセルベーンコン技術または界面重合によって調製したマイクロ カプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイク ロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイ ド薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、 ナノ粒子およびナノカプセル）、あるいはマクロエマルジョン中ニ取す込むこと できる。このような技術はＲｅ寵ｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。 以下の実施例は例示のために記載するのであって、限定を意図しない。 実施例 天然の内皮ＬＡ　Ｉ　（［ＡＩａ　Ｉ　Ｌ−８］７．及びＬ　Ｌ−８の混合物） の精製 インスリン、トランスフェリン、セレニウム（ＩＴＳ、１ｚＱ／Ｑ、Ｃｏ１１ａ ｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ＭＡ　ケンブリッジ）を含有する血清 不含のＲＰＭ１１６４０中、ヒト謄静脈内皮細胞Ｕｌｌｈｅｅｌｅｒ、　Ｍ、　 Ｅ、らのＪ。 ｈＩＬ−１β（５−１０Ｕ／ｘ（１）と共にインキュベートし、ＬＡＩ活性を生 じさせた。調整培地を無菌状態でウェットアイス上に採取し、遠心により清澄化 し、−７０℃で保存した。解凍し、０．２−０゜５９、トルの試料をトリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ３，０に調節し、続いて４℃において３０ｋＤ及び５ｋ ＤのＹＭ膜ｌＡｍ１ｃｏｎ　Ｉｎｃ。 ＭＡ　デンバースコに通して限外濾過した。ＹＭ−５２１Ｉ縮した（５０Ｘ）保 持液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（ｐＨ３，０）中のＴＦＡに対してスピン透析（ｓｐｉ ｎ−ｄｉａｌｙｚｅ）　Ｌ、凍結乾燥し、陰イオン交換カラム平衡化緩衝液（１ ０ＩＩＩＭトリスーＣＣ，６Ｍ尿素、００１％Ｔｗｅｅｎ　８０．　ｐＨ８０） 中に溶解し、Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５／　５カラムで分離した。非結合物中に回収 されたＩＡｌａ　ＩＬ　８二ｔｔ活性をセントリコン１０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ 　１（１）限外濾過二、袖１ｃｏｎ３により濃縮し、それを陽イオン交換緩衝液 （２５ｍＭ酢酸ナトリウム、６Ｍ尿素、０．０１％Ｔ　ｗｅｅｎｓｏＳｐＨｓ、 Ｏ）で希釈し、Ｍ’ｏｎｏ　Ｓ　ＨＲ５／　５カラムで分離した。平衡化緩衝液 中、ＮａＣＱの３段階直線勾配（グラジエン）　）（０１５Ｍ　ＮａＣＱで５分 、０．５Ｍ　ＮａＣ（で４０分、ＩＭＮａＣ（で５０分：流速０．　５ｚＱ１分 ）により、結合タンパク質を溶出させた。ランアルブミンを含有するＲＰＭＩ（ ０，４ｘｇ／ｘＱ、ＣｏｈｎＦｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ）に対してスピン透析するこ とにより、カラム画分（２ｚｔ２）をバイオアッセイのために準備した。２４時 間調整培地を上記と同様に処理するに当たり、ＹＭ−３０濾過及び凍結乾燥は省 き、ＭｏｎＯ８平衡化緩衝液には０．１５Ｍ　ＮａＣｅを加えて行った。改変内 皮白血球接着検定を使用し、活性を定量したＪＢｅｖｉｌａｃｑｕａ、　Ｍ、　 Ｐ、らのＪ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：２００３（１９８５）　 ；　Ｂｅｖｉ　Ｉａｃｑｕａ、　Ｍ、　Ｐ、らのＰｒｏｃ、　Ｎａ狽■ Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ＾、　８４　：９２３８（１９８７）　： 　Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、　Ｍ、　Ｐ、の５ｃｉｅｎｃｅ　Q４３： １１６０（１９８９）（。 ＋Ｌ−１処理Ｈ処理油ＥＣ活性て隠された白血球接着阻害活性は、高いイオン強 度における〜１ｏｎｏ　Ｓ　陽イオン交換カラムから溶出された小さなタンパク 質ピークと同時分画された（図１０Ａ）。最大活性を示す画分プール（２８−３ １）は、濃度依存的にＩＬ−１活性化ＨＥＣへの好中球接着を阻害した。ゲル電 気泳動により分析すると（図１０　Ｃ：　Ｓｃｈａｇｇｅｒ及びｖｏｎ　Ｊａｇ ｏｖのＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅａ、１６６：３６２１（１９８７）に記載のよう にして行う１２％アクリルアミドゲル中の非還元試料）、この部分精製物質は顕 著な１０ｋＤタンパク質を含有していた。 ０、　１　Ｍ　Ｑｕａｄｒｏｌ（ｐＨ１０，０）、フェニルインチオシアネート ［Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ］及びＴ　Ｆ　Ａ　［Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｗｓ］を試薬として使用し、Ｅｄｍａｎ及びＢｅｇｇのＥ ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１：１ｌｌＯ（１９６Ｑに記載の操作の改変 法により、プールしたピーク画分を５３サイクルのＮＨ２−末端配列決定操作に 付した。試料を溶液中の逆相配列決定用カラムに適用し、配列決定を行う前に水 て洗１争した。次いで、この逆相カートリノンを基本型の気−液相配列決定装置 ＪＥＰ−２５７７３５二に適用した。各サイクルから得た２−アニリノ−５−チ ア゛／すノンをＨａｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉ　Ｏ９０Ｌ　液体クロマト グラフィーにより同定するため、それをフェニルチオヒダントイン誘導体に変換 した。主要な（〉９０％）配列は次のようであった　ＮＨ，−ＡＶＬＰＲ５ＡＫ ＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦ　ＩＫＥＬＲＶ　ｒＥｓＧＰＨＣＡＮＴ Ｅ　Ｉ　ＩＶＫＬｓＤＧＲＥｏこれは当該タンパク質の完全なアミノ酸配列を示 すものでなかった。質量スペクトル分析により、完全なタンパク質は［Ａｌａ　 Ｉ　Ｌ−８］、、と同一であることが判明した（データは示していない）［ここ に、アミノ酸残基の１文字略語は次の意味を有する：　Ａ、Ａｌａ；　Ｃ，Ｃｙ ｓ：　Ｄ、Ａｓｐ；　Ｅ、Ｇｌｕ；　Ｆ。 Ｐｈｅ；Ｇ、Ｇｌｙ：　Ｈ，Ｈｉｓ：　１．ｒｌｅ；に、Ｌｙｓ；　Ｌ、Ｌｅｕ ：Ｖｉ。 Ｍｅｔ；　Ｎ、Ａｓｎ；　Ｐ、Ｐｒｏ：　Ｑ、Ｇｉｎ：　Ｒ，Ａｒｇ；　Ｓ、Ｓ ｅｒ；　Ｔ。 Ｔｈｒ；Ｖ、　Ｖａｌ：Ｗ、　Ｔｒｐ；及びＹ、　Ｔｙｒｊこれは、活性化Ｔ細 胞及び単球から分泌される７２アミノ酸の好中球活性化ポリペプチドであるイン ターロイキン−８（Ｉ　Ｌ−８）の配列と殆どが同一である二Ｙｏｓｈｉｍｕｒ ａ、　Ｔ、らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕター ロイキン−８（Ｉ　Ｌ−８）ｊ　ＥＬａｒｓｅｎ、Ｃ，Ｇらの５ｃｉｅｎｃｅ　 ２４３：１４６４（１９８９）（なる用語は、刺激ヒト末梢血リンパ球及び単球 から産生されるポリペプチドを意味し、これは従来、好中球活性化ペプチド−１ （ＮＡＰ−１）［Ｌａｒｓｅｎ、Ｃ，Ｇ、らの前掲］、好中球化学走性因子（Ｎ ＣＦ　）［Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、　ＴらのＪ、　Ｉａｍｕｎｏｌ、　１３９ニア ８８（１９８７）］、単球−誘導化好中球化学定性因子（ＭＤ　Ｎ　ＣＦ　）ｆ Ｙｏｓｈｒｍｕｒａ、　Ｔ、らのＰｒｏｃ、　Ｍａｔ　１．　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　、　ｔｌＳ、　Ａ、　８４：９２３３（１９１！７）Ｆ、好中球活性 因子（Ｎ　Ａ　Ｆ　）［Ｐｅｖｅｒｉ、　ＰらのＪ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　 １６７：１５４７（１９８８）　；　Ｌｉｎｄｌｅｙ、　Ｉ　らのＰｒｏｃ、　 ！ｌａｔ　１．　ＡｃａпA　Ｓ ｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８５：９１９９（１９８江、ならびに単球−誘 導化及びリンパ球−誘導化好中球−活性ペプチド（ＭＯＮＡ　Ｐ／ＬＹＮＡ　Ｐ ）ＪＳｈｒｏｅｄｅｒ、Ｊ、Ｍし、本明細書においてＸＡ］ａ　ＩＬ　８ｐｔ７ と呼んている主要な内皮誘導化ポリペプチドかそのＮＨ，末端にペンタペプチド ＡＶＬＰＲ伸長を有していることに基づけば、これは単核白血球誘導化ＩＬ〜８ の主要な型１７０−１００％（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、　Ｔ、らのＰｒｏｃ、　Ｎ ａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓ；　Ｇｒｅｇｏｒｙ、　Ｈ，らのＢｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１５１　：８８３（１９８８）） ］とは異なっている。内皮細胞誘導化物質はＩ　Ｌ−８を微量成分として含有し ていた［８時間調整培地中、７％；２４時間調整培地中、２０％：それぞれ３つ の調製物］。 内皮ＬＡＩ／Ｉ　Ｌ−８の最終的精製を、水中０．　１％のＴＦＡで平衡化させ たＡ　ｑｕａｐｏｒｅ（Ｃ−８）ＲＰ　−３００ガードカラムの逆相ＨＰＬＣに より行った。０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルの直線０−６０％グラジ ェントで展開した（流速０．　５ｘρ／分）。内皮ＬＡＩ／ＩＬ−８型が約３５ ％アセトニトリル中に溶出された。 バイオアッセイ、Ｎ　Ｈを−末端配列決定、及び定量アミノ酸分析に先立ち、精 製した１０ｋＤタンパク質を凍結乾燥した。 得られた１ＯｋＤタンパク質は、ＩＬ−１活性化ＨＥＣに認められる増幅した（ ２０−６２倍）好中球接着を強力に阻害し、そのＥＣ５ｏは０．　５−１．　０ ｎＭ　（閾値：＜Ｑ、３ｎＭ、最大阻害範囲３−３−３０ｎであった。高い濃度 （＞５０ｎＭ）では阻害活性か減少することが認められた。サイトカイン活性化 ＨＥＣ単層で観察される顕著な阻害（８０％まで）とは対照的に、非活性化単層 に対する非刺激好中球の接着（「基礎接着Δ、６１±２６好中球／１１１″、平 均±ＳＤ、４つの実験）は、この精製タンパク質によっては有意に減少されず、 非常に高い濃度において増大された（１００ｎＭ、２．５倍；５００ｎＭ、５倍 ）。 実施例２ 哺乳動物細胞における組換え：Ａｌａ　Ｉ　Ｌ　８］？？の発現ＩＬ〜８のＮＨ ，−末端アミノ酸配列に基づく合成りＮＡオリゴヌクレオチドプローブを使用す るスクリーニングにより、［ＡＩａｌＬ−ａ：、、／Ｔ　Ｌ−ｓの相補ＤＮＡを ホルボールエステル誘発ヒト末梢血白血球のｃＤＮＡライブラリー二Ｇｒａｙら のＮａｔｕｒｅ　３１２ニア２１（１９８４）二カラ単離した。Ｉ　Ｌ−８の全 暗号領域をまたぐ８００ｂｐ　Ｈｐａｌｌ−Ｎｈｅｌ断片を、哺乳動物発現ベク ターｐＲＫＳ内におけるＣＩａＩ及びＸｂａ１部位間であり、かつサイトメガロ ウィルスプロモーターの下流にある多重クローニング領域に挿入した。得られた プラスミドｐＲＫ、ｈｇ、８ｋを使用し、ＣａＰＯ−／ＤＮＡＤＮＡ沈降ウニト ２９３細胞をトランスフェクトした（プラスミドＤＮＡ　１０μｇ／１００ｙ培 養皿）。７２時間後に調整培地を採取し、遠心して細胞残１［［去し、次いでＳ −セファロースのクロマトグラフィーヲ行った。 実施例３ ＪＡＩａ　ＩＬ　８］？？及びＩ　Ｌ−８の分離ＩＬ−８含有プラスミドでトラ ンスフェクトしたヒト２９３細胞は、［Ａ　ｌａ　Ｉ　Ｌ　８　］７？及びＩ　 Ｌ−８の両者を分泌した。以下の操作にて説明するように、培地中に分泌される ２つの変異体の相対量はそれぞれ８０％及び２０％であった。この２つの型は、 １６％アクリルアミド　トリス／トリノン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）−緩衝化ゲル／ス テムを使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分割することができた。［ＡＩ’ａｒ ｔ、−ａ２７７及びＩＬ−８にそれぞれ相当する上方及び下方のタンパク質バン ドの同定は、インモビロン（１＋ｎｍｏｂｉｌｏｎ）膜にエレクトロプロットし た材料をＮ−末端配列決定することにより行った。長い型の付加的なアルキニン 残基により、２つの変異体間にはｐＦの若干の相違が生じる（［Ａｌａ　ＴＬ　 ８］７？のｐｌ＝９．５４に対し、■Ｌ−８のｐ＋＝９．３４）。このことから 、両者は塩基性ｐＨにおける陽イオン交換クロマトグラフィーによって分割でき るのではないかと考えられた。 ｐＲＫ５−Ｉ　Ｌ−８でトランスフェクトした２９３細胞から得た７２時間調整 培地を遠心により清澄化し、２５ｍＭ酢酸ナトｌ）ラム、６Ｍ尿素、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０．ｐＨ５，０に調節した。得られた培地を、２５ｍＭ酢酸ナトリ ウム、Ｏ，ｌ　５Ｍ　ＮａＣＱ、６Ｍ尿素、０．０１％Ｔｖｅｅｎ８０、ｐＨ５ ，０で平衡化したＳ−セファロースＱｚＱ上に適用した。結合タンパク質を直線 ０．１５Ｍ　ＩＭＮａＣＱグラジェント１００ｉ０．て溶出した。１６％アクル アミドゲル中の非還元試料を、トリス／トリ７ン　システム３Ａｎａ１．　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　１８６：３６ｇ（１９８７）ｒで電気泳動した。Ｉ　Ｌ−８種を 含有するカラム画分（３１１２）をプールした。セントリコン１ｏ限外濾過ユニ ツト［Ａｍ１ｃｏｎｉにより、得られたタンパク質を濃縮し、その緩衝液を陽イ オン交換平衡化緩衝液（１０ｍＭ　トリスＣσ、４Ｎ・丁尿素、０．０１％Ｔ　 ｗｅｅｎ　８０、ｐＨ８，７）と交換した。その試料をＭｏｎｏ　Ｓ　ＨＲ５１ ５カラムに適用し、結合タンパク質を平衡化緩衝液中０．５Ｍ　ＮａＣＱの直線 グラジェント（０，１４Ｍ　ＮａＣＱまで、１０分）で溶出し、次いて０．１４ ＭＮａＣＱで４０分間アイソクラティック溶出した（０５　ｚＱ／分）。［Ａｌ ａ　ＩＬ−８］７７を含有する画分（０，５ｍ１２）をプールし、タンパク質濃 縮のためにセントリコン１０限外濾過ユニツト［へｍ１ｃｏｎコを使用し、緩衝 液をＰＢＳ＋０．０４％ＲＩＡ−ＢＳＡと交換してバイオアッセイ用に調製した 。’Ａｈａ　ＩＬ−８］７７か豊富なカラム画分（０，５ｚのにＭｏｎｏ　Ｓ工 程の操作を繰り返すと共に、実施例４に記載しているトロンビン開裂によりＩ　 Ｌ−８豊富な画分を純粋なＩ　Ｌ　−８に変換した。 図７は、ＪＡｌａ　ＩＬ−８１７７とＩ　Ｌ−８とか分離されたことを示してい る。ｊＡｌａ　ＩＬ　８Ｊ７７における１Ｌ−８の混在は、Ｎ−末端配列決定文 び質量スペクトル分析により２％以下であることが示された。従って、本実施例 のクロマトグラフィ一工程は、夾雑ｊＬ−８を除去してＥＡ　ｌａ　Ｉ　Ｌ　− ８１７ｔを精製するための簡便かつ効率的な方法である。 実権例４ ［、Ａｌａ　ｒｔ、ｓコｔｔからＩＬ−８へのタンパク質分解的変換ＩＡＩａ　 Ｉ　Ｌ　８］？？ポリペプチドは、Ａｒｇ−特異的なプロテアーゼについての開 裂部位となり得るアルギニン−セリン配列を５位及び６位に有している。従って 、本発明者らは、精製［Ａｌａ　Ｉ　Ｌ　８３７７をトリプシン、トロンビン、 ウロキナーゼ又は組織型プラスミノーケンアクチベータ−（ｔ−ＰＡ）のいずれ かと共に３７℃で３０分間インキュベートした。トロンビンでの処理により、ｒ ＡＩａ　ＩＬ−８］７７がＳＤＳゲル上でＩＬ−８と同時に移動する型に変換さ れた（図５）。Ｎ−末端配列決定を行い、この低分子層フは実際にＩＬ−８であ ることを確認した。トロンビンと同様に、トリプシンもまた、ｇＡＩａ　ＴＬ− ８１７７をＩ　Ｌ−８と同時移動する型に変換した。これらとは対、照的に、ウ ロキナーゼ及びｔ−ＰＡは２００ｎＭ用量でさえも、：ＡＩａ　ＩＬ−８１７７ の検出可能な開裂を引き起ごさなかった（図５）。トロンビンの濃度を２００ｎ Ｍにまで上昇させた場合てさえも、トロンビンがＡｒｇ５と５ｅｒ６との間以外 の他の部位で［ＡＩａ　ＩＬ　−８Ｊ、、を開裂している形跡は何ら見いだされ なかった。しかし、２００ｎＭのトリプシンでは、［ＡｌａｌＬ〜８］７７が多 重開裂した産物群に変換された。 ［Ａｌａ　ＩＬ−８］７？を含有する調製物からＩＬ−８を単離するため、Ｍｏ ｎｏ　Ｓ　セントリコン１０限外ａｉ５ユニツト［Ａｍ１ｃｏｎ］を使用し、Ｉ 　Ｌ−８が豊富なＭｏｎｏ　Ｓ　画分を濃縮し、その緩衝液を、１ｍＭＣａＣ（ １−を含有するＰＢＳと交換した。得られた試料を２００ｎＭ　トロンビン［Ｃ ａｌｂｉｏｃｈｅｍ３の存在下に３７℃で１時間インキユベートシ、陽イオン交 換平衡化緩衝液中で１：４に希釈し、実施例３に記載している：ｖ１ｏｎｏ　Ｓ 　クロマトグラフィ一工程を行った。得られたＩ　Ｌ−８画分（０，５ｘＱ）を プールし、セントリフン１０限外濾過ユニツト「八ｍ１ｃｏｎＦで濃縮し、ＰＢ Ｓ＋０．０４％Ｒｒｌ−ＢＳＡに溶媒交換してバイオアッセイ用に調製した。溶 媒交換した後、■Ｌ−８Ｊ縮物を競合ＲＩＡにより測定した。 このように、この方法を使用すれば、２つの型のｒＬ−８の混合物を純粋なＩ　 Ｌ−８に変換することができる。 実施例５ ［Ａｌａ　ＩＬ−８］７．の細菌発現 ユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）−メチオニル−［ＡｌａＩＬ−８コ、７融合 タンパク質を発現させた後、その融合タンパク質を精製し、ＣＮＢｒ開裂により ［Ａｌａ　Ｉ　Ｌ−８］７７を遊離させ、次いてＥＡｌａｌＬ−８］７７を精製 することにより、生物学的に活性な組換えＥＡＩａ　ＩＬ−８；７□をＥ、ｃｏ ｌｉ　（大腸菌）において生産した。 Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉはユビキチンーＣＡｌａｌＬ８曇、７融合タンパク質を大量 に発現するか、［Ａｌａ　ＩＬ　８］、ｔｔは僅かしか発現しないことば圧目に 値する。この発現法は、種々のタイプの細菌細胞における［ＡｌａｌＬ８ｊ７７ の発現に適用することができる。 ）酸配列から推定した合成りＮＡ断片ＶＬＲＧＧＭＡＶＬＰＲ８ＡＫＥＬＲＣＱ ＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦ　ｒ　ＫＥＬＲＶ　Ｉ　ＥＳＧＰＨＣＡＮＴＥ　Ｉ 　Ｔ　ＶＫＬ］を挿入することにより、ユピキチン［ＡｌａＩＬ−８］７．融合 タンパク質をコードするＤＮＡを構築した。オリゴヌクレオチドの合成は、Ｆｒ ｏｅｂＩｅｒ、　Ｂ、　Ｃ，、Ｎｇ、　Ｐ、　Ｇ、及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ。 Ｍ、ＤのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１４．５３９９−５４０７（１ ９８６）、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、　Ｃ及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、　Ｄ のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２７，４６９−４７２（１９８６ ）に記載のようにして行った。５０−６０残基に伸びる６個のオリゴヌクレオナ ト（各３０ｎｇ）をリン酸化し、５０ｍＭ　トリス−ＨＣＱｐＨ８，Ｏｌｌ　０ ＋ｅＭ　ＭｇＣＣ−，０，５ｍＭ　ＡＴＰ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０ 単位、及びＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ１０００単位を含有する単一の反応混合 物中てそれろを相互に連結した。得られ：’二Ｄ　Ｎ　Ａ二重体（ＤＮＡ　ｄｕ ｐｌｅｘ）を５ａｃＵ’ｌびＨｉｎｄＩ［ｌて消化し、６％ポリアクリルアミド ゲル中で分画した。１５０塩基対の断片に相当するＤＮＡを切り出し、電気、容 土（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅ）　した。溶出されたＤ　Ｎ　Ａをクロロホルム で抽出し、エタノールで／ｉ′殿させ、それを、既に記載されているものＪｎｉ ｌｌｅｒ、　Ｈ，１，、Ｈｅｎｚｅｌ、　Ｌ　Ｊ、、［ｉｉｄｇｗａｙ、　Ｊ、 　ＢＳＫｕａｎｇ、　Ｌ　Ｊ。 、Ｃｈｉｓｈｏｌｍ、Ｖ、、及びＬｉｕ、　Ｃ，Ｃ，のＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　７，６９８−７０４（１９８６）、Ｌｉ　ｕ、　Ｃ，Ｃ，、Ｍｉｌｌｅ ｒ、　Ｈ，１，、Ｋｏｈｒ、　Ｌ　Ｊ、及びＳｉ　１ｂｅｒ、　Ｊ、　ｌのＪ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ（１９８９）発行中コと同様の５ａｃＵ及びＨｉｎｄｌ ＩＩ開裂したユビキチン融合タンパク質発現プラスミドと連結した。５８６塩基 対のＨｉｎｄＩＩ［−ＨｌｎｄｌＩ［断片（プラスミドｐＲＫ　３−１０Ｃ由来 ）を先に構築したプラスミドから得たＨｉｎｄＩＩＩ開裂ＤＮＡ中に挿入するこ とにより、［Ａｌａｌｌ−８］、７タンパク質の残りの暗号領域を完全にした。 ジデオキシヌクレオチドＤＮＡ配列決定分析により、その融合タンパク質をフー ドしているＤＮＡ配列を確認した。この融合タンパク質の発現は、大腸菌のｔｒ ｐオペロン由来のプロモーターによる制御下にあｊり、インドールアクリル酸の 添加によって誘発させることがてきる二Ｋｌｅｉｄ、Ｄ、、　Ｙａｎｓｕｒａ、 Ｄ、、　Ｓｍａｌｌ、Ｂ６．　Ｄｏｗｂｅｎｋｏ、Ｄ、、　Ｍｏｏｒｅ、Ｄ、Ｍ 、、　Ｇｒｕｂｍｅｎ、Ｎ１．、　ＭｃＫｅｒｃｈｅｒ、Ｐ、Ｄ、、　Ｍｏｒｇ ａｎ、Ｄ、Ｏ，、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｂ、Ｈ，及びＢａｃｈｒａｃｈ、　Ｈ， Ｌ、の５ｃｉｅｎｃｅ　２１４．１１２５−１１２４１（１！１８１）Ｅ。 上記プラスミドでトランスフェクトした大腸菌から融合タンパク質を精製するた め、沈降させて洗浄した大腸菌ペーストを細胞溶解緩衝液（２５０１Ｍ酢酸ナト リウム、５０ｍＭＮａＣｌ２．２５＠ＭＥＤＴＡ、１．Ｃ１＋Ｍ　ＰＭＳＦ、ｐ Ｈ５，７）２リツトル中に再懸濁した。 微小流動化装置（ａｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）中、４５ｐｓｉで細胞を破壊 し、細胞溶解緩衝液が６Ｍ尿素、ｏ、０１％Ｔｖｅｅｎ８０を含有するように調 節した。この混合物を、先に調節した細胞溶解緩衝液で平衡化させたファスト・ フローＳ−セファロースカラムに適用した。この緩衝液でカラムを洗浄し、次い で０．２Ｍ　ＮａＣＱに調節したその緩衝液で洗浄した後、直線ＮａＣＱグラジ エン）（ＮａＣＣ濃度は０゜２Ｍから０．５Ｍに増大）２リツトルを用いて結合 タンパク質を溶出させた。主要なＬ８ｋＤａタンパク質を含有するピーク画分を 新たなＰＭＳＦ中１ｓＭに調整し、”２０Ｋ　ＭＷＣＯ’サルトリウム（Ｓａｒ ｔｏｒｉｕｓ）膜ユニ、トでの限外濾過により濃縮した。（この段階での回収率 は〉９０％と算定された）濃縮し、部分精製した融合タンパク質を５０１＋１Ｍ 　）リスｃ（！（ｐＨ８，０）（５°Ｃ）ニ対して透析し、３０００Ｇ、５分間 の遠心により清澄化させ、次いでＡｍ１ｃｏｎ　１０　ｋＤａ分子量排除Ｃｅｎ ｔｒｉｐｒｅｌ）ユニットにより濃縮した。得られた物質を（：　Ｎ　Ｂ　ｒ開 裂するまで一７０℃で保存した。 融合タンパク質（２０＋ｇ／　１　ｘＱ）を暗所で１２時間、７０％ギ酸中、メ チオニン１残基当たり１００倍過剰モルのＣＮＢｒを使用してインキュベートし 、それを開裂させた。その反応溶液を凍結乾燥し、Ｍｏｎｏ　Ｓ　平衡化緩衝ｔ Ｉ（１０ｍＭ　）リスＣ（！、６Ｍ尿素、００１％Ｔｗｅｅｎ８０．５０ｍＭ　 ＮａＣＱ、ｐＨ８，７）中に再懸濁し、Ｍｏｎｏ　Ｓ　カラムに適用した。多段 階グラジェント（ＮａＣ＆Ｊ度は５０ＩＩＩＭから０．４Ｍに増大）を使用し、 ｊＡｌａ　ＩＬ　８Ｊ？？ポリペプチドを溶出させた。 ＬＡｌａ　ＩＬ　８Ｊ７？を含有する画分は、上記のようにしてトリス／トリノ ンゲルを使用して検出し、それをセントリコン１０フイルターを使用して濃縮し 、０１％ＴＦＡで平衡化したＢｒｏｗｎｌｅｅ　ＲＰＣ−８逆相ＨＰＬＣカラム に注入した。そのカラムを、アセトニトリル中０．　１％ＴＦＡを使用するくぼ みグラジェント（ｃｏｎｃａｖｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）を展開させて溶出した。 図１１には、このカラムから溶出する［Ａｌａ　ＩＬ　８］７７の光学密度のプ ロフィル（２８０ｎ口）を示している。純粋な［ＡＩａ　ＩＬ　８］？？を含有 する画分をプールし、凍結乾燥し、水に再溶解し、再度凍結乾燥し、−７０℃で 保存した。 銀染色分析法による５ＤＳ−ＰＡＧＥ、２８０μｍにおけるＨＰＬ％の純度であ ることを示した。カブトガニ遁走細胞の細胞溶解検定によって測定すると、この プロトコールによりエンドトキシン（内毒素）を含んでいない謂！ｉｌ物が得ら れたＪＬｅｖｉｎ及びＢａｎｇのＴｈｒｏｍｂ、　Ｄｉ換え：、ＡｌａｌＬ−Ｆ 、ヮについて既述している操作に実質的に従い、この組換え１−ＡｌａｌＬ−８ 二、７をトロンビン処理すれば、Ｉ　Ｌ−８を調製することができるであろう。 大腸菌から得られた組換えｇＡＩａ　ＩＬ−８’）７．及びＩ　Ｌ−８は、哺乳 動物細胞から発現される：Ａｌａ　ＩＬ−８１７７及びＴ＞８と同様のＬＡＩ活 性を示した（図１２）。 ニューシーラント白ウサギの背中に、フロイントの完全アジュバント中のユビキ チンーｒＬ−８８合タンパク１ｔ（ＵＱ−ｒ　Ｌ−８）１００μｇを皮下注射し 、３適間隔でフロイントの不完全アジュバント中のＵＱ−ＩＬ−８（１００μｇ ）をブースター投与した。血清を入手するため、ウサギの耳血管から採血した。 抗体力価は、プラスチ／りに吸収させた哺乳動物組換えＩ　Ｌ−８及びアルカリ ポスフ１ターゼーカツプリング化ヤギ抗−ウサギＩｇＧを利用する間接ＥＬＩＳ Ａで試験した。 試験抗原又はｌ　Ｌ−８漂品をウサギ抗−Ｉ　Ｌ−８抗血清と共に、ＲＩＡ緩衝 液（ＰＢＳｌｏ、５％Ｂ５Ａ１０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＩＭ　ＮａＣ（１ ７０，０２％入ａＮ　、）中、５℃で１２−１８時間インキュベートした。痕跡 量の”５ｌ−ＩＬ、−８（２ｘｌＯ’ｃｐｍ）を加え、得られた混合物を室温で ３時間インキュベートした。ＲＩＡ緩衝液中、ヤギ抗−ウサキＩｇＧ抗血清（１ ：１０）をその混合物と共に室温で１時間インキュベートし、６％ＰＥＧ３００ ０を終濃度４％まで加えて免疫複合体を沈降させ、遠心した（２０分、２ＸＩＯ ’Ｇ、５°Ｃ）。上清をデカントし、得られたペレットをガンマ−カウンターで 計白血球接着阻害検定 ［ＡＩａｌＬ−８３，７及びＩＬ−８がＩＬ−１刺激された内皮細胞への白血球 の接着を阻害する阻害能を以下に記載のようにして試験した。簡単に説明すれば 、９６ウエルのマイクロタイター平［［Ｃｏ５ｔａｒ　Ｃｏｒｐ、、　ＭＡ　ケ ンブリソジコ中で全面成長したヒト慶静脈内皮細胞の単層を、５　Ｕ／ｘｉ！　 ｒｈ　Ｉ　Ｌ−１βと共に、又はそれを加えないでブレインキュベートした。４ 時間後、培養培地を吸引し、得られた単層を洗浄し、ＩＬ−８又は対照試料を複 製ウェルに加えた。 次いで、それらマイクロタイターウェルにフルオレセイン誘４体ＢＣＥ　ＣＦ　 ＪＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ、　Ｅｕｇｅｎｅ、　ＯＲｊて１３したヒ ト多形核白血球（９７％好中球）を加えた（終濃度：２Ｘ１０５好中球／ウェル 、終容量：Ｏ，Ｉｚｊ）。３７°Ｃの１ｏ分後、その平板を、密封し、反転させ て遠心しく２５０　ＸＧ、５分）、上清を除去した。自動マイクロタイター平板 蛍光測定装置により単層に結合した蛍光を読み取り、吸着した好中球の数を計算 した。 害廊男毘 内皮保護検定 既に報告されているようにして［ＴｈｅｅｌｅｒらのＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖ ｅｓｔ、　８２：１２１１（１９８ｇ）］、ヒト内皮細胞をゼラチン被覆マイク ロタイターウェル上で全面成長するまで増殖させた。次いて、その単層を培地（ ＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳ）で２回洗浄した。培地＋／−１ｏ単離／Ｊｌｆ！ｒｈＩ Ｌ−１β（］ｏＯμｇ）を各ウェルに加え、３７°Ｃで４時間インキュベートし た。ＩＬ−１処理した後、その単層を培地で１回洗浄した。 次いて、試験物質を含有する培地１００μＱ中、ヒト血液ＰＭＮを加えた（２ｘ 　１０５−２ｘ　１０”／ウェル）ｆ：ｒｈｌＬ−８では、１−５１　００ｎＭ で試験したコ。次いて、得られた平板を３７℃で１ｏ分がら２時間インキュベー トした。このインキュベート時間の後、ウェルを培地で充満させ、密封し、反転 させ、２５０Ｇで５分間回転させた。次いで、ウェルから液を排出し、２％バラ ポルムアルデヒド１００μａを１５分間加えて固定させた。固定した後、ウェル をライト〜ギムザ染色（ｆｒｉｇｈｔ’　５−Ｇｅ１ｍ５ａ）により染色し、顕 微鏡で観察して、ＰＭＮ接着の量及び内皮単層への損傷の程度を評価した。 ウサギ好中球の調製及び標識化を１ｓｓｅｋｕｔｚ及びＭｏｖａｔにより開示さ れた改変法［ｌ５ｓｅｋｕｔｚ、　Ａ、　Ｃ，及びＭｏｖａｔ、　Ｈ，Ｚ、のＬ ａｂ、１ｎｖｅｓｔ、　４２：３１０゜１９８０Ｘにより行った。簡単に説明す れば、ヒドロ牛ジエチルセルロース沈降法により、クエン酸デキストロースて抗 凝血処理したウサギ血液から白血球豊富な血漿（ＬＲＰ）を調製した。次いで、 Ｐ　ｅｒｃ。 １１密度勾配遠心により、ＬＲＰから好中球を＞９０％純度で単離した。好中性 白血球を５１クロミウムで放射線標識し、洗浄して非結合の放射活性を取り除き 、次いてヒドロキシエチルセルロースで再度沈降させて、″クロミウムー標識化 赤血球の夾雑物を希釈した［Ｃｙｂｕｌｓｋｙ　Ｍ、　１．、　Ｃｙｂｕｌｓｋ ｙ　１．　Ｊ、、及びＭｏｖａｔ　Ｈ，Ｚ、のＡｓ、　Ｊ、　Ｐａｔｈ、１２４ 　：　ｌ。 クロミウム標識化好中球の一部を取り出し、ニューシーラント白ウサギに注入し た。白血球（ＷＢＣ）の計数、ＷＢＣの分別（単核白血球に対する好中球の％） 、及び好中球比活性（放射活性／好中球）を測定する間は、種々の部位から血液 試料を採取した。 クロミウム標識化好中球を注入して２０分後に、大腸菌にて発現させた組換えヒ トインターロイキン−８［Ａｌａ　ＩＬ　８ｉ７ｔをポーラスとして静脈内投与 し、初期循環、ａ度を計算して約１５ｎＭの値を得た。静脈内［Ｌ〜８処置ウサ ギはそれぞれ、食塩水しが注入しない対照ウサギと組みにした。Ｉ　Ｌ−８又は ＰＢＳをポーラス投与した３０分後に、両方のウサギの背側ヒフの皮肉に炎症の 媒介物質（メチイエイタ−）を皮肉注入した（４組行う）。この時間間隔は、こ の間隔ならばＩ　Ｌ−８ポーラス投与に伴って観察される有意な好中球が回収で きるので選択した。このメゾイエイタ−とはホルミル−メチオニル−ロイシル− フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）（１０〜１０モル／部位）、組換えヒト補体Ｃ３ ａ（１０−”モル／部位）、ロイコトリエンＢ４（１０−１０モル／部位）、及 び組換えヒトインターロイキン−１β（１０−’ｔモル／部位）などである。 皮肉注入した２時間後にウサギを殺し、皮肉注入した部位の放射活性をガンマ分 光測定装置にて測定した［１ｓｓｅｋｕｔａ、＾、ｃ、及びＭｏｖａｔ。 Ｂ、　Ｚ、のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　に２７．１９７９］。 ある部位の放射活性を血液好中球の比活性で割ることにより、２時間にわたって 蓄積した好中球の数を得た。 図２は、ウサギに静脈内ポーラスにより投与した、大腸菌にて発現させた組換え ＪＡＩａ　Ｉ　Ｌ　８］７７が、以下に挙げるプロ炎症物質のいずれかを注入し た皮肉部位への好中球の蓄積を顕著に減少させたことを示している：ホルミルー メチオニルーロイシルーフェニルアラニン（ＦＭＬＰ）、Ｃ５ａ、ロイコトリエ ンＢ４、及びＩＬ−１β。［ＡｌａｒＬ−８コ、７介在性の阻害は、

【Ｌ−１β の場合の５９％から、ＬＴＢ４の場合の７５％までの程度であった。 実施例１１ ウサギ心筋虚血／再潅流モデル Ｈｙｐｎｏｒｍ　２　、　５　ｘＱを筋注することで麻酔した雄性ニューシーラ ントウサギを使用した。器官にカニユーレ挿入し、２５−３４息／分て１８−２ １＆（１回換気量（ｔｉｄａｌ　ｖｏｌｕｍｅ　ｒｏｏｌｌａｉｒ））の呼吸を 行わせた。 右頚動脈にカニュー、し挿入し、心室圧を記録するため左心室にカニユーレを挿 入した。薬物を投与し、ベンドパルビタール麻酔薬を追加投与するために、右頚 静脈（ｒｉｇｈｔ　ｃｏｍｍｏｎ　ｊｕｇｕｌａｒ　ｖｅｉｎ）にカニユーレ挿 入した。末梢血圧を記録するため、左大腿動脈にカニユーレ挿入した。リードＨ 型ＥＣＧを使用し、心臓の電気伝導性をモニターした。左冠動脈（ＬＡＬ）の最 初の前外側の分岐付近のその起点から約１ｃｙのところに、結んでいない３．　 ０プロレン（ｐｒｏｌｅｎｅ）の結紮糸を設置した。 すべての外科処置を終えた後、ウサギを１５−３０分開放置して安定させた。対 照の記録時間１０分経過後、ＬＡＬを閉塞させ、閉じた状態を６０分維持した。 その虚血の３０分後、［Ａｌａ　ＩＬ−８］、、壬（蒸留水５００μＱ中、５０ μｇ０食塩水５ｘＱと共に一気に）ポーラス投与した。虚血の６０分後、結紮糸 をほどき、今度は４時間、虚血′領域１に再還流させた。 実験の間中（５時間１０分）、拡張期、収縮期、平均動脈圧、心拍数、回心拍数 の積、左心室圧、＋ｄｐ／、＋ｉｔ、−ｄｐ／ｄｔ、及びＳＴ上セグメント昇な どのＥＣＧパラメーターを連続してモニターし、１０分毎に記録した。 実験の終わりの時点で、Ｌ　Ａ　Ｌを再度閉塞し、左心室を介してエバ７ス・ブ ルー（食塩水中１％月Ｏスｅを注入し、ベンドパルビタールを過剰投与して安楽 死させた。心臓を素早（切除し、食塩水で洗浄し、左心室を切開して心房、右心 室、脂質沈着物、弁及び乳頭筋を除去し、重量測定した。染色されていない領域 を切り出し、それを−危険領域（ｔｈｅ　ａｒｅａ　ａｔ　ｒｉｓｋ）ｊと呼ぶ 。「正常な」左心室組織の重量を測定し、ドライアイス上に置いた。次いで、こ の危険領域の重量を測定し、２−３ｚ切片に切断し、それらをｐ−ニトロブルー ・テトラゾリウム（０，５ａｇ／ｍ１）中に入れ、３７°Ｃで１５分間インキュ ベートした。次に、梗塞した領域（非染色）を切除し、重量測定した。次いで、 その梗塞組織及び危険領域の生存部分をドライアイス上に置き、骨髄ペルオキシ ダーゼ（＋５ｙｅｌｏｐｅｒｏｘ　１ｄａｓｅ）内容物について測定するまで、 −７０℃で保存した。 実験の全期間にわたって以下の時点に、動脈血試料（ＥＤＴＡ３ｚＱ抜き取りチ ューブ中、１．３ｚ（りを採取した。 表２ 実時間　実時間　［Ａｌａ　ＩＬ〜８］７７からの時間（分）　（時）　（分） 】０　−３０ ５Ａｌａ　ＩＬ　８’ｌ？７ホーラス及び注入開始２３０　３’５０″　１９０ これらの試料中の血液細胞を計数し、残りを遠心（３０００ｒｐｍ、１５分）し 、血漿を分離した。 ウサギに［Ａ’ｌａ　Ｉ　Ｌ　８］７？（５０μｇ）をポーラス注入しても、心 拍数、血圧、回心拍数の積、／ｄｌ）／ｄｔに何ら影響を与えなかった。しかし 、このペプチドは、試験した３匹のウサギにおいてＳＴ上セグメント昇の増大を 減少させることができたようである。これらの予備実験は、［ＡｌａＩＬ−８］ ７７かこの閉塞及び再潅流モデルにおける梗塞サイズを７２＝８％の対照レベル から危険領域の５７＝５％に減少させることを示しており、即ちこれは対照群及 び［ｉａｌＬ８Ｔ−７処置群がそれぞれ左心室の３４＝７％及び３８＝６％で一 定性を保持していることを示している。このことは、健康な組織では２８％増大 し、また［Ａｌａ　Ｉ　Ｌ−８］７７が循環系における好中球の数を増大させた 観察事項と矛盾しない。 実施例１２ ”’ｆ−１−８結合性検定 単離した好中球を、０．５ｍＭ放射性ヨウ素化［ＡＩａ　ＩＬ　８］？、又はＩ 　Ｌ−８と共に指定した時間だけ３７℃でインキュベートするに当たり、１００ ０倍過剰の非標識化ＥＡＩａ　ＩＬ　８］ｔ７又はＩＬ−８の存在又は不存在下 （総結合）に（非特異的結合）、あるいは０゜１から３２０ｎｇ／ｘＱの範囲の 種々の濃度の非標識化［ＡＩａｌＬ−８コ７．又はＩＬ−８の存在又は不存在下 に（競合結合性）行った。結合培地は、２５　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含み、０５％ ＢＳＡを加えたＣａ”及びＭｇ！′不倉のＨａｎｋｓ−緩衝化食塩水であった。 インキュベート時間の終了時点で、３つの試料（１０６細胞／ポイント、２００ μｇ中）をショ糖クッション（ＰＢＳ中、２０％ショ糖、０．１％ＢＳＡ）上に 重層し、微小遠心器により１３ｋＧで３分間遠心した。上清を吸引して除去し、 好中球ベレットをガンマ−カウンターで計数した。 内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）　した１２５１−ＩＬ−８リガンドを、０． １ＭグリシンーＨＣＱ、ｐＨ３中、５°Ｃの１０分インキュベート時間に好中球 からの抽出に抗したものと定義した：Ｂａｊｐａｉ及びＢａｋｅｒのＢｉｏｃｈ ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｎ＋ｎｕｎ、　１３３：４７５（ １９８５）３゜最初の実験は、上記のインビトロにおけるバイオアッセイの結果 に基づき、Ｉ　Ｌ−８レセプターを飽和するのに必要とされる濃度よりも少ない と予想される濃度の０．５ｎＭである”！　−［Ａｌａ　ＩＬ　−８］、、又は ”’Ｉ　−Ｉ　Ｌ−８を使用して行った。放射性ヨウ素化リガンドの好中球への 結合性は極めて迅速であり、特異的結合の定常状態レベルの５０％には１分以内 で到達することが見いだされた（データは示していない）。非特異的な結合性は 、Ｋｄｉｓｓよりも数倍も高いと予想され、後にそれが証明された（下記参照） 濃度である０゜５μＭの非標識化Ｉ　Ｌ−８を使用して測定した。 ｐＨ２，７の緩衝液（４°Ｃ１１０分）による抽出に対する結合１２５Ｉ−二Ａ Ｉａ　ＩＬ　Ｆ７７の耐性をｆ測定することで、放射性ヨウ素化ＩＬ−８リガン ドの内在化をモニターした。図６Ａは、すべての、及び酸抽出耐性の、好中球に 付随するＩ　Ｌ−８の時間依存性の増大を示している。図６Ｂは、酸抽出耐性の ＩＬ−８を、ＰＭＮに結合する全Ｉ　Ｌ−８に対する％として表した場合、その データは、全ＰＭＮ付随ＩＬ−８の７５％が５分後に内在化しているという、Ｉ Ｌ−８の迅速な内在化を証明していることを示している。図６Ｃは、結合インキ ュベートの時間を３０分で行った場合、酸抽出耐性の［ＡＩＡＩＬ−８］７７が 、ＩＬ−８と同時移動する種に変換したことを示している。 これらのデータは、［ＡＩａｌｌ−８コ７．が低分子量のＩ　Ｌ−８型、おそら くはＩＬ−８に変換することはその好中球への取り込みと同時に起こることを示 唆している。このことは、内在化には［Ａｌａ　ＩＬ　−８］、、の開裂が必要 であり得ることを示すものである。従って、５位のＡｒｇ開裂部位を欠いている ［Ａｌａ　Ｉ　Ｌ　８］−ｗの修飾型は好は増大するであろう。 これらのデータは、［Ａｌａ　ＩＬ　５３ｔｔ自体がシグナルを好中球に導入（ トランスフェクト）しない可能性とも符合している。［Ａ　ＩａＩＬ−Ｂ］、、 の生物活性は、そのＩ　Ｌ−８又は（他の低分子量型）への変換性によって変動 するであろう。従って、非開裂的なアナログに突然変異されたＩＡｌａ　ＩＬ　 ８］７７はＩｔ−８アンタコニストとして治療学的に価値ある活性を有している であろう。この修飾は、６位のアルギニンをアラニン残基に変換し、又は他の部 位に別の変換を導入するものであってよい。あるいは、［Ａｌａ　ＩＬ　８］ｙ ７のセグメントはＩＬ−８アンタゴニストとしての用途を提供すること［ＡＩａ ＩＬ−８コ１．及びＩ　Ｌ−８のインビトロ活性ＩＬ−１で活性化されたＨＥＣ ，及びＩＬ−８含有プラスミドでトランスフェクトされたヒト２９３細胞の両者 は、２つの璽のＩＬ−８である［Ａｌａ　Ｉ　Ｌ　８］？？及びＩ　Ｌ−８を分 泌し、またこれら２つの型の混合物を含有する精製されたＩ　Ｌ−８調製物は、 サイトカイン活性化ＨＥＣ単層への好中球の接着を阻害することが既に証明され ている。これら２つのＩＬ−８型のそれぞれのＬＡＩ活性を既述のようにしてイ ンビトロＬＡＩ検定法により試験した。ＩＬ−８の両型はＰＭＮ接着を８０％程 も阻害することができた（図４）。 最大有効量はＩ　Ｌ−８の場合は１ｎＭであり、［ＡｌａｌＬ−８コ、７の場合 は１０ｎＭであった。ＥＣ，、についてはＩＬ−８は約０．　３ｎＭであり、［ Ａｌａ　Ｉ　Ｌ　８］？７は約２ｎＭであった。 図８は、［ＡＩａ　ＩＬ　８］７ｖ及びＩ　Ｌ−８は共にＩＬ−１活性化内皮へ の好中球の接着を阻害し得るが、これらのポリペプチドは単球又はリンパ球の表 面とのその相互作用には検出可能に影響しないことを示している。従って、両ペ プチドは、これらの他の白血球の免疫機能を阻害することなく、好中球を標的化 し得る。 図９は、［Ａｌａ　ＩＬ　８Ｅ７．が、４から４８時間の種々の間隔でＩＬ−１ に暴露された内皮に好中球が接着することを顕著に阻害することを示している。 この知見は、種々のタイプの内皮レセプターがこの時間間隔で接着を媒介してい るので意義があるＪＬｕｓｃｉｎｓｋａｓらのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２ ：２２５７（１９８９）］。ｊＡｌａ　ＩＬ　８］７７は、種々の抗−レセプタ ーモノクローナル抗体と比較して、１以上のタイプのレセプター系に媒介される 活性化内皮とのＰＭＮ結合を阻害するので、［Ａｌａ　ＩＬ−８ｊ、、は血管内 皮との好中球接着の阻害物質として広範な用途を有している。 本発明の理解を容易ならしめるために、実施例及び詳細な説明によって本発明を 説明してきたが、当業者ならば、本発明の補正した請求の範囲又は思想を逸脱す ることなく、特定の改変及び変更を行えることは容易に知れるであろう。 本明細書に引用するすべての文献及び特許出願は、個々の文献又は特許出願を引 用によって具体的にかつ個々に本明細書に包含させているように、引用によって 本明細書に包含されるものである。 １５表平５−５０３５１２　（２４） 接着の阻害 Ｉ　Ｉ　、７．為（Ｊ　（５１−Ｊωψ００　Ｃ１００００００Ｑ　０　（） 接着の阻害率（％） ＦＩＧ、５ 接着阻害率（％） ＰＭＮ接着の阻害率（％） 接着の阻害率（％） 培薔の６日！＄Ｃ％） 国際調査報告 １°“１′１°１１Ｍｊｌ　Ａ°３°’−’　”　ＰＣＴ／［５９０１０ｂ９１ ８ＰＣＴ／ＬＩＳ９０１０６９１８ 人Ｌｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ＩＳＡ／２１０．　Ｐａｒｔ　ＶＩＯｂｓｅｒｖ ａｔｉｏｎ　Ｗｈｅｒｅ　Ｕｎ’ｔｖ　ｏｆ　Ｔ　ｖｅｎｔｉｏｎ　ｉ　ａｃｋ Ｇｒｏｕｐ　ｖｙ、ｃｌａｉｍ　５９．　ｄｒＪＩＷｎ　ｔｏ　ｄ　ｍ＠Ｉｔｈ ｎｄ　Ｏｆ　ｐｒｏｔｅｃｔｊｎ（１ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｐｄ　ｃ＋ｒｇａｎ ｓ　ｏｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ、ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　４２４／８５．１゜ ｒ）ｅｔａｊｌｅｄ　Ｒｅａｓｏｒ＋＋ｑ　ｆｃ＋ｒ　Ｈ（Ｉｌｄｉｎ　１．ａ Ｃｋ　Ｏｆ　υ　ｉｔｖ　ＯＴｎｖｅｎｔｉｏｎ

Claims (64)

【特許請求の範囲】
1. １．白血球の、別の細胞表面への接着を阻害し得る実質的に純粋なポリペプチド であって、該ポリペプチドが［ＡｌａＩＬ−８］７７またはその誘導体であるポ リペプチド。
2. ２．該阻害が炎症の部位で起こる請求項１のポリペプチド。
3. ３．該ポリペプチドがヒト由来であり、他のヒトタンパク質を含有しない請求項 １のポリペプチド。
4. ４．該ポリペプチドが図１のアミノ酸配列からなる請求項３のポリペプチド。
5. ５．該アルギニン５が、トロンビンによるタンパク加水分解に対して感受性でな い別のアミノ酸で置換されている請求項４のポリペプチド。
6. ６．組換え発現系で合成された請求項１のポリペプチド。
7. ７．該組換え発現系が原核生物である請求項６のポリベプチド。
8. ８．検出可能な標識と組み合わされた請求項１のポリベプチド。
9. ９．該検出可能な標識が、放射性同位体、酵素、発蛍光団、安定な遊離基または 金属イオンの１つである請求項８のポリペプチド。
10. １０．［ＡｌａＩＬ−８］７７をコードする組換えＤＮＡ分子。
11. １１．該分子が図１のヌクレオチド配列からなる請求項１０のＤＮＡ分子。
12. １２．請求項１１のＤＮＡ分子の連続的な１２〜１００ヌクレオチドの断片から なるＤＮＡプローブ。
13. １３．請求項１１のＤＮＡ分子を含有するプラスミド。
14. １４．該プラスミドがｐＲＫ５である請求項１３のプラスミド。
15. １５．請求項１３のプラスミドで形質転換された生育可能な細胞。
16. １６．請求項１４のプラスミドで形質転換された生育可能な細胞。
17. １７．該細胞がヒト２９３細胞である請求項１５または１６の細胞。
18. １８．該細胞が原核細胞である請求項１５または１６の細胞。
19. １９．該細胞が大腸菌である請求項１５または１６の細胞。
20. ２０．抗炎症性化合物、免疫抑制化合物、または血栓溶解性化合物の１つと組み 合わされた請求項１のポリペプチド。
21. ２１．該抗炎症性化合物がアスピリン、アセトアミノフェン、またはイブプロフ ェンから選択される請求項２０のポリペプチド。
22. ２２．該免疫抑制化合物がＴＧＦ−βまたはインターフェロン−ａ、−βまたは − から選択される請求項２０のポリベプチド。
23. ２３．該血栓溶解性化合物が組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、 またはエミナーゼから選択される請求項２０のポリペプチド。
24. ２４．白血球が媒介する別の細胞への損傷から保護する方法であって、該細胞を 治療的量の［ＡｌａＩＬ−８］７７またはその誘導体と接触させることからなる 方法。
25. ２５．該治療的量が約５〜５０ｎＭの［ＡｌａＩ−８］７７濃度をもたらすに足 る量である請求項２４の方法。
26. ２６．該細胞が白血球である請求項２４の方法。
27. ２７．該白血球が好中球であり、該細胞が内皮細胞である請求項２４の方法。
28. ２８．白血球接着を阻害する量の［ＡｌａＩＬ−８］７７またはその誘導体を投 与することからなる、哺乳類の炎症を治療する方法。
29. ２９．白血球接着を阻害する量の［ＡｌａＩＬ−８］７７からなる、哺乳類対象 の炎症の治療に有用な医薬組成物。
30. ３０．該組成物が医薬的に許容される担体をさらに含有する請求項２９の組成物 。
31. ３１．該組成物が、白血球が媒介する活性化された内皮細胞への損傷から保護す る、請求項２９の組成物。
32. ３２．該［ＡｌａＩＬ−８］７７またはその誘導体が組換え技術によって製造さ れる請求項２９の組成物。
33. ３３．誘導物質分子を哺乳類細胞と接触させることからなる、［ＡｌａＩＬ−８ ］７７の生産を誘導する方法。
34. ３４．該誘導物質分子がイン−ロイキン−１、細菌内毒素、および腫瘍壊死因子 からなる群から選択される請求項３３の方法。
35. ３５．該哺乳類細胞がヒト内皮細胞である請求項３３の方法。
36. ３６．請求項１３のプラスミドを含有する細胞を、［ＡｌａＩＬ−８］７７の発 現にとって充分な時間インキュベートし；実質的に細胞夾雑物を含有しない該［ ＡｌａＩＬ−８］７７を単離する；ことからなる、［ＡｌａＩＬ−８］７７の合 成法。
37. ３７．該細胞が原核細胞である請求項３６の方法。
38. ３８．該プラスミドがｐＲＫ５である請求項３６の方法。
39. ３９．該［ＡｌａＩＬ−８〕７７単離法が８．０より高いｐＨにおけるカチオン 交換からなる請求項３６の方法。
40. ４０．該カチオン交換物質がカルボキシメチルセルロース、ｍｏｎｏＳまたはＳ −セファロースから選択される請求項３９の方法。
41. ４１．タンパク質ユビキチンにアミノ末端で融合している請求項１のポリペプチ ド。
42. ４２．該ユビキチンと該［ＡｌａＩＬ−８］７７の接合部にメチオニンが存在す る請求項４１のポリペプチド。
43. ４３．［ＡｌａＩＬ−８］７７をコードする該ＤＮＡ配列の転写的上流に、メチ オニンをコードするＤＮＡの配列をさらに含有する請求項１０のＤＮＡ分子。
44. ４４．メチオニンおよび［ＡｌａＩＬ−８］７７をコードする該ＤＮＡ配列の転 写的上流に、ユビキチンをコードするＤＮＡの配列をさらに含有する請求項４３ のＤＮＡ分子。
45. ４５．該請求項１３のプラスミドが、［ＡｌａＩＬ−８］７７をコードする該Ｄ ＮＡの転写的上流に、メチオニンをコードするＤＮＡをさらに含有する請求項３ ６の方法。
46. ４６．該プラスミドが、メチオニンをコードする該ＤＮＡの転写的上流に、ユビ キチンをコードするＤＮＡをさらに含有する請求項４５の方法。
47. ４７．［ＡＩａＩＬ−８］７７の該発現がアミノ末端ユビキチン−メチオニン− ［ＡｌａＩＬ−８］７７から融合タンパク質を発現させることからなる、請求項 ４６の方法。
48. ４８．該［ＡｌａＩＬ−８］７７単離操作が、該融合タンパク質を、該融合タン パク質を切断して［ＡｌａＩＬ−８］７７マを放出するに充分な時間臭化シアン と共にインキュベートすることからなる、請求項４７の方法。
49. ４９．該［ＡｌａＩＬ−８］７７単離操作が８．０より高いｐＨでのカチオン交 換をさらに含む請求項４８の方法。
50. ５０．該カチオン交換物質が、カルボキシメチルセルロース、ｍｏｎｏＳまたは Ｓ−セファロースから選択される請求項４９の方法。
51. ５１．抗炎症性化合物、免疫変調性化合物、血栓溶解性化合物、または抗血栓症 化合物のいずれかの治療的に有効な量をさらに含有する請求項２９の医薬組成物 。
52. ５２．該血栓溶解性化合物が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ またはエミナーゼから選択される請求項５１の医薬組成物。
53. ５３．該抗炎症性化合物が、アスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン 、ステロイド類または好中球移動に対して指向する抗体から選択される請求項５ １の医薬製剤。
54. ５４．該免疫変調性化合物がＴＧＦ−β、インターフェロン−ａ、−β、−、ま たは腫瘍壊死因子から選択される請求項５１の医薬組成物。
55. ５５．該抗血栓症化合物がヘパリンまたはアルガトロバンから選択される請求項 ５１の医薬組成物。
56. ５６．該接触が、局部的投与、エアゾル剤、座剤、筋肉内注射、静脈内注射、あ るいは炎症性反応の部位中への直接的注射から選択される方法による、白血球接 着を阻害する量の［ＡｌａＩＬ−８］７７の治療的投与によって行われる請求項 ２４の方法。
57. ５７．該治療的投与がボーラス、静脈内点滴、または徐放性製剤の１つによって 行われる請求項５６の方法。
58. ５８．抗炎症療法を必要とする患者に治療的に有効な量の請求項１の組成物を投 与することからなる抗炎症療法の方法。
59. ５９．血管が分布した器官および組織の保護を必要とする患者に、治療的に有効 な量の請求項１の組成物を投与することからなる、血管が分布した器官および組 織を保護する方法。
60. ６０．治療的量の請求項５のポリペプチドの投与からなる、［ＳｅｒＩＬ−８］ ７２の活性を阻害する方法。
61. ６１．白血球が媒介する別の細胞への損傷から保護する方法であって、該細胞を 、白血球接着を阻害する量の［ＳｅｒＩＬ−８］７２またはその誘導体と接触さ せることからなる方法。
62. ６２．該白血球が好中球であり、該細胞が内皮細胞である請求項６１の方法。
63. ６３．白血球接着を阻害する量の［ＳｅｒＩＬ−８］７２またはその誘導体を投 与することからなる、哺乳類の炎症の治療法。
64. ６４．該投与が炎症の部位中への注射からなる請求項６３の方法。 白血球接着阻害因子としての［ＡＬＡＩＬ−８］７７発明の詳細な説明