JPH04505151A - 骨形成因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

「骨形成因子１ 本願出願は、１９８８年ｌＯ月１１日に出願された特許出願番号第２５６．０３ ４号の一部継続出願である。 又１生！１ 本発明は、新規骨形成因子製剤、それらの単離法および（骨欠損の修復のための ）用途に関する０本発明に従って分離した製剤は、その通用部位において骨の形 成を促進あるいは刺激する能力を示す、骨は、その広汎な基質構造から導かれる 独特の力学的特性を持った極めて特殊な結合組織である。タンパク質、コラーゲ ンからなる繊維束の網状組織が、骨の伸張・抵抗作用を与えると考えられる。さ らに、プロテオグリカン、非コラーゲン性タンパク、脂質、および主として結晶 性の乏しいハイドロキシアパタイトからなる無機質相に結合した酸性タンパク質 等の他の物質が、骨の広汎な基質構造内に沈着している。骨組織は、哺乳類の生 涯を通じて、改作と呼ばれる工程により絶えず再生されている。この生理作用が 若い組織の特性を維持する働きをしていると考えられる。 骨の形成と再生の過程は特殊な細胞によって行なわれる。形態形成に関する骨形 成および骨の成長は、おそらく「骨芽細胞」（骨形成細胞）によって行なわれる 。骨の改作は、「破骨細胞」と呼ばれる骨吸収細胞と骨形成の骨芽細胞との間の 相互作用によって生じる。従って骨格は機械的機能を備えた建築的構造であるだ けではなく、成長、造型、改作および修復の能力を持つ生きた組織でもある。こ れらの過程は特殊な生細胞によって実施されるので、化学的（薬学的／ホルモン 性）、物理的および物理化学的変化は骨＆ｌ１ｗ１の質、量および形態に影響を 及ぼしうる。 欅々な病理学的障害ならびに物理的荷重（たとえば、骨折）は、通常の身体環境 時よりもかなり高い割合での骨！１ｕｌｌの活発な形成を必要とする。従って、 たとえば移植によって通用され、あらかじめ定められた身体部位の骨の形成を誘 導するところの生理的に許容されうる物質（ホルモン／薬剤／成長因子）を同定 することは価値がある。かような物質は、骨形成細胞の沈着が許容される基質構 造を提供するか、あるいは骨形成細胞を刺激するか、あるいは骨形成細胞の適当 な先祖の分化を誘導しうるちのである。 タンパク質欅およびプロスタグランジン様の骨芽細胞成長刺激物質の存在はこれ までに検討されているので、次の文献を参照されたい：　Ｌ、Ｇ、Ｒａ１ｓｚ、 ｅｔ　ａｌ、＋　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　ｆｔｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　 １ｌｅｄ−ｉｃｉｎｅ、第３０９ｔ！−１第１号、第２９〜３５頁（１９Ｂ３） 、およびり、Ｇ、Ｒａ１ｓｚ＋　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。 第３０９巻、第２号、第８３〜８９頁（１９８３）。 同一個体あるいは適合性個体からの骨移植は移植部位に新たな健全骨の形成を導 くという観察から、骨が、局所的骨形成を促進する活性タンパク質を含有してい るという仮説に至った。ユリス）　（Ｕｒｉｓｔ）らは、脱塩した骨粉末の解離 処理によって骨基質結合非コラーゲン性タンパク質を単離することができ、また この非コラーゲン性タンパク賀混合物は、ユリスト（たとえば、５ｃｉｅｎｃｅ 。 第１５０巻、第８９３頁（１９６５））が骨形層形成活性と称した局所的骨誘導 能力を有する証拠を開示した。 様々な骨形成、軟骨誘導、および骨誘導タンパク製剤が当該先行技術において記 述されている。ユリストらは、骨誘導特性を育する各種部分画分タンパク質製剤 について記している。これら製剤は、脱塩した骨粉末を異なる解離処理を用いて 非コラーゲン性タンパク質混合物を抽出し、該抽出物は各種タンパク分別工程に おいて分別される。当該製剤のいくつかは、それらの生物学的活性を測定する種 々の分析法、ならびに種々の標準タンパク質分析法を用いて同定されるタンパク 成分によって特徴づけられた。 ユリストらは、脱塩したウサギ骨基賞からの骨形層形成タンパク賀（ＢＭＰ）の 単離を開示した（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆ ｏｒＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 　１６Ｌ第４８〜５３頁（１９７９））　。 この参考文献は、還元ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧ Ｅ）分析に基づき、Ｂ１１Ｐが９４．０００ダルトン（９４Ｋ）から１４．００ ０ダルトン（１４に）未満の範囲の分子量を持つ多数の主要タンパク成分を含ま れることを開示している。 ユリストらは、脱塩ウサギ骨基賀から得た別のＩＭＰ製剤を開示した（Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔ’１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、第７６巻、第４号、第１８２ ８〜１８２３頁（１９７９年４月））、これら製剤をＳＯＳポリアクリルアミド ゲル電気泳動にかけることにより、それぞれの主要成分の見かけの分子量が９４ Ｋ、６８Ｋ、４３に、２１におよび１４．３にである５つのタンパク画分を同定 した。５つのタンパク製剤全部をα−メチルマンノシドによってゲルカラムから 溶出した。５製剤のうち４つ、すなわち６８Ｋから１４．３にの主要成分分子量 範囲のものをエチレングリコールで溶出し、２製剤、すなわち２１にと１４．３ にの主要成分分子量のものをリン酸カルシウムによって沈澱させた。３群の溶出 物すべてが間挿のＢＭＰ活性を持つことが認められた。この参考文献は、３番目 の群（２１×および１４．３にタンパク質主要成分を特徴とする製剤）における ＢＭＰ活性が、糖タンパク質によって行なわれする低分子量疎水性分子の解離に よるものであろうことを示唆している。同文献は、ＢＭＰが単一の糖タンパク分 子であること、生物学的活性がタンパク凝集作用によるものであること、あるい はＢＭＰ活性は全く骨糖タンパク質に関連していないこと等の代替的可能性も示 唆している（第１８３１頁）。 ユリストの米国特許第４，２９４．７５３号は、ＢＭＰの分子量が約２０Ｋから ６３にの間の範囲であろうことを開示した（第４段、第４５〜６１行目）、該特 許公報は、ウサギの象牙賞基賞タンパク質混合物から単離したＢＨＰ製剤の主要 成分分子量が約２３にであろうことを開示した。骨肉腫細胞から得られるタンパ ク画分は６３にの分子量を持つので、無基質の６３にタンパク質はＢＭＰの前駆 物質であろう。 ハナムラ（Ｈａｎａ腸ｕｒａ）とユリストらは、骨形層形成活性を有する骨肉腫 生成物質を、それぞれの主要成分分子量が１６Ｋ、１２．５１１および７にであ る３つの主要画分に精製することを開示した（ＣＩｉｎ。 ０ｒｔｈｏ、　ａｎｄ　Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、＋第１５３号、第２３２〜２４０頁 ：　１９８０年ｌｌ〜１２月）、２２にタンパク質を含むより高分子量の主要成 分を特徴とする百分は、初期精製段階において認められた；当該試料から精製さ れた活性画分は２２にタンパク質を含ま星主ユ亙、これらの結果より、１２．５ におよび１６にのタンパク質を仮にＢＭＰと同定した。 コノバー（Ｃｏｎｏｖｅｒ）とユリストらは、脱塩したウサギ象牙賀からのＢｌ ＩＰ画分の単離を開示している（Ｔｈａ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙｏｆ　Ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ ｓ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ。 Ｉｎｃ、　＋　アーサー・ベイス（Ａｒｔｈｕｒ　Ｖｅｉｓ）　１ｉｌｌ、第５ ９７〜６０６頁（１９８１））　、３０Ｋ、２３Ｋ、１８Ｌ　１５におよび１２ にの平均分子量を持つタンパク質を含有する試料を同定した。２３にタンパク質 が活性Ｂ？ＩＰ画分であろうとされたが、該活性画分は３０におよび２３に画分 から分離することのできない１８に、１５にあるいは１２にタンパク質であると されている。 ファーレイ（Ｐａｒｌｅｙ）らは、８３にの見かけ分子量を持つ脱塩ヒト骨基質 からの骨格成長因子の精製を開示している（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋第２１ 巻、第１４号、第３５０２〜３５０７頁（１９８２））　、該開示文献は、骨形 前形成タンパク質が２３にの分子量を持つと記述している、ユリスト、コノバー らによる１９８１年の文献（Ｔｒａｎｓ、＾ｎｎｕ、　Ｍｅｅｔ、　−０ｒｔｈ −ｏｐ、　Ｒｅｓ、　Ｓｏｃ、、　６．１３６（１９８１））を参照している。 ユリストらは、ウシ骨基質から抽出し、イオン交換およびゲルクロマトグラフィ ーによって分別した低分子量の骨形層形成タンパク画分を開示している（Ｃ１ｉ ｎ、　０ｒｔｈｏ、　ａｎｄ　Ｒｅ１．　Ｒｅ１−＋第１６２号。 第２１９〜２３２頁）、該参考文献は、ウシＢＭＰが、２３Ｋ、１８におよび１ ２にの主要成分分子量に対応する、１２Ｋから３０にの範囲の分子量を持つ成分 から構成されているであろうことを開示している。 該文献は、１８に成分が活性画分中に恒常的に存在するので、活性タンパク質で あるとしている。 ユリストらは、脱塩したヒト骨基質から抽出したヒト骨形態形成タンパク質（ｈ ＢＭＰ）を、分子量１８にのタンパク質と同定している（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、 　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　ａｎｄ　Ｍｅｄ、、ユ互、第１９４〜１９９頁（１９ ８３））　。 ＩＩ　１８Ｍタンパク質は、高ｈＢＭＰ活性を有するクロマトグラフ画分中に不 変的に存在すること、および該活性を持たない画分中には一般的に存在しないと いう結果から、推定的ｈＢＭＰとして同定された。 脱塩した骨から単離される３４Ｋ、２４におよび１４にタンパク質成分は、骨形 成を誘導旦呈とことが認められた。 セイエディン（Ｓｅｙｅｄｉｎ）　らの米国特許第４．４３４，０９４号および 第４．６２７，９８２号は、ユリストの米国特許第４，２９４，７５３号におけ る研究に言及し、ユリストの特許ではＢＭＰが充分に特性づけられていないと述 べている。セイエディンの特許は、骨形成因子を部分精製するための工程を記述 し、該因子は３０Ｋまたはそれ以下の分子量を持つと記している。 ユリストらは再び、脱塩した骨基質から精製したＢＭＰを分子量１８にのタンパ ク質と同定している（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２２０＋第６８０〜６８６頁（１９８ ３））　、　＄１々な置の１４Ｋ、２４におよび３４にタンパク質が１８にタン パク質と共に単離されたが、該文献は前記最後の３つのタンパク質画分が各々Ｂ ＭＰ活性を喪失することなく除去できることを開示している。該文献は、１８に 画分がＢＭＰ活性の原因であると述べ、３４Ｋ、２４におよび１４にタンパク質 は個々には不活性であるが、１８にタンパク質を伴うたより大きな８？ＩＰ複合 体のサブユニットであると示唆している。 ユリストらは、ウシＢＩＩＰが１８．５にダルトンの見かけ分子量を持つことを Ｉｉ！認している（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 、　８１．３７１〜３７５（１９８４））　、該文献はさらに、１７．５におよ び１７にの見かけ分子量を持つその他の骨由来タンパク質、３４Ｋ、２４におよ び２２にのより高い分子量を持つタンパク質、ならびに１４にというより低分子 量のタンパク質を開示している。該文献は連続するアミノ末端を持った１７．５ にタンパク質のＮ末端配列を示した。 ユリストの欧州特許側第２１２，４７４号は、少な（とも１７．５にＢＭＰ分子 の骨誘導性および免疫反応性領域の活性部分を含む、約４Ｋから７にの間の分子 量を有するペプチド断片を開示している。 ウォン（Ｈａｎｇ）らの、１９８６年７月１日付は出願の米国特許出願第８８０ 、７７６号に基づく優先櫓主張によるＰＣＴ出願第一０８８１００２０５号は、 多くのクロマトグラフィーおよび透析工程を含む操作によって脱塩骨粉束から単 離されるウシ骨誘導性因子を開示している。 このようにして単離された骨誘導性因子は、非還元５Ｏ５−ＰＡＧＥ分析法によ って測定され、約２８，０００〜３０，０００ダルトンの分子量を持つ１または それ以上のタンパク質を含むことが判明した。活性タンパク質の還元５ＯＳ−Ｐ ＡＧＥ分析法で、１８，０００ダルトンと２０　、０００ダルトンそれぞれの分 子量を持つタンパク質の移動度を示す２つの主要な帯が生じた。ウォンらは、Ｂ ？ＩＰが骨形態形酸タンパク質である、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２およびＢ？ＩＰ −３と称される３つのウシタンパク質を開示し、それらのタンパク質に関するペ プチド配列を示している。 ウォンらはまた、ＢｌＩＰ−１、ＢＭＰ−２クラスＩ、Ｂ？ＩＰ−２クラス■お よびＢｌＩＰ−３と称される４つのヒトタンパク質のヌクレオチド配列ならびに 該ヌクレオチド配列から予測されるアミノ酸配列を開示している。 ウォズネイ（ｌｌｏｚｎｅｙ）らは、新たに骨形成を誘導する能力を持つウシ骨 抽出物中に存在する３つのポリペプチドに対応する、３つのヒト相補ＤＮＡクロ ーンＣＢＭＰ−１、Ｂｌ’ＩＰ−２ＡおよびＢｌ’ＩＰ−３と称される）のヌク レオチド配列ならびに該ヌクレオチド配列から予測されるアミノ酸配列を記述し ている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４２＋　第１５２８〜１５３３頁（１９８８）） 　、　＆Ｉｌ換えヒトＢＮＰ−１，ＢＭＰ−２ＡおよびＢＩＩＰ−３タンパク質 は、生体内で独立して軟骨形成を誘導することができると述べられた。 第４の相ｌｉ　ＤＮ＾クローンＣＢＭＰ−２Ｂと称される）のヌクレオチド配列 および誘導されたアミノ酸配列も記載されている。この文献のＢｌＩＰ−１、Ｂ ＭＰ−２Ａ、　ｔｌｌ’ＩＰ−２ＢおよびＢＭＰ−３タンパク質は、ウオンらの ＢＭＰ−１、Ｎ１ＩＰ−２クラスｌ　、　ＢＭＰ−２クラス■およびＢＭＰ−３ タンパク質に各々対応すると思われる。 １９８９年２月１４日に発行されたセン（Ｓｅｎ）の米国特許第４，８０４，７ ４４号は、Ｐ３族タンパク質の一つであり、還元５Ｄ５−ＰＡＧＥ分析法のクー マシーブルー染色により見かけ分子量２２．０００〜２４　、０００ダルトンを 示した骨形成タンパク質製剤を開示している。 ライアン（Ｌｙｏｎ）らは、ＢＭＰ−２Ａ、　ＢｌＩＰ−２ＢおよびＢＭＰ−３ の推定したアミノ酸配列の相同領域を含むマウスタンパク質をコードする相ｌｌ ＤＮＡクローン（Ｖｇｒ−１と称される）のヌクレオチド配列および誘導された アミノ酸配列を記述している（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｌ 。 υＳ＾、８６．　第４５５４〜４５５８頁（１９８９））　。 ルーテン（Ｌｕｙｔｅｎ）らは、新たな骨形成を誘導すると言われているウシ骨 抽出物中に存在するポリペプチドの精製および部分的アミノ酸配列の解析を記述 している（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、　２６４＋　第１３３７７〜１３３８ ０頁（１９８９））　、オステオジェニン（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｎ）と称される このタンパク質は、還元５Ｏ５−ＰＡＧＥ分析法による測定では２２，０００ダ ルトンの見かけ分子質量、非還元５Ｏ５−ＰＡＧＥ分析法による測定では３０． ０００〜４０．０００ダルトンの見かけ分子質量を持つ、オステオジェニンにつ いて報告されているアミノ酸配列は、ウォズネイらが記しているように、ＢＭＰ −３とかなりの相同性を示すとされている。 ベンツ（Ｂｅｎｔｚ）　らは、ラットにおいて骨誘導を促進するとされる脱塩前 基質から単離したタンパク物質を記述している（Ｊ、　Ｂｏｎｅは糖タンパク質 と同定され、ＴＧＦ−β１あるいはＴＧＦ−β２の存在下においてのみ骨誘導活 性を示すとされている。　ＯＩＦは、ＳＤＳゲル電気泳動に基づき見かけ分子質 量２２．０００〜２８，０００ダルトンを持ち、５Ｏ５−ＰＡＧＥでの還元が移 動度を変化させないという事実から単量体分子と同定された。 且里皇！立 本発明は、哺乳類での移植部位において局所骨形成を促進あるいは刺激する能力 を示す哺乳類骨基質由来タンパク質に関する。 特に、本発明は骨形成タンパク質の製剤を提供し、また解離（変性）条件下での 骨基質タンパク質の抽出、そしてゲル濾過クロマトグラフィーカラム、イオン変 換クロマトグラフィーカラム、金属キレートアフィニティーカラム、疎水性吸着 クロマトグラフィ′−カラム、およびアセトニトリル勾配を用いて逆相ＨＰＬＣ （高速液体クロマトグラフィー）カラムの１種またはそれ以上のカラムからのこ れらタンパク質の特異的溶出方法による精製を含んだ、かかる骨形成活性タンパ ク質製剤の抽出および精製を含む、かかる精製工程を用いて得られるこれら製剤 は、該製剤のゲル濾過、イオン変換、金属キレート、疎水性吸着および逆相ＨＰ ＬＣカラムを使用した各々のクロマトグラフィー反応によって、またその製剤を 単独あるいは該製剤と適当な薬学的に許容される担体との混合物をあらかじめ定 められた動物の部位へ適用して局所骨形成を誘導する能力によって、明らかに特 性づけられる０本発明はさらに、哺乳類に有効量の骨形成製剤を投与することか らなる哺乳類の骨形成を誘導する方法を提供する。同様に、生理学的に許容され る基質物質と結合した１種またはそれ以上のタンパク質あるいは活性ペプチドか らなる薬学的に許容される組成物を提供する０本発明はさらに、Ｐ３０Ｆ　３１ −３４のサブユニットまたはその一部をコードする骨ヌクレオチド配列のＰ３タ ンパク質に関連することが認められているＰ３０Ｆ　３１−３４と称される３１ 　、０００〜３４．０００ダルトンの骨形成が活性であるタンパク質分子のポリ ペプチドサブユニット、およびこれらのサブユニットを含む新規の骨形成が活性 であるヘテロダイマータンパク質を提供する。 皿皿企ｊ皇呈翌里 第１図は、４Ｍ塩酸グアニジン−０，０１Ｍ　）リス・塩Ｍ緩衝液（ｐＨ７，０ ）で脱塩子ウシ骨粉末を８時間抽出して得たタンパク質をセファロースＣＬ　− ６Ｂカラムクロマトグラフイーによって得られた溶出プロフィールを示す。 第２図は、セファロースＣＬ　−６Ｂカラムクロマトグラフイーから得た活性画 分中に含まれるタンパク質の４Ｍ塩酸グアニジン−０，０１１１トリス・塩酸緩 衝液（ｐＨ７，０）中でのセファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフイーに よって得られた溶出プロフィールを示す。 第３図は、タンパク質溶出用のア七ト二トリル勾配を用いた逆相プロテシール３ ００オクチルカラムでのセファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフイーから の活性プール中に存在するタンパク質の溶出プロフィールを示す。 第４図は、還元剤存在下での不連続ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ ドゲルによる精製骨基質タンパク質の電気泳動分析およびその後のタンパク物質 検出のためのクーマシーブルー染色の結果を示す。 第５Ａ図は、逆相Ｃ８カラムを用いたブタＰ３タンパク質断片の高速液体クロマ トグラフィーによって得た溶出プロフィールである；該断片は宜亘エヱ１ｉＶ８ プロテアーゼを使用してブタＰ３タンパク質の酵素分解により生成した。 第５Ｂ図は、逆相Ｃ８カラムを用いたウシＰ３タンパク質断片の高速液体クロマ トグラフィーによって得た溶出プロフィールである；咳断片はｌ亘エエ１ｌＶＢ プロテアーゼを使用してウシＰ３タンパク質の酵素分解により生成した。 第６八図は、逆相Ｃ１８カラムを用いたブタＰ３タンパク質断片の高速液体クロ マトグラフィーによって得た溶出プロフィールである；該断片は、Ｗ工ｆｆ１Ｖ ８プロテアーゼを使用して、還元カルボキシメチル化ブタＰ３タンパク質の酵素 分解により生成した。 第６Ｂ図は、逆相Ｃ１８カラムを用いたヒトＰ３タンパク質断片の高速液体クロ マトグラフィーによって得た溶出プロフィールである；該断片は、１亘工ヱｍｖ ｓプロテアーゼを使用して、還元カルボキシメチル化ヒトＰ３タンパク質の酵素 分解により生成した。 第７図は、放射性ｔ１議した被検抗原が拮抗する非Ｉｌｌ抗原製剤の存在下で特 異的抗体分子に結合する能力を測定する、拮抗的放射性免疫測定法の結果を示す 。 第８図は、活性５に−１００に画分中に含まれるタンパク質に関して４ｉ塩酸グ アニジン−０，０１？ｌ　）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中でのセファクリ ルＳ−２００カラムクロマトグラフイーによって得た溶出プロフィールを示す。 第９図は、子ウシ骨からのＰ３０Ｆ　３１−３４　（骨形成因子）タンパク質の 選択的精製方法を示す。 第１０Ａ図は、非還元ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色によ って測定した骨形成因子の見かけ分子量を示す。 第１０Ｂ図は、Ｂ二旦タンパク質の還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 および銀染色を示す。 第１１Ａ図は、逆相ＨＰＬＣによるＰ３０Ｆ　３１−３４　（骨形成因子）タン パク質のサブユニットの単離を示す。 第１１Ｂ図は、還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の銀染色によっ て検出されるサブユニットの見かけ分子量を示す。 第１２図は、本発明に従って単離されるｈＯＤおよびｈＯＥをコードするｃＤＮ Ａクローンの推定アミノ酸配列からの相同領域を持つＰ３０Ｆ　３１−３４タン パク質のサブユニットＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、ならびに先行文献中でＢＭＰ−２Ａ、　 ＢＭＰ−２ＢおよびＶｇｒ−１と称されるポリペプチドのアミノ末端配列および 内部配列を表わす。 第１３Ａ図は、逆相Ｃ１Ｂカラムを用いたＰＳブールの高速液体クロマトグラフ ィーによって得た溶出プロフィールである。 第１３Ｂ図は、ｐｓプールの逆相１１ＰＬｃから画分２６．２７および２８中に 溶出するＰ３０Ｆ　３１−３４タンパク質の非還元ＳＯＳポリアクリルアミドゲ ル電気泳動を示す。 第１４Ａ図は、ＰＳブールの逆相ＨＰＬＣから画分２６中に溶出するＰ３０Ｆ　 ３１−３４タンパク質のサブユニットの単離および同定を示す。 第１４Ｂ図は、ＰＳブールの逆相ＲＰＬＣから画分２８中に溶出するＰ３０Ｆ　 ３１−３４タンパク質のサブユニットの単離および同定を示す。 第１５図は、サブユニットＡ　（ＡｂＡＮｔ）およびサブユニットＤ（ＡｂＤＮ ｔ）のＮ末端配列の合成ペプチドに対して生成した抗体を用いたウェスタンプロ ット分析と、クーマシー染色あるいはオートラジオグラフィーにより単離し、視 覚化したＰ３およびｅ■タンパク質の還元ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳 動を示す。 第１６図は、エンドＨあるいはＮ−グリカナーゼのいずれかによる処理前および 処理後の還元したサブユニッ）ＡおよびＤの還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル 電気泳動を示す。 第１７図は、ｈｏｏと称される、υ−２０Ｓ■ＲＡＮからのＰＣＲ増幅したＤＮ Ａのヌクレオチドおよび誘導したアミノ酸配列を示す。 第１８図は、ｈｏＩｉと称される、υ−２０５腸ＲＮＡからのＰＣＲ増幅したＤ ＮＡのヌクレオチドおよび誘導したアミノ酸配列を示す。 第１９Ａ図は、ＰＣＲ増幅した配列の誘導アミノ酸配列ｈＯＤおよびｈＯＥの相 同性を示す。 第１９Ｂ図は、ＰＣＲ増幅した配列のヌクレオチド配列ｈＯＤおよびｈＯＥの相 同性を示す。 主玉立用豊星に肌 当該技術において既知のクロマトグラフィ一方法により、脱塩した骨粉末の粗タ ンパク質抽出物から出発勧賞に対応した各タンパク質を精製した。基本的にレム リ（Ｌａｅｍｍｌｉ）が記した工程（イギリス、Ｎａｔｕｒｅ、第２２７巻、第 ６８０〜６８５頁（１９７０）　）を用いて、還元条件下でのポリアクリルアミ ドゲルにおけるこれらタンノイク賞の移動により判断して、見かけ分子量の低下 順序に従って異なるタンパク質種に２１、Ｐ２等のような番号を割り当てた。異 なる哺乳類の骨から当量のタンパク質を得た０本発明の骨形成活性ポリペプチド は、ある精製工程下において、２２．０００〜２４．０００ダルトンの見かけ分 子量を有する免疫学的に類縁のＰ３タンパク質と同時精製されるという特徴を持 つ、同様に、ヒト骨から単離し、実質的に本明細書中に記載の工程に従って精製 したＰ３タンパク質は、子ウシＰ３タンパク質と免疫学的に関連があり、還元５ ＯＳ−ＰＡＧＥ分析法のクーマシーブルー染色によって２２．０００〜２４　、 ０００ダルトンの見かけ分子量を持つことが示された。 本発明の方法を用いて得られる骨形成が活性な製剤を、本明細書中で時としてＰ ３タンパク質と称する０本発明はさらに、本発明の方法を用いて樟々な哺乳類の 骨がら骨形成が活性なＰ３タンパク質を得る能力に関する０本発明の方法を用い て様々な哺乳類骨から得た骨形成が活性なタンパク質製剤は、Ｐ３タンパク譬と 免疫学的に関連するタンパク質の一員を構成する。この集団を構成するタンパク 質は、次のような特性に関して互いに実質的当量を示す：（ｉ）骨形成活性、（ １１）解離ゲル濾過カラムにおけるクロマトグラフィー特性、（ｉｉ）アセトニ トリル中での疎水性逆相）ＩＰＬＣカラムからの溶出、（ｉｖ）還元５Ｏ５−Ｐ ＡＧＥ！分析法のクーマシーブルー染色によって示される約２２．０００〜２４ ，０００ダルトン間の分子量に関する実質的均一性、（ｖ）タンパク質分解処理 によって生成される主要ペプチド断片の特性、および（ｖｉＨｆｆ製剤中のある 免疫原性決定基特性に関する免疫測定法での反応性。 本発明はさらに、Ｐ３タンパク質の中で、非還元および解離条件下で約２５　、 ０００〜３８，０００ダルトンの範囲内の見かけ分子量を持つタンパク質として 溶出し、より詳しくは、非還元５０Ｓ−ＰＡＧＥ分析法と銀染色法によって分析 した時、約３１，０００〜３４，０００ダルトンの範囲内の見かけ分子量を持つ タンパク質として泳動するタンパク質の同定に関する。これらタンパク質をＰ３ ０Ｆ　３１−３４と称し、咳タンパク質は、骨のＰ３タンパク質と関連し、また 骨形成活性のない間挿の分子量の骨形成タンパク質分子とは異なる、骨形成が活 性な３１．０００〜３４　、０００ダルトンのタンパク質分子を意味する。 本発明はさらに、骨形成を促進することを特徴とする、Ｐ３タンパク質中に固有 のこれら３１，０００〜３４，０００ダルトン分子量のタンパク質成分を単離す る選択的タンパク質分別法を提供する。　Ｐ３　ＯＦ■二…骨形成性タンパク物 質は、還元後逆相ＨＰＬＣによって分析する時、４つの顕著なピークを生じる。 還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ法および銀染色によって分析する時、該ピークのうち３つ は１７，５００〜１９，０００ダルトンの範囲内の見かけ分子量で移動するタン パク質サブユニットとして特性づけられ、第４のピークは１６，０００〜１７， ５００ダルトンの範囲内の見かけ分子量で移動するタンパク譬サブユニットとし て特性づけられる。 出願人は、Ｐ３０Ｆ　３１−３４のタンパク質サブユニットを特性づけ、それら をサブユニットＡ、Ｂ、Ｃ１およびＤと称した。該サブユニットは、種々の内部 および推定アミノ末端ポリペプチド断片の配列決定によって特徴づけた。出願人 は、サブユニットＤをコードするものと相同なヒトｃＤＮＡの配列を増幅するた めにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法を使用し、ヒトのサブユニットＤ　（ ｈｏｅ）に関するアミノ酸およびヌクレオチド配列を提示した。出願人はまた、 新しい骨形成ポリペプチドあるいはウシサブユニットＡポリペプチドに対応する と考えられるポリペプチドサブユニット已（ｈＯＥ）として特徴づけられるもの をコードするヒトｃＤＮＡの配列を同定した。出願人はまた、Ｐ３０Ｆ　３１− ３４骨形成タンパク物質が、サブユニットＤとサブユニットＢとのヘテロダイマ ーおよびサブユニッ）Ａ（および／あるいはサブユニットＥ）とサブユニットＢ とのヘテロダイマーを含めたポリペプチドダイマーからなることをつきとめた。 則」Ｌ■二…骨形成物質は、さらにサプユニッ）Ａ（および／あるいはサブユニ ットＤ）とサブユニットＣのヘテロダイマーおよびサブユニットＤとサブユニッ トＣのヘテロダイマーを含み、サブユニットＢとＣの間に高度の相同性（８０％ ）を有するようになる。 本発明は、ウシ骨から単離されるようなＰ３０Ｆ　３１−３４のポリペプチドサ ブユニットＤ、ならびに下記のグループから選択されるヌクレオチド配列を含む ヒトＤＮ、Ａから精製し、単離した核酸を提供する：　Ｐ３０Ｆ　３１−３４の サブユニットＤをコードするヌクレオチド配列１ＰＯＦ−４のサブユニットＤを 構成するアミノ酸のヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列：皿」Ｌ■ 二ＨのサブユニットＤをコードするヌクレオチドの８０％と相同なヌクレオチド 配列；および遺伝暗号の重複がなければＰ３０Ｆ　３１−３４のサブユニットＤ をコードするヌクレオチドの８０％と相同になるであろうヌクレオチド配列０本 発明はまた、Ｐ３０Ｆ　３１−３４のサブユニットＤをコードする核酸配列を含 むベクター、該ベクターによって形質転換される細胞、および咳形質転換細胞の ポリペプチド発現産物を含むサブユニットＤの組換え発現系を提供する。 本発明はさらに、Ｐ３０Ｆ　３１−３４のポリペプチドサブユニットＥ。 及び下記のグループから選択されるヌクレオチド配列を含む精製単離した核酸を 提供する：　Ｐ３０Ｆ　３１−３４のサブユニットＥをコードするヌクレオチド 配列、Ｐ３０Ｆ　３１−３４のサブユニットＥを構成するアミノ酸のヌクレオチ ド配列をコードするヌクレオチド配列；Ｐ３０Ｆ　３１−３４のサブユニットＥ をコードするヌクレオチドの８０％と相同なヌクレオチド配列；および遺伝暗号 の重複がなけれは皿ＯＦ　３１−３４の７サブユニツトＥをコードするヌクレオ チドの８０％と相同になるであろうヌクレオチド配列０本発明はまた、Ｐ３０Ｆ …二旦のサブユニットＥをコードする核酸配列を含むベクター、・該ベクターに よって形質転換される細胞、および該形質転換細胞″のポリペプチド発現産物を 含むサブユニットＥの＆ｌ換え発現系を提供する。 本発明はまた、Ｐ３　ＯＦ　３１−３４のサブユニットＤを含むダイマーを含む 骨形成製剤と、さらに、少なくとも１つのジスルフィド結合によって結合された Ｐ３０Ｆ　３１−３４のサブユニットＤおよびＢを含むヘテロダイマーを含む骨 形成製剤を提供する。本発明はさらにまた、Ｐ３０Ｆ　３１−３４のサブユニッ トＥを含むダイマーを含む骨形成製剤と、さらに、少なくとも１つのジスルフィ ド結合によって結合されたＰ３０Ｆ３１−３４のサブユニットＥおよびＢを含む ヘテロダイマーを含む骨形成製剤を提供する０本発明はさらに、Ｐ３０Ｆ　３１ −３４のサブユニン）Ａを含むダイマーを含む骨形成製剤と、さらに、少なくと も１つのジスルフィド結合によって結合されたＰ３０Ｆ　３１−３４のサブユニ ットＡおよびＢを含むヘテロダイマーを含む骨形成製剤を包含する。 骨形成タンパク質製剤、すなわちＰ３タンパク質、Ｕ旦タンパク質を含有する製 剤、あるいはサブユニツｌ−Ａ、Ｂ、Ｃ１ＤまたはＥを含有する製剤、あるいは 本明細書中に記載したそれらのホモダイマーまたはヘテロダイマーは、該製剤と 生理学的に許容される基質物質との混合による哺乳類への移植のための組成物を 形成するのに使用しうる。さらに、骨形成因子／基ｔ！成物によって被覆された 積造部材からなる、哺乳類への移植のための装置が本発明によって提供される。 当該技術において周知の方法、たとえば化学的、酵素的あるいは１ＪｌｔＡえＤ ＮＡ手法を用いて、骨形成を促進あるいは刺激する能力を示す、本明細書中に記 した骨形成タンパク質からＬ”ＩＬされるポリペプチドを得ることは可能であろ う、たとえば、ポリペプチドのサブユニットＡＳＢ、Ｃ，ＤおよびＥ、あるいは 酸ポリペプチドをコードする核酸、あるいは本明細書中では直接提供されない該 ポリペプチドの類似体は、当業者に周知の方法に従って得られる。該方法は、ポ リペプチドサブユニットのいずれかの完全なアミノ酸配列を得、該アミノ酸配列 に基づくポリヌクレオチドプローブを用いて１種またはそれ以上の哺乳類種から のＤＮＡライブラリーをスクリーモングすることを含み、また本発明に従って標 識抗体あるいはオリゴヌクレオチドを使用することによりＦＩＩＬ…二３４中二 律４中るポリペプチドサブユニットのいずれかを発現する細胞を同定し、それか らｍＲＮＡを単離して、単離したｍＲＮＡがらｃＤＨＡを作製することを含む０ 本発明はさらに、Ｐ３０Ｆ　１−３４のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブ ユニットＣ、サブユニットＤおよびサブユニッ）Ｅからなるグループから選択さ れるポリペプチドモノマーのダイマーからなる骨形成タンパク質の調製方法を提 供する。該方法ぼ、ム」Ｌ■二…サプユニッ）Ａ、サブユニットＢ１サブユニツ トＣ２サブユニツトＤｉよびサブユニットＥからなるグループから選択される１ 種またはそれ以上のポリペプチドをコードする核酸配列によって形質転換した１ 種またはそれ以上の細胞系を、適当な培地中で培養する工程を含む０次に、前記 ポリペプチドを少なくとも１つのジスルフィド結合で結合することによりポリペ プチドモノマーからダイマーを形成し、そして該形成したダイマーを単離する。 Ｐ３０Ｆ　３１−３４タンパク質、あるいはそのサブユニットあるいは断片と免 疫学的に関連を存する骨形成が活性な種に転換される、あるいは、転換されうる タンパク質あるいはポリペプチドも、本発明の範囲内であると考えられる０本明 細書中で「活性ポリペプチド」と称される活性物質は、本発明の対象であるタン パク質あるいはポリペプチド、ならびに化学的合成あるいは組換えＤＮＡ手法の ような従来の方法によって生成されうるそれらの機能的誘導体のいかなる部分も 含む、活性ポリペプチドはさらに、骨形成り゛ンパク質およびサブユニットのア ミノ酸配列内の残基からの欠失、挿入および置換を含む、欠失、挿入および置換 それぞれの組合せも、骨形成活性を存する最終構築物に到達する。該活性ポリペ プチドの誘導体は、たとえば、化学的あるいは酵素的に修飾されたポリペプチド ；融合タンパク質；あるいはポリマーのような適当な担体物質に結合したポリペ プチドを含みうる。 １種またはそれ以上の哺乳類種のＪ二…中に存在する自然配列ポリペプチドサブ ユニットあるいはその類似体および変異体は、ポリペプチドの直接化学合成、あ るいはサブユニットＤＮＡの特定部位の突然変異誘発によって調製されるＤＮＡ の発現、あるいはオリゴヌクレオチドの化学的合成と宿主細胞における多くの手 法のいずれかによる発現前のオリゴヌクレオチドの構築によって調製されうる。 〔たとえば、カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）　、米国特許第４．５００．７ ０７号；バランド（Ｂａｌｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、　ａ７．７２５ 〜７３６（１９８５）　；工ンジ（Ｅｄｇｅ）ら、１ｌａｔｕｒｅ、　２９２． ７５６〜７６２（１９８１）参照）　、　Ｐ３０Ｆ　３１−３４あるいはそのｌ ［４ｇｉ体をコードするメツセンジャーＲＮＡも生体外で発現されうる。活性レ ベルの変化は適当な検定法によって測定される。酸化還元あるいは熱安定性、疎 水性、タンパク質分解に対する感受性、あるいは担体との凝集またはマルチマー への凝集傾向のようなタンパク質特性の変異は、当業者は周知の方法によって分 析できる。 原核微生物（細菌など）および真核微生物（酵母など）が、本発明の宿主細胞と して使用しうる。数多くの他の菌株が一般的に入手しうるが、ビール酵母Ｅｌ（ Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）あるいは通常のパン酵母が、真核微生物の中で最 も一般的に使用される。細菌および酵母における発現のためのクローニングおよ び発現ベクターは、λファージや大ｌＩ菌のｐＢＲ３２２およびビール酵母国の ＹＯ２のように、当業者にとって周知のものである。 多細胞真核生物から誘導した細胞も宿主として使用しうる。を橿あるいは無を椎 真核生物からの細胞も使用でき、その場合に用いる適当な発現ベクターは、哺乳 類宿主細胞についてはＳＶ４０レトロウィルスおよび乳ｕｉ１ウィルスベクター 、無を椎宿主細胞についてはＮＰＶベクター、および植物細胞については↑ｌベ クターのような、当業者には既知のものである。 本発明はさらに、１種またはそれ以上のタンパク質および／または活性ポリペプ チドおよび／または免疫学的に関連性を有する物質を、哺乳類における骨成長の 刺激のための薬剤として使用する方法を開示する。薬学的に許容される担体とタ ンパク質および／または活性ポリペプチドおよび／または免疫学的に関連性を有 する物質の内の１種またはそれ以上とを組み合わせた薬学的に許容される組成物 も、本明細書中に開示されている。該組成物は、該組成物の投与に役立つ、ある いは該組成物の効果を促進するその他の成分、あるいは他の生理活性勧賞を選択 的に含みうる。 本明細書中で使用する「免疫学的に関連する」という語句は、該タンパク質に対 して培養あるいは製造された抗体中の抗原結合部位への結合および／あるいは該 結合部位を認識するいかなるポリペプチドも含むことを意味する。「骨形成ｊの 語は、局所投与（たとえば、薬学的に許容される方法での活性製剤の移植）に反 応して、特異的部位における新しい骨の形成あるいは既存の骨の成長の誘発を意 味する。「骨形成量ｊは、所望する効果を与えるのに十分な、骨形成タンパク質 および／または活性ポリペプチドおよび／または免疫学的に関連する物質の量を 指す、ｒ骨形成活性」あるいは「骨形成性」の語は、該製剤が骨形成を促進ある いは誘導する能力を持つことを意味する。 さらに、本明細書中でＰ２およびＰ４と称する２つの関連性のないは３０．００ ０〜３３．０００ダルトンの見かけ分子量を持つが、Ｐ３タンパク質製剤と結合 する骨形成タンパク質の不在下では、骨形成を誘導することができない、免疫学 的に関連するＰ２タンパク賀も、実貿的には本明細書中に記した方法に従ってヒ ト骨から単離した。 間挿にして、本明細書中に記した方法に従ってＰ４タンパク質族を単離した。子 ウシ骨の精製段階において、Ｐ４製剤は、Ｐ３タンパク譬製剤と結合した骨形成 タンパク質の不在下では骨形成を誘導することができない２つの主要成分からな り、どちらも約１６．０００〜１８．０００ダルトンの見かけ分子量を持ち、後 述するようなアミノ末端アミノ酸配列を特徴とする。骨形成タンパク質の不在下 では骨形成を誘導することができない、このＰ４タンパク質族の免疫学的に関連 性を有するタンパク質も、本明細書中に記した方法に従ってヒト骨から単離した 。 骨形成因子の通用は、所望する部位において骨形成を促進するのに十分な量の１ 種またはそれ以上の骨形成タンパク質および／または１種またはそれ以上の活性 ボ゛リペプチドおよび／または１種またはそれ以上の免疫学的に関連性を有する 物質の凍結乾燥製すベブチドおよび／あるいは１種またはそれ以上の免疫学的に 関東学的に許容される基質、あるいは他の薬学的に許容される担体からなる、薬 学的に許容される組成物をか使用できる。 以下の実施例は本発明をさらに詳しく説明するためのものであり、本発明を限定 して解釈されるべきものではない。 】　：　１　ノ　の ＪＬ　（７）　７’　ｏ　＋とＡｔ 典型的なｌ製法では、哺乳類からの長管（長管の先端）（たとえば、子ウシの距 骨、ヒト骨のを柱の大腿骨頭、ラットの全脛骨および腓骨）を、Ｍ、Ｒ，ユリス ト、米国特許第４　、２９４　、７５３号（１９８１）に述べられているような 周知の方法を用いて処理し、脱塩する。 その他本明細書中で引用するすべての参考文献は、参照することにより本明細書 中に包含される。 骨を処理し、脱塩する筒便な方法は次の通りである：骨（好ましくは、骸骨は若 年哺乳類がら入手し、調製時まで冷凍保存する）を取り巻く骨膜層を機械的手段 によって除去し、骨の中心腔から骨髄を冷水で洗浄して除去する。骨を従来の手 段によって、たとえばウィリーミルを使用して、小さな粒子「一般に直径１〜２ ミリ（ａｓ）　）に粉砕する０次に粒子を０．１５Ｍ塩化ナトリウム−０，１Ｍ ）リス・塩酸緩衝液（ｐ）Ｉ　７．０）のような緩衝生理食塩水で何度も洗浄し 、脂質および残存血液の大部分を除去する０次に該粒子を直径約５００ミクロン （μ）またはそれ以下の粒子とするため、たとえばポリトロンホモジナイザー（ Ｂｒｉｎｌｖａｎ　Ｉｎ５ｔｒｕ＋５ｅｎｔｓ）を用いた剪断によって、粒子を さらに細がくする。均質化した粒子を、上述の緩衝生理食塩水と水、次にエタノ ール、そして最後にエーテルで洗浄する。洗浄した均質な粒子を真空あるいは空 気乾燥する；この「骨む）末」は−８０℃で長期間保存することができる。 なわち、骨基質からのリン酸カルシウムの除去）は、塩酸（ＨＣＩ）溶液での反 復洗浄によって、たとえば、骨粉末を骨粉末の乾燥重量ダラム（ｇ）あたり約１ ０〜１５ｍ１（７）０．５規定（Ｎ））ＩＣＩと共に１時間撹拌し、液体を回瀉 し、さらにこの工程を３〜４回反復することによって達成される０次に、脱塩し た骨粉末をｐＨが中性になるまで脱イオン蒸留水でくり返し洗浄する。エタノー ル洗浄、次にエーテル洗浄、そして乾燥することにより脱塩前粉末から水を除去 する。脱塩した骨粉末は超低温（たとえば−２０〜−８０℃）で保存することが できる。骨粉末の脱塩は他の周知の方法、たとえばエチレンジアミン四酢酸のよ うなキレート剤を使用して実施することもできる。 処理した骨粉末が、塩酸処理後前基質タンパク質の抽出にただちに使用できるほ ど十分に脱塩されているかどうかを測定するために、水で洗浄した粉末を用いて 、たとえばフォノ・コッサ（νｏｎ　Ｋｏｓｓａ）の方法で無ｆＲ′！を含量に 関して試験する（Ｊ、フォノ・コッサ、Ｚｉｅｇｌｅｒ’ｓ　Ｂｅｊｔｒ、２９ ．１６３（１９０１）参照〕、フオン・コフサ染色が陰性であれば、処理した骨 粉末はタンパク質抽出に使用するのに十分なだけ脱塩されている。 した＾　か゛の　ンバク　の　および 上述したように！ｌｉｍした脱塩前粉末をｐＨ７，０またはその付近のｐＨの塩 酸トリズマ（トリス・塩酸）のような緩衝液中で約２〜８モル（Ｍ）塩酸グアニ ジウム（ＧｕＨＣｌ）の水溶液と共に、所望するタンパク質を抽出するのに十分 な時間、絶えず撹拌することによって抽出する。好ましくは、抽出は、約４〜２ ０℃の間で８〜１２時間、フェニルメチルスルホニルフルオライドのようなタン パク質分解バク質を得るのに十分な時間、適当なＧｕＨＣｌ−トリス・塩酸緩衝 液に接触させることによって抽出できる。脱塩した子ウシ骨粉末１００ｇの典型 的な抽出においては、４門ＧｕＨＣ１−０，ＯＩＭ　トリス・塩酸１１ｉ液（ｐ Ｈ７，０）による３日間の抽出で約１５００ｍｇの総タンパク質が抽出された０ 本発明の方法において、３日間の抽出で得られた総タンパク質の８０％以上が、 ４Ｍ　ＧｕＨＣｌ−０，０１１１）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）により最初 の８〜１２時間で抽出できることを認めた。抽出の最初の８〜１２時間で、一般 的には３日間の抽出で得られる低分子量タンパク質群の９５％以上が回収される 。骨形成活性の大部分はこれらの低分子量タンパク質に結びついている。脱塩前 粉末の乾燥型ｔ　（ｇ）あたり約１５ｍ１の４Ｍ　ＧｕＨＣｌ　−０，０１Ｍ　 ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）を使用する。抽出期間が完了した後、抽出物 をたとえばワットマン紙で濾過し、従来の方法により濾液をｆＡ縮する；−Ｃ的 な実験では、約５．０００ダルトンの分子分離する膜濾過材を備えたアミコン限 外濾過装置（Ａａｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　、マサチューセッツ州ダ ンバース）をａｍ工程に使用する（すなわち、膜は約ｓ、ｏｏｏダルトン以上の 分子量を持つ分子を保持する、たとえばＹＭ−５のようなり１ａｆｌｏ　（登録 商損）　Ｉｌｌ外濾過ｆｆ）。 本明細書中に記した種々の緩衝液、たとえば４Ｍ　ＧｕＨＣｌ−（１，０１Ｍト リス・塩酸緩衝液、そして０．５Ｎ塩酸溶液のような溶液は、所望の物質が所望 の濃度で水中に存在する水性緩衝液あるいは水溶液である。濃縮タンパク質溶液 のタンパク質成分を、高速液体クロマトグラフィー（）ＩＰＬＣ）を含めた従来 の様々なりロマトグラフ手法を用いて、次のようにして分別した： 最初のタンパク質画分は、セファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａｇ　／ 　ｌｌｌの濃度まで濃縮する９種々の抽出物製剤およびカラム画分中のタンパク 質の濃度は、２８０ナノメーター（ｎ■）での溶液の吸光度を分光測光測定のよ うな従来の方法によって評価する。適量のタンパク質濃縮物（約５００■ｇのタ ンパク質に相当する量）を４Ｍ　ＧｕＨＣｌ−０，０１Ｍ　）リス・塩酸緩衝液 （ｐ）Ｉ　７．０）で平衡させた５ｃｍ×９０ｃ閣のセファロースＣＬ　−６Ｂ カラムに通用する。約５０〜１００ｃ―の静水圧で４Ｍ　ＧｕＨＣｌ　−０，０ ＩＭ　）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）によりカラムを溶出し、１５〜２０− １容量の各百分を収集する。　２８０　ｎ−での各両分の吸光度を測定すること により、上記条件下での一般的溶出プロフィールが得られ、第１図にそれを示し た。 本明細書中に記した骨ｖ！：導分析法を用いて、セファロースＣＬ−６Ｂカラム から溶出した様々な両分の骨誘導活性を測定し、第１図中のｒ　（Ｊと記した百 分のプールが骨形成活性の原因となる因子を含むことが明らかになった。貯留画 分■、■および■からなるプールＣを、従来の方法を使用して濃縮した。ｔｌ準 的抽出において、セファロースＣＬ−６Ｂカラムでの総タンパク質の溶出から得 たブールＣは、４Ｍ　ＧｕＨＣｌｏ、ＯＩＭ　）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，０ ）による脱塩子ウシ骨粉末の８〜１２時間抽出で得られる総タンパク質の約４０ ％に相当する。セファクリルＳ−２００（Ｐｂａｒｍａｃｉａ　Ｃｈｅｓ＋１ｃ ａｌｓ、ニューシャーシー）でのクロマトグラフィーによってさらに分別を実施 した。一般的な実験では、ブールＣからのタンパク！７５〜ｉｏｏ　ｍｇを約２ ５ｍｇ／ｍｌの濃度で２．２　ｃｓｉＸ１１５　ｃ−のセファクリルＳ−２００ カラムに通用し、約５０〜７５ｃｍ＋の静水圧下で４Ｍ　Ｇｕ）ＩＣＩ−０，０ １Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐ）ｌ　７．０）によりカラムを溶出して、約４謹ｌ 容量の各百分を収集する。上記条件下で得た典型的な溶出プロフイクーマシーブ ルー染色によりタンパク質帯を視覚化する、ドデシル硫酸ナトリウム存在下での 従来の不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用したタンパク質の分析で、 α〜δの各プール中に存在するいくつかのタンパク質が同定された

【レムリ（Ｌ ａｅｍ−一１１）、英国、ＮＪｌｔｕｒ（Ｉｘ第２２７巻、第６８０〜６８５買 （１９７０））　、αプールはｓｏ、ｏｏｏダルトン以上の分子量を持つ少数の タンパク質成分を含むことが認められた；βプールは、３８．０００〜４０．０ ００ダルトンの主要橿、ある種少数の高分子量汚染物質、および１４．０００〜 ３０．０００ダルトンの間で移動する少量の低分子量タンパク質を含みγ夏およ びγ■ブールは、３１　、０００〜ａｓ、ｏｏｏダルトン、２２．０００〜２５ ．０００ダＪＬ／　）　７．１６．０００〜１８．０００ダルトンおよび１２． ０００〜１４，０００ダルトンで移動する４つの主要サイズ分類種を含み；δブ ールは、主として１２．０００〜１４．０００ダルトンの範囲のタンパク質を含 むことが認められた。 本明細書中に記されているような骨誘導分析での活性測定は、γ１およびｒｎプ ールが骨形成を誘導する因子を含むことを示唆した。 １表に示す、前述したように、各主要タンパク質種に第１表に示すような認定コ ード（ＰＩ、Ｐ２等）を割り当てた。 タンパク質種の分子量割当てはすべて、ドデシル硫酸ナトリウムおよび還元剤の 存在下での融解ゲル中のｐＨ８，８の１３％アクリルアミドによる不連続ポリア クリルアミドゲル電気泳動での移動度に基づく、少数タンパク質種は、ゲルに関 して分析した各サンプル中の総物質の１０〜１５％未満であった。　”ｐｓｂは 、非還元条件下で約１０．０００ダルトンで移動し、これによってＰ５ａとｐｓ ｂｉＪ別することができる。 ’　ＪＪ１ｔ！ｉｆ　の１ＨＰＬＣ セファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフイーから得た部分精製タンパク質 製剤を、４２１型マイクロプロセンサーユニツトによって制御されるベックマン ・アルテックスＨＰＬＣを使用した逆相ＨＰＬＣにかけ、さらに精製工程を実施 した。２つの研究方法が採られた。 単離したタンパク質の一部、特に本明細書中に記したＰ３タンパク質族およびそ れと同時精製される骨形成活性タンパク質製剤の特徴は、Ｇｕ）ＩｃＩのような 強力な解離剤の不在下ではｔａｇ性がないことである。さらに、多数のタンパク 質種が１つのプール中に同時に存在する時、ＧｕＨＣｌを除去すると、Ｊ二且を 含んだＰ３タンパク質と共に他のタンパク質の共同沈降が生じた。そのため、１ つまたは２つの主要タンパク質のみからなる限られたプールをセファクリルＳ− ２００カラムから得、ＨＰＩ、Ｃによるその後の精製のための出発物質として使 用する方法を開発した。さらに、溶液中の有する従来の透析膜管が都合よく使用 される。その後ＴＰＡ　：＾ＣＭ溶媒に可溶なタンパク質が、遠心分離により各 透析したプールから不溶性物質を除去することによって都合よく得られた。この 時点での可溶性タンパク質は、本明細書中に記したプロテシール３００オクチル カラムのような逆相ＨＰＬＣカラムでのクロマトグラフィーにかけることができ た。一般的な実験では、このようにピーク画分から得たＴＰＡ　：＾ＣＮ可溶性 タンパク質を、０．１％ＴＦ＾　：１０％ＡＣＮで平衡させた粒子サイズ１０ミ クロンの０．４６ｃｍＸ２５．Ｏｃｍプロテシール３００オクチルカラム（Ｗｈ ａｔｓａｎｎ）に通用した。このような条件下でカラムに結合したタンパク質を 、４５分間展開させた１０〜８０％八ＣＮ直線へ配を用いて６０ｍ１／ｈｒの流 速で溶出した。一般的な実験では、第３Ａ図に示されているように、ｙｌビーク からＡＣＮ　１度を（点線で示されているように）上昇させていくと共にＰ２お よびＰＬタンパク質が連続的に回収された。同様に、ＰＩタンパク質がβビーク から得られ、Ｐ５ａおよびＰ５ｂがδピークから得られる。　Ｐ３タンパク質お よびそれに関連する骨形成活性タンパク質は、セファクリルＳ−２００カラムの ｒｌとｒｎＨ域の間で溶出する。　Ｐ３およびＰ３０Ｆ　３に旦タンパク質製則 は、ＴＦＡ　：ＡＣＮに対する適当な関数の透析によって得られる可溶性および 不溶性の両物質中に認められる。　Ｐ３およびＰ３０Ｆ　３１−３４タンパク質 に可溶性が欠けていることから、不溶性物質中に実質的に精製されたＰ３タンパ ク質の存在下で骨形成活性タンパク質が生じる。ＴＦＡ：＾ＣＮ溶媒の溶液中に 保持されるＰ３およびＰ３０Ｆ　３１−３４タンパク質は、上述したよう；逆相 ＨＰＬＣによってさらに精製することができる。 タンパク質を本質的に均質な状態に精製するための第二の方法Ｓ−２００カラム クロマトグラフイーからｒｌおよびｒＵブール（すなわち、骨誘導活性が認めら れるプール）に溶出するタンパク質を約１０＋ｇ／ｍｌに濃縮した。該物質を１ ５〜２３°Ｃの脱イオン蒸留水に対して速やかに透析した（　（２，０００ダル トンの分子量分別サイズを有する透析管を用いて）、たとえば、２〜３時間ごと に各々４リツトルずつ６回交換）〕、沈降したタンパク質を遠心単離によって収 集し、タンパク質の濃度を１０１ｇ／洗浄水■１以上に保ちながら脱イオン蒸留 水で数回洗浄した。この沈降物質の主な成分はＰ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５ａで あることが認められた；ある時には少量のＰＩタンパク質を樟々な量で認めた。 ！ｌ終ベレットを、１５％＾ＣＮを含む０．１％ＴＦＡ中に溶解し、溶解した物 質をプロテシール３００オクチルカラムに通用した。第３Ｂ図の典型的溶出プロ フィールに示すように、ＡＣＮ　１度が上昇すると共にＰ２、Ｐ４、Ｐ５ａおよ びＰ３タンパク質が溶出した。 第１！ｌに記した各主要タンパク質種をプロテシール３００オクチルカラムで再 びクロマトグラフにかけることによってさらに精製した。第３図に示したように して得た百分のプールを凍結乾燥によってＩｌｌ、０．１％ＴＦＡおよび個々の 凍結乾燥物質に応じて約１０〜２０％ＡＣＨの混合溶液中に再溶解し、再びプロ テシール３００オクチルカラムに通用した。タンパク質をより長時間溶出させる ことを除いた本明細書中で前述したような条件下で、１０〜８０％＾ＣＭ直線勾 配を用いて６０＠ｌ／ｈｒの流速でカラムからタンパク質を溶出し、多くの個別 画分が生じた。各タンパク質画分の純度を、従来の不連続ＰＡＧＥを使用して測 定した。１つの主要種のみを示した分画を、さらに化学的および生物学的特性づ けのために使用した。 箪４図は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルでの一般的な不連 続ゲル電気泳動分析の結果を示している０分析は、融解ゲルがｐＨ８，８の時に アクリルアミド中にて１３％およびビス−アクリルアミド架橋剤中にて０．３５ ％である、還元剤及びドデシル硫酸ナトリウムの存在下での不連続ポリアクリル アミドゲル方法で実施した。ゲルに３０分間５０ポルト、次に１００ボルトを７ 時間通電した。クーマシーブリリアントブルーＲで染色してタンパク質帯を視覚 化した。カラム１および８は、次の標準分子量マーカーを持つゲルを表わす７９ ５，０００　（ホスホリラーゼＡ）　、６８，０００（ウシ血清アルブミン）　 、４３，０００　（オボアルブミン）　、３１．０００（炭酸脱水酵素’）　、 ２１，０００　（大豆トリプシン阻害剤）および１４．０００　（リボヌクレア ーゼ）；カラム２．３．４．５および６は、各々脱塩した子ウシ骨粉末からの２ １、Ｐ２、Ｐ３　（Ｐ３０Ｆ３１−３４タンパク質を含む）、Ｐ４およびＰ５タ ンパク質（ＣＰＩ〜ＣＰ５）を示す；そしてカラム７は脱塩したヒト骨粉末から のＰ３／骨形成タンパク質（ｌＩＰ３）を示す、斜線で陰をつけた部分は低濃度 の帯である。 Ｐ３／骨形成タンパク質を含む子ウシおよびヒトタンパク質製剤は、本明細書中 に記した生物学的方法に従ってラットに移植する時、約３遇間で移植部位におけ る骨の形成を誘導する。異なる哺乳類から単離したＰ３タンパク譬族のタンパク 質と共に同時精製される骨形成タンパク質は、一般に哺乳類において骨形成活性 を示すと思われる。従って、Ｐ３タンパク質は、上記の方法に従って一次骨形成 因子と同時精製されるタンパク質と免疫学的に関連性を有するタンパク質族であ る。 搗　ノ　シスーム を本明細書中に記したように脱塩し、引き続き脱塩骨粉末１グラム当り４Ｍ　Ｇ ｕＨＣｌを１回につき１５〜２０ｍ１用いて３回抽出する。抽出した基質を水で 十分に洗浄し、エタノールとエーテルでさらに洗浄してから乾燥させる。この粉 末をラット等の実験動物に移植しても、骨形成は誘導せず、不活性骨基質（１Ｂ ＋１）と命名された。タンパク質製剤の活性を測定するために、ＩＢＦ９粉末を タンパク質水溶液あるいは！！！濁液に混ぜ、水分を凍結乾燥法により除去した 。 再組織された基質をゼラチンカプセルに詰め、若いラット（１〜２力月齢）の大 腿筋付近に皮下移植する。各カプセルでは、定量のＩＢＦ　と探りな量のタンパ ク質製剤を各カプセルに入れ、異なるタンパク譬製剤量の有効性を判断する。各 移植における骨形成活性は、次の２方法により評価する：　（ａ）移植後１７〜 ２０日後の移植組織中の酵素アルカリフォスファターゼレベルの測定、および（ ｂ）移植部に生じた組織の５〜７ミクロン厚切片をパラフィン固定して、トルイ ジン・ブルー（軟骨１５質と骨基質を染色）、ヘマトキシリン−エオシン（ｍ雄 状組織、軟骨性組織および骨組織を解明する）およびフォノ・コッサ銀染色（骨 組織の石灰化基質用）処理を行なった後、咳切片の組織学的検査を行なう。 骨の活発な形成には、アルカリフォスファターゼ酵素の顕著な増加が先行するの が特徴であり、また移植部周辺の卵管繊維性組織と比べて、アルカリフォスファ ターゼ酵素が安定して高レベルであると骨形成が持続的に行なわれるので、この 酵素レベルを測定する。タンパク質製剤中の骨誘導活性レベルの概夏定量は、多 植組織の単位重量当りのアルカリファスフォターゼレベルを定量して行う、實際 には、移植組織をトリス−生理食塩水等の適当な緩衝剤中で均質化し、非イオン 性洗剤に溶解し、遠心分ａ機を用触媒作用によるバラニトロフェニルホスフェー トからバラニトロフェノールへの転換を測定し、既知の酵素活性標準曲線から夏 山して行う。 生物学的定量の研究において、セファクリルＳ−２００カラムからのタンパク質 プールは、ｌＢ１１で再組織され、ラットの大腿に皮下移植された。移植後１７ 〜２０日後に採出した＆ｌＩ織培養片のアルカリファスファターゼ活性測定と組 織学的評価では、ＰｌおよびＰ５ａ〜Ｐ５ｂタンパク質には骨誘導活性が無かっ た。生物学的定量の研究ではｒｌとＴｎブールのタンパク質が最大の骨形成活性 を有する事が判明したｅ　ｒｍ分の３大成分、すなわちＰ２タンパク質、Ｐ３お よびＰ３０Ｆ　３１−３４タンパク質、ならびにＰ４タンパク質は、上述の逆相 １１ＰＬｃ法により精製された。精製タンパク質は、単独でも完全な混合物でも 、不活性骨基質で再組織され、骨誘導分析がなされた。その結果を第２表に示す 。 星！ ＩＢＭ”単独　〈５　繊維性組織 第２表のデータによると、Ｐ３タンパク’ｉ　（Ｐ３０Ｆ　３１−３４タンパク 質を含む）のみが骨形成を誘導した。　Ｐ３とＰ３０Ｆ　３１−３４製剤を含存 する移植組織がアルカリフォスファターゼ酵素活性が高レベルである組織になっ た。これに対し、Ｐ２またはＰ４の製剤を用いて再構成した移植組織では、検知 可能な骨の生成ができなかった。 ３製剤全部を組み合わせて使用すると、顕著な骨形成が認められ、Ｐ３タンパク 質製剤の１７３量ではあるが（Ｐ３タンパク質移植のみと比べて）高レベルのア ルカリフォスファターゼ酵素が得られた。 このようにＰ３０Ｆ　３１−３４を含むＰ３タンパク質製剤が低濃度だと、Ｐ２ および／またはＰ４タンパク質の存在がＰ３タンパク質製剤による骨形成の誘導 を促進するものと考えられる。 本明細書で述べた活性製剤を使用する際は、薬学的に許容可能な担体の存在又は 不存在下でタンパク質および／または活性ポリペプチドおよび／または免疫学的 に関連する物質の骨形成量だけ骨誘導を所望する哺乳類の身体部位あるいはその 近辺に投与する。 投与は、治療対象の年齢、健康状態、性別およびその他の特徴により決まる。移 植、局所注射またはマイクロカプセルや他の装置の使用による時間制御徐放によ る投与が好ましい、投与量は治癒すべき部位と治療箇所の形態、たとえば骨折域 等によって異なる。 たとえば、約１００〜２００　μｇのＰ３タンパク質の投与、あるいは約１００ ｓ＋ｇのＩＢＭを移植形式で局所移植すると、５　ｍｍ”の骨片が形成される、 活性製剤には、成長因子、走化剤、ステロイド、抗生物質、抗炎症剤等のような 、その他適当な生理活性物質が含まれる。 免疫学的に関連のあるタンパク質のＰ３族を製造する実施例１の方法は、脱塩工 程、グアニジン抽出工程、非還元変性溶媒中でのサイズ分別工程、透析工程およ び逆相１１ＰＬｃ工程を含む、サイズ分別工程の改良型は、多量の材料を分別し 、ｓ、ｏｏｏまたは１０，０００ダルトンと１００，０００ダルトン（５Ｋ　− １００Ｋまたはｌ０Ｋ−１００Ｋ）の間で分子量カットのできる分子分粒フィル ターの使用を含む、サイズ分別工程の第二の改良法は、非還元変性溶媒中のゲル 濾過クロマトグラフィーカラム（セフ・アクリルＳ−２００）からより狭い分子 量域にあるタンパク１Ｎ分を溶出して、その百分をプールすることである。　Ｓ −２００カラムを用いると骨形成活性は、２５，０００〜３８．０００ダルトン 分子量域に対応する範囲に溶出するが、これに反しＰ３タンパク質精製に使用し たｙｌとｒｎブールは、１４．０００〜２５．０００ダルトンの分子量域を移動 するＰ３タンパク質中の主要免疫原決定因子に対抗すべき抗体と免疫反応性のあ る１４．０００〜４０，０００ダルトンの分子量を持った物質に対応した。（第 ８図）これらの改良を加えた方法により、骨形成活性は、Ｐ３族の関連タンパク 質の溶出に用いたアセトニトリルと同濃度のアセトニトリルで、逆相ＨＰＬＣカ ラムから溶出する。　Ｓ−２００活性プール（２５，０００〜３８．０００ダル トンの分子量域で溶出する）の逆相Ｈ，ＰＬＣでは、追加分別工程または異なる 分別工程を用いて細分別できるＰ３タンパク質成分をさらに分離できる。 ＤＥＡＥイオン交喚クロマトグラフィーカラム（ファーマシアケミカルス、ニュ ーシャーシー）を用いて２５．０００〜３８．０００ダルトンタンパク質の、骨 形成活性プールを分別すると、１１）１６．５では骨形成活性はＤＥＡＥカラム に結合せず、ＤＥＡＲカラムに結合する物質から単れ以上で活性が回復した。こ のＰ３タンパク質中の骨形成活性分子の継続した精製処理もまた、骨形成活性が ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β免疫反応性物質とは相違していることを示した。結 合している骨形成活性はｐＨ６，８で平衡化しているモノ−５ＦＰＬＣ（高速タ ンパク質液体クロマトグラフィー）カラム（ファーマシアケミカルス、ニューシ ャーシー）に結合し、ＴＣＦ−βまたはＴＧＦ−β免疫反応性物質を溶出するの に用いたのより高濃度の塩化ナトリウムで溶出することができた。モノ−Ｓカラ ムから再度溶離したＳ活性プール中の骨形成活性が、Ｐ３タンパク質を溶出する のに要したアセトニトリルと同濃度のアセトニトリルで、逆相ＨＰＬＣカラムか ら溶出する特徴も判明した。 ２：ウシのＡ／　る この実施例では、多量の骨粉末からＰ３タンパク質の骨形成活性３１．０００〜 ３４．０００ダルトン成分を完全に精製する代替法を例示し、２２、０００〜２ ４，０００ダルトンの主要タンパク質成分が実質的に存在していなくともＰ３タ ンパク質の少数成分であるタンパク質成分が骨形成活性を有することを示す、こ の実施例では、ウシの骨形成因子を第９図に示す方法に従って脱塩子牛骨粉末か ら単離する。約２００ポンドの子牛骨の骨幹部から結合組織を削り落とし、骨髄 を除去した。骨髄除去部を粉末にして、約２．１００リツトルの冷脱イオン水で 洗浄した。骨粉末は洗浄中に沈澱させ、懸濁結合組織切片は、上澄み液で除去、 廃棄した。 骨粉末を、０．５Ｍ冷塩酸の総量約５７０リツトル中に約２時間ＭｆｆｉＬでか ら、沈澱させた。塩酸を上澄み液で除去し、廃棄した。 棄した。 脱塩骨粉末はｐＨ７の０．０１Ｍ　）リスおよび０．００１１１　ＥＤ丁＾を含 有する約１４０リツトルの４ｈ冷塩酸グアニジン中に約２０時間懸濁した。 抽出骨粉末を濾過して取り除き廃棄した。この上澄み液（グアニジン抽出物）を 貯えておく。 グアニジン抽出物を１００．０００ダルトンの平均分子量分離するアミコン螺旋 形カートリッジに通して濾過した。この１００．．０００ダルトン濾１（１００ に濾液）を１０．０００ダルトンの分子量分離するアミコン螺旋形カートリッジ を通してＩ縮した。　１０．０００ダルトン保持物Ｃｌ０Ｋ保持物）を採り、ｐ Ｈ値、導電率、ＢＣＡ比色クンりク賞分析法（ピアスケミカルス、ロックフォー ド、イリノイ）による総タンパク質量、還元５Ｏ５−ＰＡＧＥとそれに続く銀染 色またはクーマシーブルー染色を用いた製剤中のタンパク質成分の分析、および 下記実施例３に記述するラット移植検定法を用いた骨形成活性の測定等の分析を 行なった。 １０に保持物は、１０，０００ダルトンの分子量分離するアミコン螺旋形カート リッジによる直径濾過により、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（Ｍ ＥＳ）　、ｐＨ６，５を５０■ｉ含有する尿素６Ｍにと変換された。 直径濾過した抽出物は５１　水酸化ナトリウムを用いてｐｉ　６．５．５ｉ　塩 化ナトリウムを用いて導電率１０■Ｓ／ｃ−に調整されて、ｐＨ６，５のＭＥＳ を５０−ｈ含有し、導電率を１９曽Ｓ　／　ｃ■に調整した６Ｍ尿素で平衡化し た０、４　リットルＳ−セファロースカラム（ファーマシアケミカルス、ニュー シャーシー）へ適用した。カラムをｐＨ６，５のＭＥＳ　５０５Ｍを含有する導 電率１０ｓＳ／ｃｍに調整した尿素６．０１１．２．４　リットルで洗浄して、 未結合タンパク質を溶出した。Ｓ−セファロ−膜フィルターを用いて′ａ縮した 。製剤のｐＨ（ｉと導電率を測定し、総タンパク質含有量はＢＣＡタンパク質分 析法で測定したタンパクｔ＆Ｕ成は５ＯＳ−ＰＡＧＥ法、そしてそれに続く銀染 色法により分析し、骨形成活性はラット移植検定法を用いて測定した。 Ｓ−セファロース活性プールは、ＰＨ９，５のエタノールアミンを２０ｍＭ含有 する尿素６ｎで均衡している３　’）　７　）ルセファデックスＧ−２５カラム （ファーマシアケミカルス、ニューシャーシー）を用いてゲル濾過した。活性プ ール（Ｇ−２５プール）を含有する最初のタンパク質ビークは、ｐｉ　９．５の エタノールアミン２０−Ｍ含有の６Ｍ尿素３リツトルで溶出された。 ６．２５プールをｐ）ｌ　９．５のエタノールアミン２０−Ｍを含有する６ＰＩ 尿素で平衡化している０、７　リットルローセファロースカラム（ファーマシア ケミカルス、ニューシャーシー）に通用した。カラムをｐｕ　９．５のエタノー ルアミン２０＋ｓＭを含有する６１尿素２．１　リットルで洗浄して未結合タン パク質を溶出した。骨形成活性タンパク質ブール（ＱＳブール）をｐ）Ｉ　９． ５のエタノールアミン２ｈＭと０．２１１塩化ナトリウムとを含有する６Ｍ尿素 １．４リツトルを用いてＱ−セファロースカラムから溶離した。　ＱＳ−プール を氷酢酸でｐＨ６〜７に１１Ｍ整し、約１０，０００ダルトンの分子量分離する 膜フィルターを用いて濃縮した。　ＱＳブールのｐＨ値と導電率を分析し、ＢＣ Ａタンパク質分析法により総タンパク質含有量を測定し、還元５Ｏ３−ＰＡＧＥ 、それに続く銀染色法により、タンパク質組成を分析し、骨形成活性をラット移 植検定法により測定した。 Ｏ５−プールを次に、体積で７０％の緩衝液Ａ（緩衝液Ａｎ）リフルオロ酢酸０ ．０５％の水溶液）および３０％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：分で溶出された。以前 に実施例１のＰ３タンパク質を特徴づけたように、骨形成活性（製剤ＨＰＬＣプ ール）は、３５〜４５％の濃度のア七ト二トリルで溶出した。製剤ＨＰＬＣブー ルを凍結乾燥し、１ｍｌの水に再懸濁した。この製剤ＨＰＬＣプールのｐＨ値、 導電率を分析し、ＢＣＡタンパク質検定検定法り総タンパク質含有量を測定し、 還元５ＯＳ−ＰＡＧＥ、それに続く銀染色法により、タンパク質組成を分析し、 骨形成活性をラット移植検定法により測定した。 製剤ＨＰＬＣプールは、ｐＨ７，５〜８．０のトリス５０ｍＰＩ、エタノールア ミン２抛門および塩化ナトリウム０．５Ｍを含有する尿素６ｈ中で、タンパクｆ 　ｆＡｒＸｏ　、　５　農ｇ　／　ｍ　１に調製されて、Ｃｕ”°で帯電し、ｐ Ｈ７，５〜８．０のトリス５０−ｎ、エタノールアミン２０−Ｍおよび塩化ナト リウム０．５？Ｉを含有する尿素６ｉで均衡している５〜１０１のキレートセフ ァロース６Ｂカラム（ファーマシアケミカルス、ニューシャーシー）に通用され た。カラムを、５カラム量の平衡緩衝液、次いでｐｌ（７，４〜７．８のトリス ５０−Ｍを含有する１０カラム量の尿素６１で洗浄して、未結合タンパク質を溶 出した。結合タンパク質は、ｐｈ　７．４〜７．８のトリス５０ｍＭとイミダゾ ール４ｍＭとを含有する１０カラム量の尿素６門で溶出された。骨形成活性（Ｃ Ｃプール）は、ｐｉ（７，４〜７．８のトリス５０＠Ｍとイミダゾール１５ｍＭ とを含有する１０カラム量の尿素６１′Ｉにより、銅キレートカラムから溶出さ れた。ＣＣブールの総タンパクＴｔＭを、２ＢＯｎ−での吸光度で分析し、骨形 成活性をラツｌＩ！検定法により測定した。 ＣＣブールを２５％硫酸アンモニウムに調製し、２５％硫酸アンモニウムとｐＨ ７，４〜７．８のトリス５０園Ｍとを含有する尿素６ＦＩで平衡化した１〜３ｍ ｌフェニル−セファロースカラム（ファーマシアケミカ１５％硫酸アンモニウム とｐＨ７，４〜７．８のトリス５０５１Ｍとを含有する１０カラム量の尿素６Ｍ で溶出された。骨形成活性（ＰＳブール）はＰＨ７，４〜７．８のトリス５０Ｊ を含有する尿素６Ｍでフェニル−セファロースカラムから溶出して、総タンパク 質量を２８０ｎ−での吸光度から算出して分析し、骨形成活性をラット移植検定 法により測定した。 ｐｓプールを、上述の体積７０％緩衝液Ａと３０％緩衝液Ｂ　（１１衝液Ａは０ ．０５％トリフルオロ酢酸の水溶液、緩衝液Ｂは０．０２５％トリフルオロ酢酸 のア七ト二トリル液）とを含有する緩衝液で平衡化している準製剤用または分析 用Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムに通用した。結合タンパク質は、３０〜６０％アセト ニトリルの直線勾配を用いて溶出した。前述したのと同様、骨形成活性（ＨＰＬ Ｃブール）は、濃度３５〜４５％のア七ト二トリルで溶出した。　ＨＰＬＣブー ルの総タンパク質量は、２２９ｎｓ＋での吸光度から算出して分析し、骨形成活 性は、ラット移植検定法を用いて測定した。 ウシの１ノ　の 下記の実施例では、ウシの骨形成因子製剤の特徴を種々の方法により明らかにす る。 ３：　８パ 骨基質の誘導は、セン、ウォーカーおよびエイナーソンが１９８６年に一般的に 著したような、ラフ日多植検定法により測定する。 「　１と１　の　と　」著者Ａ、センおよびＴ、ソーンヒル、ｐｐ、２０１〜２ ２０．＾ｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｓａｍｐａｔｈ 　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ＋ゼラチンカプセル（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　１５）に詰め 、各カプセルを族ロング・エバンスラットの後脚部の大腿筋付近に皮下移植した 。移植ラットは、移植後２１〜２８日で解剖し、移植組織を摘出してブイヨン液 に入れた０次に試験片を脱石灰してトルイジンブルー染色断面を作成した。染色 断面検査により＆ｌｌＩ！形態学と骨化率を測定した。 発生能は、不活性骨基質に染色断面積の少なくとも１０％に類骨活性が発生する までの移植に要したタンパク質量（ｍｇ）により決定された。 １主１ １屋２製 ラットでの発生能 １ＬＪｉ　箆しヱバＬｌ　−一襲紅技盪り一グアニジン抽出物　１３０．０００ 〜１７０．０００■ｉｏｘ保持物　６，０００〜１５，０００　ｇ　１０．０Ｓ −Ｓプール　３００〜９００１ｇ　１．０ＱＳブール　７０〜２５０ｇ　０．２ ５製剤ＨＰＬＣ活性プール　４〜１２　ｕ　０．０５ＣＣブール　２〜５　［０ ，０２５ 上記第３表に、実施例２の精製工程を用いて得た各種骨形成活性タンパク質の製 剤の発生能向上の様子を示すが、これによるとＨＰＬＣ活性プールは、０．００ １　ｍｇ／Ｂ植の発生能を有し、これは実施例１の方法により製造したＰ３タン パク質よりもかなり高い値である。 ４：Ｌｉ゛の 実施例２に記載した各種精製工程を用いて得た骨形成活性タンパク質製剤を、Ｓ Ｏ５試料希釈緩衝液（還元剤不在下で）にＭ湧し、１０％ＳＯＳポリアクリルア ミドゲルに通用し、電気泳動を行なった。 初Ｍ染色分子量基準（ベセスダ研究所、ガイザースバーグ、メリーランド）ある いは、非初期染色分子量基準（バイオ・ランド、リッチモンド、カリフォルニア 〕と比較して、分子量を決定した。 終了後、ゲルレーンを薄く切って細片にした。各細片を電気溶出してタンパク質 を抽出した。溶出タンパク質はアセトンで沈澱させ、塩酸グアニジン中に再懸濁 して、水で透析し、次に不活性骨基買上で凍結乾燥して、実施例３の骨形成活性 分析をするためにラットに移植した。このゲル方法では、骨形成活性は見かけの 分子量域２８．０００〜３４，０００ダルトン相当のゲル細片から溶出した。 ５：　町　２五ｑ分王ｌ 実施例２のＩ（ＰＬＣ活性プールで得た、精製骨形成活性タンパク質を、還元剤 不在下（−ＤＴＴ）でＳＯ５希釈緩衝液中に懸濁し、１２．５％または１５％Ｓ ＯＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動して、タンパク成帯をｍ染色によ り視覚化した０分子量は非初期染色分６：　−での　１ノ　の　および −サブユニ・　の ＨＰＬＣ活性プール中の精製骨形成活性タンパク質を別の分析方法、すなわちジ スルフィド結合で結合されたタンパク質サブユニットを還元剤（ジチオスレイト ールまたはβ−メルカプトエタノール）存在下、ＳＤＳ希釈緩衝液中でこれら結 合を還元して分解し、１２．５％または１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを 用いて電気泳動する分析法に通用した０分子量は非初”期染色分子量基準（バイ オ−ラッド）と比較して定めた。このゲル方法によ・す、ＨＰＬＣ活性プールに は分子量域１６．０００〜１７，５００および１７，５００〜１９．０００ダル トンの２つの広域帯を移動するタンパク質があることが判明した（第１０Ｂ図参 照）。 ＨＰＬＣ活性プールは、ジスルフィド結合を還元するために塩酸グアニジン中に ６Ｌエタノールアミン中に５０１、そしてジチオスレイトール中に５０ｍＭの濃 度で置かれた。還元されたサンプルを、少なくとも２倍の水あるいは０．０５％ トリフルオロ酢酸水溶液で希釈し、前述の体積比７０％Ｉ衝液Ａと３０％緩衝液 Ｂ　（＄１衝液Ａは０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液、緩衝液Ｂは０．０２５ ％トリフルオロ酢５！１１のアセトニトリル液）からなる緩衝液で平衡、化して いる分析用Ｃ−□・１８１１ＰＬＣカラムに適用した。結合タンパク質は３０％ 〜６０％アセトニトリル直線勾配を用いて、６０分で溶出された。Ａ、Ｂ、Ｃお よびＤと称するタンパク質の４つの顕著なピークが２２９１−での紫外線吸光度 を観察することにより検出されたが、これらは、４０〜４７％アセトニトリル濃 度で溶出された（第１１＾図参照）、還元ＳＤＳゲル電気泳動、及び銀染色で分 析した時、還元サブユニットＡは、分子量域を移動していた（第１１Ｂ図参照） 。 ７：ウシの８／　゛　ンパク　Ｐ３　ＯＦ　３１−３４のアミノ■剋 実施例６に開示したＨＰＬＣ活性プールから精製した、単離還元サブユニットを 、気相アミノ酸配列分析装置（アプライドバイオシステム、４７０Ａ型）を用い て分析し、下記の末端アミノ酸配列を有することが判明した。 サブユニットＡ　：　５ＡＰＧＲＲＲＱＱＡＲＮＲ５ＴＰＡＱＤＶサブユニツト Ｃ：　５ＸＫＨＸＸＱＲＸＲＫＫＩＩＮＮサブユニツトＤ　：　５ＴＧＧＫＱＲ ＳＱＮＲ５ＫＴＰＫＮＱＥＡここでアミノ酸は、下記第４表に示す周知の１文字 表記および３文字表記で示される。 アラニン　Ａｌａ　Ａ アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ システィン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｉｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グリシン　ｃｒｙ　Ｇ リジン　Ｌｙｓ　Ｋ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ セリン　Ｓｅｒ　Ｓ スレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ トリプトファン　Ｔｒｐ　Ｗ 単離サブユニットＢのアミノ端未配列は検出不能であった。サブユニットＢを５ ｔａｐｈν８プロテアーゼで分解し、ＨＰＬＣで再度クロマトグラフ処理をする と、下記のアミノ酸配列を育する２種の検出可能な内部断片が単離された。 サブユニ７　）　Ｂ　：　ＸＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＸＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭ ここでＸは、不明のアミノ酸を表わす。 ８：　＾１ 本発明の骨形成製剤は、哺乳類へ移植する骨形成組成物を製造するのに用いる。 実施例２の製剤ＨＰＬＣプールは、１種またはそれ以上の欅々な生理学的に許容 可能な基質と混合してもよい、該基質は、吸収性、非吸収性または不完全吸収性 でもよい、吸収性基質には、ポリ乳酸、ポリカプロ乳酸、ポリグリコール酸、コ ラー性プールは、顆粒状または固形状の基質に吸着する。骨形成組成物は次に凍 結乾燥により、乾燥される。 ９：Ｘｌ　１　に　れた 本実施例では、骨形成活性タンパク質を含む実施例２の製剤１１ＰＬｃ活性プー ルを用いて、骨欠損の治癒に有効な、骨形成活性装置を作製した。製剤ＨＰＬＣ 活性プールを、多孔性ハイドロキシアパタイト板（インターボア２００、インタ ーボアインターナシラナル、アービン、カナダ）あるいは多孔性ポリ乳酸板（ト リラック、Ｏ５ＭＥＤ　、コスタメサ、カナダ）を含む固形誘導基質に吸着させ て、装置を作製した。直径８〜ｉｏｍｓ、厚さ３■腸の板の基質上に凍結乾燥に より乾燥させた製剤１１ＰＬｃ活性プール０．２〜０．３　ｍｇを被覆した。 次に装置を３．３〜３．５ＭランドのＴｗＡ照射、あるいは他の適当な方法で滅 菌した。骨形成製剤と基質とを含む装置を、体重２．５〜３．０　ｋｇのニュー シーラント・アルピノ雌ウサギの骨芽孔欠損部位に移植した。詳細に述べると、 骨形成製剤被覆または非被覆試験装置を、適当な無菌外科術により頭蓋冠に移植 した。実験動物に、ケタミンとキシラジンの筋肉注射をして麻酔をかけた。中央 切開部に沿って頭蓋冠を露出させ、２つの穿孔穴を（中心線の片側に各１個）、 眼窩の５蒙鋤後方、直径８〜１０ｍ■、硬膜までの深さで、頭蓋冠に開けた。穿 孔欠損は、スタイル頭蓋用ドリルを用い、硬膜を損傷せぬよう十分に注意して作 成した。一方の穿孔穴に１つの試験装置を移植し、もう一方の穴は空のままにし ておいた。外科的移植の次に、ペニシリンとストレプトマイシンの抗生物質予防 法が施された。実験動物は毎日臨床観察を受けた。外移植の際、頭蓋冠は一括し て切除した。試験片を１０％緩衝ホルマリンに浸し、なった（下記第５表参照） 、活性の百分率面積は、全断面中の骨基質不在の全視野と比較して新生骨基質の 視野または視野分画を肉眼で判断して夏山する。 テスト装置　外移植の時期 ６週間　１２週間 非被覆ハイドロキンアパタイト　く】０％　＜２５％非被覆ポリ乳酸　＜１０％ 　＜１０％ 骨形成製剤破覆ハイドロキンアパタイト　〉９０％　〉９０％骨形成製剤被覆ポ リ乳酸　〉９０％　〉９０％骨形成製剤被覆でＴ線照射処理の　〉７５％　〉９ ０％ハイドロキンアパタイト 天１０　：　Ｐ３０Ｆ　３１−３４のＣＮＢｒ　のアミノ　１）ＩＰＬｃ活性プ ール（実施例６）から精製した単離還元サブユニットを、ニフフ化ポリビニール （ＰＶＤＦ）転移膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国、マサチューセッツ州、ベン ドフォード）に吸着させ、７０％蟻酸溶液中の８０＊Ｌ／ＣＮＢｒの蒸気に１５ 〜２０時間さらし、気相アミノ酸分析サブユニットＡ　：　ＣＮＢｒで開裂した 後、実施例７に記載の末端アミノ配列に対応するいくつかの断片のアミノ酸配列 決定と同時に生じた配列。 ＡＮｔ：　５ＡＰＧＲＲＲＱＱＡＲＮＲ５ＴＰＡＱＤＶおよび内部断片： ＾ｔ：　ＨＰＥＹＶＰＫ サブユニッ）　Ｂ　：　ＣＮＢｒで開裂した後、２つの内部断片のアミノ酸配列 決定と同時に生じた配列。 ８１：　ＬＹＬＤＥＮＥＩｆ ＋＋２：　シシＥＧＸＧＸＲ ５ｔａｐｈ　Ｖ８プロテアーゼで切断したサブユニットＢの断片の配列（実施例 ７）と比較した時、Ｂ１と８２断片は重複領域をもっており、サブユニットＢ内 に伸長内部配列がある。 ａｔ：　ＬＹＬＤＥＮＥに ５ｔａｐｈ　Ｖ８　：　ＸＥＫＶＶＬにＮＹＱＩＩＭＳｔａｐｈ　Ｖ８　：　Ｘ ＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＢ２　：　ＶＶＥＧＸＧＸＲ 共通配列：　ＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＩＪＮＹＱＤＭＶＶＥＧＸＧＸＲサブユニッ トＤ　：　ＣＮＢｒで開裂した後、実施例７に記載したアミノ末端配列に対応す るいくつかの断片のアミノ酸配列決定と同時に生じた配列。 ＤＮｔ：　５ＴＧＧＸＱＲ５ＱＮＲ５ＫＴＰＫＮＱＥＡおよび内部配列： ［１１：　ＸＡＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＨＦＩＮＨＰＬＣ活性プール（実施例６） から精製した単離還元サブユニットＣをＰＶＯＦ転移膜に吸着させて、気相アミ ノ酸配分析装置を用いユニット　Ｃ：ＣＮＢｒで切断した後下記内部配列を得た 。 ＣＩ　：　ＬＹＬＸＥＹＤＸＶＶＬＸＮＹＱウシの骨由来のサブユニットＡ、Ｂ 、ＣおよびＤのアミノ末端配列と内部配列は、ＢｌＩＰ−２Ａ、　ＢＭＰ−２Ｂ およびＶｇｒ−１と称するポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの推定ア ミノ酸配列の相同配列と並べることができる（第１２図）　、　ＢＭＰ−２Ａ、 　ＢＭＰ−２Ｂ　０１ｏｚｎｅｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　、　員」栓ユ、第１５２ ８〜１５３４頁、１９８８年）およびＶｇｒ−１（Ｌｙｏｎｓら、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＳ」１［ａ、、第４５５４〜４５５ Ｂ頁、１９８９年）の推定配列の相同領域は箱わくで囲んである。 ＢＭＰ−２Ａ、　ＢｌＩＰ−２ＢおよびＶｇｒ−１の推定配列と比較した、ウシ のサブユニットＡ、Ｂ、ＣおよびＤの配列中の相同残基を肉太活字で示しである 。サブユニットＢとＣの配列と、ＢＭＰ−２ＡとＢＭＰ−２Ｂの配列との類似性 と差異を比較した結果、ウシのサブユニットＢはＢＩＩＰ−２Ａと同じ配列をも っており、一方ウシのサブユニットＣはＢＦＩＰ−２Ｂと同じ配列をもっている ことが分かった。 川１１＋　’−’／　ンハ’）　Ｐ３０Ｆ３−３４（７）ｆフ−Ｌニー上俳底惣 ＨＰＬＣ活性ブール（実施例５）内で溶出され、骨形成活性タンパクπＰ３０Ｆ 　３１−３４　（第１３Ａ図）を含有する、各百分を、還元剤なしで、ＳＯＳポ リアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した（第１３８図）、第１３Ａ図は、Ｐ Ｓブールの逆相Ｃ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーで得た溶出プ ロフィルを示す、第１３Ｂ図は、ＰＳブールの逆相）ＩＰＬＣ由来の画分２６． ２７および２８中に溶出するＰ３０Ｆ　３１−３４タンパク質の非還元Ｓ［１Ｓ ポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示す、これら各両分を、５０ｍＭエタノー ルアミンと６ｉの６に記載したように）で、さらに（第１４図）分析した。第１ ４Ａ図は、ＰＳＰＳブールノ逆相ＨＰＬＣの画分２６中に溶出するＰ３０Ｆ　３ １−３４タンパク質のサブユニットを単離し同定した結果を示し、一方第１４Ｂ 図は、画分２８中に溶出するＰ３０Ｆ　３１−３４タンパク質を単離し同定した 結果を示す、サブユニットＡ、Ｂ、ＣおよびＤは図中に実線で示しである。Ｐ３ ０Ｐ３１−３４領域の底辺部のバンド（第１３Ｂ図のバンドＩ）を含有する試料 である画分２６は、主にサブユニットＢとＤを含有し、サブユニットＡとＣを少 量含んでいることが分かった。　Ｐ３０Ｆ　３ｌ−３４ｊＮ域の最上部のバンド （第１３Ｂ図のバンド■）と少量のバンドＩを含む試料である百分２日は、サブ ユニットＢの相対量と比べて、サブユニットＡとＣの量が増大し、サブユニフ） Ｄの量が減少していることが分かった。 ＨＰＬＣ活性プール内で溶出され、骨形成活性タンパク質Ｐ３０Ｆ　３に旦を含 有するこれら各画分は、還元剤なしで（−ＤＴＴ）１２．５％ＳＤＳポリアクリ ルアミドゲルの電気泳動法に適用し、次に１０％メタノール、１０ｓｔｆシクロ へキシルアミノ−１−プロパンスルホンａ（ｐＨ１０−１１）の存在下、０．５ 　ａｔｘｐで１５〜３０分間、電気泳動して、ニフン化ポリビニール（ＰＶＤＦ ）転讐多膜に転移させ、次いでクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し て視覚可した。囚」Ｌ針二旦領域中のバンドＩ　（下方位置）およびバンド■（ 上方位置）個々のタンパク質のバンドを前記の膜から切取り、まずＮ末端配列の 決定を行ない、次に実施ｔｎｉｏと同様にしてＣＮＢｒ処理して内部配列を決定 した。これらの方法によってバンドＩと■の下記の配列が明らかになった。 °　したバンド　ＩＬＪｌｉ　ヱ１王三ヱ上バフＦＩ内部　ＸＡＴＮＸＡＩＶＱ ＴＬ　ＤＬＹＬＤｔ！ＸＩ！ＸＶＶＬ　Ｂ バンドＵＮ末端　ＸＸＸＧＩＩＲＸＱ　ＡにＸＧＧＸＩ２１？　Ｄ バンド■内部　ＬＹＬ［１ＸＮＸＸＶＶＬＸｌｌ　ＢＸＰｆｉＸＶＰＸ　Ａ 上記の表中、アミノ酸は、第４表に示した周知の一文字表記法で示す。 これらの結果から、バンドｌすなわちｐｏｐ−且タンパク質の底辺部のバンドが 主にサブユニットＤとＢを含み、バンド■すなわちＰ３０Ｆ　３１−３４タンパ ク質の最上部のバンドは主にサブユニットＡとＢを含むことを示している。これ らの組成と、これらサブユニットが、精製Ｐ３０Ｆ　３１−３４クンバク賞中に ジスルフィドで結合したダイマーとして精製された（実施例５と６）という観察 結果から、サブユニットＡとＢはヘテロダイマーとしてジスルフィド結合したヘ テロダイマーであり、サブユニットＤとＢは別個のジスルフィド結合したヘテロ ダイマーであることを示している。 １２：１ン　ゞ　ンパク　Ｐ３０Ｆ　３１−３４に・　るボ１クロニ±土訳１盪 Ｕ　抜生皇各作 サブユニットＡ　ＡｂＡＮｔ （ＳＡＰＧＲＲＲＱＱＡＲＮＲ５ＴＰＡＱＤＶ）＊１ｙｓｔサブユニットＤ　Ａ ｂＤＮｔ （ＳＴＧ（ＪＲＲ５ＱＮＲ５ＫＴＰＫＮＱＥＡ）　＠　Ｉｙｓ　ｑ抗血清は、ウ サギ（３〜６月齢のニューシーラント白ウサギの１）にまず完全フロインドアジ ュバントを用いて皮下注射し、その後（１４日後と２１日後）に不完全フロイン ドアジュバントを用いて皮下注射し、次いで採血する標準法によって調製した。 ＡｂＡＮｔとＡｂＤＮ　ｔの抗血清は、ＥＬＩＳＡ法もしくはＤｏｔプロット法 に適用した時、合成ペプチド抗原類と交差反応性であり、またウェスタンプロッ ト法に通用した時は還元サブユニットＡとＤと交差反応性であった。またＡｂＡ ＮｔとＡｂＤＮ　ｔの抗血清は、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンプロット法もしくは Ｄｏｔプロット法に適用した時、骨形成活性タンパクｆｆＦ’３０Ｆ　３１−３ ４と交差反応性であった。これらの抗血清は、精製サブユニットＢとサブユニッ トＣに対してウェスタンプロット分析法とＤｏｔプロット分析法で決定したいか なるサブユニットＢもしくはサブユニットＣとも非交差反応性である。 １３　：　Ｐ３　にお番るＰ３０Ｆ　３１−３４タンパク　のＰ３中に含まれる タンパク質を、実施例１、第２図及び第３図に記載したようにして単離し、セフ ァロースＳ−２００を用いるゲル濾もしくは１５％のＳＯＳポリアクリルアミド ゲルの電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）に通用した。ゲルに含まれているタンパク 質を、クーマシーブリリアントプルーを用いて視覚化するが、あるいは１０％メ タノール、１０鵬ｉシクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン（ＣＡＰＳ） （ｐＨ　１０−１１）の存在下、０．５　ａｍｐで１５〜３０分間電気泳動して ニトロセルロースに転移させた．ニトロセルロースフィルターを、サブユニット Ａ　（ＡｂＡＮｔ）とサブユニットＤ（ＡｂＤＮ　ｔ）のＮ末端配列の合成ペプ チドに対して生成させた抗体を用いて、ウェスタンプロット分析に適用した。 タンパク質を含有するニトロセルロース紙を、（２０ｍＭリン酸塩ｐＨ　７．４ 　；　０．１５Ｍ塩化ナトリウムｉ　０．０５％ツイーン２０　；　０．２５％ ゼラチン；および０．０２％アジ化ナトリウムを含む）溶液指定緩衝液Ｐ中に、 ｆｊｔｆｌしながら２２“Ｃで最低１時間開いておいた。 次いで緩衝液Ｐを（８１衝液Ｐと抗体ＡｂＡＮｔとＡｂＤＮｔを含む）！ｌ街液 Ｑに取り替えて、２２℃で最低１時間（または４℃で一夜）置いておいた．ｕｋ 衝液Ｑを緩衝液Ｐで取り替え、該緩衝液Ｐは、最低限１時間に４回新しいものと 取り替えた．緩衝液Ｐを緩衝液Ｒ（緩衝液Ｐと″Ｓ１プロティンＡ　Ｃ２．５　 Ｘ１０’ｃｐｍ／＋ｓｌ）　、Ａｍｅｒ−ｓｈａ−社）に取り替え、撹拌しなが ら２２°Ｃで１時間培養した．緩衝液Ｒを緩衝液Ｐに取り替え、この緩衝液を１ 時間の培養中受なくとも４回取り替えた。 濡れたニトロセルロースフィルターをプラスチックラップの間に遮光物とＸ線フ ィルム（Ｄｕｐｏｎ　Ｃｒｏｎｅｘ，米国、プラウエア州、ウィルミントン）と 共にはさんで、耐光ホルダーに封入し、−７０℃で適当な時間静置した．ｎ光し たフィルムを標準法と１！準装置１４：ウシの１ノ　′　ンバク　Ｐ３　０Ｆ　 ３１−３４のグリコシ皿 還元サブユニ７）ＡとＤを実施例６に開示したＨＰＬＣ活性プールから精製し、 これを、ペプチド−Ｎ’　（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アルギニンア ミダーゼ（Ｎ−グリカナーゼ、Ｇｅｎｚｙｍｅ　）とエンド−βーアセチルグル コサミニダーゼＨ（エンドＨ％Ｇｅｎｚｙｓ＋ｅ）を該酵素の使用方法に従って 用いて分解した．これらエンドグリコシダーゼによる分解前後の還元サブユニッ トの相対分子量を、１５％ＳＯＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動、次にＡｂ ＡＮｔとＡｂＤＮ　ｔと称する抗体を用いたウェスタン分析により測定した．第 １６図は、エンドＨもしくはＮ−グリカナーゼで処理した前後の還元サブユニッ トＡとＤの還元ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す．グリコシ ダーゼで処理した前後の単離還元サブユニットＡのウェスタンプロット分析の結 果を第１６図のパネルＡに示す。 グリコシダーゼで処理した前後の単離還元サブユニットＤのウェスタンプロット 分析の結果を第１６図のパネルＤに示す．分解されたサブユニッ）ＡとＤが各々 、相対分子量がｌｊ１７，５００〜１９，０００ダルトンから１４．０００〜１ ６，０００ダルトンに低下しているのは、サブユニットＡとＤがエンドＨもしく はＮ−グリカナーゼの分解作用に対して敏感な、アスパラギン結合した炭水化物 を含むことを示している。 １５：ウシのＡノ　ンパク　Ｐ３　０Ｆ　３１−３４のサブユニットＤに　西　 の　ンバク　コード　るヒトｃＤＮ＾且皇旦定 特定の配列のタンパク質に相同性のタンパク質をコードするヒトｃＤＮパライブ ラリ−のスクリーニング法が含まれている。ヒトＤＮＡ配列に完全に相補的なプ ローブ；特定のタンパク質配列をコードする可能性のあるＤＮＡ配列のすべても しくは一部に相補的なプローブの混合物；特定のタンパク質配列をコードする可 能性のあるＤＮＡのすべてに相補的な可能性のある配列すべてを合成する変性プ ローブ：およびデオキシイノシン三リン酸のようなヌクレオチド類似体を用いて 合成した変性プローブ等の各種オリゴヌクレオチドプローブを用いることができ る。この実施例において、ウシの骨形成活性タンパクｆｆ！二旦のサブユニッｌ −Ｄに相同性のタンパク質をコードするヒトｅＤＮＡの配列を増幅するのに、ポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いた。 Ｕ−２Ｏ３胞か゛のｃＤＮＡの８ ヒトの骨形成肉腫細胞系１１−２　Ｏ５をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国、メリーランド州、ロックビル ）から入手し、１０％の子ウシ胎児血清と、１％のグルタミン／ペニシリン／ス トレプトマイノンとを補充したＭｃＣｏｙの５ａ培地内に置いた。特に注釈がな ければ、ＤＮＡ操作法、用語の定義および緩衝液と溶液の組成は、門ａｎｉａｔ ｉｓ、　Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　八Ｌａｂｏｒａ　ｔ ｏｒｙＭａｎｕａｌ　（］９９８２年の記載に従った。ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡ を、Ｉｎｖｉ　ｔｒｏｇｅｎ社（米国、カリフォルニア州、サンジエゴ）から入 手したＦａｓ　を丁ｒａｃｋ−削ＲＮ＾単離キフｌ−を用いて、１１−２０Ｓ細 胞から単離した。　ｗＲＮ＾の最初の鎖状ｃＤＮＡのコピーが、Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ＢＲＬ、米国、メリーラン ド州、ガイサースバーグ）から入手したＡＭシリバーストランスクリブターゼシ ステムＩを用い、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いることによって生成さ せリ　（Ａ）”　ＲＮＡ　１　ｔｔ　ｇを用いた。　ｃＤＮへの合成に続いて、 ＲＮＡを５０ｍＭ水酸化ナトリウムで６５°Ｃにて処理して加水分解し、次いで ０．２Ｎ塩酸で中和した。 且旦且壇彊 Ｒ，に、　５ａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　ｓ第２３９巻、第４８７〜４９１１ 頁、１９８８年に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｃｔ？）を、上記の ようにして調製したＵ−２０Ｓ　ｃＤＮＡからＤＮＡを増幅するために用いた。 ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドブライマーを、自動ＤＮＡ合成装置で合成し、ウ シサブユニ７）Ｄのアミノ末端配列と内部アミノ酸配列からｔＭ　４した。　Ｏ ＩＩＭ−１と称される５’ＰＣＲプライマーは、ウシサブユニフ）Ｄのアミノ末 端の最初の１１個のアミノ酸の配列、すなわち５ＴＧＧＫＩＩＲ３ＱＮＲに一致 した。この３２マーは、この配列のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の可 能性のあるすべての組合せを存し、４００万倍の縮重より大きい、　０ｒｌＤ− １のヌクレオチド配列は、５’−（Ｔ／　八、ｌ　ＣＣ／　Ｇ）ｌｉＡｃＩｉＧ ＧＮＧＧＮＡＡ　（に／　Ａ）ＣＡ　（Ｇ／　Ａ）（Ｃ／　Ａ）　ＧＮ　［Ｔ／ 　Ａ）　ＥＣ／　Ｇ）　ＮＣＡ　（Ｇ／　Ａ）　ＡＡ（Ｃ／　Ｔ）　（Ｃ／　Ａ ）　Ｇ−３′であった。括弧をつけたヌクレオチドは２者のいずれかであること を示し、”Ｎ”はＡ、Ｃ，ＴおよびＧのいずれかであることを示す。 ３’　ＰＣＩＩプライマーは、ウシサブユニットＤの内部配列、すなわちＮ）Ｉ ＡＩＶＱＴＬＶＨＦＩＮと一致し、逆の相補的配列として合成した。このオリゴ ヌクレオチドブライマーは０ＤＢ−１と称され、下記の配列５゛−丁ＴＴＴＴＴ ＴＴＧＧＡＴＣＣ（Ｇ／　Ａ）　ＴＴＸＡＴ　（Ｇ／　Ａ）　ＡＡ　（Ｇ／　Ａ ）　ＴＧＸＡＣＸＡ（Ｇ／　Ａ）　ＸＧＴ　（Ｃ／　Ｔ）　丁［；ＸＡＣＸＡＴ ＸＧＣ（Ｇ／　Ａ）　ＴＧ　（Ｇ／　Ａ）　ＴＴ−３°を持っていた。括弧内の ヌクレオチドは２者のいずれかであることオキシイノシン三リン酸（ｄｌＴＰ） を示す、この配列は、５゛末端に８個のＴからなる配列が先行し、これにＢａ− 旧認識部位と称される配列ＧＧＡＴＣＣが続き、次いで、ウシサブユニットＤの 内部アミノ酸配列に対応する３９のヌクレオチドからなる配列が続く。 これら２つのプライマーを用いて行なう、ウシサブユニットＤに相同性のタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列の増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ 　Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔに ｉｔ　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｓｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　、米国、コネチカット州、ノ ーウオーク；またはυｎｅｅｄ　５Ｌａ（ｅｓ　８ｉｏｃｂｅｓｉｃａｌ　Ｃｏ ｒｐｏｒａＬｉｏｎ　、米国、オハイオ州、クリーブランドから入手）を利用し て行なった。　ＰＣＲ反応は、１９Ｈの各プライマーＯＤＭ−１とＯ［１Ｂ−１ 、合成されたＵ−２Ｏ３の最初の鎖状ｃＤＮＡの１／８（約２５〜５０ｎｇ）　 、２００　ｕ　Ｍの各ｄＮＴＰ、および５０ｖ＋１１塩化カリウム、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１％（ｗ／ν）ゼラチンからなる前記キットの反応緩衝 液中の２．５υのハ旺り旦ＬＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。　ＰＣＲとして は、９４°Ｃで１．５分間の変性、５０°Ｃで２分間のアニーリングおよび７２ °Ｃで３分間の伸長からなるサイクルを３０サイクル行なった。３０サイクル後 、最後に７２°Ｃで１０分間の伸長を行なった。 ＰＣＲ産吻をアガロースゲル電気泳動法で分析したが、約３００ｂρの増幅ＤＮ Ａの主要バンドを示した。上記ゲル中のＤＮＡを、ＮｙｔｒａｎナイロンＰＩ４ 　（Ｓｃｈｌｅｉｅｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、米国、ニューハンプシャ ー州、キーン）に、ＬにＢ　ＶａｃｕｇｅｎｆＩＶａｃｕｕｍ　Ｂｌｏｔｔｉｎ ｇ　Ｕｎｉｔを用いて転移させてサザンブロフト法を行ない、次にＤＮＡを、５ ｔｒａｔａ−１ｉｎｋｅｒ　（ＳＬｒａｔａｇｅｎｅ、米国、カリフォルニア州 、う・ジコラ）を用いて前記膜に紫外線で架橋結合させた。この膜を、アミノ酸 配列ＸＴＰＫＮ［１ＥＡＬＩ？に相当するプローブを用いて、ウシサブユニット ＤサブユニットＤのアミノ末端近くに見出される。それ故このプローブは、増幅 に用いた２つのプライマーのいずれとも重複することなく、ウシサブユニットＤ に相同のタンパク質をコードする増幅配列とハイブリダイズするであろう、この ２９マーのプローブは０Ｉ）ｔｂｂと称され、配列ＡＡＸＡＣＸＣＣＸＡＡ　［ Ｇ／　Ａ″）　ＡＡ　（Ｃ／　Ｔ）　ＣＡＸＧＡ［Ｇ／　Ａ）　にＣＸ　（Ｃ／ 　Ｔ）　ＴＸ　ＥＣ／　Ａ）　Ｇを持っており、配列中の括弧内のヌクレオチド は２者のいずれかであることを示し、“Ｘ”はｄｌＴＰを示し、これは４つのヌ クレオチド（Ａ、Ｃ，、ＴもしくはＧ）全部が胃かれる可能性がある位置に用い た。サザンプロットは、ポリヌクレオヂドキナーゼとｒ　（！ｔＰ）ＡＴＰを用 いて放射能でラベルした０Ｄｉｂｂプローブと、５　Ｘ５ＳＰＢ、　０．５％Ｓ ＤＳ、　３メデンハ一ト氏液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、４２゛Ｃで プレハイブリダイズさせ、次いで５ＸＳＳＰＥ、０．５％ＳＯＳ中、４２°Ｃで ハイブリダイズさせた。プロットは４２°Ｃで、２　Ｘ５ＳＣ、Ｏ，Ｉ％ＳＤＳ で洗浄された。そのプロットのオートラジオグラフィは、０Ｄｉｂｂが、３００ ｂｐのＰＣＲで増幅されたＤＮＡと特異的にハイブリダイズしたことを示した。 １６：ウシのＡン　ゞ　ンバク　Ｐ３０Ｐ３１−３４のサブ王王２トＤに　西の 　ンバク　をコ；ドするヒトｃＤＮＡのり三：し」３ＪＣ工夫定 ５″リン酸を、キナーゼとＡＴＰを用いた実施例１５のプラント・エンドされた ＰＣＲ産物に付加し、得られたＤＮＡを、ベクターｐＴ７Ｔ３１８υＣＰｈａｒ 鯉ａｃｔａ社、米国、二ニーシャーシー州、ビス力タウエイ）のＳｍａ　ｌ切断 （プラント・エンド）部位に連結した。　５ｅａｌで分解し、再連結されたベク ターを直線化した後１、その組換え体プラスミド製するのに用いた。これらプラ スミドに含有されている挿入断片の大きさは、制限分析法によって３００ｂρで あることがｆＩ認された。 ７種の異なる形質転換体から得たＤＮＡの配列を、ジデオキシ配列決定法（Ｓｅ ｑｕｅｎａｓｅ、　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｃａｌ　 Ｃｏｒｐ）により決定した。これらクローンのうち３種の配列は互いに同一であ り、そしてアミノ酸配列に翻訳した時、それらはウシサブユニットＤの配列に相 同であることが確認された。　ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの配列は”ｈＯＤ”と 称され、既知の誘導アミノ酸配列と共に第１７図に示した０両プライマーが縮重 して相同領域の正確な配列を同定できないため、２つのプライマー間のＤＮＡ配 列だけを示しである。 ＯＤＭ−１プライマーに続く最初の３４個の増幅されたヌクレオチドの配列は、 ウシサブユニットＤ内に先に同定されたアミノ酸配列をコードする。 他の４つのＵｔａえ体クローンの配列は、互いに同一であるが、ｈＯＤ増輻増列 配列異なり、異なるアミノ酸の配列をコードしていた。このクローンの集団は° ｈＯＥ”　と称され、その配列を第１８図に示す、第１９図は、ｈＯＤで増幅さ れた配列とｈＯＥで増幅された配列間の相同性を示し、この領域におけるヌクレ オチドとアミノ酸レベルの同一性は、６９−７０％である。第１９Ａ図は、ＰＣ Ｒで増幅されたｈＯＤ配列とｈＯＥ配列の誘導アミノ酸配列間の相同性を示して おり、図中相同残基は、肉太活字で示しである。ｍ初のシスティン残基に続く領 域では、これら２つの配列は、３９／４４の同一のアミノ酸を存し、ＴＧＦ−β ファミリーのメンバー間が高度に保たれた領域である。第１９Ｂ図は、ｈＯＤと ｈＯＥと称されたＰＣＲで増幅された配列のヌクレオチド配列間の相同性を示す 。 １７７　Ｐ３０Ｆ　３−３４サブユニートの　゛　の完全および部分的ｇ…ｆサ ブユニットボリベブチド産物とその類似体は、細菌、酵母もしくは哺乳類の発現 システム中の組換えＤＮＡ分子を利用して作成できる０本発明の単離されたＰ３ ０Ｆ　３１−３４サブユニツトから誘導されたアミノ酸配列に基づく産物をコー ドするＤＮＡは、たとえばプラスミド、ファージもしくはウィルス発現ベクター のような発現ベクターに挿入することができる（Ｖｉｅｉｒａら、江憇、星用土 、第２５９〜２６８頁、１９８２年；Ｙｏｕｎｇら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ、星靭皇、第１１９４〜１１９８頁、１９８３ 年；Ｂｉｔｔｅｒら、Ｇｅｎｅ、黒双皇、第２６３〜２７４頁、１９８４年ＨＣ ｅｐｋｏら、Ｃｅ１ｌ、　ｆｆｉ、第１０５３〜１０６２頁、１９８４年；およ びＧｏｒｍａｎら、ＭＯｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、里１皇、第１０４４〜 １０５１頁、１９８２年）。 特に、Ｐ３０Ｆ　３１−３４サブユニツトＤとＥはそれぞれ、第１７図と第１８ 図に示すヌクレオチド配列で特徴づけられるＤＮＡの発現によって製造すること ができる。あるいは、第１７図と第１８図に示したのと同じアミノ酸配列をコー ドするヌクレオチド配列で特徴づけられるＤＮＡを、同じ目的のために発現ベク ターに挿入することができる。また、これらサブユニットの類似体は、第１７図 と第１８図に示すヌクレオチド配列の少なくとも８０％と、ハイブリダイズする （または遺伝コードの重複がなければハイブリダイズする’）　ＤＮＡ配列によ って調製することができる。 出願人らの発明の他の態様として、サブユニットＤのダイマーと、サブユニット ＤとサブユニットＢのヘテロダイマーからなる骨形成物質の調製法が含まれる。 骨形成活性ダイマーは、生合成で発現された各サブユニットを、ジスルフィド結 合してダイマーを形成させることによって製造することができる。サブユニット Ａのダイマーと、サブユニットＡとサブユニットＢとのヘテロダイマーも同様に 調製することができる。出願人らの方法で単離されたＰ３０Ｆ　３１−３４骨形 成製剤と同じ骨形成活性を有する、組換体で製造したダイマーとへテロダイマー からなる骨形成製剤を調製することができる。同様に、サブユニットＢと高度に 相同性のポリペプチド、たとえばサブユニットＣをサブユニ７）Ｂの代わりに用 いたヘテロダイマーも製造することができる。かような組換え体で製造したポリ ペプチドと生理的に許容可能な基質物質とからなる薬学的にとして許容可能な組 成物を調製し、ヒトの骨から単離したポリペプチドと同じ方法で使用することが できる。 この発明の好ましい実施態様の前記説明を考慮することによって、当業者は、こ の発明を実施する際に、多（の改良と変更を思い付くことであろう、従って、こ の発明は、下記請求の範囲に記載されている発明にのみ限定されるべきである。 吸光度（λ−２８Ｏｎ閣） ■ アセトニトリルの濃度（％合計） 吸光度（λ＝２８０ｎｍ） アセトニトリルの濃度（％合計） 吸光度（λ−２８０ｎｍ） ｖ８プロテアーゼ−ブタＰ３タンパク質（Ｃ８高速液体クロマトグラフィーカラ ム）７０分　２０分 保持時間（分） 吸光度（λ＝２２９ｎｍ） ■８プロテアーゼ−ヒトＰ３タンパク質拮抗抗原（０ｇ７ｍ１） ＦＩＧ、７Ｂ １０　２５　５０　１００　；？５０　５００拮抗抗原（ｎｇ／１Ｉ１１） ＦＩＧ、７Ｃ Ｆ　Ｉ　０．　９　（ｔｆｔ！’） 製剤高速液体クロマトグラフィープール分子量（×１０弓） ＦＩＧ、１ＩＡ ン容出時間（分） ＦＩＧ、ＩＩＢ ＦＩＧ、！２ 溶出時間（分） ＦＩＧ、１４Ａ 言式験管（Ｎｏ、２６） ＦＩＧ、ｔ５ ＦＩＧ、１６ Ｒ（Ｊ　９　（５９１４：ｌ：　Ｌ） ０　べ　υ　υ べｚ　（Ｊぺ　υペ　トー ＜　ｕ　Ｏト ａ　（５ａ　υ べｋ　ト〉　ぺｃｍ　（５１／） べ　０　υ　ぺ υ　Ｏｕ　υ υ−べ２：　ロ匡　←〉 ０　＜　ぺ　０ ！２０　♀ｒ、）　ｇ　（５８１４ （ＪＩ４　（Ｊべ　べＯぺζ べ　Ｇ　（Ｊ　）４ （５（ｊ　（Ｊ　（ｊ ９　Ｏｒ−＜３　８← （９ｔｙｚ　べζ　０べ　（Ｊ）＠ Ｒ（ｊ（ｊ　Ｓ＜（ｊ（ｊ　ｇｔｂｕ　−ｕ＜８−　べ閲　ぺ閲　＜２ べｏ　ｕ　Ｑａ　（ｊ　（ｊ　Ｆ’Σ ０　０　０　＜ べ　ａ　ＬＪ　Ｕ Ｏヱ　リ＜　＜閲　べζ ｌｕ　９ａ　ｇ←　＝０ ＜：ｌ：　ＯＬ５　ｕ＜　←− 〇り　トシ　ペＯｏｔ／） ）４　Ｕ　ｔＪ　べ υ　ト　ベ　０ ａｔｎ　ａ瞬　べに　←〉 ベ　ペ　ベ　Ｕ ３Ｏ♀υ　ｇぺ　Ｆ３ｆ４ ０リ　υの　べＯ＜ζ ｈ　）４　（Ｊ　？ ＯＯべ　０ ｗ　＜３　ｒ−Ｑ　８（Ｊ ←Ｈ（ｊ　（Ｊ　（Ｊ　＜ Ｑａ　Ｚ　＜　：１Ｉ４ｏｔｎ　ＣＪ　）４□Ｅ−４Ｅ−４Ｅ４ぺ ＬＬ　＜　＜　Ｆ−０ ｇ０（５ヌ（ｊＬ）　ｇａｕ　−ＣＪベト−ベロ　ベロ　＜２ Ｕ　ａ　ＣＪベ ト　ベ　＜　０ べｏ　（ＪＱａ　ｔｊｔ：）　）ｅΣ Ｃご　υベ　ベロ　ペエ ｈＯＤ　５ＫｒｐｘＮＱ＋ｕＬＲＭＡｓＶＡＥＮｓｓＳｏＱＲＯＡＣＫＫＨＥＬ ＹＶＳＦＲＤＬＧＷＣＩＤＷＩＩ八ＰεＧｈＯＥ　ＮＫＳＳＳＨＣＩＤＳＳＲＭ ＳＳＶＧＤＹＮＴＳＥＱＫＱＡＣににＨＥＬＹＶＳＦＲＤＬＧＷＯＤＷ　Ｉ　Ｉ 　ＡＰＥＧｈＯＤ　ＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬＮＳＹＭＮＡＴｈＯＥ　ＹＡ ＡＦＹＣＤＧＥＣ５ＦＰＬＮＡＨＭＮＡＴＦＩＧ、ｌ９Ｂ ｈＯＤ　ＣＴＣＣＡＡＧＡＣＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣ ＧＧＡＴＧＧＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＡＧｈＯＥ　ＣＡＡＴＡＡＡＴＣＣＡＧＣＴ ＣＴＣＡＴこ八ＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧ ｈＯＤ　ＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＴ ＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＴｈＯＥ　ＡｎＡｒＡＡＣＡｃＡＡＧｒＧ ＡＧＣＡＡＡＡＡｃＡＡＧｃｃ丁ＧＴＡＡＧ、ｆｌｌＡＧＣＡＣＧＡＡｃＴｃ丁 ＡＴｈＯＤ　ＧＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣ ＴＧＧＡＴＣＡＴＣＧＣＧＣＣＴＧＡＡＧＧｈＯＥ　ＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＧＧ ＧＡＴＣＴＧＧＧＡＴＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＡＴＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡ ＧＧｈＯＤ　ＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＡＧＧＧＧＧＡＧＴＧ ＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴｈＯＥ　ＡＴＡＣＧＣ丁ＧＣＡＴＴ ＴＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＣＴＴＡＡＣＧＣ ＣＣｈＯＤ　ＡｃＡＴＧＡＡＣＧＣＣＡＣＣｈＯＥ　ＡＴＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡ Ｃ口国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非還元変性ゲル濾過法で約２５．０００〜約３８，０００ダルトンの分子量 を示し、 さらに、水、アセトニトリル、および０．０２５〜０．０５％のトリフルオロ酢 酸を含有する緩衝液で平衡化した逆相高速液体クロマトグラフィーのカラムから 、濃度３５〜４５％のアセトニトリルで溶出することを特徴とする骨形成タンパ ク質の製剤。 ２．前記骨形成タンパク質が、非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法で分子量が約３１，０００ダルトン〜約３４，０００ダルトン を示す請求項１に記載の製剤。 ３．前記骨形成タンパク質が、さらにその還元状態で還元ドデシル硫酸ナトリウ ムポリアクリルアキドゲル上で、分子量が１７，５００〜１９，０００ダルトン の範囲、あるいは１６，０００〜１７，５００の範囲にあるタンパク質と共泳動 する少なくとも１つのタンパク質サブユニットを有する請求項１もしくは２に記 載の製剤。 ４．前記サブユニットの１つが、 【配列があります】及び 【配列があります】からなるグループから選択されるアミノ末端を有するか、も しくは 【配列があります】 および【配列があります】（但しＸは未決定のアミノ酸を示す）からなるグルー プから選択される内部アミノ酸配列を有する請求項３に記載の製剤。 ５．前記骨形成タンパク質が、少なくとも１つのジスルフィド結合で連結された ２つのサブユニットのダイマーを含む請求項４に記載の製剤。 ６．前記ダイマーが、少なくとも１つのジスルフィド結合で互いに連結された２ つの同一でないサブユニットのヘテロダイマーである請求項５に記載の製剤。 ７．前記のヘテロダイマーの一方のサブユニットが【配列があります】の内部配 列を有し、他方のサブユニットが【配列があります】の内部配列を有する請求項 ６に記載の製剤。 ８．前記ヘテロダイマーの一方のサブユニットが【配列があります】の内部配列 をし、他方のサブユニットが【配列があります】の内部配列を有する請求項６に 記載の製剤。 ９．前記サブユニットが、 【配列があります】および【配列があります】からなるグループから選択された アミノ末端配列を有し、アスパラギンで連結された炭水化物を含有する請求項３ に記載の製剤。 １０．ウシの骨から単離された請求項１に記載の製剤。 １１．ヒトの骨から単離された請求項１に記載の製剤。 １２．プタの骨から単離された請求項１に記載の製剤。 １３．脱塩骨組織から骨形成タンパク質の製剤を単離する方法で、下記の工程を 含む； （ａ）水性条件下で、前記脱塩骨組織を前記骨形成タンパク質の可溶化剤で処理 し、骨形成性因子を前記可溶化剤で溶液に抽出し；（ｂ）前記溶液をサイズ分別 し、分子量が約１０，０００〜約１００，０００ダルトンのタンパク質の濃縮プ ールを回収し；（ｃ）前記濃縮プールをｐＨ６．５，５０ｍＭＭＥＳを含有する ６．０Ｍ尿素で平衡化したＳ−セファロースカラムから、ｐＨ６．５，５０ｍＭ ＭＥＳと０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する６．０Ｍ尿素で活性製剤を溶出する ことによって、タンパク質の活性製剤を回収する第１クロマトグラフィー工程に 適用し； （ｄ）工程（ｃ）の活性製剤を緩衝液交換工程に適用し；（ｅ）工程（ｄ）の活 性製剤を、ｐＨ９．５，２０ｍＭエタノールアミンを含有する６Ｍ尿素で平衡化 したＱ−セファロースカラムから、ｐＨ９．５，２０ｍＭエタノールアミンと０ ．２Ｍ塩化ナトリウムを含有する６．０Ｍ尿素で活性製剤を溶出することによっ て、タンパク質の活性製剤を回収する第２クロマトグラフィー工程に適用し；そ して（ｆ）工程（ｅ）の活性製剤を、トリフルオロ酢酸とアセトニトリルを含有 する緩衝液で平衡化したＣ−１８高速液体クロマトグラフィーのカラムから、濃 度３５〜４５％のアセトニトリルで活性製剤を溶出することによってタンパク質 の活性製剤を回収する第３クロマトグラフィー工程に適用する。 １４．骨形成タンパク質の製剤を単離する請求項１３に記載の方法であり、さら に下記の工程を含む： （ｇ）工程（ｆ）の活性画分を、Ｃｕ２−で帯電させかつｐＨ７．５〜８．０， ５０ｍＭトリス、２０ｍＭエタノールアミンおよび０．５Ｍ塩化ナトリウムを含 有する６Ｍ尿素で平衡化したキレートセファロースカラムから、ｐＨ７．４〜７ ．８，５０ｍＭトリスと１５ｍＭイミダゾールを含有する６Ｍ尿素で活性製剤を 溶出してタンパク質の活性製剤を回収する第４クロマトグラフィー工程に適用し ；（ｈ）工程（ｇ）の活性画分を、ｐＨ７．４〜７．８，５０ｍＭトリスと２５ ％硫酸アンモニウムを含有する６Ｍ尿素で平衡化したフェニルセファロースカラ ムから、ｐＨ７．４〜７．８，５０ｍＭトリスを含有する６Ｍ尿素で活性製剤を 溶出してタンパク質の活性製剤を回収する第５クロマトグラフィー工程に適用し ； （ｉ）工程（ｈ）の活性製剤を、トリフルオロ酢酸とアセトニトリルを含有する 緩衝液で平衡化したＣ−１８高速液体クロマトグラフィ一のカラムから濃度３５ 〜４５％のアセトニトリルで活性製剤を溶出してタンパク質の活性製剤を回収す る第６クロマトグラフィー工程に適用する。 １５．哺乳類の骨形成を促進する能力を有し、請求項１３に記載の方法で調製さ れた骨形成タンパク質の製剤。 １６．非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で約３１ ，０００〜３４，０００ダルトンの分子量を示し、かつ哺乳類の骨形成を促進す る能力を有し、請求項１４に記載の方法で調製された骨形成タンパク質の製剤。 １７．請求項１、４、７、８、１５または１６に記載の骨形成製剤の有効量を前 記哺乳類に投与することからなる、哺乳類の骨形成を誘導する方法。 １８．前記骨形成製剤が、生理的に許容可能な基質物質と混合して投与される請 求項１７に記載の方法。 １９．前記骨形成製剤が、生理的に許容可能な基質物質と混合した骨形成製剤で 被覆された構造物質を含む装置の形態で投与される請求項１７に記載の方法。 ２０．生理的に許容可能な基質物質と混合した請求項１、４、７、８、１５また は１６に記載の骨形成因子の製剤を含む哺乳類に移植する組成物。 ２１．前記生理的に許容可能な基質物質が、リン酸三石灰、ハイドロキシアバタ イト、コラーゲン、パリス熱可塑性樹脂の硬膏、ポリ乳酸、ポリグリコール酸お よびポリカプロ乳酸からなるグループから選択される請求項２０に記載の組成物 。 ２２．請求項２０に記載の組成物で被覆された構造部材を含む哺乳類に移植する 装置。 ２３．第１７図に示すヌクレオチド配列；第１７図に示すヌクレオチド配列がコ ードするのと同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列； 第１７図に示すヌクレオチドの８０％と相同で、骨形成活性を有するポリペプチ ドをコードするヌクレオチド配列；および遺伝コードの重複がなければ第１７図 に示すヌクレオチドの８０％と相同であり、骨形成活性を有するポリペプチドを コードするヌクレオチド配列 からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含む精製単離された核酸。 ２４．請求項２３に記載の核酸で形質転換された細胞。 ２５．請求項２３に記載の精製・単離された核酸がコードするアミノ酸の連続配 列を含むポリペプチド。 ２６．請求項２５に記載の第１ポリペプチドサブユニットを含む、少なくとも１ つのジスルフィド結合によって連結されている２つのポリペプチドサブユニット のダイマーを含む骨形成性製剤。 ２７．前記ダイマーが２つの同一でないサブユニットのヘテロダイマーである請 求項２６に記載の骨形成性製剤。 ２８．１つのポリペプチドサブユニットが、【配列があります】および 【配列があります】からなるグループから選択される内部アミノ酸配列を有する 請求項２７に記載の骨形成製剤。 ２９．第１８図に示すヌクレオチド配列；第１８図に示すヌクレオチドがコード するのと同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列； 第１８図に示すヌクレオチドの８０％と相同で、かつ骨形成活性を有するポリペ プチドをコードするヌクレオチド配列；および遺伝コードの重複がなければ第１ ８図に示すヌクレオチドの８０％と相同であり、かつ骨形成活性を有するポリペ プチドをコードするヌクレオチド配列 からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含む精製単離された核酸。 ３０．請求項２９に記載の核酸で形質転換された細胞。 ３１．請求項２９に記載の精製・単離された核酸がコードするアミノ酸の連続配 列を含むポリペプチド。 ３２．請求項３１に記載の第１ポリペプチドサブユニットを含み、少なくとも１ つのジスルフィド結合で連結された２つのポリペプチドサブユニットのダイマー を含む骨形成製剤。 ３３．前記ダイマーが、２つの同一でないサブユニットのヘテロダイマーである 請求項３２に記載の製剤。 ３４．１つのポリペプチドサブユニットが、【配列があります】および 【配列があります】からなるグループから選択される内部アミノ酸配列を有する 請求項３３に記載の骨形成製剤。 ３５．Ｐ３０Ｆ３１−３４サブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニット・Ｃ 、サブユニットＤおよびサブユニットＥからなるグループから選択された１つあ るいはそれ以上のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された１つある いはそれ以上の細胞系を適当な培地で培養し； ポリペプチドモノマーを少なくとも１つのジスルフィド結合で連結することによ って前記ポリペプチドモノマーのダイマーを形成し；および 得られたダイマーを単離する ことからなる、Ｐ３０Ｆ３１−３４サブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニ ットＣ、サブユニットＤおよびサブユニットＥからなるグループから選択された ポリペプチドモノマーのダイマーからなる骨形成タンパク質の調製方法。