ES2320603T3

ES2320603T3 - Sistemas de expresion, vectores, adn, proteinas de mineralizacion osea novedosos.

Info

Publication number: ES2320603T3
Application number: ES98937281T
Authority: ES
Inventors: Greg Hair; Scott Boden
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1997-07-30
Filing date: 1998-07-29
Publication date: 2009-05-25
Anticipated expiration: 2018-07-29
Also published as: US6444803B1; JP2001512019A; US20020086987A1; AU745122B2; DE69840361D1; US6858431B2; AU8602998A; EP1007673A1; US6300127B1; TWI244502B; ATE417927T1; CA2297489A1; JP4302877B2; WO1999006563A1; US20030125248A1; US20060019392A1; US7825228B2; US20090247733A1; US6521750B2; EP1007673B1

Abstract

Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de mineralización LIM humana que contiene un dominio LIM y potencia la osificación, hibridándose la molécula de ácido nucleico en condiciones de hibridación convencionales con una molécula de ácido nucleico complementaria a la longitud completa de la SEQ. ID NO: 26.

Description

Sistemas de expresión, vectores, ADN, proteínas de mineralización ósea novedosos.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

El campo de la invención se refiere en general a células osteogénicas y a la formación de hueso y tejido óseo en especies de mamífero. Específicamente, la invención se refiere a una familia novedosa de proteínas, y a ácidos nucleicos que codifican para esas proteínas, que potencia la eficacia de la mineralización ósea in vitro e in vivo. La invención proporciona métodos para tratar una variedad de estados patológicos asociados con el hueso y el tejido óseo, tales como, por ejemplo, artrodesis vertebral, reparación de fracturas y osteoporosis.

2. Descripción de la técnica relacionada

Se cree que los osteoblastos se diferencian a partir de células madre mesenquimatosas pluripotentes. La maduración de un osteoblasto da como resultado la secreción de una matriz extracelular que puede mineralizarse y formar hueso. La regulación de este proceso complejo no se comprende bien, pero se cree que implica un grupo de glicoproteínas de señalización conocidas como proteínas morfogenéticas óseas (BMP). Se ha demostrado que estas proteínas están implicadas en la formación del patrón dorsoventral, desarrollo del blastema de una extremidad y reparación de fracturas en animales adultos. B. L. Hogan, Genes & Develop., 10:1580 (1996). Este grupo de proteínas secretadas por la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta tiene un espectro de actividades en una variedad de tipos celulares en diferentes fases de diferenciación; las diferencias en la actividad fisiológica entre estas moléculas estrechamente relacionadas no se han aclarado. D. M. Kingsley, Trends Genet., 10:16 (1994).

Para discernir mejor el papel fisiológico único de diferentes proteínas de señalización BMP, se comparó recientemente la potencia de BMP-6 con la de BMP-2 y BMP-4, para inducir la diferenciación de osteoblastos calváricos de rata. Boden et al., Endocrinology, 137:3401 (1996). Se estudió este proceso en cultivos de primer pase (secundarios) de calvarias de rata fetal que requieren BMP o glucocorticoide para la iniciación de la diferenciación. En este modelo de osificación membranosa, el glucocorticoide (GC) o una BMP iniciará la diferenciación para dar nódulos óseos mineralizados que pueden secretar osteocalcina, la proteína específica de los osteoblastos. Este sistema de cultivo secundario es distinto de los cultivos de osteoblastos de rata primarios que experimentan diferenciación espontánea. En este sistema secundario, el glucocorticoide dio como resultado una inducción de diez veces de la expresión de proteína y ARNm de BMP-6 que era responsable de la potenciación de la diferenciación de osteoblastos. Boden et al., Endocrinology, 138: 2920 (1997).

Además de las señales extracelulares, tales como las BMP, las moléculas reguladoras o señales intracelulares pueden desempeñar también un papel en la cascada de acontecimientos que conduce a la formación de hueso nuevo. Una amplia clase de moléculas reguladoras intracelulares son las proteínas LIM, que se denominan así debido a que presentan un motivo estructural característico conocido como el dominio LIM. El dominio LIM es un motivo estructural rico en cisteína compuesto por dos dedos de zinc especiales que están unidos mediante un espaciador de 2 aminoácidos. Algunas proteínas tienen solamente dominios LIM, mientras que otras contienen una variedad de dominios funcionales adicionales. Las proteínas LIM forman un grupo diverso, que incluye factores de transcripción y proteínas citoesqueléticas. El papel principal de los dominios LIM parece ser en la mediación de interacciones proteína-proteína, a través de la formación de dímeros con dominios LIM idénticos o diferentes, o mediante la unión de proteínas distintas.

En proteínas de homeodominio LIM, es decir, proteínas que tienen tanto dominios LIM como una secuencia de homeodominio, los dominios LIM funcionan como elementos reguladores negativos. Las proteínas de homeodominio LIM están implicadas en el control de la determinación del linaje celular y la regulación de la diferenciación, aunque las proteínas de sólo LIM pueden desempeñar papeles similares. Las proteínas de sólo LIM están implicadas también en el control de la proliferación celular puesto que varios genes que codifican para tales proteínas están asociados a translocaciones cromosómicas oncogénicas.

Los seres humanos y otras especies de mamífero son propensos a enfermedades o lesiones que requieren los procesos de reparación y/o regeneración ósea. Por ejemplo, el tratamiento de fracturas se mejoraría mediante nuevos regímenes de tratamiento que pudieran estimular los mecanismos naturales de reparación ósea, reduciendo de ese modo el tiempo requerido para que se consolide el hueso fracturado. En otro ejemplo, los individuos afectados de trastornos óseos sistémicos, tales como osteoporosis, se beneficiarían de regímenes de tratamiento que dieran como resultado la formación sistémica de hueso nuevo. Tales regímenes de tratamiento reducirían la incidencia de fracturas que surgen de la pérdida de masa ósea que es característica de esta enfermedad.

Al menos por estos motivos, se han investigado factores extracelulares, tales como las BMP, con el fin de usarlas para estimular la formación de hueso nuevo in vivo. A pesar de los éxitos tempranos conseguidos con las BMP y otras moléculas de señalización extracelulares, su uso conlleva varias desventajas. Por ejemplo, se requieren dosis relativamente grandes de BMP purificadas para potenciar la producción de hueso nuevo, aumentando de ese modo el gasto de tales métodos de tratamiento. Además, las proteínas extracelulares son susceptibles de degradación tras su introducción en un animal huésped. Además, debido a que normalmente son inmunogénicas, la posibilidad de estimular una respuesta inmunitaria frente a las proteínas administradas está siempre presente.

Debido a tales preocupaciones, sería deseable tener regímenes de tratamiento disponibles que usen una molécula de señalización intracelular para inducir la formación de hueso nuevo. Los avances en el campo de la terapia génica hacen ahora posible introducir en células precursoras osteogénicas, es decir, células implicadas en la osificación, fragmentos de nucleótidos que codifican para señales intracelulares que forman parte del proceso de osificación. La terapia génica para la osificación ofrece varias ventajas potenciales: (1) menores costes de producción; (2) mayor eficacia, en comparación con los regímenes de tratamiento extracelular, debido a la capacidad para conseguir una expresión prolongada de la señal intracelular; (3) evitaría la posibilidad de que el tratamiento con señales extracelulares pudiera verse dificultado debido a la presencia de números limitantes de receptores para esas señales; (4) permite la inserción de células osteoprogenitoras potenciales transfectadas directamente en el sitio en el que se requiere la osificación localizada; y (5) permitiría la osificación sistémica, proporcionando de ese modo un régimen de tratamiento para la osteoporosis y otras enfermedades óseas metabólicas.

Sumario de la invención

La presente invención intenta superar los inconvenientes de la técnica anterior proporcionando composiciones y métodos novedosos para inducir osificación usando una molécula de señalización intracelular que participa de manera temprana en la cascada de acontecimientos que conduce a la osificación. Los solicitantes han descubierto 10-4/RLMP (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2), un gen de LIM novedoso con una secuencia aislada originariamente de cultivos de osteoblastos calváricos de rata estimulados. El gen se ha clonado, secuenciado y sometido a ensayo para determinar su capacidad para potenciar la eficacia de la mineralización ósea in vitro. La proteína RLMP afecta a la mineralización de la matriz ósea así como a la diferenciación de células en el linaje de osteoblastos. A diferencia de otras citocinas conocidas, por ejemplo, las BMP, RLMP no es una proteína secretada, sino que es en cambio una molécula de señalización intracelular. Esta característica tiene la ventaja de proporcionar amplificación de la señalización intracelular así como una evaluación más sencilla de las células transfectadas. También es adecuada para aplicaciones in vivo más eficaces y específicas. Las aplicaciones clínicas adecuadas incluyen potenciación de la reparación ósea en fracturas, defectos óseos, injertos óseos y homeostasis normal en pacientes que presentan osteoporosis.

Los solicitantes también han clonado, secuenciado y deducido la secuencia de aminoácidos de una proteína humana correspondiente, denominada LMP-1 humana. La proteína humana demuestra una eficacia de mineralización ósea potenciada in vitro e in vivo.

Además, los solicitantes han caracterizado una versión truncada (corta) de LMP-1, llamada HLMP-1s. Esta versión corta resultó de una mutación puntual en una fuente de un clon de ADNc, que proporcionó un codón de terminación que truncaba la proteína. La versión corta (LMP-1s) es totalmente funcional cuando se expresa en cultivo celular e in vivo.

En la siguiente descripción se expondrán características y ventajas adicionales de la invención, y en parte resultarán evidentes a partir de la descripción, o pueden aprenderse mediante la puesta en práctica de la invención. Los objetivos y otras ventajas de la invención se realizarán y lograrán mediante los métodos y composiciones particularmente señalados en la descripción por escrito y reivindicaciones del presente documento.

En un aspecto amplio, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para cualquier proteína de mineralización LIM, hibridándose la molécula de ácido nucleico en condiciones convencionales con una molécula de ácido nucleico complementaria a la longitud completa de la SEQ. ID NO: 25, e hibridándose la molécula en condiciones sumamente rigurosas con una molécula de ácido nucleico complementaria a la longitud completa de la SEQ. ID NO: 26. En un aspecto específico, la molécula de ácido nucleico aislada codifica para HLMP-1, HLMP-1s o RLMP. Además, la invención se refiere a vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, así como a células huésped que comprenden los vectores. En otro aspecto específico, la invención se refiere a las propias proteínas.

En un segundo aspecto amplio, la invención se refiere a un anticuerpo que es específico para la proteína de mineralización LIM, incluyendo HLMP-1, HLMP-1s y RLMP. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otro aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En un tercer aspecto amplio, la invención se refiere a un método de inducción de osificación en el que se transfectan células precursoras osteogénicas con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de mineralización LIM. En un aspecto específico, la molécula de ácido nucleico aislada está en un vector, que puede ser un plásmido o un virus, tal como adenovirus o retrovirus. La transfección puede producirse ex vivo o in vivo mediante inyección directa de la molécula de ácido nucleico aislada. La molécula de ácido nucleico aislada transfectada puede codificar para HLMP-1, HLMP-1s o RLMP.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a métodos de artrodesis vertebral transfectando células precursoras osteogénicas con una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de mineralización LIM, mezclando las células precursoras osteogénicas transfectadas con una matriz y poniendo en contacto la matriz con la vértebra.

Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a métodos para inducir osificación sistémica mediante transfección estable de células huésped con los vectores de la invención.

Ha de entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son a modo de ejemplo y de explicación y pretenden proporcionar una explicación adicional de la invención tal como se reivindica.

Abreviaturas y definiciones

BMP: Proteína morfogenética ósea

HLMP-1 LMP-1: humana, también denominada proteína LIM humana o HLMP

HLMP-1s: Proteína corta (truncada) LMP-1 humana

HLMPU: Región única de proteína LIM humana

LMP: Proteína de mineralización LIM

MEM: Medio mínimo esencial

Trm: Triamcinolona

\beta-GlyP: Beta-glicerolfosfato

RACE: Amplificación rápida de extremos de ADNc

RLMP: Proteína de mineralización LIM de rata, también designada como RLMP-1

RLMPU: Región única de proteína LIM de rata

RNAsin: Inhibidor de ARNasa

ROB: Osteoblasto de rata

10-4: Clon que contiene la secuencia de ADNc para RLMP (SEQ ID NO: 2)

UTR: Región no traducida

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a proteínas LIM de mamífero novedosas, designadas en el presente documento como proteínas de mineralización LIM, o LMP. La invención se refiere más particularmente a LMP humana, conocida como HLMP o HLMP-1. Los solicitantes han descubierto que estas proteínas potencian la mineralización ósea en células de mamífero cultivadas in vitro. Cuando se produce en mamíferos, la LMP induce también la osificación in vivo.

La transfección ex vivo de células de médula ósea, células precursoras osteogénicas o células madre mesenquimatosas con ácido nucleico que codifica para LMP o HLMP, seguido del reimplante de células transfectadas en el donante, es adecuada para tratar una variedad de trastornos o lesiones relacionados con los huesos. Por ejemplo, se puede usar este método para: aumentar la reparación de fracturas de huesos largos; generar hueso en defectos segmentarios; proporcionar un sustituto de injerto óseo para fracturas; facilitar la reconstrucción de tumores o artrodesis vertebral; y proporcionar un tratamiento local (mediante inyección) para hueso débil o con osteoporosis, tal como en osteoporosis de la cadera, vértebras o muñeca. La transfección con ácido nucleico que codifica para HLMP o LMP también es útil en: la inyección percutánea de células de médula transfectadas para acelerar la reparación de huesos largos fracturados; el tratamiento del retraso de la consolidación o falta de consolidación de fracturas de huesos largos o pseudoartrosis de artrodesis vertebrales; y para inducir formación de hueso nuevo en la necrosis avascular de la cadera o la rodilla.

Además de métodos ex vivo de terapia génica, la transfección de un vector de ADN recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para LMP o HLMP puede conseguirse in vivo. Cuando se inserta un fragmento de ADN que codifica para LMP o HLMP en un vector viral apropiado, por ejemplo, un vector de adenovirus, el constructo viral puede inyectarse directamente en un sitio del organismo en el que se desea la osificación endocondral. Usando una inyección percutánea directa para introducir la secuencia de LMP o HLMP puede conseguirse la estimulación de la osificación sin la necesidad de intervención quirúrgica o bien para obtener células de médula ósea (para transfectar ex vivo) o bien para reimplantarlas en el paciente en el sitio en el que se requiere hueso nuevo. Alden et al., Neurosurgical Focus (1998), han demostrado la utilidad de un método de inyección directa de terapia génica que usa un ADNc que codifica para BMP-2, que se clonó en un vector de adenovirus.

También es posible llevar a cabo la terapia génica in vivo inyectando directamente en un sitio del organismo apropiado, un plásmido recombinante desnudo, es decir, no encapsulado, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para HLMP. En esta realización de la invención, la transfección se produce cuando el ADN de plásmido desnudo se capta, o internaliza, por las células diana apropiadas, que se han descrito. Tal como en el caso de la terapia génica in vivo que usa un constructo viral, la inyección directa de ADN de plásmido desnudo ofrece la ventaja de que se requiere una pequeña intervención quirúrgica o ninguna. Se ha mostrado de manera satisfactoria en pacientes humanos la terapia génica directa, que usa ADN de plásmido desnudo que codifica para el mitógeno de células endoteliales VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular). Baumgartner et al., Circulation, 97(12):1114-23 (1998).

Usando un vector de adenovirus para insertar LMP en células osteogénicas, se consigue la expresión transitoria de LMP. Esto se produce debido a que el adenovirus no se incorpora en el genoma de las células diana que se transfectan. La expresión transitoria de LMP, es decir, la expresión que se produce durante el tiempo de vida de las células diana transfectadas, es suficiente para conseguir los objetos de la invención. Sin embargo, la expresión estable de LMP puede producirse cuando se usa un vector que se incorpora en el genoma de la célula diana, como vehículo de inserción. Los vectores basados en retrovirus, por ejemplo, son adecuados para este fin.

La expresión estable de LMP es particularmente útil para tratar diversos trastornos sistémicos relacionados con los huesos, tales como osteoporosis y osteogénesis imperfecta. Para esta realización de la invención, además de usar un vector que se integra en el genoma de la célula diana para insertar una secuencia de nucleótidos que codifica para LMP en las células diana, la expresión de LMP se sitúa bajo el control de un promotor regulable. Por ejemplo, es adecuado un promotor que se activa mediante la exposición a un agente de inducción exógeno, tal como tetraciclina. Usando este enfoque, puede estimularse la formación de hueso nuevo de manera sistémica administrando una cantidad eficaz del agente de inducción exógeno. Una vez que se consigue una cantidad suficiente de masa ósea, se interrumpe la administración del agente de inducción exógeno. Este proceso puede repetirse según sea necesario para remplazar la masa ósea que se ha perdido, por ejemplo, como consecuencia de la osteoporosis.

Los anticuerpos específicos para HLMP son particularmente adecuados para su uso en los métodos para someter a ensayo el potencial osteoinductor, es decir, de osificación, de las células del paciente. De este modo, pueden identificarse pacientes que corren el riesgo de una consolidación lenta o escasa de la reparación ósea. Además, los anticuerpos específicos de HLMP son adecuados para su uso en ensayos con marcadores para identificar factores de riesgo en enfermedades degenerativas óseas, tales como, por ejemplo, osteoporosis.

Siguiendo métodos convencionales y bien conocidos, los genes de la presente invención se preparan mediante ligamiento de segmentos de ácido nucleico que codifican para LMP a otras secuencias de ácido nucleico, tales como vectores de clonación y/o expresión. Se han descrito métodos necesarios para construir y analizar estos vectores recombinantes, por ejemplo, digestos de endonucleasas de restricción, protocolos de clonación, mutagénesis, síntesis orgánica de oligonucleótidos y secuenciación de ADN. Para ADN de secuenciación de ADN, el método de didesoxiterminador es el preferido.

Se han publicado muchos tratados sobre métodos con ADN recombinante, incluyendo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2ª Edición (1988), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1988). Estos manuales de referencia se incorporan específicamente al presente documento como referencia.

La amplificación dirigida por cebadores de ADN o ADNc es una etapa común en la expresión de los genes de esta invención. Se realiza normalmente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se describe en la patente estadounidense número 4.800.159 concedida a Mullis et al. y otras fuentes publicadas. El principio básico de la PCR es la replicación exponencial de una secuencia de ADN mediante ciclos sucesivos de extensión de cebadores. Los productos de extensión de un cebador, cuando se hibridan con otro cebador, se convierten en un molde para la síntesis de otra molécula de ácido nucleico. Los complejos de cebador-molde actúan como sustrato para la ADN polimerasa, que al realizar su función de replicación, extiende los cebadores. La enzima convencional para las aplicaciones de PCR es la ADN polimerasa termoestable aislada de Thermus aquaticus, o Taq ADN polimerasa.

Existen numerosas variaciones del método de PCR básico, y un procedimiento de elección particular en cualquier etapa dada necesaria para construir los vectores recombinantes de esta invención se realiza fácilmente por un experto. Por ejemplo, para medir la expresión celular de 10-4/RLMP, se extrae ARN y se transcribe de manera inversa con procedimientos convencionales y bien conocidos. Entonces, se analiza el ADNc resultante para determinar la secuencia de ARNm apropiada mediante PCR.

El gen que codifica para la proteína de mineralización LIM se expresa en un vector de expresión en un sistema de expresión recombinante. Por supuesto, la secuencia construida no es necesario que sea igual a la original, ni su secuencia complementaria, sino que en cambio, puede ser cualquier secuencia determinada mediante la degeneración del código de ADN que no obstante exprese una LMP que tiene actividad de osificación. También pueden emplearse sustituciones de aminoácidos conservativas, u otras modificaciones, tales como la aparición de un residuo de metionina amino-terminal.

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Un sitio de unión a ribosoma activo en el sistema de expresión del huésped de elección se liga al extremo 5' de la secuencia que codifica para la LMP quimérica, formando un gen sintético. El gen sintético puede insertarse en uno cualquiera de una gran variedad de vectores para la expresión mediante ligamiento a un plásmido linealizado de manera apropiada. Un promotor regulable, por ejemplo, el promotor lac de E. coli, es también adecuado para la expresión de las secuencias codificantes quiméricas. Otros promotores regulables adecuados incluyen promotores trp, tac, recA, T7 y lambda.

El ADN que codifica para LMP se transfecta en las células del receptor mediante uno de varios procedimientos publicados convencionales, por ejemplo, precipitación con fosfato de calcio. DEAE-dextrano, electroporación o fusión de protoplastos, para formar transformantes estables. Se prefiere la precipitación con fosfato de calcio, particularmente cuando se realiza tal como sigue.

Se coprecipitan los ADN con fosfato de calcio según el método de Graham y Van Der, Virology, 52:456 (1973), antes de transferirse a las células. Se usa una alícuota de 40-50 \mug de ADN, con ADN de timo de ternero o esperma de salmón como vehículo, para 0,5x10^{6} células sembradas en placa en una placa de 100 mm. Se mezcla el ADN con 0,5 ml de 2X disolución Hepes (NaCl 280 mM, Hepes 50 mM y Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, pH 7,0), a lo que se añade un volumen igual de 2x CaCl_{2} (CaCl_{2} 250 mM y Hepes 10 mM, pH 7,0). Se distribuye de manera uniforme un precipitado granular blanco, que aparece tras 30-40 minutos, gota a gota sobre las células, que se dejan incubar durante 4-16 horas a 37ºC. Se elimina el medio y se almacenan las células sacudidas con glicerol al 15% en PBS durante 3 minutos. Tras eliminar el glicerol, se alimentan las células medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contiene suero bovino fetal al 10%.

El ADN puede transfectarse también usando: los métodos de DEAE-dextrano de Kimura et al., Virology, 49:394 (1972) y Sompayrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7575 (1981); el método de electroporación de Potter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7161 (1984); y el método de fusión de protoplastos de Sandri-Goddin et al., Molec. Cell. Biol., 1:743 (1981).

La química de la fosforamidita en fase sólida es el método preferido para la síntesis orgánica de oligodesoxinucleótidos y polidesoxinucleótidos. Además, se encuentran disponibles muchos otros métodos de síntesis orgánica. Esos métodos se adaptan fácilmente por los expertos en la técnica a las secuencias particulares de la invención.

La presente invención incluye también moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones convencionales con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas de mineralización LIM de la invención. Las "condiciones de hibridación convencionales" variarán con el tamaño de la sonda, el fondo y la concentración de los reactivos de ácido nucleico, así como el tipo de hibridación, por ejemplo, in situ, transferencia de tipo Southern, o hibridación de híbridos de ADN-ARN (transferencia de tipo Northern). La determinación de las "condiciones de hibridación convencionales" está dentro del nivel de conocimiento en la técnica. Por ejemplo, véase la patente estadounidense 5.580.775 concedida a Fremeau et al., incorporada al presente documento como referencia para este fin. Véase también, Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98:503 (1975), Alwine et al., Meth. Enzymol., 68:220 (1979), y Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2ª edición, páginas 7.19-7.50, Cold Spring Harbor Press (1989).

Un conjunto preferido de condiciones de hibridación convencionales implica una transferencia que se hibrida previamente a 42ºC durante 2 horas en formamida al 50%, 5X SSPE (NaCl 150 nM, NaH_{2}PO_{4} 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM [pH 8,0]), 5X disolución de Denhardt (20 mg de Ficoll, 20 mg de polivinilpirrolidona y 20 mg de BSA por 100 ml de agua), sulfato de dextrano al 10%, SDS al 1% y ADN de esperma de salmón 100 \mug/ml. Se añade una sonda de ADNc marcada con ^{32}P y se continúa la hibridación durante 14 horas. Después, se lava la transferencia dos veces con 2X SSPE, SDS al 0,1% durante 20 minutos a 22ºC, seguido de un lavado de 1 hora a 65ºC en 0,1X SSPE, SDS al 0,1%. Entonces se seca la transferencia y se expone a película de rayos X durante 5 días en presencia de una pantalla de intensificación.

En "condiciones sumamente rigurosas", una sonda se hibridará con su secuencia diana si esas dos secuencias son sustancialmente idénticas. Tal como en el caso de condiciones de hibridación convencionales, un experto en la técnica puede, dado el nivel de conocimiento en la técnica y la naturaleza del experimento particular, determinar las condiciones en las que solamente hibridarán secuencias sustancialmente idénticas.

Otro aspecto de la invención incluye las proteínas codificadas por las secuencias de ácido nucleico. Todavía en otra realización, la invención se refiere a la identificación de tales proteínas basándose en anticuerpos anti-LMP. En esta realización, se preparan muestras de proteína para análisis de inmunotransferencia de tipo Western lisando las células y separando las proteínas mediante SDS-PAGE. Se transfieren las proteínas a nitrocelulosa mediante electrotransferencia tal como se describe por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1987). Tras bloquear el filtro con leche en polvo desnatada instantánea (1 g en 100 ml de PBS), se añade anticuerpo anti-LMP al filtro y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava el filtro meticulosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incuba con conjugado de peroxidasa del rábano (HRPO)-anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava de nuevo el filtro meticulosamente con PBS y se identifican las bandas de antígeno añadiendo diaminobencidina (DAB).

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Los anticuerpos monoespecíficos son el reactivo de elección en la presente invención y se usan específicamente para analizar las células del paciente para determinar características específicas asociadas con la expresión de LMP. "Anticuerpo monoespecífico" tal como se usa en el presente documento se define como una única especie de anticuerpo o múltiples de especies de anticuerpo con características de unión homogéneas para LMP. "Unión homogénea" tal como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse a un epítopo o antígeno específico, tal como los asociados a LMP, tal como se describió anteriormente. Se purifican anticuerpos monoespecíficos frente a LMP a partir antisueros de mamífero que contienen anticuerpos reactivos frente a LMP o se preparan como anticuerpos monoclonales reactivos con LMP usando la técnica de Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975). Los anticuerpos específicos para LMP se generan inmunizando animales tales como, por ejemplo, ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras o caballos, con una concentración apropiada de LMP o bien con o bien sin un adyuvante inmunitario.

En este proceso, se recoge suero preinmunitario antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 1000 mg de LMP asociada a un adyuvante inmunitario aceptable, si se desea. Tales adyuvantes aceptables incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes completo de Freund, incompleto de Freund, precipitado de alumbre, emulsión de agua en aceite que contiene Corynebacterium parvum y ARNt. La inmunización inicial consiste en LMP en, preferiblemente, adyuvante completo de Freund que se inyecta en múltiples sitios o bien por vía subcutánea (s.c.), por vía intraperitoneal (i.p.) o ambas. Se extrae sangre de cada animal a intervalos regulares, preferiblemente de manera semanal, para determinar el título de anticuerpos. Los animales pueden o no recibir inyecciones de recuerdo tras la inmunización inicial. A los animales que reciben inyecciones de recuerdo se les administra generalmente una cantidad igual del antígeno en adyuvante incompleto de Freund mediante la misma vía. Las inyecciones de recuerdo se administran a intervalos de aproximadamente tres semanas hasta que se obtienen títulos máximos. Aproximadamente a los 7 días tras cada inmunización de recuerdo o aproximadamente de manera semanal tras una única inmunización, se extrae sangre de los animales, se recoge el suero y se almacenan alícuotas a aproximadamente -20º C.

Se preparan anticuerpos monoclonales (AcM) reactivos con LMP inmunizando ratones consanguíneos, preferiblemente ratones Balb/c, con LMP. Se inmunizan los ratones por vía i.p. o s.c. con de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg, preferiblemente con aproximadamente 1 mg, de LMP en aproximadamente 0,5 ml de tampón o solución salina incorporado en un volumen igual de un adyuvante aceptable, tal como se trató anteriormente. Se prefiere el adyuvante completo de Freund. Los ratones reciben una inmunización inicial en el día 0 y descansan durante aproximadamente 3-30 semanas. A los ratones inmunizados se les administra una o más inmunizaciones de recuerdo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg de LMP en una disolución tampón tal como solución salina tamponada con fosfato por vía intravenosa (i.v.). Se obtienen linfocitos de ratones positivos para los anticuerpos, preferiblemente linfocitos esplénicos, extirpando los bazos de ratones inmunizados mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Se producen células de hibridoma mezclando los linfocitos esplénicos con un componente de fusión apropiado, preferiblemente células de mieloma, en condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables. Los componentes de fusión pueden incluir, pero no se limitan a: mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp 2/0, prefiriéndose Sp 2/0. Las células productoras de anticuerpos y células de mieloma se fusionan en polietilenglicol, peso molecular de aproximadamente 1000, a concentraciones de desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 50%. Se seleccionan células de hibridoma fusionadas mediante crecimiento en hipoxantina, timidina y aminopterina en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado (DMEM) mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se recogen los líquidos sobrenadantes de los pocillos con crecimiento positivo aproximadamente en los días 14, 18, y 21, y se examinan para detectar la producción de anticuerpos mediante un inmunoensayo tal como radioinmunoanálisis en fase sólida (SPIRA) usando LMP como antígeno. También se someten a prueba los líquidos de cultivo en el ensayo de precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo del AcM. Se clonan células de hibridoma de pocillos positivos para anticuerpos mediante una técnica tal como la técnica en agar blando de MacPherson, "Soft Agar Techniques", en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y Paterson (eds.), Academic
Press (1973). Véase, también, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory (1988).

Pueden producirse también anticuerpos monoclonales in vivo mediante la inyección a ratones de Balb/c sensibilizados con Pristane, aproximadamente 0,5 ml por ratón, de aproximadamente de 2x10^{6} a aproximadamente 6x10^{6} células de hibridoma aproximadamente 4 días tras la sensibilización. Se recoge el líquido ascítico aproximadamente a los 8-12 días tras transferir las células y se purifican los anticuerpos monoclonales mediante técnicas conocidas en la técnica.

La producción in vitro en AcM anti-LMP se lleva a cabo haciendo crecer la línea de células de hibridoma en DMEM que contiene suero de ternero fetal a aproximadamente el 2% para obtener cantidades suficientes del AcM específico. Se purifican los AcM mediante técnicas conocidas en la técnica.

Se determinan los títulos de anticuerpo de líquidos de cultivo de hibridoma o ascitis mediante diversos ensayos serológicos o inmunológicos, que incluyen, pero no se limitan a, técnicas de precipitación, aglutinación pasiva, técnica de anticuerpo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA) y radioinmunoanálisis (RIA). Se usan ensayos similares para detectar la presencia de la LMP tejido o fluidos corporales o extractos celulares.

Resulta fácilmente evidente para los expertos en la técnica que los métodos descritos anteriormente para producir anticuerpos monoespecíficos pueden utilizarse para producir anticuerpos específicos para fragmentos de polipéptido de LMP, polipéptido de LMP naciente de longitud completa, o variantes o alelos de los mismos.

El 22 de julio de 1997, se depositó una muestra de 10-4/RLMP en un vector designado pCMV2/RLMP (que es el vector pRc/CMV2 con el inserto clon 10-4/RLMP) en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. El número de registro de cultivo para ese depósito es 209153. El 19 de marzo de 1998, se depositó una muestra del vector pHis-A con el inserto HLPM-1s en la Colección Americana de Cultivos Tipo. El número de registro de cultivo para ese depósito es 209698. Estos depósitos, realizados bajo los requisitos del Tratado de Budapest, se mantendrán en la ATCC durante al menos 30 años y estarán disponibles al público tras la concesión de una patente que los describa. Debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye un permiso para poner en práctica la invención objeto en menoscabo de los derechos de patente concedidos por la acción gubernamental.

En la evaluación de los ácidos nucleicos, proteínas o anticuerpos de la invención, se emplean ensayos enzimáticos, purificación de proteínas y otros métodos bioquímicos convencionales. Se analizan ADN y ARN mediante técnicas de transferencia de tipo Southern y de transferencia de tipo Northern, respectivamente. Normalmente, las muestras analizadas se fraccionan por tamaños mediante electroforesis en gel. Entonces se transfieren ADN o ARN en los geles a membranas de nailon o nitrocelulosa. Entonces se hibridaron con sondas las transferencias, que son réplicas de los patrones de muestra en los geles. Normalmente, las sondas están radiomarcadas, preferiblemente con ^{32}P, aunque podrían marcarse las sondas con otras moléculas de generación de señales conocidas por los expertos en la técnica. Entonces pueden visualizarse bandas de interés específicas mediante sistemas de detección, tales como autorradiografía.

Para los fines de ilustrar las realizaciones preferidas de la presente invención, se incluyen los siguientes ejemplos no limitativos. Estos resultados demuestran la viabilidad de inducir o potenciar la formación de hueso usando las proteínas de mineralización LIM de la invención, y las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para esas proteínas.

Ejemplo 1 Cultivo de células calváricas

Se obtuvieron células calváricas de rata, también conocidas como osteoblastos de rata ("ROB"), de ratas 20 días antes del parto tal como se describió anteriormente. Boden et al., Endocrinology, 137(8):3401-07 (1996). Se hicieron crecer cultivos primarios hasta confluencia (7 días), se sometieron a tripsinización y se pasaron a placas de 6 pocillos (1 x 10^{5} células/pocillo de 35 mm) como primeras células de subcultivo. Se hicieron crecer las células de subcultivo, que estaban en confluencia en el día 0, durante 7 días adicionales. Comenzando en el día 0, se cambiaron los medios y se aplicaron tratamientos (Trm y/o BMP) en una campana de flujo laminar, cada 3 ó 4 días. El protocolo de cultivo convencional era tal como sigue: días 1-7, MEM, FBS al 10%, ácido ascórbico 50 \mug/ml, \pm estímulo; días 8-14, medio BGJb, FBS al 10%, \beta-GlyP 5 mM (como fuente de fosfato inorgánico para permitir la mineralización). Se realizó en el día 14 el análisis del punto final de la formación de nódulos óseos y la secreción de osteocalcina. Se eligió la dosis de BMP como 50 ng/ml basándose en los experimentos piloto en este sistema que demostró un efecto de intervalo medio sobre la curva dosis-respuesta para todas las BMP estudiadas.

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Ejemplo 2 Cultivo celular y tratamiento antisentido

Para explorar el posible papel funcional de LMP-1 durante la osificación membranosa, se sintetizó un oligonucleótido antisentido para bloquear la traducción de ARNm de LMP-1 y se trataron cultivos secundarios de osteoblastos que estaban sometiéndose a diferenciación iniciada por glucocorticoides. Se realizó la inhibición de la expresión de RLMP con un oligonucleótido antisentido sumamente específico (que no tenía homologías significativas con las secuencias de rata conocidas) correspondiente a una secuencia de 25 pb que abarca el supuesto sitio de inicio de la traducción (SEQ ID NO: 35). Los cultivos control o bien no recibieron oligonucleótido o bien recibieron oligonucleótido sentido. Se realizaron los experimentos en presencia (preincubación) y ausencia de lipofectamina. En resumen, se incubaron 22 \mug de RLMP sentido o antisentido en MEM durante 45 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, se añadió o bien más MEM o bien lipofectamina/MEM preincubada (7% v/v; incubada durante 45 minutos a temperatura ambiente) para lograr una concentración de oligonucleótido de 0,2 \muM. Se incubó la mezcla resultante durante 15 minutos a temperatura ambiente. Entonces se mezclaron las mezclas de oligonucleótidos con el medio apropiado, es decir, MEM/Ascorbato/\pmTrm, para lograr una concentración final de oligonucleótido de 0,1 \muM.

Se incubaron las células con el medio apropiado (\pm estímulo) en presencia o ausencia de los oligonucleótidos apropiados. Se realimentaron los cultivos incubados originalmente con lipofectamina tras 4 horas de incubación (37ºC; CO_{2} al 5%) con medios que no contenían ni lipofectamina ni oligonucleótido. Se realimentaron todos los cultivos, especialmente los cultivos que recibieron oligonucleótido, cada 24 horas para mantener los niveles de oligonucleótidos.

El oligonucleótido antisentido de LMP-1 inhibió la formación de nódulos mineralizados y la secreción de osteocalcina de una manera dependiente de la dosis, similar al efecto de oligonucleótido BMP-6. El bloqueo antisentido de LMP-1 en la diferenciación de osteoblastos no pudo rescatarse mediante la adición de BMP-6 exógena, mientras que se invirtió la inhibición de oligonucleótido antisentido de BMP-6 con la adición de BMP-6. Este experimento confirmó además la posición anterior de LMP-1 con respecto a BMP-6 en la ruta de diferenciación de osteoblastos. El oligonucleótido antisentido de LMP-1 también inhibió la diferenciación espontánea de osteoblastos en cultivos de osteoblastos de rata primarios.

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Ejemplo 3 Cuantificación de la formación de nódulos óseos mineralizados

Se fijaron durante la noche en etanol al 70% cultivos de ROB preparados según los ejemplos 1 y 2 y se tiñeron con tinción de plata de von Kossa. Se usó un sistema de análisis de obtención de imágenes de vídeo computerizado semiautomatizado para cuantificar el recuento de nódulos y el área de los nódulos en cada pocillo. Boden et al., Endocrinology, 137(8):3401-07 (1996). Entonces se dividieron estos valores para calcular los valores del área por nódulo. Se validó este procedimiento automatizado frente a una técnica de recuento manual y se demostró un coeficiente de correlación de 0,92 (p < 0,000001). Todos los datos se expresan como la media \pm el error estándar de la media (E.E.M.) calculada a partir de 5 ó 6 pocillos en cada condición. Se confirmó cada experimento al menos dos veces usando células a partir de diferentes preparaciones calváricas.

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Ejemplo 4 Cuantificación de la secreción de osteocalcina

Se midieron niveles de osteocalcina en los medios de cultivo usando un radioinmunoanálisis competitivo con un anticuerpo policlonal (AcP) monoespecífico producido en nuestro laboratorio frente al nonapéptido C-terminal de osteocalcina de rata tal como se describió en Nanes et al., Endocrinology, 127:588 (1990). En resumen, se trató con yodo 1 \mug de nonapéptido con 1 mCi de ^{125}I-Na mediante el método de lactoperoxidasa. Tubos que contenían 200 \mul de tampón de ensayo (fosfato de sodio 0,02 M, EDTA 1 mM, timerosal al 0,001%, BSA al 0,025%) recibieron medios tomados de cultivos celulares o patrones de osteocalcina (0-12.000 fmoles) a 100 \mul/tubo en tampón de ensayo. Entonces se añadió el AcP (1:40.000; 100 \mul) seguido del péptido yodado (12.000 cpm; 100 \mul). Se prepararon muestras sometidas a prueba para determinar la unión no específica de manera similar pero sin contener anticuerpo.

Se separaron AcP unido y libre mediante la adición de 700 \mul de IgG de cabra anti-conejo, seguido de la incubación durante 18 horas a 4ºC. Tras centrifugar las muestras a 1200 rpm durante 45 minutos, se decantaron los sobrenadantes y se sometieron a recuento los precipitados en un contador gamma. Se notificaron los valores de osteocalcina en fmoles/100 \mul, que se convirtieron entonces en pmoles/ml de medio (producción de 3 días) dividiendo estos valores entre 100. Se expresaron los valores como la media \pm el E.E.M. de determinaciones por triplicado para 5-6 pocillos para cada condición. Se confirmó cada experimento al menos dos veces usando células a partir de diferentes preparaciones calváricas.

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Ejemplo 5 Efecto de Trm y RLMP sobre la mineralización in vitro

Hubo un pequeño efecto evidente de los nucleótidos o bien sentido o bien antisentido sobre la producción global de nódulos óseos en el sistema de cultivo celular no estimulado. Sin embargo, cuando se estimularon ROB con Trm, el oligonucleótido antisentido para RLMP inhibió la mineralización de nódulos en > 95%. La adición de BMP-6 exógena a los cultivos tratados con oligonucleótido no rescató la mineralización de nódulos tratados con antisentido de RLMP.

Osteocalcina ha sido desde hace tiempo sinónimo de la mineralización ósea, y los niveles de osteocalcina se han correlacionado con la producción de nódulos y la mineralización. El oligonucleótido antisentido de RLMP disminuye significativamente la producción de osteocalcina, pero el recuento de nódulos en cultivos tratados con antisentido no cambia significativamente. En este caso, la adición de BMP-6 exógena sólo rescata la producción de osteocalcina en cultivos tratados con antisentido de RLMP en el 10-15%. Esto sugiere que la acción de RLMP es posterior a, y más específica que, BMP-6.

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Ejemplo 6 Recogida y purificación de ARN

Se recogió ARN celular de pocillos por duplicado de ROB (preparados según los ejemplos 1 y 2 en placas de cultivo de 6 pocillos) usando una disolución 4 M de isotiocianato de guanidina (GIT) proporcionando triplicados estadísticos. En resumen, se aspiró el sobrenadante de cultivo de los pocillos, que entonces se recubrieron con 0,6 ml de disolución de GIT por recogida de pocillos por duplicado. Tras añadir la disolución de GIT, las placas se agitaron durante 5-10 segundos (siendo lo más constante posible). Se guardaron las muestras a -70ºC durante hasta 7 días antes del procesamiento adicional.

Se purificó ARN mediante una ligera modificación de los métodos convencionales según Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª edición, capítulo 7, 19, Cold Spring Harbor Press (1989). En resumen, las muestras descongeladas recibieron 60 \mul de acetato de sodio 2,0 M (pH 4,0), 550 \mul de fenol (saturado en agua) y 150 \mul de cloroformo:alcohol isoamílico (49:1). Tras agitar con vórtex, se centrifugaron las muestras (10000 x g; 20 minutos; 4ºC), se transfirió la fase acuosa a un tubo nuevo, se añadieron 600 \mul de isopropanol y precipitó el ARN durante la noche a -20ºC.

Tras la incubación durante la noche, se centrifugaron las muestras (10000 x g; 20 minutos) y se aspiró suavemente el sobrenadante. Se resuspendieron los sedimentos en 400 \mul de agua tratada con DEPC, se extrajeron una vez con fenol:cloroformo (1:1), se extrajeron con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y precipitaron durante la noche a -20ºC tras la adición de 40 \mul de acetato de sodio (3,0 M; pH 5,2) y 1,0 ml de etanol absoluto. Para recuperar el ARN celular, se centrifugaron las muestras (10000 x g; 20 min.), se lavaron una vez con etanol al 70%, se secaron al aire durante 5-10 minutos y se resuspendieron en 20 \mul de agua tratada con DEPC. Se calcularon las concentraciones de ARN a partir de las densidades ópticas que se determinaron con un espectrofotómetro.

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Ejemplo 7 Reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa

Se añadió ARN total calentado (5 \mug en un volumen total de 10,5 \mul de DEPC-H_{2}O a 65ºC durante 5 minutos) a tubos que contenían 4 \mul de 5X tampón MMLV-RT, 2 \mul de dNTP, 2 \mul de cebador dT17 (10 pmol/ml), 0,5 \mul de ARNsin (40 U/ml) y 1 \mul de MMLV-RT (200 unidades/\mul). Se incubaron las muestras a 37ºC durante 1 hora, entonces a 95ºC durante 5 minutos para inactivar la MMLV-RT. Se diluyeron las muestras mediante la adición de 80 \mul de
agua.

Se sometieron las muestras transcritas de manera inversa (5 \mul) a reacción en cadena de la polimerasa usando metodologías convencionales (volumen total de 50 \mul). En resumen, se añadieron las muestras a tubos que contenían agua y cantidades apropiadas de tampón de PCR, MgCl_{2} 25 mM, dNTP, cebadores directo e inverso para gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAP, un gen de mantenimiento) y/o BMP-6), ^{32}P-dCTP y Taq polimerasa. A menos que se indique lo contrario, se normalizaron los cebadores para ejecutar de manera constante 22 ciclos (94ºC, 30''; 58ºC, 30''; 72ºC, 20'').

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Ejemplo 8 Cuantificación de productos de RT-PCR mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y análisis de Phosphorimager

Los productos de RT-PCR recibieron 5 \mul/tubo de colorante de carga, se mezclaron, se calentaron a 65ºC durante 10 min. y se centrifugaron. Se sometieron diez \mul de cada reacción a PAGE (poliacrilamida al 12%:bis; 15 V/pocillo; corriente constante) en condiciones convencionales. Entonces se incubaron los geles en tampón de conservación (10% v/v de glicerol, 7% v/v de ácido acético, 40% v/v de metanol, 43% de agua desionizada) durante 30 minutos, se secaron (80ºC) a vacío durante 1-2 horas y se revelaron con un sistema de obtención de imágenes fosforescentes potenciado electrónicamente durante 6-24 horas. Se analizaron las bandas visualizadas. Se representaron gráficamente los recuentos por banda.

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Ejemplo 9 PCR de presentación diferencial

Se extrajo ARN de células estimuladas con glucocorticoide (Trm, 1 nM). Se transcribió de manera inversa ARN total calentado, tratado con ADNasa (5 \mug en un volumen total de 10,5 en DEPC-H_{2}O a 65ºC durante 5 minutos) tal como se describió en el ejemplo 7, pero se usó H-T_{11}M (SEQ ID. NO: 4) como cebador de MMLV-RT. Se amplificaron por PCR los ADNc resultantes tal como se describió anteriormente, pero con diversos conjuntos de cebadores comerciales (por ejemplo, H-T_{11}G (SEQ ID NO: 4) y H-AP-10 (SEQ ID. NO: 5); GenHunter Corp, Nashville, TN). Se fraccionaron los productos de PCR radiomarcados mediante electroforesis en gel sobre un gel de secuenciación de ADN. Tras la electroforesis, se secaron los geles resultantes a vacío y se expusieron a autorradiografías durante la noche. Se cortaron del gel bandas que representaban ADNc que se expresaban de manera diferencial y volvieron a amplificarse mediante PCR usando el método de Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:278 (1983). Se clonaron los productos de la reamplificación por PCR en el vector PCR-II (TA cloning kit; InVitrogen, Carlsbad, CA).

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Ejemplo 10 Exploración de una biblioteca de ADNc de células de osteosarcoma de rata UMR 106

Se sembró en placa una biblioteca de UMR 106 (2,5 x 1010 ufp/ml) a 5 x 10^{4} ufp/ml sobre placas de agar (agar de fondo LB) y se incubaron las placas durante la noche a 37ºC. Se recubrieron las placas con membranas filtrantes durante dos minutos. Una vez retirados, los filtros se desnaturalizaron, se enjuagaron, se secaron y se reticularon mediante UV. Entonces se incubaron los filtros en tampón de prehibridación (2X PIPES [pH 6,5], formamida al 5%, SDS al 1% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml) durante 2 h a 42ºC. Se añadió una sonda radiomarcada de 260 pares de bases (SEQ ID NO: 3; marcada con ^{32}P mediante cebado aleatorio) a los filtros/mezcla de hibridación completa, seguido de hibridación durante 18 horas a 42ºC. Se lavaron las membranas una vez a temperatura ambiente (10 min., 1 x SSC, SDS al 0,1%) y tres veces a 55ºC (15 min., 0,1 x SSC, SDS al 0,1%).

Tras lavarse, se analizaron las membranas mediante autorradiografía tal como se describió anteriormente. Se purificaron por placa los clones positivos. Se repitió el procedimiento con un segundo filtro durante cuatro minutos para minimizar los falsos positivos. Se rescataron clones purificados por placa como fagémidos lambda SK(-). Se secuenciaron ADNc clonados tal como se describe a continuación.

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Ejemplo 11 Secuenciación de clones

Se secuenciaron insertos de ADNc mediante métodos convencionales. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1988). En resumen, se sometieron concentraciones apropiadas de mezcla de terminación, molde y mezcla de reacción a un protocolo de ciclación apropiado (95ºC, 30 s; 68ºC, 30 s; 72ºC, 60 s; x 25). Se añadió mezcla de detección para terminar las reacciones de secuenciación. Tras calentar a 92ºC durante 3 minutos, se cargaron las muestran sobre un gel de secuenciación de poliacrilamida al 6% desnaturalizante (acrilamida:bis-acrilamida 29:1). Se sometieron a electroforesis las muestran durante aproximadamente 4 horas a 60 voltios, corriente constante. Tras la electroforesis, se secaron los geles a vacío y se tomaron autorradiografías.

Se analizaron manualmente las autorradiografías. Se examinaron las secuencias resultantes en las bases de datos mantenidas por el Centro Nacional de Información Biotecnológica ("National Center durante Biotechnology Information" (NIH, Bethesda, MD; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando el programa BLASTn ajustado con parámetros por defecto. Basándose en los datos de secuencia, se prepararon nuevos cebadores de secuenciación y se repitió el procedimiento hasta que todo el gen se había secuenciado. Se confirmaron todas las secuencias un mínimo de tres veces en ambas orientaciones.

Se analizaron también las secuencias de aminoácidos y nucleótidos usando el paquete de software PCGENE (versión 16.0). Se calcularon valores de homología en tanto por ciento para las secuencias de nucleótidos mediante el programa NALIGN, usando los siguientes parámetros: peso de nucleótidos no apareados, 10; peso de huecos no apareados, 10; número máximo de nucleótidos considerado, 50; y número mínimo de nucleótidos considerado, 50.

Para las secuencias de aminoácidos, se calcularon valores de homología en tanto por ciento usando PALIGN. Se seleccionó un valor de 10 tanto para el coste de hueco abierto como para el coste de hueco unitario.

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Ejemplo 12 Clonación de ADNc de RLMP

Los productos de amplificación por PCR de presentación diferencial descritos en el ejemplo 9 contenían una banda principal de aproximadamente 260 pares de bases. Se usó esta secuencia para examinar una biblioteca de ADNc de osteosarcoma de rata (UMR 106). Se sometieron clones positivos a análisis con cebadores anidados para obtener las secuencias de cebadores necesarias para amplificar el ADNc de longitud completa. (SEQ. ID NO: 11, 12, 29, 30 y 31). Uno de los clones positivos seleccionados para su estudio adicional se designó clon 10-4.

El análisis de secuencia del ADNc de longitud completa en el clon 10-4, determinado mediante análisis con cebadores anidados, mostró que el clon 10-4 contenía el fragmento de 260 pares de bases identificado mediante PCR de presentación diferencial. El clon 10-4 (1696 pares de bases; SEQ ID NO: 2) contiene un marco de lectura abierto de 1371 pares de bases que codifica para una proteína que tiene 457 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). El codón de terminación, TGA, se produce en los nucleótidos 1444-1446. La señal de poliadenilación en los nucleótidos 1675-1680, y la cola de poli(A)^{+} adyacente, estaba presente en la región no codificante en 3'. Había dos posibles sitios de N-glicosilación, Asn-Lys-Thr y Asn-Arg-Thr, en las posiciones de aminoácido 113-116 y 257-259 en SEQ ID NO: 1, respectivamente. Se hallaron dos posibles sitios de fosforilación mediante proteínas cinasas dependientes de AMPc y GMPc, Ser y Thr, en las posiciones de aminoácido 191 y 349, respectivamente. Había cinco posibles sitios de fosforilación mediante proteína cinasa C, Ser o Thr, en las posiciones de aminoácido 3, 115, 166, 219, 442. Se determinó un posible motivo A de sitio de unión a ATP/GTP (bucle P), Gly-Gly-Ser-Asn-Asn-Gly-Lys-Thr, en las posiciones de aminoácido 272-279.

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Además, se hallaron dos supuestos motivos LIM sumamente conservados en las posiciones de aminoácido 341-391 y 400-451. Los supuestos dominios LIM en este clon de ADNc de rata recién identificado mostraron una homología considerable con los dominios LIM de otras proteínas LIM conocidas. Sin embargo, la homología global con otras proteínas LIM de rata era inferior al 25%. RLMP (designado también 10-4) tiene una homología de aminoácidos del 78,5% con respecto a la proteína enigma humana (véase la patente estadounidense 5.504.192), pero sólo una homología de aminoácidos del 24,5% y el 22,7% con respecto a sus homólogos de rata más cercanos, CLP-36 y RIT-18, respectivamente.

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Ejemplo 13 Análisis de transferencia de tipo Northern de la expresión de RLMP

Se fraccionaron por tamaño treinta \mug de ARN total de ROB, preparados según los ejemplos 1 y 2, mediante electroforesis en gel de formaldehído en geles de fondo plano de agarosa al 1% y se transfirieron osmóticamente a membranas de nylon. Se examinó con sonda la transferencia con un fragmento de EcoR1 de 600 pares de bases de ADNc de 10-4 de longitud completa marcado con ^{32}P-dCTP mediante cebado aleatorio.

El análisis de transferencia de tipo Northern mostró una especie de ARNm de 1,7 kb que se hibridaba con la sonda de RLMP. El ARNm de RLMP se regulaba por incremento aproximadamente 3,7 veces en ROB tras 24 horas de exposición a BMP-6. No se observó regulación por incremento de la expresión de RMLP en ROB estimuladas con BMP-2 o BMP-4 a las 24 horas.

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Ejemplo 14 Métodos estadísticos

Para cada resultado de nódulo/osteocalcina notificado, se usaron datos de 5-6 pocillos de un experimento representativo para calcular la media \pm EEM. Pueden mostrarse gráficos con datos normalizados con respecto al valor máximo para cada parámetro para permitir la representación gráfica simultánea de recuentos de nódulos, zonas mineralizadas y osteocalcina.

Para cada análisis de inmunotransferencia de tipo Western, ensayo de protección de ARNasa o RT-PCR notificado, se usaron datos de muestras por triplicado de experimentos representativos para determinar la media \pm EEM. Pueden mostrarse gráficos normalizados con respecto a o bien el día 0 o bien controles negativos y expresarse como aumento en veces por encima de valores control.

Se evaluó la significación estadística usando análisis de la varianza de una vía con correcciones de Bonferroni para comparaciones múltiples post-hoc según fue apropiado. D. V. Huntsberger, "The Analysis of Variance", en Elements of Statistical Variance, P. Billingsley (ed.), págs. 298-330, Allyn & Bacon Inc., Boston, MA (1977) y Sigmastat, Jandel Scientific, Corte Madera, CA. Se definieron niveles alfa para la significación como p < 0,05.

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Ejemplo 15 Detección de proteína de mineralización LIM de rata mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western

Se prepararon anticuerpos policlonales según los métodos de England et al., Biochim. Biophys. Acta, 623: 171 (1980) y Timmer et al., J. Biol. Chem., 268:24863 (1993).

Se transfectaron células HeLa con pCMV2/RLMP. Se recogió proteína de las células transfectadas según el método de Hair et al., Leukemia Research, 20:1 (1996). Se realizó análisis de inmunotransferencia de tipo Western de RLMP nativo tal como se describe por Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350 (1979).

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Ejemplo 16 Síntesis del producto de PCR humano derivado de LMP de rata único (RLMPU)

Basándose en la secuencia del ADNc de LMP-1 de rata, se sintetizaron cebadores de PCR directo e inverso (SEQ ID NO: 15 y 16) y se amplificó por PCR una secuencia de 223 pares de bases única a partir del ADNc de LMP-1 de rata. Se aisló un producto de PCR similar a partir de ADNc de células de osteosarcoma MG63 humanas con los mismos cebadores de PCR.

Se recogió ARN de células de osteosarcoma MG63 hechas crecer en matraces T-75. Se eliminó mediante aspiración el sobrenadante de cultivo y se recubrieron los matraces con 3,0 ml de disolución de GIT por duplicado, se agitaron durante 5-10 segundos y se transfirió la disolución resultante a tubos Eppendorf de 1,5 ml (5 tubos con 0,6 ml/tubo). Se purificó el ARN mediante una ligera modificación de los métodos convencionales, por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, capítulo 7, página 19, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y Boden et al., Endocrinology, 138:2820-28 (1997). En resumen, las muestras de 0,6 ml recibieron 60 \mul de acetato de sodio 2,0 M (pH 4,0), 550 \mul de fenol saturado con agua y 150 \mul de cloroformo:alcohol isoamílico (49:1). Tras la adición de esos reactivo, se agitaron con vórtex las muestras, se centrifugaron (10000 x. g; 20 min.; 4ºC) y se transfirió la fase acuosa a un tubo nuevo. Se añadió isopropanol (600 \mul) y se precipitó el ARN durante la noche a -20ºC. Se centrifugaron las muestras (10000 x g; 20 minutos) y se aspiró el sobrenadante suavemente. Se resuspendieron los sedimentos en 400 \mul de agua tratada con DEPC, se extrajeron una vez con fenol:cloroformo (1:1), se extrajeron con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se precipitaron durante la noche a -20ºC en 40 \mul de acetato de sodio (3,0 M; pH 5,2) y 1,0 ml de etanol absoluto. Tras la precipitación, se centrifugaron las muestras (10000 x g; 20 min.), se lavaron una vez con etanol al 70%, se secaron al aire durante 5-10 minutos y se resuspendieron en 20 \mul de agua tratada con DEPC. Se derivaron las concentraciones de ARN a partir de las densidades ópticas.

Se calentó ARN total (5 \mug en un volumen total de 10,5 \mul en DEPC-H_{2}O) a 65ºC durante 5 minutos, y entonces se añadió a tubos que contenían 4 \mul de tampón 5X MMLV-RT, 2 \mul de dNTP, 2 \mul de cebador dT17 (10 pmol/ml), 0,5 \mul de ARNsin (40 U/ml) y 1 \mul de MMLV-RT (200 unidades/\mul). Se incubaron las reacciones a 37ºC durante 1 hora. Después de eso, se inactivó el MMLV-RT mediante calentamiento a 95ºC durante 5 minutos. Se diluyeron las muestras mediante adición de 80 \mul de agua.

Se sometieron las muestras transcritas (5 \mul) a reacción en cadena de la polimerasa usando metodologías convencionales (volumen total de 50 \mul). Boden et al., Endocrinology, 138:2820-28 (1997); Ausubel et al., "Quantitation of rare DNAs by the polymerase chain reaction", en Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 15,31-1, Wiley & Sons, Trenton, NJ (1990). En resumen, se añadieron muestras a tubos que contenían agua y cantidades apropiadas de tampón de PCR (MgCl_{2} 25 mM, dNTP, cebadores directo e inverso (para RLMPU; SEQ ID NO: 15 y 16), ^{32}P-dCTP y ADN polimerasa. Se diseñaron los cebadores para que funcionasen de manera constante en 22 ciclos para la detección de bandas radiactivas y 33 ciclos para la amplificación de producto de PCR para su uso como sonda de exploración (94ºC, 30 s, 58ºC, 30 s; 72ºC, 20 s).

La secuenciación del producto de PCR derivado del osteosarcoma MG63 purificado en gel de agarosa dio una secuencia más del 95% homóloga con respecto al producto de PCR de RLMPU. Esta secuencia se designa región única de HLMP (HLMPU; SEQ ID NO: 6).

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Ejemplo 17 Exploración de ADNc de MG63 derivado de transcriptasa inversa

Se realizó la exploración con PCR usando cebadores específicos (SEQ ID NO: 16 y 17) tal como se describió en el ejemplo 7. Se purificó en gel de agarosa un producto de PCR de MG63 de 717 pares de bases y se secuenció con los cebadores dados (SEQ ID NO: 12, 15, 16, 17, 18, 27 y 28). Se confirmaron las secuencias un mínimo de dos veces en ambas direcciones. Se alinearon las secuencias de MG63 entre sí y luego frente a la secuencia de ADNc de LMP de rata de longitud completa para obtener una secuencia de ADNc de LMP humana parcial (SEQ ID NO: 7).

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Ejemplo 18 Exploración de una biblioteca de ADNc de corazón humano

Basándose en experimentos de transferencia de tipo Northern, se determinó que LMP-1 se expresa a niveles diferentes por varios tejidos diferentes, incluyendo músculo cardiaco humano. Se examinó por tanto una biblioteca de ADNc de corazón humano. Se sembró en placa la biblioteca a 5 x 10^{4} ufp/ml sobre placas de agar (agar de fondo LB) y se hicieron crecer las placas durante la noche a 37ºC. Se recubrieron las placas con membranas filtrantes durante dos minutos. Después de eso, se desnaturalizaron los filtros, se enjuagaron, se secaron, se reticularon mediante UV y se incubaron en tampón de prehibridación (2X PIPES [pH 6,5]; formamida al 5%, SDS al 1%, ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 g/ml) durante 2 h a 42ºC. Se añadió una sonda radiomarcada, de LMP única, de 223 pares de bases (^{32}P, marcaje por cebado aleatorio; SEQ ID NO: 6) y se hibridó durante 18 h a 42ºC. Tras la hibridación, se lavaron las membranas una vez a temperatura ambiente (10 min., 1 x SSC, SDS al 0,1%) y tres veces a 55ºC (15 min., 0,1 x SSC, SDS al 0,1%). Se rescataron clones de la biblioteca de corazón purificados por placa dobles positivos, identificados mediante autorradiografía, como fagémidos lambda según los protocolos de los fabricantes (Stratagene, La Jolla, CA).

Los digestos de restricción de clones positivos produjeron insertos de ADNc de tamaños variables. Se seleccionaron insertos mayores de 600 pares de bases de longitud para la exploración inicial mediante secuenciación. Se secuenciaron esos insertos mediante métodos convencionales tal como se describió en el ejemplo 11.

Un clon, el número 7, se sometió también a análisis de secuencia automatizado usando cebadores correspondientes a SEQ ID NO: 11-14, 16 y 27. Las secuencias obtenidas mediante estos métodos eran rutinariamente homólogas en el 97-100%. El clon 7 (ADNc de LMP-1 humana parcial de una biblioteca de corazón; SEQ. ID NO: 8) contenía una secuencia que era homóloga en más del 87% con respecto a la secuencia de ADNc de LMP de rata en la región traducida.

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Ejemplo 19 Determinación del ADNc de LMP-1 humana de longitud completa

Se usaron regiones solapantes de la secuencia de ADNc de células de osteosarcoma humanas MG63 y la secuencia del clon 7 de ADNc de corazón humano para alinear esas dos secuencias y derivar una secuencia de ADNc humano completa de 1644 pares de bases. Se usó NALIGN, un programa del paquete de software PCGENE, para alinear las dos secuencias. Las regiones solapantes de las dos secuencias constituían aproximadamente 360 pares de bases que tenían homología completa excepto por una sustitución de un único nucleótido en el nucleótido 672 en el ADNc de MG63 (SEQ ID NO: 7) teniendo el clon 7 una "A" en lugar de una "G" en el correspondiente nucleótido 516 (SEQ ID NO: 8).

Se unieron las dos secuencias alineadas usando SEQIN, otro subprograma de PCGENE, usando la sustitución "G" del clon de ADNc de osteosarcoma MG63. Se muestra la secuencia resultante en SEQ ID NO: 9. Se consiguió la alineación de la secuencia novedosa derivada de ser humano con el ADNc de LMP-1 de rata con NALIGN. La secuencia de ADNc de LMP-1 humana de longitud completa (SEQ. ID NO: 9) es homóloga en el 87,3% con respecto a la parte traducida de la secuencia de ADNc de LMP-1 de rata.

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Ejemplo 20 Determinación de la secuencia de aminoácidos de LMP-1 humana

Se determinó la secuencia de aminoácidos supuesta de LMP-1 humana con el subprograma TRANSL de PCGENE. El marco de lectura abierto en SEQ ID NO: 9 codifica para una proteína que comprende 457 aminoácidos (SEQ. ID NO: 10). Usando el subprograma Palign de PCGENE, se halló que la secuencia de aminoácidos de LMP-1 humana era homóloga en el 94,1% con respecto a la secuencia de aminoácidos de LMP-1 de rata.

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Ejemplo 21 Determinación de la región no traducida en 5 prima del ADNc de LMP humana

Se amplificó el ADNc en 5' de MG63 mediante RT-PCR anidada de ARN total de MG63 usando un protocolo de amplificación rápida en 5' de extremos de ADNc (5' RACE). Este método incluyó la síntesis de ADNc de la primera cadena usando un cebador de oligo (dT) "lock-docking" con dos posiciones de nucleótidos degenerados en el extremo 3' (Chenchik et al., CLONTECHniques, X:5 (1995); Borson et al., PC Methods Applic., 2:144 (1993)). Se realiza la síntesis de la segunda cadena según el método de Gubler et al., Gene, 25:263 (1983), con un cóctel de ADN polimerasa I de Escherichia coli, ARNasa H y ADN ligasa de E. coli. Tras la creación de extremos romos con ADN polimerasa de T4, se ligó el ADNc bicatenario al fragmento (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGG
CAGGT-3') (SEQ. ID NO: 19). Antes de RACE, se diluyó el ADNc ligado al adaptador hasta una concentración adecuada para las reacciones de Marathon RACE (1:50). Entonces, el ADNc bicatenario ligado al adaptador estaba listo para clonarse específicamente.

Se realizó la PCR de primera ronda con el oligonucleótido específico de adaptador, 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (AP1) (SEQ. ID NO: 20) como cebador sentido y un cebador específico de gen (GSP) a partir de la región única descrita en el ejemplo 16 (HLMPU). Se realizó la segunda ronda de PCR usando unos cebadores anidados GSP1-HLMPU (cebador inverso/antisentido) (SEQ. ID NO: 23) y GSP2-HLMPUF (SEQ. ID NO: 24) (véase el ejemplo 16; cebador directo/sentido). Se realizó la PCR usando un kit comercial (kit Advantage cDNA PCR core; Clone Tech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) que utiliza un protocolo de inicio en caliente mediado por anticuerpos, pero convencional por lo demás. Las condiciones de PCR para el ADNc de MG63 incluían una desnaturalización de inicio en caliente inicial (94ºC, 60 s) seguida de: 94ºC, 30 s; 60ºC, 30 s; 68ºC, 4 min.; 30 ciclos. El producto de PCR de primera ronda tenía aproximadamente 750 pares de bases de longitud mientras que el producto de PCR anidada tenía aproximadamente 230 pares de bases. Se clonó el producto de PCR de primera ronda en el vector pCR 2.1 linealizado (3,9 Kb). Se secuenciaron los insertos en ambas direcciones usando cebadores inverso y directo M13 (SEQ. ID NO: 12; SEQ. ID NO: 11).

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Ejemplo 22 Determinación del ADNc de LMP-1 humana de longitud completa con UTR en 5 prima

Se alinearon la secuencia de UTR en 5' del ADNc de células de osteosarcoma humanas MG63 solapante (SEQ ID NO: 21), la secuencia de 717 pares de bases de MG63 (ejemplo 17; SEQ ID NO: 8) y la secuencia del clon 7 de ADNc de corazón humano (ejemplo 18) para derivar una secuencia de ADNc humano novedosa de 1704 pares de bases (SEQ. ID NO: 22). Se consiguió la alineación con NALIGN, (tanto PCGENE como Omiga 1,0; Intelligenetics). Las secuencias solapantes constituían casi toda la región de 717 pares de bases (ejemplo 17) con una homología del 100%. Se consiguió la unión de las secuencias alineadas con SEQIN.

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Ejemplo 23 Construcción del vector de expresión de proteína LIM

Se llevó a cabo la construcción del vector de expresión pHIS-5ATG LMP-1s con las secuencias descritas en los ejemplos 17 y 18. Se digirió el clon de 717 pares de bases (ejemplo 17; SEQ ID NO: 7) con ClaI y EcoRV. Se purificó en gel un pequeño fragmento (\sim250 pares de bases). Se digirió el clon 7 (ejemplo 18; SEQ ID NO: 8) con ClaI y XbaI y se purificó en gel un fragmento de 1400 pares de bases. Se ligaron los fragmentos de restricción de 1400 pares de bases y 250 pares de bases aislados para formar un fragmento de \sim1650 pares de bases.

Debido a la sustitución de un único nucleótido en el clon 7 (en relación con la secuencia de PCR de 717 pares de bases y la secuencia de rata original), resultó un codón de parada a las 672 pares de bases traducidas. Debido a este codón de parada, se codificó una proteína truncada (corta), de ahí el nombre LMP-1s. Este fue el constructo usado en el vector de expresión (SEQ ID NO: 32). Se creó la secuencia de ADNc de longitud completa con UTR en 5' (SEQ ID NO: 33) mediante la alineación de SEQ ID NO: 32 con la secuencia RACE en 5' (SEQ ID NO: 21). Entonces se dedujo la secuencia de aminoácidos de LMP-1s (SEQ ID NO: 34) como una proteína de 223 aminoácidos y se confirmó mediante inmunotransferencia de tipo Western (como en el ejemplo 15) que migraba al peso molecular pronosticado de \sim23,7 kD.

Se digirió el vector pHis-ATG (InVitrogen, Carlsbad, CA) con EcoRV y XbaI. Se recuperó el vector y entonces se ligó el fragmento de restricción de 1650 pares de bases en el pHis-ATG linealizado. Se clonó y se amplificó el producto ligado. El vector de expresión pHis-ATG-LMP-1s, también designado pHIS-A con inserto de HLMP-1s, se purificó mediante métodos convencionales.

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Ejemplo 24 Inducción de la mineralización y la formación de nódulos óseos in vitro con el vector de expresión de LMP

Se aislaron células calváricas de rata y se hicieron crecer en cultivo secundario según el ejemplo 1. Los cultivos o bien no se estimularon o bien se estimularon con glucocorticoide (GC) tal como se describió en el ejemplo 1. Se usó una modificación del protocolo de transfección Superfect Reagent (Qiagen, Valencia, CA) para transfectar 3 \mug/pocillo de cada vector en cultivos secundarios de osteoblastos calváricos de rata según el ejemplo 25.

Se visualizaron los nódulos mineralizados mediante tinción de Von Kossa, tal como se describió en el ejemplo 3. La sobreexpresión del producto del gen de LMP-1s humana sola indujo la formación de nódulos óseos (\sim203 nódulos/pocillo) in vitro. Los niveles de nódulos eran aproximadamente el 50% de los inducidos por el control positivo con GC (\sim412 nódulos/pocillo). Otros controles positivos incluían el vector de expresión pHisA-LMP-Rat (\sim152 nódulos/pocillo) y el vector de expresión pCMV2/LMP-Rat-Fwd (\sim206 nódulos/pocillo), mientras que los controles negativos incluían el vector de expresión pCMV2/LMP-Rat-Rev (\sim2 nódulos/pocillo) y placas no tratadas (NT) (\sim4 nódulos/pocillo). Estos datos demuestran que el ADNc humano era al menos tan osteoinductor como el ADNc de rata. El efecto era inferior al observado con la estimulación con GC, lo más probablemente debido a dosis subóptimas de vector de expresión.

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Ejemplo 25 Diferenciación celular inducida por LMP in vitro e in vivo

Se cortó el ADNc de LMP de rata en el clon 10-4 (véase el ejemplo 12) del vector mediante digestión doble del clon con NotI y ApaI durante la noche a 37ºC. Se digirió el vector pCMV2 MCS (InVitrogen, Carlsbad, CA) con las mismas enzimas de restricción. Se purificaron en gel tanto el fragmento de ADNc lineal del clon 10-4 como pCMV2, se extrajeron y se ligaron con ligasa de T4. Se purificó en gel el ADN ligado, se extrajo y se usó para transformar células E. coli JM109 para la amplificación. Se recogieron colonias positivas en agar, se digirieron con NotI y ApaI y se examinaron los digestos de restricción mediante electroforesis en gel. Se prepararon cultivos de reserva de clones positivos.

Se preparó un vector inverso de manera análoga excepto porque las enzimas de restricción usadas fueron XbaI y HindIII. Debido a que se usaron estas enzimas de restricción, se insertó el fragmento de ADNc de LMP del clon 10-4 en pRc/CMV2 en la orientación inversa (es decir, no traducible). El vector recombinante producido se designa pCMV2/RLMP.

Se resuspendió un volumen apropiado de pCMV10-4 (es óptima una concentración final de 60 nM [3\mug]; para este experimento se prefiere un intervalo de concentración final de 0-600 nM/pocillo [0-30 \mug/pocillo]) en medio Eagle mínimo (MEM) hasta un volumen final de 450 \mul y se agitó con vórtex durante 10 segundos. Se añadió Superfect (disolución final de 7,5 \mul/ml), se agitó con vórtex la disolución durante 10 segundos y entonces se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras esta incubación, se añadió MEM complementado con FBS al 10% (1 ml/pocillo; 6 ml/placa) y se mezcló mediante pipeteo.

Entonces se pipeteó inmediatamente la disolución resultante (1 ml/pocillo) sobre cultivos de ROB lavados. Se incubaron los cultivos durante 2 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Después de eso, se lavaron suavemente las células una vez con PBS estéril y se añadió el medio de incubación normal apropiado.

Los resultados demostraron una formación de nódulos óseos significativa en todos los cultivos de células de rata que se indujeron con pCMV10-4. Por ejemplo, células transfectadas con pCMV10-4 produjeron 429 nódulos/pocillo. Cultivos control positivo, que se expusieron a Trm, produjeron 460 nódulos/pocillo. En cambio, los controles negativos, que no recibieron tratamiento, produjeron 1 nódulo/pocillo. De manera similar, cuando se transfectaron cultivos con pCMV10-4 (inverso), no se observaron nódulos.

Para demostrar la osificación de novo in vivo, se aspiró la médula de extremidades traseras de ratas normales de 4-5 semanas de edad (rnu/+; heterocigotas para el estado atímico recesivo). Se lavaron las células de la médula ósea aspiradas en MEM alfa, se centrifugaron y se lisaron los RBC resuspendiendo el sedimento en NH_{4}Cl al 0,83% en Tris 10 mM (pH 7,4). Se lavaron las células de la médula restantes 3x con MEM y se transfectaron durante 2 horas con 9 \mug de pCMV-LMP-1s (orientación inversa o directa) por 3 x 10^{6} células. Entonces se lavaron las células transfectadas 2X con MEM y se resuspendieron a una concentración de 3 x 10^{7} células/ml.

Se aplicó la suspensión celular (100 \mul) mediante una pipeta estéril a un disco de colágeno bovino de tipo 1 de 2 x 5 mm estéril (Sulzer Orthopaedics, Wheat Ridge, CO). Se implantaron quirúrgicamente los discos por vía subcutánea en el cráneo, pecho, abdomen o columna vertebral de ratas atímicas de 4-5 semanas de edad (rnu/rnu). Se sacrificaron los animales a las 3-4 semanas, momento en el que se extrajeron los discos o las zonas quirúrgicas y se fijaron en etanol al 70%. Se analizaron las muestras fijadas mediante radiografía y se realizó el examen histológico no descalcificado sobre secciones de 5 \mum de grosor teñidas con Goldner Trichrome. También se realizaron experimentos usando matriz ósea desmineralizada desvitalizada (extraída con guanidina) (Osteotech, Shrewsbury, NJ) en lugar de discos de
colágeno.

La radiografía reveló un alto nivel de osificación mineralizada que se conformaba a la forma del disco de colágeno original que contenía células de la médula transfectadas con LMP-1s. No se observó osificación mineralizada en el control negativo (células transfectadas con una versión orientada de manera inversa del ADNc de LMP-1s que no codificaba para una proteína traducida), y la absorción del portador parecía estar en marcha.

La histología reveló nuevas trabéculas óseas recubiertas con osteoblastos en los implantes transfectados con LMP-1. No se observó hueso junto con la resorción parcial del portador en los controles negativos.

La radiografía de un experimento adicional en el que se añadieron 18 conjuntos (9 controles negativos de pCMV-LMP-REV y 9 pCMV-LMP-1s experimentales) de implantes a sitios que alternaban entre la columna torácica y la lumbar en ratas atímicas mostró que 0/9 implantes control negativo presentaban osificación (artrodesis vertebral) entre vértebras. Los nueve implantes tratados con pCMV-LMP-1s presentaban artrodesis óseas sólidas entre vértebras.

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Ejemplo 26 La síntesis del vector de expresión pHIS-5' ATG LMP-1s a partir de las secuencias mostradas en los ejemplos 2 y 3.

Se digirió el clon de 717 pares de bases (ejemplo 17) con ClaI y EcoRV (New England Biologicals, city, MA). Se purificó en gel un fragmento pequeño (\sim250 pares de bases). Se digirió el clon nº 7 (ejemplo 18) con ClaI y XbaI. Se purificó en gel un fragmento de 1400 pares de bases a partir de ese digesto. Se ligaron los fragmentos de ADNc de 1400 pares de bases y de 250 pares de bases aislados mediante métodos convencionales para formar un fragmento de \sim1650 pb. Se digirió el vector pHis-A (InVitrogen) con EcoRV y XbaI. Se recuperó el vector linealizado y se ligó al fragmento de ADNc de 1650 pares de bases quimérico. Se clonó el producto ligado y se amplificó mediante métodos convencionales, y el vector de expresión pHis-A-5' ATG LMP-1s, también denominado el vector pHis-A con inserto de HLMP-1s, se depositó en la ATCC tal como se describió anteriormente.

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Ejemplo 27 La inducción de la mineralización y la formación de nódulos óseos in vitro con el vector de expresión pHis-5' ATG LMP-1s

Se aislaron células calváricas de rata y se hicieron crecer en cultivo secundario según el ejemplo 1. Los cultivos o bien se estimularon o bien no se estimularon con glucocorticoide (GC) según el ejemplo 1. Se transfectaron los cultivos con 3 \mug de ADN de vector pHis-A recombinante/pocillo tal como se describió en el ejemplo 25. Se visualizaron los nódulos mineralizados mediante tinción de Von Kossa según el ejemplo 3.

La sobreexpresión del producto del gen de LMP-1s humano sola (es decir, sin estimulación con GC) indujo la formación de nódulos óseos significativa (\sim203 nódulos/pocillo) in vitro. Esto es aproximadamente el 50% de la cantidad de nódulos producidos por las células expuestas al control positivo con GC (\sim412 nódulos/pocillo). Se obtuvieron resultados similares con cultivos transfectados con el vector de expresión pHisA-LMP-Rat (\sim152 nódulos/pocillo) y pCMV2/LMP-Rat-Fwd (\sim206 nódulos/pocillo). Por el contrario, el control negativo pCMV2/LMP-Rat-Rev produjo (\sim2 nódulos/pocillo), mientras que se observaron aproximadamente 4 nódulos/pocillo en las placas no tratadas. Estos datos demuestran que el ADNc de LMP-1 humano era al menos tan osteoinductor como el ADNc de LMP-1 de rata en este sistema de modelo. El efecto en este experimento era inferior al observado con la estimulación con GC; pero en cierto modo el efecto era comparable.

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Ejemplo 28 LMP induce la secreción de un factor osteoinductor soluble

La sobreexpresión de RLMP-1 o HLMP-1s en cultivos de osteoblastos calváricos de rata tal como se describió en el ejemplo 24 dio como resultado una formación de nódulos significativamente mayor que la observada en el control negativo. Para estudiar el mecanismo de acción de la proteína de mineralización LIM se recogió el medio condicionado en diferentes puntos de tiempo, se concentró hasta 10 X, se filtró de manera estéril, se diluyó hasta su concentración original en medio que contenía suero fresco y se aplicó durante cuatro días a células no transfectadas.

Los medios condicionados recogidos de células transfectadas con RLMP-1 o HLMP-1s en el día 4 eran aproximadamente tan eficaces para inducir la formación de nódulos como la sobreexpresión directa de RLMP-1 en células transfectadas. Los medios condicionados de células transfectadas con RLMP-1 o HLMP-1 en la orientación inversa no tenían efecto aparente sobre la formación de nódulos. Los medios condicionados recogidos a partir de cultivos transfectados con LMP-1 antes del día 4 tampoco indujeron la formación de nódulos. Estos datos sugieren que la expresión de LMP-1 provocaba la síntesis y/o secreción de un factor soluble, que no aparecía en el medio de cultivo en cantidades eficaces hasta 4 días tras la transfección.

Puesto que la sobreexpresión de rLMP-1 dio como resultado la secreción de un factor osteoinductor en el medio, se usó análisis de inmunotransferencia de tipo Western para determinar si la proteína LMP-1 estaba presente en el medio. Se evaluó la presencia de la proteína rLMP-1 usando anticuerpo específico para LMP-1 (QDPDEE) y se detectó mediante medios convencionales. Se halló la proteína LMP-1 sólo en la capa de células del cultivo y no se detectó en el medio.

Se consiguió la purificación parcial del factor soluble osteoinductor mediante cortes convencionales con sulfato de amonio al 25% y al 100% seguido de cromatografía discontinua de intercambio aniónico DE-52 (NaCl 100 mM o 500 mM). Se observó toda la actividad en las fracciones de alto contenido en sulfato de amonio, de alto contenido en NaCl. Tal localización concuerda con la posibilidad de que un único factor sea el responsable para condicionar el medio.

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<110> Hair, Gregory A.

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Boden, Scott D.

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<120> Sistemas de expresión, vectores, ADN, proteínas de mineralización ósea novedosos

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<130> 06148.0115

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<140>

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<141>

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<150> 60/054.219

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<151> 30-07-1997

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<150> 60/080.407

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<151> 02-04-1998

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<160> 35

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 457

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 1

1

2

3

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<210> 2

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<211> 1696

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<212> ADN

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 2

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4

400

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<210> 3

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<211> 260

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<212> ADN

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 3

5

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<210> 4

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<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR de presentación diferencial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagctttttt tttttg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR de presentación diferencial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcttggct atg

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 717

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1488

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

8

800

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1644

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 457

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

10

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccagggttt tcccagtcac ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccagggttt tcccagtcac ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcttagcaga gcccagcctg ct

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatgaactc tgtgcccgtg ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atccttgctc acctcacggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcactgtgct ggttttgtct gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catggattcc ttcaaggtag tgc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttgtctg gggcagagcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcctaat acgactcact atagggc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 765

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

12

1200

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1689

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcactgtgct cgttttgtcc gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccttgctca cctcacgggc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctcatccg ggtcttgcat gaactcggtg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccccgccc gctgacagcg ccccgcaa

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccttgctca cctcacgggc accg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaatacgac tcactatagg gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggctgatg gagaatactg aag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcttgtggc actggtggca tac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgtcgggt cagcactgtg ct

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1620

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1665

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcactacctt gaaggaatcc atggt

\hfill

25

Claims

1. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de mineralización LIM humana que contiene un dominio LIM y potencia la osificación, hibridándose la molécula de ácido nucleico en condiciones de hibridación convencionales con una molécula de ácido nucleico complementaria a la longitud completa de la SEQ. ID NO: 26.

2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, comprendiendo la molécula de ácido nucleico aislada la SEQ ID NO: 33.

3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, comprendiendo la molécula de ácido nucleico aislada la SEQ ID NO: 22.

4. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que comprende la SEQ ID NO: 9.

5. Proteína de mineralización LIM humana codificada por una molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Proteína de mineralización LIM humana según la reivindicación 5, que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.

7. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de mineralización LIM de rata que contiene un dominio LIM y potencia la osificación, hibridándose la molécula de ácido nucleico aislada en condiciones convencionales con una molécula de ácido nucleico complementaria a la longitud completa de la SEQ. ID NO: 2.

8. Proteína de mineralización LIM de rata codificada por una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7.

9. Proteína de mineralización LIM de rata según la reivindicación 8, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

10. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7.

11. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 10, seleccionándose la célula huésped del grupo que consiste en células procariotas, células de levadura y células de mamífero.

12. Molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7, que comprende además un marcador para la detección.

13. Anticuerpo monoclonal o policlonal específico para una proteína de mineralización LIM según una cualquiera de las reivindicaciones 5, 8 ó 9.

14. Anticuerpo monoclonal o policlonal según la reivindicación 13, siendo la proteína de mineralización LIM la SEQ ID NO: 10.

15. Uso de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7, que codifica para la proteína de mineralización LIM para la preparación de una composición para transfectar células precursoras osteogénicas para su uso en la inducción de osificación.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que la molécula de ácido nucleico aislada está en un vector.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que el vector se selecciona de un vector de expresión, un plásmido, un virus, un adenovirus o un retrovirus.

18. Uso según la reivindicación 15, en el que las células precursoras osteogénicas se transfectan ex vivo.

19. Uso según la reivindicación 15, en el que las células precursoras osteogénicas se transfectan in vivo mediante inyección directa de la molécula de ácido nucleico aislada.

20. Uso según la reivindicación 15, en el que la molécula de ácido nucleico aislada está en un vector seleccionado del grupo que consiste en un plásmido y un virus.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que el vector es un plásmido, inyectándose dicho plásmido directamente en el tejido muscular.

22. Uso según la reivindicación 15, en el que la proteína de mineralización LIM es la SEQ ID NO: 10.

23. Uso según la reivindicación 15, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de mineralización LIM es la SEQ ID NO: 22 o la SEQ ID NO: 33.

24. Uso de una molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7, que codifica para una proteína de mineralización LIM para la preparación de una composición para transfectar células precursoras osteogénicas para su uso en artrodesis vertebral.

25. Uso según la reivindicación 24, en el que las células precursoras osteogénicas se transfectan ex vivo.

26. Uso según la reivindicación 24, en el que la proteína de mineralización LIM se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 34 y la SEQ ID NO: 1.

27. Uso de un vector que se mantiene de manera estable en células precursoras osteogénicas, comprendiendo el vector una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, ó 7, que codifica para una proteína de mineralización LIM y un promotor regulable, controlando el promotor regulable, que responde a un compuesto de control exógeno, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de mineralización LIM, para la preparación de una composición para transfectar células precursoras osteogénicas para su uso en la inducción de osificación sistémica en un huésped mamífero.

28. Uso según la reivindicación 27, en el que la proteína de mineralización LIM se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 34 y la SEQ ID NO: 1.

29. Método in vitro de estimulación de la producción de un factor soluble osteogénico por una célula osteogénica, que comprende:

(a): transfectar la célula osteogénica con una molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, ó 7 y

(b): sobreexpresar la molécula de ácido nucleico aislada.

30. Método in vitro de inhibición de la expresión de la proteína de mineralización LIM según una cualquiera de las reivindicaciones 5, 8 ó 9, que comprende transfectar una célula en el que la proteína de mineralización LIM se expresa con un oligonucleótido antisentido.

31. Método según la reivindicación 30, en el que el oligonucleótido antisentido tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 35.

32. Uso de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7, para preparar una composición para transfectar una célula osteogénica para su uso en la estimulación de la producción de un factor soluble osteogénico por la célula osteogénica.

33. Uso de un oligonucleótido antisentido para preparar una composición para inhibir la expresión de la proteína de mineralización LIM según cualquiera de las reivindicaciones 5, 8 ó 9 en una célula.

34. Uso según la reivindicación 33, en el que el nucleótido antisentido tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:35.