JPH04505158A - 非細胞性ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非細胞性ワクチン 本発明は、非細胞性百日咳菌（ＢｏｒｄｅｔｅＩＩａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　）ワ クチン組成物、とくに百日咳菌からの６９ｋＤａ抗原と線維状ヘマグルチニン抗 原（ＦＨＡ）との相乗性組成物である非細胞性百日咳菌ワクチン、それらからな るワクチンの製造方法、およびそれらの医学的使用に関する。

百日咳菌はヒトに、重篤な消耗性疾患を惹起し、とくに小児が罹患しやすいが、 開発国においては大規模な免疫処置計画によって制御されている。免疫処置はこ の疾患の減少にきわめて重要な因子であること、ワクチン接種を行わないとこの 疾患の発症率の上昇を招くことが明らかにされている。はとんどすべての地域で 、免疫処置は全細胞百日咳ワクチンを用いて行われ、これはその疾患の予防に比 較的有効なことが見出されている。しかしなから最近、このワクチンの有害反応 に対する憂慮からワクチンの受入れが低下し、その使用の継続が討議されるよう になった。

知られている有害反応の一部としては、発熱、局所反応および持続性スクリーニ ングがある。発熱および持続性スクリーニングは患者の７％に起こると評価され ている（Ｗａｒｄｌａｗら：　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第 ２巻、Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｄｉ ｓｅａｓｅ、ｌ　９８３　）。

免疫処置計画が行われている開発国では最近この疾患の発症率が低下しているこ とから、その利益／危険比には低い評価が与えられていて、多くの臨床家は、接 種の危険は免疫処置で得られる利益を上回ると考えている。

結果として、多くの子供達には接種が行われなくなり、それにより現在は百日咳 の流行の危険がある。実際に近年、全細胞ワクチンの使用が低下するに従い、百 日咳の発症率とそれによる小児罹患率か上昇してきた。したがって、改良された 百日咳ワクチン、とくに、問題の原因となる全細胞ワクチンの毒性作用に関連す る成分を含まず、一方、疾患の予防に必要な成分が組込まれた、非細胞性ワクチ ンの開発に、かなりの研究努力が向けられるようになった。

より安全な、効果的な、非細胞性ワクチンの研究は、過去には、全細胞ワクチン 内に含まれる百日咳菌の病原性、毒性および防禦性部分の実体および作用機構に 関する情報不足のために妨げられていた。したがって、研究は、百日咳菌生物体 の２０種もしくはそれ以上の表面抗原の単離および精製、ならびにそれらか免疫 応答を誘導する能力の性質の解明に集中されてきた（たとえば、Ｊ２Ａｍ、　Ｍ ｅｄ、　Ｓｏｃ、２４８　（１）　２２〜２３参照）。検討が考慮された抗原の 例には、リンパ球増多症促進因子（百日咳菌トキシン／ＬＰＦ）、線維状へマグ ルチニン（ＦＨＡ）、リボ多糖（ＬＰｓ）、アグルチノーゲン、皮膚壊死トキシ ン（ＤＮＴ）　、熱不安定性および熱安定性トキシン、多形核白血球阻害因子、 アデニルサイクラーゼ、ならびに他の表面成分が包含される。他の検討が提案さ れた抗原の候補には、気管サイトトキシンおよび各種の外膜蛋白質がある。

初期の抽出ワクチンはり、　Ｐｉｌｌｅｍｅｒ（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ 。

Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、７５　：　７０４〜７０５．１９５０）によって開発され た。これは、分断した百日咳菌細胞に基づくものであり、防御効果が認められた が、その製品の毒性により上布されるには至らなかった。

もっと最近になって提案された百日咳菌抽出ワクチンには、培養上清からエンド トキシンを除去した英国特許明細書２　０８３　３５８　Ａ　（Ｔａｋｅｄａ） に記載されたワクチン、微生物懸濁液の陰イオン界面活性剤抽出によるフランス 特許明細書２　０４７　８８６　（ＩｎｓｔｉｔｕｔＭｅｒｉｅｕｘ　）に記載 されたワクチン、および百日咳菌トキシン（ＬＰＦ）に基づくサブユニット蛋白 質ワクチンからなる日本特許明細！５８−２２２０３２　（Ｔｅｊｊｉｎ）記載 のワクチンがある。

非細胞性百日咳ワクチンに関して行われた研究の多くは、ＬＰＦに基づくワクチ ンの可能性に対して集中されている。しかしながら、百日咳菌の予防接種に伴っ てこれまで観察されている存置作用の一部はそのトキシンに関連すると考えられ ている。狂犬病またはジフテリアのトキソイドとＬＰＳの混合物により、感受性 マウスに実験的脳炎を誘発することができる（Ｌ、　Ｓｔｅｉｎｍａｎら：Ｎａ ｔｕｒｅ、２９９　：　７３　ｇ　〜７４０．１９８２　；　Ｒｅｄｈｅａｄら ：　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、　Ｎａｔ、　［ｎｓ ｔ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌ。

５ｔａｎｄａｒｄｓ　＆　Ｃｏｎｔｒｏｌｓ、　Ｈｏ１ｙ　Ｈｉｌｌ、　Ｈａｍ ｐｓｔｅａｄ、　Ｌｏｎｄｏｎ。

１９８３）。予防接種後に脳障害のような併発症を生じることがあれば、それは ＬＰＦによる可能性が高いと考えている臨床家もいる。

それにもかかわらず、今日までの研究は、ＬＰＦが非細胞性ワクチンの必須成分 であるとの一般的な考え方を導くようなデータを生み出してきた（　Ｂａｃｔｅ ｒｉａｌＶａｃｃｉｎｅｓ、１９８４、第３章、ＬＩａｎｃｌａｒｋら、編者Ｇ ｅｒｍａｎｉｅｒ　）。

現在日本で用いられている新しい非細胞性ワクチンが、スエーデンにおいて、制 御された臨床試験でテストされた。このワクチンは百日咳菌トキシン（ＬＰＦ） とＦＨＡまたはＬＰＦの単独を包含する（Ｌａｎｃｅｔ　１　：　９５５．１９ ８８）。しかしながら、このワクチンは全細胞ワクチンはど有効ではなく、約６ ９％の防御しか与えないことが証明された。

防御効果が劣るほかに、トキシンをベースとしたワクチン群には、このワクチン に多分関連すると思われる３例の死亡例が生じた。すべてのこれらのデータを考 慮して、スエーデンの保健局はこのいわゆる［日本ワクチンＪのスエーデンにお ける許可を拒否した。

しかしながら、この臨床試験は、百日咳がトキシン仲介疾患であり、百日咳マウ ス防御試験におけるマウスの防御はもっばら、製剤中の活性ＬＰＦの存在に依存 するとの示唆があったことから、ＬＰＦはワクチンの必須成分であるとの考え方 の実例である（Ｐｉｔｔｍａｎ、　Ｍ、：　ＴｈｅＣｏｎｃｅｐｔ　ｏｆ　Ｐｅ ｒｔｕｓｓｉｓ　ａｓ　ａ　Ｔｏｘｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ。

Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ、３　：　４　８　 ７　〜４　８　６　、　１９８４）。これらの仮定は誤っていると思われる。

線維状へマトグルチニン（ＦＨＡ）は分子量１０７〜１３０ｋＤａの蛋白質であ り、電子顕微鏡では線維のようにみえる。ヘマグルチニンはコレステロールによ って阻害される。

多くの研究グループは、ＦＨＡが重要な免疫原であり、ワクチン候補である可能 性を示唆してきた（総説として、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　１９ ８４、第３章、Ｍａｎｃｌａｒｋら、編者Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ参照）。しかしな がら、発明者らのデータでは、ＦＨＡ単独はわずかな防御作用を示すにすぎなか った。

百日咳菌の６９ｋＤａ抗原は、外膜蛋白質であり、熱安定性で、本技術分野にお いて既知の方法により製造できる（ＥＰ　０　１６２　６３９参照）。６９ｋＤ ａそれ自体では、全細胞ワクチンはど有効ではない。

本発明者らは、６９ｋＤａとＦＨＡを一緒に混合すると、驚くべきことに、個々 の成分の合算よりも強力な効果を示すことを見出した。６９ｋＤａとＦＨＡの相 乗的混合物は、ＬＰＦを必要とせず、その結果、存寄作用の危険が減少すること から有利である。しかも、６９ｋＤａとＦＨＡのみを含む二価ワクチンは、同時 にＬＰＦを含む三価ワクチンに比べて、製造が明らかに容易で、安価である。

それはともかく、百日咳菌抗原の適当な組合わせにより、示唆された混合物の同 等有効用量は、たとえば６９ｋＤａとＬＰＦの混合物に比べて１５倍まで低い。

したがって、本発明は、百日咳菌の６９ｋＤａ抗原を線維状ヘマグルチニン抗原 とともに、医薬的に許容される賦形剤と混合してなる医薬組成物を提供する。こ の場合、医薬組成物とはワクチン組成物を包含するものと理解すべきである。

本発明はまた、ｉ）百日咳菌からの６９ｋＤａ抗原およびｌｌ）百日咳菌の線維 状へマグルチニン抗原の、百日咳病原性法のその後のチャレンジに対して哺乳動 物に防御を誘発するのに有効な量からなる相乗性混合物を提供する。

６９　ｋＤａ抗原とＦＨＡの比は、広範囲に（たとえば１　二１０〜１０：１） 変動させることができるが、約１：１が好ましい。

本発明はさらに、百日咳菌の感染を受けやすい哺乳動物の予防的処置に同時に使 用するための６９ｋＤａおよびＦＨＡ抗原を提供する。

医薬的に許容される賦形剤は、患者に抗原を導入するためのビヒクルとしての使 用に適当な液体メジウムとすることかできる。このような担体の例としては食塩 溶液がある。抗原性蛋白質は、担体中に溶解または固体として懸濁される。

ワクチンの処方にはまた、免疫応答を刺激してワクチンの効果を増強するために 、アジュバントを添加することもできる。本発明に使用するのが便利なアジュバ ントには、たとえば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムがある。

ワクチン処方は、抗原蛋白質を最終濃度が０．０１〜５　ｍｇ／−の範囲になる ように含有させるのが便利であり、この濃度は好ましくは０．０３〜２ｍｇ／ｒ ＩＬｌ、と（に好ましくはｏ、３ｍｇ／ｌｎｌである。処方後、ワクチンは滅菌 容器に充填し、ついで密閉し、低温たとえば４°Ｃで保存するか、または凍結乾 燥することができる。

百日咳に対する免疫をヒトに誘発するためには、適当に処方されたワクチンの１ または２用量以上を投与することができる。各用量は、ワクチン０．１〜２ｒＩ ＬＩ、好ましくは０．２〜１ｍ７’、最も好ましくは０．５−とすることが推奨 される。本発明は、さらに他の態様において、上に定義したワクチン処方の存効 量を宿主に投与することからなる、百日咳に対する免疫をヒトに誘発する方法を 提供する。

本発明はまた、百日咳に対する免疫のヒトへの誘発に使用するためのワクチンの 製造における６９ｋＤａおよびＦＨＡの使用を包含する。本発明のワクチンは、 経口および非経口を含むワクチンの慣用の投与方法により、投与することができ る。処置は、単一用量または、ある期間にわたる複数回の用量とする。

したがって、本発明は、百日咳菌の６９ｋＤａおよびＦＨＡを同時にまたは連続 的に投与することからなる、百日咳菌の感染を受けやすい哺乳動物の処置方法を 提供線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）の製造ＦＨＡは、本技術分野でよく知られ た方法により製造できる（Ａｒａｉｈ　＆　Ｍｕｎｏｚ、　Ｊ、Ｊ、：　［ｎｆ ｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、２５、７６４〜７６７、ｌ　９７０　；　Ａｓｈｗ ｏｒｔｈら：　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３７．１２７８〜１２８１，１９８２；Ｃｏｗｅ　ｌ　ｌら ：　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ＶａｃｃｉｎｅｓＳｐ　３７１〜３７９、Ｓｅｍ１ｎ ａｒｓ　ｉｎ　ｆｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ第４巻、１９８２；５ ａｔｏら：　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　４１．３１３〜３２０．１９８ ３参照）。しかしながら、以下の操作におけるＦＨＡは以下のプロトコールに従 って製造した。

ＦＨＡ精製 百日咳菌ＴｏｍａｈａもしくはＢＰ３５７　（ＬＰＦを分泌しないＡＡ、　Ｗｅ ｉｓｓら（１９８３）のＴｎ５）ランスボゾン変異体〕またはＲ，Ｒａｐｐｕｌ ｏｉから得られるＷ２８ΔＬＰＦを、６５０ｒｄ！のコスタ−フラスコ（各１５ ０７ｎｌ）により５ｔａｉｎｅｒ　＆　５ｃｈｏｌｔｅメジウム（０，０５Ｔｒ ｉｓ）中３７°Ｃで５日間生育させた（Ｓａｔｏら、Ｉ９８３、前出）。蛋白分 解阻害剤として１．１０−フェナンスロリン−水和物５０μＭを培養液に添加し たのち、遠心分離した（６０００ｘｇ、３０分）。細胞を含まない上溝をｐＨ８ ，７に調整しく５Ｎ　ＮａＯＨ使用）、回転楕円体ヒドロキシアパタイト（ＢＨ Ｄ）の３０Ｘ３５０ｏｌｌ！Ｉｌカラムに流速５００ｍ／／時で適用した（すべ ての操作は室温で実施）。ついでカラムを冷室（＋４°Ｃ）中、安定なベースラ インが達成されるまで流速５０ｍ１／時において、（ａ）１０ｍＭリン酸緩衝液 、ｐＨ８，０、（ｂ）１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８，０で洗浄し、最後に（ Ｃ）残留物質を１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，０中０．５ＮＮａＣｆで溶出 した。ガチョウ赤血球を凝集するピーク分画（各分画からのｌＯμ！容量をＰＢ ３　５０μｌに懸濁し、洗浄０．５％ガチョウ血球の等量を添加し、３７°Ｃで １〜２時間インキュベートした）をプールした。

このプールを０．０２５Ｍ　Ｂ１５−Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ！緩衝液、ｐＨ７，１の ２０〜３０容量に対して、４°Ｃで一夜透析した。沈殿したＦＨＡを遠心分離し て（８０００ｘｇで２０分）集めた。次工程はＦＨＡ　（ならびにＬＰＦ）か４ ０ｍＭβ−アラニン緩衝液、ｐＨ３，５に可溶性であることを見出したＣｏｗｅ ｌｌら（１９８３）の啓示によるものである。沈殿したＦＨＡを最小容量のβ− アラニン緩衝液（Ｉｆあたりβ−アラニン３．５７ｇおよびギ酸０．３５ｇ）に 溶解し、不溶物を遠心分離によって除去し、澄明な上清を、同じ緩衝液で予め平 衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ　Ａ　ｃ　Ａ　３４またはＡｃａ４４のカラム（２５ Ｘ８００ｍｍ）に適用し、同じ緩衝液で溶出して、不純物を除去した。残った血 球凝集性物質は０．５ＭＮａＣ１含有０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１緩衝液（ｐ Ｈ７，２）により溶出されるピークに現れた。主ピークからの、血球凝集性を有 する分画を集め、凍結状態に保つか、または０．０２５Ｍ　Ｂ１５−Ｔｒｉｓ／ ＨＣｊ７緩衝液、ｐＨ７，１に対する透析により再沈殿させ、最小容量のβ−ア ラニン緩衝液に溶解した。溶解度は約３．０ｍｇＦＨＡ／イである、このように してＴｏｍａｈａ、ＢＰ３５７またはＷ２８ＬＰＦ株から得られた最終生成物は 、ＣＨＯ細胞検定（組織培養液２００μｌを含む単一ウェルあたりＦＨＡ２〜３ μｇの濃度で陰性であった。

この試験の感度：ウェルあたり１〜２ｐｇのＬＰＦで陽性の凝集を示す）または ヒスタミン感作により検出可能な量のＬＰＦを含まない。Ｎ：ＮＩＨ−Ｓマウス に５０Ｍｇの用量のＦＨＡを腹腔内に注射し、４日後にヒスタミン塩酸塩４ｍｇ の腹腔内注射をチャレンジした。死亡例は認められなかった。酸性ｐＨて凍結し た物質（−２０または一４０°Ｃ）はそのＥＬＩＳＡ反応性および５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにおける外観から判断して、安定と考えられる。

これは、１５０〜１００ｋＤの領域に、主要な３個の強力なバンドを形成する。

例２ ６９ｋＤａ抗原は、公告された欧州特許出願０１６２６３９号に低連された操作 に従って製造された。百日咳菌のＢＰ３５７またはＷ２８ΔＬＰＦ株のいずれか を用い、Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ 　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒＡｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ。

５ａｌｉｓｂｕｒｙ　Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ　Ｓ　Ｐ　４　０　Ｊ　Ｇ、　ＵＫに 、１９９０年２月１日９００２０１０３号として寄託されたモノクローナル抗体 ＢＢＯ５を使用して免疫精製した。

これは、体重１４〜１６ｇの非近交系ＮＩＨ−Ｓマウス（ＯＬＡＣ１３類、ｓ、 　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを包含する大部分の病原体を含まない）を使用 する百日咳菌ワクチンについてのＷ、Ｈ，Ｏ，基準に従って行われた。０．５− 容量の抗原が混合物として腹腔内に接種され、これらは最初の希釈と３個の３倍 希釈系列とした。２週後、推奨の攻撃法＋８−３２３　（〜４００ＬＤｉ。）を 用いて、マウス脳内にチャレンジした。各群の生存動物数を、近似線プロビット 分析のプログラムを用い英国百日咳菌標準ワクチン６６／８４に対する相対強度 の計算に使用した。６９ｋＤａ／ＬＰＦワクチンを用いた比較試験も実施した。

結果は表１に示す。この実験での６９ｋＤａ蛋白質およびＦＨＡはＢＰ３５７株 に由来するものであった。

表１ ６９ｋｄ（μｇ）　ＦＨＡ（μｇ）　生存数６、７　６．７　１２／１６ ２．２　２．２　８／１６ ０、７４　０．７４　８／１６ ６９ｋｄ　（μｇ）　ＬＰＦ　（ｎｇ）６、７　３３　６／１６ ２．２　１１　０／１６ ０、７４　３．７　１／１６ ６６／８４　１．Ｕ。

全細胞英国　０．２５　９／１５ 標準ワクチン　０．０８　９／１６ ０、０２８　２／１６ ０、００９　１／１に のデータを近似線プロビット分析法に従ってコンピューターで処理した。結果は 図１に示す。

結果は、６９ｋＤａ／ＦＨＡワクチンが６９ｋＤａ／ＬＰＦよりも強力であり、 また全細胞ワクチンに比べそれ以上ではないにしても少なくとも同等に強力であ ることを、明瞭に示している。

例４ 百日咳菌のＷ２ａ　ＬＰＦ株に由来する抗原の組合せおよび／または個々の抗原 を用いて、さらにＫｅｎｄｒｉｃｋ試験を行った。この株では全トキシン遺伝子 が遮断されていたので、これらのプレバレージョンにＬＰＦが夾雑する可能性は ない。抗原は０．５−容量を個々にまたは混合物として腹腔内に接種し、これら は最初の希釈と３個の４倍希釈系列とした。２週後、攻撃味１８−３２３（約４ ００　ＬＤｉｏ）を用いて、マウス脳内にチャレンジした。各群の生存動物数を 、近似線プロビット分析のプログラムを用いる英国百日咳菌標準ワクチン６６／ ８４に対する相対強度の計算に使用した。英国標準６６／８表２ 百日咳菌培養液から様々な操作で調製される亜細胞性ワクチンはすでに作成され ていて（Ｂｉｋｉｎ、　Ｔａｋｅｄａ。

Ｌｅｄｅｒｌｅ、　Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ）　、これらは不純物のほか、ＬＰＦ。

ＦＨＡおよび１０％までの６９ｋＤａ蛋白質も含有する。

しかしながら、これらの亜細胞性ワクチンのどれもが、ＷＨＯマウス有効性検定 において、みるべき防御効果を示していない。しかしながら、これらの非防御性 ワクチンに６９　ｋＤａ蛋白質の新鮮なプレバレージョンを添加すると、それら の防御効果は増強された（表３）。ここに述べた不純なプレバレージョンをホル マリンまたはグルタルアルデヒドで処理したところ、すべてでそれらの防御効果 は損なわれた。６９ｋＤａ蛋白質はホルマリンまたはグルタルアルデヒドで処理 すべきでない。このような形では、ホルマリンまたはグルタルアルデヒド処理前 の抗原と異なり、マウスに腹腔内注射後も十分な抗体を誘発しない。

表３ 抗　原　生存数／総数 各抗原（ワクチン）のＬＤ、。は別個にまたは混合物として、近似線に適合させ るプロビット分析を用いて評価した。

ＬＤ６゜およびそれらの９５％信頼限 抗　原　ＬＤ、。　９５％信頼限界 ６９ｋＤａ　１０３．５μｇ　３．４−５３００μｇＢｉｋｅｎ　ＰＰＰ３　ワ クチン　０．９４０　０．１３−１０．２ＵＣｏｎｎａＵｇｈｔ　２０．６　ｔ ｔ　ｇ　４．６−１２４．７８ｇ全細胞標準６６／８４　０．＋４１．０．　０ ．０５−０．４２１．Ｕ。

Ｂｉｋｅｎ　ＰＰＰ３＋６９ｋＤａ Ｂｉｋｅｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　３と６９ｋＤａの混合物は１％のレベルで、Ｂｉｋｅ ｎ　Ｐ　Ｐ　Ｐ　３単独と有意差を示す。Ｃｏｎｎａｕｇｈｔワクチン単独に対 しては等級づけした応答がなかったことにより、ＣｏｎｎａＵｇｈｔ　＋　６９ 　ｋ　Ｄ　ａ混合物との比較は統計的に有意ではない。このワクチン（ロット１ ７）は大量の遊離百日咳菌トキシンも含存していたので、ヒトへの使用は適当で はなかった。

Ｆｉｇｕｒｅ　１ プロビット ｒ工ｇｕｒｅ　２ プロビット Ｆｉｇｕｒｅ　３ プロビット　（生存率　％） 国際調査報告 ”””””””ｕ東”　ＰＣＴ／ＧＢ　９０００６４９国際調査報告 ＧＢ　９０００６４９ Ｓ＾　３６５３７

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．百日咳菌の６９ｋＤａ抗原と百日咳菌の線維状マドグルテニン抗原からなる 相乗性混合物。
2. ２．「請求項１」記載の相乗性混合物を医薬的に許される賦形剤と混合してなる 非細胞性ワクチン。
3. ３．百日咳菌トキシンを含まない「請求項１」記載ワクチン。
4. ４．６９ｋＤａ抗原と線維状ヘマトグルテニン抗原１：１０〜１０：１の比で含 有する「請求項２または」記載のワクチン。
5. ５．比はほぼ１：１である「請求項４」記載のワクン。
6. ６．抗原性蛋白質の濃度は０．０ｌ〜５．０ｍｇ／ｍｌ範囲である「請求項２〜 ５」のいずれかに記載のワクン。
7. ７．さらにアジュバントを含有する「請求項２〜」のいずれかに記載のワクチン 。
8. ８．医学的治療に使用するための「請求項１」記載相乗性混合物。
9. ９．医学的治療に使用するための「請求項２〜７」いずれかに記載のワクチン。
10. １０．百日咳菌の感染を受けやすい哺乳動物の予防的置用医薬を製造するための 「請求項１」記載の混合物使用。
11. １１．百日咳菌の６９ｋＤａ抗原と線維状ヘマトグルニチン抗原との、相乗効果 を示す量での混合物を投与することからなる、百日咳菌の感染を受けやすい哺乳 動物の処置方法。
12. １２．６９ｋＤａ抗原と線維状ヘマトグルテニン抗原は同時に投与する「請求項 １１」記載の処置方法。
13. １３．６９ｋＤａ抗原と線維状ヘマトグルテニン抗原は連続的に投与する「請求 項１１」記載の処置方法。