JPH04505259A - 副甲状腺ホルモンの製造のための組換えｄｎａ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 副甲状腺ホルモンの製造のための組換えＤＮＡ法発明の背景 発明の分野 本発明は、組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で大量のヒト副甲状腺ホル％７ｌ−８ ４（ｈＰＴＨｌ−８４）またはその変異体を製造するための方法に関する。

微來炊術翌輩朋 副甲状腺ホルモン（Ｐ　Ｔ　）（）は８４アミノ酸残基のペプチドであり、哺乳 動物におけるカルシウム・ホメオスタシスの主要な調節物質の１つである。ＰＴ Ｈは主に腎臓で作用してカルシウムの再吸収を刺激し、そして骨細胞に作用して カルシウムの動員を刺激する。また、ＰＴＨは骨の整形過程の増強を導＜　［Ｐ ｏｔｔｓら、　Ａｄｖ、Ｔ’ｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｗ。

防に有望な作用を有しているかもしれない。

ＰＴＨの変異体または類似体はＰＴＨ受容体に結合することができ、ＰＴＨまた は最近になって発見されたＰＴＨ関連ペプチド（腎細胞癌、肺癌および乳癌など の多種の腫瘍によって産生され、現在では悪性腫瘍の過カルシウム血症の原因で あると考えられている）上記の理由から、大量の精製が容易なヒトＰＴＨの供給 源が多年にわたってめられていた。

大腸菌におけるＰＴＨの直接発現がいくつかの報告に記載されている［Ｂｒｅｙ ｅｌら、　３ｒｄ　Ｅｕｒｏ　、Ｃｏｎｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、　、！：　３６３ −３６９　（１９８４）ｓ　Ｂ。

ｅｌラオよびＭｏｒｅｌｌｅら（上記）の試みによっては、ＲＮＡと９Ｊバク質 の不安定性の故に、極めて限られた量のホルモン（＜５００μｇ／Ｌ）しか得ら れなかった。Ｒａｂｂａｎｉら（上記）は２００μｓ／ＬのＰＴＨ収量を達成し たが、これはＮ−末端で様々に先端切除されたペプチドを不純物として含んでい た。純粋かつ無傷のＰＴＨ（１−８４）を複雑な方法で精製すると、最終的な収 量はＩＬの培養物あたりＩＯμｇにすぎなかった。Ｂ　ｏｒｎら（上Ｓｃ）は、 ヒトプレプロＰＴＨｃＤＮＡの複数フビープラスミドを用いて、主にＰＴＨ（３ −８４）およびＰＴＨ（８−８４）である先端切除ｈＰＴＨを発現させたが、こ れらは実質的にＰＴＨの生物活性を欠いていた。

従って、容易に精製することができ、かつＰＴＨの不活性形態／類似体を含まな い、安定なＰＴＨのさらに大量の製造を導く発現ベクターの必要性が認議されて いた。この問題を解決するための１つの方法が、細菌宿主中での他のペプチドの 発現について記ａする研究によって示唆されている［１ｔａｋｕｒａら、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　１９８：　１０５６−１０６３　（１９７７）；　Ｒｉｇｇｓ、米 国特許Ｎｏ、　４．３６６、２４６．微生物ポリペプチド発現のための方法、　 （１９８２年１２月２８日）Ｈ１ｋｅｈａｒａら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ。

Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７、上記）およびＲｉｇｇａ（１９８４、上記）は 、外来タンパク質の細菌発現のための方法、特に所望の異種タンパク質（ヒトソ マトスフチン）と大きな細菌性タンパク質（β−ガラクトシダーゼ）の間の融合 タンパク質の製造のための方法を教示している。この融合タンパク質は、外来タ ンパク質の細胞内分解を防止する機能を供する。さらに、過剰発現された融合タ ンパク質、特にβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質は細菌細胞中の細胞封 入体として蓄積されることが多く、従って単離および精製するのが比較的容易で ある［Ｍａｒｓｔｏｎ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、Ｊ、　２４０：　１−１２　（１ ９８６）］。ンマトスタチン遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＣ−末端に 相内で挿入され、ンマトスタテン配列のＮ−末端にメチオニンが存在するように して臭化シアンによって後に行う融合タンパク質の切断を可能にしている。

誘導可能な細菌性プロモーターであるｌａｃプロモーターが、融合タンパク賀の ｍＲＮＡの転写を刺激するために挿入されている。非細菌性タンパク質（例えば 、ＭＳ２ファージ）を産生させるために大腸菌中で好ましいことがわかっている アミノ酸コドンが使用されている。この融合タンパク質を７０％ギ酸、６Ｍグア ニジニウムＨＣＩ。

８Ｍｖｒｃ素、または２％ＳＤＳで可溶化し、次いで所望の産物であるソマトス フチンをＣＮＢｒ切断、アルコール抽出、およびクロマトグラフィーを用いて豊 富化している。選択的切断部位の考えに基づいて別の切断法についての示唆が為 されている：メチオニンを所望の連結点に挿入して臭化シアンの標的部位とする ことができると同様に、アミノ酸特異性を有するタンパク質加水分解酵素によっ て攻撃されうる特異的なアミノ酸部位を導入することができる。

Ｉ　ｋｅｈａｒａら（１９８４、上記）は、ヒト成長ホルモン（ｈＧ　Ｈ”）の 合成遺伝子の発現を促進して１９１アミノ酸のｈＧ）（ペプチドの合成を高める 大腸菌ｔｒｐプロモーターを含有するプラスミドを記載している。

この合成遺伝子は、大腸菌において最も頻繁なアミノ酸フドンを使用している。

Ｎａｇａｉら［Ｎａｔｕｒｅ　３０９：　８１０−８１２　（１９８４）コは、 たとえ適切なプロモーターおよびリポソーム結合配列を導入したときであっても 、大腸菌において真核性遺伝子を高レベルで発現させることの限界を指摘し、所 望のペプチドの効率的かつ容易な分離を高めるための有用な方法として、融合タ ンパク質中での所望の遺伝子産物の産生を開示している。この目的を達成するた めに、Ｎａｇａｉらは血液凝固因子ｆ　Ｘａの切断部位として作用する４アミノ 酸の配列を導入し、ファー！　シラムダｃｌｌ遺伝子の一部に融合させたヒトβ グロビン遺伝子の発１　現を行った。因子Ｘａによる切断によって、通常の方法 で大腸菌において発現されたほとんどの真核性タンパク質中に存在する、開始フ ドンによってコードされている余分なＮ−末端メチオニンが削除他の文献は所望 の異種タンパク質と第２のタンパク質の間の融合タンパク質をフードしているプ ラスミドの設計および使用を開示しており、これらの一部は、所望のタンパク質 の細菌中での発現を高めるためおよびその精製をさらに容易にするために、因子 Ｘａまたはトロンビンによって認識される切断部位を含んでいる［Ｇｅｒｍｉｎ ｏら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：　８９２−４６９６　 （１９８４）；　５ｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋら。

ら、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｔ　１７４：　４０５−４１０　（１９８８） ；およびＤｙｋｅ＠ら、　Ｅｕｒ、ムＢｉｏｃｈｅｓ、　１７４：　４１１−４ １８　（１９８８）］。

Ｗ　ｉｎｇｅｎｄｅｒら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４：　４３６７−４ ３７３　（１９８９）］は、大腸菌中でのｈＰＴＨの発現を高めるために上記の 方法を適用することを試みた。Ｎａｇａｉら（１９８５、上記）が記載したよう に発現プラスミドのｈＰＴＨ部位の上流に因子Ｘａの認識部位を導入し、因子Ｘ ａによるタンパク質加水分解切断を用いて融合タンパク質からｈＰＴＨを単離し ようとする試みは、精製度の高い融合タンパク質およびプロテイナーゼを用いた ときであっても不成功に終わった。

発明の簡単な要約 ｈＰＴｌ（およびその類似体（選択的なアンタゴニストであって、ある種の病的 状態においてＰＴＨ受容体に作用するアゴニストによって媒介される不都合な作 用を遮断することができる）が入手可能になることは、臨床的に大きな価値を有 するものと考えられる。この目的のためには、原核性の発現系が極めて有用であ ろう。このような系は臨床および研究用に十分な原料を供給するだけでなく、構 造−機能の関係を調べるためおよびホルモン変異体を設計して特異的な働きをさ せるためにタンパク質操作法を適用することをも可能にするであろう（例えば、 カルシウム動員と骨の再構成、アゴニスト作用とアンタゴニスト作用）。

本発明は、細菌中で効率的に発現させることができるヒト副甲状腺ホルモンをフ ードしている組換えＤＮＡ分子に関する。このＤＮＡ分子は宿主において遺伝子 配列を発現させるためのコントロール領域を含有しており、このコントロール領 域はポリペプチド配列をコードしているリーダー配列と機能的に結合している。

このリーダー配列は長さが約６００ヌクレオチド未満であり、選択的な酵素切断 部位をコードしているヌクレオチド配列に機能的に結合しており、このヌクレオ チド配列は発現させようとする遺伝子配列の前に結合さらに、本発明は、リーダ ーポリペプチド、選択した酵素切断部位、およびｈＰＴＨ（１−８４）またはそ の変異体からなる融合タン／（り質に関する。

また、本発明は、上記の組換えＤＮＡ分子を用いて細菌中で、大量のヒト副甲状 腺ホルモン１−８４（ｈＰＴＨ１−８４）またはその変異体を製造するための方 法を包含するものである。

本発明の主要な利点の１つは、現在達成することができるレベルの５０〜１００ 倍に改善された高濃度の精製ｈＰＴＨ１−８４を製造しうることである。

本発明は、付加されたＮ−末端メチオニンを欠（（それが存在しているときには 、ホルモン調製物の活性を減少させ、ヒト宿主に対してさらに免疫原性にする） 、細菌の細胞内での分解に耐性である安定な形態のｈＰＴＨ１−８４を製造する ことを可能にする。

さらに、本発明は、有用な副甲状腺ホルモンのアゴニストまたはアンタゴニスト として作用しつる、変ｊ％Ｎ−末端を育するｈＰＴＨ類似体を製造するためのプ ラスミド構築物を作成することを可能にする。

図１は、因子Ｘａ認識配列（ＦＸＲ５）を含有するオリゴヌクレオチドフラグメ ントおよびトロンビン認識配列を含有する類似フラグメントを示すものであり、 さらに制限部位の存在をも示すものである。特に重要な部位はＡｒｇコドンの３ ”側の５ｊｕｌ部位であり、この部位がｈＰＴＨの暗号配列の５°末端との結合 を可能にする。

図２は、組換えｈＰＴＨの製造方法を図式的に示すものである。

出発プラスミドであるｐＧＨ−Ｌ９は、大腸菌のトリプトファンプロモーターお よびヒトＧＨをコードしているヌクレオチド配列を含み、ＢｇｌｌｌおよびＳ　 ａｌ　ｒ制限部位を含有している。ＦＸＲ３を含む３５ヌクレオチドのオリゴマ ー（図１を参照）を、ｐＧＨ−Ｌ９中のＢｇｌｌｌＳａｉ１部位にクローニング する。即ち、得られた中間体プラスミド（ｐＴ　Ｇ　１　、示していない）は、 ＦＸＲ３配列に結合したヒトＧＨのアミノ酸１〜１３８をコードしているヌクレ オチドを含有している。この中間体プラスミドを５ｊｕｌで処理して、Ａｒｇを コードしているコドンの３゛側に平滑末端を創製する。ｈＰＴ、Ｈをコードして いる遺伝子配列をプラスミドｐＰＴＨｍ１２４からＸｂａｌで切り出し、平滑末 端にし、Ｘｂａ１部位をフレノウ試薬を用いて充填し、得られた配列を中間体プ ラスミドｐＴＧｌ中にクローニングする。この方法により、ｈＰＴＨのＮ−末端 コドンをＦＸＲＳフラグメントのＡｒｇフドンに隣接させることが可能である。

この新規に構築したプラスミドをｐＧＦＰ−１と命名した。次いで、このプラス ミドを大腸菌中で発現させると、ｈＧＨ（１−１３８）、ＦＸＲ３，およびｈＰ ＴＨ（１−８４）配列を含有する融合タンパク質が産生された。因子Ｘａで切断 すると、Ｎ−末端のセリン残基が修飾されていない無傷のｈＰＴＨ（１−８４） ホルモンが放出された。次いで、このｈＰＴＨをＨＰＬＣで精製した。

図３は、フクロネズミ腎細胞への組換えｈＰＴＨ（１−８４）および合成ＰＴＨ （１−３４）の結合を示すものである。

図４は、Ｕ　Ｍ　Ｒ，Ｉｌｌ瘍細胞への組換えｈＰＴＨ（１−８４）および合成 ＰＴＨ（１−３４）の結合を示すものである。

図５は、組換えｈＰＴＨ（１−８４）および合成ＰＴＨ（１−３４）による刺激 に対する、フタロネズミ腎細胞の環状ＡＭＰ応答を示すものである。

図６は、組換えｈＰＴＨ（１−８４）および合成ＰＴＨ（１−３４）による刺激 に対する、ＵＭＲ腫瘍細胞の環状ＡＭＰ応答を示すものである。

好ましい態様の説明 ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）は８４アミノ酸残基のポリペプチドである［ ｈｐＴＨ（１−８４）］。そのアミノ酸配列［Ｋｅｕｔｍａｎｎ、　Ｈ，Ｔ。

叩：　７３６５−７３６９　（１９８１）］は既知である。

ｈＰＴＨ（１−８４）のヌクレオチド配列は多数の既知供給源から得ることがで きる。例えば、プラスミドｐＰＴＨｍｌ　２４［Ｂｏｒｎら、珂ｅｃ、Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏ１．１：　５−１４　（１９８７）］がこの配列を含んでおり、本発 明のプラスミドｐＧＦＰ−１を構築するために用いるＤＮＡの供給源となる（図 ２を参超）。

ｈＰＴＨの生物学的活性およびこれら活性を測定するための方法は当分野で周知 である［例えば、Ｐｏｔｔｓら、　Ａｄｖ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｓ、　３２ ：３２３−３９５　（１９１１２）を参照］。これらの活性には、腎細胞および 種々の腫瘍セルライン上の受容体への結合、ならびに環状ＡＭＰ産主の刺激が含 まれる。

本明細書で用いるｈＰＴＨの「変異体」なる用語は、ｈＰＴＨの生物学的活性に 実質的に類似した生物学的活性を有するポリペプチドを指す。このような生物学 的活性には、ｈＰＴＨの受容体への結合、ならびにその後のこの受容体へのｈＰ ＴＨの結合または作用の阻害が含まれる。２つの分子が実質的に類似した構造を 有しているとき、または２つの分子が類似した生物学的活性を保持しているとき に、一方の分子は他方の分子に「実質的に類似」していると言われる。

組換えｈＰＴＨの「変異体」には、組換えｈＰＴＨの「フラグメントエオヨび「 変異体」の両方が含まれる。

ｒｈＰＴＨのフラグメント」なる用語は、該分子の任意のポリペプチド小集団を 指すことを意味する。ｒｈＰＴＨの変異体」なる用語は、この「変異体」がｈＰ ＴＨの生物学的活性に類似する生物学的活性の少なくとも１つを有しているとい う条件のもとで、完全分子またはそのフラグメントのいずれかに構造が実質的に 類似している分子を指すことを意味する。即ち、ある分子がｈＰＴＨの活性に類 似する生物学的活性（ｈＰＴＨ受容体への結合およびその後のｈｐＴＨの結合の 阻害を含む）の少なくとも１つを保持しているときには、一方の分子が他方に見 い出されない１またはそれ以上のアミノ酸を含有しているときであっても、また 、２つの分子中のアミノ酸残基の配列が同一ではないときであっても、本明細書 においてこの用語を用いるときにはｈＰＴＨの「変異体」であるとみなされる。

本発明で意図されているように、ｈＰＴＨの変異体がｈＰＴＨの生物活性（ｈＰ ＴＨの受容体に結合する能力およびｈＰＴＨのアンタボ」　ニストとして機能す る能力を含む）を保持している限り、任意のｈｐＴＨ変異体を発現させ、製造す ることができる。

ｈＰＴＨの変異体は組換え法によって製造する。一方または他方の末端からアミ ノ酸残基を失っている末端切除の変異体を、ポリペプチドとして発現されうるポ リヌクレオチドを合成することによって製造する。

ウシＰＴＨの合成類似体であるＰＴＨ（３−３４）は、インビトロで強力なＰＴ Ｈアンタゴーストであると認識されている。Ｎ−末端アミノ酸ｉ２および１−７ を欠＜ｈＰＴＨの変異体はアゴニスト活性を欠き、アンタゴニスト活性の能力が あることが示されている［Ｂｏｒｎ−Ｌら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１２３： 　１８４ｇ−１８５３（１９８８）］。本発明の好ましいｈＰＴＨ変異体は、Ｎ −末端で末端切除された変異体である。変異体がＮ−末端から１個のアミノ酸を 切除したものであるときには、この変異体は残基Ｎｏ、ｌを欠いているが残基Ｎ ０．２〜８４を含んでおり、ｈＰＴＨ（２−８４）と呼ばれる。同様に、Ｎ−末 端が切除された変異体は、ｈＰＴＨ（３−８４）、ｈＰｒＨ（４−８４）などと 呼ばれる。

本発明の好ましい変異体は、ｈＰＴＨ（３−８４）、（４−８４）、（５−８４ ）、（６−８４）、（７−８４）、および（８−８４）である。

「融合タンパク質」なる用語は、ヒトＰＴＨまたはその変異体がそのＮ−末端の ところで「選択的切断部位」に結合し、次いでこれがそのＮ−末端のところで別 のアミノ酸リーダーポリペプチド配列に結合している融合タンパク質を意味する 。融合タンパク質中の結合は、本発明の一部を構成する遺伝子配列から転写され るｍＲＮＡに由来する、タンパク質生合成中に宿主細胞において生成される通常 のペプチド結合によっている。

「選択的切断部位」なる用語は、化学物質または酵素のいずれかによって選択的 に切断することができ、かつ予測可能な状態で切断することができるアミノ酸残 基または残基群を指す。選択的な酵素切断部位は、タンパク質加水分解酵素によ って認識され、そして加水分解されるアミノ酸またはペプチド配列である。この ような部位の例には、トリプシンまたはキモトリプシン切断部位が含まれる。

本発明の好ましい態様においては、この選択的切断部位は、血液凝固因子Ｘａに よって認識され、そして切断される配列１１ｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｒｇ からなる。他の態様では、この選択的切断部位は、トロンビンによって認識され 、そして切断される配列Ｌ　ｅｕ−Ｖ　ａｌ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｒｇを有している 。

この酵素認識部位をコードしている配列の５゛側のオリゴヌクレオチド配列の大 きさは変化してよい。好ましい態様においては、１３個のヌクレオチドを、ｌｌ ｅのコドン（認識部位の最初）とリーダー配列の３°末端の間に設置する。他の 態様においては、さらに長い配列を用いることもできる。これら上流配列は、こ れらをリーダー配列に隣接したＤＮＡ中にクローニングすることを可能にする適 当な制限部位を含んでいなければならない［因子Ｘ認識部位（ＦＸＲ３）を含有 するオリゴヌクレオチドのＢｇ１１１部位のように；図１および図２を磐照コ。

「リーダー配列」なる用語は、ｈＰＴＨに結合されるポリヌクレオチド配列であ って、選択的切断部位およびｈＰＴＨに融合した融合タンパク質として宿主細胞 中で発現される配列を意味する。「リーダーポリペプチド」なる用語は、融合タ ンパク質中に得られる［リーダー配列Ｊの発現形態を指す。

ある態様では、約６００ヌクレオチド未満のリーダー配列を利用する。別の態様 では、ヒト成長ホルモン（１９１アミノ酸残基）をコードしているヌクレオチド 配列を用い、その結果、リーダーポリペプチドがヒト成長ホルモンである融合タ ンパク質が得られる［Ｉｋｅｈａ−ｒａら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：　５９５６−５９６０　（１９８４）］。他の態様では 、このリーダーポリペプチドは約５０アミノ酸からなる。さらに別の態様では、 このリーダーポリペプチドは約１００アミノ酸からなる。

本発明で用いるリーダー配列は、完全なヒト成長ホルモンポリペプチドをコード するのに必要なヌクレオチド数よりも少ない、即ち、ヒト成長ホルモンの短縮さ れた変異体をコードしているものであってもよい（これが融合タンパク質に発現 される）。好ましい態様においては、このリーダー配列は、ヒト成長ホルモンの 残基１〜１３８をコードしているヌクレオチド配列からなる。

リ　過剰発現されたときに細胞封入体中に見い出され、不溶性であることが多い 融合タンパク質を、当分野で周知の方法によって他の細菌性タンパク質から精製 する。好ましい態様では、この不溶性の融合タンパク質を、細胞溶解の後に遠心 して洗浄し、グアニジン−ＨＣｔで再溶解する。これは、透析による変性物質の 除去の後に可溶性のままであることができる［屈折力のあるタンパク質の精製に ついては、ＪＯｎｅ＆の米国特許Ｎｏ、　４．５１２．９２２　；　０１ｇ０１ １の米国特許Ｎｏ、　４．５１８．５２６　；　Ｂｕｉｌｄｅｒらの米国特許Ｎ ｏ、　４．５１１．５０２およびＮｏ、４．６２０．９４８を参照］。

組換えｈＰＴＨは、種々の方法のいずれかを用いることにより、可溶化した融合 タンパク質から天然不純物を実質的に含まないように精製することができる。本 明細書においては、ある化合物が細菌または真核宿主細胞において発現された後 にその化合物に伴われる物質から実質的に精製されたときに、その化合物は「天 然不純物を実質的に含まない」と言う。通常のクロマトグラフィー分離法を用い てｈＰＴＨを精製することができる。

別法では、このペプチドを免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製 してもよい［Ｒｏｔ＋ｓａｎ、＾、ら、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ＋＋、 Ａｃｔａ　３４１：　１１４−１２１　（１９８１）；　５ａｉｒａ＋ｍ、Ｍ、 Ｒ，，Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏ　、　２１５：　１４３−１５２　（１９８１）　 ；　Ｎ１ｅｌｓｅｎ、　Ｌ、　ｓ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１：　６ ４１０−［１４１５（１９８２）；　Ｗｏｅｋｌｅｙ、　Ｊ、ら、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｊ、２１７：　５３５−５４２　（１９８４）；　Ｐａｕｃｈａ、Ｅ、ら、Ｊ 、Ｖｉ６８　（１９８５）］。

部分的または実質的な精製の後に、融合タンパク質を選択的切断部位に対応する 酵素で処理する。別法では、さらに不純な状態にある融合タンパク質を、屈折力 のある形態であっても酵素で処理することができる。必要なら、得られた成熟ｈ ＰＴＨまたはその変異体をさらに精製することができる。

酵素処理のための条件は当業者に既知である。

ＤＮＡ配列の発現は、このＤＮＡ配列が転写および翻訳調節情報を含むＤＮＡ配 列に「機能的に結合」していることを必要とする。

機能的な結合とは、コントロールまたは調節ＤＮＡ配列および発現させようとす るＤＮＡ配列が、遺伝子を発現させるような仕方で結合している結合を指す。遺 伝子発現に必要な「コントロール領域」の正確な性質は生物の種類によって変わ るであろうが、通常は、プロモーター領域を含むであろう。原核生物では、この プロモーター領域は、プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指令する）ならびにＲ ＮＡに転写されたときにタンパク質合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の 両方を含んでいる。通常、真核細胞における調節領域はＲＮＡ合成の開始を指令 するに十分なプロモーター領域を含有している。

２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が次のようであるときに、この２つのＤＮＡ 配列は機能的に結合していると言われる＝（１）フレームシフト突然変異を導入 する結果にならない；（２）融合タンパク質をコードしている配列の転写を指令 するプロモーター領域配列の能力に悪影響を及ぼさない；または（３）プロモー ター領域配列によって転写させようとする融合タンパク質コード化配列の能力に 悪影響を及ぼさない。即ち、プロモーターがＤＮＡ配列を転写させることができ るなら、該プロモーター領域は該ＤＮＡ配列に機能的に結合している。

原核細胞（ｆ！ｑえば、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属、ストレプトマイセ ス属など）中でｈＰＴＨ分子またはその変異体もしくは機能的誘導体を発現させ るためには、ｈＰＴＨをコードしている配列を機能的な原核性プロモーターに機 能的に結合させることが必要である。このようなプロモーターは構成性またはよ り好ましくは調節可能（即ち、誘導可能または抑制解除可能）のいずれであって もよい。

構成性プロモーターの例には、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐ Ｂ　Ｒ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＰＲ３ ２５のクロラムフ二ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモ ーターなどが含まれる。誘導可能な原核性プロモーターの例には、バクテリオフ ァージλの主右側および左側プロモーター（ＰＬおよびｐ、）、大腸菌のｔｒｐ 、　ｒｅｃＡ、　１ａｃＺ、　１ａｃｌおよびｇａｌプロモーター、枯草菌のα −アミラーゼプロモーター［Ｕｌｍａｎｅｎ、　１．ら、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ、　１６２：　１７６−１８２　（１９８５）］およびσ−２８特異的なプ ロモーター［Ｇ１１ａａｎ、Ｍ、Ｚ、ら、　Ｇｅｎｅ　３２：　１１−２０　（ １９ｇ４）］、ハシラス属のバクテリオファージのプロモーター［Ｇｒｙｃｚａ ｎ、　Ｔ、　Ｊ、　、　ＥＮＹ　（１９８２）］、ならびにストレプトマイセス 属のプロモーター［１ａ　ｒｄ　＋ＪＭ、ら、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 　２０３：　４６８−４７８　（１９８６）］が含まれる。原核性のプロモータ ーは概説されている［Ｇ１１ｃｋ、　Ｂ、　Ｒ，、Ｊ、　Ｉ　ｎｄ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ。

１：　２７７−２８２　（１９８７）；　ＣｅｎａＬｉｅ＋＊ｐｏ、Ｙ、、Ｂｉ ｏｃｈｉｍｉｅ　６８：　５０５−５１６　（１９８６）；およびＧｏｔｔｅｓ ｍａｎ、Ｓ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１８：　４１５−４４２　（１９ ８４）コ。

本発明の発現ベクターを得るための種々のＤＮＡフラグメントの結合は、平滑末 端または付着末端にした連結用末端、適当な末端を得るための制限酵素消化、適 切な付着末端の充填、所望ではない結合を避けるためのアルカリおよびホスファ ターゼ処理、ならびに適当なりガーゼによる連結を用い、常法に従って行う。こ の遺伝子構築物は、融合タンパク質の５°遺遺伝子列に機能的に結合した誘導可 能なプロモーターをコードしており、融合タンパク質の効率的な発現を可能にす る。

で誘導することができる大腸菌ｔｒｐプロモーターである。

原核細胞における適切な発現には、遺伝子コード化配列の上流のリポソーム結合 部位の存在が必要である。このようなリポソーム結合部位は開示されている［例 えば、Ｇｏｌｄ、　Ｌ、ら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｆｃｒｏｂｉｏｌ。

真核細胞（例えば、酵母、菌類、哺乳動物細胞または植物細胞など）での発現が 所望であるときには、そのような真核宿主において転写を指令することができる プロモーターを用いることが必要である。好ましい真核性プロモーターには、マ ウスメタロチオネイン！遺伝子のプロモーター［Ｈａｍｅｒ、　ｏ、ら、　ＪＪ ｏｌ、Ａｐｌ）１．Ｇｅｎ、　４：　２７：ｌ−２８８（１９８２）］　；　ヘ ルペスウィルスのＴＫプロモーター［ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｓ、、　Ｃｅｌ子のプ ロモーター［Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｓ、　Ａ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　？９：６９７１−６９７５　（１９８２）；　５ｉｌｖ ｅｒ、Ｐ、Ａ、ら、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：５ ９５１−５９５５　（１９８４）］が含まれる。

導入された遺伝子配列を、受容宿主において自律的な複製が可能なプラスミドま たはウィルスベクターに導入するのが好ましい。この目的に多種多様のベクター の任意のものを用いることができる。

特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択する際の重要な因子には次のも のが含まれる：即ち、ベクターを含んでいる受容細胞を、ベクターを含んでいな い受容細胞から認識および選択する際の容易さ；特定の宿主において望ましいベ クターのコピー数；ならびに、異なる種の宿主細胞の間でベクターを「往復」さ せうろことが所望であるか否かなどである。好ましい原核性ベクターには、大腸 菌中で腹製することができるプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ１、 ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４、πＶＸなどが含まれる。

このようなプラスミドは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ　、ら［Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ中、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）］が開示している。バシラス属プラスミド にはｐＣ１９４、ｐｃ２２１、ｐＴ１２７などが含まれる。このようなプラスミ ドは、例えば、Ｇ　ｒｙｅＺａｎｌ　”ｒ、　［Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙｏｒ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ中＋　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、　ＮＹ　（１９８２）、　ｐｐ、３０７−３２９コが開示している。適当 なストレプトマイセス属プラスミドには、ｐ■Ｊ　１０１　［Ｋｅｎｄａｌｌ、 １［、Ｊ、ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：　４１７？−４１８３（ＬＨ ７）］、およびφＣ３１などのストレプトマイセスバクテリオファージ［Ｃｈａ ｔｅｒ、　Ｋ、　Ｆ、ら、　Ｓｉ＋＋ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙ ｍ　ｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ＡｃｔｉｎｏａｙｃｅｔａｌｅｓＢｉｏｌｏｇｙ中、＾ ｋａｄｅｍｉａｉ　Ｋａｉｄｏ、　Ｂｕｄａｐｅｓｔ、　Ｉ（ｕｎｇａｒｙ　（ １９８６）＋　ｐｐ、４５−５４］が含まれる。シ二−ドモナス属プラスミドは 、Ｊｏｈｎ、Ｊ、Ｆ、ら［Ｒｅｖ、　Ｉｎｒｅｃｔ、Ｄｉｓ、　８：　６９３− ７０４　（１９８６）］、およびＩ　ｚａｋｉ、　Ｋ、　［江ムムＢａｃｔｅｒ ｉｏ１．３３：　７２９−７４２　（１９７ｇ）コが概説している。

好ましい真核性プラスミドにはＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０．２−ミクロンサ ークルなどが含まれる。このようなプラスミドは当分野で周知である［Ｂｏｔｉ ｔｅｉｎ、　ｏ、ら＋　Ｍｉａｓｉ　Ｗｎｔｒ、Ｓｙｍｐ、　１９：　２６５− ２７４（１９８２）；　Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ、Ｒ，、Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ： 　Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ中＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ、　ＩＩＹ＋　ｐ、４４５−４７０　（１９８１）；　Ｂｒｏａｃ ｈ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｃｅ旦２８：　２０３−２０４　（１９８２）；　Ｂｏｌｌ ｏｎ、Ｄ、Ｐ、ら、Ｊ、（ｌｉｎ、Ｈｅ５ａｔｏ１．ｏｎｃｏｌ、　ｔｏ：　ａ ９−４８　（１９８０）；　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏ 　：　Ａ　Ｃｏ＋ａ肛江μ臣込ｅ　Ｔｒｅ畦江り二邑しム」１狙」鼾シ徂畦勉中 、　Ａｃａｄｅ■ｉｃ　Ｐｒｅｇｓ、　ＮＹ、　ｐｐ、５６ａ−６０８（１９８ Ｇ）］。

本発明に好ましい細菌宿主は大腸菌である。別の態様では、別の細菌種を用いる ことができる。さらに別の態様では、例えば酵母、糸状菌などの真核細胞を用い ることができる。これらの細胞種の使用は当分野で周知である。発現プラスミド 中のレプリコンおよびコントロール配列に適合する任意の宿主を用いてタンノ（ り質を発現させることができる。通常は、宿主細胞に適合する種から導いたレプ リコンおよびコントロール配列を含有するベクターを、この宿主と組合せて使用 する。このベクターは、レプリフン部位、ならびに感染細胞または形質転換細胞 において表現型選択を与えることができる特別の遺伝子を担持しているのが普通 である。また、融合タンパク質の発現を他の調節配列の制御下に置くこともでき 、この配列は形質転換されていない状態の生物にホモローガスであってもよい。

次いで、ｈＰＴＨをその周知の用途のすべてに対して使用することができる。

実施例１　ヒトＰＴＨ（１−８４）の製造ｐＧＦＰ−１（図２を参照）で形質転 換した大腸菌（１０ｍｌ）をＬＢアンピシリン培地（ＩＬ）に接種した。培養物 の光学密度が６００　ｎｍｌ二連したときに、３β−インドールアクリル酸（４ ０ｓ＋ｇ）を加え、この培養物を３７℃で１６時間誘導した。５０００ｘｇで１ ０分間遠心することによって細胞をベレット化し、ＴＥ−スクロース（１００ａ ｌ）に再懸濁し、これにリソチーム（１００ｍｇ）を加えた。０℃で１．５時間 インキュベートした後、ＭｇＣ１ｙを２０１Ｍの濃度となるように、そしてＤＮ アーゼ■を５０ａｇ／ｓｌの濃度となるように加え、さらに１．５時間インキュ ベートした。０．２Ｍ　ＮａＣ１，１％デオキシコール酸、１．６％Ｎｏｎ１ｄ ｅｔ　Ｐ　４０．２０饋Ｍ　トリス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、２ｍＭＥＤＴＡ、 および０．５−Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む溶液（２００霞ｌ）を加 え、０℃で１．５時間インキュベートすることによって細胞を溶解した。この溶 菌液を５０００ｘｇで１０分間の遠心によってベレット化した。このベレ・ノド を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、ｌ＊ＭＥＤＴＡ、および０．５＠ＭＤＴ Ｔで４回洗浄し、遠心することによって融合タンパク質に富むペレ、２トを得た 。

この融合タンパク質のペレ・ｙトを５０−１の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、２０５ Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、０．５−Ｍ　ＤＴＴ、および１＠ＭＥＤＴＡ に溶解し、融合タンパク質が１ｍｇ／＋ｉｌになるようにした。

この溶液を、５０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）、０．１ＭＮａＣ＋に対し て透析した。

活性化した因子Ｘを１００ｍｇの融合タンパク質あたり１ｍｇの比で加え、この 混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、この溶液をＨＰＬＣＲ ＰＣ−１８システムにかけ、直線の３０〜７０％アセトニトリル／Ｈ，Ｏ勾配液 で溶離した。ＰＴＨ分画は３８％アセトニトリルで溶出することがわかった。こ の分画を凍結乾燥し、後に行う分析用に水に再懸濁した。

ＧＨ−ＰＴＨ融合タンパク質は疎水性であり、６８％アセトニトリルで溶出する ことがわかった。因子Ｘａで処理した後には、このハイブリッドタンパク質のピ ークは顕著に減少し、同時に３８％アセトニトリルのところにＰＴＨのピークが 現れた。

通常、ハイプリントＧＨ−ＰＴＨの収量はＩＬの培養物あたり約５０＋ｍｇであ った。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によると、上記の因子Ｘ処 理条件により、融合タンパク質のｈＰＴＨ（１−８４）およびＧＨフラグメント への５０％の変換が得られた。

実施例２　組換えｈＰＴＨ（１−８４）のアミノ酸組成およびＮ４端配列の分析 アミノ酸組成の分析は、ｈｐＴＨ（１−８４）に対する予想アミノ酸組成と一致 していた。ｈｐＴＨ（１−８４）のガス相マイクロ配列決定によって、最初の１ ８アミノ酸の配列を確認した。重要なことは、Ｎ−末端の１位がセリンであるこ とがわかったことである。他の研究者が記載しているように［Ｒａｂｂａｎｉら 、　１９８８；上記］、得られたｈｐＴＨの重要な部分の中にブロックされたア ミノ末端が存在するという事実は認められなかった。

実施例３　組換えｈｐＴＨ（１−８４）の生物学的活性上記の実施例１の記載の ように製造された組換えペプチドについて、２種類の細胞型に対する結合を調べ た。図３に示した結果がられかるように、組換えｈＰＴＨ（１−８４）は、約３ ｎＭの半一最大結合でもって７クロネズミ腎細胞に特異的に結合した。この結果 は、約１　１ｎＭの半一最大結合を示す合成ＰＴＨ（１−３４）の結合に類似し ていた。図４はＵＭＲラット骨肉腫セルラインを用いた同様の研究を示すもので あり、ここでは、合成ＰＴＨ（１−３４）の約２ｎＭに対し、組換えｈｐＴＨ（ １−８４）は約１０ｎＭの半一最大値で結合した。

環状ＡＭＰ生成を誘導する生物学的活性が図５および図６に示されている。組換 えｈＰＴＨ（１−８４）は約１０ｎＭのＥＣ，、でフクロネズミ腎細胞中の環状 ＡＭＰを刺激し、合成ＰＴＨ（１−３４）は約４ｎＭのＥＣ，。を有していた（ 図５）。ＵＭＲ細胞では、組換えｈＰＴＨ（１−８４）は約３ｎＭのＥＣ，、で 環状ＡＭＰを刺激し、一方、合成ＰＴＨ（１−３４）は約０．１ｎＭのＥＣ５ｏ を有していた（図６）。即ち、この組換えペプチドは、既知の活性フラグメント の活性とほとんどプラスミドｐＧＦＰ−１を含有する大腸菌株ＤＨＩは１９８９ 年５月１２日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）に寄託されており、受託番号ＡＴＣＣ ６７９７７が付与されている。

本発明をその具体的な態様との関係において説明したが、さらに修飾を加えるこ とができることは理解されよう。本出願は、広く本発明の原理に従うあらゆる変 異形、使用ま、たは適合を包含することを意図するものであり、本発明が属して いる分野の既知または通常の実施の範嗜に含まれ、添付した請求の範囲に記載し たような上記説明の本質的特徴に当てはめることができる本開示からの逸脱を包 含するものである。

、、、ＬｎｎＬ／） ０　Ｑ　（り　ＣＪ 組換えｈＰＴＨの製造方法 ■■■■■■ 口匪Ｉ！ヨ ＯＫ細胞の結合 （ペプチドＮｏｇＭ （ペプチド月ｏｇＭ （ペプチド）ｌｏｇ（Ｍ） ＯＫ細胞中でのＡＭＰの産生 （ペプチド）ｌｏｇ（Ｍ） 国際調査報告 Ｉ−−＾−−−５売葡１０２６笥 ＰＣＴ／１３８９０７０２６５０ Ａ？ｒＡｍ ｇＡＯ（πＲε： Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｎｍｅ、　ＣａＳ　ｒｅｇｉｓｔ１７　ｎｕ＋ ｎｂｅｒ　’ＩＸ）２−６４−６＋　５ｅｑｕｅｎｃｅ。

ｃ’Ｊｔｙｎ＠ｆ、　ｆ’ｕｇｉｏｎ、　ｖｅｃｔｏｒ、　ｃｌｅａｖり、　ｔ ｈｒｏｍｂｉｎ、　ｎ　ｔａｒｍ釦？、−ｔｅｒｍｉｎ？、　ｔｒｕｎｃ＠ｔ？ 　ｃｓｕ’ｂｏｘｙＩＩｌｔｅｍ紬？、　Ｃｔｅｍ鋤？、　ｃａ内内喘石曲？。

ｇｙｙｗｔｈ　ｈＯ丁ｅ、　ｆ’ｕｓｉｏｎ、　ｒ−ｅ６．１ｅａｄｅｒ、　ｐ ａｒａｔｈｏｎｎｃｒ＋ｅ、　Ｍ！！＋ｐａｒｓｔｈｙｒｉｎ、　’ｋａｋｅｒ ｂｉｎ、　３８４゜

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）宿主中でヒト副甲状腺ホルモンまたはその変異体を発現させるための コントロール領域； （ｂ）該領域と機能的に結合し、長さが約６００ヌクレオチド未満の、ポリペプ チド配列をコードしているリーダー配列；（ｃ）該リーダー配列と機能的に結合 し、ヒト副甲状腺ホルモンまたはその変異体をコードしている遺伝子配列に先行 して結合している、選択的酵素切断部位をコードしているヌクレオチド配列；を 含有する組換えＤＮＡ分子。
2. ２．コントロール領域が、細菌、ウイルス、菌類、または哺乳動物プロモーター を含む請求項１に記載の分子。
3. ３．プロモーターが、バクテリオファージλの右側プロモーター（ＰＬ）、バク テリオファージλの左側プロモーター（ＰＲ）、大腸菌のｔｒｐプロモーター、 大腸菌のｒｅｃＡプロモーター、大腸菌のｌａｃＺプロモーター、大腸菌のｌａ ｃＩプロモーター、大腸菌のｇａｌプロモータ、枯草菌のα−アミラーゼプロモ ーター、枯草菌のσ−２８特異的プロモーター、バシラス属バクテリオファージ のプロモーター、およびストレプトマイセス属プロモーターからなる群から選ば れる請求項２に記載の分子。
4. ４．プロモーターが大腸菌ｔｒｐプロモーターである請求項３に記載の分子。
5. ５．リーダー配列が成長ホルモンをコードしている請求項１に記載の分子。
6. ６．選択的酵素切断部位が因子Ｘａによって切断される請求項１に記載の分子。
7. ７．選択的酵素切断部位がＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇである請求項５に記 載の分子。
8. ８．選択的酵素切断部位がトロンビンによって切断される請求項１に記載の分子 。
9. ９．選択的酵素切断部位がＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである請求項７に記 載の分子。
10. １０．ヒト副甲状腺ホルモンがｈＰＴＨ（１−８４）である請求項９に記載の分 子。
11. １１．ヒト副甲状腺ホルモンの変異体がＮ−末端のところで先端切除されたもの である請求項９に記載の分子。
12. １２．変異体が、ｈＰＴＨ（２−８４）、ｈＰＴＨ（３−８４）、ｈＰＴＨ（４ −８４）、ｈＰＴＨ（５−８４）、ｈＰＴＨ（６−８４）、ｈＰＴＨ（７−８４ ）、およびｈＰＴＨ（８−８４）からなる群から選ばれる請求項１１に記載の分 子。
13. １３．プラスミドである請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
14. １４．ｐＧＦＰ−１である請求項１３に記載のプラスミド。
15. １５．請求項１に記載の分子を含有する宿主細胞。
16. １６．原核性である請求項１５に記載の細胞。
17. １７．細菌である請求項１６に記載の細胞。
18. １８．大腸菌種である請求項１７に記載の細胞。
19. １９．真核性である請求項１５に記載の細胞。
20. ２０．酵母細胞または哺乳動物細胞である請求項１９に記載の細胞。
21. ２１．（ａ）約２００アミノ酸未満のリーダーポリペプチド；（ｂ）核ポリペプ チドに融合した選択的酵素切断部位；（ｃ）該切断部位に融合したｈＰＴＨ（１ −８４）またはその変異体；を含有する融合タンパク質。
22. ２２．リーダーポリペプチドが成長ホルモンである請求項２１に記載のタンパク 質。
23. ２３．選択的酵素切断部位が因子Ｘａによって切断される請求項２１に記載のタ ンパク質。
24. ２４．選択的酵素切断部位がＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇである請求項２１ に記載のタンパク質。
25. ２５．選択的酵素切断部位がトロンビンによって切断される請求項２１に記載の タンパク質。
26. ２６．選択的酵素切断部位がＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである請求項２１ に記載のタンパク質。
27. ２７．変異体がＮ−末端のところで先端切除されたものである請求項２１に記載 のタンパク質。
28. ２８．変異体が、ｈＰＴＨ（２−８４）、ｈＰＴＨ（３−８４）、ｈＰＴＨ（４ −８４）、ｈＰＴＨ（５−８４）、ｈＰＴＨ（６−８４）、ｈＰＴＨ（７−８４ ）、およびｈＰＴＨ（８−８４）からなる群から選ばれる請求項２１に記載のタ ンパク質。
29. ２９．変異体がｈＰＴＨ（３−８４）である請求項２８に記載のタンパク質。
30. ３０．天然の不純物を実質的に含まないヒト副甲状腺ホルモンまたはその変異体 の製造方法であって、 （ａ）請求項１に記載の分子を宿主中に供し；（ｂ）ヒト副甲状腺ホルモンまた はその変異体を発現きせ；そして（ｃ）約２００アミノ酸未満のリーダーポリペ プチド、これに融合した選択的酵素切断部位、これに融合したｈＰＴＨ（１−８ ４）またはその変異体を含有する融合タンパク質を得る；ことからなる方法。
31. ３１．（ｄ）工程（ｃ）の融合タンパク質を選択的酵素切断部位を認識する酵素 で切断する； 工程をさらに含む請求項３０に記載の方法。
32. ３２．（ｆ）ｈＰＴＨ（１−８４）またはその変異体を精製する；工程をさらに 含む請求項３０または３１に記載の方法。