JPH04506074A

JPH04506074A - レトロウイルス複製を阻害するαアノマーオリゴヌクレオチド化合物

Info

Publication number: JPH04506074A
Application number: JP2508923A
Authority: JP
Inventors: アンバシュ，ジャン―ルイ; レネ，ベルナール
Original assignee: サントル、ナショナル、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク（セエヌエルエス）
Priority date: 1989-06-13
Filing date: 1990-06-12
Publication date: 1992-10-22
Also published as: EP0477248A1; FR2648045B1; FR2648045A1; WO1990015813A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は天然βアノマー配置とは反対の非天然αアノマー配置を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴデオキシヌクレオチドからなる化合物に関する。

このような化合物は特許出願、特に本出願人の名称のフランス出願第８７　０４３３９号（ＰＣＴ　ＷＯ３８１０４３０１）及び第８８　１２２６４号明細書の生国を形成しているが、特にそれらの製造方法に関する記載をそこでみつけるためその出願が参考にされるべきである。

更に詳しくは、本発明はレトロウィルスの複製を阻害する上で有用なこういう種類のオリゴヌクレオチド化合物、特にＨＩＶウィルスの複製を１ｌｆｌ害する上で有用なオリゴヌクレオチドに関する。

それらの本質的特徴によれば、本発明による化合物は非天然αアノマー配置のオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチド配列からなるが、その配列はウィルスＲＮＡの複製に関するｔ　ＲＮＡプライマーの結合部位からなるいわゆるＴＢＳもしくはＰＢＳ（ｔＲＮＡ結合部位又はプライマー結合部位）配列中に又はＴＢＳ配列から上流のウィルスＲＮＡ配列中に含まれる配列と相補的である。

ＴＢＳ又はＰＢＳ配列から上流におけるこれらの配列の中では、ＣＡＰ配列が特に挙げられる。

本発明によるα−オリゴヌクレオチド化合物は場合により挿入剤又は反応性もしくは光活性化学基のようなエフェクター剤と共有結合させることができる。

本発明による化合物の一態様において、後者は下記式：基Ｂは同一でも又は異なっていてもよく、各々が場合により修正されて非天然α アノマー配置に従いグリコシド環に結合された核酸塩基を表す、：基ＢはＴＢＳ配列又はプロウィルスＲＮＡから上流の配列中に含まれる配列の標的オリゴヌクレオチド塩基に逐次的と考えられるが相補的である；基Ｘは同一でも又は異なっていてもよく、各々がオキｅソ陰イオン０１チオ陰イオンＳ　１アルキル基、アルコキシもしくはアリールオキシ基、アミノアルキル基、アミノアルコキシ基又はチオアルキル基を表す；Ｒ及びＲ′は同一でも又は異なっていてもよく、各々が水素原子又は基−Ｙ−Ｚを表す；Ｙは直鎖もしくは分岐鎖アルキレン基−ａｌｋ−又は　Ｅ −Ｃ−ａｌｋ、Ｃ−ＮＫ−ａｌｋ、−Ｐ−Ｕ−ａｌｋ、−Ｐ−ａｌｋｏｏ　ｏ　。

−ａｌｋ−Ｃ−Ｎ−ａｌｋ、−Ｐ−Ｕ−ａｌｋ−Ｎ−Ｃ−ａｌｋ　および　−Ｐ −Ｌｌ−ａ　Ｉ　ｋ−Ｃ−Ｎ−ａ　ｌ　ｋｌｌ　ロ　ＩＩ　Ｉ　ＭＩＯＨＯＨＯ００Ｈ（Ｕ−０、Ｎ又はＳ）から選択される基又は代わりに基−Ｙ’　−０−Ｙ−（Ｙ ’又はＹ゛はＹに関して示された意味を有する）を表す：ＥはＸと同様の意味を有する：Ｊは水素原子又はヒドロキシル基を表す：Ｚはエフェクター剤に相当する基である；ｎはＯを含む整数である；Ｌは酸素原子、イオウ原子又は−ＮＨ−基を表す。

この式１において、ヌクレオシドの下記略記表示が用いられているが二に相当し、そこでは（３°）及び（５゛）末端が示されている。

式Ｉは同一でも又は異なっていてもよいヌクレオチドの配列を表すが、ｎは分子中に含まれるヌクレオチドの数を単に示し、ｎは好ましくは１〜３０、更に好ましくは１〜２０の数であり、レトロウィルスのＲＮＡの標的配列のサイズに依存していることに留意すべきである。

一般に、例えば、ＴＢＳ配列は約２０のヌクレオチドを有する。

エフェクター基は核酸に関する技術上で公知の化合物であるエフェクター剤に相当する。それらは例えばＤＮＡ又はＲＮＡ構造中に“挿入°しうる化合物である。

これらの挿入剤は特にアクリジン、フロコラマリン・ダウノマイシン、１．１０ −フェナントロリン、フエナントリジニウム、プロフィリン類、ジピリド［１，２−ａ：３−．２−−ｄ］イミダゾール誘導体、エリブチシン又はエリブチジニウム及びそれらの誘導体のような平面配置を育する多環式化合物からなる。

これらのエフェクター剤は化学開裂基のような反応性化学基であってもよく、即ちこれらの基はヌクレオチド鎖を開裂するように直接又は間接的に反応できる。

これらの反応性化学基は例えば化学的に又は光化学的に活性化しうろことが好ましい。

活性化しうる反応性開裂基は例えばニーエチレンジアミン四酢酸一ジエチレントリアミン五酢酸一ポルフィリン類 −１，１０−フェナントロリン、ブソラレン及び近ＵＶ及び可視領域の光を吸収する他の芳香族基のような化合物の誘導体である。

金属イオン、酸素及び還元剤の存在下で化学的に活性化しうるこれらの基はそれらに隣接して位置する核酸配列において開裂を誘導する。

基Ｂはαアノマー配置によりヌクレオチドの糖部分に結合された核酸塩基からなる。それにはチミン、アデニン、シトシン、グアニン又はウラシルがある。しかしながら、修正された、特にＩ＼ロゲン化又はアジ化された核酸塩基、例えば５ −ブロモウラシル又は８−アジドアデニン；２−アミノアデニンのようなアミノ化誘導体及び例えばＮ６においてアミノアルキレン基又はアジドフェニルアルキレン基で置換されたその誘導体；Ｏｅにおいて例えば（ω−アルキレン）−９− アクリジン基又は８−　（ω−アミノアルキル）アミノアデニンで置換されたグアニン及びω−ＮＨ２においてアクリジン基で置換されたその誘導体を用いることも可能である。

本発明によれば、通常の塩基及び修正塩基を導入しうる可能性が考えられる。相補β鎖と共有結合しうる“エフェクター”塩基も導入してよい。このため、４位におけるアジリジン基によるＣ又はＴの官能化は各々Ｇ及びＡ上における２本の相補鎖間で共有ＣＨ−ＣＨ２架橋の形成を生じる。

このため、更に具体的には、基Ｂはチミン、アデニン、シトシン、グアニン、４ −アジドシトシン、４−アジドチミン、８−アジドアデニン、ウラシル及び５− ブロモウラシルから選択される。

基Ｘは、それは好ましくはオキソ陰イオンを表すが、他の意味を有することもでき：基Ｘがアルキル基を表す場合に後者は好ましくはＣ−Ｃ７低級アルキル基、例えばエチル、メチル又はプロピル基であり：基Ｘがアルコキシ基を表す場合に後者は好ましくはＣ−Ｃ低級アルコキシ基、例えばメトキシ又はエトキシ基であり；Ｘがアミノアルキル又はアミノアルコキシ基を表す場合に後者は一置換もしくは二置換アミノアルキル基又は代わりに四級アンモニウム塩の形のアミノ基である。これらの条件下において、置換基は好ましくは前記のような低級アルキル基であり、アミノ基をリンに結合するアルキル又はアルコキシ鎖に関してそれは炭素原子１〜１０を有する直鎖又は分岐鎖であることが好ましい。アルキル又はアルコキシ基が含窒素へテロ環で置換されている場合、後者は特に四級化していてもよい窒素原子１つを含む飽和５−６員環である。最後に、基Ｘがチオアルキル基である場合、後者は低級チオアルキル基、即ち炭素原子１〜７を含む基であることが好ましい。

基−ａｌｋ−は炭素原子１〜１０を有する直鎖又は分岐鎖アルキレン基であることが好ましい。

特に、αオリゴマーの３−又は５″末端アルコール官能基から出発して、エフェクターはオリゴマーのグリコシド部分において別の性質の官能化Ｚ゛に結合された（ＣＨ２）。鎖により導入してもよい。

下記式：又は−〇−Ｚ’−（Ｃ）Ｉ　）　−エフェクター（Ｚ）ｎ５゜から出発して、Ｚ′で何が表されるかに応じて、例えば−下記式のホスフェート又はメチルホスホネートＵ−０、Ｎ又はＳ −下記一般式のエーテル３゛又は−ＭＣＨ←ＣＨ２ｉ　Ｚ５゛一下記一般式のエステル又は代わりに一下記一般式のカルバメート −Ｏ−＋ＧＯＮ）））−＋ＣＨ２→］−Ｚ。

が得られる。

本発明によれば、精製された又は混合物として、塩基もしくは酸との塩の形の前記化合物、ラセミ形又はＲもしくはＳ光学異性体の形の化合物も包含される。

本発明によれば、Ｄ又はＬ系の前記化合物も包含される。

本発明の態様では、α−オリゴデオキシヌクレオチドｅ、が用いられる。後者は式■においてＸ−０、Ｒ及びＲ″−Ｈ，ＢがＡ、ＣＳＴ及びＧから選択される：Ｌが酸素原子である化合物である。

本発明の主題は活性物質として前記化合物を含有した抗ウイルス医薬組成物、特にエイズウィルスＨＩＶＩのようなＲＮＡウィルスに起因するウィルス症状の治療に有用な組成物でもある。

最後に、本発明の主題は特にエイズの治療に有用な抗ウイルス医薬組成物の製造に関する本発明による化合物の用法である。

前記のように、本発明によるα−オリゴヌクレオチド化合物の適用はレトロウィルス複製、特にエイズのヒト免疫不全ウィルスＨＩＶＩの複製を阻害する。

ＨＴＬＶ−１１１ウイルス（ＨＴＬＶ　−ヒトＴ白血病ウィルス）又はエイズ関連ウィルス（Ａ　ＲＶ）としても知られるリンパ節症（ＬＡＶ）に関与するレトロウィルスは更に最近になりＨＩＶＩと命名され、エイズに関与する病原体として事実上認識されている。

ＲＮＡウィルス、特にエイズウィルスはより一般的には逆転写酵素としても知られるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を事実主要する増殖メカニズムを有している。この酵素はウィルスＲＮＡを、相補的と称される一本鎖ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）にコピーする。これを行うためには、コピーされるＲＮＡ鋳型の３−末端とペアになるオリゴヌクレオチドプライマーを見つけなければならない。

逆転写酵素はプロウィルス状態の確立、ウィルス複製の開始及び細胞で可能な形質転換のいずれのためにも必要である。

レトロウィルスにおいて、プライマーはピリオン内部に存在する細胞源のｔ　ＲＮＡである。特にウィルスが細胞に感染した場合、逆転写酵素（ＲＴ）はウィルスＲＮＡに結合し、リジン３−−ｔＲＮＡは合成されるＤＮＡに関して開始に役立つ。合成された鎖はプライマー溝でガイドされる。次いでこうして合成されたＤＮＡ鎖はＲＴに結合されたＲＮアーゼ活性の結果として一本鎖形であり、相補的ＤＮＡ鎖はＲＴのＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性により合成される。

宿主細胞のＤＮＡへの組込み前後におけるレトロウィルスの構造は以下のように略記される：ａ）宿主細胞のＤＮＡへのレトロウィルスの組込み□ウィルスＲＮＡ逆転写酵素１ゲノムＲＮＡ５’　Ｒ−０５−０１１−ＴＢＳ−ＮＯ−コード領域−ＮＣ−Ｐｕｒ−ＡＡ−Ｕ３−Ｒ３゜（ＲＮＡ）レトロウィルスのＲＮＡは、コード領域がウィルス複製及び発現に必須である配列で隣接された一本鎖ＲＮＡである。これらの配列は５′から３−末端にかけて以下からなるニーＲ（短鎖“リピート”）：翻訳が生じうる上で必要なＣＡＰ配列を、配列の開始部に含んだ５゛末端における短鎖配列（同様のヌクレオチドが３′末端で反復される） −Ｕ　：５−末端に唯一の配列（約８０ヌクレオチドからなる） −ＵＵ：２つのウラシルヌクレオチド −ＴＢＳ　（“ｔ　ＲＮＡ結合部位０）：これは複製時にプライマーとして機能しうるｔ　ＲＮＡの結合（その３′末端による）が生じる部位である。相補的かつ逆平行な結合部は約２０ｐｂを含む。

−ＮＣ：非コード配列一コード領域：これは中央に位置し、それは非常にわずかな遺伝子を含むだけである。

これらは： “ｇａｇ“　（“グループ特異性抗原″に関する）、即ち開裂された場合に核様体のタンパク質を生じるポリタンパク質についてコードするグループ抗原に関する遺伝子。これらの内部タンパク質のうち１つはグループの抗原性を有する。

逆転写酵素についてコードする“ｐｏ１″　（“ポリメラーゼ°に関する）及びエンベロープ糖タンパク質についてコードする“ｅｎｖ”　（″エンベロープ“ に関する）。これらのうち１つは各ウィルス血清型の抗原性を有する。

コード領域において、レトロウィルスに特異的なウィルスタンパク質（又はタンパク質セグメント）についてコードする遺伝子も存在することができる（例えば癌レトロウィルスにおいて、ｏｎｃ遺伝子がみられる。これは癌レトロウィルスでないエイズウィルスに関するものではない；それは細胞を癌化させないが、但しそれらを破壊する）。

−ＮＣ：非コード領域 −Ｐｕｒニブリン塩基に富む配列 −ＡＡ：２つのアデニンヌクレオチド −Ｕ　：３″末端に唯一の配舛（約３００ヌクレオチド） −Ｒ：３−末端における（短鎖“リピート１）１逆転写酵素の作用後におけるＤＮＡ：非組込みウィルスＤＮＡ３°ＴＴ−Ｕ　−Ｒ−Ｕ５−ＡＡ−ＴＢＳ−ＮＣ−コード領域−Ｎ　Ｃ−Ｐ　ｙ　ｒ　−Ｔ　Ｔ　−Ｕ　３−Ｒ−υ５−＾Ａ　５’ 逆転写酵素の作用後において、転写された二本鎖ＤＮＡ分子は対応ゲノムＤＮＡよりも長い。実際に、２末端において２配列が付加されているニー　Ｕ　３配列が５゛末端で加えられている−　Ｕ　ｓ配列が３′末端で加えられているアセンブリーＵ　−Ｒ−Ｕ５はＬＴＲ”　（長鎖末端リピート）と称される。２末端の各々に１つのＬＴＲが存在する。

１組込みウィルスＤＮＡ　（プロウィルス）二本鎖直鎖ＤＮＡは閉環ＤＮＡになり、しかる後再度開環されて、宿主細胞のＤＮＡに組込まれる。組込まれたウィルスＤＮＡは“プロウィルス″と称される。組込みに際して、転写ＤＮＡ　（及びＵ　又はＵ５の形成部分）の末端に位置するジヌクレオチド（ＴＴ、、ＡＡ）が除去される。

組込み部位における接合では以下を要するニー宿主ＤＮＡに関してプロウィルスとの接合に直接反復配列ＤＲ。

すべてのＤＲは鎖長４〜６ｂｐである。それらの配列は異なる。全く同一のプロウィルスのために、異なるＤＲが宿主細胞のＤＮＡで更にみられるべきである。

このためウィルスの組込み部位は特異的でなく、ウィルスはいくつかの異なる箇所で宿主のゲノムに組込むことができる。

−ウイルスＤＮＡに関して、レトロウィルスの末端に逆方向反復配列ＩＲ，２つの配列は一方が他方の逆向き及び相補の双方である場合に“逆方向リピート′と称される。

アンチセンスオリゴヌクレオチド、即ちリポソームにより合成されるタンパク質について直接コードするウィルスのメツセンジャーＲＮＡの一部に相補的なりＮＡ上セグメントエイズウィルスの複製に対抗する試みが行われてきた。

α−オリゴヌクレオチドはそれらに相補的なβ−オリゴヌクレオチドとへテロ二本鎖を形成しかつ後者はＲＮアーゼＨ酵素の基質でないという事実から、α−オ・リボヌクレオチドによるタンパク質発現の阻害はリポソームがｍ　ＲＮ　Ａをウィルスタンパク質に翻訳するのを妨げることでおそらく行えることが認識できた。

しかしながら、これで理解された実験は確定的でなかった。

逆に、ウィルスＲＮＡの開始配列、特にプロウイルスＲＮＡへのりジンｔ　ＲＮＡ結合の開始部位、に相補的なオリゴヌクレオチドを用いることを目的とした本発明によるアプローチは有効とわかった。

このため、本発明の主題は、配列がＨＩＶウィルスのプロウィルスＲＮＡのＰＢＳ配列の部位１８２−１９９に相補的であるα−オリゴヌクレオチドである。即ちα−オリゴデオキシヌクレオチドｄ　（ＡＣＣＧＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧ）”又は更に一般的には式％式％（リボデオキシリボヌクレオチドの場合Ｘ−Ｔ又はα−オリゴリボヌクレオチドの場合Ｘ−υ）又は一方でＸ及びＡ１他方でＣ及びＧを相互交換して相補的な配列である。

本発明の他の特徴及び利点は下記例から明らかになるであろう。

一図１は逆転写酵素活性（ｐｌ）＠）を調べることによるα−オリゴヌクレオチドｄ　（ＡＣＣＧＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧ）３°（α−５゜オリゴＰＢＳ”）でのＭＴ４細胞のウィルス産生の阻害について示す。

例１：α−オリゴヌクレオチドの細胞毒性用いられたオリゴヌクレオチドのタイプに関係なく、これらのオリゴヌクレオチドは最終的に細胞酵素で多少急速に分解される。α−オリゴヌクレオチド並びにそれらのα−ヌクレオシド及びα−ヌクレオチド異化代謝産物は細胞毒性を示さないことが以下で示されている。

このため、アプリオリ的にＭＴ−４細胞のゲノムにおけるいずれの部位に対するものでもないオリゴヌクレオチドａ−ｄ（ＣＣＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＴＡＣ）　、ａ−オリゴＴａｔは２５０ａｇ／ａｔ以上のＣＤ５ｏを有する。同様に、α− オリゴチミジレート、α−（ｄＴ）　（２≦ｎ≦１２）も同様の細胞系に関して無細胞毒性であることがわかった。

最後に、オリゴヌクレオチドのゆっくりとした加水分解から生じうるα−ヌクレオシド及びα−ヌクレオチドも様々な細胞系（Ｈｅ１ａ、　Ｖｅｒｏ、−次ウサギ腎臓細胞、ＭＴ　−４）に対して細胞毒性を有しない。

α−オリゴデオキシリボヌクレオチド及び成分ニットの細胞毒性（ヌクレオシド及びヌクレオチド） α−ｄＴ５−リン酸（α−ｄＴＭＰ）　）１２５０α−ｄ（ＣＣπｍＡＧ）　＞２５０ α−ｄ（ＴＴ）　）１００ α−ｄ（′ｍ１’）　＞１００ａ　−ｄ　（ＴｒＴＴＴｒ）　＞１００α−ｄｉπ貫江ＴＴ）　＞ｔｏ。

α−ｄ（π汀汀テテ汀）　＞１００１正常細胞の形態に関して顕微鏡検出可能な変化を生じるために要求される２細胞の５０％の死滅をおこすために要求される評価はＨＩＶＩウィルス感染後にＭＴ４細胞系におけるＨＩＶＩウィルスの細胞病原性効果の研究に基づいており、融合細胞の形成は感染後４〜６日目に観察され、しかる後ウィルス粒子の産生、続いて細胞の死滅がみられる。

免疫防御に必須である１４９２８球の破壊はＨＩＶ惑染に特徴的な免疫不全の主要原因である。このウィルスはそこで増殖することで細胞を殺すことが知られており、それがそれらから抜は出た箇所でそれは細胞膜にダメージを与える。ＨＩＶもおそらく感染細胞の膜上に存在するｇｐ１２０タンパク質を介して間接的に１４９２８球を殺すのであろう。実際に、１４９２８球はｇｐ１２０タンパク質が結合する表面分子ＣＤ４レセプターを有しており、健常な１４９２８球はタンパク質と結合して感染細胞と融合する。生じた細胞凝集物は生存しえない“融合細胞“であり、それが構成されるすべての健常な細胞は感染細胞と共に死ぬ。ＨＩＶは感染リンパ球に対して正常な免疫反応も誘発させることができる。抗体の助けで又はそれなしで、細胞毒性防御細胞は表面にウィルスタンパク質を有する感染細胞を破壊する。最後に、ｇｐ１２０タンパク質は感染体の血液中で溶液中遊離して時々循環しており、それは健常な細胞のＣＤ４レセプターと結合し、感染を促進して非感染細胞の破壊反応を誘発する。

融合細胞は単一細胞膜で囲まれたいくつかの細胞核から構成される構造体であり、それらは細胞培養においてＨＩＶによる感染のサインであって、融合細胞は、２２１２０分子を合成しそれをそれらの表面で輸送する感染細胞がＣＤ４分子を有する健常な細胞と融合した場合に生じる。

ｂ）試験される化合物 α−ｄ”　ＡＣＣＧＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧ　Ｏ、５４Ｕ無菌二重蒸留水中でＩ　Ｂ／ｓｌ含有し、−８０℃で貯蔵されたストック溶液。

ｃ）ＭＴ４試験最終継代後２日月のＭＴ４細胞を（９６ウエルマイクロプレートにおいて）化合物１００μｇ当たり３Ｘ１０５細胞の割合で化合物の連続希釈下３７℃で１時間ブレインキュベートする。

感染はＨＩＶＩウィルスの１０−４希釈液１００μｇを加えることによりマイクロウニルで行う（ウィルスの希釈倍率は４日間にわたり融合細胞の形成を誘導するように決定された）。

３７℃で１時間のインキュベート後、感染ＭＴ４細胞を選択された異なる希釈液の存在下において２４ウエルマイクロプレート中３×１０５細胞／曙１の濃度で培養維持する前に５回洗浄する。

３又は４日毎に、細胞を３又は４倍希釈し、更にα−オリゴＰＢＳの存在下でＲＰＭＩ培地、１０％ＦＣＳ。

１％ＰＳＮ、１％グルタ（Ｇｌｕｔａ）で３×１０５細胞１１の濃度に調整する。

２又は３日毎に、融合細胞の出現が培養中に観察される。

ｄ）逆転写酵素アッセイＭＴ４細胞のウィルス産生のモニターは培養中３又は４日毎に逆転写酵素活性（図１、ＲＴ）を調べることにより行う。簡単には、酵素活性は合成プライマー及び３Ｈで放射性同位元素標識された基質を用いて“インビトロ°で試験する。沈降してカウント／ｗｉｎで表示された放射性同位元素標識物質の量は逆転写酵素活性に比例しており、それ自体も感染ＭＴ４細胞で産生されるウィルスの量に比例している。

２、結果Ｄ３　Ｄ４　Ｄ５　Ｄ７　ＤＩＯＤｌｌ　Ｄ１２　０１４　０１８１００μｇ／ｉｔ　−−−−−−−−−−−（＋）　−（−）　（＋）＋＋　→に２５μｇ／ｉｆ　（＋）−（”）−（＋）−（”）（＋）　（＋）→　＋　←　＋　→　＋＋＋＋ＫＫｌＯμｇ／ｍｌ　−（＋）　（”）（”）　＋　←　＋＋＋＋　←＋＋　→→　＋＋＋−＋　→＋＋ＫＫ５μｇ７１１１　（＋）（＋）　＋　＋　＋＋＋　十＋＋＋　→　＋＋＋＋＋＋　→　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋＋＋１μｇ／ｍｌ　（＋）（＋）　（＋）（＋）　＋　（＋）　”　＋＋　→　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋　←　＋＋　＋＋　→　÷＋１００μｇ／ｍｌ　（＋）（＋）　（＋）　”　＋　＋＋　＋　＋＋　＋＋＋＋　＋＋＋＋　＋＋＋＋　＋＋＋＋　Ｋ　十＋５０μｇ／ｍｌ　（＋）（＋）　＋　＋＋　＋　＋＋　＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋＋＋　→　Ｋ１１１ｖｌ　（＋）（＋）　＋　＋　＋＋＋＋　＋＋＋＋　＋＋　十＋　＋＋＋＋　＋＋＋＋　４＋４−＋　Ｋ　Ｋ注釈ニー・融合細胞なしく＋）・融合細胞形成＋：融合細胞の出現 →・融合細胞Ｋ・細胞死滅３、結論 α−オリゴＰＢＳ”によるＭＴ４系でのＨＩＶＩウィルスの細胞病原性効果の阻害評価において、融合細胞の形成に関する遅延は１０〜１００μｇ／ｓｌの無毒性用量で観察され、１００μｇ／ｍｌの濃度で感染後１２日月末でこの遅延を伸ばすことができる。

同時に、感染ＭＴ４細胞によるウィルス産生のモニターでは、用いられたα−オリゴＰＢＳ”の用量に関係なくウィルス産生がＨＩＶＩウィルスの存在下で得られた場合よりも低く留まり、最大ウィルス産生ピークも遅れることを示している（図１）。

これらの結果は要約するとα−オリゴＰＢＳがＨＩＶ１ウィルスに関して抗ウイルス効果を有することを示しＨＩＶＩ　ＢＲＵで感染されオリゴヌクレオチド存在下で培養されたＣＥＭ細胞によるウィルス粒子の産生を逆転写酵素アッセイ（ｃｐｓ）でモニターする。

オリゴヌクレオチド“α−Ｔａｔ”はα−オリゴヌク５゛レオチドｄ　ＧＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＡＡＣＣＣＡＣ３°に相当する。それはエイズウィルスのＴａｔ遺伝子の配列と相補的である。

オリゴヌクレオチド“α−ランダム°はいずれのα−、？　リコヌクレ、ｔ　＋　）’　ｄ”’ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴにＡＣＴＧＡＣ”ニモ相当する。

逆転写酵素結果はカウント／ｗｉｎでランダムコントロールと比較したところ下記のとおりである。

オリゴヌクレオチド“α−ＰＢＳ”は１００μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌの濃度でウィルス産生の阻害を示す。

６．２５μｇノ腸１の濃度で、オリゴヌクレオチド“α−Ｔａｔ”は１１日ローウィルス産生を示していない。同様のことが３．１でランダムにもあてはまる。

これらの結果は要約すると、オリゴヌクレオチド“α−ＰＢＳ’が１００μｇ／ ■１及び５０μｇｅｍ　ｌの濃度でＨＩＶ１ウィルスに対して抗ウイルス効果を有するが、一方オリゴヌクレオチド“α−Ｔａｔ”及びオリゴヌクレオチド“α −ランダム”が全く抗ウイルス効果を有しないことを示している。

（ｃｏｍ）国際調査報告国際調査報告ＦＲ９０００４１２Ｓ＾　３７９５８

Claims

【特許請求の範囲】

１．レトロウィルスの複製を阻害する上で有用なオリゴヌクレオチド化合物であって、非天然αアノマー配置のオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチド配列からなり、その配列がＴＢＳ配列又はウィルスＲＮＡから上流の配列、特にＣＡＰ配列中に含まれるウィルスＲＮＡの開始配列と相補的であることを特徴とするオリゴヌクレオチド化合物。
２．更にエフェクター剤に共有結合されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
３．化合物が下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼［Ｉ］〔上記式中：基Ｂは同一でも又は異なっていてもよく、各々が場合により修正されて非天然α アノマー配置に従いグリコシド環に結合された核酸塩基を表す；基ＢはＴＢＳ配列又はウィルスＲＮＡから上流の配列中における配列の標的オリゴヌクレオチド塩基に逐次的と考えられるが相補的である；基Ｘは同一でも又は異なっていてもよく、各々がオキソ陰イオンＯ■、チオ陰イオンＳ■、アルキル基、アルコキシもしくはアリールオキシ基、アミノアルキル基、アミノアルコキシ基又はチオアルキル基を表す；Ｒ及びＲ′は同一でも又は異なっていてもよく、各々が水素原子又は基−Ｙ−Ｚを表す；Ｙは直鎖もしくは分岐鎖アルキレン基−ａｌｋ−又は▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲ 数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼（Ｕ＝Ｏ、Ｎ又はＳ）から選択される基又は代わりに基−Ｙ′′−Ｏ−Ｙ′（Ｙ′′ 又はＹ′はＹに関して示された意味を有する）を表す；ＥはＸと同様の意味を有する；Ｊは水素原子又はヒドロキシル基を表す；Ｚはエフェクター剤に相当する基である；ｎは０を含む整数である；Ｌは酸素原子、イオウ原子又は−ＮＨ−基を表す〕である、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
４．エイズウィルスＨＩＶの複製の阻害に有用であって、配列がウィルスのプロウィルスＲＮＡの部位１８２−１９９に相補的であり、即ちα−オリゴヌクレオチドＡＣＣＧＣＧＧＧＣＸＸＧＸＣＣＣＸＧ（Ｘ＝Ｔ又はＵ）又は一方でＸ及びＡ、他方でＣ及びＧを相互交換したその相補的な配列を含んでいる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
５．化合物が式ＩにおいてＸ＝Ｏ■；Ｊ、Ｒ、Ｒ′＝Ｈ；ＢはＡ、Ｃ、Ｔ及びＧから選択され；Ｌは酸素原子であるα−オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
６．活性物質として請求項１〜５のいずれか一項に記載された化合物を含有することを特徴とする抗ウィルス医薬組成物。
７．エイズの治療に有用な医薬組成物であって、活性物質としてαアノマー配置ｄ５′（ＡＣＣＧＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧ）３′のオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする医薬組成物。
８．ＲＮＡウィルスに起因するウィルス感染の治療に有用であって、活性物質として請求項１〜５のいずれか一項に記載された化合物を含有した医薬組成物の製造に関する請求項１〜５のいずれか一項に記載された化合物の用法。
９．エイズの治療に有用な医薬組成物の製造に関する、請求項８に記載の用法。
１０．エイズの治療に有用な医薬組成物の製造に関するα−オリゴヌクレオチドｄ５′（ＡＣＣＧＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧ）３′の用法。