JPH0578386A - 新規な抗ｈｉｖ剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus；ヒ
ト後天性免疫不全ウイルス；エイズウイルス）の遺伝子
中の主な蛋白質をコードするシーケンス（例えばgag,po
l,vif,vpr,tat,rev,env,nef,LTRなど）の全部又は一部
に対して相補的なオリゴヌクレオチド（すなわちアンチ
センス ＤＮＡ）を作り、その燐酸エステル部を化学修
飾してホスホロチオエートとした、下記一般式［Ｉ］で
示されるＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオ
キシリボヌクレオシドホスホロチオエート類、及びその
製造方法並びにこれを有効成分とする抗エイズウイルス
剤。 【効果】 毒性が少なく、抗ウイルス作用の優れた化合
物およびこれを用いたエイズ治療薬を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＨＩＶ（Human Immuno
deficiency Virus；ヒト後天性免疫不全ウイルス；エイ
ズウイルス）の遺伝子中の主な蛋白質をコードするシー
ケンス（例えば gag,pol, vif,vpr,tat,rev,env,nef,LT
R など）の全部又は一部に対して相補的なオリゴヌクレ
オチド（すなわちアンチセンス ＤＮＡ）を作り、その
燐酸エステル部を化学修飾してホスホロチオエートとし
た、下記一般式［Ｉ］で示されるＨＩＶ遺伝子に対する
アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロ
チオエート類、及びその製造方法に関するものであり、
かつこの製造方法によって合成されたＨＩＶ遺伝子に対
するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホス
ホロチオエート類を有効成分とする抗エイズウイルス剤
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】抗エイズ薬としては、現在唯一の認可薬
であるＡＺＴ（アジドチミジン） ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 7096 (1985)］や臨
床薬であるｄｄＩ（ジデオキシイノシン）［Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 82 1911(1986)］などが良く知られ
ている。また、ｄＣＳ₂₈（シチジンのオリゴホスホロチ
オエート 28mer） ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 7706 (1987)］に
は、in vitroで抗ＨＩＶ効果があることが知られてい
る。さらに、オリゴリボヌクレオチド誘導体のホスホロ
チオエート体の一部が抗エイズウイルス活性を有すると
いう報告がある（特開平3-128391号公報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＡＺＴやｄｄＩは、ジ
デオキシヌクレオシドとよばれる化合物群に属する核酸
誘導体である。ジデオキシヌクレオシドの作用機構は、
レトロウイルスの逆転写酵素に直接作用し、拮抗阻害効
果とチェーン・ターミネーション効果によって抗ウイル
ス効果を発現する。したがって、これらの化合物は逆転
写酵素阻害剤であると言える。一方、エイズウイルス
（ＨＩＶ）の複製サイクルの中には、多くのウイルス特
異的な蛋白質とそれに関連した段階が存在する。そして
これらの複製サイクルの諸段階やウイルス特異的な蛋白
質は、抗ウイルス剤を開発する側から見れば絶好のター
ゲットであると言える。

【０００４】ウイルス特異的な過程（段階）とは、例え
ば １．ウイルスの標的細胞への吸着（Adsorption） ２．細胞内部への浸透（ Penetration） ３．ウイルス粒子の脱核（ Uncoating） ４．ウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写（ Reverse T
ranscription） ５．細胞遺伝子上へのウイルスＤＮＡの組み込み（ Int
egration） ６．ウイルスＲＮＡの複製（ Replication） ７．ウイルスＲＮＡからウイルス蛋白への翻訳（ Trans
lation） ８．ウイルスの調節蛋白による活性化（ Transactivati
on） ９．ウイルス蛋白によるウイルスＲＮＡの修飾（Assemb
ly） 10．ウイルス粒子の出芽（ Budding）などが挙げられ
る。

【０００５】また、エイズウイルスに特異的な蛋白質と
しては、例えば、 ア．糖蛋白（gp-120） イ．逆転写酵素 （ＲＴ；reverse transcriptase, and RNase Ｈ；ribo
nuclease H） ウ．ＨＩＶの遺伝子発現を活性化する蛋白質 （ｔａｔ；trans-acting transcriptional activator） エ．ウイルス粒子蛋白発現の調節因子 （ｒｅｖ；regulator of expression of virion protei
n ） オ．蛋白質切断酵素プロテアーゼ（ｐｒｏ；protease） などが挙げられる。

【０００６】先に述べたＡＺＴやｄｄＩは、段階として
は４の逆転写の段階を、そして蛋白質としては、イの逆
転写酵素を阻害する抗ウイルス剤である。しかし上記に
見られるように、ウイルスを攻略できる可能性のあるポ
イントはまだまだいくつもあり、ＡＺＴやｄｄＩなどの
ジデオキシヌクレオシド類では効果の発現できない段階
や酵素をターゲットとする薬剤を開発することは非常に
意義があり、かつ重要である。このように従来の薬には
見られない、異なる作用を持つ薬が開発できれば、例え
ばＡＺＴなどと併用療法をすることによりお互いの投薬
量を減らしたり、単独投与では見られない相乗効果が期
待できる。なおＡＺＴは in vitro のみならず、 in vi
voや臨床の場においてもその効果を発現する優れた抗エ
イズ薬であるが、最近ＡＺＴの持つ副作用（骨髄毒性な
ど）が問題となっており、その意味からもＡＺＴとは異
なった作用点を持つ薬の開発は、緊急かつ重要である。

【０００７】本発明の目的は、新しい効能を有する新規
な抗ウイルス剤と、その合成方法を提供することにあ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＨＩＶ（Huma
n Immunodeficiency Virus；ヒト後天性免疫不全ウイル
ス；エイズウイルス）の遺伝子中の主な蛋白質をコード
するシーケンス（例えば gag,pol, vif,vpr,tat,rev,en
v,nef,LTR など）の全部又は一部に対して相補的なオリ
ゴヌクレオチド（すなわちアンチセンス ＤＮＡ）を作
り、その燐酸エステル部を化学修飾してホスホロチオエ
ートとした、ＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴ
デオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類が、抗
ＨＩＶ作用を有することを見いだしたことに基づいてい
る。

【０００９】本発明は、上記の下線部で説明されるＨＩ
Ｖ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌク
レオシドホスホロチオエート類のうち、少なくとも一種
類を有効成分として含有することを特徴とする新規な抗
ＨＩＶ剤及びその製造方法に関するものである。

【００１０】また本発明は下記一般式［Ｉ］で示される
オリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類 ［式中ｍは１〜50の整数を表し、ＢはＢ₂ からＢ_m+1 ま
でのいずれかを表し、（すなわちＢ＝Ｂ₂ ，Ｂ₃ ，Ｂ₄
………Ｂ_m ，Ｂ_m+1 ）Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 は相互に同一又は異
なっており、それぞれ、ヒポキサンチン-9- イル，グア
ニン-9- イル，アデニン-9- イル，シトシン-1- イル，
ウラシル-1- イル，チミン-1- イルのいずれかを表して
いる。ただし、Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 のそれぞれは、部分的に同
一であっても一向にかまわないが、全て同一であること
は無い。即ち、一般式［Ｉ］において以下の６つの場合
は除かれる。 ア．Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 が全てヒポキサンチル-9- イルである
場合 イ．Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 が全てグアニン-9- イルである場合 ウ．Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 が全てアデニン-9- イルである場合 エ．Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 が全てシトシン-1- イルである場合 オ．Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 が全てウラシル-1- イルである場合 カ．Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 が全てチミン-1- イルである場合］ およびこれを含有する抗ＨＩＶ剤、並びにトリクロロ酢
酸で脱トリチル化処理を行なった、チミジン（あるいは
２´−デオキシアデノシン，２´−デオキシグアノシ
ン，２´デオキシシチジン，２´−デオキシウリジン，
２´−デオキシイノシン）が導入されたロングアルキル
アミノＣＰＧ（コントロールドポアガラス）に、目的シ
ーケンスに適う塩基を持つホスホロアミダイトユニット
（例えば、ｄ−ＤＭＴｒＡ^bzｐ，ｄ−ＤＭＴｒＣ^anｐ，
ｄ−ＤＭＴｒＧ^ibu ｐ，ｄ−ＤＭＴｒＴｐ，ｄ−ＤＭＴ
ｒＩｐ，ｄ−ＤＭＴｒＵｐなど）を30〜50当量と、1H-
テトラゾール 150当量とを加えて縮合反応させ、続いて
硫黄により酸化反応を行ない燐酸エステル部に硫黄を導
入することよりなる一連の操作をｎ−１回（ただし、ｎ
は目的鎖長を表す）繰り返すことによって合成する、ホ
スホロアミダイト法を用いるアンチセンスオリゴデオキ
シリボヌクレオシドホスホロチオエート類の合成方法
［ただし、上記のホスホロアミダイトユニットとは、た
とえば以下に示す構造をしている化合物かあるいはその
誘導体のことである。 （ここで、ｂｚはベンゾイル基，ａｎはアニソイル基，
ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基，ＮＣＥｔはシアノエ
チル基，ｉ−Ｐｒ₂ Ｎはジイソプロピルアミノ基をそれ
ぞれ表している）］に関するものである。

【００１１】本発明において、本発明の新規な抗ＨＩＶ
剤であるＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオ
キシリボヌクレオシドホスホロチオエート類を合成する
際に用いている試薬類は、全て既に市販の試薬を用いて
いるが、必要であれば容易に入手可能な化合物を良く知
られていて簡単な手法によって、誘導した後に用いても
差しつかえ無い。

【００１２】

【作用】以下に、本発明のＨＩＶ遺伝子に対するアンチ
センスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエ
ート類の抗ＨＩＶ効果について説明する。

【００１３】本発明のＨＩＶ遺伝子に対するアンチセン
スオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート
類の抗ＨＩＶ効果は、エイズウイルス（ＨＩＶ）の複製
サイクルを以下のように分類した場合には、６のウイル
スＲＮＡの複製(Replication）を主に阻害するものであ
ると言える。 １．ウイルスの標的細胞への吸着（Adsorption） ２．細胞内部への浸透（ Penetration） ３．ウイルス粒子の脱核（ Uncoating） ４．ウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写（ Reverse T
ranscription） ５．細胞遺伝子上へのウイルスＤＮＡの組み込み（ Int
egration） ６．ウイルスＲＮＡの複製（ Replication） ７．ウイルスＲＮＡからウイルス蛋白への翻訳（ Trans
lation） ８．ウイルスの調節蛋白による活性化（ Transactivati
on） ９．ウイルス蛋白によるウイルスＲＮＡの修飾（Assemb
ly） 10．ウイルス粒子の出芽（ Budding）

【００１４】ただし、上記の段階の１〜10は、一連のサ
イクルであるので、当然のことながら、結果として６の
Replication以下の段階（即ち、Replication,Translat
ion,Transactivation,Assembly,Budding）は阻害され
る。

【００１５】見方を変えれば、本発明のＨＩＶ遺伝子に
対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホ
スホロチオエート類は、ＨＩＶがプロウイルスとしてヒ
トの細胞の遺伝子中に組み込まれた後、その増殖を押さ
えることのできる抗ＨＩＶ剤である。したがって本発明
のＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシリ
ボヌクレオシドホスホロチオエート類は、ＨＩＶに対す
る感染の予防だけではなく、感染後の患者にも有効な新
しいタイプの抗ＨＩＶ剤であると言える。このことは、
ＡＺＴのようなジデオキシヌクレオシド類が、ＨＩＶが
プロウイルスとして組み込まれる前の段階（逆転写の段
階）を阻止する抗ＨＩＶ剤であるのとは、明らかに異な
っている。

【００１６】効果の発現する段階が異なっていると言う
ことは、副作用を押えての同時投与を可能にし、ＨＩＶ
によって引き起こされる種々の症状に対し、よりフレキ
シブルに対応できる道を開くものである。

【００１７】さてＨＩＶの遺伝子上には、種々のウイル
ス蛋白をコードしているシーケンスが見られる。それら
は例えば、 gag,pol,vif,vpr,tat,rev,env,nef,LTRなど
である。これらのシーケンスはいずれも本発明のＨＩＶ
遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレ
オシドホスホロチオエート類の対象になることができ
る。ただし、上記の各種シーケンスの中で、ｔａｔやｒ
ｅｖなどの調節蛋白をコードする遺伝子のアンチセンス
オリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類
は、ウイルスの複製による遺伝子の突然変異の影響を受
けにくく、より高い抗ＨＩＶ効果が期待できる。

【００１８】また、本発明の、ＨＩＶ遺伝子に対するア
ンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチ
オエート類の長さは、その使用目的に応じて自由に選ぶ
ことができるが、合成の簡便さ，変異に対する適応性
（追従性），細胞内への浸透性，精製の容易さ，薬剤の
安定性，長さと効能の相関関係より生じるコスト・パフ
ォーマンス等、を考え合わせると、ヌクレオシド-5'-1-
燐酸を一単位として数えてその50量体まで（すなわちヌ
クレオシドで数えて 50mer以内）が用いうるが、その中
でも20量体（ 20mer）までがより適当である。

【００１９】また、本発明の、ＨＩＶ遺伝子に対するア
ンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチ
オエート類は、その部分構造としてホスホロチオエート
結合を持っている。このホスホロチオエート結合とは通
常のＲＮＡやＤＮＡ中に見られる燐酸結合を化学的に修
飾し、硫黄官能基を導入したものであり、生体内の各種
酵素などで切断されにくい構造となっている。従って、
分解等の阻害を受けること無く目的とする、活性を発現
するための場所へ運ばれることができる。

【００２０】これに対し、通常のアンチセンス鎖［Zame
cnicら Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 75 280 (1978)］
では、燐酸結合であるため生体内の分解を受けやすい。

【００２１】既に何度も述べて来たように、ＨＩＶ遺伝
子に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシ
ドホスホロチオエート類は、本発明が最初のものであ
る。

【００２２】ただし、構造的に似た骨格を持つ化合物と
して、松倉らが報告しているｄＣＳ₂₈（デオキシシチジ
ン・ホスホロチオエートの 28mer）が知られている［Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7706 (1987) ］松倉ら
のｄＣＳ₂₈はデオキシシチジン（2'-deoxycytidine）を
ホスホロチオエート結合で繋いだ28量体であり、いわ
ば、オリゴデオキシシチジンホスホロチオエート 28mer
ともいうべき化合物である。

【００２３】本発明のＨＩＶ遺伝子に対するアンチセン
スオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート
類と松倉らのｄＣＳ₂₈とは、その分子内にホスホロチオ
エート結合を有することで類似点がある。しかし、その
発想・思想の段階から効果・作用点に至るまで、全く異
なっている。

【００２４】最も大きな相違点は、その全体の構造（す
なわちシーケンス）である。本発明のＨＩＶ遺伝子に対
するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホス
ホロチオエート類は、ＨＩＶ（Human Immunodeficiency
Virus；ヒト後天性免疫不全ウイルス；エイズウイル
ス）の遺伝子中の主な蛋白質をコードするシーケンス
（例えば gag,pol,vif,vpr,tat,rev,env,nef,LTRなど）
の全部又は一部に対して相補的なオリゴヌクレオチド
（すなわちアンセンス ＤＮＡ）を作り、その燐酸エス
テル部を化学修飾してホスホロチオエートとした、ＨＩ
Ｖ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌク
レオシドホスホロチオエート類である。従って、本発明
のＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシリ
ボヌクレオシドホスホロチオエート類は、ＨＩＶの主な
蛋白をコードするシーケンスには完全に“相補的”にな
っている。従ってＨＩＶの主な蛋白をコードするシーケ
ンスに対し、“特異的”かつ“位置選択的”に結合して
ウイルス蛋白の合成を阻害し、結果としてＨＩＶの増殖
を抑制する。

【００２５】例をあげれば、ＨＩＶ遺伝子のうちｔａｔ
に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシド
ホスホロチオエートである、以下に示すシーケンスであ
らわされる本発明の化合物 ［ただし、Ｔ；２´−デオキシチミジン（あるいは単に
チミジン），Ｃ；２´−デオキシシチジン，Ｇ；２´−
デオキシグアノシン，Ａ；２´−デオキシアデノシンで
あり、ｐ_s は、ホスホロチオ酸（phosphorothioic aci
d）による燐酸エステル結合をを表している。］は、Ｈ
ＩＶの１０ｋｂにおよぶ遺伝子のうち 5348 から 5367
番目の遺伝子コード（ｔａｔという調節蛋白質をコード
しているシーケンスのうちの一部分）である、ＣＣＡＵ
ＵＵＵＣＡＧＡＡＵＵＧＧＧＵＧＵという構造に完全に
“相補的”であり、この部分に特異的に結合して二重鎖
を形成し、ＨＩＶ遺伝子の発現を抑制する。

【００２６】即ち、このＣＣＡＵＵＵＵＣＡＧＡＡＵＵ
ＧＧＧＵＧＵという構造は、ＨＩＶの遺伝子の中の特に
ｔａｔという特種な蛋白をコードする遺伝子断片に特種
なものであるので、おなじＣＣＡＵＵＵＵＣＡＧＡＡＵ
ＵＧＧＧＵＧＵという構造を、その遺伝子中に持つ可能
性が殆ど無いことが予想されるヒトの遺伝子には、なん
ら相互作用をもたらさない。即ち、ヒトのゲノム中には
結合しない。従って副作用は少なく、抗ＨＩＶ選択性は
非常に高い理想の薬であるといえる。

【００２７】一方、先に述べたｄＣＳ₂₈は、デオキシシ
チジンの繰り返し単位であるので、本発明のＨＩＶ遺伝
子に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシ
ドホスホロチオエート類に見られるような、ＨＩＶの遺
伝子に対する高い選択性は期待できない。このことはｄ
ＣＳ₂₈のＨＩＶ遺伝子に対する結合力や選択性の弱さを
予想させるだけでなく、ヒトの遺伝子にも無作為に結合
する危険性を秘めていることを物語っている。従って、
当然副作用も増大し、薬としての治療係数も（ｄＣＳ₂₈
は本発明のＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデ
オキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類に比べ
て）低下する。

【００２８】さらに、柴原らの開示（特開平3-128391号
公報）によれば、オリゴリボヌクチオチド誘導体のホス
ホロチオエート体の一部が、抗ＨＩＶ活性を示すとある
が、この化合物は、リボヌクレオシドを単位部分構造と
するものであり、本発明の2'- デオキシリボヌクレオシ
ドを部分単位構造とするアンチセンスオリゴデオキシリ
ボヌクレオシドホスホロチオエート類とは本質的に、全
く異なっている。また、その作用の点でも大きく異なっ
ている。例えば、柴原らの開示（特開平3-128391号公
報）によれば彼らの化合物は１〜３μＭの濃度から抗Ｈ
ＩＶ効果がありとされているが、本発明のＨＩＶ遺伝子
に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシド
ホスホロチオエート体は、 1.0〜 5.0×１０^-3μＭの濃
度で、既に著しい効果が見られる。さらに５〜６μＭ以
上の濃度でも毒性はみられない。このことはそれぞれの
化合物の作用機構，抗ウイルス効果，薬としての可能性
などが、全く異なっていることを示すものである。

【００２９】以上のべてきたように、本発明のＨＩＶ遺
伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオ
シドホスホロチオエート類は、ＨＩＶ（Human Immuno-d
eficiency Virus；ヒト後天性免疫不全ウイルス；エイ
ズウイルス）の遺伝子中の主な蛋白質をコードするシー
ケンス（例えば gag,pol,vif,vpr,tat,rev,env,nef,LTR
など）の全部又は一部に対して相補的なオリゴデオキ
シリボヌクレオシドホスホロチオエート類であるため
に、従来の抗ＨＩＶ剤には見られない高い選択性と低毒
性を兼ね備えた、新しいタイプの抗ＨＩＶ剤である。

【００３０】また、本発明のＨＩＶ遺伝子に対するアン
チセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオ
エート類は、ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus；
ヒト後天性免疫不全ウイルス；エイズウイルス）の遺伝
子中の主な蛋白質をコードするシーケンス（例えば ga
g,pol,vif,vpr,tat,rev,env,nef,LTRなど）のいずれの
シーケンスに対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌ
クレオシドホスホロチオエートであっても良い抗ＨＩＶ
活性を示すが、特にｔａｔあるいはｒｅｖなどの調節蛋
白質をコードする遺伝子は、変異の可能性も少ないた
め、ｔａｔあるいはｒｅｖなどの調節蛋白質をコードす
る遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌク
レオシドホスホロチオエートが、より高い抗ＨＩＶ活性
を発現するためには適当である。

【００３１】この中でも、特に以下に示す化合物が、高
い抗ＨＩＶ活性を示す。即ち、その化合物とは、 ａ）ＨＩＶ遺伝子のｒｅｖ領域に対するアンチセンスオ
リゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類の
うち、以下に示すシーケンスで表される化合物。 ［ただし、ｄはこのシーケンスの単位構造がデオキシヌ
クレオシドユニットよりなっていることを示し、Ｔ；２
´−デオキシチミジン（あるいは単にチミジン），Ｃ；
２´−デオキシシチジン，Ｇ；２´−デオキシグアノシ
ン，Ａ；２´−デオキシアデノシンであり、ｐ_s は、そ
のＴ，Ｃ，Ｇ，Ａのそれぞれの５´位と３´位の水酸基
をホスホロチオ酸による燐酸エステル結合すなわち を表している。］

【００３２】ｂ）ＨＩＶ遺伝子のｔａｔ領域に対するア
ンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチ
オエート類のうち、以下に示すシーケンスで表される化
合物。 ［ただし、ｄはこのシーケンスの単位構造がデオキシヌ
クレオシドユニットよりなっていることを示し、Ｔ；２
´−デオキシチミジン（あるいは単にチミジン），Ｃ；
２´−デオキシシチジン，Ｇ；２´−デオキシグアノシ
ン，Ａ；２´−デオキシアデノシンであり、ｐ_s は、そ
のＴ，Ｃ，Ｇ，Ａのそれぞれの５´位と３´位の水酸基
をホスホロチオ酸による燐酸エステル結合すなわち を表している。］などが挙げられる。

【００３３】本発明に関わるＨＩＶ遺伝子に対するアン
チセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオ
エート類は、市販の化学試薬を用いて容易に合成するこ
とができる。

【００３４】以下に本発明中で用いた、本発明のＨＩＶ
遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレ
オシドホスホロチオエート類の合成方法を示す（表１お
よびフローチャート）。

【００３５】

【表１】オリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオ
エートの合成サイクル 段階 試薬又は溶剤 量（ml） 時間(min) 作業回数 １ 3% ＴＣＡ in ＣＨ₂ Ｃｌ₂ １ ×２ ２ ＣＨ₂ Ｃｌ₂ １ ×３ ３ ＣＨ₃ ＣＮ ２ ×３ ４ vacuum １０ ５ Phosphoramidite unit (30eq.) ６ vacuum, Ｎ₂ atmosphere １０ ７ 1H-tetrazole (150eq.) in 0.45 ２０ ＣＨ₃ ＣＮ ８ ＣＨ₃ ＣＮ ２ ×３ ９ Ａｃ₂ Ｏ/Lutidine/THF ＝ 1/1/8 0.25 7% ＤＭＡＰ in ＴＨＦ 0.25 ２ 10 ＣＨ₃ ＣＮ ２ 11 ＣＳ₂ /Pyridine ＝ 1/1 ２ ×２ 12 5% Ｓ₈ in ＣＳ₂ / １５ Pyridine/ Ｅｔ₃ Ｎ ＝12/12/1 13 ＣＳ₂ /Pyridine ＝ 1/1 ２ ×４ 14 ＣＳ₃ ＣＮ/Pyridine ＝ 1/1 2.5 ×３ 15 ＣＨ₃ ＣＮ ２ ×３ 16 ＣＨ₂ Ｃｌ₂ １ ×３ 17 ヌクレオチドシーケンスが完全となるまで段階１〜16を繰返す。

【００３６】 合成サイクルのフローチャート

【００３７】すなわち、グラスフィルターのついたガラ
ス反応管に、チミジン（あるいは2'- デオキシアデノシ
ン，2'- デオキシイノシン，2'- デオキシシチジン，2'
-デオキシウリジン，2'- デオキシグアノシン）が導入
されたロングアルキルアミノＣＰＧ（コントロールドポ
アガラス，英国エトレクトロヌクレオニック社製）（３
μmol ，担持量18μmol/g)を入れ、３％トリクロロ酢酸
−塩化メチレン溶液で脱トリチル化反応後、塩化メチレ
ン，アセトニトリルの順に良く洗浄を行なう。そしてＣ
ＰＧを減圧乾燥させた後、目的シーケンスに適う塩基を
持つホスホロアミダイトユニット（ｄ−ＤＭＴｒＡ
^bzｐ，ｄ−ＤＭＴｒＣ^anｐ，ｄ−ＤＭＴｒＧ^ibu ｐ，ｄ
−ＤＭＴｒＴｐ，ｄ−ＤＭＴｒＵｐ，ｄ−ＤＭＴｒＩ
ｐ）（30〜45eq，米国ＡＢＩ社製）と、1H- テトラゾー
ル（ 150eq）のアセトニトリル溶液0.45mlを加え、20分
間の縮合反応を行なった。反応管をアセトニトリルで洗
浄した後、反応管へ無水酢酸：2,6-ルチジン：無水ＴＨ
Ｆ＝１：１：８（ v/v），ＤＭＡＰ：無水ＴＨＦ＝７：
93（ v/v）を加え、未反応の末端5'- 水酸基のキャッピ
ング（未反応化合物の5' 末端水酸基をアセチル化し、
次の洗浄操作などにより取り除きやすくなる操作）を行
なう。ふただびアセトニトリルで洗浄し、続いて五価の
リン酸誘導体として生体における基本的かつ安定な状態
とするために、イオウによって酸化反応を行なった。

【００３８】全ての燐酸基を硫黄酸化処理するために各
縮合反応・キャッピング操作終了後に反応管中に５％硫
黄を含む二硫化炭素：無水ピリジン：無水トリエチルア
ミン＝12：12：１（ v/v）を入れ、15分間の硫黄酸化操
作を行なった。ただし、雰囲気を整えてイオウ酸化が充
分に進行し、かつまた次回の縮合反応に影響をおよぼさ
ないように、硫黄酸化の前後で二硫化炭素：無水ピリジ
ン＝１：１（ v/v）によって充分な洗浄を行ない、残留
硫黄を除去する必要がある。以上の硫黄酸化処理によ
り、ホスファイト体をホスホロチオエート体へと変換し
た。次に無水アセトニトリル：無水ピリジン＝１：１
（ v/v），無水アセトニトリル，無水塩化メチレンの順
で良く洗浄する。この一連の操作をｎ−１回（ただしｎ
は目的鎖長を表す）繰り返すことによって目的プローブ
の合成を行なった（Table １）。なお洗浄においては、
圧搾空気により乾固させた後、次のステップに進んだ。

【００３９】得られた目的鎖長（ｎ量体）の脱保護は、
28％アンモニア水で60℃，６時間油浴を用いて処理する
と、生成物がＣＰＧから脱離してくる。と同時に、この
条件でインター・ヌクレオチド部位及び塩基部位の脱保
護が行なわれる。次に、ＤＭＴｒ基の結合したものだけ
を分離するためにアセトニトリル20〜50％を含むＴＥＡ
Ａ（トリエチルアミンアンモニウムアセテート）溶出溶
媒により、このＤＭＴｒ基を含むオリゴマーを80％酢酸
水溶液で室温下15分間処理して脱トリチル化を行う。反
応生成物を20％アセトニトリルを含むギ酸アンモニウム
水溶液（pH 6.8，0.38〜0.36Ｍ）のグラディエント溶媒
で、イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫ gel DEAE-2SW ，東ソ
ー製）を用いて、燐酸部の解離数によって単離精製し、
目的とするアンチセンスオリゴデオキシホスホロチオエ
ートを合成した。

【００４０】こうして得られたアンチセンスオリゴデオ
キシホスホロチオエート類は、以下のようにしてその構
造確認をすることができる。すなわち、各合成オリゴマ
ーの水溶液中にヨウ素−ピリジン溶液を加え、60分間室
温下に静置して、ホスホロチオエート結合をホスフェー
ト体へと置換した後、このオリゴマーをヘビ毒ホスホジ
エステラーゼ及びアルカリ性ホスホターゼ（いずれもシ
グマ社製）によって酵素分解を行った。その分解生成比
（ｄＣ：ｄＧ：Ｔ：ｄＡ）が、ＨＩＶ遺伝子の中の目的
とする遺伝子断片の分解物と同等の比となっていること
から、目的のシーケンスが得られたと判断した。

【００４１】以上述べてきたように、本発明の合成方法
によれば、市販の容易に入手可能な試薬を用いて、簡単
な手法によって本発明に関わる新規抗ＨＩＶ剤、即ち、
ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus；ヒト後天性免
疫不全ウイルス；エイズウイルス）の遺伝子中の主な蛋
白質をコードするシーケンス（例えば gag,pol,vif,vp
r,tat,rev,env,nef,LTR など）の全部又は一部に対して
相補的な、ＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデ
オキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類を合成す
ることができる。

【００４２】

【実施例】以下に実施例に従い、本発明をさらに詳細に
説明する。ただし、下記の実施例は説明のためにのみ示
すものであって、如何なることがあっても本発明の範囲
を制限する意図は無い。

【００４３】（１）製造例 製造例１．ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus）の
ｒｅｖ領域のアンチセンスオリゴマー20量体の合成

【００４４】ＨＩＶのウイルスゲノムのうち、5550から
5569にいたるシーケンス、すなわち塩基の配列で表す
と、ＡＵＧＧＣ ＡＧＧＡＡ ＧＡＡＧＣ ＧＧＡＧＡ
というシーケンスに対する、アンチセンスオリゴデオキ
シリボヌクレオシドホスホロチオエート ［ただし、Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ａはそれぞれチミジン，デオキ
シシチジン，デオキシグアノシン，デオキシアデノシン
であり、ｐ_s はホスホロチオ酸による燐酸エステル結合
を表している。］を以下のようにして合成した。

【００４５】（ｉ）塩基部およびインターヌクレオチド
部位に保護基を有するアンチセンスオリゴマー20量体の
合成

【００４６】［操作Ｉ］ グラスフィルターのついた内
径20mmのガラス反応管に、チミジンが導入されたロング
アルキルアミノＣＰＧ（コントロールドポアガラス，英
国ヌクレオニック製）（83mg，３μmol)を入れ、３％ト
リクロロ酢酸の塩化メチレン溶液（１ml×２）により脱
トリチル化を行い、無水塩化メチレン（１ml×３）で洗
浄する。さらにアセトニトリル（２ml×３）で洗浄す
る。

【００４７】［操作 II ］ そしてＣＰＧを減圧乾燥さ
せた後、目的シーケンスに適う塩基を持ったホスホロア
ミダイトユニット（90μmol ，30eq）を反応管中に入れ
てから再度減圧乾燥する。そこに0.45mlの1H- テトラゾ
ール(450μmol ，150eq)の無水アセトニトリル溶液を加
えて、20分間縮合反応を行う。

【００４８】［操作 III］ 無水アセトニトリル（２ml
×３）で洗浄した後、反応管中に無水酢酸，2,6-ルチジ
ン，無水ＴＨＦよりなる混合溶媒［無水酢酸：2,6-ルチ
ジン：無水ＴＨＦ＝１：１：８（ v/v）］を 0.3mlと、
ジメチルアミノピリジン （ＤＭＡＰ），無水ＴＨＦの混合溶媒［ＤＭＡＰ：無水
ＴＨＦ＝７：93（ v/v）］ 0.3mlを加えて、キャッピン
グ（未反応化合物の5'- 末端水酸基をアセチル化し、次
回以降の洗浄操作等によって除去しやすくする操作）を
行う。再び無水アセトニトリル（２ml×３）で洗浄し
た。

【００４９】［操作 IV ］ 続いて、硫黄によって酸化
反応を行った。すなわち、ＨＩＶのアンチセンス鎖の各
縮合反応・キャッピング操作終了後に、反応管中に５％
硫黄を含む二硫化炭素溶液と無水ピリジン，無水トリエ
チルアミンよりなる混合溶媒 ［二硫化炭素溶液：無水ピリジン：無水トリエチルアミ
ン＝12：12：１（ v/v）］を入れ、15分間の硫黄酸化操
作を行った。ただし、イオウ酸化の前後で二硫化炭素と
ピリジンの混合溶媒［二硫化炭素：ピリジン＝１：１
（ v/v）］（２ml×４）によって充分な洗浄を行って雰
囲気を整え、残留硫黄を除去した。

【００５０】［操作Ｖ］ さらに、無水アセトニトリル
と無水ピリジンの混合溶媒［無水アセトニトリル：無水
ピリジン＝１：１（ v/v）］（ 2.5ml×３）で洗浄し、
続いて無水アセトニトリル（２ml×３）無水塩化メチレ
ン（２ml×３）の順に良く洗浄する。

【００５１】以上述べた、この一連の［操作Ｉ］〜［操
作Ｖ］をｎ−１回（ただしｎは、目的鎖長を表す、した
がってこの場合目的とする化合物は20量体なので、ｎ＝
20）繰り返すことにより、目的物の20量体（ただし、こ
の段階ではまだ保護されたオリゴマーである）を合成し
た。ただし、上記の［操作II］の中の下線部で、目的シ
ーケンスに適う塩基を持ったホスホロアミダイトユニッ
トとあるのは、以下に示すｄ−ＤＭＴｒＡ^bzｐ，ｄ−Ｄ
ＭＴｒＣ^anｐ，ｄ−ＤＭＴｒＧ^ibu ｐ，ｄ−ＤＭＴｒＴ
ｐのいずれかを表している。

【００５２】

【００５３】また、一連の操作［操作Ｉ］〜［操作Ｖ］
の１回あたりに、ｄ−ＤＭＴｒＡ^bzｐ，ｄ−ＤＭＴｒＣ
^anｐ，ｄ−ＤＭＴｒＧ^ibu ｐ，ｄ−ＤＭＴｒＴｐのいず
れかひとつだけが、［操作 III］で投入される。投入す
るホスホロアミダイトユニット（すなわち、ｄ−ＤＭＴ
ｒＡ^bzｐ，ｄ−ＤＭＴｒＣ^anｐ，ｄ−ＤＭＴｒＧ
^ibu ｐ，ｄ−ＤＭＴｒＴｐのいずれか）の順は、この場
合、目的とするＨＩＶの塩基配列（すなわちＡＵＧＧＣ
ＡＧＧＡＡ ＧＡＡＧＣ ＧＧＡＧＡ）に相補的にな
るように、順に投入しなければならない。したがってホ
スホロアミダイトユニットを、（［Ａ］；ｄ−ＤＭＴｒ
Ａ^bzｐ，［Ｃ］；ｄ−ＤＭＴｒＣ^anｐ，［Ｇ］；ｄ−Ｄ
ＭＴｒＧ^ibu ｐ，［Ｔ］；ｄ−ＤＭＴｒＴｐのように略
記すると） 〈Ｔ〉，［Ｃ］，［Ｔ］，［Ｃ］，［Ｃ］，［Ｇ］，
［Ｃ］，［Ｔ］，［Ｔ］，［Ｃ］，［Ｔ］，［Ｔ］，
［Ｃ］，［Ｃ］，［Ｔ］，［Ｇ］，［Ｃ］，［Ｃ］，
［Ａ］，［Ｔ］の順に投入し反応させた。ここで、最初
の〈Ｔ〉は［操作Ｉ］で投入済みである。

【００５４】（ii）アンチセンスオリゴマー20量体の脱
保護 実験項（ｉ）で合成された、アンチセンスオリゴマー20
量体（ただし、この段階ではまだ保護されたオリゴマー
である）を、反応管内より取り出してバキュームバイア
ルに移し、28％アンモニア水を入れて密封した後、油浴
を用いて60℃，６時間処理して、ＣＰＧからの脱離を行
い、と同時にインター・ヌクレオチド部位と塩基部の脱
保護を行う。反応溶液をメンブレンフィルターで濾過
し、減圧濃縮する。

【００５５】得られた残渣にＴＥＡＡ溶液を加えて溶解
し、20〜50％ＣＨ₃ ＣＮを含むＴＥＡＡ溶出溶媒によっ
て、逆相ＨＰＬＣ（ＯＤＳ-80 ＴM ＣＴＲ，東ソー製）
で、ＤＭＴｒ基の発色のある部分を分取する。これを減
圧濃縮し、残渣に80％酢酸水溶液を加えて15分間処理す
る。溶液を減圧濃縮し濃縮物を蒸留水に溶解する。この
水溶液を少量の酢酸エチルで洗浄し、水層を減圧濃縮す
る。さらにこの濃縮物を20％アセトニトリルを含むギ酸
アンモニウム水溶液（pH 6.8，0.38〜1.36Ｍ）のグラデ
ィエント溶媒を用いて、イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳ gel
DEAE2SW）で単離精製して、目的物であるＨＩＶ(Human
Immunodeficiency Virus ）のｒｅｖ領域のアンチセン
スオリゴマー20量体（脱保護体）を得た。製造例１のト
ータル収率42％。

【００５６】こうして得られた化合物は、20％ポリアク
リルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、ブロモフェノ
ルブルー（ＢＰＢ）とキシレンシアノール（ＸＣ）の標
識との間に単一スポットを確認している。

【００５７】製造例２．ＨＩＶ（Human Immunodeficien
cy Virus）のｔａｔ領域のアンチセンスオリゴマー20量
体の合成。

【００５８】ＨＩＶのウイルスゲノムのうち、5548から
5567にいたるシーケンス、すなわち塩基の配列で表す
と、ＣＣＡＵＵ ＵＵＣＡＧ ＡＡＵＵＧ ＧＧＵＧＵ
というシーケンスに対する、アンチセンスオリゴデオキ
シリボヌクレオシドホスホロチオエート ［ただし、Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ａはそれぞれチミジン，デオキ
シシチジン，デオキシグアノシン，デオキシアデノシン
であり、ｐ_s は、そのホスホロチオ酸による燐酸エステ
ル結合を表している。］を以下のようにして合成した。

【００５９】即ち、｛１｝ 製造例１．中の（ｉ）の
［操作Ｉ］において、チミジンが導入されたロングアル
キルＣＰＧの替わりに、アデニンが導入されたロングア
ルキルＣＰＧを用いること、｛２｝ および［操作II］
において投入するホスホロアミダイトユニットの順を、
目的とするＨＩＶの塩基配列、ＣＣＡＵＵ ＵＵＣＡＧ
ＡＡＵＵＧＧＧＵＧＵに相補的にするために〈Ａ〉，
［Ｃ］，［Ａ］，［Ｃ］，［Ｃ］，［Ｃ］，［Ａ］，
［Ａ］，［Ｔ］，［Ｔ］，［Ｃ］，［Ｔ］，［Ｇ］，
［Ａ］，［Ａ］，［Ａ］，［Ａ］，［Ｔ］，［Ｇ］，
［Ｇ］とすること、（ここで、最初の〈Ａ〉は［操作
Ｉ］で投入済みである。また［Ａ］，［Ｃ］，［Ｇ］，
［Ｔ］はそれぞれ、ホスホロアミダイトユニット ｄ−
ＤＭＴｒＡ^bzｐ，ｄ−ＤＭＴｒＣ^anｐ，ｄ−ＤＭＴｒＧ
^ibu ｐ，ｄ−ＤＭＴｒＴｐに対応する略号である）の上
記２点｛１｝｛２｝を上記のように変える他は、製造例
１の（ｉ）及び（ii）と同様の操作を行って、目的物で
あるＨＩＶのｔａｔ領域のアンチセンスオリゴマーを、
収率45％で得た。

【００６０】（２）構造および純度確認 上記の製造例に従って合成した、ＨＩＶ遺伝子に対する
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオシドホスホロチオ
エート類の純度および構造確認は以下に示す方法で行
い、いずれも目的となる化合物であることを確認した。

【００６１】（ｉ）ゲル電気泳動 尿素（21ｇ）に40％ポリアクリルアミド溶液（25ml），
ＴＢＥ緩衝液（５ml）を入れ尿素を完全に解かし、アス
ピレーターで脱気した後、 1.2％過硫酸アンモニウム溶
液（4.15ml）とN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミ
ン（ＴＥＭＥＤ）（25μｌ）を加え、 0.5mmの隙間を持
つガラス板に空気が入らないように素早く流し込み上部
にスロットメーカーを差し込む。ゲルを一晩放置し、ス
ロットメーカーをはずして泳動用緩衝液（ＴＢＥ緩衝液
を10倍に希釈したもの）で洗い流してから、新しい泳動
波で30分， 400Ｖ前泳動を行う。前泳動終了後、試料
（ 0.3〜 0.5ＯＤのオリゴマー水溶液と同量の80％ホル
ムアルテドヒド溶液の混合物）（60μｌ）および色素マ
ーカー（ B.P.B.,X.C.）（10μｌ）をスロットに入れ30
分，50Ｖで泳動し、オリゴマーのゲルへの移動を確認し
た後、 400Ｖで本泳動を行う。泳動終了後、ゲルをラッ
プに包み、直接印画紙にＵＶランプ（2537Ａ）で焼き付
けて写真を取る。

【００６２】いずれの化合物も、ＢＰＢとＸＣの標識と
の間に単一スポットが得られた。

【００６３】（ii）ホスホロチオエート結合の解離 （オリゴデオキシリボヌクレオシドホスフェートの合
成） 製造例で得られたオリゴデオキシリボヌクレオシドホス
ホロチオエート （１Ａ₂₆₀ unit）を蒸留水（50μｌ）に解かした後、0.
026Ｍのヨウ素−ピリジン溶液（ 150μｌ）を加えて、
室温下１時間静置してホスホロチオエート結合を解離さ
せ、ホスフェート体に置換した。そこへさらに蒸留水
（ 1.5ml）を加えてからジエチルエーテル（２ml×６）
で洗浄した後、水層を減圧乾固する。その残渣を蒸留水
に溶かして、8.75〜20％のアセトニトリルを含む 0.1Ｍ
−ＴＥＡＡ（pH 7.0）のグラディエント溶媒を使用し
て、逆相ＨＰＬＣ（Inertsil PREP-ODS ）により単離精
製した（33〜45％）。

【００６４】(iii) 酵素分解 前述（ii）で得たオリゴデオキシリボヌクレオシドホス
フェート（0.33Ａ₂₆₀ unit）を0.01Ｍ− Trisacetate緩
衝液（pH 8.8， 500μＭ）に溶解し、ヘビ毒ホスホジエ
ステラーゼ（ 4.6μｇ）により37℃，１時間、インキュ
ベーションを行った。この溶液を90℃，１時間の熱処理
を施すことで失活させた後、遠心分離操作を行った。そ
の上澄み液を逆相ＨＰＬＣ（Inertsil PREP-ODS）によ
り分析した。オリゴマーの組成比は、その 260ｎｍにお
けるピーク面積およびヌクレオシドのモル吸光係数
（ｅ：ｄＣ7300，ｄＧ 11700，ｄＴ8800，ｄＡ 15400）
に基づいて定量計算した。

【００６５】いずれの化合物も、そのオリゴマーの組成
比が、理論計算値と良く一致し、構造の確認ができた。

【００６６】（３）抗ウイルス試験 本発明で合成した一般式［Ｉ］で表される化合物、すな
わちＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシ
ホスホロチオエート類の抗ウイルス作用は、Pauwels ら
の試験方法であるＭＴＴ assay（J. Virol. Methods 20
309 (1988)）に準じて確認した。

【００６７】代表的な化合物の抗ウイルス試験の結果
を、図１，２，３に示した。 使用ウイルス ＨＩＶ 使用細胞 ＭＴ−４ 即ち本発明のＯＤＳ１９（ｒｅｖ． 20mer）については
図１に、同じくＯＤＳ´１９（ｔａｔ， 20mer）につい
ては図２に、さらにこれら本発明の化合物の活性を比較
的に知るために同様の方法でＡＺＴについての試験結果
を図３に示した。

【００６８】図１〜３において明らかなように、ＡＺＴ
が 0.001μＭから 0.2μＭの範囲で抗ＨＩＶ効果を表す
のに対し、本発明の化合物ＯＤＳ１９（ｒｅｖ， 20me
r）とＯＤＳ´１９（ｔａｔ， 20mer）は、いずれも0.0
002μＭから 0.6μＭ以上の範囲で抗ＨＩＶ効果を示し
ている。すなわち、本発明の化合物ＯＤＳ１９（ｒｅ
ｖ， 20mer）とＯＤＳ´１９（ｔａｔ， 20mer）は、い
ずれもＡＺＴより低い濃度で効果を示し、またその範囲
も広い。さらにＯＤＳ１９（ｒｅｖ， 20mer）とＯＤＳ
´１９（ｔａｔ， 20mer）は、いずれも 500×１０^-3μ
Ｍの濃度でも細胞毒性効果を示していないので高い効果
と低い細胞毒性を持った優れた薬であるといえる。

【００６９】ただし、図中ＯＤＳ１９（ｒｅｖ， 20me
r）とあるのは、本発明中の製造例１に従って合成でき
る化合物に対応し、ＯＤＳ´１９（ｔａｔ， 20mer）と
あるのは、本発明中の製造例２で合成される化合物にそ
れぞれ対応する。

【００７０】また図中の横軸（ Concentration）は薬剤
の濃度を示し、縦軸（ Viability）は、生存ＭＴ−４細
胞数の比率［薬剤濃度が０である時のウイルス悲感染細
胞の数を 100％としたときの相対比率（％）］を表して
いる。さらに図中において、黒く塗りつぶされたカラム
はウイルス（ＨＩＶ）に感染した細胞を示し、斜線のカ
ラムはウイルス（ＨＩＶ）に未感染の細胞を示してい
る。

【００７１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば毒
性が少なくかつ抗ウイルス作用の優れた化合物が提供さ
れる。特にエイズの治療薬として極めて有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＯＤＳ１９（ｒｅｖ， 20mer）の抗ＨＩＶ効果
と細胞毒性を示す試験結果線図である。

【図２】ＯＤＳ´１９（ｔａｔ， 20mer）の抗ＨＩＶ効
果と細胞毒性を示す試験結果線図である。

【図３】ＡＺＴの抗ＨＩＶ効果と細胞毒性［比較例］を
示す試験結果線図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成３年１０月２９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】さらに、柴原らの開示（特開平３−１２８
３９１号公報）によれば、オリゴリボヌクレオシド誘導
体のホスホロチオエート体の一部が、抗ＨＩＶ活性を示
すとあるが、この化合物は、リボヌクレオシドを単位部
分構造とするものであり、本発明の２´−デオキシリボ
ヌクレオシドを部分単位構造とするアンチセンスオリゴ
デオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類とは本
質的に、全く異なっている。また、その作用の点でも大
きく異なっている。例えば、柴原らの開示（特開平３−
１２８３９１号公報）によれば彼らの化合物は１〜３μ
Ｍの濃度から抗ＨＩＶ効果がありとされているが、本発
明のＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシ
リボヌクレオシドホスホロチオエート体は、１．０〜
５．０×１０^−３μＭの濃度で、既に著しい効果が見ら
れる。さらに５〜６μＭ以上の濃度でも毒性はみられな
い。このことはそれぞれの化合物の作用機構，抗ウイル
ス効果，薬としての可能性などが、全く異なっているこ
とを示すものである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５８】ＨＩＶのウイルスゲノムのうち、５３４８
から５３６７にいたるシーケンス、すなわち塩基の配列
で表すと、ＣＣＡＵＵ ＵＵＣＡＧ ＡＡＵＵＧＧＧＵ
ＧＵというシーケンスに対する、アンチセンスオリゴデ
オキシリボヌクレオシドホスホロチオエート ［ただし、Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ａはそれぞれチミジン，デオキ
シシチジン，デオキシグアノシン，デオキシアデノシン
であり、ｐ_Ｓは、そのホスホロチオ酸による燐酸エステ
ル結合を表している。］を以下のようにして合成した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 ＺＮＡ Ｂ 7822−4Ｃ // Ｃ１２Ｎ 15/00 8828−4Ｂ (72)発明者 山本 直樹 東京都渋谷区恵比寿南３丁目11−17 原町 住宅 (72)発明者 中島 秀喜 東京都武蔵村山市学園４−３ 武蔵野住宅 10−405 (72)発明者 高久 洋 千葉県船橋市新高根４−５−９

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式［Ｉ］で示されるオリゴデオ
   キシリボヌクレオシドホスホロチオエート類。 ［式中ｍは１〜50の整数を表し、ＢはＢ₂ からＢ_m+1 ま
   でのいずれかを表し、（Ｂ＝Ｂ₂ ，Ｂ₃ ，Ｂ₄ ………Ｂ
   _m ，Ｂ_m+1 ）Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 は相互に同一又は異なってお
   り、それぞれ、ヒポキサンチン-9-イル，グアニン-9-
   イル，アデニン-9- イル，シトシン-1- イル，ウラシル
   -1- イル，チミン-1- イルのいずれかを表している。た
   だし、Ｂ₁ 〜Ｂ_m+2 の全てが同一である場合を除く。］
2. 【請求項２】 ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Viru
   s；ヒト後天性免疫不全ウイルス；エイズウイルス）の
   遺伝子中の主な蛋白質をコードする gag,pol,vif,vpr,t
   at,rev,env,nef,LTR などのシーケンスの全部又は一部
   に対して相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンス
   ＤＮＡ）の燐酸エステル部を化学修飾してホスホロチオ
   エートとした、ＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリ
   ゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類。
3. 【請求項３】 ｍが１〜18である請求項１及び２記載
   の、ＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシ
   リボヌクレオシドホスホロチオエート類。
4. 【請求項４】 ＨＩＶ遺伝子がＨＩＶ遺伝子のｒｅｖ領
   域である請求項１〜３記載の、ＨＩＶ遺伝子に対するア
   ンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチ
   オエート類。
5. 【請求項５】 ＨＩＶ遺伝子がＨＩＶ遺伝子のｔａｔ領
   域である請求項１〜３記載の、ＨＩＶ遺伝子に対するア
   ンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチ
   オエート類。
6. 【請求項６】 請求項１〜４記載の、ＨＩＶ遺伝子ｒｅ
   ｖ領域に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレ
   オシドホスホロチオエート類である、以下に示すシーケ
   ンスで表される化合物。 ［ただし、ｄはこのシーケンスの単位構造がデオキシヌ
   クレオシドユニットよりなっていることを示し、Ｔ；２
   ´−デオキシチミジン（あるいは単にチミジン），Ｃ；
   ２´−デオキシシチジン，Ｇ；２´−デオキシグアノシ
   ン，Ａ；２´−デオキシアデノシンであり、ｐ_s は、そ
   のＴ，Ｃ，Ｇ，Ａのそれぞれの５´位と３´位の水酸基
   をホスホロチオ酸によりつなぐ燐酸エステル結合すなわ
   ち を表している。］
7. 【請求項７】 請求項１〜５記載の、ＨＩＶ遺伝子ｔａ
   ｔ領域に対するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレ
   オシドホスホロチオエート類である、以下に示すシーケ
   ンスで表される化合物。 ［ただし、ｄはこのシーケンスの単位構造がデオキシヌ
   クレオシドユニットよりなっていることを示し、Ｔ；２
   ´−デオキシチミジン（あるいは単にチミジン），Ｃ；
   ２´−デオキシシチジン，Ｇ；２´−デオキシグアノシ
   ン，Ａ；２´−デオキシアデノシンであり、ｐ_s は、そ
   のＴ，Ｃ，Ｇ，Ａのそれぞれの５´位と３´位の水酸基
   をホスホロチオ酸によりつなぐ燐酸エステル結合すなわ
   ち を表している。］
8. 【請求項８】 ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Viru
   s；ヒト後天性免疫不全ウイルス；エイズウイルス）の
   遺伝子中の主な蛋白質をコードする gag,pol,vif,vpr,t
   at,rev,env,nef,LTR などのシーケンスの全部又は一部
   に対して相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンス
   ＤＮＡ）の燐酸エステル部を化学修飾してホスホロチオ
   エートとした、ＨＩＶ遺伝子に対するアンチセンスオリ
   ゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類の合
   成に際し、ホスホロアミダイト法を用いることを特徴と
   する、請求項１記載の一般式［Ｉ］で示されるアンチセ
   ンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエー
   ト類の合成方法。
9. 【請求項９】 トリクロロ酢酸で脱トリチル化処理を行
   なった、チミジン（あるいは２´デオキシアデノシン，
   ２´デオキシグアノシン，２´デオキシシチジン，２´
   −デオキシウリジン，２´−デオキシイノシン）が導入
   されたロングアルキルアミノＣＰＧ（コントロールドポ
   アガラス）に、目的シーケンスに適う塩基を持つｄ−Ｄ
   ＭＴｒＡ^bzｐ，ｄ−ＤＭＴｒＣ^anｐ，ｄ−ＤＭＴｒＧ
   ^ibu ｐ，ｄ−ＤＭＴｒＴｐ，ｄ−ＤＭＴｒＩｐ，ｄ−Ｄ
   ＭＴｒＵｐなどのホスホロアミダイトユニットを30〜50
   当量と、1H- テトラゾール 150当量とを加えて縮合反応
   させ、続いて硫黄により酸化反応を行ない燐酸エステル
   部に硫黄を導入することよりなる一連の操作をｎ−１回
   （ただし、ｎは目的鎖長を表す）繰り返すことによって
   合成する、請求項１〜７記載のアンチセンスオリゴデオ
   キシリボヌクレオシドホスホロチオエート類の合成方
   法。
10. 【請求項１０】 請求項９に示されたＨＩＶ遺伝子に対
    するアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオシドホス
    ホロチオエート類の合成方法において、硫黄酸化の前後
    で二硫化炭素と無水ピリジンの混合溶媒によって充分な
    洗浄を行なうことにより、雰囲気を整え、かつ残留硫黄
    を除去することを特徴とする、アンチセンスオリゴデオ
    キシリボヌクレオシドホスホロチオエート類の合成方
    法。
11. 【請求項１１】 請求項１〜５記載の、アンチセンスオ
    リゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類の
    うち、少なくとも１種を有効成分とする抗ウイルス剤。
12. 【請求項１２】 請求項１〜５記載の、アンチセンスオ
    リゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類の
    うち、少なくとも１種を有効成分とする抗レトロウイル
    ス剤。
13. 【請求項１３】 請求項１〜５記載の、アンチセンスオ
    リゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類の
    うち、少なくとも１種を有効成分とする抗エイズウイル
    ス剤。
14. 【請求項１４】 請求項１〜５記載の、アンチセンスオ
    リゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート類の
    うち、少なくとも１種を有効成分とする遺伝子工学上用
    いられる実験用試薬および実験用医薬。
15. 【請求項１５】 請求項６記載の、化合物及びその誘導
    体を有効成分として含む抗ウイルス剤。
16. 【請求項１６】 請求項６記載の、化合物及びその誘導
    体を有効成分として含む抗レトロウイルス剤。
17. 【請求項１７】 請求項６記載の、化合物及びその誘導
    体を有効成分として含む抗エイズウイルス剤。
18. 【請求項１８】 請求項６記載の、化合物及びその誘導
    体を有効成分として含む遺伝子工学および免疫学上用い
    られる実験用試薬および実験用医薬。
19. 【請求項１９】 請求項７記載の、化合物及びその誘導
    体を有効成分として含む抗ウイルス剤。
20. 【請求項２０】 請求項７記載の、化合物及びその誘導
    体を有効成分として含む抗レトロウイルス剤。
21. 【請求項２１】 請求項７記載の、化合物及びその誘導
    体を有効成分として含む抗エイズウイルス剤。
22. 【請求項２２】 請求項７記載の、化合物及びその誘導
    体を有効成分として含む遺伝子工学および免疫学上用い
    られる実験用試薬および実験用医薬。