JPH04506089A

JPH04506089A - 褐藻植物より得られた硫酸化ポリサッカライド類、抗凝固剤、抗補体剤及びその製法

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Publication number: JPH04506089A
Application number: JP2508929A
Authority: JP
Inventors: コリエ，シルヴァ; ブレトゥディエ，ジャクリーヌ; デュラン，パトリック; フシェ，アンヌ―マリ; ジョゼホンビッツ，ジャクリーヌ; クロアレ，ベルナール; ヴィダ，カトゥリーヌ
Original assignee: フレメール−アンスティティ　フランセ　ドゥ　ルシェルシュ　プール　レックスプロアタシオン　ド　ラ　メール
Priority date: 1989-06-14
Filing date: 1990-06-13
Publication date: 1992-10-22
Anticipated expiration: 2015-05-15
Also published as: DE69033626T2; EP0676207B1; IE902153A1; FR2648463A1; EP0676207A3; ATE196089T1; EP0403377A1; CN1051564A; DD296937A5; EP0403377B1; IE902153L; ATE131176T1; AU5841090A; JP3042543B2; FR2648463B1; PT94359A; DE69023957T2; WO1990015823A1; ES2152998T3; DE69033626D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】褐藻植物より得られた硫酸化ポリサッカライド類、抗凝固剤、抗補体剖及びその製法この発明は、褐藻植物（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ：　ｂｒｏｗｎ　ａｌｇａｅ）から抽出したフカン（ｆｕｃａｎ）の調節溶解でえた新規な硫酸化ボリサ・ツカライド類、その製法ならびに、新規な抗凝固剤、抗血栓剤と新規な抗補体剤に関する。

抗凝固効果は血漿中ての活性トロンビン生成の阻害として定義され、一方抗血栓効果は、血栓の発生および／またはその生長の阻害と定義される。

現在使用されている殆どの抗凝固剤はヘパリンで、ヘノ＜リンは、グルコサミン単位とグルクロン酸単位の１−〉４結合からなる硫酸化ポリサッカライドで、硫酸基は、グルコサミンのアミン官能、および／またはグルコサミンとウロン酸のアルコール官能に存在する。ヘパリンは、２つの血漿阻害剤の抗凝固作用を上昇して凝固に作用する。第１のものは抗トロンビン■（ＡＴＩＩＩ）でトロンビン（因子ＩＩａとしても知られている）と活性化因子Ｘ（または因子Ｘａ）の双方に作用し、ヘパリン補因子２（ＭＣＩ［）と称せられる第２のものは、因子ＩＩａに作用し、因子Ｘａには作用しない。

その上、血栓の防止に関して、脱高分子化で得られた低分子量のヘパリンの使用が増大しつつある。これの全凝固に関する作用は弱い。例えば、低分子量のヘパリンは、全体的に、体内経路による血漿凝固、すなわち因子■と血小板因子を除く全血漿因子を検査するセファリン　カオリン時間（ＣＫＴ）で生体外で効果がない。反対に、生体内で、実験的血栓の防止をする。

そして、このものは因子Ｘａに関してＡＴＩＩ［の阻害活性を上昇させ、因子Ｘａに関する活性は弱いことが判明している。しかし、血栓防止の作用は、低残渣の抗Ｉｒａ活性によって本質的に奏されるとみるのがより適切とみられる。

ヘパリンの抗補体性も知られている。補体系は免疫防禦機構で重要な役割をする一組の血漿あるいは膜蛋白である。補体系は、生体の防禦（感染剤の分解、免疫複合物の浄化）と炎症タイプの病状工程に関与している。血中では、赤血球の溶血又は溶解に付加的に感応している。

補体蛋白は、血漿中で不活性化され、２つのシーケンス、すなわち別の経路と古典的経路で特殊な順序で活性化される。別経路の活性化は、ターゲット表面（細菌、ウィルス、寄生物、腫瘍細胞）の認識について非特異な機構に基づいている。古典的経路での活性化は、抗体によるターゲットの特異的認識に基づいている。別経路では、初期は、Ｃ３（Ｃ３ｂ）の分裂産物の固定とＣ３ａの放出（炎症反応に感応のアナフイラトキシンについて）でトリガーされる。Ｃ３ｂは、表面でヒドロキシ基とアミノ基に共有結合する。一旦結合すると、因子Ｂに結合でき、因子Ｂが因子りで活性化された後、別の０３コンバーターゼを形成する。古典経路では、初期は、主に抗原−抗体反応のレベルで行われるＣ１の活性化てトリガーされる。Ｃ１の活性化後に、成分Ｃ４と０２が順次活性化され、表面で、酵素複合体、古典的Ｃ３コンバーターゼを形成する。Ｃ４の活性化は、Ｃ４ｂとＣ４ａの放出を伴い、Ｃ３の活性化に類似である。Ｃ４ｂはＣ３ｂと同じタイプの化学基に共有結合で固定化する。

ヘパリンは、Ｃ３コンバーターゼとの相互作用で、補体活性化の阻害剤として作用する。ヘパリンのこの抗補体活性はへ、（リンの抗血栓（ｓｉｃ）活性と全体として無関係であり、この活性は、アミン感応の置換基がスルフアート基でないときて観察されない抗凝固活性に反し、スルフアート基又はアセチル基のアミン官能の存在と関連していることが分っている。ウロン酸のアルコール官能の１つにスルフアート基の存在することが抗補体活性に重要な役割をするとみられているＣ　ＫＡＺＡＴＣＨＩＮＥら。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　６７、　（＋９８１））。

他のポリサッカライドの抗凝固性および／または抗血栓性も　・知られている。

例えば、デルマタンスルファートは、抗凝固活性はヘパリンより弱いが、抗血栓活性はヘパリンと同等である。

このデルマタンスルファートは、トロンビンを阻害し、補因子ＨＣｎの阻止効果を上昇させる。反対に、補因子ＡＴＤＩ経由で作用せず因子Ｘａに作用しない。

血栓防止に繁用されているベントサンポリスルフアートも、ＨＣＩＩよりトロンビンの阻害を触媒して作用する。

一方、これらのポリサッカライドはヘノくリンに比較しうる抗補体活性を奏しない。ＫＡＺＡＴＣＨＩＮＥらは上記の刊行物で、デルマタンスルフアートは、ガラクトサミンのアミン官能がアセチル化されているが、ウロン酸のアルコール官能は硫酸化されていないものであり、その抗補体活性がヘパリンより１４倍９ないことを報告している。

フカンは、カッソウ類の葉状体から抽出された、高い平均分子量（１００〜８００　ＫＤａ）の硫酸化ポリサッカライドである。この化合物は、α−１，２−Ｌ −フコース　４−スルフアートのポリマーで、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース及びウロン酸を含むことがある。フカンのウロン酸は、ヘパリンとは異なり、硫酸化されていない。その上、フカンはアミノ糖を含まず、ヘパリン及びデルマタンスルファートと異なる。

粗製のフカンで行なった研究により、１つ及び同じ粗抽出物から、各種のサブクラスのフカン、すなわち平均分子量と物質化学的の性質を異にするものを分離することが可能になった。

この研究は、フカン分子のポリサッカライド骨格を分解しない、非凝集性分側法（分割沈澱、ゲル濾過など）を使用するもので、実際に天然のサブクラスのフカンの存在が判明した。

粗製フカンの抗凝固性は１９５７年に５ＰＲＩＮＧＥＲらにより例証され、以来多数の著者によって確認されているＣＢＥＲＮＡＲＤＩ　＆ＳＰＲ［ＮＧＥＲ，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２３７．１゜（１９６２）　ＭＯＲＩら、　Ｍａｒｉｎｅ　Ａｌｇａｅ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ。

２、１９８２）。

本発明者による粗製フカンの凝固に関する作用機序の研究では、粗製フカンはセファリン　カオリン時間（ＣＫＴ）及び特にトロンビン時間（ＴＴ）（これはフィブリノーゲンのトロンビン影響下でのフィブリンクロットへの変換、凝固の最終段階を調べるもの）を延長することが分った。この研究は、粗製フカンが殆ど独占的にトロンビン（因子Ｉａ）に作用し、かつこれは主にＨＣＩＩ阻害剤の効果（ヘパリンと同じ濃度で）及び抗トロンビン■の効果（ヘパリンより３０倍大きい濃度で）を上昇するものであることが分った。

同じ観察が、粗製フカンの性質を研究した他の著者らＣＣＨＵＲＣＨら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　２６４．６　（１９８９）〕によってもなされている。これらの著者は、粗製フカンかトロンビンのＡＴＩ［［による阻害を弱く触媒し、トロンビンのＨＣｌによる阻害を強く触媒することを提案（ｓｉｃ）した。

従って、フカンは、公知の抗凝固剤とは異なる作用機序のため新しい凝固剤の新しいカテゴリーを構成する。事実、フカンはＨＣＩ［の阻害活性をトロンビンに関してＡＴＩ［Ｉの阻害活性を上げるもので、ＭＣＩＩの阻害活性のみを独占的に上げるデルマタンスルファートと異なる。一方、フカンはデルマタンスルファートと同様で、かつヘパリンとは異なり、因子Ｘａの阻害作用はない。すなわちフカンは、トロンビンの独占的阻害剤である。本発明者は、また、フカンは、ヘパリンとは異なりアミノ糖又は硫酸化ウロン酸を含有しないが、意外にも補体の活性化を阻止する性質を有することを認めた。

補体活性化阻害剤は、移植拒絶現象の防止にある役割を果すことができる。すなわち、腎臓透析を行っている人や心筋梗塞から回復中の人の処置への使用が提案されている。体外循環装置での補体の活性化を阻止する抗補体活性がもたらされる利点もある。

古くからフカンの抗凝固性が知られているが、粗フカンは治療に用いられておらず、これは残留蛋白が比較的高いため免疫現象を誘因するリスクがあり、一方分子量が高いため溶解性か悪く、高濃度での使用がかなり制限されるからである。

ここに、フカンの抗凝固作用、特に、粗フカンの分割で得られた各種のフカンの細分についての抗凝固活性を今日まて行った研究により、抗凝固活性が、フカン分子の大きなサイズに正確に関連することが示唆された。あるチームは、抗凝固活性が高分子量に関連しているとの結論に達したＣＵＳＬＩＩら、　Ａｇｒ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４４〜８（１９８０））。

他の研究による、２０ＫＤａの低限が存在し、それ以下はみるべき抗凝固活性が認められない観察に一致する。例えば、英国特許第８９０．２０７号では、粗フカンをエタノールを用いての分割沈澱により、５〜ｓｏ、ｏｏｏＯ間の分子量の７つの異なる区分を得たことを記載している。この特許では、フラクション中、２０．０００以上の分子量の区分にのみ顕著な抗凝固活性を奏している。

西野ら［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１８６（１９８９）、１１１３−１２９）は非分解フカンから得た区分の抗凝固活性を研究し、この２０ＫＤａの限界を確かめている。その上、そこで記載された精製区分は粗フカンと異なる作用機序を育するとしている。これは、精製区分が、粗フカンと同様に、因子Ｘａよりトロンビンにより活性とみられるが、精製区分の作用は、それ自体本質的に凝固の全機序に現れ、セファリン　カオリン時間（ＣＫＴ）の延長をすることになる。反対に、トロンビン時間についてはごく僅かしか効果を示さず、そのため凝固の最終段階では活性が少ない。

従って、これまで粗フカンの非分解分割によって得られたポリサッカライドの細分は、凝固について作用を有するが、これは各細分によって変動するもので、粗フカンでの観察されたものと異なるとみられる。一方、今日までの研究から、溶解性で特に優れている２０ＫＤａより低い分子量の区分は実質的に凝固作用を有さないことが明らかである。

本発明者は、この仮説を進めた。すなわち、粗フカンのポリサッカライド長鎖を分断すると、低分子量の区分が得られるであろう。しかしフカン分子のサツカライド骨格をカットする溶解工程の使用が必要で、これにはフカンの性質の欠損につながる過剰分解を避けるよう調節できることが必要である。

この指針で行った実験では、中間の分子量を有する区分を与えるフカンの分解法の開発に至っていない。実際、使用した方法では、分解が不十分で４０ＫＤａより大きい分子量の区分を与えるが、殆ど全分解されて、抗凝固活性のない区分を与える［Ｖ、Ｃ０ＬＬＩＥＣｅｔ　ａｌ、、　ＩＶａｍｅｓ　Ｊｏｕｒｎ６ｅｓ　ｄ’ｈ６ｍｏｓｔａｓｅ　ｅｔ　ｄｅｔｈｒｏｍｂｏｓｅ、　Ｐａｒｉｓ、　Ｍａｒｃｈ　１９８８］、　［ＦＩＳＣＨＥＲｅｔ　ａｌ、　、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ。

ｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　（Ａｔｈｅｎｓ）、Ｍａｙ　１９８８］、　［Ｃ０ＬＬＩＥＣｅｔａｌ、、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｗａｒｓａｗ、０ｃｔｏｂｅｒ　１９８８］　。

結果として、この発明の目的は褐藻植物（ｂｒｏｗｎ　ａｌｇａｅ）のフカンを調節溶解（ｌｙｓｉｓ）　して得た比較的低分子量のポリサッカライド区分を提供することである。またこの発明は、活性が因子ａの阻害で奏されること、何れの抗Ｘａ活性も有さないこと、高分子量及び粗フカンの高い残留蛋白含量による欠点を表さないことで特に有利であり、かつ大量に容易に入手しうる原料である褐藻植物から得られる抗凝固剤および抗血栓剤を提供することを目的とする。また、褐藻植物のフカンから得られる新規な拡補体剤を提供することを目的とする。

この発明は、分子量が、ポリサッカライド標品を比較としてゲル濾過で測定し、５ＫＤａより大で４０ＫＤａより小さく、硫黄含量が夾雑蛋白の０．１５％より少ない、もとのフカンより溶解性であり、抗凝固と拡血栓性を有することで特徴付けられる褐藻植物のフカンから得られた硫酸化ポリサッカライドに関する。

この発明の硫酸化ポリサッカライドは、褐藻植物から抽出した粗フカンの調節溶解によって得ることができる。

この発明による硫酸化ポリサッカライドの好ましい具体例によれば、その平均分子量は２０ＫＤａより小さいか等しい。

この発明による硫酸化ポリサッカライドの他の好ましい具体例では、その平均分子量は、２０ＫＤａと３５ＫＤａの間である。

この発明の硫酸化ポリサッカライドの同様に好ましい具体例では、その硫黄含量は、原フカンのものより２〜２０％大きい。

この具体例の特に有利な構成によれば、硫酸化ポリサッカライドは、フカス　ベシキュロサス（Ｆｕｃｕｓ　ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）から抽出されたフカンを調節酸加水分解で得られ、その硫黄含量は原フカンより約１５〜２０％大で、蛋白含量は０．０５％少ない。

この具体例の他の有利な構成によると、硫酸化ポリサッカライドは、アスコフィリウム　ノドサム（Ａｓｃｏｈｙｌｌｕｍ　ｎｏｄｏｓｕｍ）から抽出のフカンを調節酸加水分解で得られ、その硫黄含量が原フカンより約２〜５％大であり、蛋白含量は０．０５％より少ない。

この具体例の他の有利な構成では、硫酸化ポリサッカライドは、ペルベチア　カナリクラタ（Ｐｅｌｖｅｔｉａ　ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ）からの抽出のフカンを調節酸加水分解で得られ、硫黄含量は原フカンより約１５〜２０％大で蛋白含量は０．０５％より少ない。

この具体例の更に他の有利な構成では、硫酸化ポリサッカライドは、ウンダリャ　ピナチフィダ（Ｕｎｄａｒｉａ　ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）の抽出によるフカンを調節酸加水分解で得られ、硫黄含量か原フカンより約１０〜１５％大で、蛋白含量が０．０５％より少ない。

本発明者は、この発明による硫酸化ポリサッカライドか抗凝固と拡血栓（ｓｉｃ）の両方を育することを生体外と生体内で例証した。西野らの低分子量のポリサッカライド細分と異なり、この発明のポリサッカライドは本質的に凝固の最終段階に作用する。

この発明は、また、上で定義した少なくとも１つの硫酸化ポリサッカライドからなることを特徴とする補因子ＨＣｎとＡＴＩ［［の活性剤に生体外と生体内ともに活性な抗凝固、抗血栓剤に関する。

さらに、この発明は、褐藻植物を源とする粗フカンの調節溶解が行われ、得られた溶解産物ゲル濾過で分刻され、５ＫＤａより大で４０ＫＤａより小さい分子量の区分を回収することを特徴とする、前に定義した硫酸化ポリサッカライドの収得方法に関する。

この発明の方法の好ましい実施態様では、フカンの調節溶解は酸加水分解で行なわれる。

この実施態様の特に有利な構成では、酸分解は０．５〜ＩＮＨ，Ｓｏ、で、４０〜５０℃の温度で１〜４時間行なわれる。

この発明の方法による他の好ましい態様では、フカンの調節溶解は、フカンを照射、特にガンマ−線に付し放射分解により行なわれる。

この発明の方法の更に他の好ましい実施態様では、フカンの調節溶解は酵素分解によって行なわれる。この態様にはフカンの炭化水素骨格を細分しつる少なくとも１つの酵素、例えばα−１−２−フコシダーゼ　タイプの酵素、例えば海軟体動物（ｓｅａ　ｍｏｌｌｕｓｃｓ）の胃液から作られた酵素の混合物または、海軟体動物から得られた酵素の使用が含まれる。また、それ以外に藻を分解する細菌中に含まれる酵素が使用できる。

この発明の方法の他の好ましい実施態様では、フカンの調節溶解は、物理的方法特に音波処理で行なわれる。

この発明の方法の有利な実施態様では、２０ＫＤａより小さいか等しい分子量の区分が回収される。

この発明により硫酸化ポリサッカライドの分子量は、高濃度でも、血漿及び注射液への溶解を可能とする。その上、粗フカンと比較して、夾雑蛋白の含量が小さい。そのため、ヒトに医薬として使用ができる。この発明による硫酸化ポリサッカライドの抗血栓性をある種の適用、特に、抗血栓剤の皮下注射て静脈血栓の防止に特に有利である。この適用には、非分割フカンでは不可能であった比較的濃度の高い溶液の使用を必要とするものである。またこの発明の硫酸化ポリサッカライドを経口的及び経皮的に使用することも考えられる。

その上、フカンから得られる５〜１００ＫＤａの分子量を有する区分は、非分割フカンと等しいか大きい抗補体活性を育する。

従って、この発明は、褐藻植物から抽出したフカンおよび／またはその区分からなることを特徴とする補体の活性を阻害する剤に関する。

この発明による補体活性阻害剤の好ましい具体例では、褐藻植物から抽出したフカンから得られた５０ＫＤａ以上の分子量を有する区分からなる。

この発明の補体活性阻害剤の好ましい具体例では、褐藻植物から抽出したフカンから得られた５〜５０ＫＤａの分子量を育する区分からなる。

この発明の補体活性阻害剤の好ましい他の具体例では、上記で定義した硫酸化ポリサッカライドからなる。

この発明は、以下の記述からより理解されるであろう。この記述には各種の褐藻から抽出したフカンよりこの発明の硫酸化ポリサッカライドを収得する実施例及びこれらのポリサッカライドの活性の実証に関する。

しかし、これらの実施例は、発明の主題の例証のためてあり、これによって限定されるものではない。

Ａ）フカンの褐藻からの抽出褐藻の若枝の子房壁材料から通常の抽出法でフカンを抽出する。この方法は、ＢＬＡＣＫら［Ｊ、Ｓｃｉ、Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、（１９５２））の方法に由来する。

抽出原理の要旨は次の通りである。若技（ｔｈａｌｌｉ）を５重量％のホルマリン含有の無水エタノールで粉砕する。得られる粉砕物を５重量％のホルマリン含有の９５％エタノールによる第１抽出に付し、２／］　（Ｖ／Ｖ）のアセトン／トルエン混液による第２抽出に付す。

オーブンで乾燥後、２重量％の（ａ　Ｃ］　２含有の０．Ｏ］ＭＨＣＩを用いて一回以上の酸抽出に付す。

水酸化ナトリウムで中和後、酸抽出物をＮ−セチルピリジニウム　クロリドと処理し、殆んど高度に硫酸化したフカンとのコンプレックスを形成し、前記の硫酸化フカンでの製剤を濃厚にすることが可能となる。

次いで得られた沈澱物は、３　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１鵞に再溶解し、凍結乾燥する。

Ｂ）抽出フカンの分割第１工程：粗抽出物の分解ａ）酸加水分解酸抽出物をｔＮ−ＨｔＳＯｔ液にｌＯ■／−の割合で溶解し、温度を４５°Ｃに固定する。分解は粘度測定（流管直径０．５ｍ＋ｍのウーベローデ型粘度計）を行い、フカンの全加水分解が起る前に水酸化ナトリウム液（Ｍ−ＮａＯＨ）を加えて停止する。分解中、減少した比粘度（η５ｐｅｃ、　／ｃ）を３０分ごとに計算する。

分解した酸抽出物の溶液を濃縮し、１０００ダルトンのカットオフ閾値を育する膜を用いる限外濾過に付し、最後に凍結乾燥した。

ｂ）放射線分解放射化学的加水分解を、６０．０００Ｃｉコバルト−６０源からの照射で行う。

粗フカンを全サンプルに対し、線量率２０８１ラッド／分は又は照射量１１．５ラツドて室温で９２時間照射する。

Ｃ）酵素分解ハリオチス（Ｈａｌｉｏｔｉｓ　ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔａ）とアプリシア（Ａｐｌｙｓｉａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）からの胃液の粗抽出物を用いて、ペルベチアカナリキュラータ（Ｐｅｌｖｅｔｉａ　ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ）の粗抽出物の酵素分解を次のようにして行う。粗フカンをｐＨ５，８のクエン酸−リン酸緩衝液（クエン酸−０，１Ｍ　Ｃｓ　Ｈ＊　Ｏｈ　；リン酸水素２ナトリウム＝ｏ、２Ｍ　Ｎａｚ　ＨＰＯ，−２Ｈｚ○）中１０■／−の濃度に溶解する。このフカン溶液を３７℃に加熱し、２００μｌの胃抽出物を１時間ごとに活性酵素の定濃度になるように加える。粘度測定で分解をモニターし、減少した比粘度（η Ｓｐ）／ｃを各種のサンプリング時に計算する。反応は０．２Ｍ−炭酸ナトリウム（Ｎａｔ　ＣＯ２）溶液を加えて停止する。

第２工程：分解粗抽出物の予備的公開ａ）実験室スケールについて５００■の溶解産物０．２Ｍ食塩水に入れ、公開ゲル（セファクリル（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ）　Ｓ　−２００又はＳ−３００）のカラム（高さ３５〜４５　ｃｍＸ４．８ｃｍ　）に導入する。

直線流量は３．３３ｃｍ／時である。カラムの出口で差異屈折計とＵＶ検出器（２８０ｎｍ）を用いて２重検出を行う。シグナルを２重チャンネルレコダ−に記録する。クロマトグラフで検討し、カラムの出口から得た各種フラクション（５ −）について３又は４フラクシヨンに合す。各フラクションを濃縮し、第１フラクシヨン用に１０，０００ダルトンのカットオフ閾値を有する膜で、また他のフラクション用に１０００ダルトンのカットオフ間値を有する膜で限外濾過に付し、凍結乾燥する。

ｂ）半パイロットスケールについて３０ｇの溶解産物を０゜２Ｍ食塩水１２５艷に入れ、セファクリル（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ）　Ｓ　−２００カラム（高さ６０ｃｍＸ直径１１．３ｃｍ）に導入する。線流速は１５ｃｍ／時間。

カラム出口で、差異屈折計をＵＶ検出量（２８０ｎｍ）を用いて２重検出を行う。シグナルを２重チャンネル記録計に記録する。クロマトグラフを調べ、カラム出口で得た各種フラクション（３０ｄ）を３又は４つのフラクションに合す。各フラクションを濃縮し、第１フラクシタン用に１０，０００ダルトンのカットオフ閾値の膜と他のフラクション用に１０００ダルトンのカットオフ間値の膜で限外濾過に付し、凍結乾燥した。

Ｆ　ｉ　ｇ、　ｌは、フカン醜抽出物をＩＮ−硫酸を使用し４５℃で分解したもののセファクリルＳ−２００ゲルでの予備分割（公開範囲２５０Ｘ１３’〜５ＸＩＯ”ダルトン）で、Ａ、は第１フラクシヨン（分子量＞２０ＫＤａ）　、Ａｔは第２フラクシヨン（２０ＫＤａ分子量＞　１０ＫＤａ）　、Ａｓは第３フラクシヨン（分子量＞１０ＫＤａ）　、Ｖｄはデッド容量、Ｖｔは全容量。

破線の曲線は差異屈折計で測定した溶出材の量を示す。実線の曲線は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収で測定した蛋白量を表す。

実施例２：得られたフラクションの物理化学的特性赤外スペクトル：Ｆｉｇはフコス　ベシキロサス（Ｆｕｃｏｓ　ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）の壁がら抽出した粗フカンと、この酸抽出物を調節酸加水分解して得た平均分子量１３ＸｌＯ’のＡ、フラクション（２ｂ）の赤外スペクトルである。１２４０ｃｍ− ’でのピークは、硫酸基の特徴である。８５０ｃｍ”でのピークは、大部分のスルフアート基がＬ−フコースの０４位にあり、スルフアート基のあるものは８２０ｃｍ−’でのショルダーで示されるよう０５位にある。

カルボキシル官能の大部分は、１７２０ｃｍ”’でのピークで示されるように非解離で、解離したカルボキシル官能を表す１４２０ｃｍ”での弱いショルダーに比較される。

分子量の測定：フカン　フラクションのｇ／ｍｏｌｅでの分子量測定は、Ｓｉ−ジオール（Ｓｉ −Ｄｉａｌ）５００カラム（分割範囲５０００〜１０′ダルトン）に、標準ポリサッカライド（プルラン、ポリマーラボラトリ−社）の５０μ！、又は測定対象のフカンフラクションの５０μｍ！を０．２Ｍ食塩水中２ｒｎｇ／ｍｌで、流速１ｍ／／ｍｍ、屈折測定で検出する分析用高速流体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で行った。クロマトグラムは貯蔵し、ＧＰＣプログラムを育するマイクロコンピュータで分析する（透過ゲル上立体エクスクル−ジョンクロマトグラフィー）、結果はプリンター上に記録する。

ＳとＮの含量：フカン　フラクションと硫黄と窒素含量は元素分析で％（純品の重量で）として出す。

蛋白含量：蛋白含量は、プラトフォード　カラーメトリーテスト（“パイオーラッド”ＣＢｉｏ−Ｒａｄ）テスト）を使用し、参照として牛アルブミンを用い、％（純品の重量で）と測定する。

フカンすなわち未分割の酸抽出物（ＡＥ）と、これらの粗フランの酸加分解によって得たＡ、フラクションとして表した本発明による硫酸化ポリサッカライドについての物理化学的性質の比較である。

表１で得たＡ、フラクションとして表示した本発明の硫酸化ポリサッカライドについての物理化学的物質の比較である。

表２非分解フカンと、ｌＯと２０ＫＤａの間の分子量を有する分解フカンの抗凝固活性を、セファリン　カオリン時間（ＣＫＴ）を用いて評価する。活性は、次の間係：フカン　フラクションの直線スロープ／標準ヘパリンの直線スロープ×標準ヘパリン（ラボラトリーズ　チョアしａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓＣＨＯＡＹ）からのヘパリンＨ１０８のＩＬＩ／■活性により、産物の■当りの国際単位（１０／ ■）で表す。

スロープは、抗凝固濃度（ヘパリン０．５〜ｌμｇ／ヘパリンの−の濃度とフカンｌＯ〜５０μｇ／ｍｌの濃度）の関数として、凝固時間（秒）の対数をプロットして得た直線から計算する。

表■は、褐藻（アスコフィルム　ノドサム（Ａｎ）、’；７三７゜フカン）（ＡＥ）と酸加水分解で得たＡ２フラクシシンについての抗凝固活性の比較である。

表３＊参照として、＋７３１０／■の標準ヘパリンを用いて測定した抗凝固活性表■は、本発明による硫酸化ポリサッカライドの抗凝固活性のより精密な分析を示すもので、Ａ、フラクション及びヘパリンのクイック時間（ＱＴ）　、セファリン　カオリン時間（ＣＫＴ）、トロンビン時間（ＴＴ）とレブリラーゼ時間（ＲＴ）のそれぞれの効果の比較である。

表４上記は、本発明による硫酸化ポリサッカライドかトロンビン時間で本質的て活性であるこを示す。

本発明のポリサッカライド　フラクションの抗凝固活性をウサギで評価する。実施例１の酸加水分解で作った平均分子量１５０００Ｄａのフラクションを３ｋｇ体重のウサギに注射する。ウサギから所定間隔で採血し、凝固指標をトランビン時間（ＴＴ）とセファリン　カオリン時間（ＣＫＴ）を測定して評価する。

表Ｖは、本発明の硫酸化ポリサッカライドの溶媒アスコフィルム　ノドドラムの酸加水分解で得たフラクションＡ２　（ｓｉｃ）の０．５−の注射、（但し１００■／ｄ、　４００■／−と３０■／ｒｄりの時間関数として凝固指標の変化を、ヘパリンの注射（但し２■／ｍＩりと比較して示す。

表■ 実施例５：生体外抗血栓活性：実験的血栓使用した実験的血栓は、ウサギでのウニスラー、ハウブトマンＣ３ＴＡＮＦＯＲＤ　ＷＥＳＳＬＥＲ，５ＴＡＮＬＥＹ　Ｍ、ＲＥＩｌｌＥＲ，ＭＩＮＤＥＬ　Ｃ，５ＨＥＰＳ−Ｊ。

Ａｐｐｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９５９）１４，９４３〜９４６頁〕によるもので、このモデルは、剤トリガー血栓として、因子Ｘａ　（Ｊ、　ＨＡＵＰＴＡＩＡＮＮ。

Ｂ、　ＫＡ　ｌ５ＥＲ，Ｆ、　ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ、　Ｇ、　ＮＯＬＩＡＫ−Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓ　ｔａｒｉ　ｓ　（ｓ　ｉｃ）Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　４３（１９８０）、０８〜１２３頁）を使用するものである。

テストは、実施例】で記載のように、粗フヵンの酸加水分解で得た平均分子量２０．０００＋２，０００のポリサッカライドで行う。このものを血栓誘因前に、０．１５０．０．６２５．１．２５．２．５及び５■／ｋｇの用量で貯液する。

各用量共５匹のウサギで行う。

抗血栓のＥＤ５０（生成した血栓の５０重量％減する量に対応する、有効量５０）の測定は、対数回帰で行い、ＣＬ４０■／ｋｇｉ　（０，２３■／ｋｇと０，６６■／ｋｇＯ間）の平均値が出る。採血は、静脈凝集の創製直後の静注後１０分で行う。各用量での平均結果を表■に要約する。

表■ ａ）セファリン　カオリン時間ｂ）トロンビン時間Ｃ）クイック時間これらの結果は、生体外で観察し、実施例３の表■で報告したものを確認するものである。

実験的血栓プロトコールに対し、但しＡ、フラクションの溶液のみを与えたコントロールのウサギでの結果もこの表に示す。

表■に、０．１５．０．６２５．１：２５と５■／ｋｇ用量での対側性血管から採取の湿潤トロンビュの平均重量を表■に示す。

表■ 抗補体活性をフカンの存在又は不存在下にＨＣ５０（溶血補体５０）のアッセイで測定する。ＨＣ５０アッセイは、ヒト血漿の補体系の古典的経路についての全体的官能活性を評価するものである。このテストは、ヒツジの赤血球〔この赤血球は、ヒツジ赤血球に対するウサギ抗体で最大に感作性にされている（Ｓｅ＝感作血球）〕の所定数の５０％溶解しつる新たに回収したヒト血漿の最小量を測定するものである。

補体系の古典的経路の蛋白は、外来要素としてこれらの赤血球を認識し、これらの赤血球に反応し継続的分解により活性化され、赤血球を溶解するヘパリンやフカンのようなポリマーの存在下でＨＣ５０をアッセイすることによりこれらのポリマーの阻害性を測定することができる。

阻害性は、ポリマー濃度の関数として細胞の溶解についての用量／応答カーブを作り、細胞の溶解を５０％阻止しうる４分の１に希釈のヒト血漿の一当たりのポリマー■濃度として与える。ポリマーの阻害性が弱い程、抗補体活性が大きい。

フカンの抗補体活性の測定には、酸抽出物（粗フカン）ならびに粗フカンの酸加水分解で得た異なる分子量のフラクションを用いた。

実験条件は次の通りである。

５０μｌの純ＮＨ３（正常ヒト血漿）を異なる濃度（０，２〜０．５■／−）のフカン５０μｌと混合し、３７°Ｃで３０分培養後、４９００μｌのＶＢＳ″０バッファーを加える。溶液へを得る。

ソノ上、０．３〜０．８ｄ（７）　Ｖ　Ｂ　Ｓ　”バッファーを０〜０．５−の溶液へを混合し全量０．８−とじ、０．２ｍＡ’の感作赤血球を混合物に加える。３７℃で４５分培養後、混合物を４℃で１３００ｇでｌＯ分遠心分離し、４１４ｍｍでＯＤの読みを行う。

ＶＢＳ−バッファーの組成ＮａＣ１（ｓｉｃ）　４２．５　ｇベロナール（ジエチルパルビタールナトリウム”）　１．８７５ｇジエチルバルビッール酸　２．８５ｇ蒸留水　加えて　１０００　ｍＩ！ｐＨは７．４に調製する。この溶液２０−を蒸留水８０−と混合し、０．０３Ｍ　Ｃａ　ＣＩ　ｔ　０．５−と０．１０Ｍ　Ｍｇ　Ｃ］　ｘの０．５ｍｌを加える。

得られた結果は、表■（第２＃Ｉ）に示される。フカンフラクションは、同一条件下で分析したヘパリンＨＩＯ３より３〜１００倍活性である。この活性は抗凝固活性と無関係である。

表■ 粗フカンならびに５〜１００ＫＤａの平均分子量を有するフラクションは、全体的に補体の活性を阻害し、ヘパリンより大きい抗補体活性を有することが分る。

実際、細胞溶解を５０％阻止するのにポリマーのヘパリン４■／　ｍｌを必要とするのに対し、同じ効果を得るのに粗フカン又は分割フヵンでは０．０３５〜１．９５■／−（分子量による）のみである。実施例１で記載のように作られた平均分子量１８０００ＫＤａのフラクションは、１．３■／ＴｒＬｌの濃度て細胞溶解の５０％を阻害し、平均分子量３〜１゜ＫＤａのフラクションは、０．２０ ■／ｒｒＬＩ！の濃度で細胞溶解の５０％を阻止する。

実施例７：Ｃ３ａとＣ４ａの放射線免疫アッセイによる測定活性化中波体層で遊離した蛋白Ｃ３ａとＣ４ａの濃度を放射線免疫アッセイ測定（ｓｉｃ）により上澄液で測定する。

アッセイはＣ３ａ−デサルグ１２５上放射線アッセイ　キット（アマースハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）より市販）を用いて次のようにしてのＶ　Ｂ　Ｓ　”／＜ッファーと１００μｌの各種濃度のフカン（０，１〜５■／ｒｎｌ）と混合する。

混合物を３７°Ｃで３０分間培養し、次いで１７００ｇで５分間遠心分離する。

１６０μｍの上澄液を除去し、それに、（補体の活性化をブロックする）１０μ ｌのＥＤＴＡ　（８，６６Ｘ１０−２Ｍ）を加え、次いで（アッセイ　キットに備えられた）沈澱剤の１７０μｌを加える。室温て５分間培養後に、混合物を１００００ｇで２分間遠心分離し、上澄液をＲＩＡに付す前に希釈する（１７４〜１１５１２）。

サンプルの活性（ＬＤ５０）は、ＮＨ３希釈１／４の１ｍｌに通常発生するＣ３ａの量を５０％阻害するのに必要なフカン量として表す。この阻害量は、フカン ■／ＮＨＳ希釈１／４−として表す。結果は表■（第３欄）に示す。

ＮＨ３希釈１／４中のＡｔ　（Ａｎ）のｏ、２１ｍｇ／＋ｎｊ’溶液は、ＮＨＳの自発活性化以下で０３の活性化の減少をする。

加えて、同じフラクションの０．５■は、ＮＨ３希釈１／４の１ｍｌ中に含まれかつ補体の全活性に必要な量より大きな量でアクチベター（１５■／ｒＩＬｌの濃度で、補体の全活性化にもたらす、セファデックス）に付したＣ３の活性化を全体的に阻害するのに十分である。

Ｃ４ａに関する結果は、表■（第４ａ）に示す。

上記の記載から明らかなように、この発明は、手段のやり方、具体例及びより詳細に記載した、適用の仕方に限定されない。

反対に、この発明の枠又は範囲から離脱することなく、当業者に理解される変形を含むものである。

国際調査報告一一一一一一一−ｅｗ　ＰＣｒ／Ｆ’Ｒ９０１００４２０国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１）褐藻植物から抽出された粗フカンの調節溶解で収得できること、ポリサッカライド標品を比較としたゲル濾過で測定した分子量が５ＫＤａより大で４０ＫＤａより小であること、硫黄含量が原フカンより大であること、夾雑蛋白が０．１５％より少ないこと、溶解性が原フカンより溶け易いことおよび抗凝固性と抗血栓性を有することで特徴付けられる褐藻植物から抽出したフカンから得られた硫酸化ポリサッカライド。２）平均分子量が２０ＫＤａより小さいか等しいことを特徴とする請求項１による硫酸化ポリサッカライド。３）平均分子量が２０ＫＤａと３０ＫＤａの間であることを特徴とする請求項１による硫酸化ポリサッカライド。４）硫黄含量が原フカンより２％〜２０％大であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１つによる硫酸化ポリサッカライド。５）フコスベシクロサスから抽出されたフカンの調節酸加水分解によって得られること、硫黄含量が原フカンより約１５〜２０％大であることおよび蛋白含量が０．０５％少ないことを特徴とする請求項４による硫酸化ポリサッカライド。６）アスコフリウムノドサムから抽出されたフカンの調節酸加水分解によって得られること、硫黄含量が原フカンより約２〜５％大であることおよび蛋白含量が０．０５％少ないことを特徴とする請求項４による硫酸化ポリサッカライド。７）ベルベチアカナリキュラータから抽出されたフカンの調節酸加水分解で得られること、硫黄含量が原フカンより約１５〜２０％大きいこと、蛋白含量が０．０５％より小であることを特徴とする請求項４による硫酸化ポリサッカライド。８）ウンダリアペナチフィダから抽出されたフカンの調節酸加水分解で得られること、硫酸含量が原フカンより約１０〜１５％大きいこと、蛋白含量が０．０５％より小であることを特徴とする請求項４による硫酸化ポリサッカライド。９）請求項１〜８の何れか１つによる少なくとも１種の硫酸化ポリサッカライドからなることを特徴とする生体外と生体内の両方で活性で、補因子ＨＣＩＩとＡＴＩＩＩの活性化剤である抗凝固、抗血栓剤。１０）褐藻植物を源とする粗フカンの調節溶解を行い、得られた溶解産物をゲル濾過で分割し、５ＫＤａより大で４０ＫＤａより小さい分子量のフラクションを回収することからなることを特徴とする請求項１による硫酸化ポリサッカライドの収得方法。１１）フカンの調節溶解が酸加水分解で行われることを特徴とする請求項１０による方法。１２）フカンの酸加水分解が、０．５〜１規定硫酸を４０〜５０℃の温度で１〜４時間作用させて行われることを特徴とする請求項１１による方法。１３）フカンの調節溶解が、放射線分解、すなわちフカンを特にガンマー線照射に付して行われることを特徴とする請求項１０による方法。１４）フカンの調節溶解が酵素加水分解によって行われることを特徴とする請求項１０による方法。１５）フカンの調節溶解が、物理的方法、特に超音波で行われることを特徴とする請求項１０による方法。１６）分子量が２０ＫＤａより小さいか等しいフラクションが回収されることを特徴とする請求項１１〜１５の何れか１つによる方法。１７）褐藻植物から抽出されたフカンおよび／またはそのフラクションからなることを特徴とする請求項１１〜１５の何れか１つによる補体活性化阻害剤。１８）褐藻植物から抽出されたフカンより得られ、５０ＫＤａより大きな分子量を有するフラクションからなることを特徴とする請求項１７による補体活性化阻害剤。１９）褐藻植物から抽出されたフカンより得られ、５〜５０ＫＤａの平均分子量を有するフラクションからなることを特徴とする請求項１７による補体活性化阻害剤。２０）請求項１〜８の何れか１つによる硫酸化ポリサッカライドからなることを特徴とする補体活性化阻害剤。