JPH04506209A - Ｒｎａウイルスに対するワクチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＲＮＡウィルスに対するワクチンの製造方法技術分野 本願発明はＲＮＡウィルスに対するワクチンの製造方法に関するものである。

背景技術 特にＲＮＡウィルスによって誘発されたものを含む多数のＲＮＡウィルス感染に 対して有効なワクチンを開発することが緊急に必要である。その際上記ウィルス には編心筋炎ウィルスのようなピコルナウィルス、インフルエンザＡのようなオ ルトミクソウィルスおよびマウス白血病／マウス肉腫ウィルスのようなレトロウ ィルスが含まれる。レトロウィルスにはまたヒト免疫不全疾病ウィルス（ＨＩ　 Ｖ）やヒトＴ−細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ　Ｉ）も含まれ、これらは精 神抑圧性で致命的な慢性疾患の原因である。ＨＩＶの場合には、今後２０年以内 に世界向な流行性疾患になる可能性がまさにある。

レトロウィルスは、ウィルス酵素、即ち逆転写酵素によるイソプツトＲＮＡから ＤＮＡを合成する中間段階がウィルス複製に介在している点で通常でない。これ が、これら核酸、特にＤＮＡを接種するとヒト対象でリボ核酸か転写されて感染 性ウィルス粒子または場合によっては発癌がもたらされるという複雑さを生じさ せている。

このような影響は提案のワクチン製造には明らかに受け入れられない。このよう なワクチンが感染性の可能性のある全ウィルス粒子を含まないこと、またワクチ ンが感染性であるか若しくは病原性であるかまたはＤＮＡに転写されるＲＮＡ或 いは感染性であるかまたは発癌性であるＤＮＡを含有してはならないことも同等 に重要である。

ピコルナウィルスおよびオルトミクソウィルスによる感染はＤＮＡ転写過程に関 係しておらず、それ故ウィルスＤＮＡ感染過程のどの段階にも存在していない。

ウィルスで感染された細胞の無傷核を分離して廃棄することによってＤＮＡウィ ルスに対するワクチンを製造することがヨーロッパ特許出願００８９８５４で知 られている。

次いで請求める抗原タンパク質は残っている細胞質フラクションから分離される 。細胞およびウィルスＤＮＡの９０％以上が感染細胞の核内に含まれているので 、上記方法によって細胞質フラクション中の抗原タンパク質に悪い影響を与える ことなく上記ＤＮＡの大部分が除去される。

発明の目的 本願発明の目的はＲＮＡウィルスに対するワクチンを製造することであり、その 際該ワクチンはウィルス粒子、合成ウィルスＤＮＡおよび活性ウィルスＲＮＡを 有していない。

発明の開示 上記目的は、細胞をＲＮＡウィルスで感染させ、感染細胞を細胞溶解に不十分な 時間および温度でインキニーベートし、無傷の細胞核を細胞の細胞質フラクショ ンから分離し、分離した細胞質フラクション中に固定剤を導入して細胞質フラク ション中のウィルス性抗原タンパク質を安定化させ、そして該ウィルス性抗原タ ンパク質を沈殿させることによって達成され、該タンパク質はワクチンの活性成 分を提供する。

発明を実施するための最良の形態 本発明の１つの実施態様はここで、例としてインフルエンザウィルスＡ、ＮＷＳ 株を参照して記載する。以下の記載中では、用語ウィルス粒子は全ウィルス構造 を述べているものとして理解すべきであり、該構造はタンパク質外皮で囲まれた 核酸からなっている。ある種のウィルスはタンパク質外皮を囲むエンベロープを 有しており、その場合には用語ウィルス粒子はエンベロープも含む。

ハムスター腎細胞（Ｂ　ＨＫ　−２１ＳＭａｃｐｈｅｒｓｏｎおよび５ｔｏｋｅ ｒ、　Ｉ　９６２）は回転ウィンチェスタ−瓶（２，５００ｍ／　）中で増殖さ せるため１０％ウシ胎児またはウシ新生児血清および１０％トリプトース（ｔｒ ｙｐｔｏｓｅ）ホスフェートブイヨンを補充したイーグル培地で培養する。培養 細胞の分別物は続いて使用するためグリセロール含有培地中−７０℃で貯蔵する 。

細胞はウィンチェスタ−瓶内でシート状にほぼ集密化させる。続いて各細胞シー トは予熱したイーグル培地で洗浄してウシ胎児血清を除去する。細胞は血清薄剥 条件下で２４時間維持する。この血清薄剥レベルでは記載した方法の結果得られ るウィルス抗原値はさほど減少しない。血清薄剥は以前には、得られたワクチン 中のウシ血清値を減少させるためワクチンの製造に必要であると考えられたが、 感染細胞の精製細胞質フラクションからウィルス性タンパク質を沈殿させる以下 に記載の工程の少なくとも幾つかによって血清薄剥工程を完全に省略できること が予想される。

上記インフルエンザウィルスは細胞当たり０．５から５プラ一ク形成単位の間で 血清薄剥細胞に加える。次いで、この培養物を細胞溶解を生じさせるには不十分 な段階までで且つ実質的に１００％の細胞変性効果が存在する段階で培養する。

細胞は穏やかに採集し、リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄しそして２Ｘ１０’個の 細胞／−の濃度に再懸濁する。

ノニデソト（Ｎｏｎｉｄｅｔ　（Ｎ　Ｐ　−４０）　）はｌ容量％の濃度まで加 え、そして細胞は４°Ｃで１０分間維持する。ノニデット界面活性剤の濃度およ び温度は細胞核を崩壊させるには不十分であり、それ故細胞核は無傷のままで褐 り、そして実質的に細胞核の全内容物を保有している。ノニデットは細胞質から 細胞核を分離させ、そして細胞質中に存在する可能性のあるエンベロープのある ウィルスから重要な抗原タンパク質を取り除く。ノニデットはまたウィルス粒子 の感染性を減少させるが総合的には排除しないこともある。

細胞は４００ｇで１０分間遠心し、そして細胞調製物の細胞質フラクションであ る上清液を採集し、残っている物は廃棄する。この段階の上清液はウィルス抗原 タンパク質、ウィルス粒子、ＢＨＫ細胞タンパク質および培地血清のりンパク質 、並びに少量のウィルスＲＮＡおよび細胞ＤＮＡをノニデット界面活性剤と共に 含有されている。

細胞質フラクション中のポリペプチド鎖は、ホルムアルデヒドまたはグルタルア ルデヒドのような既知の固定剤を０．０４％の最終濃度まで添加して室温で１８ 時間安定化させる。この工程はポリペプチド鎖の固定化に加えて残存ウィルスＲ ＮＡおよび細胞ＤＮＡを不活性化させそして残存ウィルス粒子を不活性化させる 。

得られたフラクションは残存核酸を崩壊させるのに役立つブローブソニケーター による超音波振動に付し、次いで４〇−容量のバケツ中で２０Ｗ／Ｖ％の濃度の スクロースクッション上８０．０００ｇで５時間遠心する。各遠心容器中の４ｒ ｒｌの上部フラクションは、ウィルス粒子またはウィルス核酸を含有しておらず 、これまでに添加したホルムアルデヒド、スクロースおよび界面活性剤のみなら ず、細胞および血清タンパク質と共にウィルス抗原タンパク質からなることが見 い出されている精製細胞質フラクションからなっている。

次いで、精製物細胞質フラクションは該フラクションからタンパク質を単独かま たは該タンパク質の抗体と組み合わせて沈殿させる方法に付す。この沈殿化は好 ましくは、アセトン、エタノールまたはメタノールのような極性の有機溶媒を添 加して実施する。これらの有機溶媒は水と混合するとき混合物の誘電率を低下さ せそしてタンパク質−タンパク質相互作用を増加させる。溶媒は細胞質フラクシ ョン中の水１部に対して溶媒１０部の比率でＯｏＣから一３０℃の間の温度で加 えられる。好ましくは、溶媒の温度は一１０℃から一２０℃の間である。沈殿物 は遠心によって分離されそして残っている溶媒は留去する。

次いで、沈殿物はリン酸緩衝生理食塩水中に再度溶解させ、そして貯蔵のため凍 結乾燥する。

このようにして得られたワクチン調製物は抗原性で、免疫原性でそして実質的に ウィルス核酸を有さないことが見い出されている。

上記した冷溶媒沈殿工程は精製細胞質フラクション中のタンパク質を全て沈殿さ せ、感染させる前にＢＨＫ細胞の血清薄剥が必要である。他の分離方法、例えば 所望の抗原タンパク質との抗原抗体複合体の形成によって血清薄剥工程を不要と することもできる。

上記した方法は他のＲＮＡウィルス、例えばピコルナウィルス（エンベロープの ない小ウィルス）またはＨＩＶまたはＨＴＬＶのようなレトロウィルスに適用可 能であり、その際ＲＮＡだけでなくＤＮＡも調製物から確実に除去されているこ とが重要である。レトロウィルスの場合には、ウィルスＲＮＡからウィルスＤＮ Ａへの転写は感染細胞の細胞質内で生起すると考えられているが、ウィルスＤＮ Ａのほぼ全体が感染後間もなく細胞核内にあることが知られている。最大の感染 性を確実にするか細胞溶解を生じさせるには不十分である時間感染細胞をインキ ュベートする本願発明の方法は、ウィルスＲＮＡまたはウィルスＤＮＡが感染細 胞の細胞質フラクション中に実質的に存在しないという効果ををする。上記した ように、分離された細胞質フラクションに実施された以後の固定、超音波処理お よび遠心工程によって残存ウィルスＲＮＡおよびＤＮＡ並びに残存ウィルス粒子 が先ず不活性化され、残存核酸か崩壊され、そしてウィルス粒子および核酸の残 存組織が除去される。

ｍ　恣　！Ｉ　審　鱗　失 国際調査報告 ｆ塾＠　＠ｌ０Ｉ６６３０Ｊ ＳＡ　３７６８３

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ＲＮＡウイルスで細胞を感染させ、細胞溶解を生じさせるには不十分な時間 および温度で上記感染細胞をインキュベートし、該細胞の細胞質フラクションか ら細胞核の無傷物を分離し、分離した細胞質フラクションに固定剤を加えて該フ ラクション中のウイルス抗原タンパク質を安定化させ、そして上記ウイルス抗原 タンパク質を沈殿させる、その際該タンパク質はワクチンの活性成分を提供する 、ことからなるＲＮＡウイルスに対するワクチンの製造方法。
2. ２．上記細胞が上記ウイルスによる感染前に血清奪剥されている請求項１に記載 の方法。
3. ３．細胞質フラクションからの細胞核の分離が、細胞核を崩壊させるには不十分 な濃度および温度並びに時間界面活性剤で上記細胞を処理しそして処理細胞を遠 心することによって実施される請求項１または２に記載の方法。
4. ４．安定化した抗原タンパク質を含有する細胞質フラクションが超音波振動に付 される上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
5. ５．超音波処理したフラクションを遠心してウイルス粒子を除去しそして上記細 胞質フラクションの上部精製フラクションを提供する請求項４に記載の方法。
6. ６．上記ウイルス抗原タンパク質が、上記細胞質フラクションの誘電率を低下さ せ且つタンパク質−タンパク質反応を高める極性有機溶媒を加えることによって 沈殿させられる上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
7. ７．上記溶媒が０から−３０℃の間の温度である請求項６に記載の方法。
8. ８．沈澱したウイルス抗原タンパク質が細胞質フラクションから遠心によって分 離される請求項６または７に記載の方法。
9. ９．上記ウイルスがピコルナウイルスである上記請求項のいずれか１項に記載の 方法。
10. １０．上記ウイルスがレトロウイルスである上記請求項のいずれか１項に記載の 方法。
11. １１．上記ウイルスがオルトミクソウイルスである上記請求項のいずれか１項に 記載の方法。