JPH04506220A

JPH04506220A - ウイルス感染予防の誘導

Info

Publication number: JPH04506220A
Application number: JP3506292A
Authority: JP
Inventors: ジラール，マルク
Original assignee: アンステイテユ・パストウール
Priority date: 1990-03-19
Filing date: 1991-03-16
Publication date: 1992-10-29
Also published as: EP0472706B1; EP0742229A3; ES2104695T3; CA2057040A1; JPH03271233A; EP0742229A2; GR3024670T3; EP0472706A1; AU7498991A; DK0472706T3; AU6461594A; AU7196098A; ATE154244T1; WO1991014449A1; DE69126486D1; DE69126486T2; AU651816B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ウィルス感染予防の誘導本発明は、初回免疫抗原の同時又は連続使用を含むワクチン接種方法に係る。この場合、初回免疫抗原は、糖タンパク質、例えば、ＨＩＶＳＳＩＶ、または、天然宿主に＾１０５を誘発することのできるレンチウィルスから得たもの、または、）ＩＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−１１タイプのレトロライスルから得たもの、及び、合成オリゴペプチドから成る増幅組成物であって、そのオリゴペプチドは、遊離しているかまたは担体分子に結合しており、かつ、オリゴペプチドが、当該糖タンパク質の中和エピトープに相当するものである。

ウィルスに対する有効なワクチン組成物は、ウィルスの迅速な中和をもたらすものでなければならない。これは、ウィルスが、休止期にある細胞の染色体の内部で、潜伏するプロウィルス形態を取っておそらく自らを防衛したり、または、免疫系の手の届かないような細胞区画や組織区画に逃げ込んだりできないようにするためである。

）（ＩＶについてはチンパンジーで、ＳＩｖについてはマカック属サルで行なわれた先行実験から、ウィルスエンベロープの糖タンパク質だけの接種では、予防性の十分な免疫応答は得られないことが明らかになっている。特に、ウィルスエンベロープ糖タンパク質は、感染に対する予防を施すに足るほどの十分な量の中和抗体を産生じない。

従って、この分野においては、ウィルス感染に対して感受性を有する宿主において、当該ウィルスに対する十分な量の中和抗体を誘発する方法が要求されている。さらに、この分野においては、この方法に使用される医薬組成物に対する要求がある。

本発明は、この分野におけるこのような要求を実現することを補佐するものである。本発明の一つの目的は、ウィルスエンベロープ糖タンパク質と少なくとも一種のペプチドとを組み合わせることによって、あるウィルスの、少なくとも一種のエンベロープ糖タンパク質の免疫原性を強化することである。当該ペプチドは、好ましくは、異なる時期に投与するのがよく、また、エンベロープ糖タンパク質の配列から得られたもので、ウィルス中和エピトープすなわち、そのものが投与される宿主において、中和抗体の産生に関わるアミノ酸配列に相当する一群のペプチドである。

従って、本発明は、ある宿主においてウィルスのエンベロープ糖タンパク質の免疫原性を強化する方法、及び、その方法に使用するための組成物を提供する。この方法は、ウィルスの、少なくとも一種のエンベロープ糖タンパク質と、このエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列から誘導された少なくとも一種のペプチドとを宿主に投与することから成る。このペプチドは、少なくとも一種のウィルス中和エピトープから成る。このエンベロープ糖タンパク質とこのペプチドは、宿主に対し、中和抗体を誘発するに十分な量で投与される。

本発明は、ある決められたウィルスのエンベロープ糖タンパク質の免疫原性を強化するための組成物を提供する。本発明の組成物は、同時に、別々に、または順次に使用するための併合製剤として、次のものを含む。

（Ａ）当該ウィルスの、少なくとも１種のエンベロープ糖タンパク質、または、当該糖タンパク質の少なくとも５０アミノ酸のフラグメント、及び（Ｂ）当該エンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列から誘導された少なくとも１種のペプチド。

ここで、当該ペプチドは、少なくとも１種のウィルス中和エピトープを含んでおり、並びに、当該エンベロープ糖タンパク質及び当該ペプチドは、中和抗体を誘発するに十分な量で宿主に投与される。

本発明において、「組成物」という用語は、複数の成分−この場合は、エンベロープ糖タンパク質及び、そのエンベロープ糖タンパク質から誘導されたペプチド −を混合物として、または、並存物として与える、そのような併合製剤をも含むことを意図したものである。したがって、並存物の場合、宿主にたいし、同時に、別々にも、間隔をおいて与えることができるものである。

例えば、この組成物中に存在するペプチドは、その他の成分と分離しておくこともできる。そうすることによって、エンベロープ糖タンパク質によって初回感作された免疫原性反応を追加抗原刺激するために、継続的に投与することができる。

ドとから成る組成物を提供する。ここで、エンベロープ糖タンパク質は、投与されるべき宿主において中和抗体の誘発のために初回感作するに十分な量で存在し、かつ、少なくとも一種のペプチドは、その投与されるべき宿主において効力持続性の中和抗体の誘発を強化するのに十分な量を有゛する。

従って、本発明は、あるウィルスのエンベロープ糖タンパク質を、中和抗体を誘発するために宿主に投与するに際し、その糖タンパク質の免疫原性を強化するための、少なくとも１種の上記ペプチドの使用に関わる。

本発明の組成物は、免疫治療薬の調製に用いることができる。

この場合、その組成物は、中和抗体のレベルを増すことによってウィルスの抑制を可能にするために、血清陽性の人に投与される。

方法は、次の文献にＪ、　５ａｌｔによって記載されている。４゜Ｃｏ１１ｏｑｕｅ　ｄｅｓ　Ｃｅｎｔ　Ｇａｔｄｅ＋−Ｒｅｌｔｏｙｉｒｕｓｅｓ　ｏｆ　ｈｕｌＩｌａｎ　ＡＩＤＳ　ａｎｄｒｅｌａｔｅｄ　ｘｎｉｍａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ−Ｅ＋１．　Ｍ、　Ｇｉｒａｒｄ、Ｌ、Ｙａｌｅｌｌｅ　−Ｆ。

ｎｄ［ｉｏｎ　Ｍｅ＋１ｅｏｘ　−１９９０，ｐ、２７３−２７８およびＮａｔｕｒｅ　３２７，４７３−４７６、　１９１１９゜本発明はまた、ウィルスによる感染に対して、宿主をワクチン接種するための組成物を提供する。この組成物は、そのウィルスの少なくとも１種のエンベロープ糖タンパク質を、このエンベロープ糖タンパク質が投与される宿主においてワクチン接種のために初回抗原刺激するに十分な量で含有する。この組成物はまた、上記エンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列から誘導された少なくとも１種のペプチドを含む。このペプチドは、その糖タンパク質の少なくとも１個のウィルス中和エピトープを含む。本発明の組成物は、宿主において効力持続性の中和抗体の誘発を強化するのに十分な量のペプチドを含む。

ここに定義された組成物をワクチンとして使用することに関する本発明の記載はまた、本発明組成物の免疫治療薬としての使用にも適用することができる。ただし、記載の手段は、中和抗体の産生を強化することができる場合に限る。

ペプチドとエンベロープ糖タンパク質は、非共有的な物理的組み合わせ、または、共有的な化学結合による相互作用を可能にするような条件下で、互いに組み合わせることができる。あるいは、本発明の好ましい実施態様において、ワクチン接種のための初回抗原刺激（プライミング）を、エンベロープ糖タンパク質を注入し、それに続いて、中和エピ−トープに相当する免疫原性ペプチドを注入することによって免疫予防を強化して、実現する。

免疫された３匹のチンパンジーのうち、２匹が、ウィルス感染に対してうまく予防され、もう−匹においても、本発明の組酸物と方法を用いて長期に亘って、ウィルスは制圧された。この結果は、本発明が、免疫処置により、）ＩＩＶ−１に対する予防（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を誘導することができることを証明するもの下記の図を参照することによって、本発明をもつと十分に説明する。

第１図は、チンパンジーＦＵＮＦＡＣＥ　（Ｃ−３３９）と対照（Ｃ−５１９）において、ＥＬＩＳＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓ７Ｓ７５ｌｅキツト）によって測定した抗ＨＩＶ抗体レベルを示したものである。結果は、血清ＥＬＩＳ＾抗体価（１：陽性反応を与える希釈率）を時間に対して示した。

図の時間ゼロは、不活性化ＨＩＶによる第１回追加抗原刺激の日に相当する。動物は、７０週で、告各÷４抗原刺激（チャレンジ）を行なった（矢印）。

第２図は、ＫＬＨ−ＢＲＵペプチド接合体の注入（矢印）に応答する、チンパンジーＦＵＮＦＡＣＥ　（黒丸）とＲＯＢＥＲＴ　（白丸）における中和抗体レベルの変化を示す。両動物には、０．３．９週（矢印）で接種し、２４週でチャレンジを行なった。

第３図は、チンパンジーＲＯＢＥＲＴ　（Ｃ−４３３）においてＥＬＩＳＡによって測定した抗ＨＩＶ抗体レベルの変化を表わす。結果は、血清ＥＬＩＳＡ抗体価（１：陽性反応を与える希釈率）を時間に対して示した。時間ゼロは、第１回の抗原注射（ｇｐ１６０　ｅｎマ、Ｄ２７ｎｅＬ　ｐ２３ｖ目、ｐｌｇｇｘｇ　）の日に相当する。動物は、８４週で、チャレンジを行なった（矢印）。

第４図は、チンパンジーＪＯＪＯＴＯＯ（４９９）、ＩＲＡ　（１５１）、　ＨＥＮＩＩＹＩＩ　（５３１）において、旧Ｖ−１８ＲＵの中和を血清の希釈率の関数として表わしたものである。遊離ペプチドの３回目接種後ゼロ時（Ｅｌ）　、２週（ロ）、５週（◆）目の結果である。

第５図は、チンハン’）　−ＪＯＪＯＴＯＯ（Ｃ−４９９）　＋：オイテ、ＨＩＴ−ＢＲ■（点線カーブ）、）ＩＩＶ−１＾ＲＶ−２（実線カーブ）を、血清希釈率の関数として示したものである。遊離ペプチドの第３回接種ゼロ時目（ロ）及び接種後（◆）の結果である。

ｊｌ！６図は、チンパンジーＣ−３３９（＾）、　Ｃ−４３３ＣＢ）及びＣ−４９９（Ｃ）における、ＨＩＶ−１特異抗体の全抗体価を示す。指定の時間に、チンパンジーに各種免疫原（第１表参照）を接種、または、）１１Ｖ−１でチャレンジした。抗体価は、）ＩＩＶ−Ｉ　ＥＩＡキット（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓ７ｔｊｅｍｓ　）で陽性になる最大希釈率の逆数と定義した。

第７図は、ＨＩＶ−１抗原による免疫時における、Ｃ−３３９，Ｃ−４３３及びＣ−４９９の血清の中和抗体の抗体価を表わしたものである。抗体価は、非免疫チンパンジーのコントロール血清から得られた値と比較してＣＥＭ−３３細胞によって形成される多核体の数を９０％減少させる、血清の最大希釈率の逆数である（Ｎｓｒａ。

Ｐ、Ｌ、、　Ｈａｔｃｈ、　Ｗ、Ｃ，、Ｄｅｎｌｏｐ、　Ｎ、Ｍ、、　Ｒｏｂ＊７．　Ｗ、Ｇ、、＾ｒｌｂ＋ｒ、　Ｌ。

０、　、　Ｇｏｎｄｘ、　Ｍ、＾、　＆　Ｆｉｓｃｈｃｔ、　Ｐ、Ｊ、（ｔ９８７）　＾ＩＤＳ　Ｒｅｓ、　ｌｌｏｍｕＲｔｌｒｏｖｉｒｗｓｅｓ　３．２８３ −３０２　）。

第８図は、チンパンジーＣ−３３９及びＣ−４３３をＨＩ　Ｖ−１テチヤレンジして６力月後に得られたＰＢＭＣ及びリンパ節組織からのＤＮＡのＰＣＲ分析の結果を表わす。

（Ａ）は、プライマー取り込みセットによるＰＣＲ２ラウンド後の、増幅ＨＩＶ配列の臭化エチヂウム染色ゲル像。ＨＩＶ特異的増幅フラグメントの大きさは、１４１塩基対である。

レーン１は、分子量マーカーとしての、Ｈｘｅｌｌｌを用いて切断された０、５　ｕ　ｇノ０Ｘ１７４　ＤＮＡ。

レーン２−７は、感度を示す陽性コントロールであって、レーン２の３０００分子から始まり、各々、Ｘｂａｌによって切断されたｐＨＸＢ２の分子を、直前サンプルの１０分の１含む。各サンプルは、非感染コントロール・チンパンジー、Ｃ−５１９から得た１μｇ　（１，５ｘｌＯ５細胞中のＤＮＡ量）のＤＮＡ存在下で増幅された。１つの陰性コントロールサンプル（レーン１４）を特定し、非感染チンパンジーの細胞ＤＮＡ源として用いた。他のサンプルはすべて、盲検法でテストした。Ｃ−４８７は、１（ＩＶ−１感染チンパンジーであり、陽性コントロールとして用いた。

レーン８−１１は、それぞれ、Ｃ−３３９，Ｃ−４８７，Ｃ−４３３，Ｃ−５１９のＰＢＭＣから得たＤＮＡである。

レーン１２−１５は、それぞれ、Ｃ−４８７，Ｃ−４３３，Ｃ−５１９，Ｃ−３３９のリンパ節組織から得たＤＮＡである。

（Ｂ）ベーターグロブリン遺伝子（Ｓｃｈ＊百、　Ｓ、１．、　Ｈｏｒａ、　Ｇ、？。

・＆　Ｅｒ１ｉｃｈ、　）１．＾、（１９８６）　５ｃｉｓ＋＋ｃｅ　２３３．　１０７６−１０７８　）増幅部の臭化エチヂウム染色ゲル。これは内部コントロールとなる。

（Ｃ）ＰＣＲ増幅配列のオリゴヌクレオチド・ノ＼イブリダイゼーシ薔ン。（Ａ）に示したＰＣＲ反応生成物を変性し、［３２Ｐ］標識プライマー５Ｋ１０２でアニーリングした。このプライマーは、増幅配列内部で完全にアニーリングする。生成物は、ＫｖｏｋとＫｅｌｌｏｇｇ　（Ｋｖｏｋ、　Ｓ、　＆　Ｋｅｌｌｏｇ、　Ｄ、Ｅ、（１９９０）　ｉｎ　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ；＾Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｓｊｉｏｎｓ　：　ｅｄｓ、Ｉｎｎ１ｓ、Ｌ、非感染チＭ、＾、、　Ｇｅ１ｆｓｎｄ、　Ｄ、Ｈ，、５ｎｉｎｓｋ７．　Ｊ、１．　＆　ＷｈＨｅ　Ｔ、Ｊ。

（＾ｃｓｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、Ｓ＆ｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）　ｐｐ、３３７−３４７）に従って、ポリアクリアミドゲル電気泳動とオートラジオグラフィーによって調べた。

第９図は、チンパンジーＣ−４３３，Ｃ−３３９及びＣ−４９９を免疫し、チャレンジした後の、ＨＩＶ−１蛋白質特異抗体のイムノプロット分析の結果を示したものである。血清サンプルを１＋２００に希釈し、市販のキット（Ｄｉｘｇｎｏｓｌｉｃｓ　Ｐｘｓｔｅａｒ　）でテストした。

図示したサンプルの場合、血清は、チャレンジ（矢印で示す）の１ケ月前に採集し、その後は、４週問おきとした。）ＩＩＶ−１タンパク質の分子量は、陽性コントロール血清に示す通りである。

第１０図は、本発明に従って処理したアカゲザルにおける、抗ｇｐ１６０　ＥＬＩＳＡ抗体価を示す。

第１１図は、本発明に従って処理したアカゲザルにおける、抗Ｖ３　ＢＲＵ抗体の抗体価を示す。

本発明の好適実施態様ワクチン接種によりチンパンジーをＨＩＶ感染から予防しようという従来の試みは失敗している。これは、下記の、いくつかの異なるタイプのワクチンを使用したにもかかわらずそうであった。例えば、合成ペプチド、ＨＩＶ抗原を発現する、組換えワクチニアウィルス（ＶＶ）の生存株、天然ないし組換えｇｐ１２［１若しくはｇｐ１６０のエンベロープ抗原、及び不活性化したウィルス全体、である。組換えｖｖで最初のワクチン接種を行った後に、フォルマリンおよびベータプロピオラクトンで不活性化したＨＩＶ全体でワクチン接種を行うことによって、感染性ＨＩＶのチャレンジによる感染から、チンパンジーを予防しようとして失敗したことについては既に記載した。

この失敗から、二つの考えが生まれ、それに基づいて本発明の方法が導かれた。

１、細胞非含有ＨＩＶによって感染予防を実現するには、おそらく高濃度の中和抗体（Ａｂ）が必要であろう。もしウィルスが、Ａｂすなわち抗体依存性の細胞性細胞毒性（八〇ＣＣ）を中和することによって撲滅を免れたならば、このウィルスは、組み込みプロウィルスとなることによって、および／または、骨髄ないし中枢神経系の細胞に感染することによって、免疫系から簡単に身を守ることができる。たとえ僅かなものであれ、ウィルスの複製が行なわれたならば、これは、中和を免れた変異株の早期出現に導くことになる。従って、チャレンジ・ウィルスの迅速な中和が、ワクチン接種の成功の鍵となろう。

２．１９９０年までにチンパンジーで試みられた全てのワクチンによる中和Ａｂの誘発は、並の程度であった。これは、この動物を感染から保護できていないことを物語るものであろう。

従って、有効であるためには、ワクチンは、これまでのもの以上に高い中和Ａｂの抗体価を誘発しなければならない。

このため、各種免疫原による連続免疫養生法を用いて、チンパンジーに可能なかぎり最高の中和Ａｂ価を誘発しようと試みた。

Ｃ−３３９という一匹のチンパンジーを、最初に、フォルマリン及びベータプロピオラクトンで不活性化したＨＴＶ全体２５０μｇを、１ｍｇスレオニルＭＤＰ濃縮液を用いて５ＡＦ−１と混合して得た混合物を４回注射（０，１，２，６ケ月目）して免疫Ｐａ５ｔｅｕｒのＥＬＡＶＩ人キットによって、カットオフ０．１で、１：２００．０００　）　、ウェスタン・プロットにより、ｇｐ１６０．　ｇｐ１２０゜ｇｌ１４１　凹、およびｐ５５．　ｐ４Ｇ、　ｐ２５．　ｐ１８ｇｘｇに対して強い反応性を示した。その中和Ａｂの抗体価は、２種の異なる中和アッセイを用いたところ、それぞれ、１：４００及び１．６４であった。

第１のアッセイは、ＭＴ４細胞における免疫蛍光性スポット形成（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｌ　ｆｏｃｉ　ｆｏｒｍｓｊｉｏｎ）の５０％抑制をもとにスコアしたもので、２番目のものは、ＣＥＭ−３Ｓ細胞のレンジチウム形成（ｓ７ｎｅｙｔｉａ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の９０％抑制をもとにスコアしたものである。さらに厳しい測定法を用いると（新鮮なヒトＰＢＬにおける逆転写酵素産生の１００％抑制）、中和Ａｂの最高抗体価は、追加抗原刺激のための注射の直後に得たものでは、１：１６０であった。しかしながら、この抗体価は持続せず、急速に減衰して低レベルになった。

チンパンジーＣ−３３９の中和Ａｂの抗体価を増す試みとして、その動物を、ＶＶ−１６３で感染したＢＨＫ−２！１培養細胞の上清から精製した組換え可溶性ｇＰ１６０ｅｎｖ　、膜貫通ドメインの欠損を含むｇｐ１６０分子を発現するＶＶ−ｅｎｖ組換え体、及び、ｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位の部位特異的突然変異誘発によって、切断を受けないようにした改変体を用いて繰り返し追加抗原刺激した。ワクチニアウィルスＶＶ−１１６３は、Ｋｉｅｎ７　ら、Ｐｒｃｌｅｉｎ　ＥＢｉｎｅｅｒｉｎｇ　２＋２１９−２２６　（１９８８）に記載の方法を用いて作製することができる。

この抗原を、レクチン及び陽イオン交換クロマトグラフィーによって順次精製し、次に、ヒト用量のＢＣＧとともに、胸部の多数部位に、皮内注射した（１回の注射あたり　１２５−１５０μｇ）。

この後、ＳＡＦ処方の抗原を、３回連続で筋注した。ＥＬＩＳ＾抗体価及び中和Ａｂ価について、通例として、その経過を追った。

しかしながら、両方とも、この免疫過程を通じて、また、その後も、変わらなかった。

ｇｐ１６０ｅｎｖが、抗体反応を強化できなかったのは、免疫原性がないためではない。これは、それ以前には）（ＩＶ抗原に触れさせていない未処理チンパンジーＣ−５１９を並行して免疫することによって判明した。Ｃ−３３９に用いたものと同じ免疫養生法を用いると、Ｃ−５１９は、すぐに、強い抗ｇｐ１６０　Ａｂ反応を生じ、そのＥＬＩＳ＾抗体価は、２回の注射で、２０Ｇ、　Ｏ［ＩＯに達した。従って、Ｃ−３３９が、ｇＰ１６０ｅｎｖの注射に反応しなかったのは、免疫原の活性の不足ではなく、もっとも考えられるのは、恐らく、その動物の体内に未知の免疫ブロックがあるためであろう。このような障害は、中和Ａｂの誘発に必要なｓ　ｇｐ１２Ｇ分子のエピトープだけを動物に注射することによってかわすことができるだろうと、推量した。

ＨＩＶ中和Ａｂは、主に、ｇｐ１２０のｖ３領域由来のタイプ特異的な、変動性の高いループに対するものであることが判明している。従って、ビス−ジアゾベンジジンを用いて、ＨＩＭ−Ｉ　ＢＲＵ　（ｌｌｌｂ）株由来のコノループの配列、４−　（ＹＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮ）を持つ２５マーのオリゴペプチドを、ＫＬＨに架橋させた。Ｃ−３３９に、ＳＡＦの存在下、当該ペプチド−担体接合体（ペプチド３００μｇ）を、０．３及び１９週目に注入した。

ＥＬＩＳＡ抗体価の上昇は認められなかったが、持続性の中和Ａｂ価が、第２回注射後に得られた。この動物を、別様ではあるが、並行して免疫過程を実施していた別のチンパンジーＲＯＢＥＲＴ　Ｃ−４３３と共に、２６週目にチャレンジした（下記参照）。

チンパンジーＣ−４３３は、ＹＶ−１１３９なるＶＶ組換え体で初回抗原刺激した。この組換え体は、ＶＶ−１６３と同様の、　ｇｌ１６０ｅｎｖの非切断変種を発現するが、膜貫通領域を含まない。ワクチニアウィルスＶＶ−１１３９は、ＫｉｅＢ　ら、Ｐｒｏｌｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２：２１９−２２６　（１９８８１に記載しである方法を用いて作製することができる。肉芽形成（ｓｃｘｒｉｌｉｅｘｌｉｏｎ　）は、２Ｘ１０８ＰＦＵ　（７）ＶＶ組換え体を用いて行い、４週と２２週に繰り返した。次に、この動物を、前記のように精製した可溶性組換え体ｇｐ１６０、並びに、ＳＡＦと混合し７た組換え体＋１１．８！ＩＩリー、ｐ２７＋＋ｅ！−及び９２３但（Ｅ、ｃｏｌｉから精製）、それぞれ１２５−１５０μｇで免疫した。注入は、０．１．２．６ケ月目に実施したところ、ＥＬＩＳＡ抗体価ｉｔ、１：４００．００Ｇになった。しかしながら、またしても、中和Ａｂの抗体価は低いままであった（免疫蛍光スポットアッセイ、レンジチウム形成アッセイで、それぞれ、ｌ；４００．１：１２Ｂであった）。このため、Ｃ−４３３には、Ｃ−３３９と同じ免疫養生法を用いて、同じｖ３ペプチド−ＫＬＨ接合体を注入した。Ｃ−４３３の中和Ａｂの抗体価は、ただちに、数倍の急上昇を見たので、この動物を、　Ｃ−３３９と並行してチャレンジした。

この２匹の動物を、国立癌研究所（Ｌｘｒｒｙ　Ａｒｊｈｕｒ、　ＮＣＩ、　Ｆｒｅｄｅ「ｉｃｋ、　ＭＤの恵与による）から得た、抗体価既知のウィルス・ストック（ＩＩＩ　Ｂストック、ロフト番号４０）を用いてチャレンジした。１［１’　ＴＣＩＤ５０／ｉｆを含むこのストックをｌ：１００に希釈し、その希釈液の１ｍｌを、この免疫した動物の両方に静注した。動物を不必要に使用することを防ぐため、また、このウィルス・ストックは、以前に、２度、チンパンジーで抗体価を測定しており、チンパンジーに対するその感染性は定期的に観測されているという事実に鑑み、本実験には、未処理の、コントロール動物は使用しなかった。このウィルス・スト・ツクのチンパンジーに対する　ＩＤ５０は、４　ＴＣＩＤ５０に相当するものであり、二つの実験において、４０　ＴＣＩ０５０を注射したところ、注射後早くも２週間で、ＰＢＬ中に検出可能なウィルスの出現を見、その後、４週で、血清交代（セロコンバージラン）が起こった。

これとは対照的に、チンパンジーＣ−３３９，Ｃ−４３３を、１００　ＴＣＩ０５０でチャレンジしたが、チャレンジ後に経過した２４週の間に、抗体価の検出可能な上昇は見られなかった。さらに、Ｃ，−４３３は抗１１２５■ｇ　Ａｂを生成せず、Ｃ−３３９は抗ｐ２７＋ｅｆ　Ａｂを生成しなかった。また、創動物とも、抗ｐ６ａｐｏｌ　Ａｂを生成しなかった。

チャレンジ後６．１２．２４週に、両チンパンジーから得たＰＢＬでＰＣＲテストをしたところ、結果は陰性であった。ところが、１年前にチャレンジし感染していた免疫の不十分なチンパンジー（Ｃ−４８７）は、ＰＣＲにおいて陽性であった。最後に、Ｃ−３３９又はＣ−４３３のいずれかのＰＢＬとヒトＰＢＬとの同時培養を行なったが、ウィルスは回収されなかった。これは、６週間の培養後にも、ＲＴ活性の見られないことからそう判断したものである。

すでに了知されていることであるが、「中和エピトープ」とは、ＨＩＶ−４の場合、主要なウィルス中和エピトープを指す、すなわち、いろいろある中でも、例えば、１９８６年にＰｕｔｎｅ７ようなものを指す。この場合、問題の配列は、すでにＭｙｅｒｓらの研究（ｌｌｕｍ＊ｎ　Ｒｅｔｒｏｗ旨ｕｓｅｓ　ｕｄ　ＡＩＤＳ　１９ｆ１９．−　Ｌｏｓ＾ｌｕ＋ｏｓ、　Ｎａｔｌ、　Ｌｓｂ　）に述べられているような、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列２９６から３３１にほぼ相当する。

さらに本発明に関わるものとして、ＨＩＶ−１の様々な変種や別（７）　し）　ｏ　ｆｙイルス（ヒト（Ｄ　ＨＩＴ−２，ＨＴＬＶ−１又ハ）ＩＴＬＶ−１１やＦＩＶ、　ＦｅＬＶ　）や動物の別のレンチウィルスの、等価領域に相当するペプチド、また、ここで扱うウィルスの中和エピトープに相当するペプチドがある。

さらに、本発明の範囲内に入るものとして、マイナーな中和エピトープとして知られるものに相当するペプチドがある。このエピトープは、エンベロープ糖タンパク質の保存領域に属し、比較的低い抗体価で、ここで扱うウィルスの数種の異なる分離株を中和することが可能な抗体を誘発するという特徴を持つ。

分離株としては、例えば、）ＴＩＶ−１の数種の異なる分離株、または、ＨＩＶ −１、さらにはＨＩＶ−２の、異なる分離株がある。マイナーなエピトープの例は、１９８６年のＣｈｇｎｂらの１ｒｕｓｅｉ　ｏｊ　ｈｕｍｘｎ　ＡＩＤＳ　ｉｎｄ　ｔｅｌａｊｅｄ　ａｎｉｍａｌ　ｄｉｓｅｉｓｅ　”　、Ｍ。

Ｇｉｒｘｔｄ　ｓｎｄ　Ｌ、　ＶｓｌｅＮｅ、　Ｆｏｕｎｄｘｊｉｏｎ　Ｍｘｒｃｅｌ　Ｍｅｔｉｅｕｘ、　Ｌ７ｏｎ。

１９９Ｇ、印刷中、の中に見ることが出来る。

メジャー及びマイナーな中和エピトープの免疫原性ペプチドは、最大の予防効果を確保するために、互いに混合するのが好ましい。それらのペプチドは、担体分子に結合させず、遊離状態で投与してもよい。また、同一のレトロウィルス、または、そのウィルスと免疫学的交差反応の可能なレトロウィルス、特に１９８９年８月１８日出願の、フランス国特許出願第８９．　ｔｔ０４４号（Ｇｉｒｕｄ −Ｇｌｕｃｋｍｘｎ−Ｂｓｈｒｓｏｕｉ　）に記載しであるものの１個ないし数個の構造タンパク質又は非構造タンパク質から得た、１個、好ましくは数個のＴ −エピトープを持つアミノ酸配列と組み合わせてもよい。

本発明の特に好ましい実施態様の一つにおいては、中和エピトープに相当する免疫原性ペプチドを、Ｔ−エピトープに相当するアミノ酸配列に化学的に結合させる。もう一つの態様においては、例えば、二官能性試薬又は所望の他の結合剤と当該ペプチドとを反応させることによって、そのペプチドを、望ましいＴ−エピトープを持つ担体分子に結合させる。

担体分子としては、そのウィルスゲノムによってコードされ一用−思・匣−川・ユ・−■・コ・上り里・またはｎｅｔ遺伝子によって産生されるタンパク質）。

また、その他の（タンパク質量の）分子、例えば、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、テタヌス類毒素、ヘモシアニン、ヒトアルブミン、ポリペプチド（例えば、ポリリジン）や、適当なりポペプチド類も使用できる。

本発明の、ある特定の実施態様においては、エンベロープ糖タンパク質分子と、メジャー及びマイナーな中和ペプチド（遊離していても、担体分子に結合していてもどちらでもよい）とを組み合わせて、同一ワクチン製剤としたのであるが、このエンベロープ糖タンパク質のプライミング効果は、１回ないし数回のワクチン注入後に現われ、また、その直後にペプチドによる増幅効果が現われた。

上記から、本発明の目的の一つは、ここで扱っているレトロウィルスの血清型の各々の、数種のエンベロープ糖タンパク質であって、免疫系の反応を初回抗原刺激する作用をする第一抗原と、ここで扱うウィルスの様々な血清型の、メジャーな、そして恐らくマイナーなものも含めて、中和エピトープに相当する合成ペプチドである第二抗原とを、特に、持続的な、高い抗体価を持つ中和抗体を誘発することによって、最初の免疫反応を増幅及び強化する目的で、ワクチン接種に使用することにある。本発明は、約６ケ月、さらには１年以上にも持続する免疫を誘発することを可能にする。

免疫系の反応を初回抗原刺激するのに用いられる糖タンパク質は、可能な切断の前に得られるような分子全体であることが好ましい。したがって、ＨＩＶ−１の場合、ｇｐ１６０の方がｇｌｌ１２０よりも好ましく、同じことが、他のレトロライスルについても言える。ｇｐ１６Ｇによって、特に、抗ｇｐ４１抗体を誘発することができるが、これは、ウィルス・キャリアーにとっては望ましい兆候である（Ｋｌｓｓｓｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｊｌ、＾ｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５：５２２５−５２２９）。

「増幅体（ｓｍｐｌｉ＋１ｅｔ）Ｊを構成するペプチドは、遊離のものでも、担体分子に物理的（特に、疎水結合によって）又は化学的（特に共有結合によって）に結合したものでもよい。また、当該ペプチドは、Ｔ−エピトープに相当する他のペプチドに結合していていもよいし、あるいは、ペプチド、リポペプチド、糖タンパク質、脂肪族鎖、脂肪酸、あるいは、免疫系を刺激したり、および／または、「増幅体」ペプチドを特異的に抗原提示細胞の標的にすることのできる前述のもののいかなる組合わせ物に結合していてもよい。

この観点から、ＨＩＶ中和エピトープに相当するペプチドの特に有利な提示形態は、そのペプチドを、好ましくは化学的共有結合によって、脂肪族配列、特に１９８９年にＤｅｒｅｓらの（Ｌｊｕｒｅ　Ｊ旦＋５６１−５６４）記載したものに結合させることである。ｑのようにして形成された増幅性ペプチドは、Ｂ細胞反応を誘発するばかりでなく、１９８８年にＴｘｋｇｎｓｓｂｉ　ら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａ　ｔ　１．＾ｃｇｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾　８５：３１０５−３１０９）が記載しているような、ＣＴＬ　ＣＤ８　反応即ち制限ＨＬＡクラス■をも誘発することができる。

ウィルスが、ＨＬＶ−１及びＨＩ　Ｖ−２の場合のように、高度の抗原変動を持っている場合は、初回抗原刺激用抗原をたった一種ではなく、各々が、ここで扱っているウィルスの一種の分離株または一群の分離株に相当する配列である、そのような様々な配列を持つ数種のエンベロープ糖タンパク質を用いて、望めるだけ多くの初回抗原刺激現象を得ることが必要である。

なぜなら、それらの各エンベロープ糖タンパク質が、単一の分離株または一群の分離株に対して特異的に作用するからである。

この場合、増幅性ペプチドは、下記に示すように、ここで扱う分離株の各々の中和ペプチドの混合物から成ることは理解されよう。

本発明のＨＩＶ−１増幅性ペプチドの調製物は、−文字アミノ酸コードで表わした下記の少なくとも一つの配列、または、その配列の一部を含むという事実によって特徴付けられる。

Ｃ−ＴＲＰＮＮＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡ　ＦＶＴＩＧＫ−ＩＧＮ　Ｍ− ＲＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳ　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡ　ＦＶＴＩＧＫ −ＩＧＮ　Ｍ−ＲＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＮＮＮＴＲＫＫ　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡ　ＦＶＴＩＧＫ−ＩＧＮ　Ｍ−ＲＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＮＮＮＴＲＧＳ　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡ　ＦＶＴＩＧＫ−ＩＧＮ　Ｍ−ＲＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳ　ＩＹＩ−ＧＰＧＲＡ　ＦＨＴＴＧＲＩＩＧＤ　−ＩＲＫＡＩｉ−ＣＣ− ＴＲＰＹＮＮＶＲＲ８ＬＳＩ−ＧＰＧＲＡ　ＦＲＴＲＥ−１１ＧＩ　−ＩＲＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＧＮＮＴＲＲＧ　ＩＨＦ−ＧＰＧＱＡ　ＬＹＴＴＧＩＶ−ＧＤ　−ＩＲＲＡＴ−ＣＣ−ＡＲＰＹＱＮＴＲＱＲＴＰＩ−ＧＬＧＱＳ　ＬＹＴＴＲ３Ｒ−Ｓｌ　−ＩＧＱＡトＣ。

Ｃ−ＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳ　ＩＴＫ−ＧＰＧＲＶ　ＩＹＡＴＧＱＩＩＧＤ　−ＩＲＫＡトＣＣ−ＴＲＰＮＮＮＴＲＫＲＩＴＭ−ＧＰＧＲＶ　ＹＹＴＴＧＱＩＩＧＤ　−ＩＲＲＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＧＳＤＫＲＱＳ　Ｔｌ’１−ＧＬＧＱＡ　ＬＹＴＴＲＧＲＴＫＩ　−ＩＧＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＧＳＤＫＫ！Ｉｔ　ＱＳＩＲＩＧＰＧＫＶ　ＦＹ［ＧＧ−−−１−ＴＧＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＮＮＮＴＫＫＧ　Ｉ＾１−ＧＰＧＲＴ　ＬＹＡＲＥＫＩＩＧＤ　−ＩＲＱＡＩＩ−ＣＣ−ＴＲＰＮＮＨＴＲＫＲＶＴＬ−ＧＰＧＲＶ　ＷＶＴＴＧＥＩＬＧＮ　−ＩＲＱＡＨ−ＣＣ −ＴＲＰＧＮＮＴＲＲＧ　５）ＩＦ−ＧＰＧＱＡ　ＬＹＴＴＧＩＶＧＤＩ　−ＲＲＡＹ−ＣＣ−ＴＲＰＤＮＫＩＴ、５ＲＱ−ＴＰＩ−ＧＬＧＱＡ　、ＬＹＴＴＲＩＫＧＤｌ　−ＲＱＡＹ−ＣＣ−ＴＲＰＮＮＮＶＲＲＲ−ＨＩＨＩ−ＧＰＧＲＡ　ＦＹＴＧＥＩＲＮＩ　−ＲＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＹＫＮＴＲＱＳ−ＴＰＩ−ＧＬＧＱＡ−ＬＹＴＴＲＴＫＳＩ　−ＧＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＮＮＮＴＴＲ３−ＩＨＩ−ＧＰＧＲＡ　ＦＹＡＴＧＤＩＩＧＴＩＲＱＡＨ−ＣＣ−ＴＲＰＮＹＮＫＲＫＲ−１旧−ＧＰＧＲＡ　ＦＹＴＴＫ旧ＩＧＤＩＲＱＡＨ−Ｃ少なくとも１つの中和エピトープを含む配列、特に、前記リストのものの一つと、少なくとも１つのＴ−エピトープを持つ担体配列を用いることによって行なう、本発明の増幅用分子の製造は、これらの配列を結合して行なってもよいし、または、同一組成で物理的に組み合わせてもよい。

十分に有効であるためには、初回抗原刺激用抗原と増幅用抗原を、例えば、また、好ましくは、脂質アジュバントで強化しなければならない。このアジュバントは、例えば、指軍乳濁液中のムラミルジペプチド誘導体、または、Ｆｒｅ、ａｎｄの不完全アジ。

ユバントである。

初回抗原刺激用抗原及び増幅用抗原５は、例えば霊長類、特にヒトのような宿主に筋注で投与することが好ましい。下記のものは典型的な免疫スケジュールであって、これは、　１ｐ１６ＧとＨＩＶのペプチドに使用することができる。

ｇｐ１６０　ペプチド（月）　（月）０、ｌ、（２１，、，６、、、１２，１３０，１，、ｇ、、、１２．、　１３．１４０、　１．　２．　１２　１．２．　（１２）この免疫スケジュールは代表的なものにすぎないこと、宿主に最適効果を生み出すために、スケジュールは変更可能なこと、は了解されるであろう。同様に、初回抗原刺激用抗原、増幅用抗原の量も変更可能である。例えば、５７ｎｔｅｘ　５ＡＦ−１アジユバント中のｇｐ１６０約１５０μｇを指示のように投与し、その後で、ペプチドを、各ペプチドの通常量１００μｇとして投与してもよい。

最後に、含有するペプチドの相対的割合は、最終製剤における各ペプチドの、所望の最終割合にしたがって変えてもよい。

特に、この割合は、各ペプチドの免疫原性や、各ペプチドがもつ官能基の関数として調整されるだろう。これらの官能基は、少なくとも、これらのペプチドが担体分子に結合している場合には、相補的官能基と接合反応を起こすことのできるものである。

本発明の特定の応用では、増幅用ペプチドの注入を、粒子、ウィルス、または細菌の投与に代えるということがある。すなわち、この粒子、ウィルス又は細菌は、ここで扱うウィルスの中和エピトープを、その表面に発現するおよび／またはその増殖の間に発現する組換え体であって、そのようにして、前記レトロウィルスに対する中和抗体を誘発することのできるものである。そのような例は、ＨＢｃ抗原粒子、ＨＢｓ抗原粒子、表面ないし細胞質タンパク質（例えばＩｉ’　Ｉ！ＩＩＢ受容体）中の中和エピトープを発現する細菌、ピコルナウィルスキメラ（例えば、ポリオウィルス−ＨＩＶキメラ）、ポックスウィルス組換え体、アデノウィルス組換え体またはアデノウィルスキメラなどである。中和エピトープの提示に選ばれた生存ベクターに応じて、この投与を、生ワクチンの経口投与という形で実施することもできるしく例えば、５ｉｂｉｎポリオウィルス株もしくはヒトアデノウィルスから、又は、Ｓｓｌｍｏｎｅｌｌｘ、Ｓｈｉｇｅｌｌａもしくはその他の腸内細菌の弱毒株から、又は、経口投与後に免疫反応を引き起こすことのできる全ての生物、ウィルス、酵母もしくは細菌、から構築したキメラ）、あるいは、非経口投与による生ワクチン（例えば、組換えポックスウィルス）や、非経口投与による不活性化ワクチン（例えば、ポリオウィルスのＭｘｈｏｎｅ７株から構築したキメラ、または、ＨＢｓ＾ｇ、　ＨＢｃＡｇの不活性粒子）の形態でその投与を実施することができる。

本発明の別の特定の実施態様において、ワクチン接種の初回抗原刺激のために注入される抗原（エンベロープ糖タンパク質）、すなわち、当該ウィルスのエンベロープ糖タンパク質は、ＩｓｃＯＭ　（抗原タンパク質とグリコシドＱｕｉｌ　Ａとの結合から成る免疫刺激性複合体）やリポソームのような粒子の形態で存在させることもできる。

前記初回抗原刺激用抗原および／または前記ペプチドはまた、ウィルスや細菌のような生存組換え微生物と結合させてもよいしく例えば、あるいは、ポックスウィルスやＢＣＧすなわちなる生ワクチンと結合させてもよい。

エンベロープ糖タンパク質および／またはそれから誘導されるペプチドは゛また、不活性化粒子、例えばＨＩＶウィルスもしくはそのウィルスの一部、又は、ゲノムのない粒子によって提示させることもできる。

このようなゲノムのない粒子は、）Ｉｘｆｆｓｒ　Ｏ，ら（ＪｏｍｒｎｓＩ　ｏｆＶｉｒｏｌｏｇ７−Ｊｕｎｅ　１９９０　ｐ、２６５３−２６５９　）によって、ワクチンを生産できることが記載されている。

これらの粒子は、ＨＩｖウィルスの場合、ＨＩＶ様粒子粒子ぶことができる。本発明の目的にとっては、当該粒子は、完全なＨＩＶゲノムを含まないが、その表面に、本発明の組成物のウィルス成分を提示させることが可能なものである。

本発明の別の実施態様においては、エンベロープ糖タンパク質を、混合物として他の抗原と組み合わせる。例えば、初回抗原刺激用抗原がＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質である場合、１種ないし数種の抗原、例えばｇｓｇ、　ｎｅｔ、　ｗＨ，ｐｏｌ、　ＧＰＧまたはＧＬＧ抗原を当該エンベロープ糖タンパク質と組み合わせてもよい。なぜなら、これらの抗原は、当該組成物のペプチドと組み合わせることができるからである。

本発明はまた、ｅｆｌマ糖タンパク質がそのフラグメントと交換または結合している上記の組成物を含む。このフラグメントは、有利には、５０以上のアミノ酸を持ち、本発明の主旨に沿って、その糖タンパク質の免疫原性を保持しているという特徴を持つ。

本発明はまた、当該組成物の糖タンパク質および／またはペプチドを認識するモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体に関わる。これらの抗体は混合物として組み合わせて、例えば血清学的治療目的のために使用することもできる。

実施例１−１（１？−１１１Ｒｔｌ及びこの分離株の糖タンパク質によるチンパンジーの免疫と、ＫＬＨに結合したＢＲＵ　ｅｎマオリゴペプチドによる反応の増幅チンパンジー３３９　（ＦＩＩＮＦＡＣＥ　）を、最初に、不活性化精製ＨＩＶ −１８ＲＵウィルス２５０μｇを１ケ月間隔で３回注射して免疫した。このウィルス（２５０μｇ）は、これを３０℃で４８時間、０．０２５％のフォルマリン、３７℃で３０分、［１，０２５％のベータプロピオラクトンで処理して不活性化し、５％スクアランと２．５％プルロニック・ポリマーとの乳濁液中１　ｍｇ／ｍｌスレオニル−ＭＤＰを含む８７Ｎｅｗアジュバントと組合わせたものである。

この注射後、７ケ月目に第１回目の追加抗原刺激を、１年後に２回目の追加抗原刺激を行なった。

次に、この動物に、ＢＲＵウィルスエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１６［１）を５回注射した。このタンパク質は、ワクシニアウィルス組換え体（ＶＶｅｎマ１１６３株）に感染したＢＨＫ−２１細胞培養物の上清から精製したものであり、この組換え体は、遺伝子組換え技術によって、ｇｐ１２０／ｇｐ４１切断に関わる配列を除去するためのオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発によって改変されたｇｆｌ１６０ｅｎマをコードするＨＩＴ−Ｉ　ＢＲＵ配列を挿入し、かつ、膜貫通疎水性領域を欠失したゲノムを持つ（Ｋｉｅｎ７ら、　ＰｒｏＬＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２二２１９−２２６の１９８８）、この精製タンパク質は、Ｓ７ｎ！ｅｘアジユバントの存在下、１筋注あたり１２５−１５０μｇの量で用いた。糖タンパク質を調製するために、ＶＶ−１１６３で感染させたＢＨＫ細胞の培養液を、硫酸アンモニウム、次いで、トリクロロ酢酸で沈澱させて濃縮し、次ぎにこの糖タンパク質を、レンチルレクチン上でのアフィニティー・クロマトグラフィー、陽イオン交換樹脂上でのイオン交換、及び高速液体クロマトグラフィー（）ＩＰＬＣ）の３つの処理を連続的に行うことによって精製した。このようにして得られた組換えｇｐ１６Ｇの純度は、９５％である。この組換え体は、旧Ｖ−１のｇｐ１６０に対して特異的なモノクロナール抗体、特に、ＢＲＵ分離株のメジャーな中和エピトープに対して特異的な中和抗体１１０−４によって認識される。

さらに、１４９２８球のＣＤ４受容体に対して強い親和性を示す。

不活性化ウィルスの注入に応答して誘発される抗体の抗体価（ＥＬＩＳＡ測定− Ｄｉｇｇｎｏｓ＋ｉｃｓ　Ｐｓｓｊｅｕｒ　ＥＬＡＶＩＡキットで１／２００．０００；中和抗体価−免疫蛍光スポット形成の５０％抑制測定により　１／４００　；　ＣＥＭ−５Ｓ細胞におけるレンシチウム形成の９０％抑制の測定により１／６４）は、ｇｐ１６０の注入で大きく変化はしなかった。

当該動物に、ＢＲＵ分離株の中和エピトープに相当する配列ＹＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮを持つ合成ペプチド調製物３００μｇを与えた。但し、チロシン残基（Ｙ）は、ビス（ジアゾベンジジン）を用いてヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に結合され、かつ、Ｓｙ＋＋ｔｅｘアジュバントと併合されている。この注入を、その後、３週間に１回、次ぎに、１９週目にもう一度繰り返した。

これらの注入では、ＥＬＩＳＡで測定した場合、抗体価の上昇は見られなかったが（第１図）、３種の異なる抗体価測定法で測定したところ、第１表及び第２図に見られる通り、中和抗体価には著明な増加があった。

第　１　表チンパンジーＦＵＮＦＡＣＥ　（Ｃ−３３９’）における中和抗体の誘発第１回注入後の時間　下記の方法で測定した中和抗体のレベル（週）　Ａ　Ｂ　ＣＡ　：　ＭＴ４細胞におけるレンシチウムの９０％抑制Ｂ　：　ＣＥＭ−ＳＳ細胞におけるレンシチウムの９０％抑制Ｃ：Ｈ９細胞における免疫蛍光の７５％抑制次に、ＦＵＮＦＡＣＥを、２６週目に、Ｌｘｒｒｙ　Ａｒｊｈｕｒ　（ＮＣＩ、Ｆｒｅｄｅｔｉｃｋ）によって恵与された、抗体価１０’　ＴＣＩＤ５０／１のＨＴＶ−１保存株１；１００希釈液１１または１００　ＴＣＩＤ５Ｇを静注投与してチャレンジした。この保存株０４Ｇは、チンパンジーで２回それに対する抗体価が測定されており、Ａｒｔｈａｔらは、チンパンジーに対するそのＩＤ５ｏは４　ＴＣＩＤ５０であると決定している。この保存株４０ＴＣＩ０５０を、免疫を受けていないチンパンジーに注入すると、２つのサンプルで観察されるように、この動物のリンパ球に、注入後２週目から、検出可能なウィルスの出現を見、４週以内に抗旧Ｖ血清交代が起こった。これは、Ａｒ１ｋ＋＋ｔらが、１９８９年に発表している通りである（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）。

このチンパンジーＦＵＮＦＡＣＥは、保存ウィルス０４０株１００　ＴＣＩＤ５０による感染に対し一見完全な防御を示した。この判定は、チャレンジ注入後６ケ月までに、彼のリンパ球には（ｐａｌ及びｇ１ｇプローブによる遺伝子増幅法による測定かまたは、ヒトリンパ球との同時培養と、培養液上清から得た１０Ｇ、　ＯＯＯｘｇペレット中の逆転写酵素アッセイのいずれかかで調べた）ウィルスが全く検出されず、６ケ月目でも、ＥＬＩＳＡやウェスタン・プロット法で調べても抗旧Ｖ既往反応は見られず（第２表）、ウェスタン・プロット法によって検出可能な抗ｎｅ１抗体も存在しなかったことに基づく。

第　２　表ＦＵＮＦＡＣＥのチャレンジ注入後の、抗ｇｐ１６０及び抗　原　チャレンジ　＋１ケ月　＋２ケ月　＋３ケ月　＋４ケ月した日ｇｐ１６０　１７９．０００　１２７，０００　８９，０００　４４，０００　１ｆｔ、０００［ＩＲＵ　ペプチド　６．０００　３．Ｏｎ　２．５００’１．００Ｇ　１，０００実施例２−　ＨＩＭ−１の組換え抗原ｅｎｖ、　ｇｉｇ、　ｎｅｔ、　およびｖｉｆによるチンパンジーの免疫と、ＫＩ、Ｈに結合したＢＲＵ　ｅｎｖオリゴペプチドによる反応の増幅チンパンジー４３３　（ＩＩＯＢＥＲＴ）を、最初に、旧Ｖ−Ｉ　ＢＲＵ　（７）ｇＰ１６［１ｅｎｗを発現する組換えワクチニアウィルス（ＹＶｅｎｖ　１１３９）の２Ｘ１０８ＰＦＵで３回連続して肉芽形成を行ない、次に、以前に、インビトｏ　（ｉｎ　ｖ；ｔｒｏ　）で、組換えウィルスＶＶｅｎｖ　１１３９によって感染し、フォルムアルデヒドで固定された、そのチンパンジー自身のリンパ球を静注投与することによって、初回抗原刺激した。次に、この動物に、１ケ月置きに、３回連続してて筋注を行い、それから、３３．３８．４０週目に３回の追加抗原刺激を行い、最後の追加抗原刺激を６６週目に行なった。

その最後の追加抗原は、５７ｎｌｅｘアジユバントと混合した下記の抗原それぞれの１２５−１５［１Ｈｇの混合物であった。その抗原とは、実施例１に記載するやり方で精製したｇｌｌ１６０ｅｎマ、Ｅ、ｃｏｌｉで発現され、１９８９年８月１８日出願のフランス国特許出願第８９、　１１０４４号に記載するやり方で精製したタンパク質ｐ１８ｇａｇ　。

ｐ２７ｎｅｔ、ｐ２３ｖｉｔである。最後に、ＲＯＢＥＲＴには、ＫＬＨに結合し、３７ｎｊｕアジユバントと混合した同じＢＲＵペプチドを、前の実施例でＦ［１ＮＦＡＣＨに施したのと同じ接種スケジュールに従って、与えた。

ペプチド−ＫＬＨ接合体の注入は、ＥＬＩＳＡで測定したところ、いかなる抗体レベルの増加をも招かなかったが（第３図）、第２図及び第３表に見られる通り、中和抗体にたいしては、著明な増加をもたらした。さらに、中和抗体は、三つの異なる方法で測定した。

第　３　表チンパンジー、ＲＯＢＥＲＴ（Ｃ−４３３）における中和抗体の誘発第１回注入後　下記の方法で測定した中和抗体のレベル０　２００　６４’　２［１０３２Ｈ２００８＞８００　２５６−５１２　＞１６００Ａ　：　ＭＴ４細胞におけるレンジチウムの９０％抑制Ｂ　：　ＣＥＭ−３Ｓ細胞におけるレンジチウムの９０％抑制Ｃ：Ｈ９細胞における免疫蛍光の７５％抑制次に、Ｒ（ｌ［１ＥＲＴを、ＦＩＩＮＦＡＣＥと並行してチャレンジした。すなわち、前の実施例と同じ、ＭＣＩ由来のＨＩＶ−１ウィルス保存株０４０の１００　’ＴＣＩＤ５０を静注により接種した。ここでもまた、感染にたいして、完全な防御が獲得されたようである。

なぜなら、この動物のリンパ球にはウィルスが無く、チャレンジしてから６ケ月後のＰＣＲは陰性であり、また、抗ｐ２５ｇｘｇ抗体及び抗ＥＬＩＳＡまたはウェスタン争プロットで測定しても抗ＨＩＶ既往反応は見られなかったことからそのように判断した。策４表は、同様に既往反応のないことが、抗ｇｐ１６０　、抗ＢＲＵ中和エピトープにどのような作用を及ぼすかを示したものである。

第　４　表ＲＯＢＥＲＴへのチャレンジ注入後の、抗ｇｐ１６Ｇ。

抗メジャーＢＲＵ中和エピトープ抗体の推移表示した日付におけるＥＬＩＳＡ　抗体価抗　原　チャレンジ　＋１ケ月　＋２ケ月　＋３ケ月　＋４ケ月した日ｇｐ１６Ｇ　５４５．Ｇ（ｔｏ　４２１．、Ｇ（１（１２００，［１ｌｌｆｌ　９５．（１１１１１３２，０［１０ＢＲυペプチド　９．００Ｇ　６，０００　３．０００　３，０００　４，００Ｇ実施例３−　ＨＩＶ−１抗原のｇｐｔａｏ幻ビー、ｐｔａ匹によるチンパンジーの免疫と、担体分子に結合していないＨＩＶ−１ｅｎマペプチドによる増幅チンパンジーＪＯＪＯＴＯＯ（４９９）　、Ｉ　ＲＡ　（１５１）及びＩ（Ｅ！ｆＲＹ二世（５３１）の３匹のチンパンジーをこの実験で用いた。

最初のチンパンジーＪＯＩＯＴＯＯに、１ケ月置きに、上述のように精製したｇｐ１６０ｅｎｙ、ｐ１ｇｇリーの１２０−１５０Ｉｇを５７ｎｌｅｘアジユバントと混合したものを３回注入した。この第１回の注入シリーズの後に、同じ抗原による３回の追加抗原刺激を、３３．３８．４０週に行い、最後の追加抗原刺激を１４ケ月に行なった。これらの注入により、ウェスタン・プロットやＥＬＩＳＡによって検出可能な高い抗体レベルの出現が、最初の３回の注入直後に見られた。もっとも、中和抗体のレベルは、後述するように比較的低かった。

第２のチンパンジーＩ　ＲＡ　ハ、それぞれ、旧Ｖ−Ｉ　ＢＲＵ　（７）ｇｐ１６０υリー、ｐ５５■ｇ、ｐ２７ｎリー、ｐ２３ｗｉｌ−を発現する、４種の組換えワクチニアウィルス保存株のそれぞれ、１０８ＰＦＵを与えて免疫した。皮内に与えたこの接種によって、何の中和抗体の出現も見られなかったが、かろうじて有意なレベル（≦Ｉ：２［１０）の抗体が、ウェスタン・プロット法またはＥＬＩＳＡで検出された。

次に、チンパンジーＩＲＡを、２年間休ませた。

第４のチンパンジーＨＥＮＲＹ二世は、実験の開始日まで、ＨＩＶまたはＳＩＶ抗原との接触に関する実験に使用されたことがなかった。

その日、前記の３匹の動物に、２１個の合成ペプチドから成る混合物を筋注した。この合成ペプチドは、Ｍ７ｅｒｓ　ら（１９８９）の発表したｎ＋ｖ−ｔのメジャーな中和エピトープ（ループＶ３）の２１個の配列に相当するものであるが、これを、１ペプチドにつき５０μｇの量で、５７ｎｊｅｘアジユバントの存在下に与えた。

このペプチドの各々が、Ｎ末端位置にシスティンを持ち、Ｃ末端にも別のシスティンを持っており、これにより、所定の分離株のＶ−３ル一プ全体を表わしていることになる（ＢＲＵ分離株のアミノ酸２９６−３３１と、ＭＹｅｔｓら（１９８９）の配列に従う対応アミノ酸）。次に、この動物たちに、それぞれ、最初の注入から１ケ月、２ケ月後に同じ混合物を再び注入した。ペプチドの混合物（１回の注入当り　１．　Ｏ５ｍｇ）によるこの免疫の後で、ＪＯＪＯＴＯＯには、ＢＲＵ分離株のｇ９１６０にたいする、また、そのメジャーな中和エピトープにたいする有意な既往反応が見られた。これは、ＥＬＩＳＡで、抗原として、精製ｕ１６０　ＢＲＵまたはＯＲ■ペプチドを用いて測定したものである。

第　５　表ＨＩＶ−１中和エピトープの２１個の配列に相当する遊離ペプチド混合物の注入に対して応答する、抗ｇｐｔ６゜第１回　第２回　第３回　第４回注入　注入　注入　注入チンパンジー　（時間０）（１ケ月）　（２ケ月）　（３ケ月）ＪＯＪＯＴＯＯ（４９９）　３００，０００　４５０．００Ｇ　２，５００，０００　７００，０００Ｉ　ＲＡ　（１５１）　陰性　Ｎ　Ｄ　１３．００Ｇ　７．０００）ＩＥＮＲＹ　Ｉ＋（５３１）　陰性　ＮＤ　陰性　陰性ＮＤ：測定せず第　６　表２１個のペプチドを含む混合物の注入に対して応答する、ＢＲＵ抗中和エピトープ抗体の誘発（ＥＬＩＳＡ抗ＢＲＵ抗体）時　間第１回　第２回　第３回　第４回注入　注入　注入　注入チンパンジー　（時間０）（１ケ月）　（２ケ月）　（３ケ月）ＪＯＪＯＴＯＯ（４９９）　ｌｉ、Ｇｏ（１１０，０００３８０，０００２００，０００Ｉ　ＲＡ　（１５１）　陰性　Ｎ　Ｄ　４．０００　２．０００ＩＲＡから得られた抗体価はきわめて低いままであり、ＨＥＮＲＹ二世の場合は完全に陰性であった。

この結果は明らかに、ｇｐ１６０によってあらかじめ免疫処理することが、免疫反応喜こた０して初回抗原刺激作用を及ぼすことを物語って０る。

しかしながら、市販の診断用キット（ＥＬＡＶＩ＾　ＤｉｉｇｎｏｓｊｉｃｇＰ８山ｏｒ）を用いて調べて分かる通り（第７表）　、ＪＯＪＯＴＯＯｌこおける抗ペプチド、抗ｇｐｉｆｉ（ｌ抗体価の上昇は、抗旧Ｖ　ＥＬＩＳＡ抗体価の著明な上昇を伴っていなかった。

第　７　表ＥＬＡＶＩＡで測定した抗旧Ｖ抗体しベル日　付時間０　２ケ月　５ケ月チンパンジー　第１回注入　第２回注入　第３回注入ＪｏＪｏｒｏｏ＋４ｕ）ｌ、ＧＯＯ，ＯＧｏ　１．６００．０００　４ｏｏ、Ｏｏ。

Ｉ　ＲＡ　（１５１）　陰性　８００　１００　・ＨＥＮＲ／Ｙ　ＩＩ（５３１）　陰性　２００　陰性対照的に、ＨＩＶ−１の２１個の、分離株の中和エピトープに相当する合成ペプチドの混合物を注入すると、その後に、第８表、第４図に見られる通り、ＢＲＵ分離株を中和する抗体レベルの著明な増加が見られた。

このような増加がｌ０ＩＯＴＯＯのみに見られ、Ｉ　ＲＡ、　ＨＥＮＲＹ二世に見られないのは、ｇｔ１６Ｇによる予備免疫の初回抗原刺激効果の特異性を実証しているという点で、注目に値する（第４図）。

さらに、第５図から分かるように、ＪＯＪＯＴＯＯの中和抗体反応は、ＢＲＵ分離株にたいして特異的である。すなわち、ＪＯＪＯＴＯＯの血清は、ＳＦ２分離株（＾ＲＶ−２）を中和せず、ただ、ＢＲＵ分離株（ＨＴＬＶ−３＝ＬＡＶｌ　）　（Ｄみを中和する。

第　８　表ＨＩＹ−１のメジャーな中和エピトープの、２１個の既知の配列に相当するペプチドの混合物の３回の注入によって誘発された中和抗体のレベル−ＣＥＭ−７４細胞で測定した７５％中和抗体価（第１表の方法Ｃ）ヒト免疫不全性ウィルス１型（ＨＩＴ−１）にたいする試験ワクチンの効力を確かめるもっとも厳しいテストは、下記の生ウィルスのチャレンジ後の感染から、チンパンジーを保護することである。ここに報告する研究においては、不活性化したウィルス全体または精製した組換えタンパク質を含む各種１１１Ｖ−ＩＢＲＵ抗原調製物、その後で、メジャーな旧Ｖ−を中和エピトープｖ３と同一の合成ペプチドを連続的に注入することによって、３匹のチンパンジーに、高い抗体価の中和抗体を持続的に誘発した。

この動物たちには、旧Ｖ−Ｉ　ＨＴＬＶ−１１１Ｂの保存株の、４ｏチンパンジー感染用量（５０％組織組織感染用量”ＴＣＩＤ”１００に相当する）を静注して、チャレンジした。６ケ月追跡したが、三匹の動物はすべて、血清学的、ウィルス学的基準に基づいて、外見上感染は見られなかった。この所見の中には、ＰＲＣ分析結果や、末梢血リンパ球、骨髄、リンパ節組織からウィルスを単離できなかったこと、が含まれる。１年間追跡した２匹の動物については、１匹の動物から、３２週で、初めてウィルスが単離されたが、２匹目の動物は、１２ケ月間を通じて、あらゆるテストにおいて、ウィルス陰性であった。３匹目の動物は、７ケ月の追跡中、ウィルス陰性で、さらに１２ケ月の追跡でも陰性であった。これらの結果から、旧ｖ−１の感染を、免疫によって予防すること、ないし、有意に遅らせることは可能であり、したがって、ＨＩ’Ｖ−１ワクチン開発の基礎が敷かれたことが明らかになった。

材料と方法動物一本研究において使用した動物は、雄チンパンジー成獣であった。これらは、以前に、Ａ型、Ｂ型、非Ａ非Ｂ型肝炎の実験に使用したものである。このチンパンジーは、ＬＨＭＳＩＰ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｕｎｉｙｅｒｓｉｊ７　Ｍｅｄｉｃｓｌ　Ｃｕｔｅｒの生物安全性レベル３の施設で飼育されている。実験操作はすべて、感染性疾患の関与、人道的配慮、霊長類の取扱に関する施設ガイド（Ｍｏｏｒ−Ｊｘｎｋｏｖｓｋｉ、　Ｊ、　＆　ＭｘｈｏｎＨ，Ｃ，Ｊ、［１９８９）　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｐｒ１ｍＮｏ１１，１８．１−２６）に従って行なった。

免疫原−蔗糖勾配法で精製したＨＩＶ全体を、０．０２５％ベータプロピオラクトン、次に、０．０２５％フォルマリンとインキュベートして不活性化した。感染性ウィルスを含まないことは、免疫したチンパンジーの、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ウィルスが単離されないことで分かる（Ｇｉｒｕｄ、　Ｍ、、　Ｋｉｅｎ７．　Ｍ、Ｐ、、　Ｇｌｕｃｋａｇｎ、Ｊ、Ｃ，、Ｂｇｒｔｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ、　Ｆ、、　Ｍｏｎｌａｇｎｉｅｒ、　Ｌ、　＆　Ｆｕｌｔ！。

Ｐ、（１９９０）　ｉｎ　ＶｓｃｃｉｎｅＩｆｏｒ　５ｅｘｕｉｌ１７　Ｔｎｎｓｍｉｌｊｅｄ　Ｄｉｓｅｘｓｅｓ。

ｅｈ、　Ｍｅｂｅｕｓ、　Ａ、　＆　５ｐｉｅｒ、　Ｒ，（ＢｕＨｅｒｖｏｒｔｈ　Ｃｏ、、Ｌｔｄ、、　Ｌｏｎｄｏｎｔ、ｐ９．　２２７−２３７　）　、組換えｇｐｉ６０ｅｎｖは、Ｖｆ−１１６３に感染したＢＨＫ２１細胞の培養液から精製した。このママ−１１６３とは、部位特異的突然変異誘発によって、ｇｐ１２０／４１切断部位を破壊し、ｇｐ４１のアンカードメインを除去するように改変されたｇｐ１６Ｑｅｎｖ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスである（Ｋｉｅｎ７．Ｍ。

Ｐ、、Ｌｘ！ｈｅ　Ｒ，、Ｒｉｗｉｅｒｅ、Ｙ、、Ｄｏｌｌ、Ｋ、、Ｓｃｈｍ口ｔ、Ｄ、、Ｇｉｒｉｒｄ。

Ｍ、、　Ｍｏｎｊ＊ｇｎｉｅｒ、Ｌ、　＆　Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、（１９８８）　Ｐｒｏｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２、２１９−２２６；及びＳｃｂｍｉｄｌ、　Ｄ、、　Ｄｅｚｌｔｅｒ−Ｄｘｍｈａ７ｘｎ＋、　Ｃ，、）［ａｎｉｕ、Ｄ、、　ＳｃｂｍｉＮ、Ｄ、Ａ、、Ｋｏｌｂｅ、Ｈ，ＬＪ、、Ｋｉｅｎ７．　Ｍ、Ｐ、、　Ｃ５ｘｅｎｓｙｃ、Ｊ、Ｐ、　＆　Ｔｈ１ｙｏｌｅｌ、Ｊ、（１９８９）　Ｃｏｍｐｊｅｓ　Ｒｅｎｄｕｓ　Ａｃｚｄ、Ｓｃ組換えｐ１８ｇｓｇ、　９２７ｎｅｌ、　ｐ２３ｖｉｌ抗原と混合した。ソノ精製法は、下記の文献に記載する通りである（Ｇａ４．Ｂ、、　Ｒｉｗｉｅｒｅ、Ｙ、。

Ｄｏｌｌ、　Ｋ、、Ｒｅｇｎ■ｌ！、＾、＆　Ｋｉｅｎ７．　Ｍ、Ｐ、　（１９９０）　Ｖｉｒｏｌｏｇ７　１？６゜４１３−４２５；及びＫｏｌｂｅ、　Ｈ，Ｖ、、Ｊｓｅｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｌｅｐｉｇｅ、　Ｐ、、　ＲｏｂｓＣｈ、　Ｃｏ、、　Ｌ　＆ｃｕｄ、　Ｇ　、Ｋｉｅｎ７．　Ｍ、Ｐ、、　Ｓｘｂｇｊｉｅ、　Ｊ、、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｓ。

Ｗ、　＆　Ｌｅｃｏｃｑ、１．Ｐ、（１９８９）　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍｓｌｏｇｒｘｐｈｒ　４７６、　９９−１１２）。

各免疫前に、不活性化したＨＩＶ全体（２５０ｐｇウィルスタンパク質）、または、精製組換えタンパク質（１回用量当り　１２５−１５０μｇ　）を、アジュバント５ＡＰ−１（＾１ｌｉｓｏｎ、　Ａ、Ｃ，＆　Ｂ７ａｒｓ。

Ｎ、Ｅ、（１９８６）　Ｊ、１ｍｍｕｏｏｌ、１ｊｅｊｂｏｄｉ　９５．　１５７−１６８）と混合し、この混合物の２ｍｌを筋注（ＩＭ）した。

配列Ｙ−ＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮ　（Ｐｕ１ｎｅｙ、　Ｓ、Ｄ、、　ＭａＨｈｅｖｓ、　Ｔ、Ｊ、、Ｒｏｂｅ７．Ｗ、Ｇ、、　Ｌ７ｎｎ、　Ｄ、Ｌ、、　Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏ）ｆ、　Ｍ、、　Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ｗ、Ｔ、、Ｌ！ｎｇｌｏｉｓ、Ａ、Ｌ、、Ｇｈｒａ７ｅｂ、Ｊ、、Ｐｅｔｔｅｖａ７．　Ｓ、Ｒ，、Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、　Ｋ、Ｊ、、　Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、　Ｐ、］、、　ｌｏｎｇ−３ｔａｘｌ、　Ｆ、、　ＧＩＩＩＯ。

Ｒ，Ｃ，＆　Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、　Ｄ、Ｐ、（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４．　１３９２−１３９５；　Ｒｕ５ｅｈｅ、Ｊ、Ｒｏに昌ｖｓｈｅｒｉ！ｎ、　Ｋ、、　ＭｃＤｉｎａｌ、　Ｃ，、Ｐｔｅｒｏ、Ｊ、、Ｌ７ｉｎ、Ｄ、Ｌ、、ＧｒｉｍｉｉｌＲ，Ｒ，、Ｌｘｎｇｌｏｉｓ、Ａ、、ＧＩＩＩＯ，Ｒ，Ｃ，、＾ｒｔｈｕｒ。

Ｌ、０．、Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、Ｐ、Ｊ、、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ、Ｐ、、Ｐｕｔｎｅｙ、Ｓ、Ｄ、　＆Ｍａ＋ｔｈｅｖｓ、　Ｔ、Ｊ、（１９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｘｔｌ、　Ａｃ５ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、８５゜３１９８−３２Ｇ２；及びＬｘＲｏｓａ、　Ｇ、Ｊ、、　Ｄａｖｉｄｅ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、　Ｋ、。

Ｌｔｅｒｈａｒ７．　１．＾、、Ｐｒｏｌ７．　Ａ、Ｔ、、　Ｌｅｖｉｓ、Ｊ、＾１．　ｌＨｌｇｌｏｉｉ、　＾。

Ｊｌ、＾、Ｊ、、　Ｄｒｅ１ｓａ＋＊ｎ、　Ｇ、Ｒ，、Ｂｏｔｖｅｌｌ、　Ｒ，Ｎ、、５ｈｓｄｄｕｃｋ、Ｐ、。

Ｈｏ１ｌｅ７．　Ｌ、Ｈ，、Ｋ＊ｒｐｌｕｓ、　Ｍ、、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ、Ｐ、、　ＭｔＨｂｅｖｓ、　Ｔ。

Ｊ、、ＥＩＩｌｉｎｉ、Ｅ、＾、　＆　Ｐｕ１ｎｅｙ、　Ｓ、　Ｄ、（１９９０）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．　９３２−９３５）を持つ２５アミノ酸ペプチドのアリコート（１９，８ａ＋ｇ）を、先ず、シトラコン酸で処理し、次に、ビス −ジアゾベンジジン（ｐＨ９，０）を用いて、Ｎ末端チロシル結合によって、１９．３ｍｇのキーホール会リンペット・ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に結合させた。アミノ基上のブロックを外して、ペプチド−ＫＬＨ接合体を、２４時間、ＰＢＳにたいして透析して、過剰の遊離ペプチドを除去した。５ＡＦ−１と共に処方した後、ｖ３ペプチド−ＫＬＨ接合体による免疫（１用量当り３００μｇのペプチド）を、１Ｍルートで行なった。

株＋（ＴＬＶ−１１１８（Ｌ、＾ｒｊｂｗｒから入手）由来のもので、これは、あらかじめ、チンパンジーで抗体価を測定してあり、また、他のＨＩＶワクチン・チャレンジ研究で使用されたものである（＾ｒｊｈｗｔ、　Ｌ、Ｏ，、Ｂｅ５ｓ、　Ｊ、Ｗ、、Ｗｘｊｅｔｓ、　０．１．　Ｐ７１ｅ、　Ｓ、Ｗ、。

Ｋｅｌｌｉｂｅｒ、Ｉ、　Ｃ１，Ｎｔｒｇ、　Ｐ、Ｌ、、　Ｋｒｏｈｎ、　Ｋ、、　Ｒｏｂｅ７．　Ｗ、Ｇ、、　Ｌｘｎｇｌｏｉｓ、　＾、１．．　Ｇｔｌｌｏ、　Ｒ，Ｃ，、＆　Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、　Ｐ、Ｊ、　（１９８９）　Ｉ。

Ｖｉｒｏｌ、　６３．　５０４６−５０５３；及び［ｌｅｒｍｉｎ、　Ｐ、Ｗ、、　Ｇｒｅｇｏｒ７．　Ｔ、Ｊ、。

Ｒｉｄｄｌｅ、　Ｌ、、　Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｇ、Ｒ，、Ｃｈｇｍｐｅ、　Ｍ、＾、、　Ｐｏｒｔｅｒ、　Ｊ、Ｐ、。

Ｔｕｒｎ、Ｆ、Ｍ、、Ｈｅｒ＋ｈｂｅｒｇ、Ｒ，Ｄ、、Ｃｏｂｂ、Ｅ、に、＆　Ｅｉｃｈｂｅｔｇ、Ｊ、Ｗ。

（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３４５．６２２−６２５）　、このＨＩＶ−１保存株の感染価は、チンパンジーにたいしては、１ｍ１当り１０’　ＴＣＩＤ５０．１１当り　４×１０３感染単位と考えられる。このチンパンジーを、１：１００希釈液１１で４回チャレンジした。この同じｌ：１［１０希釈液のアリコートについて、その抗体価を、２倍継続希釈で且っＩＸｌ［１５Ｈ９細胞を感染して、９６ウエル・プレート中で４回測定した。６日間のインキュベージタン後、感染度を、免疫蛍光アッセイによって採点した。この方法によれば、本チャレンジ用接種物は、最初のアリコートについては、６４免疫蛍光スポット形成単位（終点には達していない）を超える力価を持ち、第２のものでは、１７０を超えていた。

中和アッセイ−免疫したチンパンジーから得た血清サンプルの中和活性は、ＣＥＭ−３Ｓ細胞におけるレンジチウム形成の抑制をもって測定した。その方法は、文献に記載する通りである（Ｎ１＋ａ、　Ｐ、Ｌ、、　Ｈｘｔｃｈ、　Ｗ、Ｃ，、Ｄｕｎｌｏｐ、　Ｎ」、、　Ｒｏｂｅ７．　Ｗ、Ｇ、、　＾ｒｔｔｏｒ、　Ｌ、０．、　Ｇｏｎｄｓ、　Ｍ、＾、　＆　Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、Ｐ、Ｊ、（１９８７）　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ。

Ｈｕｍｕ　Ｒｅ１ｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　３．　２８３−３０２　）　ｅまた、Ｈ９細胞における免疫蛍光スポットの抑制によっても中和活性を測定した。

ウィルス単離−免疫し、チャレンジしたチンパンジーのＰＢＭＣすなわち骨髄細胞（吸引して得た）を、下記の文献に記載するやり方で、正常ヒトＰＢＭＣと培養した（Ｆｏｕｒ、　Ｐ、Ｎ、、　ＭｃＣｌｕｒｅ、　Ｈ，Ｍ、、５ｖｅｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｂ、、　ＭｃＧｒ［ｈ、　Ｃ，Ｒ，、Ｂｒｏｄｉｅ、　＾、、　ＧｅｊｃｂｅＩＩ、］、Ｐ、、Ｊｅｕｅ＋＋、Ｆ、Ｃ，、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｄ、Ｃ，、Ｂｒｏｄｅｒｔｏｎ、Ｊ、Ｒ。

＆　Ｆｒｘｎｅｉｓ、　Ｄ、Ｐ、（１９１１６）　Ｊ、　Ｙｉｒｏｌ、、　５８．１１６−１２４）　ｏある実験においては、ＣＤ＋４に富むリンパ球を、ＣＤ８細胞表面抗原にたいして特異的なモノクロナール抗体を付着させたマグネチック・ビーズ（Ｄｙ＋ｘｂ＠ｓｄｔ、　Ｒｏｂｂｉｎｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）による分離操作によって、チンパンジーＰＢＭＣから得た。ＣＤ＋４富裕細胞を、コンカナバリンＡ（１０μｇ／ｌ）によって２日間刺激した。この後、単独で培養、または、フィトヘマグルチニンｆＰＨＡ）で刺激した正常ヒトＰＢＭＣと同時培養した。培養培地は、１０％牛脂児血清、グルタミン、ゲンタマイシン、組換えインターロイキン−２（８重位／ａｌ、　Ｂｏｅｈ＋ｉｎｇｅｒ　Ｍｓｎｎｈｅｉｍ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０である。バイオプシーによって得たリンパ節組織は、はさみで細切し、ヒトＰ［１ＭＣと培養した。全ての培養物を維持し、６週間、逆転写酵素活性について監視した後廃棄した。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）−チャレンジしたチンパンジーから得たＰＢＭＣまたはリンパ節細胞について、１重又は２重ラウンド（ネスト式（ｎｅｓｌｅｄ））　Ｐ　ＣＲを定期的に実施した。

１重うウンドＰＣＨについては、下記の文献に記載する通りである（Ｌｓｕｒｅ、　Ｆ、、　Ｒｏｕｔｉｏｕｔ、　Ｃ０Ｖｅｂｅｒ、　Ｆ、、ＪｘｃｏｍｅＬ　Ｃ，。

Ｃｏａｒｇｎｓｏｄ、Ｖ、、Ｂｌｘｎｃｈｅ、Ｓ、、Ｂｕｒｇｕｄ、Ｍ、、Ｇｔｉｓｃｅｌｌｉ、Ｃ，＆Ｂｒｅｃｈｏｔ、Ｃ，（１９８８）　Ｌｘｎｃｅｊ　２．　５Ｈ−５４１）　ｏ簡単に言うと、２μｇのＤＮＡを用いて、ＴＩＱ−Ｉ　ＤＮＡポリメラーゼ２単位と、９４．５５．７２℃で４０サイクル（それぞれ１分間ずつ）させた。２種のプライマー・ペアを用いた。一つは、ｐｏｌ遺伝子によってコードされるヌクレオチド２３９３−２４１７と２６７５−２７００に相当し、もう一つは、ｆａｔ遺伝子によってコードされる、ヌクレオチド５３６７ −５３８５と５６９４−５７１１に相当した。ＰＣＨの特異性を明らかにするために、増幅ＤＮＡフラグメントをＥ３２Ｐ］標識内部ｐｏｌ’、’　ｔｘｔ遺伝子プローブとハイブリダイズさせた。陽性コントロールは、ずっとＬＡＹ−１で感染させた１ｌＥ５細胞系から得たＤＮＡを用いた。ネスト式ＰＣＨの場合、第１回のＰＣＲは、文献に記載する通りに行なったのであるが（Ｍａｆｔｉｓ、　Ｋ、Ｂ。

４　ｒｓｌｏｏｕ、Ｆ、＾、（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎ！ｙｍｏ１．　１５５．　３３５−３５０　）、そのプライマーは、３塩基クランプ配列、ｘｂＩＩ制限部位、および、ＨＩＢ２ゲノムノヌクレオチド１０２５−１［１４Ｂに相当する５′−ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＴ＾＾ＴＡＣＡＧＴＡＧＣ＾＾ＣＣＣＴＣＴＡＴＴＧ−３’　と、３塩基クランプ配列、Ｎｏ口制限部位、および、ＨＸＢ２ゲノムのヌクレオチド５５７３−５５５３に相当する５′〜ＧＴＣＧＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧにＧＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣ−３’であった。第１回操作では、生成物の２．５μｍを、ＨＸ１１２ゲノムのヌクレオチド１３６６−１５０７に亘る領域において、プライｖ　−５Ｋ１４５と５ＫＩＳＯ（Ｋｖｏｋ、　Ｓ、　＆　Ｋｅｌｌｏｇｇ、Ｄ、Ｅ、（１９９Ｇ）ｉｎ　ＰＣＲＰｔｏｊｏｃｏｌｓ：　Ａ　ＧＩＩｉｄｅ　＋ｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ａｄ　Ａｐｐｌｉｃｘｔｉｏｎｓ：ｅｄｓ、＋１１１１１１．　Ｍ、＾、、　Ｇｅ１ｆｘｎｄ、　Ｄ、Ｈ，、５ｎｉｎｓｋｙ、Ｊ、Ｊ、　＆　ＷｈＮｅＴ、Ｊ、（＾ｃｘｄ＠ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉａｃ、、Ｓ＊ｎ、ｒ）ｒｔＨｏ、　Ｃ＾＞　ｐｐ、３３７−３４７　）を用いて、再増幅した。

免疫養生法（第９表）第９表　各種旧Ｖ−１抗原によるチンパンジー免疫養生法動物　組換え　不活性化　組換え抗原　ｖ３ＴＶ−１１３９ＨＩＶ　ｇｐ１６０　ｇＢ　ｎｅ「ｖｉｆ　ヘフチトＣ−４９９−−＋　＋　−−＋Ｃ−４３３とＣ−３３９の場合、免疫とウィルス・チャレンジの回数は、Ｃ−４３３が、ＴＶ−１１３９による最初の免疫を受けたときから計算し、この最初の免疫時を０週とした。チンパンジーＣ−４３３は、最初、組換えワクシニアウィルスＶＶ−１１３９によって免疫した。

このウィルスは、旧Ｖ−ＩＢＲＵ　ｇｆｌ１６０ｅｎマ抗原の非切断変種を発現する（Ｋｉｅａ７．　Ｍ、Ｐ、、Ｌｉｔｈｅ　Ｒ，、Ｒｉｗｉｅｔｅ、Ｙ、、Ｄｏ目、Ｋ、、Ｓｃｂ＋ａＨｔ、　Ｄ、、　Ｇｉｔｇｒｄ、　Ｍ、、　Ｍｏｌｌｇａｉｅｒ、　Ｌ、　＆　Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、　（１９８８）Ｐｒｏｔ、　ＥＢｉｕｅｔｉｎｇ　２．２１９−２２６）　ｏ　ＭＶ−１１３９は、二股針を用いて背部上方に肉芽形成を行なうことによって、０．８．１２週に投与した　（１接種体あたり２Ｘ１０８ＰＦＵ）。２７週に、Ｃ−４３３由来のＰＢＭＣを、ＰＨＡで刺激し、ＩＬ−２を含む培地中で培養し、次に、感染多重度７で、ＶＶ −１１３９で感染した。さらに１６時間培養した後、そのＰＢＭＣを、０．８％パラフォルムアルデヒドで固定し、これを、ＩＶ（静脈内）ルートによりＣ−４３３に再注入した（Ｘｇｇｕ＋７．　Ｄ、、　Ｂｅｒｎｘｒｄ、Ｊ、、　ＣｂＢｎｉｓｒ、　Ｒ，。

Ｄｅｓｐｏｒｆｅｓ、Ｉ。Ｌｅｏｎｇｒｄ、　Ｒ，、Ｆｏｕｃｈｓｒｄ、　Ｍ、、　Ｒｅｖｅｉｌ、　Ｂ、。

ｌ目ｅｌｅ、　Ｆ、Ｄ、、　Ｌａｒｈａｍｉ、　１．、　ＭｂＢｏ、　Ｋ、、　Ｗｘｎｅ、Ｊ、５１１１１１１１．　Ｊ。

Ｊ、、　Ｇｏａｓｕ＋ｄ、　Ｂ、、　Ｄｅｃｈｕａｌ、　Ｌ、、　Ｂｏｒｎ７．　＾、、　Ｎｘｒａ、　Ｐ、　＆Ｇｚｌｌｏ、　Ｒ，Ｃ，（１９８Ｂ）　ＮＮａ「ｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２２．７２８−７３１　）　、　４８、５４．５８．８１．８６．８８．１１４．１２４週に、Ｃ−４３３を、５ＡＦ−１と共に処方したｇｐ１６０ｅｎｖ、　ｐ１８ｇｉｇ、　ｐ２７ｎｅｔ及びｐ２３マ百　（各々、１回用量当り　１２５−２５０μｇ）の混合物でＩＭ接種した。

チンパンジーＣ−３３９は、最初、３３週目に、５ＡＦ−１（１ｍｇのスレオニルムラミルジペプチド）と混合した不活性化ＨＩＶ　（１２５ｔｔｇのウィルスタンパク質）で免疫し、次に、３７．４１．６２．１２４週目に追加抗原接種を行なった。次に、Ｃ−３３９に、６６．７４．８１．８５．８７週目に、精製したｇ９１６０ｅｎｖのみ（１用量当り１２５μｇ）を接種した。ｖ３ペプチド（１用量当り　３００μｇのペプチド）を、１０５．１０８．１２５週目に１Ｍ投与した。

Ｃ−３３９とＣ−４３３は、Ｉ（ＩＶ−Ｉ　ＨＴＬＶ−１１１８）１００７ＣＩＤ５ｏ’？’、１３１週目にチャレンジした。Ｃ−４４９は、０．６．１０．３３．３８．６６．７６週目に、ｇｐ１６Ｇｅｎｖ、　ｐ１８ｇａｇ及び５ＡＦ− １の混合物を、ＩＭ接種した。（注−Ｃ−４９９の０週は、Ｃ−４３３，Ｃ−３３９の４８週目に相当する）。２１個の遊離Ｖ３ペプチドの混合物（それぞれ、１用量当り　１００μｇ）を、５ＡＦ−１と共に、７９．８３．８７．１０２週目に、１Ｍ投与した。Ｃ−４９９及びＣ−０８７は、未処置のコントロールであるが、これは、１０６週目に、ＨＩＶフォルマリン、ベータープロピオラクトン不活性化ＨＩＶ全体とアジュバント５ＡＦ−１の混合物で、チンパンジーＣ−３３９を免疫すると、酵素免疫法（ＥＩＡ）で測定したｇａｇ−１ｅｎｖ−コード化タンパク質にたいする抗体の抗体価が高くなり、中和抗体反応が低（なり、かつ、細胞性免疫反応は検出されなかった。免疫反応を強化することを意図して、Ｃ−３３９を精製組換えｇｐ１６０ｅｎマで免疫した。ＢＣＧと一緒にＩ’１ｌ１５０ｅｎｖを、胸部の多数部位に１回度内接種した後、Ｃ−３３９に、５ＡＦ −１と共に処方した同じ抗原の４回の連続ＩＭ注入を行なった。全ＥＩＡ抗体、中和抗体価を定期的に測定したが、免疫過程の間、いずれも未変化のままであり、注入を中止した後に急速に低下した（第６Ａ図））１１Ｖに感染したヒトにおいては、ＨＩＶ中和抗体の多くが、ｖ３ループと名付けられた外側エンベロープ糖タンパク質の第３高可変領域に対する抗体である（Ｐｏｊｏｅ７．　Ｓ、　Ｄ、　、　Ｍａｊｌｈｅｗｓ。

Ｔ、Ｊ、、　Ｒｏｂｅ７．　Ｗ、Ｇ、、　Ｌ７ｎｎ、　Ｄ、Ｌ、、　Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｌ＋、　Ｍ、、、−ＭｕｅｌｌｅｒＪ、Ｔ、、Ｌａｎｇｌｏｉ＋、Ａ、Ｌ、、Ｇｈｒａ７ｅｂ、Ｉ、、ＰｅＮｅｖａ７．　Ｓ、Ｒ，、Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、Ｋ、Ｊ、、Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、Ｐ、Ｊ、、Ｗｏｎｇ−３ｔ＊ｘｌ、Ｆ、、Ｇ５１ｌｏ、Ｒ。

Ｃ，、＆　Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ、Ｐ、（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４．　１３９２−１３９５；　Ｒｕ５ｃｈｅ、Ｉ、ＲｏＫａｖａｈｅｒｉａｎ、Ｋ、、ＭｃＤａｎａｉ、Ｃ，、Ｐｅ１ｒｏ、Ｊ、、Ｌ７ｎｎ。

Ｄ、Ｌ、、Ｇｒｉｍａｉｌａ、Ｒ，、Ｌａｎｇｌｏｉｓ、Ａ、、ＧＩＩＩＯ，Ｒ，Ｃ，、＾ｒｔｈｕｒ。

Ｌ、Ｏ，、Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、Ｐ、１．、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ、Ｐ、、Ｐｌｎｅ７．　Ｓ、Ｄ、＆ＭａＨｈｅｖｓ、Ｔ、Ｊ、’　（１９８８１Ｐｒｏｃ、Ｎ＆口、＾ｅａｄ、Ｓｅｉ、Ｕ、Ｓ、＾、８５゜３１９８−３２０２；及びＬａＲｏｓａ、　Ｇ、］、、　Ｄａｖｉｄｅ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、　Ｋ、。

Ｗａｆｅｒｂｕｒ７．　＋　人、、Ｐｆｏｆ７．　＾、Ｔ、、Ｌｅｖｉｓ、Ｊ、Ａ、、Ｌａ、ｎｇｌｏｉｓ、＾。

Ｊ、、＾ｌ、、Ｄｒｅｓ’ｓｍａｎ、Ｇ、Ｒ，、Ｂｏｓｖｅｌｌ、Ｒ，Ｎ、、５ｈａｄｄｕｃｋ、Ｐ、。

Ｈｏ１ｌｅ７．　Ｌ、Ｈ，、Ｋａｒｐｌｕｓ、　Ｍ、、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ、Ｐ、、　Ｍａ口ｈｅｗｓ。

Ｔ、］、、Ｅｍｉｎｉ、Ｅ、＾、＆　Ｐｏｔｎｅ７．　Ｓ、Ｄ、（１９９０）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．　９３２−９３５）。ループ内部のエピトープにたいする抗体は、ウィルスの感染性を除去する。これは、恐らく、ウィルスエンベロープが標的細胞膜に融合するのを妨げることによるのであろう。実際、Ｖ３エピトープにたいする中和抗体は、ウィルスが細胞に結合してから４０から６０分後に加えても、なおかつ、感染を防止することができる（Ｎｇｔａ、Ｐ、Ｌ、、（１９８９）　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　８９゜ｅｄｓ、Ｌｅｒｎｅ＋、　Ｒ，＾、、　Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、　Ｈ，、Ｃｈａｎｏｃｋ、　Ｒ，ｌＪ、　＆　Ｂｒｏｗｎ。

Ｆ、（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｕｂｏ＋　Ｌａｂｏｒａｊｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ＮＹ）　ｐｐ、１３７−１４４　）。したがって、■３ループによる免疫が、中和抗体の抗体価をブーストするかどうかを調べるために、Ｃ−３３９に、２５アミノ酸から成るオリゴペプチドを注入した。こノオリコヘプチドは、）ＩＩＶ− Ｉ　ＢＲＵ（ＩＩｌ［ｌ）　ノＶ３配列を持ち、ＫＬ　Ｈに架橋結合し、Ｓへドー１と共に処方されている。ＥＩＡ力価には変化は観察されなかったが（第６Ａ図）、１０８週目に行なった第２回目の免疫後に中和抗体価には有意の増加が見られ、この抗体価は数ケ月間持続した（第７Ａ図）。

もう−匹のチンパンジーＣ−４３３は、あらかじめＶＶ−１１３９によるワクチン接種によって初回抗原刺激しておいたもので（Ｋｉｅｎ７、　Ｍ、Ｐ、、　Ｌｘｔｈｅ、　Ｒ，、Ｒｉｖｉｅｒｅ、　Ｙ、、　Ｄｏｆｆ、　Ｋ、、　ＳｃｈｍｉＨ，Ｄ、。

Ｇｉｒｘｒｄ、　Ｍ、、　Ｍｏｌａｇｎｉｅｒ、　Ｌ、　＆　Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、（１９８ｇ）　ＰｒｏＬＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２．２１９−２２６）　、組換え可溶性ｇｐ１６０ｅｎｖ、　ｐ１８ｇａｇ。

ｐ２７ｎｅｌ、　ｐ２３ｖｉｆそれぞれ１２５−２５０μｇで繰り返し免疫した（第１表）。この養生法によって誘発された抗ＨＩＹ抗体の反応は、明らかに一過性であって、抗体価は、各追加抗原の注入後に急上昇し、それから、急速に低下した（第６Ｂ図）。Ｃ−４３３の中和抗体とＥＩＡの力価は、平行して動揺した。最後に、Ｃ−４３３ニ、Ｃ−３３９ノものと同じｖ３ペプチド−ＫＬＨ接合体を、同じ免疫プロトコールに従って、注入した。このｖ３−ペプチド接合体の第２回目の注入後、中和抗体の抗体価が有意に増加し、その後そのまま高い状態が続いた（第７Ａ図）。４ケ月後（１２６週）３回目の免疫をしたが、抗体価に変化は起きなかった。

Ｃ−４３３が、最初に、精製組換えタンパク質の注入を受けたとき（４８週）、３番目のチンパンジーＣ−４９９は、５ＡＦ−１と共に処方した、精製ｇＰＩ６０ｅｎｖ、　ｐｌＢｇｔＨの１Ｍ注入を受けた。Ｃ−４９９は、同じ抗原で６回の追加抗原接種を受け、その後、２１個の遊離（接合されていない）Ｖ３ペプチド（Ｍ７ｅｒｓ、Ｇ、　（１９９Ｇ）　１ｎ）１１１１！ＩＩ　ＲｅｔｒｏｙｉｒＩＩｓｅｓ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ、ｅｄｓ、　ＭＨｒｓ、　Ｇ、、３ｏｘｅｐｂｓ、Ｓ。

Ｆ、、　ｌｏｎｇ−３ｊｓｓｌ、　Ｆ、、　Ｒｌｂｔｏｎ、　Ａ、Ｂ、、　Ｓｉｇｈ、　Ｔ、Ｆ、　＆　Ｂｅｒｗｏ＋ｓｋＬ　１．＾、（Ｌｏｓ＾ｌｘｍｏｓ　Ｎｘｌｉｏｎｇｌ　Ｌａｂｏｒｘｌｏｒ７．　Ｌｏｓ　Ａｌ！１１０１．　ＮＭ　）と５ＡＦ−１との混合物の一連の４回注入を受けた。Ｃ−３３９，Ｃ−４３３の場合と同様、Ｃ−４９９のＥＩＡ抗体価も、精製）ＩＴＶ抗原による免疫後急速に低下したが、ＥＩＡ抗体価にたいするｖ３３ペプチド用はほとんど検出されなかった。しかしながら、ｖ３ペプチドの接種後、中和抗体価には有意な増加（＞２０１１１１　）が見られた。

感染性）ＩＩＶによるチャレンジ中和抗体の抗体価が持続的に得られたので、チンパンジーＣ−４３３、Ｃ−３３９及びＣ−４９９を）ＩＩＶ−１の１００　ＴＣＩＤ５Ｇ（４０チンパンジー感染用量）をＩＶ接種してチャレンジした。チャレンジ時には、免疫蛍光抑制アッセイによる５０％中和抗体価は、１：２０００゜１：２８０−３５０．　１：２０００であったが、レンジチウム抑制アッセイ（Ｎｕｔ、　Ｐ、Ｌ、、　Ｈｘｔｃｈ、　Ｗ、Ｃ，、Ｄｕｎｌｏｐ、　Ｎ、Ｍ、、　Ｒｏｂｅｙ、　Ｗ、Ｇ、、＾ｒｌｈｕｒ、　Ｌ、Ｏ，、Ｇｏａｄｓ、Ｍ、＾、　＆　Ｆｉｓｅｈｉｎｇｅｔ、　Ｐ、Ｊ、（１９８７）　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、　Ｈｌｌｌｌｌｌｌｌ　Ｒｅｊｒｏｗｉｒｕｓｅｓ　３．２８３−３０２）による９０％中和抗体価は、チンパンジーＣ−４３３，Ｃ−３９９およびＣ−４９９では、それぞれ、１：５１２−１０２４．　Ｉ：１２１１および１：ＩＱ２４であった。Ｃ−４９９の免疫は、他の２匹の動物とは異なる時期に始めたのであるから、Ｃ−４９９のチャレンジは、Ｃ−３９９やＣ−４３３のものの６ケ月後に行なわれたのであるが、未処置のコントロール動物Ｃ−０８７のものと同時に行なわれた。接種後ＣＰり２週間に採取したＣ−０８７のＰＢＭＣから単離されたウィルスから、その後のものも全てそうであるが、Ｉ（ＩＶ−１保存株のＩ：１００希釈液は、われわれの実験条件下では、容易にチンパンジーに感染することが判明した。

免疫しチャレンジしたチンパンジーからＨＩＶを単離する試み１１１Ｖ−１によるチャレンジ後色々な時期に、三つの方法を用いて、免疫化動物の感染状態を評価した。先ず、ＰＣＨによって、リンパ球中に、ＨＩＶ配列を検出しようという試みを定期的に行なった（Ｌａｕｒｅ、Ｆ、、Ｒｏｕｔｉｏｕｘ、Ｃ，、Ｖｅｂｅｒ、Ｆｌ、ＪｓｃｏｍＣｌ。

Ｃ０Ｃｏｕｒ＠ｎ５ｕｄ、　Ｖ、８１ｘｎｃｂｅ、　Ｓ、、Ｂａｒｇ＊ｒｄ、　Ｍ、、　Ｇｒｉｓｃｅｌｔｔ。

Ｃ，ｈ　Ｂｒｇｃｂｏｔ、Ｃ，ｆ１９１１ｇ）　Ｌｘｎｃｅｊ　２．　５３８− ５４１；　Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ。

＆　ＦＩｌｏｏＩＩＩ、　Ｆ、Ａ、　（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅａｔ７ａ＋ｏ１．１５５．３３５−３５０；及びＫｖｏｋ、　Ｓ、　＆　Ｋ！ｌｌｏｇｇ、　Ｄ、Ｅ、　（１９９０）　ｉｎ　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：＾Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｓｎｄ　Ａｐｐｌｉｃｔｔｉｏｎｓ：　ｅｄｓ、Ｉｎｎ１ｓ、　Ｍ、＾、、　Ｇｅｌ＋ｕｄ、　Ｄ、Ｈ，、５ｎｉｎｓｋｙ、１３．　＆　Ｗｈｉｌｅ、　Ｔ１．（Ａｃｘｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｉｎｃ、、　３１１１　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）　ｐｐ、　３３７−３４７　）　、チャレンジ後３遇目、３ケ月目、６ケ月目に採取した、３匹の動物のＰＢＭＣから得たＤＮＡサンプルについてテストした。予想された電気泳動移動度を持つバンドは、コントロールの）ＩＩＶ感染チンパンジーから得たＤＮＡには検出されたが、ワクチン接種しチャレンジした動物や、コントロールの未処置動物からのＰＢＭＣには見られなかった（データは示していない）。チャレンジ後６ケ月では、ネストしたプライマー・セットを用いて、チャレンジしたチンパンジー、および、コントロール・チンパンジーから得たＰＢＭＣとリンパ節組織のＤＮＡについてＰＣＲ分析を行なった（Ｍｕｆｔｉｓ、　Ｋ、Ｂ、　＆　ＦＩｌｏｏＩＩＩ、　Ｆ、Ａ、　（１９ｇ？）　１ｅｔｂｏｄｓ　Ｅｎ！Ｙｍｏｌ。

１５５、３３５−３５０　）。この方法は、標準ＰＣＲよりも感度が高いので、この実験においては（全てのサンプルにたいして少なくとも７回繰り返す）、１．５Ｘ１０５細胞当量のＤＮＡがあれば、約１分子のウィルスＤＮＡでも強い信号を発生することが判明した。ＰＢＭＣ及びリンパ節サンプルの全てが、−貫して陰性であった。ただし、以前に感染したことのあるチンパンジーではそうではなく、この場合は、常に陽性であった（第８図）。

したがって、チャレンジ後６ケ月では、ウィルスＤＮＡは、ＰＢＭＣや、リンパ節組織内には、１０６細胞あたり１コピーよりも高い頻度では存在しなかった。

第二に、２．４．６．８週、および、その後１ケ月置きに、チンパンジーＰＢＭＣと、正常ヒトから得たリンパ球とを同時培養して、ＰＢＭＣからウィルスを単離しようと試みた（ＦｕｌｌＬ　Ｐ、Ｎ、、　ＭｃＣｌｕ＋ｅ、　）１．Ｍ、、５ｖｅｎ＠ｏｎ、　Ｒ，Ｂ、、　ＭｃＧｒａｊｈ、Ｃ，Ｒ，、Ｂｒｏｄｉｅ、　＾、、　Ｇｅ１ｃｈｅｌｌ、１．Ｐ、、Ｉｅｎｓｅｎ、　Ｆ、Ｃ，、＾ｎｄｅｒｓｏｎ、Ｄ、Ｃ，。

Ｂｒｏｄｅｒｓｏｎ、１．Ｒ，＆　Ｆｒｘｎｃｉｓ、　Ｄ、Ｐ、（１９！１６１　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、５１１．　１１６−１２４）。ＣＤ８＋細胞は、ＨＩＶに感染したヒト（Ｗａｌｋｅｒ、　Ｃ，Ｍ。

、Ｍｏｏｄ７．　Ｄ、Ｊ、、５ｔｉｔｅｓ、Ｄ、Ｐ、＆　Ｌｅｙ７．　Ｊ、＾、（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ２３４、　１５６３−１５６６；及びＴｓｕｂＮ＞、　Ｈ，、Ｌｏａｄ、　Ｃ，１，、Ｗｉｌｋｉｎｓ。

Ｄ、Ｉ、、Ｍｏｒｉｍｏｊｏ、Ｃ，＆　Ｌｅｔｖｉｎ、Ｎ、Ｌ、（１９ｇ９）　Ｉ、Ｅｌｌｌ、Ｍｅｄ、１６９、　１４２１−１４３４）およびチンパンジー（Ｐ、Ｎ、　Ｆ、　、未発表データ）においてウィルスの複製を抑制するだけでなく、ＳＩＶに感染したマカック属サル（Ｔｓｕｂｏｊｘ、　Ｈ，、Ｌｏｒｄ、　Ｃ，Ｉ、、　Ｗ［ｋｉｎｓ、　Ｄ。

１、、　Ｍｏｒｉｍｏｊｏ、　Ｃ，＆　Ｌｒｔｙｉｎ、　Ｎ、Ｌ、（１９８９）　Ｊ、　ＥＩ９．１ｅｄ、１６９゜１４２１−１４３４）においてもウィルスの複製を抑制することが判明しているので、いくつかの実験では、培養が完結する前に、チンパンジーＰＢＭＣからＣＤ８＋リンパ球を取り出した。コントロール動物すなわちＣ−０８７からのウィルス回収とは対照的に、最初の６ケ月の追跡中のいかなる時期においても、Ｃ−３３９，Ｃ−４３３又はＣ−４９９から得た全ＰＢＭＣ又はＣＤ４　に富む細胞のいずれからもウィルスは回収されなかった。ＰＩｅケ月後、未感染及びＩ（ＩＶ感染のコントロール・チンパンジーはもちろん、すべての動物について、鼠暎リンパ節のバイオプシーを行なった。正常ヒトＰＢＭＣと共に同時培養すると、感染コントロールのリンパ節からはウィルスが回収されたが、免疫し、チャレンジしたチンパンジーのものからは回収されなかった（データ示さず）。チャレンジ後、最初の６ケ月の間にウィルスを検出しようという試みは全て失敗したという事実にも拘らずに、チャレンジ後３２週以降に得たＰＢＭＣと、３７週後に得た骨髄との同時培養によって、Ｃ−４３３からウィルスが単離された。

最後に、この免疫養生法には含まれていないのであるが、チャレンジした動物については、ＨＩｖ抗原への血清交代がないかどうかを監視した。イムノプロット分析（Ｄｉｓｇｎｏｓｌｉｃ　Ｐａｇｔｅｗｔ）の結果、他の抗原の中でも取り分け、ｐ２５ｇｓｇではなく、ｐｌｇｇｓｇで免疫したＣ−４３３及びＣ−４９９は、７ケ月の追跡期間を通じて、Ｐ２５への血清交代を起こさなかったが、２１３２週で（７１／２ケ月）で、Ｃ−４３３にたいするイムノプロットにおいて、Ｐ２５バンドがかすかに観察された。このバンドは、それに続く血清サンプルでは強度を増した（第９図）。不活性化したＨＩＶ全体で免疫したＣ−３３９においては、ＥＩＡ抗、体価又は、ＨＩＶ特異タンパク質にたいする抗体の見掛けのレベルの検出可能な増加は見られなかった（第９図）。また、イムノプロットアッセイに精製抗原を用いても、マｉ【ないしｎｅｔタンパク質にたいする抗体は、１２ケ月の追跡期間中、Ｃ−３３９の血清中に全く検出されなかった。

ここに挙げた結果は、ＢｅｒＩｌ■と共同研究者（ＢｅｒＩｌｓｎ、　Ｐ、Ｗ、。

Ｇｒｅ’ｇｏｒ７．　Ｔ、Ｊ、、　Ｒｉｄｄｌｅ、　Ｌ、Ｎｓｋ＊ｍｗｔ＊、　Ｇ、Ｒ，、Ｃｂｕｅｐｅ、　Ｍ、＾。

Ｐｏｔｔｅｒ、ＩＰ、、　Ｗａｔｍ、　Ｆ９Ｍ、、　ＨｅｒｓｈｂｅｔＨ，Ｒ，Ｄ、、　Ｃｏｂｂ、　Ｅ、に、　＆ＥｉｃｈｂｓｒＨ，Ｊ、Ｗ、（１９９０）　Ｎｔｊｏｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３４５．６２！−６２５）の報告己たものと同様、様々のＩＩＩＶ−１抗原によって、チンパンジーに予防的な免疫反応を引き起こすことができることを明らかに示している。これまでに既に、Ｃ−４９９は、少なくとも７ケ月の追跡期間中、ＨＩＶ感染の成立にたいして保護されていること、また、Ｃ−３３９は１年間保護されたこと、また、ウィルスの出現に７ケ月の遅れのあったことで証拠だてられるように、ａ−Ｏ３は部分的にしか保護されなかったこと、が明らかになった。しかしながら、Ｃ−４３３も、チャレンジ用量が他の人々の用いたもの（Ｂｅｒｍｕ、　Ｐ、Ｗ、、　Ｇｔｅｇｏｔｙ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｒｉｄｄｌｅ、　Ｌ、、　Ｎｘｋｘｍｕｒｘ。

Ｇ、Ｒ，、Ｃｈ＊ｍｐｅ、　、Ｍ、＾、、　Ｐｏｒｔｅｒ、Ｊ、Ｐ、、　Ｗａｒａ＋、　Ｆ、Ｍ、、　Ｈｅｒｘｈｂｅｒｇ。

Ｒ，Ｄ、、　Ｃｏｂｂ、Ｅ、に、　＆　Ｅｉｅｈｂｅｒｇ、Ｊ、Ｗ、（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）３４５、　６２２−６２５　）と同じであったならば、完全に保護されていたという可能性はある。すなわち、今回の実験で用いた用量は、他の人々が用いた用量の４分の１であったのである。保護作用は次のことによって証明される。（ｉ）月々の試験におけるＰＢＭＣから、及びＰＩＳケ月におけるリンパ節組織から、ウィルスが回収されないこと、（ｉ　ｉ）いろいろな間隔で採取したＰＢＭＣから、及びＰＩ６ケ月におけるリンパ節から得たＤＮＡについてＰＣＲ分析しても、ハイブリダイゼーション信号が陰性であること、（ｉ　ｉ　１）ＨＩＶ−次感染後に通常続く抗体反応、または、以前にワクチン接種を受けてチャレンジされた動物における既往反応に特徴的な抗体反応が無いこと（Ｂｅｒ＋ｏｎ。

Ｐ、Ｗ、、　Ｇｒｏｏｐｓ＋ｓｎ、　Ｊ、Ｅ、、　ＧｒｅＨｏｒｙ、　Ｔ、、　Ｃｌ５ｐｈｕ＋、　Ｐ、Ｒ３，Ｗｅｉｓｓ。

Ｒ１＾、、Ｆｅｒｒｉ＊ａｉ、　Ｒ，Ｒｉｄｄｌｅ、　Ｌ、、　Ｓｈｉｍｍｓｍｋｉ、　Ｃ，、Ｌａｃｓｓ、　Ｃ。

、　ＬｘｓｋＹ、　Ｌ、＾、　＆　Ｅｉｃｂｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｗ、（１９ｇ８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｕｌｌ、　Ａｃｘｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　８５．５２００−５２０４；　Ａｒｊｈｏｔ、　Ｌ、０．、　Ｈｅ５ｓ、　Ｊ、Ｗ、、　Ｖａｔｅｒｓ、　Ｄ、Ｊ、、　Ｐ７１ｅ、　Ｓ、Ｗ、、　Ｋｅｌｌｉｈｅｒ、　Ｊ、Ｃ，、Ｎ５ｒａ、　Ｐ、Ｌ、、　Ｋｒｏｈｎ、　Ｋ、、　Ｒｏｂｅ７．　Ｗ、Ｇ、、　Ｌｓｎｇｌｏｉｓ、＾、Ｊ、、　Ｇ５１ｌｏ、　Ｒ，Ｃ，＆　Ｆｉｔｅｈｉｎｇｅｒ、Ｐ、Ｊ、（１９８９）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６３．　５０４６−５［１５３；　Ｇｉｒｇｒｄ、　Ｍ、、Ｘ１ｅｎ７．　Ｍ、Ｐ、、　Ｇｌｕｃｋｍｘｎ、　Ｊ、Ｃ，、Ｂｇｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ、　Ｆ、、　Ｍｏｎｊａｇ＋＋ｉｅｒ、Ｌ、＆　Ｆｏ目！、Ｐ、（１９９０）　ｉｎ　Ｖｇｃｃｉｎｅｓ　ｆｏｒ　５ｅｘａａｌ１７　Ｔｒｘｎｓｍ１目ｅｄ　Ｄｉｓｅｌｓｅｓ　ｅｄｘ、　Ｍｅｈｅｏｔ、＾、　＆　５ｐｉｅｒ、Ｒ，（ＢｕＮｅｒｖｏｔｊｈＣｏ、、Ｌｉｄ、、Ｌｏｎｄｏｎ）、ｐｐ、２２７ −２３７）である。

Ｃ−４３３は、７ケ月間保護されているように見えたが、実際には、チャレンジの時点から感染していた。これは、ウィルス単離や、ＰＣＲによる検出では繰り返し陰性の結果が出ていたにも拘らずそうであった。この事実は、悩ましく、また、ＨＩＶは、ウィルス学的基準及び血清学的基準のいずれに基づく検出゛　をも免れるように隔離されることがあるという事実を強調するものでもある。同様のことが報告されており（Ｄｅｍｒｏｓｉｅｔｓ、飢Ｃ，，Ｗ７ｘｎｄ、　Ｍ、Ｓ、、Ｋｏｄａ＋ｕ、　Ｔ、、Ｒｉｎｇｌｅｒ、Ｄ、Ｊ、、　Ａｒｈｌｕｒ、Ｌ、Ｏ。

、Ｓｅｈｇａｌ、Ｐ、に、、Ｌｅｌｖｉｎ、　Ｎ、Ｌ、、Ｋｉｎｇ、　Ｎ、！、　＆　Ｄａｎｉｅｌ、　Ｍ、Ｄ。

（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎ’ａｌｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　８６．６３５３−６３５７）　、それは、不活性化されたウィルス全体で免疫し、次に感染性ＳＩＶでチャレンジしたマカック属サルで見られたものであった。

その研究においては、最初、３２週まではウィルスは回収されず、既往反応も、チャレンジ後３９週までは観察されなかった。

天然ＨＩＶ感染における観察で、長期に亘って、通常のテストで血清陰性であったヒトに、ＰＣＲまたはウィルス単離法でＨＩＶが検出されたことがある（Ｒａｎｋｉ、　Ａ、、Ｖｌｌｌｅ、Ｓ、Ｌ、、Ｋｒｏｈｎ、Ｍ、、’＾ｎ１ｏｎｅｎ、Ｊ、、＾ｌ１ｓｉｎ、Ｊ、Ｐ、、Ｌｅｕｊｈｅｒ、Ｍ、、Ｆｒ５ｎｃｈｉｎｉ、　Ｇ、　＆　Ｋｒｏｌｒｎ、　ｋ　（１９’８７）　Ｌｓｎｅｅｌ　２，５８９−５９３；及びＪｅｈｕｄａ−Ｃｏｈｅｎ、Ｔ、、５ｌｘｄｅ、Ｂ、Ａ１．　Ｐｏｗｅｌｌ、］、Ｄ、、Ｖｉｌｌｉｎｇｅｔ、Ｆ、、Ｄｅ、Ｂ、。

Ｆｏｌｋｊ、Ｔ、Ｍ、、ＭｃＣＩｕｔｅ、）１．Ｍ、、５ｅｌｌ、ＬＷ、＆　＾ｈｍｅｄ−＾ｎ５ａｒｉ。

＾、（１９９０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、８７．　３９７２−３９７６　）。

このことは、高度の危険にさらされている個体、例えばＨＩＶ感染者の性交相手は、血清学的分析、ウィルス学的分析又はＰＣＲ分析が陰性であるにも拘らず、感染していや可能性のあることを示唆する。

３匹のチンパンジーの受けた免疫養生法の複雑性から見て、たくさんの抗原および／ま些は抗原調製物の内のどれが、部分的防衛を発揮するのに役だったのかを決めるのは難しい。Ｃ−３３９は、不活性化ＨＩ　Ｖ、精製ｇｐｔａｏ及びｖ３ペプチド−ＫＩ、Ｈ接合体により連続的に免疫された。Ｃ−４３３は、先ず、ワクチェアウイルスｇＮ６０ｅｎｙ組換え体で、次に、精製ｅｎｙ、　ｐ１８Ｈｇ＋ｎｅｔ及びマ１１抗原の混合物で、最後に、ｖ３ペプチド−ＫＬＨ接合体で、免疫された。もっとも簡単な免倚養生法は、Ｃ−４９９のものであった。すなわち、精製ｇｐ１６０ｅｎマ及びｐ１８ｇａｇで先ず行い、その後で、非接合ｖ３ペプチドで免疫した。この３匹の動物に共通の抗原は、ｇ９１．、−６０ｅｎマ、　ｐ１８ｇＢ及びｖ３ペプチドであるが、その重要性の相対変は、今後、決めるべき問題である。

十分な予防の゛ためには、１個以上のウィルスタンパク買上に見出される多数の抗原決定基、および／または、同一抗原決定基の多数の提示が必要であろう。

従来のテストでは、チンパンジーにおいて、中和抗体の有意な抗体価を誘発しなかったとされる原型ワクチン（ＢｅｒＩｌ■、Ｐ。

ｔ、　Ｇｔｏｏｍｓｎ、Ｊ：Ｅ、、　Ｇｒｅｌｏｒ７．　Ｔ、、　Ｃｌｇｐｈ＊ｍ、　Ｐ、Ｒ，、Ｗｅｉｓｓ、　Ｒ。

＾、、　Ｆｅｒｔｉ＊ｎｉ、　Ｒ９，Ｒｉｄｄｌｅ、　Ｌ、、Ｓｂ１ｍ１ｓｓｋｉ、　Ｃ，、Ｌｕｃｓｓ、　Ｃ，、Ｌｘｓｋ７．　Ｌ、Ａ、　＆　Ｅｉｃｂｂｅｒｇ、Ｊ、Ｗ、（１９８Ｂ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ１ｄ、　！ｉｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、１１５．　５２００−５２０４．＾Ｎｂｕｒ、　Ｌ、Ｏ，、Ｂｅ５ｓ、１．Ｗ、、　Ｗｓｔｅｔｓ、　ＤＪ、、　Ｐ７１ｅ、　Ｓ、Ｗ、、Ｋｅｌｌｉｈｅｒ、　Ｊ、Ｃ，、Ｎａｒｓ、　Ｐ、Ｌ、、　Ｋｒｏｂｎ、　Ｋ。

、　Ｒｏｂｅ７．　Ｗ、Ｇ、　Ｌ８ｎｇｌｏｉｓ、　＾、Ｊ、　Ｇｅ１ｌｏ、Ｒ，Ｃ，＆　Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、　Ｐ。

Ｊ、（１９ｇ９）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３．５０４６−５０５３；　Ｇｉｒｓｒｄ、　Ｍ、、　Ｘ１ｅｎ７．　Ｍ。

Ｐ、、　Ｇｌｏｃｋｍｌｎ、Ｊ、Ｃ，、Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ、Ｆ、、Ｍｏｎｊｘｇｎｉｅｒ、　Ｌ。

＆　Ｆｕｌｌ！、Ｐ、（１９９０）　ｉｎ　Ｖｘｃｃｉｎｅｓ　ｆｏｒ　５ｅｕｘｌ１７　ＴｒａｎｓｍｉｔｔｅｄＤｉｓｅａｓｅｓ　ｅｄｇ３Ｍｅｈｅｕｓ、＾、　＆　５ｐｉｅｒ、Ｒ，（Ｂａｌｔｅｒｖｏｒｊｈ　Ｃｏ、。

Ｌｔｄ、、　Ｌｏｎｄｏｎｇ）、　ｐｐ、２２７−２３７；及びＨｕ、　Ｓ、Ｌ、、　Ｆｕｌｌｘ、　Ｐ、Ｎ、。

ＭｃＣＩＩｌｒｅ、Ｈ，Ｍ、、　Ｅｉｃｂｂｅｒｇ、］、Ｌ、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｅ、に、、Ｘｘｒｌｉｎｇ、ｌ、。

５ｈｉＢｈｓｌ、　Ｍ、Ｃ，、Ｘｏｓｏｖｓｋｉ、　Ｓ、Ｇ、、　５ｖｅｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｂ、、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ。

Ｄ、Ｃ，＆　ＴｏｄＪｒｏ、　Ｇ、　ｆ１９８フ）　Ｎ５ｊａｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２８．　７２１−７２３）が、この動物の実験的感染を予防するという点でも無効であっ察は、Ｃ−３３９とＣ−４３３とにおいてハ、ｖ３ペブチＦ −ＫＬ）ｌ接合体の２回注入後に、Ｃ−４９９においては、ｖ３ペプチドの３回注入後に得られたということは（第７図）、ｖ３は、チンパン合よりもペプチドとして提示された時に、区別的に見られるのかもしれないことを示している。われわれは、免疫アフィニティー・クロマトグラフィーに六って、予防されたチンパンジー血清中のほとんど全てのＨＩＶ中和活性が、ｖ３ペプチドによって吸着され得ることを見出−た（Ａ、Ｐ、の未発表データ）。

ｇｐｔａｏによる免疫が、本実験では、チノパンツの予防という結果を招き、Ｂｅｒｍｕら（Ｂｅｒｍｕ、Ｐ、Ｗ、、　Ｇｒｓｇｏｒｙ、　Ｔ、Ｊ、、Ｒｉｄｄｌｅ、Ｌ、、ＮＩｋｔｎｕｒｓ、Ｇ、Ｒ，、Ｃｈｕ＋ｐｃ、Ｍ、＾、、Ｉ’ｏＮｅｒ、Ｊ、　Ｐ、、Ｗｕｒｍ。

ＦｏＭ、、Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ、Ｒ，Ｄ、、Ｃｏｂｂ、Ｅ、Ｌ　＆　Ｅｉｃｈｂｅｒｇ、Ｊ、Ｗ、　（１９９Ｇ）Ｎ５ｊａｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３４５．６２２−６２５　）の報告するものではそうならなかった理由は、ｖ３ペプチドの追加抗原接種によって説明できるかもしれない。すなわち、後者の研究では、２匹のチンパンジーがｇｐ１２Ｇでの免疫により予防され、かつ、この動物たちは、感染から予防されなかった２匹の動物よりも、ｖ３ループに見られる主要な中和抗原決定基（ＰＮＤ）にたいし、３から４倍も高い抗体価を持っていた。

本実験で観察された保護が、全く中和抗体のみによるものか、他の免疫機構が関わっているかどうか、という疑問は未解決のままである。チャレンジの時点で、抗体依存性の細胞性細胞毒性が、Ｃ−３３９の血清には認められたが、他の２匹のチンパンジーの血清には見られなかった。可溶性タンパク質ｐ１８ｇｍｇ、　ｇｐ１６０ｅｎｗ、ｐ２７ｎｅｌ　（Ｂｉｈｒｘｏｕｉ、Ｅ、、Ｙａｇｃｌｌｏ、Ｍ、、Ｂ１１１ａｕｄ、Ｊ、Ｎ。

、　５ｕｂｔｌｉｅｒ、３９Ｍ、、　（＋ｕ７．　Ｂ、、　Ｍｕｃｔ＋ｍｏｒｅ、　Ｅ、、　Ｇｉｒｓｒｄ、　Ｍ、　＆　Ｇ１ｗｅｋｍ■、Ｊ、Ｃ，（１９９０）＾ＩＤＳ　Ｒｅｓ、Ｈｕｍｘｎ　Ｒｅｌｔｏｗｉｔｕｓｅｓ　６．　１０８７ −１０８８；及びＶｓｎ　Ｅｅｎｄｅｎｂｕｒｇ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｙｘｇｅｌｌｏ、　Ｍ、、　Ｇｉｒｘｒｄ、　Ｍ。

、　Ｋｉｅｎ７．　Ｍ、Ｐ、、　Ｌｅｃｏｃｑ、　Ｊ、Ｐ、、　ｌｕｃｈｍｏｒｅ、Ｅ、、　Ｆａｃ！、　Ｐ、Ｎ、。

Ｒｉｖｉｓｒｅ、　Ｙ、、　Ｍｏｎｊａｇｎｉｅｔ、　Ｌ、　＆　ＧＩｕｃｋｍ＊ｎ、Ｊ、Ｃ，（１９１１９）＾１０５Ｒｅｓ、　Ｈｌｌｍｌｌｌ　Ｒｅｌｒｏｗｉｒｕｓｅｓ　５．４１−５０　）にだいするＨＩＶ特異的増殖反応が、Ｃ− ４３３のＰＢＭＣにおいては、ウィルスチャレンジの前後に検出されたが、Ｃ− ３３９からのＰＢＭＣにおいては検出されなかった。面白いことに、Ｖ３−ＫＬＨ接合体で免疫すると、Ｃ−４３３は、ｖ３ペプチドにたいする、Ｔ−ヘルパー細胞の反応性が持続性と強度を増すのに、Ｃ−３３９の方は、弱い反応しか示さなかった。Ｃ−４４９の反応については、現在研究中である。チャレンジ前、チャレンジ当日、チャレンジ後で、ワクチン接種したチンパンジーのＰＢＭＣにおいて、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を検出しようと繰り返し試みたが、不成功であった。したがって、観察された保護作用は、Ｔ−ヘルパー細胞またはＣＴＬ活性とは相関していないようである。

ここに示した結果は、ＨＩｖワクチンが、ウィルス感染にたいして予防作用を誘発することができる、ということを示している。ｖ３ペプチドによって誘発される、高度の中和抗体反応は、型特異的である。すなわち、チャレンジ時点においてワクチン接種を受けた動物の血清は、比較的多様なＨＩＶ分離種ＲＦを中和するが、ＭＮについてはほんのわずかしか中和しない（未発表データ）。したがって、多くの）ＩＩＹ−１変異種にたいしては、中和抗体の抗体価を高めるようなワクチンを設計することが将来必要になろう。ところが、ＨＩＶ感染者の血清の大多数が反応するＰＮＤ配列が最近同定されたが（ＬｘＲｏｓａ、　Ｇ、Ｊ、。

Ｄａｖｉｄｅ、Ｊ、Ｐ、、　Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、　Ｋ、、　Ｗｘｊｅｒｂｕｒ７．　Ｉ、Ａ、、Ｐｒｏ１７．　Ａ、Ｔ。

、Ｌｅｖｉｓ、Ｊ、人、、Ｌａｎｇｌｏｉｓ、＾、Ｉ、、Ａ、Ｊ、、Ｄｒｅｘｓｍ！ｎ、Ｇ、Ｒ，。

Ｂｏｓｖｅｌｌ、Ｒ，Ｎ、、５ｂｓｄｄｕｃｋ、Ｐ、、Ｈｏ１ｌｅ７．　Ｌ、Ｈ，、Ｋｉｔｐｌｕｓ、Ｍ、。

Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ、Ｐ、、Ｍａｌｊｂｅｗｓ、Ｔ、Ｊ、、Ｅｍｉｎｉ、Ｅ、＾、、＆　Ｐ＋ｕｎｅ７゜Ｓ、Ｄ、（１９９Ｇ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．９３２−９３５）　、それを見ると、この問題は、以前考えていたほど困難ではないかもしれない。２匹のチンパンジーでは、外見上、予防に成功し、もう−匹においても長期に亘ってウィルスを抑圧できたということは、ヒトに長期の予防免疫を与えることができるであろうという期待を持って、ＨＩＶワクチンの開発にさらに努力を向けることを正当化するものであろう。

この二重免疫法（ｇｐ１６０で初回抗原刺激し、次に、ｇｐｌｆＯのｖ３ループの配列を持つ合成ペプチドで追加抗原刺激する）の適正を確認するために、さらに実験を行なった。すなわち、ＡＩ　（ＯＨ）　３．．５７ｎｔｅｘアジユバント、　５ＡＦ−１及びＦｒｅｏｎｄの不完全アジュバント（ＩＦＡ）の３つのアジュバントを比較し、且つ、免疫のための加速スケジュールをテストする、ことである。加速スケジュールは、０及び１ケ月でｇｐ１６０を、３及び４ケ月でｖ３ペプチドを、さらに、６ケ月で最後の追加抗原としてｇｐ１６０とｖ３の両方を与えるというものである。

実験は、アカゲサルで行なった（１０ツトあたり４匹）。初回抗原刺激にはｇｐ１６．ＯＢＲＵ　１０Ｇμｇを、また、追加抗原刺激にハＶ３−ＢＲＵ　（ｇｐ１２０７　ミ／酸残基３Ｇ２−３３５）とＶ３−ＭＮ　（同一残基）のそれぞれ２００１１ｇの混合物を用いた。動物から、１月間隔で、血液を採取し、ＥＬＩＳＡにより、抗Ｖ３．抗ｇｐ抗体（’Ａｂ）抗体価を定量した。中和Ａｂの抗体価は、免疫蛍光ス系ッド形成の抑制をもって測る方法で定量した。

抗ｇｐ１６０＾ｂは、精製ｇｐ１６０　ＢＲＵでコートしたプラークを用い、ＥＬＩＳＡによって測定した。抗ｇｐ１６０＾ｂの早い反応が、３グループの動物で観察されたが（第１０図）、同じ抗原にたいする反応は、ＩＦＡ及びＳＡＦ、ｌ処理のグループの方が、ミョウバン処理のグループよりも、５から１０倍高かった。Ｖ３ペプチドの注入は、抗ｇｐ１６０抗体価には影響を及ぼさなかった。

６ケ月目にｇｐ１６Ｇによる回復注入をすると、抗体価は数倍増幅したが、またしても、ミョウバンで処理したグループでは、他の２グループに比べて、１７２〜ｊ／８の反応しか得られなかった。

抗７３　Ａｂを、ＢＲＵペプチドでコートしたプラークを用い、ＥＬＩＳＡで測定した。Ｖ３にたいする反応は、すべてのグループにおいて明らかに二相性で、３ケ月目にｖ３ペプチドを注入すると、強い追加抗原作用が認められた（第１１図）。すなわち、抗ｖ３抗体価は、３から４ケ月の間で、１０倍に増加し、その後プラトーに達した。これは、ｇｌ１１６０で初回抗原刺激処理をした動物における、ｖ３ペプチド注入の著明な追加抗原効果を裏付けるものである。これは、実験に用いたアジュノくントとは無関係に観察された。

しかしながら、ｖ３にたいする最初の反応を３ケ月目に測定してみると、ミョウバン処理グループよりも、５ＡＦ−１，ＩＦＡ処理グループの方が５から６倍高かった。最終の抗ｖ３抗体価は、結局、ミｓウバン処理グループよりも、５ＡＦ −１、ＩＦ＾処理の２グループの方が、約１０倍高かった。２段階免疫スケジュールは次のように定義できよう。

初回抗原刺激−〇及び１ケ月にｇｐ１６Ｇ、追加抗原注入−３ケ月にｖ３ペプチド、および第２の追加抗原注入−６ケ月にｇ９１６０＋Ｖ３ペプチド。

第２の追加抗原刺激は、既往反応を上昇させるために、もつと遅く、例えば１２ケ月としてもよい。

免疫前血清はすべて、中和Ａｂに関して陰性であった。第２の追加抗原刺激（７ケ月目）後１ケ月で測定した中和Ａｂの抗体価は、下記の通りであった。

アジュバントサル　＾ｌ　（ＯＨ）　３ＳＡＦ−Ｉ　ＩＦ＾１　６０　１４０　＞４５０２　陰性　１３５　３４Ｇ３　１２３　＞４５０　２９２ ±　陰性　＞４５０　４４０ここでもまた、ミョウバンを使うよりも、５ＡＦ−１ないしＦｒｅｏｎｄ不完全アジュバントを使う方が、はっきりと有利であった。もっとも、抗体価の相対的差は、各グループ間であまり目立たない程度であった。

結論として、霊長類にたいする、２段階の抗旧Ｖ高速免疫スケジュールは、高い抗ｖ３反応、高い抗ｇｐｔａｏ反応及び高い中和Ａｂ反応を誘発することができる。このスケジュールは、次の手順を含む。

ｇ９　ｇｌｌ　Ｙ３Ｖ３　ｇｐ＋Ｖ３このスケジュールにたいする別の手順も含み得る。

ＩＩＩ　ｇｐ　Ｖ３　ｇｐ＋Ｖ３ミａウバン［＾ｊ（（ＩＨ）３］を用いるよりも、Ｓ７山ｘアジユノくント５ＡＦ−１または不完全Ｆ４ｅｏｎｄアジュバントを使用する方が有利である。というのは、前の二つのアジュバントの方が、後者に比較して、最終抗体価が、５から１５倍高いからである。

下記の文献は明細書中に引用されたものである。

１、　Ｋｏｆｆ、　Ｗ、Ｃ，＆　Ｆａｕｃｉ、　Ａ、Ｓ、　（１９８９）　ＡＩＤＳ　３（５１）。

５１２５−５１２９゜２、　Ａｄａ、Ｇ、Ｌ、　（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３３９．　３３１−３３２゜Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３．５０４６−５０５３゜５、　Ｇｉｒａｒｄ、　Ｍ、、　Ｋｉｅｎｙ、　Ｍ、Ｐ、、　Ｇｌｕｃ）ａｎａｎ、　Ｊ、Ｃ，。

Ｂａｒｒｅ−５ｉｎｏｕｓｓｉ、　Ｆ、、　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、　Ｌ、　＆　Ｆｕｌｔｚ、　Ｐ、　（１９９０）　ｉｎ　Ｖａｃ−ｃｉｎｅｓ　ｆｏｒ　５ｅｘｕａｌｌｙ　Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｅｄｓ、　Ｍｅｈｅｕｓ、　Ａ、　Ａ７、　Ｂｅｒｍａｎ、　Ｐ、Ｗ、、　Ｇｒａｇａｒｙ、　？、Ｊ、、　Ｒｌｄｄｌｅ、　Ｌ、。

Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｇ、Ｒ，、Ｃｈａｍｐｓ、　Ｍ、、Ａ、、　Ｐｏｒｔｅｒ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｗｕｒｍ、　Ｆ、Ｍ、。

Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ、　Ｒ，Ｄ、、　Ｃｏｂｂ、　Ｅ、に、　＆　Ｅｉｃｈｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｗ、　（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　３４５．　ｆｆ２２−６２５゜８、　Ｄｏｓ＋ｒｏｇｉｅｒｓ、　Ｒ，Ｃ，、Ｗｙａｎｄ、　Ｍ、Ｓ、、　Ｋｏｄａｎｕ；〒９Ｒ１ｎｇｌｓｒ、　Ｄ、Ｊ、、　Ａｒｔｈｕｒ、　Ｌ、Ｏ，、Ｓｅｈｇａｌ、　ＰＪ、、　Ｌａｔｖｉｎ、　Ｎ、Ｌ、。

Ｋｉｎｇ、　Ｎ、Ｗ、　＆　Ｄａｎｉｅｌ、　Ｍ、Ｄ、　（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、８６８６，６３５３−６３５７゜９、　Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂ、　Ｍ、、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｌ、Ｍ、、　Ｄａｖｉｓｏｎ−ＦａＬｒｂｕｒｎ。

Ｂ、、　Ｍｏｎｔａｌａｒｏ、’Ｒ，Ｃ，，Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｍ、、　Ｗｅｓｔ、　Ｍ、、　Ｏｈｋａｗａ、　Ｓ、。

Ｂａ５ｋｉｎ、　Ｇ、Ｂ、、　Ｚｈａｎｇ、　Ｊ、Ｙ、、　Ｐｕｔｎｅｙ、　Ｓ、、　Ｄ、　Ａ１１ｉｓｏｎ、　Ａ、Ｃ，＆Ｅｐｐｓｔｅｉｎ、Ｄ、Ａ、（１９８９）　！；ｃｉｔａｎｃａ　２４６．　１２９３−１２９７゜１０、　Ｅｍｉｎｉ、！、入、、Ｎａｒａ、Ｐ、Ｌ、、５ｃｈｌ＠ｉｆ、Ｗ、入、、Ｌａｗｉｓ。

Ｊ、Ａ、、　Ｄａｖｉｄｅ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｌｅｅ、　Ｄ、Ｒ，、Ｋｅ＊５ｌｅｒ、　Ｊ、、　Ｃｏｎ１ａｙ、　Ｓ、。

Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ、　Ｓ、、　Ｐｕｔｎｅｙ、　Ｓ、Ｄ、、　Ｇｅｒ＠ｔｙ、　Ｒ，Ｊ、　＆　Ｅｉｃｈｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｗ。

（１９９０）　Ｊ、Ｖｌｒｏｌ、６４．　３６フ４−３６７８゜１１、　Ｍｏｏｒ−Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ、　Ｊ、　＆　Ｍａｈｏｎｅｙ、　Ｃ，Ｊ、（１９８９）　Ｊ、　Ｒｅｄ。

Ｐｒｉｍａｔｏｌ、１Ｂ、１−２６゜１２、　Ｋｉｅｎｙ、　Ｍ、Ｐ、、　Ｌａｔｈｅ　Ｒ，、Ｒｉｖｉｅｒａ、　Ｙ、、　Ｄｏｔｔ、　Ｋ、。

Ｓｃｈｍｉｔｔ、　Ｄ、、　Ｇｉｒａｒｄ、　Ｍ、、　Ｍｏｎｔａｇｎｉａｒ、　Ｌ、　＆　Ｌａｃｏｃｑ、　Ｊ、Ｐ、　（１９８８）Ｐｒｏｔ、　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２．２１９−２２６゜１３、　Ｓｃｈｍｉｄｔ、　Ｄ、、　Ｄｅｚｕｔｔｅｒ−Ｄａｍｂｕｙａｎｔ、　Ｃ，、Ｈａｎａｕ、　Ｄ、。

Ｓｃｈｍｉｔｔ、　Ｄ、λ、、　Ｋｏｌｂｅ、　Ｈ，Ｖ、Ｊ、、　Ｋｉｅｎｙ、　Ｍ、Ｐ、、　Ｃａｚｅｎａｖｅ、　Ｊ、Ｐ。

＆　Ｔｈ１ｖｏｌｅｔ、　Ｊ、　（１９８９）　Ｃｏｍｐｔａｓ　Ｒｅｎｄｕｓ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｐａｒｉｓ。

３０Ｂ（ＩＩＩ）、　２６９−２７５゜１４、Ｇｕｙ、　Ｂ、、　Ｒｉｖｉｅｒａ、　Ｙ、、　Ｄｏｔｔ、　Ｌ　Ｒａｇｎａｕｌｔ、　Ａ、　＆Ｋｉｅｎｙ、　Ｍ、Ｐ、　（１９９０）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７６、４１３−４２５゜１５、　Ｋｏｌｈａ、　Ｈ，Ｖ、、　Ｊａｅｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｌｅｐａｇｅ、　Ｐ、、　Ｒｏｉｔｓｃｈ、　Ｃ，。

Ｌａｃａｕｄ、　Ｇ、、　Ｋｉｅｎｙ、　Ｍ、Ｐ、、　５ａｂａｔｉｅ、　Ｊ、、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｓ、Ｗ、　＆　Ｌｅｅｏｃｑ。

Ｊ、Ｐ、　（１９８９）　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　４７６、９９ −１１２゜１６、Ａ１１ｉｓｏｎ、　Ａ、Ｃ，＆　Ｂｙａｒｓ、　Ｎ、Ｅ、（１９８６）　Ｊ、　Ｉｍｎｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　９５．　１５７−１６８゜１７、Ｐｕｔｎｅｙ、　Ｓ、Ｄ、、　Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｒｏｂｅｙ、　Ｗ、Ｇ、、　Ｌｙｎｎ。

Ｄ、Ｌ、、　Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ、　Ｍ、、　Ｍｕｅｌｌｅｒ、　Ｗ、Ｔ、、　Ｌａｎｇｌｏｉｓ、　Ａ、Ｌ、。

Ｇｈｒａｙｅｂ、　Ｊ、、　Ｐｅｔｔｅｗａｙ、　Ｓ、Ｒ，、Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、　ＬＪ、、　Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ。

Ｐ、Ｊ、、　Ｗｏｎｇ−５ｔａａｌ、　Ｆ、、　Ｇａ１ｌｏ、　Ｒ，Ｃ，＆　Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、　Ｄ、Ｐ、　（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４．１３９２−１３９５゜１Ｂ、Ｒｕ５ｃｈｅ、　Ｊ、Ｒ，、Ｋａｖａｈｅｒｉａｎ、　Ｋ、、　ＭｃＤａｎａｌ、　Ｃ，、Ｐｅｔｒｏ。

Ｊ、、　Ｉ＋ｙｎｎ、　Ｄ、Ｌ、、　Ｇｒｉｍａｉｌａ、　Ｒ，、Ｌａｎｇｌｏｉｓ、　Ａ、、　Ｇａ１ｌｏ、　Ｒ，Ｃ，。

Ａｒｔｈｕｒ、　Ｌ、Ｏ，、Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、　Ｐ、Ｊ、、　Ｂｏｌｏｇｎｅ＋ｓｉ、　Ｄ、Ｐ、、　Ｐｕｔｎｅｙ。

Ｓ、Ｄ、　＆　ＭＡｔｔｈｅｗｓ、　Ｔ、Ｊ、（１９８［］）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８５．３１９８−３２０２゜１９、　ＬａＲｏｓａ、　Ｇ、Ｊ、、　Ｄａｖｉｄｅ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、　Ｌ。

Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ、　Ｊ、Ａ、、　Ｐｒｏｆｙ、　Ａ、Ｔ、、　Ｌｅｗｉｓ、　Ｊ、Ａ、、　Ｌａｎｇｌｏｉｓ、　Ａ、Ｊ、。

Ａ、Ｊ、、　Ｄｒｅ！３ｓｍａｎ、　Ｇ、Ｒ，Ｂｏｓｗｅｌｌ、　Ｒ，Ｎ、、　５ｈａｄｄｕｃｋ、　Ｐ、、　Ｈｏ１ｌｅｙ。

Ｌ、Ｈ，、Ｋａｒｐｌｕｓ、　Ｍ、、　Ｂｏｌｏｇｎｊｓｉ、　Ｄ、Ｐ、、　Ｍａｔｔｈｅｗｓ＋、　Ｔ、Ｊ、　Ｅｍｉｎｉ。

Ｅ、Ａ、　＆Ｐｕｔｎｅｙ、　Ｓ、Ｄ、（１９９０）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９９３２−９３５゜２０、Ｎａｒａ、　Ｐ、Ｌ、、　Ｈａｔｃｈ、　Ｗ、Ｃ，、ｔ）ｕｎｌｏｐ、　Ｎ、Ｍ、、　Ｒｏｂｅｙ。

Ｗ、Ｇ、、　Ａｒｔｈｕｒ、　Ｌ、Ｏ，、Ｇｏｎｄａ、　Ｍ、Ａ、　＆　Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、　Ｐ、Ｊ、　（１９８７）ＡＩＤ！；　Ｒｅｓ、Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　３，２８３−３０２゜２１、　Ｆｕｌｔｚ、　Ｐ、Ｎ、、　ＭｃＣｌｕｒｅ、　Ｈ，Ｍ、、　Ｓｗｅｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｂ、。

ＭｃＧｒａｔｈ、　Ｃ，Ｒ，、Ｂｒｏｄｉｅ、　Ａ、　ＨＧｅｔｃｈｅＬｌ、　Ｊ、Ｐ−／　Ｊｅｎｓｅｎ、　Ｆ、Ｃ６ｒＡｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、Ｂｒｏｄｅｒｓｏｎ、　Ｊ、Ｒｔ　＆　Ｆｒａｎｃｉｓ、　ｏ、ｐ、（１９８６）Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５８，１１６−１２４゜２２、　Ｌａｕｒｅ、　Ｆ、、　Ｒｏｕｚｉｏｕｘ、　Ｃ，、Ｖｅｂｅｒ、　Ｆ、、　Ｊａｅｏｍｅｔ、Ｃ，。

Ｃｏｕｒｇｎａｕｄ、　Ｖ、、　Ｂｌａｎｃｈｅ、　Ｓ、、　Ｂｕｒｇａｒｄ、　Ｍ、、　Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ、　Ｃ。

＆　Ｂｒｅｃｈｏｔ、　Ｃ，（１９８８）　Ｌａｎｃｅｔ　２．５３８−５４１゜２３、　Ｍｕｌｌ土ｓ、に、Ｂ、＆　Ｆａｌｏｏｎａ、Ｆ、Ａ、（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、１５５．３３５−３５０゜２４、　Ｋｗｏｋ、　Ｓ、　＆　Ｋｅｌｌｏｇｇ、　Ｄ、Ｅ、（１９９０）　ｉｎ　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　ｅｄｓ、ｒｎｎｉｓ、Ｍ、Ａ、。

ＧｅＬｆａｎｄ、　Ｄ、Ｈ，、５ｎｉｎｓｋｙ、　Ｊ、Ｊ、　＆　Ｗｈｉｔｅ　Ｔ＋Ｊ、（λｃａｄｅｒａｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）　ｐｐ、３３７−３４７゜２５、　Ｚａｇｕｒｙ、　Ｄ、、　Ｂｅｒｎａｒｄ、　Ｊ、、　Ｃｈｅｙｎｉｅｒ、　Ｒ，。

Ｄｅｓｐｏｒｔｅｓ、　工、、　Ｌａｏｎａｒｄ、　Ｒ，、Ｆｏｕｃｈａｒｄ、　Ｍ、、　Ｒｅｖｅｉｌ、　Ｂ、、Ｉセｔｅｌｅ。

Ｆ、Ｄ、、　Ｌ＊ｒｈａｍａ、Ｚ、、　Ｍｂａｙｏ、　Ｋ、、　Ｗａｎｅ、　Ｊ、、　５ａｌａｕｎ、　Ｊ、Ｊ、。

Ｇｏｕｓｓａｒｄ、　Ｂ、、　Ｄｅｃｈａｚａｌ、　Ｌ、、　Ｂｕｒｎｙ、　Ａ、、　Ｎａｒａ、　Ｐ、　＆　Ｇａ１ｌｏ、　Ｒ，Ｃ。

（１９８Ｂ）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２２．　７２Ｂ−７３１゜２６、　Ｎａｒａ、Ｐ、Ｌ、、（１９１１１９）　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　＋９夕、ｅｄｓ、Ｌｅｒｎｅｒ。

Ｒ０入、、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、Ｈ，、Ｃｈａｎｏｃｋ、Ｒ，Ｍ、＆　Ｂｒｏｗｎ、Ｆ、（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ’Ｙ）　ｐｐ、１３７−１４４゜２７、Ｍｙｅｒｓ、　Ｇ、　（１９９０）　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ＩＵＤｓ。

ｅｄｓ、　Ｍｙｅｘｓ、　Ｇ、、　Ｊｏｓｅｐｈｓ、　Ｓ、Ｆ、、　Ｗｏｎｇ− ５ｔａａｌ、　Ｆ、、　Ｒａｂｓｏｎ、　Ａ、Ｂ、。

Ｓｍ１ｔｈ、　Ｔ、？、　＆　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、　Ｊ、Ａ、　（Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａ−ｔＯｒ７．　Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ、　ＮＭ）　。

２Ｂ、５ｃｈａｒｆ、　Ｓ、Ｊ、、　Ｈｏｒｎ、　Ｇ、？、　＆　Ｅｒ１ｉｃｈ、　Ｈ，Ａ、　（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３，１０７６−１０７８゜２９、Ｗａｌｋｅｒ、　Ｃ，Ｍ、、　Ｍｏｏｄｙ、　ＤＪ、、　５ｔｉｔｅｓ、　Ｄ、Ｐ、　＆　Ｌｅｖｙ。

Ｊ、Ａ、（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４．　１５６３−１５６５゜３０、Ｔｓｕｂｏｔａ、　Ｈ，、Ｌｏｒｄ、　Ｃ，Ｘ、、　Ｗａｔｋｉｎｓ、　Ｄ、１．。

Ｍｏｒｉｍｏｔｏ、　Ｃ＋＆　Ｌａｔｖｉｎ、　Ｎ、Ｌ＋（１９Ｂ９）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、　１６９．１４２１−１４３４゜３１、　Ｒａｎｋｉ、入、、Ｖａｌｌｅ、Ｓ、Ｌ、、Ｋｒｏｈｎ、Ｍ、、ＡｒＩｔｏｎｅｎ、Ｊ、。

３２、　Ｊｅｈｕｄａ−Ｃｏｈｅｎ、　Ｔ、、　５ｌａｄｅ、　Ｂ、Ａ、、　Ｐｏｗｅｌｌ、　Ｊ、Ｄ、。

Ｖｉｌｌｉｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｄｅ、　Ｂ、、　ＦｏｌｋＩＮ、　Ｔ、Ｍ、、　ＭｃＣｌｕｒｅ、　Ｈ，Ｍ、、　５ｅｌｌ、　Ｋ、ｗ。

＆　Ａｈｍｅｄ−Ａｎｌｌａｒｉ、　Ａ、　（１９９０）　Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ、　ＡＣａｄ、　Ｓｃｆ、　Ｕ、！；、Ａ、　８７゜３り７２−３９７６゜３３、　Ｂａｈｒａｏｕｉ、　Ｅ、、　Ｙａｇｅｌｌｏ、　Ｍ、、　Ｂ１１１ａｕｄ、　、７．Ｎ、。

５ａｂａｔｉｅｒ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｇｕｙ、　Ｂ、、　Ｍｕｃｈｍｏｒｅ、　Ｅ、、　Ｇｉｒａｒｄ、　Ｍ、　＆　Ｇｌｕｃｋｍａｎ。

Ｊ、Ｃ，（１９９０）　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、　Ｈｕｍａｎ　Ｒａｔｒｏｖｉｒｕｇｅｓ　６．１０８７−１０８８゜３４、　Ｖａｎ　Ｅｅｎｄｅｎｂｕｒｇ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｙａｇｅｌｌｏ、　Ｍ、、　Ｇｉｒａｒｄ、　Ｍ、。

Ｋｉｅｎｙ、Ｍ、Ｐ、、Ｌａｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、、Ｍｕｃｈｍｏｒｓ、、Ｅ、、Ｆｕｌｔｚ、Ｐ、Ｎ、。

Ｒｉｖｉｅｒｅ、　Ｙ、、　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、　Ｌ、　＆　Ｇｌｕｃ］ｏｎａｎ、　Ｊ、Ｃ，（１９Ｂ９）　ＡＩＤ！；　Ｒｅｓ。

Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　５，４１−５０゜Ｌ　［Ｉ　ＭＩＶ追ｖ・ａＭｔＪＡ文Ａｔ＋＊Ｆｓ’Ｔｈ　＋　週　ＩＦ’ＩＧＬＩＲＥ　ｌ中希。坑イ不しベ゛ル　（ｇ、体４６　：　９５１　）千ノ、ぐ／−どヰ釣のｊＬｉ、？シるｌ−１７ＬＶ−Ｊの甲呼。

子パン・ブー１５１め如−清１；よる１−ＩＴＬＶ−３の中和＋／、ぐン・ノー５３１り九漬ζ−よる？ＩＴＬＶ−３のｆ知ｆ甲　缶−４４！　タ（月　コントローｌし）○ Ｆｉｇ、　６ＡＦｉｇ、５ＢＥＩＡ　１プＴニイ本イｄ！ＪＦｉｇ、　６ＣＦｉｇ、７峙Ｆ５　（遁）Ｆｉｇ、ｓ（ＩＩＩＱＦ’ｉｇ、９ち　１６０εＬＸＳＡ（Ｑα 時閉＋０１／／３４５６７ＦＩＣｒＪｕ　１０Ｖ３　ＢＲＶ　ＡＣＩ乳体４面　ＱａＦｌＣルヱ　１１本発明は、初回免疫抗原の同時又は連続使用を含むワクチン接種方法に係る。この場合、初回免疫抗原は、糖タンパク質、例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、または、天然宿主にＡＩＤＳを誘発することのできるレンチウィルスから得たもの、または、＋ｎｊｙ−＋、　）ＩＴＬＹ−１１タイプのレトロライスルから得たもの、及び、合成オリゴペプチドから成る増幅組成物であって、そのオリゴペプチドは、遊離しているかまたは担体分子に結合しており、がっ、オリゴペプチドが、当該糖タンパク質の中和エピトープに相当するものである。

国際調査報告１Ｍｅｎｎ＋ｍＭｌ＾９゜工、ｌゆ、ｓｏ　ＰＣＴ／ＥＰ　９１１００５０９１ｍｅ＋酊ｂ６＋ＩＩＩＡｏ１１６＋＋ｉ＋＋ＩＩｌｌＮ１１ｐ／ｆｐＱ＋ノｎ凸ｃｎ口国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．所定のウィルスのエンベロープ糖タンパク質またはフラグメントの免疫原性を強化するための組成物であって、該組成物が、同時に、別々に、または順次に使用するための併合製剤として、（Ａ）ウィルスの少なくとも１種のエンベロープ糖タンパク質、または、該糖タンパク質の少なくとも５０アミノ酸のフラグメントと、（Ｂ）該エンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列から誘導される少なぐとも１種のペプチドと、を含み、該ペプチドが、少なくとも１種のウィルス中和エピトープを含み、かつ、該エンベロープ糖タンパク質と該ペプチドが、宿主において中和抗体を誘発するのに十分な量を投与されることを特徴とする組成物。
２．所定のウィルスのエンベロープ糖タンパク質の免疫原性を強化するための組成物であって、該組成物が、同時に、別々に、または順次に使用するための併合製剤として、（Ａ）エンベロープ糖タンパク質を投与する宿主において初回抗原刺激して中和抗体の誘発を引き起こすのに十分な量で免疫原性を持つ、該ウィルスの少なくとも１種のエンベロープ糖タンパク質またはその糖タンパク質のフラグメントと、（Ｂ）該エンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列から誘導される少なくとも１種のペプチドと、を含み、該ペプチドが、該糖タンパク質の少なくとも１種のウイルス中和エピトープを含み、かつ、該組成物が、宿主において持続的な中和抗体の誘発を強化するのに十分な量で該ペプチドを含むことを特徴とする組成物。
３．該ウィルスが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＦＩＶ、ＦｅＬＶから成る群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
４．該エンベロープ糖タンパク質またはフラグメントが、ＨＩＶのｇｐ１６０、または、ＨＩＶのｇｐ１２０、または、これらの糖タンパク質のフラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
５．前記少なくとも１種のペプチドが、ＨＩＶ糖タンパク質のペプチドの混合物から成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
６．前記少なくとも１種のペプチドが、例えば脂肪族配列のような担体分子に結合されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
７．前記少なくとも１種のエンベロープ糖タンパク質が、ＨＩＶ−１糖タンパク質とＨＩＶ−２糖タンパク質の混合物から成り、および、前記少なくとも１種のペプチドが、ＨＩＶ−２中和エピトープを持つ少なくとも１種のペプチドを含む混合物から成る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
８．前記少なくとも１種の糖タンパク質が、様々なＨＩＶ分離株（血清型）由来のｇｐ１６０糖タンパク質の混合物であり、および、前記少なくとも１種のペプチドが、対応する中和エピトープの混合物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
９．前記少なくとも１種のエンベロープ糖タンパク質が、様々なＨＩＶ分離株（血清型）由来のｇｐ１２０糖タンパク質の混合物であり、および、前記少なくとも１種のペプチドが、対応する中和エピトープの混合物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
１０．該ペプチドが、ｅｎｖ、ｇａｇ、および特に、ｐ１８ｇａｇ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｐｏｌまたはＧＰＧもしくはＧＬＧ抗原、および、これらの抗原の混合物特にｐ２７ｎｅｆとｐ２３ｖｉｆの混合物、から成る、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
１１．所定のウィルスの該エンベロープ糖タンパク質を、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆまたはｖｉｆの中から選択される少なくとも１種の抗原、特にｐ２７ｎｅｆとｐ３２ｖｉｆの混合物、と組み合わせてなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
１２．該ペプチドが、下記の配列から成る群から選択される少なくとも１種のペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。【配列があります】
１３．該ペプチドが、下記のアミノ酸配列【配列があります】を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
１４．前記少なくとも１種のペプチドが、少なくとも１種のＨＩＶ−１分離株のメジャーな中和エピトープ（ループＶ３）から成る、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
１５．該組成物が、該エンベロープ糖タンパク質を初回抗原刺激しおよび／またはその糖タンパク質の免疫原性を強化するのに十分な量のアジュバントを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
１６．該アジュバントが、ムラミルジペプチドかまたはＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバントである、請求項１５に組成物。
１７．該組成物を、経口的に、非経口的にまたは皮内に投与することを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
１８．該エンベロープ糖タンパク質またはそのフラグメントと、その糖タンパク質またはフラグメントから誘導されるペプチドとを、同時に、別々に、または間隔を置いて宿主に適用するために、一緒に存在させてなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
１９．該エンベロープ糖タンパク質を、経口または非経口投与のための医薬用ベヒクルと組み合わせてなる、請求項１８に記載の組成物。
２０．該ペプチドを、経口投与のための医薬用ベヒクルと組み合わせてなる、請求項１８または１９に記載の組成物。
２１．該ウィルスの前記少なくとも１種のエンベロープ糖タンパク質、および／または、そのエンベロープ糖タンパク質から誘導される前記少なくとも１種のペプチドが、−ＩＳＣＯＭまたはリポソームのような粒子の形態を取るか、あるいは、 −生存組み換え微生物によって提示される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
２２．該微生物が、ウィルスまたは細菌、例えばポックスウィルスまたはＢＣＧ、のような生存組換え微生物であるか、あるいは、該エンベロープ糖タンパク質または、そのエンベロープ糖タンパク質由来のペプチドを発現するように改変された全ての生ワクチンである、請求項２１に記載の組成物。
２３．該微生物が、不活性化粒子例えばＨＩＶウィルスのようなウィルス粒子、または、ウィルスゲノムをもたない粒子特にＨＩＶゲノムをもたない粒子、から誘導されたものである請求項２２に記載の組成物。
２４．ウィルスの少なくとも１種のエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列から誘導される少なくとも１種のペプチドの使用であって、該ペプチドが少なくとも１種のウィルス中和エピトープを含むものであり、および、ウィルスのエンベロープ糖タンパク質を、中和抗体を誘発するために宿主に投与した時に、その糖タンパク質の免疫原性を強化することを目的とした使用。
２５．ワクチンの製造のための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
２６．免疫療法薬の製造のための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
２７．請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を認識することを特徴とする、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体。