JPH04506448A - Ｆ８活性を有する蛋白質および／またはｆ８誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｆ■活性を有する蛋白質および／ 矛にはＦＶ［Ｉｌ誘導体の製造法 本発明は、哺乳類細胞をインビトロで培養することによるＦ■活性を有する蛋白 質および／又はＦＶＩ［ｌ誘導体を生産する方法に関する。

出血疾患血友病Ａは、第■因子（Ｆ■）の欠乏によって引きおこされる。Ｆ■は 、血漿から単離できる糖タンパク質である（米国特許４．６５０．８５８）。精 製したＦ■は、血友病Ａの治療に用いられる。遺伝子工学手法を用いることによ り、Ｆ■を合成することが可能である（ＥＰＯ１６０，４５７、Ｗｏ　８５１０ １９６１、ＵＳ　５７０，０６２）。哺乳類細胞中で産生され得るＦ■の量は、 他のヒト蛋白質に比較して相当に低い。蛋白質の量は、もしもＦ■の端を切り取 った変異体が生合成されるか（Ｗｏ　８６１０６１０１、ＤＫ　３４４２／８７ ）　、又はもしもサブユニット（Ｆ■重鎖およびＦ■軽鎖）が−緒に生産される と増大する（ＵＳ　８２２，９８９）。また、別個に生産されたサブユニットか ら活性Ｆ■をインビトロで組立てることも可能である（ＤＫ　２９５７／８６） 。上述の形態のＦ■は、全てヒトＦ■の特徴：生合成における活性、トロンビン により活性化可能および血友病の犬における生物学的活性を有する。

哺乳類は、一部は体温を３７°Ｃ近くに一定に保つ能力によって特徴づけられて いる。Ｆ■は体内を該温度で循環してお清のない培地中で生産されるＦ■は相当 に不安定であるが、しかしそれにもか−わらず培地がら血清を放出させることは 魅力的であり、更にＷＯ３７１０４１８７はＦ■が担体タンパク質フオンウレプ ラント因子（ＦＷＦ）の添加により血清のない培地中で安定化され得ることを開 示する。ＤＫ　３５９４／８７はＦ■がまたリポタンパク質の添加により血清の ない培地中で安定化され得ることを示している。これらの安定化剤は、血清含有 培地中で著るしい効果は示さない。

驚くべきことに、３７°Ｃの未満、より正確に３３°Ｃの未満の温度で哺乳動物 の細胞を培養することにより、端を切り取ったＦ■変異体の収率およびＦ■由来 サブユニット（特にＦ■重１ｉｔ）の収率は、血清含有および血清なしの媒地の 双方において劇的に増加する。

１０°Ｃ〜３２°Ｃの温度、より好ましくは２５”Ｃ〜３０°Ｃ１最も好ましく は２７°Ｃの温度で培養することが好ましい。

更に、驚くべきことに以下の内容が見出された。すなわち、収率が培地帯留時間 を通常の２４〜７２時間（この時間は通常哺乳動物の細胞からの最適収率を与え る）未満に短がくすることにより上昇する。低い増殖温度と短い培地帯留時間の 組合せ効果は、Ｆ■重鎖の場合に特に著るしく、この場合収率は２５倍に上昇す る。

低温度および短い培地帯留時間でのＦ■重鎖（ＨＣ）の収率増加は、通常の培殖 条件で生成物の不安定性に関係し得る。

第１表はＦ■重鎖が３７°ＣでＦ■軽鎖に結合する能力を失うことを示している 。第１図はＦ■重鎖が３７°Ｃで凝集体を形成することを示している。これろの 凝正集体は、還元の際、分解し得る。端を切り取ったＦ■の変異体は、Ｆ■−Ｈ Ｃと同様に挙動し更に高温度で凝集体を形成する。しかし、低温での収率増加は 、また凝正集体における減少よりも他の因子によりもたらされ得る。例えば、蛋 白分解に対するより大きな抵抗性はより重要であろう。

好ましい宿主細胞には哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯ５−７猿細胞、メラ ノーマ細胞系統、例えばボウニス（Ｂｏｗｅｓ）細胞、マウスＬ−９２９細胞３ Ｔ３系統、Ｂａ１ｂ−ｃ又はＮＩＨマウス、Ｂ）ｌＫ又はＨＡＫハムスター細胞 系統等が含まれる。

実施例は以下の内容を示している。すなわち、端を切り取ったＦ■変異体、Ｆ■ 重鎖、Ｆ■軽鎖および２種のサブユニットの各々をコードするプラスミドで同時 移入された細胞から得られたＦ■の収率は低温度で増加する。

第１表 ｍＭのＴｒｉｓ、　０．１　ＭのＮａｃｌ、　０．０２％のＮａＮ３．１５０　 ｕＭの２−ＭＥＣｐＨ７，４）中で４倍に希釈し次いで２２°Ｃおよび３７°Ｃ でインキュベートした。０，４．２４時間に試料を一８０″Ｃで凍結した。試料 を投入し次いで西欧プロット中（未沸とう）減少および未減少を分析した。更に 、試料を３００倍に希釈し次いでＦ■−ＬＣとの組合せに対して試験した（Ｗｏ 　８８１００２１０）。

本発明を図面を参照しつつ更に説明する。第１図は２２°Ｃおよび３７°Ｃでイ ンキュベートされるＦ■−ＨＣの西欧プロットを示す（試料は第１表に記載のも のと同じ）。

プ立スま上辺ｆｌ プラスミド　」 ｐＰＲ４９■変異体をコードするｃＤＮＡ　（ここにおいて、８８０個のアミノ 酸がａ　−９５域において欠損している）（変異体はＰＣＴ特許出願、公開番号 間８６１０６１０１中、ｐＬＡ−２プラスミドによりコードされるものと同一で ある）が、発現ベクターｐＳＶ７ｄに挿入されている（トルエツト等、１９８５ 年、ＤＮＡ土；３３３〜ｐＰＲ６０■因子変異体をコードするｃＤＮＡ　（ここ において、Ａｒｇ−７４０は５ｅｔ−１６９０に直接融合している）がｐＳＶ７ ｄに挿入されている。

ｐＳＶＦ８−９２Ｅ　９２　ＫＤペプチド（重鎮）由来の■因子がｐＳＶ７ｄに 挿入されている。

ｐＳＶＦ−８−８０Ｋ　８０ＫＤヘブチド（軽鎖）由来の■因子がｐＳＶ７ｄに 挿入されている。

例１ ■　のゞ　による　白　の　に・　る　：庁の六発現プラスミドｐＰＲ４９およ びｐＰＲ６０を、リン酸カルシウム法（グラ−ハムおよびファンデルニブ、１９ ７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２　；　４５６〜４６７）を用い、ＤＮＡクローニ ング、プラクティカルアプローチ、Ｖｏｌ、　Ｉ　＋　Ｕ　／ｆＲＬプレスに記 載された変法を用いＣＯ５−７猿の細胞に移入した。（各プラスミドは合計で８ 個の５ｃｍの皿に移入した８３７°Ｃおよび２７°Ｃの各々での発現に対して２ 回測定される２個の皿であって、血清含有培地（１０％）を有する；更に血清な しの培地を有する同数の皿）。移入後１６時間めに、培地を交換した；半分の皿 を血清なし培地に移した。移入後４０時間めに、培地を交換し次いで半分の皿を ２７°Ｃのインキュベーターに移した。更に２４時間後、培地を採取し次いで■ 因子の活性をＫａｂｉコーチスト発色分析法を用いて測定した。結果を第２表に 示す。

第２表 例２ ＣＨＯｌ　か■　言゛の　゛に　る　Ｆ５庁および　１　日の　ムせｔ ＣＨＯ（中国産ハムスターの卵巣）細胞系統ＤＵＫＸ−Ｂｌｌ　（ウルラウベお よびカゼン、１９８０年、ｐＮＡＳ　７７　；　４２１６〜４２２０）　（これ は、ジヒドロフオレートレダクターゼ遺伝子内で突然変異されている）をプラス ミドｐＳＶＦ８−９２ＥおよびｐＳＶＦ−８０におよびジヒドロフオレートレダ クターゼをコードするプラスミドと共に同時移入した。（これらの同時移入は米 国特許出願８２．９８９に記載されている）。

この方法で、クローン（１０Ｃ２Ｄ２）を単離し、３７°Ｃで増殖した場合、軽 鎖（ＬＣ）よりも重鎮（ＨＣ）を１０倍生産することを特徴とする。

１０Ｃ２Ｄ２を２７℃で増殖すると、ＨＣの収率はＬＣの収率に関して見られる ように劇的に上昇する（第３表）。

第３表 ＊　ＨＣ：ＡｇおよびＬＣ：５ｇは特定のイムノアッセイで測定した（ノードフ ァンク等、１９８８．　Ｏｒ、　Ｊ、　Ｈａｅ＊ａｔｏ１．６８　；　３０７〜 ３１２；　ノードファンク等、１９８５．　Ｔｈｒｏ＋ｓｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ ａｓ、５３　；３４６〜３５０）。

培地帯留時間をわずか２時間に短縮することにより、１日当たりのＩＣの収率増 が達成される（表４）：第４表 例３ １０Ｃ２Ｄ２を　いる２８〜３０°Ｃでのオプティセルバイオリアクー　でのＦ ■：ＨＣの オブティセルハイオリアクター内の細胞をセラミックスマトリックス、オプティ コア上で培養し、次いで培養培地をオブティコア内を循環させる。酸素濃度、ｐ Ｈ１培地供給および回収は全てシステムにより測定され更に制御される。

平均培地循環時間は５時間であった（７５抛Ｉの容器およびオブティコア内で１ 時間当たり１５０鼎１の容量）。培養液を５°Ｃで集め次いで一８０°Ｃで２４ 時間毎に凍結させた。

融合近（まで（酸素消費速度により測定）細胞を培養し次いでＦ■：ＨＣの調製 に対し温度を２８〜３０°Ｃに下げた。

細胞を調製温度で１０００時間保持した。酸素消費速度は、温度が３７°Ｃから ３０゛Ｃにおよび３０°Ｃから２８°Ｃに低下すると２．３時間内に減少した。

しかし各々の時間に酸素消費速度は再たび徐々に増加した。かくして、細胞は１ ０００時間よりもより長い期間に対してさえもより低温で保持できる。

第５表に、培地組成および供給／回収量並びにいくつかの回収試料に対するＦ■ ：ＨＣレベルを示す。

第５表 ＝−晶→−４−− 例４ 苅１ ■因子軽鎖をコードするｐＰＲ７７と指定される発現プラスミドを例１に記載し たと同様にＣＯ５−７細胞に移入した。プラスミドを４個の５ｃｍ皿に移入した ＝２個の皿について各々３７°Ｃおよび２７°Ｃでの発現に対し２回測定した。

培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ５）を移入後１６時間および４０時間めに交換した （４０時間で半分の皿を２７°Ｃのインキュベーターに移した）。

更に２４時間後、培地を集めた。第■因子軽鎖の含量を例２に記載の如く測定し た。結果を第６表に示す。

第６表 例５ ■　の二　のサブユニット：ｔ”およびょ言′の　々　コードするプラスミドを 　されたＣＨＯからの　■パ　をる　白　−一　の　−に　る　°°　庁の３Ｄ ＨＰＲ（−）　ＣＨＯ細胞系統（Ｇ、ウルラウブ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ　７７　；　４２１６〜４２２０．１９８０）に第■因子の軽鎖およびｄ ｈｆｒ遺伝子をコードするプラスミドを先ず移入した。ＤＨＰＲ（＋）細胞を選 択することにより、安定な軽鎖生産体を単離した。この新しい細胞系統に、第■ 因子の重鎮（およびｄｈｆｒ遺伝子）をコードするプラスミドおよびネオ遺伝子 をコードするプラスミド（ｐＳＶ２ｎｅｏ　；　Ｐ、　Ｊ、サザンおよびＰ、ベ ルク、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ土；　３２７〜３４１．１９８２）を同時移入した。移入体を１ ａ＋１当たり７００μｇのゲネチシン（Ｇ４１８５ｕｌｐｈａｔｅ、　Ｇｉｂｃ ｏ）を含有する培地中で単離した。第一のプールからの細胞を、Ｏ，ＩｕＭのＭ ＴＸを含有する培地内に直接増殖させた。２つのＴ−８０フラスコ（フラスコＡ およびフラスコＢ）内でこのようにして単離した細胞に播種した。

融合の際、培地（ＤＭＥＫ＋　１０％叶ＣＳ＋７００μｇゲネチシン／ａｌ十〇 、　１　ｕＭ　ＭＴＸ）を交換しく１０ｍ１）次いでフラスコを３７℃で２４時 間インキュベートし、しかる後培地試料を集めた。

培地を新たにし次いでフラスコＢを２７°Ｃのインキュベーターに移した。再た び、フラスコを２４時間インキュベートし、引き続き培地試料を集め更に培地を 新たにした。この手順を更に２日間くりかえした（フラスコＡは末だ３７°Ｃで あり、フラスコＢも未だ２７°Ｃであった）。第■因子の活性をカビ（ｋａｂｉ ）コーチスト発色分析法により測定した。結果を第７表に示す。

ＦＩＧ、　１ 国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類細胞をインビトロ培養によりＦＶＩＩＩ活性を有する蛋白質および／ 又はＦＶＩＩＩ誘導体の生産方法であって、該培養を３３℃未満で行うことを含 んでなる、前記方法。
2. ２．前記温度が１０〜３２℃である、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記温度が２５〜３０℃である、請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．前記温度が２７℃である、請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．生産されるＦＶＩＩＩ誘導体が９２．５ＫＤフラグメント又は重鎖である、 請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
6. ６．生産されるＦＶＩＩＩ誘導体が８０κＤフラグメント又は軽鎖である、請求 の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
7. ７．生成物が、ＦＶＩＩＩの２つのサブユニット：重鎖および軽鎖の各々をコー ドするプラスミドで移入された細胞から得られるＦＶＩＩＩ活性を有する蛋白質 −複合体である、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
8. ８．用いた哺乳類細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞又はＢＨｋ細胞である、請求 の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。