JPH04506452A - 動物処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物処理方法 発明の分野 本発明はトリインターロイキン−２（ａｖｉａｎ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ）をワクチンと併用投与してまたは併用投与しないで体重を増加するような生物 学的効果を達成させる動物、特に鳥類の処理に関トリインターロイキン−２（Ｉ Ｌ二２）はシャウエンステイン氏ほかＤｅｖ、ａｎｄ　Ｃｏｍｐ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、　６．５３３（１９８２）によって最初に確認され、彼らはマイトジェンで 刺激されたひな鳥の牌臓細胞の上澄み液におけるＴ−細胞成長因子の存在を示し ている（また、シャト氏ほかＡｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　１５．５３９ （１９８６）；シャウエンステイン氏ほかＬｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｆｕｎ ｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｇｉｎｇ　１４１〜１４７　（Ａ、デウェケ氏編集、１ ９８４）　；フォクス氏ほか「第１５回南東部免疫学コンフエレンスにおいて提 出された報告書のアブストラクトＪ　ＳｔｏｎｅＭｏｕｎｔａｉｎ　Ｉｎｎ、　 ＧＡ、１９８２年１０月２０〜２２日参照）。

その後、トリＩＬ−２は種々の純度に分離されている（シュネッエラエート氏編 集、１９８７）；または欧州特許出願明細書第８８３０４７２９．２参照）。主 としてトリ［Ｌ−２についての研究では、リンフ才力インが２つの形態、すなわ ち、１３．０００〜１４，０００キロダルトン種（以後、ｒ１４ＫＭ１４Ｋ２（ １４Ｋ　ｃｂｊｃｈｅｎ　ＩＬ−２）Ｊと称する）および２６．０００〜３０． ０００キロダルトン種（以後、ｒ３０Ｋ　）す［Ｌ−２Ｊと称する）で存在する ことを証明している。

無視できない研究では細胞培養において）　Ｕ　［Ｌ−２のＴ−細胞成長活性に ついて特徴づけられており、′また非トリ種（ｎｏｎ−ａｖ　１ａｎｓｐｅｃｉ ｅｓ）において、ト１月Ｌ−２を動物に投与した場合に興味ある生物学的特性を 有することが暗示されている（例えばギリス氏Ｊ、Ｃｌ１ｎ、ｔｍｍｕｎｏ１． ３．１〜１３（１９８３）；これにはインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）においてトリ【 Ｌ−２の実用使用について幾分示されている）しかしなから、有用な生物学的効 果がＩＬ−２を鳥類に投与して達成されることが知られるように、ＩＬ−２は極 めて有用である。

本発明は、インビボにおけるトリ！Ｌ−２の生物学的活性についての本発明者ら の研究により達成されたものである。この研究において見出された特に重要なこ とは、ト１月Ｌ−２をインオボ（ｉｎ　ｏｖｏ）において鳥類に投与した場合に 、体重の増加を測定して、ふ化後、処理された鳥の成長が高められることである 。

発明の概要 鳥類を処理する方法について記載する。方法はインオボにおいて鳥に生物学的活 性量のトリインターロイキン−２（ＩＬ−２）を投与することを含んでいる。

本発明の他の観点は鳥の成長を高める方法にある。この方法は、ト１月Ｌ−２を インオボにおける鳥に、ふ化後、鳥の成長を高めるのに有効な量で投与すること を含んでいる。

本発明の他の観点はトリ【し−２とワクチンとをインオポにおける鳥に併用投与 することを含んでいる。ワクチンは鳥に能動免疫を生ずる有効な量で投与し、　 ｒＬ−２は（ａ）ふ化後、鳥の成長を高めるのに、（ｂ）ワクチンにより生ずる 免疫度を高めるのに、または（Ｃ）ふ化後、鳥の成長を高め、かつワクチンによ り生ずる免疫度を高めるのに有効な量で投与する。

本発明の他の観点は、鳥の卵にト１月Ｌ−２を自動注入するのに用いる非注入装 置を提供することである。装置は注入器およびこの注入器に操作的に関連する卵 保持器を含んでいる。卵保持器および卵注入器は、それぞれ共通の支持フレーム に連結する。

注入器にはトリＩＬ−２を含有する注入液を含有させる。注入器は卵保持器によ り支持された卵に注入液を注入するために配置する。注入器は生物活性量のトリ ＩＬ−２を卵に注入・するように構成する。好ましくは、また装置は注入前に卵 の殻に穴をあけ、この穴を通じて注入器を挿入するために注入器と操作的に関連 する穴あけ器を含んでいる。必要に応じて、ワクチンを注入液に含めることかで きる。

本発明の他の観点は生物活性量の外因性トＩＪ　ＩＬ＝２で含む鳥の受精卵を提 供することである。また、卵には随意にワクチンを含有することかできる。

本発明においては、免疫因子が成長に影響することを任意の動物について確かめ た。それ故、本発明は動物にインターロイキン−２（ＩＬ−２）を動物の体重を 高めるのに効果的な量で投与することを含む動物の体重を増す方法を提供する。

好ましくは、体重を高めるのに処理する動物は未成熟動物（すなわち、成長しき っていない動物）である。

発明の詳細な説明 ここに用いる「動物」とは加えるに哺乳動物および鳥類を包含することを意味す る。哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、テナガイ タチ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む霊長類を包含する。「鳥」とは 雄または雌の任意の種を包含することを意味するが、しかし主として卵または食 肉を得る飼鳥類を意味する。従って、「鳥」とは、特にひな鳥（ｃｈｉｃｋｅｎ ｓ）、七面鳥、カモ、ガン、ウズラおよびキジのめんどり、おんどりおよび雄カ モを包含することを意味する。

ここに用いる「インターロイキン−２」（またはｒ［Ｌ−２」）とはウシ属の動 物、ヒツジ、ネズミ、ヒト、または鳥類の源泉（ａｖｉａｎ　ｏｒｉｇｉｎ）Ｔ あろうと、いかなるインターロイキン−２を意味する。多くの種類のＪＬ−２お よびその製造方法は知られている（米国特許第４．４０４．２８０号明細書（ギ リス氏）；米国特許第４゜４１１．９９２号明細書（ギリス氏）；米国特許第４ ．４０１．７５６号明細書（ギリス氏）：米国特許第４．４４８．８７９号明細 書（ファ不１！シウスおよびスフヒル氏）；米国特許第４．４６４．３５５号明 細書、（ファプリシラスおよびスフヒル氏）；米国特許第４．４７３．６４２号 明細書（シリス氏）参照（これらのすへての明細書を引例としてここに記載する 。））。好ましくは、本発明を実施する場合、投与するＩＬ−２は投与する種の 源泉に関する。それ故、哺乳動物ＩＬ−２を哺乳動物に投与するのが好ましく、 また鳥類ＩＬ−２を鳥に投与するのが好ましい。哺乳動物中、ある種からの［Ｌ −２は他のある種において活性であるが、しかし他の種においては活性でないこ とが知られている。当業技術者はＩＬ−２の知られている交差反応性（ｃｒｏｓ ｓ−ｒｅａｃｔ　１ｖｉｔ　１ｅｓ）および当業技術者において知られているシ ンプル　スクリーニング　テスト（ｓｉｍｐｌｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｅｓｔ ｓ）に基づいて試験する動物についての適当なルー２組成を選択するようにする 。

ここに用いる「インオボ（ｉｎ　ｏｖｏ）Ｊ　とはふ化前に卵を体内に含んでい る鳥のことを意味する。それ故、本発明は卵を処理する方法および鳥を処理する 方法を包含するものである。本発明はひな鳥、七面鳥、カモ、ガン、ウズラおよ びキジの卵を包含するとのようなタイプの鳥の卵についても実施することかでき る。ひな鳥および七面鳥の卵が好ましく、特にひな鳥の卵が好ましい。本発明の 方法によって処理された卵はふ化の４分の１期間において好ましい受精卵である 。ひな鳥の卵は約１５〜１９日にわたるふ化によって処理し、特に約１８日にわ たるふ化によって処理するのが好ましい（１８日の胎芽の発達）。七面鳥の卵は 約２１〜２６日にわたるふ化によって処理するのが好ましく、特に約２６日間の ふ化によって処理するのが好ましい。

ここに用いる「鳥類ルー２ノとは任意の鳥類種によって生成したＩＬ−２に相当 するＩＬ−２を意味する。「鳥類」とはひな鳥、七面鳥、カモ、ガン、ウズラお よびキジを包含するが、しかしこれらに制限されないすべての鳥類種を包含する ことを意味する。

鳥類【Ｌ−２の種々の種は知られている（例えばシュネッッラー氏鳥類供与体か ら（鳥類供与体の牌臓からもっとも都合よく）収集し、リンパ球をコンカナバリ ンＡのようなＴ−細胞マイトジェン剤を含有する媒質（好ましくは血清を含まな い媒質）において成長させ、および必要に応じてＩＬ−２を媒質から回収するこ とによって得ることかできる。鳥類【Ｌ−２の純度は本発明を実施するのに臨界 的でなく、実質的に少なくとも血清を含まない、およびマイトジェンを含まない ようにするのか好ましい。粗ＩＬ−２の調製は多くの既知の分離手段により、当 業技術により知られているＩＬ−２検定手段によるＩＬ−２活性についてスクリ ーニングするこれらの分離手段からの種々のフラクションによって精製すること ができる。ＩＬ−２は任意の適当な薬学的に許容しうる担体に含有することかで きるか、しかし生理的塩類溶液のような水性担体に含有させることかできる。

種々の鳥類種のＩＬ−２の交差反応性は、【Ｌ−２応答細胞を用いる既知のバイ オアッセイ手段で測定することができ（例えばシュって簡単に選別することがで きる。一般に、任意の１つのケースにおいて処理する鳥類種に投与した（Ｌ−２ の源泉の種に近いほど、それ自体におけるＩＬ−２の生物活性が大きくなると予 想されている。卵当りに投与するＩＬ−２の量は処理する種、ルー２源泉の種、 鳥類種の生存期間、卵に注入する位置およびＩＬ−２の純度によって変えること ができる。

上述するように、ひな鳥ＩＬ−２は１４に種および３０に種として存在する（フ レデリクセンおよびサルマ氏、同上；シュネッツラするのに好ましい。ＨＰＬＣ により９７％純度に測定される１ミリグラムの鳥類［Ｌ−２は後述する実施例に 示す処理によって測定されているように、約１．０００〜約ｔｏ、　０００活性 単位の鳥類［Ｌ−２である。

本発明を実施する場合、鳥類ＩＬ−２は卵当り約０．００１〜約１０活性単位、 好ましく卵当り約０．００５〜約１活性単位の量で投与する。

例えば、本発明の方法による好適な結果は、３０にひな鳥ルー２を投与したひな 鳥において、少なくとも約り０％純度のＩＬ−２の場合、卵当り約１００ナノグ ラム〜約１．０ナノグラムの範囲の投与で約１８日のふ化により得られる。

本出願人が知っているかぎりでは、鳥類ＩＬ−２の類似物は、まだ合成されてい ない。しかしながら、鳥類ＩＬ−２の類似は、使用する場合に、非−鳥類種にお ける種々のＩＬ−２の交差反応性に基づいて、慣例のように本発明における活性 度についてスクリーニングすることができ、および本発明において自然に生ずる ＩＬ−２と実質的に同様に作用するものと思われる。

本発明は米国特許第４．４５８．６３０号明細書（サルマおよびプルメスター氏 ）および欧州特許出願第０２９１１７３号明細書（スミス氏ほか）に記載されて いる方法に関連して実施てきる（これらの明細書を引例として、ここに記載する ）。それ故、ワクチンはＩＬ−２と併用して投与することができる。ここに用い る［ワクチン」とは上述するサルマおよびプルメスター氏の米国特許明細書に記 載されている生ワチクン、およびスミス氏ほかの欧州特許出願明細書に記載され ている非複製（ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）ワクチンを包含することを意味 する。生ワクチンとしては、例えば七面鳥ヘルペス　ウィルス　ワクチン（ｆｆ ｆＴ）　、およびニューシャーシー州ワインランドのワインランド　ラボラドリ ースまたはアイオワ州チャールス市のサルスバリー　ラボラドリースから得られ た滑液包病ワクチン（Ｂｕｒｓａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖａｃｃｉｎｅ）、リケ ルト菌株（Ｌｕｋｅｒｔ　５ｔｒａｉｎ）　、生ワクチンを挙げることができる が、これらに制限されるものでない。また、非複製ワクチン（例えば非複製免疫 原としては、例えば不活性ウィルス、ペプチド、タンパク質（遺伝子光学技術に よって生じたようなタンパク質サブユニット免疫原を含む）、担体に結合したペ プチドおよび抗イデイオタイプ抗体を挙げることができるが、これらに制限され るものでなく、これらのすべてはそれ自体複製できない。非複製ワクチンの特別 の例については米国特許第４．６３９゜３７２号明細書（マレー氏はか）および 第４．７２４．１４５号明細書（マレー氏ほか）および欧州特許出願第０．２４ １．１３９号明細書に記載されている（これらの明細書を引例として、ここに記 載する）。もっとも一般的な鳥類の病気の場合、ふ死後投与に使用する生ワクチ ンまたは非複製ワクチンである既知のワクチンは必要とする投与量を調整しなが ら、ここに記載する方法によって用いることができる。

［Ｌ−２は動物に任意の適当な手段、例えば静脈注射、腹膜注射および皮下注射 によって投与することができる。

卵には］Ｌ−２を、化合物を殻を通して移動する任意の手段で投与することかで きる。しかしながら、投与する好ましい方法は注入による方法である。注入位置 は黄卵嚢において羊水および胎芽自体を含む羊膜により規定された区域、または 含気洞（ａｉｒｃｅｌｌ）のいずれかの内か好ましい。ふ化の４分ｌか始まるこ とによって、軸線に沿い卵の大きい端部の中心から注入する場合に、羊膜はほと んど浸透するように十分に拡大する。ワクチンは同じ手段により、ＩＬ−２と同 じ位置に投与することができる。

注入機構は臨界的でないか、しかし方法は胎芽の組織および器官またはそれを包 囲する胚体外膜を過度に損傷を与えないようにするのか好ましく、このために処 理はふ化速度を低下しない。約１８〜２２ゲージの針を取付けた皮下注射器かこ の目的のために適当である。含気洞に注入する場合、針は卵に約２ミリメートル まで挿入する必要がある。１インチの針は、卵の大きい端部の中心から十分に挿 入した場合に、殻、含気洞を囲む外および内部殻膜および羊膜を貫通する。胎芽 の正確な発達段階および位置に影響するか、この長さの針はひなの上の流体にま たはひな自体に達する。案内穴は、針の挿入前に殻に穴あけ器でまたはドリルで 穴あけして針の損傷または鈍くするのを防止することができる。必要に応じて、 卵はワックスなとのような実質的に細菌を通さない封止材料で封止することがで きる。

鳥類胎芽についての高速自動注入システムは本発明を実施するのに特に適当であ る。入手される多くのこの種の装置は米国特許第４．６８１．０６３号明細書（ ヘブランク氏）および米国特許第４．０４０．３８８　；　４，４６９，０４７ 　、および４．５９３．６４６号明細書（ミラー氏）に記載されている（これら の明細書を引例として、ここに記載する）。本発明を実施するのに適当なすべて のかかる装置は鳥類ｒＬ−２を含有する注入器を含んでおり、注入器は装置によ り支持された卵を鳥類［Ｌ−２で注入するように位置する。装置の他の要点につ いては上述している。さらに、必要に応じて、注入装置と操作的に連結した封止 装置は、注入後、卵の穴を封止する。

本発明を実施する好ましい装置は米国特許第４．６８１．０６３号明細書（ヘブ ランク氏）および欧州特許出願第８７３０５７４６．７号明細書（エンブレック ス　インコーポレーション、　１９８７年６月２９日出願）に記載されている（ これらの明細書を引例として、ここに記載する）。この装置は流体物質を多くの 卵に注入する注入装置、および同時に掛合し、多くの個々の卵をその上方に向か う位置から上げ、かつ卵に注入する注入手段と共同する吸引装置を含み、同時に 卵は吸引装置によって掛合する。この装置の特徴は本発明を実施する上述する装 置の特徴を組合せることができる。

ここに用いる「併用投与」とはＩＬ−２とワクチンを同じ時期に（例えば、イン オボふ化の最終期間中に）投与することを意味する。ＩＬ−２およびワクチンは 実質的に同時に投与するのか好ましい。ＩＬ−２およびワクチンは単一の薬学的 に許容しうる担体に一緒に配合して同時に投与するのが、特に好ましい。

次に、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれにより制限されるも のでない。

肺臓を生後４〜ｌＯ週間のヒリン（Ｈｙｌｉｎｓ）、ＳＣひな鳥から得、単細胞 懸濁液を被膜をはいだ肺臓から調製した。特に、肺臓をリン酸緩衝生理食塩水（ ＰＢＳ）（ｐＨ７，４）中に置き、５ｍｌ注入器の胴部を通過させ、次に１８ゲ ージの針を通過させた。この懸濁液を室温に５分間置き、ストローマを沈殿させ 、上澄み液を採集した。さらに５ｍｌのＰＢＳを沈殿したストローマに加え、混 合し、５分間置き、上澄み液を採集して第１の上澄み液と一緒にした。

次いで、これらの細胞をペレットにし、以下の実施例２で説明するように、ＲＰ ＭＩ−Ｇ培地を加える前に、ＰＢＳで２回洗浄した。

細胞の生存率は、トリバンブルー色素排除試験で測定して９５％より大であった 。

Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および硫酸ゲンタマイシン（５０μｓ／ｍｌ）を含有 するＲＰＭＩ−１６４０培地から成るＲＰＭＩ−Ｇ培地（ジグ７（Ｓｉｇｍａ） 、セントルイス、ミズーリ州）。

肺臓からの単細胞懸濁液を、１０’細胞／ｍｌの細胞濃度のＲＰＭＩ−Ｇ培地５ ０ｍ１および４μｇ／ｍｌの濃度のコンカナバリンＡ（シグマ・ケミカル・カン パニー、セントルイス、ミズーリ州）と共に７５ｃｍ２のフラスコ中に採取した 。調整培地（ＣＭ）は、これらの培地から５％のＣＯ□を含有する湿潤雰囲気下 で４０℃で６４〜９６時間温置して装、９６時間後に最大生成量を得た。

温直後、上記実施例２に記載した調整培地を５０ｍ１の雄型試験管中で遠心分離 して上澄み液を細胞から分離した。上澄み液を除去してＩＬ−２の源として用い ：細胞を［Ｌ−２活性についてのバイオアッセイに用いるのに分取した。上澄み 液を１０．０００の分子量を有する膜フイルタ−（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）上 で濃縮し、次に濃縮した上澄み液を、Ｇ２００ＯＳＷ　ＴＳＫカラム（３００Ｘ 　７．５ｍｍ）および溶出緩衝液としてＰＢＳを用いてＨＰＬＣゲル濾過した。

流量は１ｍｌ／分とした。フラクションを、１０，０００の分子量のカットオフ フィルターを有する「セントリコン（ＣＥＮＴＲ［Ｃ０Ｎ）　Ｊ濃縮装置で濃縮 した。鳥類ＩＬ−２ピークの保持時間は８．２〜８．８分であった。分子量標準 により検量した所、平均種は３０±６キロダルトンの分子量を有していた。

上記実施例３で測定用に分取した細胞を【Ｌ−２反応細胞として用いた。細胞を 、１７Ｘ１００ｃｍの遠心分離試験管を用いて、フラスコあたり、勾配で細胞を 勾配に層状にすることにより２０〜６０９６の［パーコル（ＰＥＲＣＯＬＬ）　 Ｊ勾配（６０％４ｍｌ、次いで２０％２０ｍ１）に分取し、試験管を１６０ＯＲ ＰＭで１０分間遠心分離し、６０％界面から細胞を除去した。次いで、細胞を、 希釈液として加えたＰＢＳおよびＲＰＭＴ−Ｇて２度洗浄した。細胞を数え、次 いて最終細胞濃度ヲ０．１Ｍのα−メチル−Ｄ−マンノピラノシド（シグマ）を 含有する培地を用いて２．０Ｘ１０’細胞／ｍｌに調整して残留マイトジェンを 不活性化し、応答する細胞溶液を得た。

応答細胞溶液の１００μｌを、各々の９６−ウェル微培養皿に分配し、各ウェル もまた１００μｌの試験用【Ｌ−２溶液を含有するようにした。２２時間の温度 の後、５　ｍｇ／ｍｌの濃度の臭化３−（４゜５−ジメチルチアゾリル−２）− ２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）　２０μｌを各ウェルに加え、皿 をさらに３時間温度した。次いで１００μｌの培地を各ウェルから除去しく皿を 振とうすることなく）、１００μｌの酸性イソプロパツールを各ウェルに加え、 ウェルを混合させ、内容物をダイナテ・ツク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ＭＲ６５０自 動微培養皿読取機のようなＥＬＩＳＡ読取機により５７０ｎｍの波長て読み取っ た。成長した細胞からのＩＬ−２を含有する参照の調整培地に、１ユニット／ｍ ｌの活性を随意に割り当て、また温度した。

このバイオアッセイにおいて、ＭＴＴは生きたＴ−細胞のミトコンドリアで分解 されてホルマザンに変化した。ＥＬ［ＳＡ読取機で決定したウェルの内容物の吸 光度が大きくなるに従い、ウェル中に存在するホルマザンも増加し、ウェル中に 存在するＴ−細胞の数も増加した。

このバイオアッセイは、上記実施例３の方法によるＨＰＬＣゲル濾過により精製 したＩＬ−２のＴ−細胞の成長活性を確認するために用いられる。

実施例５ 上記実施例１〜３により調製し、上記実施例４に記載した測定法により純度が６ １％であると決定し、バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）タンパク質測定により８８ μｇ／ｍｌのタンパク質含量を有すると決定したｒＬ−２溶液を、インオボへの 投与に用いた。卵当り０．２ｍｌの注入量で、卵に卵当り８８ｎｇのＩＬ−２， ８，８ｎｇのＩＬ７２、および　。

０、８８ｎｇのＩＬ−２を注入することかできるように、活性化合物およびＰＢ Ｓ希釈液を含有する３種の異なるＩＬ−２注入液を調製した。

ピータ−シム（Ｐｅｔｅｒｓｉｍｅ）人工ひな保育器て養育したハバード（Ｈｕ ｂｂａｒｄ）の若鳥の受精卵に、ふ化の１８日目に比−２溶液を注入した。１７ 〜２５個の卵に各溶液を注入した。卵を平らに置き、１個の卵に一度に注入して 冷却を最小限にした。穴の深さを最大２ｍｍとするゴム製のストッパーを有する １８ゲージの注入針を用いて卵の長軸方向に穴を開け、卵の含気洞に注入した。

注入液を水浴中に保管してその温度を約４°Ｃに保持し、各卵に０．２ｍｌのＩ Ｌ−２注入液を注入し、次いで卵をふ化器に移して放置してふ化させた。雄の鳥 をふ化器で計量し、調製した環境（ピータ−シム人工ひな保育器）内で随意に飼 料および水を与え続け、ふ死後８〜１６８目に計量した。結果を以下の表１に示 した。これらの結果によりＩＬ−２を鳥にインオボで投与することにより、ふ死 後８〜１６日経過した鳥の体重が増加することがわかる。

処５試料　濃度 理　卵当り　０日後　８日後　１６日後〔〕処理ｌと比較した際の差異 （％）〔（処理Ｘ−処理ｌ）÷処理１）Ｘ１００１・１縦の欄で異なる添字を有 する体重はＰ≦０．０５において著しく異なる。

これらの実施例は、ひな鳥以外の鳥類からの鳥類ＩＬ−２の単離を示す。

肺臓を雄のニコラスシロ七面鳥から得た以外は、上記の実施例１に記載した方法 により膵臓細胞を調製した。上記の実施例２に記載した方法により、これらの膵 臓細胞から調整培地を調製し、上記の実施例３に記載した方法により、この調整 培地から七面鳥ＩＬ−２を得た。この方法では、七面鳥ＩＬ−２活性の大部分は ３番目のフラクションに見出され、ピーク保持時間は約８．８分てあった。この 保持時間は、平均種の分子量の２２±５キロダルトン（ここで「２２に七面鳥Ｉ Ｌ−２Ｊ　とする）に相当する。一連の実施例に記載した方法により分取した七 面鳥のＴ細胞を、ひな鳥のＴ細胞の代わりにバイオアッセイに用いた以外は、上 記の実施例４に記載した方法と同様に］Ｌ−２活性を決定した。

全て上記の方法により七面鳥の調整培地を活性化したひな鳥Ｔ−細胞を用いて生 物活性について測定し、ひな鳥の調整培地を活性化した七面鳥Ｔ−細胞を用いて 生物活性について測定した。

双方の調整培地は、ひな鳥および七面鳥の両方のＴ−細胞を刺激し、これにより ひな鳥ＩＬ−２と七面鳥の［Ｌ−２との間に著しい交差反応性を示すことを確か めた。

実施例１１ マレク病ワクチンとｔＬ−２との併用インオボ投与本実施例は、ｒＬ−２を標準 のインオボでのワクチン投与量と配本実施例は、以下の５通りの処理から成る： 　（１）　１８日のふ化後の卵当り０．ＯＩμｇの【Ｌ−２と標準投与量のＨＶ Ｔワクチンとの投与；（２）１８日のふ化後の卵当り０．１μｇの［Ｌ−２とＨ ＶＴワクチンとの投与；（３Ｎ８日のふ化後の卵当りｌμｇのＩＬ−２とＨＶＴ ワクチンとの投与；　（４）　１８日のふ化後の卵当りｌＯμｇの１し−２とＨ ＶＴワクチンとの投与；　（５）　１８日のふ化後の、卵殻の穴あけのみを施し た未注入の負の対照群。

本実施例を行う方法は以下の通りである。７２０個の卵を商業的な家禽の会社か ら入手し、セットし、１８日間ふ化し、羊膜に注入し、ふ化させ、翼を生えさせ 、計量した。全ての鳥を、ふ死時に加え、生後１週問および２週間の際に計量し た。負の対照群および最も良好な体重を得た処理を行った群を６週間養育し続け 、その際計量した。養育のため、４００羽のひな鳥を、西から東に向けて２０区 画のカーテンで仕切った養育舎に分けた。

各養育区画に２０羽のひな鳥を配置し；各処理に対し、４つの同様な養育区画を 用いた。本実験の継続のため、鳥を標準的な養育装置対ひな鳥の割合に保持し、 ２３時間の光および１時間の暗先の周期で光に当てた。

上記の本実施例で得られた結果を以下の表２〜４に示す。１Ｌ−２は上記の実施 例３に記載した方法により調製し、ｆ（ＰＬＣにより純度が９７％であると決定 した。

表２ ＩＬ−２をＨＶＴワクチンと配合したインオボ投与による成長効果１、第５群以 外の全ての投与は、標準投与量（卵当り７．０ＯＯＰＦＵ）のマレク病（ＨＶＴ ）ワクチンに」Ｌ−２を配合させたものである。

２、（）＝ひな鳥の番号 ３、（）＝処理番号５との差（％） 雌対雄 平　均　体　重 （ふ化後） ａ、ｂＰ≦０．０５において統計的に異なる。

表４ ＩＬ−２をＨＶＴワクチンと配合したインオボ投与による飼料変換側１　０．０ １　１．１２８　１．５７３２　０．１　１．０９３　１．５ＩＱ　１．４１７ 　１．３０２　１．４８１　１．９５０３　１．０　１．１８２　１．５７７ ４　１０．０　１．０９４　１．５５９５　無　１．２０２　１．６４１　１． ３９８　１．２９６　１．４６２　１．９５８表２において、各群の平均体重は ふ化後の最初の３週間測定した。処理群２は、養育継続に選択されたものである 。ふ化後４、　５．　６週間目における第２および第５群のデータは表３に示し た。ふ死後６週開目において、処理群２の雄は、処理群５の雄と比較して著しく 大きい体重（Ｐ≦０．０５）を有した。第１〜５群における飼料変換データを表 ４に示した。ＩＬ−２処理群の飼料変換率か改善された。

実施例１２〜１５ ＩＬ−２とのインオボ併用投与によるウシ血清アルブミンに対する増強された細 胞媒介免疫 本実施例は、ふ死後インオボで投与された抗原に対するＴ−細胞免疫に関するイ ンオボのＩＬ−２の効果を示す。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、羊膜への注入によりふ化後１８日後の抗原と して投与した。２００μｌの量で調製した抗原を卵に手動で注入した。１インチ の２１ゲージの針を最大限に注入させたものを用いて、頂上から卵の大きい方の 端への注入の深さは２６ｍｍであった。注入した卵からふ化した鳥から膵臓を採 取し、前記実施例４に記載したＭＴＴ色素測定によるＢＳＡに対するインビトロ のＴ−細胞の増殖反応の測定に用いた。

４種の異なる処理群をインビトロで肺臓Ｔ−細胞増殖反応の試験に用いた＝（１ ）インオボで２μｇのＢＳＡを与えた群；（２）イ生理食塩水を担体として用い た。ふ化後１６日において各群の供与体から膵臓（群当り３〜４個）を取り出し 、それによって十分な時間放置して記憶細胞を増殖させた。細胞懸濁液を調製し 、これらの細胞を９６−ウェル微細培養皿に３通りに分画した。試験した各群に 対し、３通りのタイプのインビトロの処理法を用いた。（１）負の対照として細 胞に抗体を与えないもの：（２）正の対照として、細胞にコンカナバリンＡ（ウ ェルあたり０．５〜ｌμｇ）を与えてこれらの条件下で可能な最大の反応を与え たもの；（３）ウェル当り０．６２５μｇから開始して２倍ずつに増加させた投 与量のＢＳＡを与えたもの３通り。抗原およびコンカナバリンＡを０．１ｍｌの 量で加えた。後者の群はインビボにおける抗体を用いて再試験をした。試験の２ 日後増殖を測定した。上記の方法により実施した試験３〜５から得られたデータ を表５に示す。負の対照の応答は最大の増殖の１２９６であった。培養中の負の 対照群からＢＳＡへの細胞の応答における変化は、最大の投与量のＢＳＡを与え た細胞以外では比較的に変わらなかった。歪ンオボで２〜２００μｇのＢＳＡを 与えた鳥からの細胞は、１〜１０μｇのＢＳＡ濃度から直線的な投与量応答を示 した。ピークは最大増殖量の３０％、すなわち、負の対照の２．５倍量であった 。ヱンオボで２０μｇのＢＳＡを投与した鳥の細胞からの応答は抑制された。

表５ 有効なＮ５　５　５　５　５　５　５　５有効なＮ４　４　４　４　４　４　４ 　４有効なＮ５　５　５　５　５　５　５　５インオボで２μｇ投与した群のコ ンカナバリンＡ応答（％）平均値　１２．００１８．４４１９．３０２５．０４ ２９．３０２９．７４２１．２６２４．２４コン力ナバリンＡ反応（％） 最適なコンカナバリンＡ応答の０Ｄ ＩＬ−２をＢＳＡ抗原と共にインオボで併用投与した以外は、前記の実験をくり 返した。ＩＬ−２は、ＨＰＬＣにより純度か６１％であると決定した：非光り０ ．１μｇのＩＬ−２を投与した。この実験から得られたデータを以下の表６に示 す。２０μｇのＢＳＡをインオボで投与した鳥から採取した細胞の増殖は、【Ｌ −２の併用投与により２〜５倍に増強した。

表６ 培地および高抗原濃度 ２．５　８　ＮＴ　１０　２４　４７　２６５　１３　ＮＴ　２１３６　６１２ ３ １０　２３　ＮＴ　１０　４３　５５　４４１　コンカナバリンＡ応答（％） 卵当り４ｎｇのＢＳＡの投与量を用いた以外は、直前に記載したＩＬ−２の投与 量を用いて前記の実験を再びくり返した。これらのデータは以下の表７に示す。

（ａ）　ＢＳＡのみの群はインビトロにおける増殖応答を示さず、Ｃｂ）ルー２ のみの群はインビトロにおける対照群より改善された応答を示さず、（Ｃ）併用 投与の群表７ 最大のコンカナバリンＡ応答（％） １、２５　１　８．５　０　４１ ２．５　３　１５．７　０　２０ ５．０　１６．１　６．６　０　５０ １０．０　９．７　８．３　０　４０ 上述する実施例は本発明を例示するものであり、これらに限定するものと解釈さ れるへきでない。本発明は、以下の請求の範囲およびそれに含まれる請求の範囲 に相当するものにより定められる。

国際調査報告

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．生物活性量の鳥類インターロイキイン−２（ＩＬ−２）をインオボで鳥に投 与することを特徴とする鳥の処理方法。
2. ２．前記鳥はひな鳥、七面鳥、カモ、ガン、ウズラおよびキジからなる群から選 択する請求の範囲１記載の方法。
3. ３．前記鳥はひな鳥および七面鳥からなる群から選択する請求の範囲１記載の方 法。
4. ４．前記鳥類ＩＬ−２を前記鳥にインオボふ化のほぼ最終期間中に投与する請求 の範囲１記載の方法。
5. ５．前記鳥をひな鳥とし、および前記鳥類ＩＬ−２を前記ひな鳥にふ化のほぼ１ ５〜１９日目に投与する請求の範囲１記載の方法。
6. ６．前記鳥を七面鳥とし、前記鳥類ＩＬ−２を前記七面鳥にふ化のほぼ２１〜２ ６日目に投与する請求の範囲１記載の方法。
7. ７．前記鳥類ＩＬ−２を前記鳥に、鳥類ＩＬ−２を鳥を含む卵に注入することに よって投与する請求の範囲１記載の方法。
8. ８．前記注入段階を、前記ＩＬ−２を羊膜、黄卵嚢、または含気洞によって規定 された区域に注入することによって行う請求の範囲１記載の方法。
9. ９．前記鳥をひな鳥とし、前記鳥類ＩＬ−２をひな鳥ＩＬ−２とする請求の範囲 １記載の方法。
10. １０．前記ひな鳥ＩＬ−２を３０Ｋひな鳥ＩＬ−２とする請求の範囲９記載の方 法。
11. １１．ワクチンを前記鳥に前記鳥類ＩＬ−２と同時に投与する請求の範囲１記載 の方法。
12. １２．ワクチンを生ワクチンとする請求の範囲１１記載の方法。
13. １３．前記ワクチンを非複製ワクチンとする請求の範囲１１記載の方法。
14. １４．鳥類ＩＬ−２を前記鳥にインオボで、ふ化後前記鳥の成長を高めるのに効 果的な量で投与することを特徴とする鳥の成長を高める方法。
15. １５．前記鳥をひな鳥、七面鳥、カモ、ガン、ウズラおよびキジからなる群から 選択する請求の範囲１４記載の方法。
16. １６．前記鳥をひな鳥および七面鳥からなる群から選択する請求の範囲１４記載 の方法。
17. １７．前記鳥類ＩＬ−２を前記鳥にインオボふ化のほぼ最終期間中に投与する請 求の範囲１４記載の方法。
18. １８．前記鳥をひな鳥とし、および前記鳥類ＩＬ−２を前記ひな鳥にふ化のほぼ ぼ１５〜１９日目に投与する請求の範囲１４記載の方法。
19. １９．前記鳥を七面鳥とし、前記鳥類ＩＬ−２を七面鳥にふ化のほぼ２１〜２６ 日目に投与する請求の範囲１４記載の方法。
20. ２０．前記鳥類ＩＬ−２を前記鳥に、鳥類ＩＬ−２を鳥を含む卵に注入すること によって投与する請求の範囲１４記載の方法。
21. ２１．前記注入段階を、前記ＩＬ−２を羊膜、黄卵嚢または含気洞によって規定 された区域に注入することによって行う請求の範囲１４記載の方法。
22. ２２．前記鳥をひな鳥とし、前記鳥類ＩＬ−２をひな鳥ＩＬ−２とする請求の範 囲１４記載の方法。
23. ２３．前記ひな鳥ＩＬ−２を３０Ｋひな鳥ＩＬ−２とする請求の範囲２２記載の 方法。
24. ２４．ワクチンを前記鳥に前記鳥類ＩＬ−２と同時に投与する請求の範囲１４記 載の方法。
25. ２５．前記ワクチンを生ワクチンとする請求の範囲１４記載の方法。
26. ２６．前記ワクチンを非複製ワクチンとする請求の範囲１４記載の方法。
27. ２７．動物にインターロイキン−２（ＩＬ−２）を、前記動物の体重を増すのに 効果的な量で投与することを特徴とする動物の体重を高める方法。
28. ２８．前記動物を哺乳動物とする請求の範囲２７記載の方法。
29. ２９．前記ＩＬ−２を哺乳動物ＩＬ−２とする請求の範囲２８記載の方法。
30. ３０．前記動物を鳥とする請求の範囲２７記載の方法。
31. ３１．前記ＩＬ−２を鳥類ＩＬ−２とする請求の範囲３０記載の方法。