JPH07504662A - 免疫無防備状態の宿主における治療用途のための免疫促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫無防備状態の宿主における治療用途のための免疫促進剤発明の技術分野 本発明は、概して免疫学及び分子生物学の分野に関し、特に、リンパ球及び他の 造血系前駆体の増殖及び分化を刺激若しくは調節し、且つ感染物質に対する及び 悪性疾患（ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）に対する動物の応答を促進するポリペプ チド因子に関する。

発明の背景 胸腺は、胸骨の真下に横たわっており、この機能は、１９６０年に初めて明らか にされた。それまで、胸腺は、青年期後の急速な萎縮により成体において殆ど存 在が認められないので、あまり重要でないと考えられていた。他の器官（例えば 膵［１）の場合と同様に、胸腺の機能は、若い動物の胸腺を除去した影響を観察 することによって示唆された。青年期前の動物は、胸腺が除去された場合に種々 の疾病によって特徴付けられる重い“消耗病“を経験する。これには、感染及び 癌の兆候の増加、成長の遅れ、アレルギー並びに神経筋麻痺が含まれる。感染及 び癌にかなり罹りやすいということは末梢血のリンパ球の劇的な減少に直接的に 帰因しているとわかっており、無菌環境下で該動物を飼育することによって、感 染及び癌を防止することができた。しかし、胸腺摘出の他の症状は、かかる手段 によって完全に取り除かれることはなかった。

１９６４年に、胸腺組織のホルモン様因子が“消耗病”の多くの症状発現を防ぐ ことができることが証明され、それにより、胸腺は、免疫系の発達において重要 な物質を産生じていることが示唆された。しかし、この観察と他の“消耗病”の 症状との関係は、この時点ては十分に理解されていなかった。

Ｂ及びＴリンパ球は、免疫応答の一次エフエクター細胞である。両細胞クラスは 共に、哺乳類の骨髄において造血幹細胞から、各クラスの分化において個別の段 階を示す先祖及び前駆細胞を経て、最終的に誘導されると考えられている。Ｂリ ンパ球即ちＢ細胞は、循環性抗体産生プラズマ細胞の前駆体である。成熟Ｂ細胞 は、特異的抗原に結合することができる表面結合抗体の発現によって特徴付けら れ、造血幹細胞からプレＢ細胞として知られているクラスの中間細胞クラスを経 て派生する。成熟Ｔ細胞は、Ｔ細胞発達の初期段階において、恐ら（骨髄から胸 腺へ移動する未だ同定されていない前駆細胞から、胸腺において主として発達す る。

１９７１年まで、胸腺由来リンパ球（Ｔ細胞）が骨髄由来抗体産生リンパ球（Ｂ 細胞）の反応を調節するということは発見されていなかった。Ｂ細胞は、多くの 自己免疫型の疾患、即ち、自己の細胞又は組織に対する体の反応を伴う疾患の病 理に関連している。このような疾患の例には、関節炎、多発性硬化症、筋ジスト ロフィ、紅斑性狼癒が含まれ、恐らく、若年発症糖尿病も含まれる。胸腺摘出動 物の“消耗病”に関連した問題の多くは、“自己免疫型“疾患に類似している。

一般に、胸腺が適正な機能を欠く場合には、免疫応答を制御するＴ細胞に欠陥が あるか或いは存在せず、この系は崩壊する。

胸腺がホルモン様因子を産生していることが発見された後、幾つかの研究者グル ープが、インシュリンが糖尿病での治療用途のために調製された場合と全く同様 の方法で、この物質を胸腺から又は血清から抽出し精製しようと試み始めた。

胸腺が該ホルモンを極めて微量に産生している点で、これは困難である。従って 、大量のウシ胸腺又は数リットルの血清が、少量の活性物質を生化学的に抽出す るために必要とされる。この方法では、成果がかなり制限されていた。

Ｂ及びＴ細胞生成に関連する調節因子については、殆ど知られていない。特に、 １以上の胸腺因子若しくはホルモンが胸腺の上皮細胞によって産生されているこ とが今や知られているにも拘らず、Ｂ及びＴ細胞系統の分化の方向決め（コミッ トメント）及び拡張（エクスパンション）に必要な全ての因子若しくは条件は、 未だ定義付けされていない。（例えば、ワクサール（ＷａｋｓａＬ）ら、Ａｎｎ 、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、２４９：４９３　（１９７５）を参照 のこと。）　これらの因子若しくはホルモンを研究するための理想的な手段は、 これらの細胞を新鮮な胸腺組織から単離してｉｎ　ｖｉｔｒ。

で成育させることであるが、上皮細胞は、実験室において連続培養で維持するこ とか極めて困難である。

近年、この技術的な障害が、ネコ起源及び幾つかのヒト起源の株である胸腺上皮 細胞（ＴＥＰＩ）のクローン化法を、ここで開示されているように確立すること によって、打開された。マウス起源のクローン化した細胞株を確立するための初 期の努力が、本発明のための手法的な基礎研究に示された。（ベアズレイ（Ｂｅ ａｒｄｓｌｅｙ）ら、ＰＮＡＳ、８０：６００５　（１９８３）　、及びヘイズ （Ｈａｙｓ）　＆ベアズレイ、ＣＩ　ｉｎ、　１ｍｍｕｎｏ１、Ｉｍｍｕｎｏｐ ａｔｈ、、３３：３８１　（１９８４）を参照のこと。これらを援用して本文の 記載の一部とする。）しかし、これらの従前の開示は、マウス細胞株にのみ関連 しており、この文献は、これらの細胞株を容易に発生させるのに十分詳しく説明 しておらず、得られるマウスＴＥＰＩ物質は、本発明の均質且つ精製された物質 ではなかった。本発明のＴＥＰ１細胞株が、実際にウシ胸腺から胸腺物質を抽出 する困難で且つ労働集約的な手法によってすでに得られている物質と同様の因子 を実際に産生するが、ここで開示した因子は、より純粋であり、より均質な形態 であって、一層大量に生成されることが本文中で証明されている。

ここで開示される方法によって生成されるクローン化ＴＥＰＩ因子の主な活性は 、幼若及び成熟Ｔ細胞の療法の免疫応答を増大させる能力を有することが示され ている。これらの因子は、ここではＴ４免疫軌激因子（“Ｔｌ５Ｆ”）と呼ぶが 、これは更に生成されて、生化学的に特徴付けされる。また、ｉｎ　ｖｉｖｏ研 究は、感染物質及び悪性疾患細胞に対する動物の応答を促進することにおけるＴ ｌ５Ｆの効力を、決定し始めている。

今日までに行われている多くの研究かマウス及びイヌのモデルに焦点を合わせて いるが、他の動物例えばネコ、ウシ種、特にヒトに対する暗示及び適用は、今や 実行可能である。ここで開示されるように、ヒト上皮細胞株を確立する困難な段 階は、現時点で首尾よく達成されている。目下の自律は、本発明の種々の態様、 特にＴｌ５Ｆを適用して、免疫学的に関連のある疾患の治療のための効果的な免 疫増強剤及び／又は治療剤を生成すること並びに、疾患の病因物質の対する免疫 に有用な薬剤を作製することにある。

発明の概要 本発明の１具体例では、動物において細胞仲介免疫応答性を誘導又は促進するこ とができる実質的に精製された均質な胸腺由来因子が開示される。該動物は、例 えば哺乳類とすることができ、ヒト及びヒト以外のいずれかで有効であり得る。

他の具体例では、該因子は、追加の外来性物質を実質的に含まない１以上のポリ ペプチドから構成される。他の変形例では、該因子は、感染物質に対する動物の 応答の促進能を有する。該因子は、好ましくはＴｌ５Ｆであり、これはクローン 化ＴＥＰｌ細胞株に由来する。

他の具体例では、本発明による胸腺由来因子は、悪性疾患細胞に対する動物の応 答の促進能を有する。別の変更変形例では、該動物は、ヒト若しくはヒト以外の 哺乳類であり、好ましい具体例では、該哺乳類は、ネコ又はイヌである。

本発明は、また製薬的に許容可能なキャリア又は賦形剤中に組み込まれた有効な 免疫応答促進量の胸腺由来因子から構成される組成物を開示する。別の具体例て は、該組成物は、免疫無防備状態の動物における治療的利益をもたらすことがで きる。本発明による組成物は、非経口投与、腹腔投与又は局所的投与に適する形 態で提供され得る。

他の具体例では、動物における細胞仲介免疫応答性を誘導又は促進することがで きる胸腺由来因子を産生ずることができる非悪性クローン化胸腺上皮細胞株が開 示される。他の変形例では、該細胞株より産生される因子は、細胞仲介免疫を種 々の動物宿主例えば、哺乳類内で促進し、これらの宿主には、免疫無防備状態と 、未熟な免疫系を有するものが含まれる。

本発明は、動物における感染を治療する方法をも開示しており、これは、動物に 対して細胞仲介免疫応答性を誘導又は促進することができる胸腺由来因子を有効 量で投与することを含む。別の具体例では動物における感染を治療する方法であ って、動物に対して胸腺由来因子を含有する組成物を有効量で投与することを含 む方法が開示され、感染がウィルス又はレトロウィルスによって発生する方法も 開示される。他の変形例では、該ウィルスはネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）で あり、別の具体例では、該動物は、ヒト又はヒト以外の哺乳類であり、好ましく は家庭内勤物、例えばネコ又はイヌである。

他の変形例では、本発明の配合物を投与する方法は、非経口投与、腹腔投与又は 局所投与、経口投与を経て、又はリポソームを経て適用され得る。

本発明は、感染又は腫瘍性疾患の治療のための薬物の製造におけるＴｌ５Ｆの使 用、このような治療におけるＴｌ５Ｆ自身の使用、並びに、Ｔｌ５Ｆを含む感染 又は癌治療のための組成物を更に含む。

詳細な説明 本文において使用する場合、’Ｔｌ５Ｆ“は、哺乳類のペプチド又はペプチドの 混合物であって、リンパ球及びＴ細胞前駆細胞を含む他の造血系先祖細胞の増殖 及び分化を刺激又は調節することができるものを表す。Ｔｌ５Ｆは更に、感染物 質に対する及び悪性疾患細胞に対する動物の応答の促進能を有する。この分子／ 物質の他の指漂は、ＴＥＰＩ及び胸腺由来因子である。本発明のために、９０％ を越える類似性、同等の生物活性及び同等の発現特性を有するアミノ酸配列は、 実質的に同−又は同種と考えられ、”ＴＴＳＦ”の文言によって定義されるタン パク質の範囲内に含まれる。４０％を越える類似性を有するアミノ酸配列は、実 質的に類似であると考えられる。

本発明のＴｌ５Ｆの主要な基準は、誘導がないと機能しない細胞集団における免 疫機能の誘導能である。胸腺細胞は、非機能性である幼若細胞から殆ど構成され ている。元々、この細胞集団は、ＴＥＰＩ培養物からの因子を試験するために用 いられ、この因子は、ここでＴｌ５Ｆとして呼ぶものと類似である。ベアズレイ ら、ＰＮＡＳ、８０：６００５　（１９８３）に証明されるように、Ｔｌ５Ｆを 含有する調製物は、通常は非応答性である細胞集団における非常に重要な免疫応 答を誘導することができる。更に、我々は、Ｔｌ５ＦをＩＬ−２又はＩＬ−１と 区別した。これらは類似しているが、顕著な効果は少ない。主要な相違点は、胸 腺細胞が２４時間Ｔｌ５Ｆによって刺激されることのみを必要とするが、ＩＬ− ２は該応答の５日間の誘導期にわたって存在しなければならない。Ｔｌ５Ｆが実 際に全体的な免疫細胞又は成熟であるが未応答の細胞において作用するか否かは 、未だ、学術的に大きな疑問である。

近年、Ｔｌ５Ｆがヘルパー細胞集団の応答を増進しているということが証明され た。ＬＹＴ−２陰性Ｔ細胞及びＬ３Ｔ４陰性Ｔ細胞集団は、非接着性牌臓細胞か ら調製された。細胞障害性キラー細胞活性を測定する慣用のアッセイ（溶解した 細胞からの”Ｃｒの放出の測定による）において、Ｔｌ５Ｆの効果が直接、ＬＹ Ｔ−２陰性細胞の濃度に関係していること、並びに、ＩＩ（：：ｒの放出はＴＴ ＳＦ濃度と直接関連していることが証明された。換言すれば、ＬＹＴ−２陰性細 胞がない場合には活性はなく、Ｔｌ５Ｆを初代培養に用いた場合にＬＹＴ−２陰 性細胞が大幅に増強された活性を示した。逆に、Ｌ３Ｔ４陽性ヘルパー細胞がな い培養物には、活性がない。

Ｔｌ５Ｆは、感染物質及び／又は癌に対する抗体仲介及びキラー細胞応答の両方 を、ＩＬ−２産生細胞の効果を通して、大幅に促進又は増強させることができる 。Ｔｌ５Ｆの驚くべき効果は、ＩＬ−２産生の刺激能によって既に示されている 。これはＩＬ−２リセブターに対する抗体（７Ｄ３又は３Ｃ７）によって細胞障 害性キラー活性のＴＴＳＦ促進を抑止することによって証明される。無関係な抗 体には抑止効果はない。治療的見地からヘルパー細胞を補充して、必要とされる 場所にＴＬ−２を作ることは、体液によって速やかに希釈又は分解されてしまう ＩＬ−２のポーラスを注入するより意義がある。

幾つかの企業が、治療薬及びアジュバントの両方としてのＩＬ−２の有効性を証 明しようとしてきた。問題は少なくとも２つある。第１は、ＩＬ−２が局所的で あって、活性が短いサイトカインだということである。所望の部位即ち、腫瘍塊 において生理学的レベルに達成するには、非自然的なかなりの量を投与しなけれ ばならない。従って、患者が副作用を患う可能性は、顕著に増加する。第２は、 ＩＬ−２は有効な応答を誘導するには少なくとも５日間継続的に存在させなけれ ばならないということである。

実践的及び経済的な視点から、ＩＬ−２治療は、論理的に難しく且つかなり高価 である。１９９２年に医療施設における５日間に及ぶＩＬ−２の１日２回の注入 は、薬剤のみて米ドルで３１０００以上かかった。

これと対象的に、我々がＴｌ５Ｆと称しているものと類似する物質は、ある種の 疾患状態を除いて、通常、生理学的に計測可能なレベルで血中に普通に存在する 。該物質の作用の仕方は、体全体にわたる免疫系の細胞に広がっている。循環　 。

系における通常の成分であるので、もしあるとしても副作用が僅かであると期待 される。しかし、最も大きな利益は、Ｔｌ５Ｆの単一注入が、長期継続の効果を 有し、ごくわずかな頻度で、インシュリンのように自己投与することができるこ とである。従って、患者及び医師の利便性、これに加えて比較的低下したコスト が臨床的な許容性を促進するであろう。

非還元条件下でのポリアクリルアミドゲル解析は、Ｔｌ５Ｆが２つの弱いバンド に隣接する１つの主要なバンドを伴う、実質的に均質な分画として出現すること を証明した。ＴＴＳＦ分画の配列解析は、本文中で開示されるクローン化胸腺細 胞株によって産生される分画の均質性をＳ認すると期待される。

その後、Ｔｌ５Ｆを、高純度な抽出物を得るために、一連の精製工程に付すこと ができる。例えば表１には、ＡＸ３００カラム（アニオン交換ビーズ）又は０Ｍ ３００（カチオン交換ビーズ）カラムのような精製方法の使用が説明されている 。

ＴＴＳＦが前述のサイトカインのいずれでもないことは証明されている。以前に 報告されティるようｌ：：　（ＰＮＡＳ、８０：６００５　（１９８３）を参照 のこと）、Ｔｌ５ＦはＩＬ−１でもＩＬ−２でもない。追加試験は、Ｔｌ５Ｆが ＩＬ−４でもないことを証明している（表２を参照）。

更に、我々は、Ｔｌ５ＦがＩＬ−５又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因 子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含まないと確認し、これは表３に挙げられているデータが 示している。Ｔｌ５ＦがＢ細胞に処する如何なる直接刺激活性をも有していない ことの事実は、ＩＬ−３、ＩＬ−６又はＩＬ−７でもないことを示している。

更なる精製及び遺伝的クローニングは、Ｔｌ５Ｆの詳細な分子特性を特異的に同 定するために進行中である。

表１ ＴＩＳＦ因子の精製 ａ　活性のユニット数／ｍｌは、アロ抗原に対するＣＴＬ　（細胞障害性１９２ ３球）応答の最大刺激の少なくとも９０％を与える試料の最大希釈の逆数として 、関数的に定義される。

ｂ　無血清条件下で回収された最初のＴｌ５Ｆ培養上清（ＳＮ）Ｃタンパク質濃 度は、ブラッドフォールドタンパク質アツセイ（）くイオラドラボラトリーズ社 、リッチモンド、カリフォルニア化）によって測定した。

ｄ　タンパク質濃度は、既知の基準を用いてＨＰＬＣ最適濃度トレースにより表 ２ 未分画化Ｔｌ５Ｆ　ＳＮ及びＩＬ−４の相違ＩＬ−４添加なし　ＩＬ−４添加８ 因子３Ｕ／ｍｌ　ＩＬＩ／ｍｌ　０．ＩＵ／ｍｌａ　精製ＩＬ−４ ｂ　結果を平均”’ＩＵｄＲｃｐｍ／培養物として表し、その後の括弧内は±１ 標準偏差範囲である。培養物は細胞当たり５Ｘ１０”のＮＫ細胞を含む。

Ｔｌ５Ｆ　ＳＮはＩＬ−５及びＱＭ−Ｃ３Ｆ活性を含まないＴＬ−５アツセイ’ 　ＧＭ−ＣＳＦア・ソセイ５添カロ因子 なし　４６７　（３７２−５８８１ｅ３５３２　（３３３６−３７３９１６（３ ４２）ｅ８３０　（７７９−８８４）部分的精製 ３％　３００（２５６，３５１）　３００３（２５４６−３５４２）　１７（８ −３３）　８３４（８０４−８６６）ａｌＬ−５活性は、Ｂ細胞リンパｌ！ｉ４ 　ＢＣＬＩ　（ＡＴＣＣ、ロツクヴイル、メリーランド州）を用いることによっ て測定した。

ｂ　ＧＭ−Ｃ３Ｆ活性は、ＤＡ−３株（ＡＴＣＣ、ロツクヴイル、メリーランド 州）を用いることによって測定した。

ｃｌＬ−５は、ＤＩＯ，Ｇ４．Ｉ　Ｔｈ２　細胞株の培養上清から精製した。

これは、マツケンジー（ＬｌｃＫｅｎｚｉｅ）ら、（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 、　１３９：２６６１　（１９８７））に記述されている。これらの実験の用い た調製物を、約５００ユニツト／ｍｌで含有して実験に用いた。

ｄ　精製ＧＭ−Ｃ３Ｆは、ジエンザイム社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州 ）から購入した。

ｅ　結果を平均”’ＩＵｄＲｃｐｍ／培養物として表し、その後の括弧内は９５ ％信頼区間である。

ｆ　製造マニュアルに詳述されているようにセファロースＳカチオン交換カラム （フフルマノア社、ビス力タウエイ、ニューシャーシー化）により集められた活 性分画 細胞培養物の調製 胸腺組織を、若いネコから一般的な麻酔下で無菌的に取り出した。取り出した組 織は、組織培養液中に直ちに置いた。

胸腺細胞のクローン化細胞株を、本文で記述したように確立できる。この場合、 ネコ起源の胸腺ストローマ細胞を、下記の述べるように改良及び精製を加えて、 ベアズレイら、ＰＮＡＳ、８０：６００５　（１９８３）の記述された方法に概 ね従い、継続的に複製する、クローン化した細胞株として確立した。この文献を 援用して本文の記載の一部とする。

手短に言うと、手順を下記のように説明することができる。約ｌＸｌ０”胸腺細 胞の初代培養物を、６０ｍｍのペトリディッシュ中、ＤＭＥＭ及び２０％ウシ胎 仔血清５ｍｌ中で確立した。約４８時間後、該胸腺細胞を緩やかに洗浄し、散在 している僅かな接着性細胞に、２０％ウシ胎仔血清及び５０％調整培地を含む新 鮮なりＭＥＭ５０％を加え、遠心した後に胸腺細胞を得た。種々の細胞型を含有 する初代培養物を、同様の新鮮な調整培地の５０：５０混合物を毎週与えること によって維持した。約４週間後、上皮細胞様の細胞の幾つかの孤立したクローン によって、該プレートが覆われた。この時点で、初代培養物からコロニーの幾つ かを爬き取って移すことによって二次培養を形成させた。三次培養までは、成長 は、ゆっくりとした傾向であり、細胞は単一層を４〜５日以内に形成し始めた。

ｌウェル当たりｌ細胞の限界希釈法による細胞のクローニングは、集密的に成長 する傾向にある３又は４個の各細胞をウェルに“植える”より、成功率が低かっ た。限界希釈で配置された単一細胞は、上皮成長因子を単一細胞を含有するウェ ルに対して６ｎｇ／ｍｌで添加すれば、集密状態までより成長しそうであった。

上皮細胞様の形感を示すクローンを成長させ、胸腺細胞全体における同種異系反 応的（アロリアクティブ）な促進能を試験した。集密化した胸腺由来培養物の上 清を、胸腺細胞の機能的活性の誘発能について試験した。例えば、このような方 法の１つは、同種異系の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原に対する胸腺細胞 のＣＴＬ　（細胞障害性１９２３球）活性を増大させる上清の能力を試験するこ とか含まれる。細胞仲介免疫応答性の誘導又は促進の可能性を示す上清は、好ま しくは、試験のため及び更なる精製のために選択された。選択された上清の精製 （例えば表１を参照のこと）は、かなり均質な因子（ＴＩＳＦ）をもたらす。上 述したような既存のアッセイ技術を用いて、Ｔｌ５Ｆの有効成分が、追加の外来 物質が実質的にない少なくともｌのポリペプチドから構成されていることが、こ こで明らかになる。

Ｔｌ５Ｆは、免疫無防備状態の動物又は未熟な免疫系を有する動物に対して種々 の方法を経て投与され得、このような方法には、非経口及び腹腔投与が含まれる 。Ｔｌ５Ｆの最少有効量は、動物の体重１ｋｇ当たり約ｌμｇとなるように規定 される。下記の多くの実験例では、投与量範囲を、投与量たり約０．　１μｇ〜 約ｌμｇＴＩＳＦとした。好ましくは、宿主体重ｋｇ当たり少なくとも約５μｇ のＴｌ５Ｆで、約５００μｇ／ｋｇを上限として、動物へ投与される。Ｔｌ５Ｆ を、単独で、他の免疫増強剤と組み合わせて又は製薬的に許容可能なキャリア若 しくは賦形剤に組み込んで、有効に投与することができる。

好ましい具体例では、下記の実施例によって説明するように、胸腺ストロマ細胞 由来Ｔｌ５Ｆは、Ｉｌ型上皮細胞によって産生される。ネコ組織の初代培養物か らのクローン化細胞は、形態に基づいてまず選択される（ベアズレイら、ＰＮＡ Ｓ、　８０：６００５　（１９８３）の文献、例えば所望の形態特徴の説明の箇 所を参照のこと）。次に、クローン化された株を、既知のｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉ ｎ　ｖｉｔｒｏバイオアッセイ手法によって測定して、Ｔｌ５Ｆの産生に基づい て選択される。培養物の純度を、ウィルス、バクテリア及びカビを含む侵襲性の 微生物を定期的にモニターすることによって維持する。

細胞は、好ましくは、Ｌ−グルタミン及び１以上の適当な抗生物質（即ちペニン ジンＧ　ｌ００１Ｕ／ｍｌ：ストレプトマイシン　１００μｇ／ｍｌ）を添加し 且つ高濃度グルコース配合（アーパインサイエンティフィック社、サンタアナ、 カリフォルニア化）のダルベツコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）中に増殖させる。こ の培地は、更に、１〜１０％のウシ胎仔血清を添加するか、又は無血清代替物（ 例えば、サークステンド（Ｓｅｒｘｔｅｎｄ）　（商品名）、アーパインサイエ ンティフィック社、サンタアナ、カリフォルニア化）としてもよい。維持培地は 、上述したように、血清なして作製される。

細胞培養物を、既知の方法に従って増殖させ維持することができる。本発明の用 いられたものを、クナゼック（Ｋｎａｚｅｋ）とグリノ（Ｇｕｌ　１ｎｏ）、Ｔ ｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎ、　Ｃｈｐ、７．ｐ３２１〜、クルーズ（Ｋｒｕｓｅ）及びパダーリン（Ｐａ ｔｔｅｒｓｏｎ）編、アカデミツクブレス社、ニューヨーク州、１９７３年に記 載されている方法に従って、人工キャビラリベッド中で増殖させた。この文献を 援用して本文の記載の一部とする。細胞株の増殖及び維持の他の方法は、週毎に 継代してＤＭＥＭ及び１０％ウシ胎仔血清中で成育させる。成育培地を、５日培 養物から除去し、２４時間無血清ＤＭＥＭに置き換えることができる。２４時間 の培養上清は、胸腺因子の供給源として有用である。

本発明は、本発明の好ましい具体例を説明した下記の実施例によって、より一層 理解されることかできるが、これは本発明の範囲を限定するために意図されたも のではない。

実施例１ イヌモデルにおいて、Ｔｌ５Ｆが狂犬病ウィルスに対する抗体応答性を少な（と も５倍促進することが証明された。ＴＴＳＦ及び狂犬病ウィルス不活性化ワクチ ンを、イヌに同時投与した。対照となる群は、狂犬病ウィルス不活性化ワクチン とミョウバンとをワクチン注射したもので、そこでは、抗狂犬病ウィルス抗体の 力価は、２５０よりずっと低いレベルで２週間以内にピークに達した。これと対 照的に、実験群の動物は、不活性化ウィルスと存続していることが証明されてい るＴｌ５Ｆとでワクチン注射されており、力価を増して、７５０を越えるレベル で免疫後約２週間以内にピークに達した。免疫応答が促進されただけでなく、Ｔ ｌ５Ｆの投与によって動物の生存も向上し、生存の期間が延びた。

この手順が予備試験的であり、まだ最適化されてぃながったことを考えると、こ の結果は更に一層重要である。また、これらの試験が事情製物質を用いて実行さ れたので、より高い純度の物質を使用すると、試験する手順を最適化したときに 、Ｔｌ５Ｆがより効力かあることがしめされると期待される。

実施例２ ＴＩＳＦの効能を試験するために用いられた第２のモデルでは、イヌを、ミョウ バン又はＴｌ５Ｆをアジュバントとして、ビルレントのジステンパーウィルスで 免疫した。ジステンパーウィルスは、免疫抑制効果を有することが知られている 。その後、この動物を、ビルレント系のジステンパーウィルスでチャレンジして 、防紳を評価した。第３の群、即ち、対照物となる非ビルレント群も、この研究 に含めた。

イヌジステンパーウィルスのチャレンジの次に該３群の生存を比較した。ワクチ ンとＴｌ５Ｆとを受けた群は、約８５％の生存率であった。ワクチンとミョウバ ンとを受けた群は、約４５％の生存率であった。対照群は、約５％の生存率であ った。このワクチンとＴｌ５Ｆを投与した動物の生存率は、ミョウバンをアジュ バントとしたワクチンを受けた動物の約倍である。細胞仲介免疫（ＣＭＩ）応答 が、ジステンパーに対する防御において重要と思われるので、リンパ球増殖応答 の測定は、ワクチン及びＴＩＳＦ群における生存率によく相関するだろうと予想 される。

実施例３ ＴＩＳＦの有用なｉｎ　ｖｉｖｏ効果は、かなり最近、第３のウィルス性疾患即 ち、インフルエンザに対する関係について証明された。インフルエンザ（ｆｌｕ ）感染自身も免疫抑制性であるにも拘らず、ある免疫抑制状態、例えばストレス 又は化学療法を既に体験している場合、一般に微生物は、ｆｌｕ感染に対して、 より敏感であるど（ｉｔられている。

感染のマウスモデルでは、初期防御は、ヒトにおけるように、ヘモグロビン抗原 （ＨＡ）に対する抗体力価を増加してもたらされる。ｆｌｕに対する一次応答で は、ＨＡ力価はＴｌ５Ｆの共同投与によって８倍促進された。力価は、ウィルス のみを接種された若いマウスにおいて１：２０であり、Ｔｌ５Ｆを加えたウィル ス接種を受けたマウスにおいてＩ：１６０であった。インフルエンザウィルスに 対する細胞仲介応答は、感染から回復するために重要である。ＣＭＩが全ての既 知のインフルエンザＡ株において一般的である感染細胞において発現されている 、かなり保存された非構造物の遺伝子産物に指向しているため、このことは重要 である。従って、ＨＡ分子の遺伝的変異性のためにインフルエンザによって感染 するならば、　”メモリー”ＣＭＩか全てのインフルエンザ株に対して相互反応 性であるので、より多くのＣＭＩ応答が、この病気の期間をかなり一層短縮する ことができるであろう。

この可能性を試験するために、既に数週間、Ｔｌ５Ｆを添加又は未添加で、イン フルエンザに感染したマウスを、インフルエンザウィルスに感染された標的細胞 に対する二次細胞障害性キラー細胞応答について試験した。標的細胞溶解によっ て測定される死滅活性は、Ｔｌ５Ｆレシピエンドからのリンパ球によって少なく とも９倍促進された。

実施例４ ＦＩＶ陽性と確認された動物、即ちネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）に感染され た動物におけるＴｌ５Ｆの最近の試験は、Ｔｌ５Ｆの免疫治療的効果を証明する 役割を果たしている。ネコの実験群はＴＴＳＦの注射を毎週受け、一方、対照群 のネコはＴｌ５Ｆを受けなかった。Ｔｌ５Ｆの注射後５週間で、未処理対照群と 比較して実験群において顕著な臨床的改良が認められた。更に、リンパ球の数は 、処理の最初の週の間に顕著に増加し、全期間に亘って確認された。例えばリン パ球減少ネコは、今や正常又は正常以上のリンパ球数を有している。ウィルス学 的な状悪及び細胞性についての実験群の骨髄の実験は、処理動物におけるＴｌ５ Ｆの治療効果を確認する。

用いた手順は以下のようであった。

１〜３年齢の１１匹のネコを、ジャネット・ヤマモト博士、カリフォルニア大学 デービス校、から入手した。ネコをＦＩＶのペタルーマ（Ｐｅｔａｌｕｍａ）株 に実験的に感染させた。（ペダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ 　２３５ニア９０−７９３　（１９８７）を参照のこと、この開示内容を援用し て本文の記載の一部とする。）全てのネコが、ＦＩＶ陽性であると確認されたが 、試験施設に到着した際は、病気の症状がないことが明らかにされた。基本的な 試験手順は以下のようにした。

■、ネコを約２週間安静にして環境に慣れさせる２、処置の開始前に血液試料を 得て、リンパ球数及び／又はＴ４／Ｔ８率の基線を決定する ３、不規則に処理群（６匹）又は対照群（５匹）にネコを割当る４、処理群のネ コに１．０ｍｌのＴＴＳＦを精製形態又は手積製形態で皮下に注射する ５、各注射の前に１週間を基本として血液試料を得る。臨床的兆候をモニターし て所見を記録する ６、処理動物及び対照動物におけるＦＩＶ検出試験（例えば、血液塗抹標本の適 当な染色）に使用するための骨髄及び／又は血液試料を得る本発明の前述した詳 細な説明及び好ましい具体例、特に生成組成物及び工程は、特定具体例の説明に 過ぎないと考えるべきである。しかし、更なる具体例が当業者によって認識され 得ることが理解されるべきである。本文中で記載された具体例は、それらの更な る具体例と共に、本発明の範囲内に含まれる。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１００　 ＡＤＺ ３９／３９　９２８４−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１４１５２　８３１８−４Ｈ／／　Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　Ｋ　９２ ８２−４ＢＩ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＺ

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳生物において細胞仲介免疫応答を誘導又は促進することができ且つクロ ーン化哺乳類細胞からの、実質的に精製された均質な胸腺由来因子ＴＩＳＦ。
2. ２．前記因子が、追加の外来性物質を実質的に含まない１以上のポリペプチドを 含む請求の範囲第１項記載の因子。
3. ３．前記因子が感染物質に対する哺乳生物の応答の促進能を有する請求の範囲第 １項記載の因子。
4. ４．前記因子が悪性細胞に対する哺乳生物の応答の促進能を有する請求の範囲第 １項記載の因子。
5. ５．前記哺乳生物がネコである請求の範囲第１項記載の因子。
6. ６．前記哺乳生物がイヌである請求の範囲第１項記載の因子。
7. ７．製薬的に許容可能なキャリア又は賦形剤中に組み込まれた、有効で免疫応答 を促進する量の請求の範囲第１項に記載の胸腺由来因子を含む組成物。
8. ８．免疫無防備状態の哺乳生物に治療利益をもたらすことができる請求の範囲第 ７項記載の組成物。
9. ９．非経口投与に適した形態の請求の範囲第７項記載の組成物。
10. １０．腹腔投与に適した形態の請求の範囲第７項記載の組成物。
11. １１．局所投与に適した形態の請求の範囲第７項記載の組成物。
12. １２．経口投与に適した形態の請求の範囲第７項記載の組成物。
13. １３．前記哺乳生物に有効量の請求の範囲第１項記載の因子を投与することを含 む哺乳生物における感染及び癌の治療方法。
14. １４．前記哺乳生物に有効量の請求の範囲第７項記載の組成物を投与することを 含む哺乳生物における感染及び癌の治療方法。
15. １５．前記感染がウィルスによって起こる請求の範囲第１３又は１４項記載の治 療方法。
16. １６．前記ウィノＬスがレトロウイルスである請求の範囲第１５項記載治療方法 。
17. １７．前記ウィルスがネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）である請求の範囲第１５ 項記載治療方法。
18. １８．前記ウィルスが狂犬病ウィルスである請求の範囲第１５項記載治療方法。
19. １９．前記ウィルスがジステンパーウィルスである請求の範囲第１５項記載治療 方法。
20. ２０．前記哺乳生物がネコである請求の範囲第１５項記載治療方法。
21. ２１．前記哺乳生物がイヌである請求の範囲第１５項記載治療方法。
22. ２２．前記哺乳生物がヒト以外である請求の範囲第１３項記載治療方法。
23. ２３．動物における感染又は癌の治療のための薬物の調製におけるＴＩＳＦの使 用。
24. ２４．動物に対してワクチンと同時に投与される免疫増強アジュバントの調製に おけるＴＩＳＦの使用。
25. ２５．ＴＩＳＦを含む、感染又は腫瘍性の疾患の治療に用いられる組成物。
26. ２６．実質的に均質な精製ＴＩＳＦとワクチンとを同時に投与することを含む、 動物の免疫方法。