JPH04506516A - 抗侵襲剤の治療への応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗侵襲剤の治療への応用 発明の背景 本発明は悪性腫瘍細胞の増殖、侵襲および転位の抑制に効用を持つ、下記の一般 式Ｉで表わされる一連の化合物に関する。

一般式Ｉ ？ 〔式中、Ｒ３は （ただし、ＰはＯ〜２を；ｍは０〜４を；およびｎは０〜５をそれぞれ表わす； Ｘはｏ、５Ｓｓｏ、ＳＯ□、ＣＯ，（ＨＣＮ、　ＣＨｔまたはＣ＝ＮＲｂを表わ す（ただし、Ｐ、は水素原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ 基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基またはシアノ基 を表す）かつＲ４およびＲ２はそれぞれハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロ メチル基、低級アルカノイル基、ニトロ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基 、カルボキシ基、低級カルバルコキシ（ｃａｒｂａｌｋｏｘｙ）基、トリフルオ ロメトキシ基、アセトアミド基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニ ル基、低級アルキルスルホニル基、トリフルオロメチルチオ基、トリフルオロメ チルスルフィニル基またはトリフルオロメチルスルホニル基を表す）　； Ｒ２はアミノ基、モノまたはジ低級アルキル基、アミノ基、アセトアミド基、ア セトイミド基、ウレイド基、ホルムアミド基、ホルムイミド基またはグアニジノ 基を表す； Ｒ５はカルバモイル基、シアノ基、カルボジイル基、アミジノ基またはＮ−ヒド ロキシカルバモイル基を表す；　（ただし、前記低級アルキル基、低級アルキル 基を含有する前記低級アルコキシ基および前記低級アルカノイル基は１〜３個の 炭素原子を持つ。）〕癌が悪性である由縁は、侵襲と転位によって致死作用が起 きることにある。その生長力から見ても分かる通り癌細胞は侵襲と転位とを特性 としている。したがって悪性細胞のこれら機能を選択的に阻止する薬剤によって 転位を防いだり、遅（することができるはずである、化合物Ｌ６５１５８２（メ ルク研究所、米国特許第４．５９０．２０１号）は元来コクシジウム抑制剤とし て設計されたものであるが、これまでに正常細胞の細胞由来の増殖を抑制するこ とが分かっていた。

Ｌ　６５１５８２は試験管内において、５−ホスホリボシルビロリン酸（ＰＲＰ Ｐ）合成を抑制し、かつギ酸エステル、ヒポキサンチン、アデニンの取り込みを 低下させたりするが、ヌクレオシド合成の新生経路、サルベージ経路によるＰＲ ＰＰシンテターゼその他の酵素を直接的に抑制しなかった。

これまでの資料によると、Ｌ　６５１５８２は細胞のシグナル加工に必要な生化 学経路に働きかけて増殖や炎症を抑制する。つまり、生長を誘発するのに必要な 第二のメツセンジャーを生産するエフェクター酵素を間接的に阻害するとされて いる。これら膜結合酵素はグアニンヌクレオチド結合タンパク（Ｇタンパク質） に結び付くことによって活性化される。ホスファチジルイノシトールの加水分解 が始まる際、血小板由来生長因子（ＰＤＧＦ）、Ｔ細胞生長因子（ＴＧＦα）な どの生長因子の作用を介在するＧタンパク質経路を阻止する結果として、抗増殖 効果が生まれると考えられる（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ、　ＡｎｎＲｅｖ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　１９８７；　Ａ１１ｅｎｄｅ、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　１９８８；　Ｎｅ ｅｒ＆　Ｃｌａｐｈａｍ、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９８８）。加水分解産物である イノシトールトリホスフェートとダイアシルグリセロールは細胞内カルシウムと 細胞内ｐＨをそれぞれ変化させて生長を促進する。

本発明者はこの点の研究を行い、腫瘍細胞の運動能、さらに運動能によって指示 される移動と侵襲とには、同様のＧタンパク質の経路が必要であるとの所見を得 た。　Ｆｅ５１５８２の作用機序についての資料を総合すると、Ｌ　６５１５８ ２はＧタンパク質の受容体活性化を防いだり、かつ／または癌の増殖、侵襲、転 位の細胞由来経路に必要なエフェクター酵素が、一連のＧタンパク質によって刺 激されるのを抑制すると考えられる。

図面の説明 図２は、Ｆｅ５１５８２（以下Ｌ６５１ともいう）の構造を示す図である。

図２は、オートリリン運動因子（ＡＭＦ）によって刺激された化学走性に対する Ｆｅ５１の投与量依存抑止作用を示すグラフである。

ＡＭＦは５Ｒラス（５Ｒｒａｓ　）をトランスインフェクシッンされたラットの 胚線維芽細胞および＾２０５８ヒト黒色腫細胞の任意、指示運動を刺激するｉＲ ５系はヌードマウスの腫瘍を形成し、また転位する。Ｇタンパク質機能のモジュ レータ−として知られている百日咳毒素（ＰＴ）で細胞を処理すると（ＰＴ、　 ０．５μｇ／ｓ＋１　２時間）、この運動能は顕著に抑制される。Ｆｅ５１　（ ０，０３−１０μｇ／ｍｌ）は投与量に依存する形でＡＭＦによって刺激された 運動能を抑制した。８時間以内のブレインキュベーションによっても運動能は僅 かに抑制されたが、至適抑制を得るためにはＦｅ５１で一部中インキユベートし なければならなかった（Ｏば５Ｒの２４時間を示し；■は２４時間を示し１口は Ａ　２０５８の４８時間を示す）　、　Ｆｅ５１は、運動能分析期間中、分析系 に保持した。トリパンブルー排除試験による細胞生存率は、９５％以上であった 。この表では無処理の細胞の運動能が刺激を受けた場合に対する百分比を示して いる。　Ｆｅ５１　（１μｓ／ｍｌ）とＰＴ　（０，１μｓ／ｗｌ　）とを併用 して細胞処理を行った場合の運動能抑制作用は、それぞれ単独使用の場合よりも 大きくはなかった（資料省略）。

図３は、組織培養プラスチック容器中の腫瘍細胞の付着力に対するＦｅ５１の投 与量依存抑制効果を示すグラフである。

付着力分析に先立って、細胞にＦｅ５１　（０，０３−１０μｇ／ｍｌ）を加え て２〜４８時間ブレインキュベーションしたのち、この細胞についてＬ６５１存 在下で９０分間付着力分析を行った。事前処理のインキュベーションを２〜４時 間続けた後、組織培養プラスチック容器中の付着力に僅かながら投与量依存性の 抑制がみられたが、運動能の場合と同様に、薬剤を５Ｒ（グラフ中０で示す）と Ａ２０５８（グラフ中−で示す）とに−晩中暴露した後でなければ最大の付着力 抑制は認められなかった。

Ｆｅ５１はまた、マトリックス成分のラミニン（ｌａｗｉｎｉｎ　）およびフィ ブロネクチン（ｆ　１ｒｏｎｅｃｔｉｎ）に対゛する細胞の付着力を低下させた （資料省略）、細胞の拡散は顕著には低下しなかった。

表１．腫瘍細胞の付着力および運動能 に対するＬ６５１効果の可逆性の評価 運動能および付着力実験（図１．２）は、運動能と付着力に対するＬ６５１抑制 効果の可逆性を測定することを目的として、常時Ｌ６５１の存在下で実施した。

　Ａ２０５８黒色腫細胞を標準培地（ＤＭＥＭ／牛脂児血清（Ｆｅ２）　１０χ ）で２４時間培養し、生理食塩水で２回洗った後、ＤＭＥＭ／ＦＣ５ＩＯ％にＦ ｅ５１を添加しく＋）または添加しないで（＝）再び２４時間培養した。この後 、細胞を洗い、交換の度に標準培地のみを加えた。Ｆｅ５１の「洗い出し」効果 を評価するため、処理細胞（−／＋）、「洗い出し」細胞（＋／−）およびコン トロール細胞について、ＡＭＦに対する運動反応と組織培養プラスチック容器中 の付着能力を検討した（図１．２の通り）０表中のデータは、Ｆｅ５１の２濃度 におけるコントロール細胞の運動能と付着力に対する百分比で表されている。画 濃度によるＦｅ５１の効果は、Ｌ６５１不存在下で２４時間培養することにより 可逆性とすることができた。

図４は、ＡＭＦ刺激世代の総イノシトールホスフェートに対するし６５１の効果 を示すグラフである。

Ａ　２０５８細胞をＬ６５１（１Ｒｇ／■ｌ）で２４時間処理し、燐酸緩衝生理 食塩水（ＰＢＳ）で洗った後、Ｌ６５１を添加しない３Ｈ−イノシトール含有培 地で一部中インキュベートした。採集後、塩化リチウム（ＬｉＣＩ　１０ｍＭ） で３０分処理し、処理細胞およびコントロール細胞を１５分間と１２０分間ＡＭ Ｆに暴露した０反応が停止した後、リビッドを抽出し、Ｄｏｗｅｘアニオン交換 カラムにより総イノシトールホスフェートを単離した。１２０分間ＡＭＦに暴露 された後でも、Ｌ６５１で前処理した細胞では、イノシトールホスフェートの形 成が抑制されていた。

図５は、３Ｈ−チミジン（’Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）取り込みに対するＬ６５ １の投与量依存性の抑制効果を示すグラフである。

Ａ２０５８　（■で示す）、５Ｒ（Ｏで示す）　、ＭＤＡ−２３１ヒト乳癌（ム で示す）および０ＶＣＡＲ３ヒト卵巣癌（◆で示す）それぞれの細胞を、血清無 添加条件下で９６ウエルのプレートによって培養し、サブコンフルエンスさせた 後、Ｌ６５１　（０〜１０μｇ／＋ｌ）を添加した血清含有培地によって一部中 処理した　３Ｈ−チミジンによるパルス標識法を２時間実施した後、細胞を固定 し、チミジン取り込みを測定した。表のデータは、無処理のコントロール細胞が 取り込んだ標識チミジンに対する百分比で表している。

図６は、腫瘍細胞の増殖に対するＬ６５１の投与量依存性の抑制効果を示すグラ フである。

Ａ２０５８　（■で示す）、５Ｒ（Ｏで示す）、門０Ａ−２３１（ムで示す）お よび０ＶＣＡＲ３（◆で示す）それぞれの細胞を、Ｌ６５１（０〜１０μｇ／ｓ ｌ）を添加した血清含有培地中で、２４ウエルのプレートにより培養した。細胞 をメタノールテ［１ｌｌｉ　定し、クリスタルバイオレット核染色法により染色 を行った。溶出した染色液の吸光度を測定し、細胞の種類毎の増殖を無処理のコ ントロール細胞の増殖に対する百分比で表に示しである。

図７は、ヒト卵巣転位癌を持つヌードマウスが、Ｌ６５１５８２　５０Ｂ／ｋｇ ／ｄで治療後生存日数が増加したことを示している。

ヌ−）’？ウスニｌ：：　ト卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３）　３．４ｘ　１０７を 腹腔内に移植して腹膜癌腫症を作った。３週間後重篤な腫瘍のため全てのマウス の腹部が腫張したので、治療群とコントロール群の２群に分けた。治療群には毎 日、腹腔内注射（ＩＰ）によりジメチルスルホキシド（Ｄ門ＳＯ）　６０χを賦 形剤とするＬ６５１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄを投与し、コントロール群には、毎日Ｉ Ｐにより賦形剤のみを与えた。治療開始後の生存日数を基準とする評価結果では 、総合生存日数は治療開始後７．２５＋／−４，４日から１６．０＋／−２，５ 日までに延長していた。

発明の説明 癌細胞に対するＬ　６５１５８２の効果の研究結果は、Ｌ　６５１５８２が腫瘍 細胞の移動、侵襲、増殖に優れた効果を持ち、運動能刺激因子に優れた反応を呈 することを示している。侵襲こそ悪性疾患の特性であり、前述したように、１１ １１Ｇ細胞は化学誘引物質であるオートクリン運動因子に対して分泌反応を示す （Ｌｉｏｔｔａ　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　１９８６）　、その反面、 百日咳毒素はＧタンパク質複合体に感受性を持ち、ＡＭＦに対する運動反応に介 在して、刺激を受けた運動能を抑制する効果に優れている（Ｓｔｒａｃｋｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏ１．１９８７） 。また、Ａ？ｌＦはイノシトールトリホスフェートの世代を刺激して反応させる が、百日咳毒素がこの反応を抑制する事が知られており、これからホスファチジ ルイノシトールビスホスフェート−特異的ホスホリパーゼの活性化が示唆されて いる（Ｋｏｈｎ　ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ　Ａｍｅｒ　Ａｓ５ｏｃ　Ｃａｎｅｒ 　Ｒｅｓ、　１９８８）。

この所見によって生化学経路と腫瘍の移動との結び付きが初めて証明され、現在 では、ホスホリパーゼＣの活性化に介在するタンパク質と運動能との連係が転位 カスケード（転移メカニズム）の一部を構成するとみなされている。生長と運動 能の両者に介在するこの重要な経路を阻止する事ができる薬剤は新しい貴重な癌 療法であり、本発明の一般式Ｉで表わされる一連の化合物はＧタンパク質の介在 によって転位シグナルが導入されるのを直接的に抑制する初めての新抗侵襲剤、 抗増殖剤である。

癌生物学分野では、これまでに腫瘍細胞の付着力と運動能が侵襲と転位に必要な 重要機能であることが立証されている。本発明の一般式■で表わされる化合物は これらの機能を特異的に抑制するう一般式■の化合物の一つであるＬ　６５１５ ８２はヌクレオシド合成の新生サルベージの両経路を抑制するばかりでなく、さ らにバナジウム酸塩で刺激されたイノシトールトリホスフェートがＭＤＢＫ細胞 から放出され、ｆ？ｌＬＰによる刺激を受けた多形核好中球（ＰＭＮｓ）内でア ラキドン酸代謝のためシクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ経路の代謝産物 が減少するのを抑制すると共に、標識を付けたカルシウムが正常細胞から放出さ れるのも防ぐことができる。しかしながら、Ｌ　６５１５８２はこれらの経路に 関連する酵素に直接影響を与えるものではない。また、上記の効果は高モル濃度 領域で顕著である。さらに、Ｌ６５１５８２の抑制作用発現部位は、Ｇタンパク 質が何れかの受容体エフエフ−ター酵素と相互作用を行う部位あるいはその近傍 と考えられ、したがって、腫瘍細胞の重要機能を効果的に抑制することができる 。運動能、侵襲、付着、生長のような受容体が介在する機能は、シグナル導入段 階で本発明の化合物により阻止することも可能である。

これまでに、本発明一般式Ｉで表わされる化合物が悪性疾患、特に卵巣癌のよう な固形癌の腹膜癌腫症の治療に効用があることが分かっている。　Ｌ６５１５８ ２は濃度１〜１０ＩＩＭで、ヒトおよびラット由来の数系統の腫瘍についてＡＭ Ｆ刺激を受けた運動能を抑制すると共に、組織培養プラスチック容器に対するこ れら腫瘍の付着力を低下させ、しかもこれらの効果は可逆性であった。

また、この系の化合物はホスホイノシチドに対するＡ？ｌＦの刺激効果を減少さ せる。実験中に行ったクローン発生分析（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ　ａｓｓａｙ） では、Ｌ　６５１５８２はヒト黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、ヒ） Ｔ細胞リンパ腫、ネズミ白血病およびラスをトランスインフェクシゴンしたラッ ト胚腺維芽細胞の生長を抑制したとの所見を得た。上記の抗増殖効果に加え、Ｌ ６５１５８２は腫瘍の侵襲と転位の必要条件である付着力、生長および刺激され た運動能の抑制に優れいることが認められている。ヒト卵巣癌の腹膜癌腫症の動 物モデルでは、Ｌ　６５１５８２は一時的ではあるが悪性腹水の規模を縮少し、 これが遠因となって総合生存率が２２０χに上昇した。

ヒト卵巣癌は、ｌｔＩ膜腔内で潜伏しながら拡大して、複数の腹腔臓器に侵襲す る傾向があり、このため腹膜癌腫症による死亡率は高率となっているが、本発明 一般式Ｉの化合物による付着力、侵襲、増殖の抑止効果は卵巣癌治療に特に有用 である。Ｌ　６５１５８２の実験は、ヒト卵巣癌の病理に綿密に近づけた動物モ デルによって実施した。このモデルでは、ヒト卵巣癌細胞をヌードマウスの腹腔 内に注入したが、ヒト腫瘍細胞はヒト患者と同一の様態で急速に腹腔内を移動浸 潤して、全てのマウスに急速に腹腔回転位が発生した。腹膜癌腫症マウスをＬ　 ６５１５８２で治療した結果、有意性の高い生存期間の延長が認められ、この使 用分野に於ける本発明の化合物の効用が立証された。

本発明の研究では、Ｌ　６５１５８２が付着力、運動能、生長の効果的な阻止剤 であることを示しているが、同時に卵巣癌腫症に対するこの薬剤の効果も非常に 特徴的な分析によって立証された。

本発明一般式Ｉの化合物の投与方法はリンパ腫、白血病および全ての固形腫を治 療する場合、例えば静注、経口投与、局所投与、腹腔内投与を行うことができる し、また膜包埋剤として投与することもできる。また、癌の局所療法の場合には 、適当な賦形剤に添加することも可能で、局所投与の適応例としては基底細胞癌 、カポージ肉腫の様な腫瘍を響げるごとができる。腫瘍の再発防止には、癌細胞 が増殖している特定部位に薬剤が到達できるような組成で投与することが有利で あり、例えば腹膜癌腫症の原因となることで知られている腫瘍の治療には、腹腔 内投与が好ましい手段である。

移行上皮癌の層内治療、歯状息肉腫の局所治療なども、部位指向タイプ療法の例 である。全身投与方法としては、持続注入法、ポーラスの非経口投与、あるいは スローリリーズのデボ−を移植してこれから薬剤をリリーズさせことが泰げられ る。本発明の薬剤は、細胞毒性剤および生物反応モデファイヤーを含む従来の癌 治療方法の補助療法として用いることもできるのは明白で、悪性疾患が現在の部 位から浸潤癌に移行することを防止する治療手段として用いてもよい。

本発明の組成の使用は悪性疾患の治療にみに限定されるものではなく、子宮内膜 症のような疾患において異常細胞が局所的に拡散することから生ずる症状の治療 薬として使用しても良い。

実施例１ 材料 メルク研究所から結晶状のＬ　６５１５８２粉末の提供を受け、デメチルスルホ キシド（ＤＭＳＯ）により２０　ｍｇ／ｍｌの原液を作り、アリコートを一７０ ℃で貯蔵した。使用の場合、その日毎に培地中（ＤＭＥＭ）で１０　ｔｔ　ｇ／ ｌａ１溶液を調製し、必要に応じて連続希釈液を調製した。　使用した濃度領域 は０．０３〜１０．Ｏｔｌ　ｇ／ｍｌであり、−力木発明の実験では、賦形剤の ＤＭＳＯに活性を持たせないため、すくなくとも千倍に希釈した（資料省略）。

３Ｈ−イノシトール（比活性　１０５　ｍｃｉ／ｍｇ）、’Ｈ−チミジン（比活 性　１０２　ｍｃｉ／ｗｇ）はアマージャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ａｒｌｉ Ａｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）から、また、ドーヴエンクス（Ｄｏｗｅ 、ｘ）アニオン交換レジン１−ｘ８ギ酸塩型はビオラッド社（ＢｉｏＲａｄ、　 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｃｅｎｔｅｒ、　ＮＹ）から購入した。運動能チェンバー およびヌクレオポアー　（ｎｕｃ　Ｉｅｏｐｏｒｅ）フィルター（８μ、ポリビ ニールピロリドン不　添加）はニュウロブローブ社（Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ。

Ｉｎｃ、（Ｃａｂｉｎ　ＪｏｈＬ　ＭＤ）から購入した。また、タイプＩＶコラ ーゲンはコラボラチイブ研究所（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅ−ａｒｃ ｈ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）から、さらに小量のイノシトールを含有するフ ェノールレッド不添加ＩＭＥＭ　［２，７ＨＭ］はナショナルインスチチュトオ プヘルス（ＮＩＨ）の培地係から入手した。

他の試薬は試薬グレードであった。

細胞、培養およびオートタリン運動因子の調製Ａ２０５８ヒト黒色腫細胞系は、 ウシ胎児血清（ＦＣＳ）　１０χを含有するダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’　ｓ 　）のモデファイドエッセンシャル培地（ＤＭＥＭ）を用いてサブコンフルエン ト培養基中に保持した。ＡＭＰは簡単に説明すると、上記のＡ　２０５８細胞を ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　０．０１％を含有する血清無添加ＤＭＥＭ中で ４８時間培養した後、アミコン濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ 　ｓｙｓｔｅｍ）を用いこの培地から分子量３０ＫＤ以上の化合物を取り除いた ものを濃縮して調製した（Ｓｔｒａｃｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ　ＲｅｓＣｏｗｓ、　１９８７）。本発明の分析全てにこのＡＭＦ を使用した。

Ｈ−ラスを活性化し、これによってラッテ胚線維芽細胞を形質転換（２倍体）さ せた系、即ち５Ｒを同一条件下で培養した。この系については、予め腫瘍化、転 位化表現型であることが確かめられていた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌系は ＡＴＣＧ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）から購入して、上記と同様に保持し た。　０ＶＣＡＲａ！Ｈ胞はロバートオゾルス博士（Ｆｏｘ　Ｃｈａｓｅ　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｔｐｈｉａ、　ＰＡ）から提供を受 け、ＦＣＳＩＯχを含有するＲＰ旧により培養した。

細胞の運動能および付着力 細胞運動能分析についての公知の方法（Ｓｔｒａｃｋｅ　ｅｔａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｓ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ＋　１９８７）により、ト リプシン−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）でサブコンフルエント細胞を採 集し、室温で一時間放置して回復させた。

５Ｒの採集は、２価のカチオンを持たないＰＢＳにＥＤＴＡ　２ｍＭを加えたも ので行った。ＢＳＡ　Ｏ，１χを含有させた血清無添加培地中に細胞を再懸濁し たが、−カニ〇〇ＭＥＭ　（培地）／ＢＳＡ　Ｏ，１χをその後の全ての分析の コントロールとして使用した。４８ウエル化学走性チエンバーに、８μヌクレオ ポアー（ｎｕｃ　１ｅｏｐｏｒｅ）タイプＩＶフィルターにコラーゲンを塗布し たものを装着し、この装置を用いて分析を三回繰り返した。チェンバーを４時間 培養した後、フィルターを取り除いて染色を行った。細胞移動の定量については 、移動する細胞数と直線的に相関することを確かめであるレーザーデンシトメー ターを使用した。　Ａ２０５８および５Ｒ細胞にＬ６５１５８２　［０，０３〜 ５゜０Ｍｇ／ｍｌ　］を添加して４８時間ブレインキュベートした後、ＡＭＦに 対する運動反応を分析して両者の運動能についてのＬ　６５１５８２の効果を検 討した。また、トリバンプルー排除試験によって細胞の生存率を測定したところ 、平均９６％以上であった。　ＡＭＦに対する反応試験は、細胞をＬ　６５１５ ８２各樗濃度に暴露して行い、コン１−ロールと比較した。運動能と付着力の分 析はＬ　６５１５８２の存在下で実施した。刺激された運動能（デンシトメータ ーによる）の百分比は、次の弐により計算した。

付着力分析には、組織培養プラスチックペトリ皿を基質として使用した。ペトリ 皿に三枚のプレー１−をのセ、それぞれに同様に処理した細胞のアリコートを置 き、９０分３７°Ｃでインキュベートした後、付着不良の細胞をＰＢＳでゆっく りと洗い流し、付着細胞には染色を行った。レーザーデンシトメーターを用いて 付着力の定量を行い、結果をコントロールの付着力に対する百分比として計算し た。

ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）代謝の分析ＡＭＦによって刺激されたＰＩ 代謝に対するＬ　６５１５８２の効果を検討した。　Ａ２０５８細胞にＬ６５１ ５８２１．０Ｍｇ／ｍｌを添加して２４時間インキュベートした後、標識法を一 部中実施した。この際、無処理のコントロールフラスコも並行して保持した。ブ レインキュベーション後小量イノシトールＩ？ｌＥＭ　（Ｌｌ−ＩＭＥ？Ｉ）で ある血清無添加の３Ｈイノシトールによりコントロール細胞と処理細胞について 一部中標識法を行ったが、この標識期間中、さらにはその後の代謝回転分析期間 中はＬ　６５１５８２の再添加を行わなかった。さらに、細胞を採集し、ＬｉＣ １１０ｍＭを含有するＬＩ　−ＩＭＥＭ中に懸濁して３０分間インキュベートし た。代謝分析の開始時、ＡＭＦまたは血清無添加培地コントロールを細胞１００ ，０００から成るアリコートに添加し、このアリコートを３７°Ｃで１５分間お よび１２０分間インキュベートした。インキュベーション終了後、細胞を水冷Ｐ ＢＳで温度洗い、クロロホルムとメタノールの混液（１：２）で抽出した。ドー ヴエックス（Ｄｏｗｅｘ　）アニオン交換カラムクロマトグラフから１．０Ｍギ 酸アンモニウム１０．１Ｍギ酸緩衝液を溶出させて総イノシトールホスフェート を取り除き、総イノシトールホスフェートおよび取り込まれていない細胞内の総 ３Ｈ−イノシトールの定量をリガンドシンチレーション計数管によって行った。

総イノシトールホスフェートと取り込まれていない総３Ｈ−イノシトールとの比 によってデータを作成し、またこの比の標準偏差値も計算した。

生長 ３Ｈ−チミジン標識法およびクリスタルバイオレット核染色法の異なる二つの方 法により、またＡ２０５８．５Ｒ１ＯＶＣＡＲ３とＭＤＡ−２３１それぞれの細 胞を対象として、生長抑制の定量を行った。チミジンの取り込み分析にっては、 ９６ウエルのプレートに細胞１５，０００のアリコートを置き、血清無添加の細 胞にＬ　６５１５８２を増量して添加した血清含有培地を加えた。さらに２４時 間後細胞にＪ−チミジンによるパルス標識法を２時間行い、トリクロロ酢酸（Ｔ ＣＡ　）で沈澱する細胞をＥｔＯＨ／エーテルで抽出し、続いて０．２Ｍ　Ｎａ ＯＨにより可溶化を行った。このようにして、生長抑制の百分比を測定した。ク ローン発生分析では、標準組織培養条件により、また増量したＬ　６５１５８２ の存在下でウェル（２４ウェルのプレート）１個当り５０，０００の細胞を培養 した。培養後ＰＢＳでゆっくりと細胞を洗い、固定し、ＭｅＯＨ２０χにクリス タルバイオレット０．５％加えたもので染色した。過剰の染色液は水道水で除き 、結び付いた染色は０．ＩＮクエン酸ナトリウム（ｐＨ４，２）と１００χＥｔ Ｏ１（の１：１　（ｖ／ｖ）混液で溶出させた。溶出液のアリコートの吸光度を ５４０　ｎｓで測定し、コントロール吸光度に対する百分比で表した。

動物生存期間の検討 生後６週間の無胸腺マウスの腹腔内に、ヒト卵巣癌細胞０ＶＣＡＲ３３，４Ｘ１ ０’を移植し、３週間後全てのマウスの腹部が０ＶＣＡＲ３腹水のため大きく張 れているのが認められた。腹水の相対重篤度によりマウスを２群（Ｎ・４）に分 けて治療を開始し、一方にはＤＮＳＯ６０χ（２００ｕ　１　アリコート）中に Ｌ６５１５８２５０■ｇ／ｋｇ／ｄを添加したものを、他方には賦形側のみを、 何れも毎日−同腹腔内投与した。治療開始後の総合生存期間を基準とし、治療群 の平均生存期間をコントロール群の平均生存期間で除して、相対生存改善率を計 算した。

結果 腫瘍細胞の運動能と付着力 Ｌ６５１５８２　［０，０３〜５．０　μｇ／腫ｌ］と細胞とを共にブレインキ ュベーションすることの効果の検討は、Ａ２０５８またはＲ５細胞を対象とし、 ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チェンバー運動能装置改良型を使用して行った。Ｌ　 ６５１５８２に暴露開始後２〜４時間でＡＭＦで刺激された運動能が僅かに低下 したが（資料省略）、−晩中プレインキユベーシゴンすると図２に示すように刺 激された運動能に、再現性良く５５％までの投与量依存性の低下が認められた。

暴露時間をさらに延長しても（４８時間以下）、ＡＭＦにより刺激された運動能 が上記以上に抑制されることはなかった。５ＫＢＲおよびＭＤＡ−２３１の二つ のヒト乳癌細胞系についても、Ｌ　６５１５８２に一部中暴露した後ではＡＭＦ に対する運動反応が抑制されるのが認められた（資料省略）。また、腫瘍細胞が 組織培養容器に付着することに対するＬ６５１５８２　［０，０３〜５．０　μ ｇ／＋ｉｌ　］の効果を検討したところ、図３に示す通りＡ２０５８および５１ １胞の付着力に投与量依存性の低下が認められた。僅か４時間のブレインキュベ ーションで付着力が抑制されるのが認められたが、その程度はインキュベーショ ンを一部中続けた後より低かった。さらに、検討を行った中で最大の投与量であ る５μｇ／ｍｌでは抑制の大きさも最大で、コントロールの５０〜６０％に達し ていた。また、インキュベーション培地からＬ　６５１５８２を除くことにより 、この薬剤の運動能と付着力に与える影響が可逆であるか、不可逆であるかの点 の検討も行った（表１）。

この検討では、細胞にそれぞれＬ　６５１５８２またはコントロール何れかを加 えて２４時間インキュベートした後、ＰＢＳで二面洗い、それぞれコントロール またはＬ　６５１５８２のどちらかを添加してさらに２４時間インキュベートし た。細胞を採集して運動能と付着力の双方を検討したところ、培養培地からＬ　 ６５１５８２を取り除きさえすれば、腫瘍細胞の運動能と付着力の抑制は可逆性 であることが分かった。

ホスホイノシチドの代謝 好中球をはじめとする正常細胞を用いる研究によって、Ｌ　６５１５８２がホス ファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解を阻害することが認められている（Ｄ 、Ｈｕｐｅ＋　ＭｅｒｃｋＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ、ｔｏｒｉｅｓ、未 公開）、さらに、Ａ−ＦがＡ　２０５８細胞のＰＩ代謝を刺激することおよびＰ ！代謝と運動能が並行する投与量依存反応を示すことがかねてから分かっていた が、今回ＡＭＰに対するこの生化学反応にＬ　６５１５８２が効果があることが 立証された。この検討では、細胞をＬ６５１５８２　［１，Ｏｔ１ｇ／ｍｌ］と 共に２４時間インキュベートし、続いて一部中８Ｈ−イノシトールによる標識法 を実施、この標識の期間中さらには代謝分析中はＬ　６５１５８２を再投与しな かった。図４はＬ　６５１５８２がＡＭＦで刺激されたＰＩ加水分解を顕著に抑 制したことを示している。抑制の大きさは、同一投与量による運動能の抑制と同 様である（４５χ）。また、Ｌ　６５１５８２は分析に先立つ２４時間の標識期 間中あるいはその後の分析の間中存在していなっかったのであるから、この薬剤 がＰ１回転に与える生化学効果は、運動能と付着力に対する効果とは対照的に可 逆性が容易ではなかったことが示唆されている。この薬剤は処理されてはいるが 、刺激されていない細胞には認められるような効果を示さなかった。ＡＭＦで刺 激されたホスホイノシチド代謝がＬ　６５１５Ｂ２によって部分的に抑制された こと、さらにはかねてから知られているようにこれが百日咳毒素によっても部分 的に抑制されることから、Ｌ　６５１５８２の作用発現部位はホスホリパーゼＣ と結びついているＧタンパク質の部位、あるいはその近傍であることが示唆され ている。

生長 Ｌ　６５１５８２は間接的にヌクレオシド合成の新生経路、サルベージ経路の双 方を抑制する。Ｌ　６５１５８２の生長に対する効果は次の四つの異なる腫瘍細 胞系を対象として検討した。　Ａ２０５８黒色腫、ＭＤＡ−２３１乳癌、０ＶＣ ＡＲ３卵巣癌および５Ｒで形質転換したラット胚線維芽細胞。細胞増殖の評価に は、二つの異なる手法を用いた；３Ｈ−チミジンの取り込みおよびクリスタルバ イオレット核染色を用いるクローン発生分析。クローン発生法を用いたのは、ピ リミジン（特に、チミジン）代謝に対するＬ　６５１５８２の効果が不明であっ たからである。図５はＬ　６５１５８２に２４時間暴露後、全ての細胞系に新生 ＤＮＡ合成のマーカーである３Ｈ−チミジンの取り込み抑制が認められたことを 示している。クローン発生分析では、Ｌ　６５１５８２に暴露する時間の長さを 、各細胞系の倍加時間に合わせて調整した。図６ではクローン発生性腫瘍細胞の 増殖に認められた投与量依存抑制を、無処理のコントロールに対する百分比に換 算して示している。

抑制の程度は細胞の種類により異なったが、Ａ　２０５８を９６時間培養した際 に最大の抑制（２４％　）が認められた。

Ｌ　６５１５８２は上記した正常細胞に対する効果の他に、ＨＤ５０１〜１０μ 阿で腫瘍細胞に対して顕著な抗増殖特性を示した。

動物生存の検討 腹膜癌腫症を合併する卵巣癌第三期の臨床症状に正確に近づけた０ＶＣＡＲ３ヒ ト卵巣癌の動物モデルを作った。

０ＶＣＡＲ３腹水は治療しないとヌードマウスにとり致命的である。０ＶＣＡＲ ３ヌードマウスをＬ６５１５８２５０　ｓ＋ｇ／ｋｇ／ｄで治療したところ、生 存期間に顕著な改善が認められた。

重篤なマウスを、Ｌ　６５１５８２で治療する群と賦形剤のみを与える群の２群 に分けた。総合生存期間は７．２４±４．４日から１６．０±２．５日にまで延 長し、コントロール（治療していない標準の場合に比べ）の２２０χに達した。

〔（邸ＩＴｉ　Ａ、。

ＦＩＧｔＪＲＥ　２ 投与量、ｕｇ／ｍ１ ＦＩＧＵＲＥ　３ １鱒量、ｕ　ｇｌｍ　１ ＦＩＧＵＲＥ’？ 時間、静中佑 ＦＩＧＵＲＥｆｆ 投与量、　ｐｇ／ｍ１ ＦＩＧＵＲＥ６； 股１も〃３／ゆ１ ＦＩＧＵＲＥ　′：Ｆ ｆ１口役５１−　、　ｍｇ／ｋｇ／ｄ ＦＩｇｃｌｌ？Ｅ　８ 国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の悪性腫瘍の侵襲と転位を抑制する方法において、前記の方法が下 記一般式で表わせられる化合物の抗侵襲および抗転位有効量を前記哺乳動物に投 与することを特徴とする哺乳動物の悪性腫瘍の侵襲と転位を抑制する方法。 一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１は ▲数式、化学式、表等があります▼ ｛ただし、ｐは０から２までを；ｍは０から４までを；ｎは０から５までをそれ ぞれ表わす；Ｘは０、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＨＣＮ、ＣＨ２、またはＣ＝ ＮＲ６（ただし、Ｒ６は水素原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコ キシ基、アミノ基、低級アルキルアミン基、ジ低級アルキルアミノ基またはシア ノ基を表す）；Ｒ４とＲ５とはそれぞれハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロ メチル基、低級アルカノイル基、ニトロ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基 、カルボキシ基、低級カルバルコキシ基、トリフルオロメトキシ基、アセトアミ ド基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルフ ォニル基、トリクロロビニル基、トリフルオロメチルチオ基、トリフルオロメチ ルスルフィニル基またはトリフルオロメチルスルフォニル基を表す｝； Ｒ２はアミノ基、モノまたはジ低級アルキルアミノ基、アセトアミド基、アセト イミド基、ウレイド基、ホルムアミド基、ホルムイミド基またはグアニジノ基を 表す；および Ｒ３はカルバモイル基、シアノ基、カルバゾイル基、アミジノ基またはＮ−ヒド ロキシカルバモイル基を表す｛ただし、前記の低級アルキル基、低級アルキル基 を含有する低級アルコキシ基および低級アルカノイル基はそれぞれ１〜３個の炭 素原子を持つ｝〕。
2. ２．請求項１の方法において、ｐは１であり；ｍは２でありおよびｎは１であり ；ＸはＣＯであり；Ｒ４とＲ５は共に塩素原子であり；Ｒ２はアミノ基でありお よびＲ３はカルバモイル基である請求項１の方法。
3. ３．哺乳動物の固形腫の腹膜癌腫症を治療する方法において、前記の方法が下記 の一般式で表わせられる化合物の抗腹膜癌腫症有効量を前記の哺乳動物に投与す ることを特徴とする哺乳動物の固形腫の腹膜癌腫症を治療する方法。 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１は ▲数式、化学式、表等があります▼ ｛ただし、ｐは０〜２までを；ｍは０から４までを；およびｎは０から５までを それぞれ表す；ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＨＣＮ、ＣＨ２またはＣ＝ ＮＲ６を表す（ただし、Ｒ６は水素原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級 アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基また はシアノ基を表す）；Ｒ４とＲ５はそれぞれハロゲン原子、シアノ基、トリフル オロメチル基、低級アルカノイル基、ニトロ基、低級アルキル基、低級アリコキ シ基、カルボキシ基、低級カルバルコキシ基、トリフルオロメトキシ基、アセト アミド基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスフィニル基、低級アルキルスフ ォニル基、トリクロロビニル基、トリフルオロメチルチオ基、トリフルオロメチ ルスルフィニル基またはトリフルオロメチルスフォニル基を表す｝； Ｒ２はアミノ基、モノまたはジ低級アルキルアミノ基、アセトアミド基、アセト イミド基、ウレイド基、ホルムアミド基、ホルムイミド基またはグアニジノ基を 表す；および Ｒ３はカルバモイル基、シアノ基、カルバゾイル基、アミジノ基またはＮ−ヒド ロキシカルバモイル基を表す｛ただし、前記の低級アルキル基、低級アルキル基 を含有する低級アルコキシ基および低級アルカノイル基はそれぞれ１から３個の 炭素原子を持つ｝〕。
4. ４．請求項３の方法において、前記の固形腫が卵巣腫瘍である方法。
5. ５．請求項３の方法において、ｐは１であり、ｍは２でありおよびｎは１であり ；ＸはＣＯであり；Ｒ４とＲ５は共に塩素原子であり；Ｒ２はアミノ基であり； およびＲ３はカルバモイル基である方法。