JPH04506563A - 表面プラズモン共鳴スペクトロメトリーを用いるアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 表面プラズモン共鳴スペクトロメトリーを用いるアッセイ法 本発明は表面プラズモン共鳴スペクトロメトリー（ＳＰＲ８）技術を用いる被分 析体のアッセイ法に関する。この方法は被分析体一般に利用しつるが、被分析体 がハプテン（抗体が結合しうるが、それ自体は免疫原でない小分子）である場合 に特に重要であると思われる。

ＳＰＲにおける現象は周知であるので、詳述しない。ＳＰＲを生じる２種類の効 果が知られている。すなわち金属化された回折格子を伴うウッズ効果；およびク レッチマン効果であり、本発明はこれに関する。クレッチマン効果の考察につい ては欧州特許出願第３０５１０９号明細書が参照される。要約すると、光学的に 透明な材料、たとえばガラス、と金属薄膜との境界面から反射する単色面偏光（ 簡便にはレーザーから得られる）の強度は、金属の下流側にある最高数百ｎｍの 厚さの薄層状材料の屈折率に依存する。従って反射光の強度を測定することによ り、金属上にある材料の屈折率の変化についての指示を得ることができる。反射 光の強度は入射角によっても変化し、反射能は装置に特徴的な特定の角度におい て最小値にまで急激に低下する。金属表面は一般に銀製であるが、これは本発明 にとって決定的ではない。

表面プラズモン共鳴スペクトロメトリー（ＳＰＲ８）によるハプテンのイムノア ッセイには特定の問題がある。それはハプテンが必然的に低分子量であり、従っ てそれらが抗体被覆された５ＰＲ３銀被覆面に結合し、またはそれから解離した 場合にごくわずかな屈折率の変化を生じるにすぎないからである。この問題は国 際特許出願第ＧＢ８９１００１５６号明細書において取り組まれている。

この問題に対処する２方法が添付の図面の第１図に示される。１（ａ）において は、ハプテン１０または同族体が５ＰＲ３検出に用いられる銀表面１２に固定化 され、対応する抗体１４を結合させる。遊離ハプテン１６（その濃度を測定した い）が導入されると、表面結合ハブテンと競合することにより抗体を置換する。

この表面からの抗体の置換が５ＰＲ３信号として検出される。１（ｂ）において は、抗体１４が表面１２に結合し、ハプテン１０または同族体と、添加された遊 離ハブテンによるコンジュゲートの置換に際して有意の５ＰＲ８信号を与えるの に十分な分子量の（一般に）蛋白質２０とのコンジュゲート１８を結合させる。

しかしこの様式は必ずしも常に高感度ではない。本発明は感度を高める方法を提 供する。

欧州特許出願第２７６１４２号明細書には、ＳＰＲ信号を増強するために高い屈 折率をもつべくアッセイ試薬Ｘを選ぶＳＰＲアッセイ法が記載されている。そこ に記載されるシステムにおいては、ウッズ効果を利用してＳＰＲにより試薬Ｘの 沈着を探知する。

本発明は特異的結合ベアの１員である被分析体を、この特異的結合ペアの１員で ある第１試薬がそれに固定化した状態で保有された固体表面およびこの特異的結 合ペアの１員のコンジュゲートである第２試薬の使用によりアッセイする方法で あって、第１および第２試薬のうち少なくとも一方は被分析体の特異的結合パー トナ−であり、 該方法は、被分析体を含有する流体試料を第１および第２試薬と共に、同時に、 またはいずれか任意の順序でインキュベートし、これにより試料中の被分析体の 存在と関連する様式で固体表面にコンジュゲートを存在させることよりなり、固 体表面としては電磁線に対して透明な材料のブロックに付与された金属層が使用 され、該表面におけるコンジュゲートの存在が表面プラズモン共鳴スペクトロメ トリーによりアッセイされ、かつコンジュゲートが強いＳＰＲ信号を与えうるよ うに選ばれることを特徴とする 方法を提供する。

１形態においては、（ａ）第１試薬は被分析体の同族体であり、かつ第２試薬は 被分析体の特異的結合パートナ−のコンジュゲートであるか、または（ｂ）第１ 試薬は被分析体の特異的結合パートナ−であり、かつ第２試薬は被分析体の同族 体のコンジュゲートであり、 アッセイは被分析体と被分析体同族体との間で被分析体の特異的結合パートナ− との結合に対して競合させることにより行われ、これにより試料中の被分析体の 存在と関連する様式で固体表面にコンジュゲートを存在させる。

被分析体の同族体は、被分析体の特異的バインダーとの結合に対して被分析体と 競合する物質である。しばしば同族体は可能な限り被分析体に近似するか、また は完全に一致すべ（調整される。アッセイにおける被分析体の使用は周知である 。

好ましい様式においては、前工程として第２試薬を第１試薬に可逆的に結合させ る。試料を固体表面に接触させると、被分析体と被分析体同族体との間の競合に より第２試薬の一定割合が検出表面から置換され、この割合は試料中の被分析体 の濃度と正比例する。この第２試薬は強いＳＰＲ信号を与えつるように選ばれた コンジュゲートであるから、それが固体表面から置換されたことは５ＰＲ８によ って直ちにかつ正確に探知される。この様式の利点は、試料を固体表面と接触さ せることによりアッセイが簡単に実施され、他の試薬を必要としないことである 。

本発明の２形態を（ａ）および（ｂ）と表示した。（ａ）においては、固体表面 に固定化される第１試薬は被分析体の同族体、好ましくは適切なスペーサー分子 （一般に高分子、たとえば蛋白質）に保有される被分析体自身である。第２試薬 は被分析体の特異的結合パートナ−１最も一般的には被分析体に対する抗体、の コンジュゲートである。

（ｂ）においては、固体表面に固定化される第１試薬は被分析体の特異的結合パ ートナ−１一般的には被分析体に対する抗体である。その場合第２試薬は被分析 体または被分析体同族体のコンジュゲートである。

１方法においては、第２試薬は後記のようにそれ自身が強いＳＰＲ信号を与える 物質とのコンジュゲートである。

他の方法においては、第２試薬は被分析体と非反応性である異なる特異的結合ペ アの１員とのコンジュゲートである。この場合、アッセイはこの異なる特異的結 合ペアの他方の量子とそれ自身が強いＳＰＲ信号を与える物質とのコンプレック スを固体表面に接触させる追加工程を含む。異なる特異的ベアの例にはビオチン −アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジン系が含まれる。好ましくはビオ チンが第２試薬中に存在する。

この追加工程はアッセイの競合工程の途中または後に行われる。コンプレックス は固体表面と接触させる流体中に存在しつる。あるいはコンプレックスを流体試 料に装入することもできる。たとえば流体試料を２種類の固体表面上で効果的に 流動させ、それらのうち第１が可溶性の形のコンプレックスを保有し、第２はＳ ＰＲ検出表面である。

この物質は高い屈折率をもつものであってもよい。これは高い屈折率をもつか、 または大型の分子または粒子であって、全体として試薬に対しより高い屈折率を 付与し、従って修飾されていない分子の場合より高いＳＰＲ信号を生じるもので あってもよい。使用しつる物質には重質の物質（たとえば金属イオンまたは比較 的高級のハロゲン）、高度に電子非局在化した物質種（たとえば多環式芳香族化 合物または色素）、金属もしくは金属酸化物粒子、たとえばチタニア粒子、また は高屈折率の有機化合動程、たとえばフェリチンが含まれる。

あるいはこの物質は低い屈折率、すなわち固体表面に近接する雰囲気のものより 低い屈折率をもつものであってもよい。

あるいはこの物質は固体表面に析出する反応生成物を産生ずる反応を触媒させる 酵素であってもよい。酵素の作用により生じる反応生成物は金属表面上に、また はこれに著しく近接して（すなわち数百ナノメーター以下の薄層内に）固定化さ れる必要がある。反応生成物はその薄層内に存在する物質より高いかまたは低い 屈折率をもつ。適切な酵素の例は以下のものであるニーａ）Ｈ２Ｏ２およびジア ミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質とするペルオキシダーゼ。

後者は不溶性生成物に転化される。

ｂ）ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈおよびテトラゾリウム塩を特徴とする特定のオキシドレダ クターゼ。後者は不溶性生成物（フォルマザン）に転化される。他の還元体と色 素の組み合わせもある。（参照、アルドマン（Ｆ　Ｐ　Ａｌ　ｔｍａｎｎ）。

１９７２、’定量的酵素細胞化学におけるテトラゾリウム塩の使用の導入′、コ ツホ・ライト・ラボラトリーズ、コーンプルツク、パックス、英国）Ｃ）ある種 のカタラーゼ酵素は気体を発生し、その気泡を固体表面に近接して保持しうるこ とが知られている。

第２試薬が特異的結合ペアの１員と酵素とのコンジュゲートである場合、アッセ イはサンドイッチアッセイ形式で行うのが好都合である。この場合、第１および 第２試薬の双方が被分析体の特異的結合パートナ−（すなわち被分析体が抗原ま たはハブテンである場合は抗体）である。これは、必然的に競合アッセイ形式で 行われる前記の置換アッセイ法と対照的である。

この方法により行われるアッセイは定性的、すなわち試料中の被分析体の存否を 検出するためだけであってもよ（、または定量的であってもよい。定量的アッセ イに関しては、反射能の変化率および／または特定の時点における絶対反射能も よいが、たとえば流体媒質を金属表面を横切って流動させることにより動的とな すことがより好ましい。

被分析体の性質は決定的ではない。しかし前記の理由から被分析体がＩ＼ブテン である場合に本発明は特に有用である。第１試薬は金属表面、たとえば銀層上に 、常法により、たとえば共有結合または単に物理的吸着により固定化することが できる。ビオチニル化された試薬はストレプトアビジンが結合した金属表面に固 定化することができる。実際に固定化はＤＮＡ／ＤＮＡまたは抗体／抗原を含め たいかなる結合ベアを伴うものであってもよい。

本発明の詳細な説明する添付の図面の第１Ｉ、ＩＩＩおよびＩＶ図について述べ る。これらにおいて： 第１Ｉ図は１形態を示す２反応図からなり；第１ＩＩ図は他の形態を示す反応図 であり、そして第１Ｖ図は酵素を用いた場合の固体表面の最終状態を示す。

第１Ｉ図（ａ）は試料中の被分析体に関するアッセイの予備工程を示す。開始時 には被分析体の同族体２２が銀層２８に不可逆的に結合し、抗体コンジュゲート ２４がこの同族体に可逆的に結合する。

第１Ｉ図（ｂ）は同様な様式を示す。開始時には被分析体に対する抗体２６が銀 層２８に不可逆的に結合し、被分析体同族体コンジュゲート３０が抗体に可逆的 に結合する。

両系とも同様に作動する。被分析体３４を含有する試料３２を添加すると、コン ジュゲート分子の一定割合が銀層から置換され、この割合は試料中の被分析体の 濃度に正比例する。

第１ＩＩ図は２工程アツセイ法を示す。開始時には被分析体に対する抗体３６が 銀層３８に不可逆的に結合し、被分析体同族体４０とビオチン４２とのコンジュ ゲートが抗体に可逆的に結合する。被分析体４６を含有する試料４４を添加する と、コンジュゲート分子の一定割合が銀層から置換され、この割合は試料中の被 分析体の濃度に正比例する。

次いでストレプトアビジン５０とＨＲＰ酵素５２のコンプレックスを含有する流 体４８を銀層と接触させる。ストレプトアビジンは試料中の被分析体の濃度に反 比例する量でビオチンに結合する。

アッセイの最終工程を第１Ｖ図に示す。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）および過 酸化水素（Ｈ，Ｏ，）を銀層と接触させると、ＨＲＰ酵素がそれらの間の反応を 触媒して不溶性生成物を形成させ、これが銀層３８に隣接して蓄積し、容易に探 知される強いＳＰＲ信号を発生する。

ＨＲＰ酵素５２の代わりに前記のように高屈折率の物質、たとえばフェリチンま たはチタニア粒子を用いることができる。

他の形態においては、酵素を不活性な形で固体表面に不可逆的に結合させること ができる。流体試料を固体表面と接触させると、試料中の被分析体が酵素を活性 化し、次いでこれが第４図に示す様式で用いられ、ＳＰＲ信号を発生する。こう して被分析体により活性化される酵素は、それ自体が不溶性生成物を形成するも のであってもよく：またはこのような酵素の基質を形成するものであってもよい 。

以下の実施例は本発明を説明するものである。

実施例１および２のそれぞれにおいては、被分析体はヒト免疫グロブリンであり 、サンドイッチアッセイ形式が採用される。銀表面に固定化される第１試薬は抗 −ヒト免疫グロブリン抗体である。第２試薬は（抗−ヒト免疫グロブリン抗体） −酵素コンジュゲートである。第１工程においては、被分析体を含有する試料を 銀表面と接触させると、これにより被分析体は固定化された第１試薬（過剰に存 在する）と結合する。

第２工程においては、第２試薬の溶液を銀表面と接触させると、これにより第２ 試薬は試料中の被分析体の量に正比例する量で固体表面に結合する。これにより わずかではあるが測定可能な５ＰＲＰ信号が発生する。信号を増幅するためには 、酵素の基質を供給して不溶性反応生成物を銀表面に析出させる。

実施例１および２において、第１工程が行われたと思われる時点で、第２試薬を 銀表面に直接付与することにより第２工程が行われる。これらの実施例に示す第 ２工程が本方法に重要である。

実施例１ 抗−ヒト免疫グロブリン−β　ガラクトシダーゼコンジュゲートを１０ｍＭリン 酸ナトリウム、ｐＨ７，４、中に希釈して３６ｎＭとなし、１ｍｌを銀スライド 上に８μｌ／秒でポンプ輸送した。コンジュゲートの結合に際してＳＰＲが起こ る角度のシフト（反射能の変化）を探知した。次いで３ｍｌの１９ｍＭリン酸ナ トリウム、ｐＨ７，４、を手動でスライドに注入して表面を洗浄した。

１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，３ｍＭ　ＭｇＣｌ２中のヒツジ免疫グ ロブリンのブロック（２μＭ、１ｍ１）をスライドに注入し、次いで３ｍｌの１ ０ｍＭリン酸ナトリウム　ｐＨ７，４，３ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２，０，５％　Ｂ ＳＡで洗浄した。次いで１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，４、中に希釈して０． 　４ｍＭとなした基質溶液（ＶＬＭ、ＰＰＲダイアグノスティックスより、キン ゲス・カレッジ、ロンドン）をスライド上に３μｍ／秒で導通し、反射能の変化 を経時的に探知した。次いで３ｍｌの１９ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４、 による洗浄工程を行った。

２実験の結果を後記の表に示す。基質の添加に際して少なくとも５倍の信号増強 が生じた。

１０ｍＭ）リス／ＨＣＩ　ｐＨ９，５，３ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２（希釈用緩衝 液）中に希釈して０．１２５ｎＭおよび６０ｐＭとなした抗−ヒト免疫グロブリ ン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを、銀スライド上に４μｍ／秒で導 通し、反射能の変化を探知した。これと同じ緩衝液３ｍｌで洗浄したのち、スラ イドを１０ｍＭトリス／ＨＣＩ　ｐＨ９，５，３ｍＭ　Ｍｇ（ｌｘ中の２μＭヒ ツジ免疫グロブリンでブロックした（１ｍ１手動で注入）。さらに洗浄工程（３ ｍｌの希釈用緩衝液）を実施し、次いで基質溶液（３，３ｍｇ／ｍｌニトロブル ーテトラゾリウム、１．６５ｍｇ／ｍｌ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インド イルホスフェート、希釈用緩衝液中）をスライド上に３μｌ／秒で導通した。反 射能の変化を経時的に探知した。

次表にそれぞれ０．１２５ｎＭおよび６０ｐＭ抗−ヒト免疫グロブリンーアルカ リホスファターゼコンジュゲートに関する結果を示す。酵素基質の添加によりア ッセイの感度が有意に上昇する。

反射能の最終的変化（％） 酵素コンジュゲート　酵素基質 の結合　の添加 実施例１ ３６ｎＭ　β−ガラクトシダーゼ−７３７抗−ヒト免疫グロブリン 実施例２ ０．１２５ｎＭ　抗−ヒト 免疫グロブリン　４　５１ −アルカリホスファターゼ ６０ｐＭ　抗−ヒト 免疫グロブリン　２．２　２８ −アルカリホスフェート 実施例３ 屈折率プローブを用いるヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）の置換アッ セイ １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４（緩衝液１）を銀スライド上にポ ンプ輸送し、ＳＰＲ角度の変化を探知した。次いで緩衝液１中に希釈した１６６ ｎＭヒト免疫グロブリンーＨＣＧコンジュゲートを銀表面に８μｍ／秒でポンプ 輸送することにより表面に結合させた。緩衝液１による洗浄工程ののち、０゜５ ％ウシ血清アルブミンを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７゜４ （緩衝液２）中に希釈した２μＭヒツジ免疫グロブリンを銀スライドに手動で注 入することにより、銀表面をブロックした。次いでマウス抗−ＨＣＧモノクロー ナル抗体−一溶液中に遊離したもの、または５５ｎｍポリスチレン屈折率プロー ブに結合させたもの（感度の上昇）−一を、予め固定化されたＨＣＧコンジュゲ ートに、緩衝液２中に希釈した１１００ｎ抗−ＨＣＧ抗体溶液の銀スライド上へ のポンプ輸送により結合させた。次いで銀スライドを緩衝液２で洗浄した。次い で緩衝液２中に希釈した１μＭＨＣＧを添加し、銀表面からの抗−ＨＣＧ抗体の 置換をＳＰＨにより観察した。次表に示すように、抗−ＨＣＧ抗体を５５ｎｍポ リスチレン屈折率プローブに結合させた場合の方が、置換速度およびＳＰＲ角度 シフトの最終変化が共に大きい。

屈折率プローブ上に ＳＰＲ固定化された　抗−ＨＣＧ ★　秒当たりの反射能の変化 ★★アッセイ終了時の反射能の変化 夛 牟 種−督　・ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　３年　９月！０日　０句

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．特異的結合ペアの１員である被分析体を、この特異的結合ペアの１員である 第１試薬がそれに固定化した状態で保有された固体表面およびこの特異的結合ペ アの１員のコンジュゲートである第２試薬の使用によりアッセイする方法であっ て、第１および第２試薬のうち少なくとも一方は被分析体の特異的結合パートナ ーであり、 該方法は、被分析体を含有する流体試料を第１および第２試薬と共に、同時に、 またはいずれか任意の順序でインキユベートし、これにより試料中の被分析体の 存在と関連する様式で固体表面にコンジュゲートを存在させることよりなり、固 体表面としては電磁線に対して透明である材料のブロックに付与された金属層が 使用され、該表面におけるコンジュゲートの存在が表面プラズモン共鳴スペクト ロメトリーによりアッセイされ、かつコンジュゲートが強いＳＰＲ信号を与えう るように選ばれることを特徴とする方法。
2. ２．（ａ）第１試薬が被分析体の同族体であり、かつ第２試薬が被分析体の特異 的結合パートナーのコンジュゲートであるか、または（ｂ）第１試薬が被分析体 の特異的結合パートナーであり、かつ第２試薬が被分析体の同族体のコンジュゲ ートであり、インキユベーション工程が被分析体と被分析体同族体との間で被分 析体の特異的結合パートナーとの結合に対して競合させるべく行われる、請求の 範囲第１項に記載の方法。
3. ３．コンジュゲートが強いＳＰＲ信号を与える物質とのものである、請求の範囲 第１項または第２項に記載の方法。
4. ４．コンジュゲートが被分析体と非反応性である異なる特異的結合ペアの１員と のものであり、アッセイがこの異なる特異的結合ペアの他方の表子と強いＳＰＲ 信号を与える物質とのコンプレックスを固体表面に接触させる追加工程を含む、 請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
5. ５．物質が高い屈折率を有するものである、請求の範囲第３項または第４項に記 載の方法。
6. ６．第２試薬が特異的結合ペアの１員と酵素とのコンジュゲートであり、該酵素 に固体表面に析出する反応生成物を産生する反応を触媒させる、請求の範囲第１ 項または第２項に記載の方法。
7. ７．第２試薬を第１試薬に可逆的に結合させ、次いで試料を固体表面と接触させ 、これにより試料中の被分析体の濃度と正比例する割合の第２試薬が検出表面か ら置換される、請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の方法。
8. ８．サンドイッチアッセイ形式を採用する、請求の範囲第６項に記載の方法。
9. ９．被分析体がハプテンである、請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかに記 載の方法。