JPH04506604A - 繊維芽細胞成長因子のための受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 繊維芽細胞成長因子のための受容体 本出願は、１９８９年７月６日に出願された通常の譲渡された特許出願Ｕ、　Ｓ 、　Ｓ、　Ｎ、　０７／３７７、００３号の一部継続出願であり、これは、引用 により本明細書に組込まれる。

本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　。

ｆ　Ｈｅａｌｔｈにより与えられた譲渡契約書第ＨＬ−０７１９２号及び譲渡証 ＲＯＩ　ＨＬ−３２８９８及びＰＯＩＨＬ−４３８２１−０１号下で政府の支持 により一部製造された。政府は、本発明において一定の権力を有する。

発明の分野 本発明は、成長因子のための受容体、特に繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−Ｒ）に 関する。より詳しくは、それは、種々の精製された繊維芽細胞成長因子受容体タ ンパク質、前記受容体タンパク質をコードする核酸、精製されたＦＧＦ−Ｒタン パク質の生成のための方法、これらの方法により製造されたタンパク質、これら のタンパク質に対する抗体及びこれらの種々の試薬の診断及び治療への使用を提 供する。

発明の背景 ポリペプチド成長因子は、形質膜に位置する受容体に特異的に結合することによ って、細胞上で作用するマイトジェンである。これらの受容体は通常、３種の主 な同定可能領域を有する。第１番目は、ポリペプチド成長因子を結合するドメイ ン（すなわちリガンド結合ドメイン）を含む細胞外領域である。第２番目の領域 はトランスメンプラン領域であり、そして第３番目は細胞内領域である。これら の受容体の多くは、細胞内領域にチロシンキナーゼドメインを含む。

繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦ−Ｒ）タンパク質は、関連する成長因子リガ ンドの種類、すなわち繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の種類に結合する。この成 長因子の種類は、アミノ酸配列により相同性、ヘパリン結合活性、脈管形成を促 進する能力及び上皮、間葉及び神経超厚の細胞に対するマイトジェン活性により 特徴づけられる。

ＦＧＦの種類は、次の７種の既知ＦＧＦを包含する＝（１，２）酸性ＦＧＦ　（ ａＦＧＦ＞及び塩基性ＦＧＦ　（ｂｌ、Ｂｉｏｌ、、８：３４８７　（１９８８ ））；（６）表皮ケラチン細胞成長因子（Ｊ、Ｓ、Ｒａｂｉｎなど、、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８６　：　８０２　（１９８９） ）；及び（７）　ＦＧＦ−６（１，Ｍａ　ｒ　ｉ　ｃ　ｓ、など１．Ｏｎｃ。

ｇｅｎｅ　３：３３５（１９８９））。

酸性及び塩基性ＦＧＦの作用は、約１４５及び１２５　ｋＤａの高い親和性細胞 表面受容体への結合を通して仲介される（Ｇ、Ｎｅｕｆｅｌｄ　ａｎｄ　Ｄ、Ｇ ｏｓｐｏｄａｒｏｗＩｍａｍｕｒａなど、、”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　。

ｆ　Ｂａ５ｉｃ　ＦＧＦ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｒｏｍＲａｔ　Ｂｒａｉｎ、 ”Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１５５：５８３（１９８８年９月１５ 日）の引例は、ラット脳からの塩基性ＦＧＦ受容体（ｂＦＧＦ−Ｒ）の層量での 精製を開示する。

多くの成長因子受容体をコードする遺伝子は分子的にクローン化されて来たが（ たとえばマウスＦＤＣＦ受容体、Ｙａｒｄｅｎなど、、Ｎａｔｕｒｅ、３２３： ２２６　（１９８６））、繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦ−Ｒ）をコードす るクローンはこれまで同定されていない。λｇｔｌｌｃＤＮＡ発現ライブラリー をスクリーンするために抗ホスホチロシン抗体を用いて、ｂｅＫ　（細菌性発現 キナーゼ）として命名された、新規チロシンキナーゼ遺伝子をコードする２、５ キロ塩基のｃＤＮＡが、マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーから単離された。

（Ｓ、Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈなど、、”Ｎｏｖｅｌ　Ｔｙｒ。

５ｉｎｅ　１ｃｉｎａｓｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙＰｈｏｓｐｈｏｔｙｒ ｏｓｉｎｏ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂ ｒａｒｉｅｓ”。

して従って、成長因子受容体として同定され得なかった。ＬＩｇ　（ｆｍｓ一様 遺伝子）として命名されるもう１つのタンパク質チロシンキナーゼ遺伝子が、ｖ 　−ｆ　ｍ　ｓ腫瘍遺伝子による緩和された緊縮下でのハイブリダイゼーション によりヒト内皮細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離された。（Ｍ、Ｒｕｔａなど 、、＝Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｇ ｅｎｅ　Ｗｈｏｓｅ　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎらＭｏｄｕｌａｔｅｄ　Ｄｕｒｉｎ ｇ　Ｅｎｄｏｔｈｅ］ｉａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”、 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、３　：　９　（１９８８））。これらの業者は、それらの単 離された配列にトランスメンプラン領域を同定しておらず、そして従って、ｆｌ ｇが細胞質チロシンキナーゼをコードすることが仮定された。

本発明の精製され且つクローン化されたニワト１ＪｂＦＧＦ及びヒトｂＦＧＦ受 容体は、単離された領域においてｂｅｋであり、そしてＦＧＦ結合受容体として のそれら機能の認識は存在しなかった。さらに、従来の報告は、本発明に記載さ れる多くの構造的且つ機能的特徴を認識しなかった。

ＦＧＦ種類のメンバーは、組織成長、組織修復、ニューロンの維持及び疾病の病 因に役割を有するように思われる。ＦＧＦの異常な発現は、自己分泌機構による 細胞形質転換を引き起こす。さらに、ＦＧＦは、腫瘍における血管成長を刺激す ることによって又はタンパク質、たとえばプラスミノーゲン活性化因子の生成を 誘発することによって、腫瘍増殖及び侵入を増強することができる。しかしなが ら、包含される成分の同定及び包含される機構及び相互作用の理解は、はとんど 不完全なまま残っている。

精製されたＦＧＦ受容体及びフラグメント、及び定義されたＦＧＦ受容体及び同 定されたフラグメント（たとえばリガンド結合ドメイン）をコードする単離され たＤＮＡ配列は、繊維芽細胞成長因子機能の理解をひじょうに早めるであろう。

ＦＧＦ受容体の特定の及び定義された領域に対する抗体がまた利用できるように なった。これらの試薬は、前記方法での診断的及び治療的に使用されるであろう 。本発明は、これらの及び他の必要性を満たす。

発明の要約 本発明は、精製された繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦ−Ｒ）タンパク質、Ｆ ＧＦ−Ｒタンパク質をコ・−ドする核酸、精製されたＦＧＦ−Ｒタンパク質の生 成方法、これらの方法により製造された精製タンパク質、これらのタンパク質及 びフラグメントに対する抗体及びこれらの試薬の診断的且つ治療的使用を提供す る。特に、本発明は、通常でない受容体構造を示す受容体の可溶性且つ分泌形を 提供する。

本発明は、繊維芽細胞成長因子受容体に結合する繊維芽細胞成長因子を阻害する のに有効な繊維芽細胞成長因子受容体阻止剤の量を患者に投与することを含んで 成る、繊維芽細胞成長因子受容体調節活性をインビボで変性するための方法を提 供する。典型的には、その阻止剤は、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体のフラグメ ント、たとえば：ａ）第３又は４図におけるＤＮＡ配列；ｂ）第３，４又は５図 のポリペプチドをコードする配列；及び Ｃ）第３又は４図の配列に実質的に相同な配列から成る群から選択された配列の 少なくとも約１５個の塩基を含む核酸により形質転換された細胞に生成されるフ ラグメントであろう。そのフラグメントは、しばしば、チロシンキナーゼ領域を 有さない繊維芽細胞成長因子受容体細胞外ドメインであろう。

他方、繊維芽細胞成長因子と溶液中の繊維芽細胞成長因子受容体との間の結合を 阻害するための方法が提供される。この方法は、繊維芽細胞成長因子及び繊維芽 細胞成長因子受容体、通常、生来の繊維芽細胞成長因子受容体を含む溶液又は媒 体に、ＦＧＦ−Ｒペプチド、たとえば第３．４又は７図に記載される配列に配列 上相同のペプチドを組合す段階を含むであろう。そのような方法は、ラベルされ たＦＧＦ−Ｒペプチドを用いた後、アッセイ方法においてインビトロで有用でヒ トＦＧＦ−Ｒ細胞外ドメインからの約２００〜５００の隣接するアミノ酸を有す る可溶性ＦＧＦ−Ｒポリペプチドを含む組成物が記載される。１つの態様におい て、前記ポリペプチドは、第７図のヒト繊維芽細胞成長因子受容体の残基１〜２ ８７からの少なくとも約８０個のアミノ酸又はＩｇｌｌ又はＩ　ｇ　ＩＩＩ　ド メイン、又は両者を含む。もう１つの態様において、１ｇｌｌドメインは、第７ 図のヒト配列の残基８５〜１４１からの約７個の隣接するアミノ酸を有し、又は 第７図の可溶性ヒトタンパク質の残基２２２〜３００からの７９個のアミノ酸配 列に実質的に相同のカルボキシ末端配列を含むことができる。特に好ましいポリ ペプチドは、ｈ４又はｈ５配列から実質的になる（第７図）。

本発明の追加の観点は、繊維芽細胞成長因子結合ドメインを含んで成る約８５ｋ Ｏａ以下の実質的に純粋なポリペプチドを含む繊維芽細胞成長因子受容体組成物 である。そのポリペプチドは可溶性であり、又は特に、シグナルセグメント、■ ｇＩセグメント、酸性セグメント、Ｉｇ１１セグメント、ＩｇＩＩＩセグメント 、ＩｇｌｌＩＴセグメント又はトランスメンプランセグメントを有することがで きる。好ましい態様は、第３゜４又は７図に記載される配列に相同であり、又は 両Ｉｇｌｌ及びＩｇｌｌｌ　ドメインの個々の少なくとも約３０個のアミノ酸を 含むであろう。そのポリペプチドは、タンパク質の複数鎖複合体における１つの ポリペプチド鎖であり得る。ニワトリ繊維芽細胞成長因子受容体は１つの好まし い態様である。

本発明は、細胞内ドメインを実質的に欠くヒト繊維芽細胞成長因子受容体タンパ ク質をコードする単離された核酸を包含する。そのような核酸は通常、第７図に 記載されるＩｇＩＩドメインに相同の配列を示し、又は実質的に完全な長さの１ ｇｌｌドメインを含むことができる。核酸は通常また、シグナルセグメント、Ｉ ｇＩセグメント、酸性セグメント、ＩｇｌｌＩセグメント、ＩｇｌｌｌＴセグメ ント、トランスメブランセグメント、又はチロシンキナーゼセグメントを有し、 そして好ましくは、第３，４又は９図に記載される配列に対応するであろう。特 に好ましい態様は、ヒト生来の受容体をコードする核酸である。その核酸は、転 写プロモーター配列に操作可能的に結合され、そしてさらに、組換えＦＧＦ−Ｒ ペプチドの生成のために適切な発現ベクター中に組込まれ得る。

また、可溶性ヒト繊維芽細胞成長因子受容体、好ましくはｈ４又はｈ５に相同の 受容体をコードする単離された核酸が包含される。そのような単離された核酸を 発現することによって製造されたタンパク質生成物が供給される。

新しく認識された利用性、たとえば繊維芽細胞成長因子受容体活性のこれらのタ ンパク質を製造するための方法が提供され、ここで前記方法は、単離された核酸 を発現することを含んで成る。この方法により生成された生成物はまた、現在利 用可能である。

ａ）第３，４又は９図におけるＤＮＡ配列；ｂ）第３．４又は７図のポリペプチ ドをコードする配列；及び Ｃ）第３，４又９図の配列に実質的に相同の配列から成る群から選択された配列 の少なくとも２１個の塩基の核酸により細胞を形質転換することによって繊維芽 細胞成長因子受容体ペプチドを製造するための追加の方法が提供される。

第３．４又は７図に記載される少なくとも６個の隣接するアミノ酸の配列に相同 のポリベブチドエピトープに対する抗体を製造する段階を含んで成る、繊維芽細 胞成長因子受容体フラグメントに対する抗体を製造するための他の方法が記載さ れる。最っとも興味あるエピトープは、シグナルセグメント、ＩｇＩセグメント 、酸性セグメント、Ｉｇｌｌセグメント、Ｉｇｌｌｌセグメント、又はＩｇｌｌ ｌＴセグメントからのものであろう。

診断用使用として、これらの試薬は、標的サンプルにおける繊維芽細胞成長因子 又は繊維芽細胞成長因子受容体を測定するための方法を提供し、前記方法は、繊 維芽細胞成長因子受容体セグメントと前記標的サンプルとを組合し；そして 前記セグメントと前記サンプルとの間の結合の程度を決定することを含んで成る 。

本発明はまた、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体の少なくとも一部に相同のポリペ プチドを発現することができる形質転換された細胞を提供する。好ましい態様は 、細胞が、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体の完全な膜結合又は可溶性形に実質的 に相同のポリペプチドを発現することである。

図面の簡単な説明 第１図は、ＦＧＦの種々の誘導体のＦＧＦ−Ｒへの結合を比較する。第１　（Ａ ）図は、１′Ｉ−ラベルｂＦＧＦの％結合阻害率を示すグラフである。第１　（ Ｂ）図は、ゲル電気泳動にかけられたｂＦＧＦ架橋されたＳｗｉ　ｓ　ｓ　３Ｔ ３細胞のオートラジオグラフである。

第２　（Ａ）図は、ゲル電気泳動にかけられた架橋ニワトリ膜両分及びＷＧＡ溶 出液のオートラジオグラフである。第２（Ｂ）図は、第２（Ａ）図に示されるＷ ＧＡ−３ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｒｏｓｅ４Ｂカラムニワトリ胚溶出液に対して行なわ れたアフィニティー精製に起因する純粋なＦＧＦ受容体を示す銀染色ゲルである 。

第３図は、ニワトリｂＦＧＦ受容体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。

第４図は、ヒトＦＧＦ受容体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。

第５（Ａ）図は、高い緊縮条件下で完全な長さのｃ　ＤＮＡニワトリｂＦＧＦ受 容体によりプローブされたニワトリＲＮＡのノザンプロットのオートラジオグラ フを示す。第５　（Ｂ）図は、アクリルアミド配列決定ゲル上での電気泳動にか けられたニワトリｒｎＲＮＡのプライマー波長のオートラジオグラフを示す。

第６図は、酸性ドメイン（黒くぬられたブロック）；トランスメンプラン領域（ 斜線のブロック）；チトロシキナーゼドメイン（斑点のブロック）；ＳＨシステ ィン残基の位置（第１表のＳに対する）（Ｓ）；Ｉｇ様ドメインにおける最初の システィン残基に関してのトリプトファン残基の位置（Ｗ）を示すニワ）ｌＪｂ ＦＧＦ受容体の図である。

第７図は、種々の異なったＦＧＦ受容体形のアミノ酸配列比較を提供する。４種 のヒト受容体形のアミノ酸配列が、ニワトリＦＧＦ受容体配列に比較して示され る。ニワトリＦＧド受容体配列と異なる配列は、四角で示されている。トランス メンプラン配列は下線が引かれている。これらのＤＮＡ配列は、次の取得番号下 でＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースに存在する：ｈ２はＭ３４．１８５で あり、ｈ３はＭ３４１８６であり、ｈ４はＭ３４１８７であり、そしてＭ５はＭ ３４１８８である。

第８図は、種々の異なったＦＧＦ受容体の代表的な図を示す。次の構造的な特徴 が同定される：推定上の疎水性シグナル配列（黒くぬられたブロック）、高い酸 性の領域（空白のブロック）、トランスメンブランドメイン（斜線のブロック） 、キナーゼ１及びキナーゼ２ドメイン（斜線のブロック）、及びｈ　４／ｈ　５ の分岐領域（ジグザグの線）。星印は、ｈ２及びｈ４が配列ＡｒｇＭｅｔを含み 、ニワトリ受容体が単一のＡｓｎ残基を含み、そしてｈ３及びｈ５が対応する残 基を含まない位置を示す。三角は、ｈ３がＧｌｕ残基を含み、そしてすべての他 の受容体形がＬｙｓ残基を含む位置を示す。図の上部での数字は、ｈ２ヒト受容 体の類似するドメインとニワ）　ＩＪ受容体との間でのアミノ酸の同一性の程度 を示す。

第９図は、ＦＧＦ受容体ｃＤＮＡクローンの推定上のアミノ酸配列と種々のヒト ＦＧＦ受容体ゲノム配列との比較を示す。ＰＣＲにより得られたヒトゲノムフラ グメントの配列は、ヒト及びニワトリｃＤＮＡ配列に比較して示されている。１ ｋｂのイントロンは、Ｉｇ一様（Ｉｇ）　ドメイン及び高い酸性の領域をコード するゲノム配列を分離する。点線は、ギヤ・ツブを有さない連続した配列を示す 。ニワトＩＪＦＧＦ受容体のために示される推定上のアミノ酸配列は開始メチオ ニン残基（１）から始まり、そして酸性領域（ＥＤＤＤＤＥＤＤ；　ｃＩ　ＦＧ Ｆ−Ｒにおけるアミノ酸１２５〜１３２）で終わる。

ヒ１−ｈ２ＦＧＦ受容体のために示されるアミノ酸配列は、開始メチオニン残基 （１）から始まり、そして酸性領域（ＥＤＤＤＤＤＤＤ　；　ｈ２におけるアミ ノ酸３７〜４４）で終わる。

第１０図は、ＦＧＦ受容体ｃＤＮＡによりトランスフェクトされた細胞における 受容体への酸性又は塩基性ＦＧＦの架橋を示す。ｃＦＧＦＲ／ｐＳＶ７ｄ発現構 造体くレーン１゜２．７、及び８）　、ｈ２ＦＧＦＲ／ｐＳＶ７ｄ発現構造体（ レーン３．　４．　９、及び１０）、又はベクターのみ（レーン５，６．１１、 及び１２）によりトランスフェクトされたＬ６細胞（５Ｘ１．０５）が、２００ 倍過剰のラベルされていないａＦＧＦ　（レーン２，４、及び６）又はｂＦＧＦ 　（レーン８，１０、及び１２）の存在又は不在下で、０．１ピコモルの”５ｌ −ａＦＧＦ　（レーン１−６）又は”’Ｉ−ｂＦＧＦ（レーン７−１２）と共に インキュベートされた。結合は、３７℃で３０分間行なわれた。次に、細胞は、 ２０ｍＭのＨＭＥ　Ｈ２１により２度及び水冷却のＰＢＳにより２度洗浄された 。ジスクシンイミジル　スベレ−１−（ＤＳＳ＞が添加され、０．１５ｍＭの最 終濃度にされ、そして架橋が４℃で１５分間進行せしめられた。サンプルがサン プル緩衝液に再懸濁され、次にＳＤＳ　ＰＡＧＥ、次にオートラジオグラフィー にかけられた。

第１１図は、ニワトリＦＧＦ受容体又はｈ２ヒ）ＦＧＦ受容体をコードするＲＮ Ａにより注入されたアフリカッメガエルの卵母細胞からの”Ｃａ　２＋流出の酸 性及び塩基性ＦＧＦ誘発を示す。グラフは、ニヮＩ−ＩＪＦＧＦ受容体ＲＮＡ　 （Ａ及びＣ１空白の四角）、ヒトｈ２ＲＮＡ（Ｂ及びＤ、空白の四角）、ヒＩ− ｈ３ＲＮＡ（Ｂ及びＤ１黒くぬられた三角）又は水（Ａ−Ｄ、黒くぬられた四角 ）により注入された卵母細胞からの４ＳＣａ２４流出を示す。注入された卵母細 胞は、１９℃で３時間”Ｃａ　Ｃ１□と共にインキュベートされ、そして次に、 集中的に洗浄された。５個の卵母細胞のグループを、２４個のウェルプレートの 個々のウェルに配置し、そして媒体０．　５−を添加した。１０分間隔で、媒体 を計数のために取り出し、そして新鮮な媒体を添加した。４０分後、ａＦＧＦ　 （パネルＡ及びＢ）　又ｉｂ！　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（パネルｃ及びＤ）を添加し 、０゜５ｎＭの最終濃度にした。陽性の対照として、１００分後、カルバコール を添加した。個々のデータ点は、３個のウェルの平均を示す。

特表平４−５０６６０４　（６） 好ましい態様の詳細な説明 概略 ■、一般的な説明 Ａ、ＦＧＦ−Ｒ １、構造的な特徴 ａ、細胞外ドメイン ｉ、シグナル配列 ｉｉ、１ｇドメイン ｉｉｉ、酸性アミノ酸領域 す、トランスメンプランセグメント Ｃ０細胞内ドメイン ｉ、チロシンキナーゼ ｉｉ、挿入体 ２、機能 ａ、ＦＧＦを結合する す、ＦＧＦ−Ｒペプチドに結合する Ｃ、チロシンキナーゼ活性 Ａ、生理学的機能 １、細胞性 ２゜組織分化 ３、生物性 １１、ポリペプチド Ａ、可溶性形 Ｂ、切断された形 Ｃ１融合タンパク質 り、遺伝的変異体く特定部位突然変異誘発）Ｅ、タンパク質を含む組成物 ＩＩＩ。核酸 Ａ、単離された核酸 Ｂ１組換え核酸 Ｃ０核酸を含む組成物 ＩＶ、ＦＧＦ−Ｒを製造するための方法Ａ、タンパク質精製 １ｏ　誘導体化されたＦＧＦとの親和性２、種々のリガンド、同じ受容体 Ｂ、核酸の発現 ■、抗体 Ｖｌ、使用方法 Ａ１診断 Ｂ、治療 ■、一般的な説明 本発明の第１の観点は、均質ＦＧＦ−Ｒペプチドに関する。これらの均質ＦＧＦ −Ｒは、ニワトリ塩基性繊維芽細胞成長因子受容体及び種々のヒト繊維芽細胞成 長因子受容体を包含する。ＦＧＦ−ＲＩＪガント結合結合活性石か又はＦＧＦ− Ｒのリガンド結合ドメインの一部を含んで成る均質ポリペプチドが記載される。

特に、本発明は、予測されない構造特徴を有する天然に存在するＦＧＦ結合タン パク質に対応する均質ポリペプチドを提供する。１つの種類は、トランスメンプ ランセグメントを欠く可溶性ダンバク質を提供し、もう１つの種類は、トランス メンプランセグメント及びチロシンキナーゼドメインの両者を有するタンパク質 を提供する。これらの両種類は、その対応するニワトリＦＧＦ−Ｒよりも短い予 測できない細胞外ドメイン構造を有する。単一の受容体が種々のＦＧＦタイプを 結合することを示す実験データがまた記載されている。

本発明の第２の観点は、単離されたＤＮＡ配列に関する。

これらの配列は、Ｆ　Ｇ　Ｆ　−ＲＵガント結合活性を有するポリペプチド、た とえば天然に存在する完全な長さの繊維芽細胞成長因子受容体に対応するポリペ プチドをコードする。ニワトリｂＦＧＦ−Ｒ又は種々のヒトＦＧＦ−Ｒ（ｈＦＧ Ｆ−Ｒ）をコードするＤＮＡ配列が単離された。また、クローニング及びＦＧＦ −Ｒコード配列を含む発現ビークルが提供される。

完全な長さのＦＧＦ受容体又はＦＧＦ−Ｒポリペプチドフラグメントをコードす るＤＮＡ配列は、対照配列に操作可能的に結合され、そして適合性の形質転換さ れ、トランスフェクトされ又は感染された宿主細胞の培養物に発現され得る。

成長因子受容体タンパク質の合成方法及び繊維芽細胞成長因子受容体の相同体の 供給方法が提供される。

本発明はまた、受容体の定義されたドメインに対する抗体を提供する。さらにも う１つの本発明の観点は、リガンド及び受容体の相互作用に対して作用性であり 又は拮抗性である組成物、特に結合相互作用を促進し、又は阻害するものを評価 するための方法を包含する。

本発明で供給される試薬のための診断的及び治療的使用もまた記載される。

Ａ、ＦＧＦ受容体 繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦ−Ｒ）は、上記のような繊維芽細胞成長因子 （ＦＧＦ）の種類のための受容体である。また、Ｐ、Ｌ、Ｌｅｅなど、、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４５：５７〜６０、（１９８９）（これは、引用により本明細書に 組込まれる）を参照のこと。

ＦＧＦ種類は、アミノ酸配列相同、ペバリン結合活性、脈管形成を促進する能力 及び上皮、間葉及び神経超厚の細胞に対するマイトジェン活性により特徴づけら れるポリペプチド成長因子から成る。そのＦＧＦ種類は、酸性ＦＧＦ、塩基性Ｆ ＧＦ、１ｎｔ−２遺伝子生成物、ｈｓｔ遺伝子生成物（Ｋａｐｏｓ　ｉ肉腫−Ｆ ＧＦ）　、ＦＧＦ−５、表皮ケラチン細胞成長因子、及びＦＧＦ−６を包含する 。ＦＧＦ種類のメンバーは、ニューロンの発育、組織修復、維持、及び疾病の病 因において役割を有するように思われる。Ｆ　Ｇ　Ｆ”の異常な発現は、自己分 泌機構による細胞形質転換を引き起こすことができる。さらに、ＦＧＦは、腫瘍 中への血管の成長を刺激することによって又はプロテアーゼ、たとえばプラスミ ノーゲン活性化因子の産生を誘発することによって腫瘍成長及び侵入を高めるこ とができる。

用語“リガンド”とは、成長因子結合に関与されるドメインを結合する分子、通 常繊維芽細胞成長因子種類のメンバーを意味する。また、リガンドは、受容体が 結合する天然のリガンドとして又は作用剤又は拮抗剤として作用することができ る機能的な相同体として作用する分子である。

本明細書に記載されるように、ニワトリｂＦＧＦ受容体は、種々の同定可能な構 造的特徴により特徴づけられる。ニワトリ及びヒ１−ＦＧＦ−Ｒ構造体は、他の ＦＧＦ−Ｒに適用できる構造命名法を定義するために一般化される。タンパク質 構造及び核酸配列とのその関係の一般的な説明は、Ｊ、　Ｄ、　Ｗａｔｓｏｎな ど、、Ｍｅｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第４版、 第１及び２巻、Ｂｏｎｊａｍｉｎ／ＣｕＣｕｍｍ１ｎ、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、（１９８７）；及びＢ、Ａｌｂｅｒｔｓ（１９８９）（ それぞれ引用により本明細書に組込まれる）に論じられている。既知のＦＧＦ− Ｒ，たとえば種々の天然に存在する可溶性ヒ）ＦＧＦ結合タンパク質の通常の構 造特徴が記載される。ヒト繊維芽細胞成長因子受容体は、天然のヒトＦＧＦ−Ｒ 遺伝子に由来するタンパク質又はＦＧＦのための天然に存在するヒト受容体に独 特な有意な構造特徴を共有するタンパク質である。

単離された完全な長さのニワトリＦＧＦ−ＲｍＲＮＡは、膜拡張セグメント　（ トランスメンプランセグメントとして命名される）に類似する単一の疎水性セグ メントを含む。トランスメンプランセグメントに近い方のＦＧＦ−Ｒアミノセグ メントは、細胞外ドメインとして命名され、そしてトランスメンプランセグメン トに近い方のカルボキシセグメントは、細胞内ドメインとして命名される。その アミノ末端から、細胞外ドメインは、推定上のＮＨ２−末端疎水性シグナル配列 、免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＩとして命名される）及び酸性セグメント、 第２免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＩＩとして命名される）及び第３免疫グロ ブリン様ドメイン（ＩｇＩＩＩとして命名される）を有する。種々の構造化され た特徴がＦ　Ｇ　Ｆ−Ｒの外部ドメインに同定され得るが、そのドメインを定義 する最っとも重要な機能性質は、受容体リガンド、たとえばＦＧＦ種類のメンバ ーへの結合である。下記に論ぜられるように、この機能は、Ｉｇｌｌ及びＩｇｌ ｌｌ　ドメインの組合された存在と相互関係する。

細胞内ドメインは、分離チロシンキナーゼ構造ドメインの存在により特徴づけら れ、そしてニワトリ受容体においては、約４２４個の残基の長さである。機能的 には、このドメインは、細胞外ドメインに結合するリガンドにより調節されたそ のチロシンキナーゼ活性により定義される。タンパク質は、それが原型的な細胞 内ドメイン、特にチロシンキナーゼドメインを欠く場合、細胞内ドメインを実質 的に欠く。

ニワトリ受容体の他に、４種のユニークなヒ）ｃＤＮＡクローンが同定された。

これらは、たった２種のＩｇ様ドメインを含むこれまで未知のＦＧＦ受容体変異 体をコードする。

ヒトクローンのうち２種は、膜拡張受容体をコードし、そして他の２種は推定上 の分泌された形をコードする。３　Ｉｇ一様又は２　Ｉｇ一様ドメイン構造を示 す両者の形は、酸性及び塩基性ＦＧＦへの生物学的な応答を仲介する。従って、 ３　Ｉｇドメイン形の第１のＩｇドメインは、酸性及び塩基性ＦＧＦの結合以外 の機能を有する。複数のヒト受容体形は、いくつかの領域で同一であるが、しか し細胞外ドメインの他の選択された領域においてひじように異なる。ヒト変異受 容体のうち２種のｈ４及びｈ５は、ＦＧＦ受容体の選択された形をコードするで あろう。

典型的なＦＧＦ−Ｒ核酸配列は、変移的なＮＨ，末端疎水性配列をコードし、こ れは通常、トランスロケーション工程の間に切断される。シグナル配列の従来の 機能は、膜結合リポソームに新生ポリペプチド鎖に向けることであり、それによ って、膜トランスロケーションを導ひく。しかしながら、シグナル配列は典型的 には、トランスロケーション工程において除去されるので、シグナル配列は、成 熟ポリペプチドには不在である。

Ｔｇ一様ドメイン（Ｉｇドメイン）は、３種の主な特徴：（ｊ）個々のドメイン における２種の特徴的なシスティン残基の存在； （２）個々のＩｇ一様ドメインにおける第１システイン残基のＣ０ＯＨ末端側上 での１１〜１２個のアミノ酸のコンセンサストリプトファン残基の存在；及び（ ｉｉｉ）第２システイン残基のＮＨ２末端側上でのコンセンサス配列ＤＸＧＸＹ ＸＣの存在により特徴づけられる。最後の特徴は、可溶性受容体タンパク質の場 合、変性され、そして同等の大きさの配列により置換される。

１ｇドメインに特徴的な追加の特徴は、ドメインをお互いに比較し、そして種々 の受容体分子の相同ドメインを比較することで明らかである。ニワトリのクロー ンに見出されるアミノ−近接ＩｇドメインがＩｇＩとして命名された。ニワトリ のクローンは３種の１ｇドメインを有するので、ドメインはアミノ末端から番号 を付与された。第６図に示されるように、ＩｇＩドメインは、一対のシスティン 残基を端に有する４５個のアミノ酸を含む。ニワトリＩｇＩドメインは、ヒトＦ ＧＦ−Ｒのゲノム配列に見出されるＩｇＩドメインと配列的に高い相同性を有す る。しかしながら、ヒト形は、ＩｇＩに対応するドメインを欠いているように思 われる。

次の１ｇドメインは、ＩｇｌＩとして命名され、そしてニワトリ受容体において 、２種のシスティン残基間に５１個のアミノ酸を含む（第３及び６図を参照のこ と）。下記に記載されるように、このドメインは、ＩｇＩＩＩ　ドメインと一緒 に、リガンド結合により包含される。ニワトリ及びヒト受容体の間のこのドメイ ンのポリペプチド配列相同性は、第７図における配列により示されるようにひじ ょうに高い。ヒト受容体はＩｇＩドメインを欠くが、しかしＩｇ［ｌ及びＩｇｌ ｌｌ　ドメインを有することが注目されるであろう。このドメインを示すために 使用されるシスティン残基は、それぞれニワｌ−リ、ｈ２、ｈ３、ｈ４及びｈ５ 受容体のために、アミノ近接側上で残基１７６．８９，８７．８９及び８７及び カルボキシ近接側上で２２８，１４１，１３９．１４１及び１３９である。

第３Ｉｇドメインは、Ｉｇｌｌｌとして命名され、そしてニワトリ受容体におい ては、２種のシスティン残基間に６３個のアミノ酸を含む。第３及び６図を参照 のこと。再び、ヒト受容体はたった２種のドメインを有するが、そのドメインは ＩｇｌＩ及びＩ　ｇ　ＩＩＩに対応する。ニワＩ−ＩＪ及びヒト形においては、 Ｉｇｌｌｌ　ドメインは、トランスメンプランセグメントに最っとも隣接するも のである。このドメインを示すために使用される、それぞれニワｌ−ＩＪ、ｈ２ 、ｈ３、ｈ４及びｈ５受容体のためのシスティン残基は、アミノ近接側上で残基 ２７４．１８７，１８５，１８７及び１８５及びカルボキシ近接側上で残基３３ ９，２５２，２５０．２５３及び２５１である。

ｈ４及びｈ５可溶性受容体は、Ｉ　ｇ　ＩＩＩＴとして命名される置換された末 端セグメントを有する。このセグメントは、Ｉｇ　ＩＩＩに結合される幕の一部 を置換する置換された末端セグメントであり、そして７９個のアミノ酸の長さで ある。この配列はそれぞれｈ４及びｈ５のアミノ酸２２４及び２２２に対応し、 そしてＤＳＧＳＹＳＣを除＜Ｉｇｌｌｌ　ドメインに見出される多（の特徴を保 持する。しかしながら、ＩｇｌＩＩＴ配列は、ヒ）ＦＧＦ−Ｒの可溶性形の間に 保存されることが注目されるべきである。

第」及び第２免疫グロブリン様ドメイン間に、ＦＧＦ受容体（塩基性ＦＧＦ−Ｒ のために示されるが、しかし同じＦＧＦ−Ｒは酸性及び塩基性ＦＧＦの両者を結 合しない）は、免疫グロブリン種類の他のメンバーに見出されない特徴を有する 。一連の８個の連続した酸性残基にニワトリの場合、ＥＤＤＤＤＥＤＤ、及びヒ トの場合、ＥＤＤＤＤＤＤＤ）　、続いて３個のセリン残基及び２個の追加の酸 性残基が存在する（第３及び７図）。７〜３５個の酸性残基の連続した拡張がい くつかの細胞内タンパク質、特に核タンパク質のために記載されているが、その ような酸性領域は、トランスメンプラン受容体タンパク質の細胞外領域において は異常である。

５種の受容体積（たとえばニワトリ、ｈ２、ｈ３　、ｈ４及びｈ５形）はまた、 保存された酸性領域と保存された第２Ｉｇ一様ドメイン（Ｉｇｌｌ）との間の特 定の位置で変動性を示す。ｈ２及びｈ４受容体形は、位置５９及び６０で２個の アミノ酸（ＡｒｇＭｅｔ）を含み、そしてニワトリ受容体はこの位置で単一のア ミノ酸（Ａｓｎ）を含み、そしてｈ３及びｈ５受容体形はこの位置で対応するア ミノ酸を含まない（第８図の星印を参照のこと）。

もう１つの異常な特徴は、膜拡張セグメントとキナーゼドメインとの間の並置膜 （ｊ　ｕ　ｘ　ｔ　ａｍｅｍｂ　ｒ　ａ　ｎ　ｅ）領域の長さである。この領域 は、通常、受容体チロシンキナーゼの間で保存される。たとえば、並置膜領域は 、ＰＤＧＦ、Ｃ３Ｆ−１、上皮成長因子（ＦＧＦ）　、ヒト上皮成長因子−２（ ＨＥＲ２）及びインシュリンのための受容体に４９〜５１個の長さの残基である 。細胞内ドメインを有するＦＧＦ受容体は、約８７個の残基の異常に長い並置膜 領域を有する。

アミノ酸配列の原形質領域は、ニワ）　ＩＪ及びヒト形のためにそれぞれ約４２ ４個及び４２５個の残基の長さである。これらはまた、チロシンキナーゼ配列に ニワトリ、ｈ２及びｈ３形のためにそれぞれ約残基４８２〜７５９．３９５〜６ ７２及び３９３〜６７０）を含むことができる。全体的に、ｂＦＧＦ受容体のキ ナーゼ領域は、ＰＤＧＦ及びＣ３Ｆ−１受容体と最大の配列同一性（約５１〜５ ３％）を共有する。ｂＦＧＦ受容体は、ＧＸＧＸＸＧモチーフ及びチロシンキナ ーゼのアデノシン５′−トリホスフェート（ＡＴＰ）結合部位の一部を形成する 保存されたりシン残基（残基５１２）を含む。ｂＦＧＦ受容体はまた、２つの特 徴的なチロシンキナーゼモチーフ、ＨＲ，Ｄ　Ｌ　Ａ　Ａ　ＲＮ　Ｕ　Ｌ及びＤ ＦＧＬＡＲ，及びｐｐ６０°−”’　（Ｔｙ　ｒ　４１６）の主要リン酸化部位 に相同の位置でのチロシン（残基６５１．５６４及び５６２）を含む。

他のチロシンキナーゼへの相同性により定義される、ｂＦＧＦ受容体のキナーゼ コード配列は、１４個のアミノ酸の挿入により分離される。キナーゼ領域におけ る挿入体の長さは、ＰＤＧＦ及びＣ３Ｆ−１（それぞれ１０４及び７０個のアミ ノ酸）のために受容体に見出される長さよりも短かく、そしてインシュリン及び インシュリン様成長因子−■のための受容体における挿入された配列の長さに類 似する。

ＦＧＦ−Ｒは、３種の異なった生物学的機能を有すると思われる。第１は、リガ ンド、通常ＦＧＦタンパク質又はそれらの類似体の結合である。これらのリガン ド又は類似体はまた、作用剤又は拮抗剤としても作用することができる。リガン ド結合部位は、明らかに、細胞外ドメインに存在する。受容体はリガンド結合に 応答してシグナルを伝達し、そしてその結果はリガンド調節活性である。たぶん リガンドはＦＧＦであるので、そのシグナルは、通常、ＦＧＦ−調節されるであ ろう。

第２の生物学的活性は、チロシンキナーゼ酵素活性に関する。この活性は典型的 には、リガンド結合に応答して活性化される。しかしながら、受容体はたぶん、 二量体状態で機能するので、鎖内結合相互作用は、阻害剤により介在され得るも う１つの生物学的活性として見なされ得る。これは、特定の活性のＦＧＦ−仲介 を調節するために追加の手段として作用することができる。

Ｂ、生理学的示唆 ＦＧＦとそれらの受容体との相互作用は、特定の細胞タイプ上で、細胞形態及び 細胞形質転換、細胞増殖、細胞分化、細胞老化、ヘパリン感受性及びヘパリン効 果の変化を引き起こす。ＦＧＦのインビボ効果は、特定の生物においての種々の 活性の調節、たとえば周囲の再生、レンズの再生、正常及び腫瘍細胞に対する拮 抗効果、創傷の治癒、脂肪細胞分化及び種々の神経及び筋芽細胞の増殖を包含す る。Ｆ　Ｇ　Ｆ’はまた、効果的な脈管形成活性を示す。ＦＧＦの脈管形成活性 は、大部分、内皮細胞に対するこれらの因子の走化性及びマイトジェン効果によ る。さらに、ＦＧＦの構成的発現は、トランスフェクトされた細胞に細胞性形質 転換を誘発することが示されており、Ｆ’　Ｇ　Ｆによる自動分泌又は傍分泌刺 激が腫瘍形成に包含されることを示唆する。これらの種々の細胞及び生理学的効 果は、これらの受容体−リガント相互作用の重要性を予示する。

それらを含む組成物及び細胞は、診断目的のために及びＦＧＦ受容体に関係する 疾病を研究し、そして処理するために使用され得る。定義された配列を含む細胞 発現クローニングビークルは、特定の活性をもたらすために必要なＦＧＦ受容体 の特異的部位を定義するために使用され得る。他方、これらの細胞は、異なった リガンド（ＦＧＦ及び類似体）を結合する選択された受容体の能力を評価するた めに有用であり、それによって、特定のＦＧＦ−誘発性細胞応答を促進せしめ又 は阻害するための薬物の可能性を評価するための強力な手段を提供する。

完全な長さの天然のＦＧＦ−Ｒ配列を含むＤＮＡ又はｍＲＮＡによりトランスフ ェクトされ、注入され、感染され又はエレクトロポレートされた細胞はしばしば 、天然又は野生タイプの受容体及び従って応答を発現するであろう。特定濃度の 精製された受容体又は受容体ポリペプチドフラグメントが、天然のＦＧＦ受容体 へのリガンド（ＦＧＦ）の結合を阻害するために使用され得る。他方、受容体又 はフラグメントに対する抗体は同じ効果を有する。

均質及び定義されたポリペプチド及びＤＮＡ配列は、抗体の発生に使用される。

特に、受容体の特定領域、たとえばリガンド結合部位に対する抗体は、診断試験 に使用されるであろう。試薬ＦＧＦ−ＲＳＦＧＦ−Ｒポリペプチド及び受容体の 特定領域に対する抗体は、ＦＧＦ介在の活性の調節を研究するために使用され得 る。たとえば、ＦＧＦ作用剤は、血管成長、すなわち心臓の虚血性部分における 創傷治癒に及び付随する血管の成長において特に有益な効果を刺激するはずであ る。ＦＧＦ拮抗剤は、糖尿病性網膜病及びリウマチ様関節炎に見られるような異 常な脈管形成の阻止に又は腫瘍への血管化の増殖を阻止することによっての腫瘍 の制御に使用されるはづである。

Ｉｌ、ポリペプチド 本発明は、繊維芽細胞成長因子受容体ポリペプチド及びＦ　Ｇ　Ｆ−ＲＩＪガン ト結合活性を有するタンパク質を含む。本発明の受容体は、第３，４及び７図に 示されるように、ＦＧＦ受容体アミノ酸配列、たとえばニワ１−ＩＪｂＦＧＦ− Ｒ及びヒ１−ＦＧＦ−Ｒ形のためのアミノ酸配列を含む。また、相同配列、対立 遺伝子変化、天然の変異体、誘発された変異体、他方発現された変異体、及び高 い又は低い緊縮条件下で、天然に存在する物質から回収されたアミノ酸をコード するＦＧＦ受容体にハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質が 包含される。ＦＧＦ受容体に対する抗血清により回収されたひじように関連する ＦＧＦ−受容体が包含される。

アミノ酸残基のための記号は、第１表に示される。

第１表 アミノ酸残基のための略語 Ａ、ＡＩａ；　Ｇ、Ｇｌｙ；　Ｍ、Ｍｅｔ；　Ｓ、Ｓｅｒ；Ｃ，Ｃｙｓ；　Ｈ， Ｈｉｓ；　Ｎ、Ａｓｎ；　Ｔ、Ｔｈｒ；Ｄ、Ａｓｐ；　Ｉ、Ｉｌｅ；　Ｐ、Ｐｒ ｏ；　Ｖ、Ｖａｌ；Ｅ、Ｇｌｕ；　Ｋ、Ｌｙｓ；　Ｑ、Ｇｌｎ、　Ｗ、Ｔｒｐ； Ｆ、Ｐｈｅ；　Ｌ、Ｌｅｕ；　Ｒ，Ａｒｇ；　Ｙ、Ｔｙｒ；ｘｌいづれかのアミ ノ酸及びＺ、終結。

種々の新規ヒ）ＦＧＦ受容体が、さらに下記に記載されるようにしてクローン化 され、そして特徴づけられた。ＦＧＦ受容体の種々の短い形（ｈ２及びｈ３）及 び可溶性形（ｈ４及びｈ５）が発見された。ＦＧＦ結合能力を有する可溶性タン パク質（たとえばトランスメンプランセグメントを欠く形）は、より短い形が治 療的及び／又は診断的に使用されるであろうことを示す。

典型的には、本発明の繊維芽細胞成長因子受容体ペプチドは、Ｉｇｌｌ及びＩｇ ｌｌｌ領域における天然に存在する受容体と少なくとも約８５％の相同性、通常 少なくとも約９０％の相同性及び好ましくは少なくとも約９５％の相同性を示す であろう。

特に、リガンド結合機能は細胞外ドメインに局在化し、そして可溶性形はこの特 定の機能を保持する。ＦＧＦ受容体の可溶性フラグメントは、天然の可溶性変異 体の機能のための置換に又はその機能の妨害において有用であるはずである。

他方、可溶性形は、受容体が通常、二量体形で存在することができるので、ＦＧ Ｆ受容体の二量体化を妨げることができる。受容体の二量体化は、適切な生理学 的シグナルのトランスフクトョンのために不可欠である。

トランスメンプランセグメントを有するヒト受容体は、３種のＩｇドメインのう ちＩｇｌｌ及びＩｇｌＩＩのみを有することにおいて異常である。ＩｇＩドメイ ンの不在は、あの機能がヒト受容体に不在であり、又はＩｇＩドメインがヒト受 容体に不必要であることを示す。下記に示されるデータは、ＩｇＩドメインがリ ガンド結合のために必須でないことを示す。

本明細書に使用される場合、用語、実質的に純粋及び均質とは、天然において付 随する成分から分離されたタンパク質を意味する。典型的には、モノマータンパ ク質は、少なくとも約６０〜７５％のサンプルが単一のポリペプチド主鎖を示す 場合、実質的に純粋である。少々の変異体又は化学的変性は典型的には、同じポ リペプチド配列を共有する。実質的に純粋なタンパク質は、典型的には、約８５ 〜９０％のタンパク質サンプルを含んで成り、より通常には、少なくとも約９５ ％、及び好ましくは約９９％以上のタンパク質サンプルを含むであろう。通常、 純度は、ポリアクリルアミドゲル上で測定され、そして均質性は染色により決定 される。ある目的のためには、高い解決法が使用され、そして精製のためのＨＰ ＬＣ又は類似する手段が利用されるであろう。はとんどの目的のためには、単純 なりロマトグラフィー力ラム又はポリアクリルアミドゲルが、純度を決定するた めに使用されるであろう。

タンパク質は、それが天然の状態でそれに付随する生来の汚染物から分離される 場合、天然に関連する成分を実質的に有さない。従って、化学的に合成され、又 は天然に起因する細胞とは異なる細胞システムに合成されるタンパク質は、その 天然に関連する成分を実質的に含まないであろう。その用語は、異種哺乳類細胞 又は植物細胞、Ｅ、コリ及び他の原核細胞において合成される受容体及び核酸を 記載するために使用される。

ポリペプチドは、それが実質的に、ＦＧＦ−Ｒの天然に存在する膜結合形に対応 する又はそれと高い相同性の完全な長さのペプチドである場合、ＦＧＦ−Ｈの完 全な膜結合形である。

可溶性又は膜結合形であっても、本発明は、実質的に純粋な調製法を提供する。

生物学的材料からのそれらの単離のための種々の方法が、本明細書に含まれる構 造的及び機能的な説明に一部基づいて、考案され得る。

ニワトリ及びヒ）ＦＧＦ受容体を包含するＦＧＦ・受容体ペプチドは、下記に見 出されるような従来のタンパク質化学の技法を用いて精製され得る。たとえば、 レクチンアフィニティークロマトグラフィ一段階、続いて、ＦＧＦのシスティン 残基を通してビオチンに結合されるＦＧＦを利用する高い特異性のりガントアフ ィニティークロマトグラフィー法が使用され得る。精製されたＦＧＦ−Ｒ受容体 はまた、Ｉ　ｍ　ａ　ｍ　ｕｒ　ａ　ｓ　Ｕ８２に記載されるように、第一アミ ノ基を通してＦＧＦに結合される活性化されたＣＨ−３ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｒ　ｏ 　ｓ　ｅを用いて、ＦＧＦアフィニティークロマトグラフィー法により得られる 。しかしながら、この方法は、精製されたタンパク質をもたらすが、作業できる ほどの量の精製されたタンパク質を提供することはできない（すなわち、ｎｇ以 上の量）。

特異的抗体の利用可能性に依存して、本発明に提供されるように、特定のＦＧＦ 受容体がまた、イムノアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され得る 。下記のようにして調製された抗体は、高い特異性のアフィニティーカラムを生 成するために不活性物質に固定され得る。下記Ｈａｒｌ。

ｗａｎｄ　Ｌａｎｅを参照のこと。

測的手段（但し、限定的でない）によれば、ラベルされたビオチン−ｂＦＧＦが 多量のそれらの受容体を含む細胞における受容体に高い親和性で結合する事実の 利点を有する１つの精製方法が使用され得る。　１′■−ラベルされたビオチン −ｂＦＧＦは、５ｗ１ｓｓ３Ｔ３細胞におけるｂＦＧＦ受容体に結合し、そして 受容体タンパク質に架橋され得る。

種々の細胞又は組織源が、所望する多くの受容体のために通常選択される出発材 料として選択され得る。ニットＩＪの胚（６日目、段階２９−３０）は、それら がヒト及びウシｂＦＧＦの高−親和性結合により結成される場合、比較的多量の 受容体タンパク質を含むので、好ましい。胚抽出物は、最初に、小麦幼芽アグル チニン（ＷＧＡ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ上で分別され、そして次に、一部精製 されたｂＦＧＦ受容体はビオチン−ｂＦＧＦに結合される。受容体−リガント複 合体は、ビオチンとアビジン成分との間での高い親和性相互作用によりアビジン −アガロースに吸着され得る。アビジン−アガロースカラムは、ＦＧＦをその受 容体、たとえばスラミン又はＳＤＳから分離する化合物により溶出され得る。Ｆ ＧＦ−依存性手段でアビジン−アガロースに結合されるニワトリタンパク質は、 ｂＦＧＦ受容体の予測サイズ（１３０ｋＤａ＞で移動した。第２Ｂ図を参照のこ と。

アミノ酸配列を決定し、そして受容体のポリペプチドフラグメントを得るために は、受容体がトリプシンにより消化され得る。ペプチドフラグメントは、逆相高 性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離され、そしてガス相配列決 定により分析され得る。当業界に知られている他の配列決定法もまた使用され得 る。

ＦＧＦ受容体又はその受容体の特定の外部領域を用いて、それぞれのＦＧＦをア フィニティー精製することができる。

第３図に示されるニワトリｂＦＧＦ−Ｒのリガンド結合ドメインを含んで成る外 部領域は、アミノ酸２２からアミノ酸３７４まで拡張する。第４図に示されるヒ トＦＧＦ−Ｒのリガンド結合ドメインは、アミノ酸２２からアミノ酸２８５まで 拡張する。リガンド結合ドメインは種々のＦＧＦ受容体と共に変化し、そして約 ５％〜１００％の細胞外領域であり得る。

リガンド結合のために必要な最少量のタンパク質配列は、細胞外ドメインの種々 のセグメントを切断し、そして残る配列に結合するりガントをアッセイすること によって決定され得る。リガンド−受容体の相互作用の研究は、少なくともリガ ンド結合領域が受容体の細胞外領域に位置することを示す。

本出願で使用される場合、ＦＧＦ受容体又はＦ　Ｇ　Ｆ　−ＲＩＪガント−結合 活性とは、繊維芽細胞成長因子又は他の特定のリガンドを結合する能力を有する ことを意味する。通常、これらのリガンドはＦＧＦ種類のメンバーであろう。従 って、外部領域は、ＦＧＦ作用剤又は拮抗剤の確立に利用できる。

多くの他の成長因子受容体のように、ＦＧＦ−Ｒは、多量体タンパク質複合体、 通常二量体形で天然において見出される傾向がまたある。従って、受容体の他の 重要な領域は、細胞外領域又は二量体化に関与する他の領域のいづれかであろう 。

受容体の細胞内領域（たとえば、それぞれ第３及び４図に示されるように、ニワ トリｂＦＧＦ−Ｒのためには、ｃｏ。

Ｈ末端基を通してアミノ酸３９６で出発し、そしてヒ）ＦＧＦ−Ｒのためには、 Ｃ０ＯＨ末端基を通してアミノ酸３０７で出発する）はまた、チロシンキナーゼ 活性を有する酵素としても使用され得る。ｂｅｋ遺伝子は、ニワトリｂＦＧＦ− Ｒの相同領域（チロシンキナーゼ領域）に対して８４％のアミノ酸配列同一性を 有する。ｆｌｇは、第４図に記載されるヒトＦＧＦ受容体の種々の配列と９９％ の相同性を有する。

シグナル又はリーダー配列は、細胞の膜を通してタンパク質を指図する。受容体 のシグナル配列は、それらのそれぞれの受容体と一緒に使用され得るが、しがし また、他のタンパク質と一緒にも使用され得る（たとえば、Ｎ−末端配列のアミ ノ酸１〜２１は、第３図に示されるニワトリｂＦＧＦ−Ｒ及び第４図に示される ヒトＦＧＦ−Ｒのリーダー又はシグナル配列を含む）。

本発明はまた、繊維芽細胞成長因子受容体ポリペプチドの類似体を供給する。そ のような類似体は、ポリペプチド主鎖に対する変性及びそのポリペプチドの変種 体及び変異体の両者を包含する。変性は、ポリペプチドの化学的誘導体化、たと えばアセチル化、カルボキシル化及び同様のものを包含する。それらはまた、グ リコジル化変性及び典型的なポリペプチドのプロセッシング変異体も包含する。

これらのプロセッシング段階は特に、酵素的変性、たとえばユビキニ化（ｕｂｉ ｑｕｉｎｉｚａｔ　１ｏｎ）を包含する。たとえば、Ｈｅｒｓｈｋｏ　ａｎｄ　 Ｃ１ｅｃｈａｎｏｖｅｒ　（１９８２）、”Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｉｎ ｔｒａｃｅｌｌｕｌａ他の類似体は、天然の及び誘発された遺伝的変異体を包含 する。誘発された変異体は、種々の技法、たとえば照射又はＥＭＳへの暴露を用 いてコード核酸のランダム突然変異誘発に起因し、又は特定部位の突然変異誘発 又は近代分子生物学の他の技法による構築された変化の形を取ることができる。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　ＭａｎｉａｔＨＰｒｅｓｓを参照 のこと。

実質的に完全な長さのポリペプチドの他に、本発明は、ポリペプチドの生物学的 に活性なフラグメントを供給する。有意な生物学的活性は、リガンド結合の免疫 学的活性及び繊維芽細胞成長因子受容体ポリペプチドに特徴的な他の生物学的活 性を包含する。免疫学的活性は、標的免疫システムにおける免疫原性機能、及び 繊維芽細胞成長因子受容体エピトープのための競争体又は置換体抗原のいづれか として作用する、結合のための免疫学的エピトープの共有の両者を包含する。

本明細書で使用される場合、ポリペプチドに適用されるような用語、セグメント とは、通常、少なくとも約５個の連続するアミノ酸、典型的には少なくとも約７ 個の連続するアミノ酸、より典型的には少なくとも約９個の連続するアミノ酸、 普通少なくとも約１１個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも約１３個の 連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約１６個の連続するアミノ酸、及 び最っとも好ましくは少なくとも約２０〜３０個又はそれ以上の連続するアミノ 酸を意味する。特定のドメインのセグメントは、対応するドメイン内での適切な 大きさのセグメントであろう。

たとえば、リガンド結合又は他のドメインは、種々の新規融合ポリペプチド又は フラグメント内で“交換され”得る。

従って、特異性の新しい組合せを示す新規キメラポリペプチドは、リガンド結合 の特異性及び細胞内ドメインの機能的な結合に起因する。たとえば、ｒｇドメイ ンは、他の関連するポリペプチドからのＩｇドメインにより置換され得る。

免疫学的目的のためには、ポリペプチドセグメントを並んで反復する免疫原が生 成され得、それによって、高い抗原性のタンパク質が生成される。他方、そのよ うなポリペプチドは、特異的結合のための効果的な競争体として作用するであろ う。繊維芽細胞成長因子受容体ポリペプチドに対する抗体の産生が下記に説明さ れる。

本発明はまた、繊維芽細胞成長因子受容体のフラグメントを含んで成る他のポリ ペプチドを供給する。従って、受容体と他の相同体又は異種タンパク質との間の 融合ポリペプチドが供給される。相同ポリペプチドは、たとえば１つの受容体の リガンド特異性を示すハイブリッドタンパク質をもたらす種々の成長因子受容体 ともう１つの受容体又は拡大され又は弱体化された結合変異性を有する受容体の 細胞内ドメインとの間の融合体であり得る。同様に、誘導体タンパク質の性質又 は活性の組合せを示す異性融合体が構成され得る。典型的な例は、レポーターポ リペプチド、たとえばルシフェラーゼとレポーターのドメイン、たとえばリガン ド結合ドメインとの融合体であり、その結果、所望するリガンドの存在又は位置 が容易に決定され得る。たとえば［）ｕｌｌなど、、アメリカ特許第４．８５９ ．６０９号（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。他の遺伝子融合 パートナ−は、細菌性β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥプロティンＡ、β−ラク タマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及び酵母α接合因子を包 含する。たとえばＧｏｄｏｗｓｋ；など、（１９８ｇ）、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ １：８１２〜８１６；及び下記実験セクションを参照のこと。

融合タンパク質は典型的には、組換え核酸方法又は合成ポリペプチド方法のいづ れかにより製造されるであろう。核酸操作のための技法は、たとえば“Ｓａｍｂ ｒｏｏｋなど。

巻、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（引用に より本明細書に組込まれる）に一般的に記載される。ポリペプチドの合成のため の技法は、たとえばＭｅｒｒ　ｉ　ｆ　ｉｅ　ｌｄ、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、８５：２１４９〜２１５６　（１９６３）に記載される。本発明の融合 タンパク質を生成するために使用される組換え核酸配列は、天然又は合成配列に 由来する。多くの天然の遺伝子配列が、適切なプローブを用いて、種々のｃＤＮ Ａ又はゲノムライブラリーから得られる。ＧｅｎＢａｎｋ”、Ｎａ　ｔ　ｉ　。

ｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈを参照のこと。繊維芽細胞成 長因子受容体のための典型的なプローブは、標準方法に従って、第３．４又は９ 図の配列から選択され得る。適切な合成りＮＡフラグメントは、Ｂｅａｕｃａｇ るホスホラミジット（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）方法により調製され得 る。二本鎖フラグメントが、その相補的鎮を合成し、そして適切な条件下で一緒 にその鎖をアニールすることによって又はＤＮＡポリマラーゼを用いて、適切な プライマー配列により相補的鎮を付加することによって得られる。

１１１−核酸 本発明は、上記種々のＦＧＦ受容体配列をコードする核酸配列を提供する。第３ ，４及び７図はそれぞれ、ニワ）　ＩＪ及びヒ）ＦＧＦ受容体をコードするその 対応するｃＤＮＡ配列を示す。

ニワトリｂＦＧＦ−Ｒを示す第３図においては、精製されたタンパク質から配列 決定されたペプチドは下線が引かれ、アミノ酸３５−５３　（ａｌａ−−−ａｒ ｇ）　、５６−６７（１ｅ　ｕ　−−−ａ　ｒ　ｇ）及び１３９−１５８　（ｇ ｌｕ−−−１ｙｓ）からのＮＨ２近位配列が包含される。トランスメンプラン配 列は、濃い線により示され、ユニークな酸性アミノ酸領域は四角で囲まれ、可能 性あるＮ−結合グリコシル化部位は点により示され、そして断続下線は推定上の 疎水性シグナル配列を示す。アミノ酸配列は、整合停止コドン（残基−１２）、 次にイニシエターメチオニンを含む。構造配列はアミノ酸２２で始まる。

ヒトＦＧＦ−Ｒを示す第４図においては、ヌクレオチド５２９で出発するコドン ＡＴＧのメチオニンが、ＦＧＦ−Ｒ遺伝子の最初のアミノ酸である。たとえば、 第４図に記載されるレポーターのアミノ酸２２は、第４図の第１ページ上の“５ ８９”と６３０”との間の底部に示されるアミノ酸の左から２番目に位置するア ルギニン残基（Ｒ）である。

本発明の核酸は、天然のヒト、ニワｌ−ＩＪ又は他のＦＧＦ−Ｒ遺伝子又は天然 のＦＧＦ−Ｒ遺伝子と実質的な相同性を有する遺伝子又はその一部のいづれかに 由来する配列を有するであろう。

核酸含有における実質的な相同性とは、そのセグメント又はそれらの相補的鎖が 、最適に並べられ、そして比較される場合、適切なヌクレオチド挿入又は欠失に より、少なくとも約８０％の残基、通常少なくとも約９０％、より通常には少な くとも約９５％、好ましくは少なくとも約９７％及びより好ましくは少なくとも 約９８〜９９．５％のヌクレオチドにふいて同一であることを意味する。他方、 実質的な相同性は、そのセグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、 鎮又はその相補体に、典型的には第３，４又は９図に由来する配列を用いてハイ ブリダイズする場合に存在する。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性の 完全な欠失よりも選択性であるハイブリダイゼーションが生じる場合に存在する 。

典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４／２５のヌク レオチドに対して、少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より 好ましくは少なくとも約７５％、及び最っとも好ましくは少なくとも約９０％の 相同性が存在する場合に生じるであろう。Ｋａｎｅｈｉｓａ。

Ｍ、（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１２＋２０３〜２１３（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。緊縮 条件ハイブリダイゼーションは典型的には、約１Ｍ以下、より通常には約５００ ｍＭ以下及び好ましくは約２００ｍＭ以下の塩濃度を包含するであろう。温度は 、典型的には２０℃以上、より通常には約３０℃以上及び好ましくは約３７℃以 上であろう。他の要因、たとえば数ある中で、相補的鎖の塩基組成及び大きさ、 有機溶媒の存在及び塩基ミスマツチングの程度がハイブリダイゼーションの緊縮 性に有意に影響を及ぼすので、パラメーターの組合せが、いづれよりも重要であ る。

単離された核酸は、通常それに付随する他の配列、たとえば他の細胞性核酸配列 から実質的に精製された核酸である。

通常、その用語は、選択的にクローン化され、単離され、そして実質的な均質性 に精製されたゲノムのプライマーを言及する。

プローブは、第３，４及び９図に提供されるＦＧＦ受容体ｃＤＮＡの配列に基づ いて調製され得る。そのプローブは、ラベル又はレポーター分子に結合される単 離された核酸を含み、そして標準方法により他のＦＧＦ受容体核酸配列を単離す るために使用され得る。たとえばＪ、Ｓａｍｂｒｏｏｋなｓｓ、Ｎ、Ｙ、（１９ ８９）（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。他の類似する核酸は 、相同核酸を用いることによって選択され得る。他方、これらの同じ又は類似す る受容体ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子コードにおける冗長性の使用 により合成され又は選択され得る。種々のコドン置換、たとえば非活性変化が導 入され、それによって、種々の制限部位を生成し又は特定のシステムのための発 現を最適化する。突然変異は、受容体の性質を変性するために、たぶんリガンド 結合親和性、鋼量親和性又はポリペプチド劣化又は回転率を変えるために導入さ れ得る。

本発明のＤＮＡ組成物は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに由来し、合成により調製 され又は種々の組合せのハイブリッドであり得る。天然に存在しない配列を含む 組換え核酸がまた、本発明により供給される。単離されたＤＮＡ配列は、プライ マー又はハイブリダイゼーション反応により得られ、又は制限酵素又は同様のも のによる処理にゆだねられたいづれかの配列を包含する。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｌｅｕｃｃｉ、など、。

Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、５ｏｃ０．１０３　：　３１８５　（１９８１）のトリエ ステル方法又は他の方法、たとえば市販の自動オリゴヌクレオチド合成機により 製造され得る。オリゴヌクレオチドは、過剰のポリヌクレオキナーゼによりラベ ルされ得る（たとえば、約１０単位〜０．１ｎモルの基質が、５０ｍＭのトリス （ｐｔ（７，６）　、５ｍＭのジチオトレイトール、１０ｍＭのμｇ　ＣＩ　２ ．１〜２ｍＭのＡＴＰ、１．７ｐモルの”ｐ−ＡＴＰ　（２，９ｍＣｉ／ミリモ ル）、０．１ｍＭのスペルミジン、０．１ｍＭのＥＤＴＡと共に使用される）。

プローブはまた、ニックトランスレーション、タレノウフィルイン反応又は当業 界で知られている他の方法により調製され得る。

種々のタイプのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーがスクリーンされ得る。ｃＤＮ Ａライブラリーの選択は通常、所望する受容体のためにｍＲＮＡに富む組織源に 相当する。ファージライブラリーは通常好ましいが、しかしプラスミドライブラ リーもまた使用され得る。たとえば、表皮ケラチン細胞ゲノム又はｃＤＮＡライ ブラリーは、表皮ケラチン細胞成長因子受容体を単離し、そしてクローン化する ために好ましい。

を受容体のために使用され得、モして内皮細胞ライブラリーは酸性ＦＧＦ受容体 のために好ましい。ライブラリーのクローンはプレート上に広げられ、スクリー ニングのために支持体に移され、変性され、そして所望する配列の存在のために プローブされる。

たとえば、プラークハイブリダイゼーション方法に関しては、バクテクオファー ジプラークを含む個々のプレートが、２種のニトロセルロースフィルター紙（Ｍ ｉ　１１１ｐｏｒｅ−ＨＡＴＦ）上に重複される。ファージＤＮＡが緩衝液、た とえば５００ｍＭのＮａＯＨ１１，５ＭのＮａＣ］溶液により約１分間、変性さ れ、そしてたとえば０．５Ｍのトリス−ＨＣ１（ｐ）Ｉ’７．　５）　、１．５ ＭのＮａＣｌ溶液により中和される（それぞれ１０分間、３度）。次にフィルタ ーが洗浄される。乾燥の後、フィルターは典型的には、真空オーブン中において ８０℃で２時間ベータされる。その重複フィルターが、フィルター当たり１０ｍ ｊ？のＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液〔２０〜５０％のホルムアミド、５ ＸＳＳＣ，ｐ）ｔ７゜０．５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液（ポリビニルピロリ ドン、及びＦｉｃａｌｌ及びウシ血清アルブミン：１×＝それぞれ０．０２％） 、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７゜０）、０．２％のＳＤＳ及び５ ０Ｒ／ｍｊ２の変性されたサケ精子ＤＮＡ、ｌにより４２℃で４〜２４時間、プ レハイブリダイズされる。適切なプローブとのハイブリダイゼーションは、フィ ルター当たり１０ｍｊ！のＩ　Ｘ　１０　’ｃｐｍ／ｍｊ？のラベルされたプロ ーブを含むＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液により４２℃で１６時間行なわ れ得る。ホルムアミドの最終濃度は、プローブの長さ及び所望する緊縮性の程度 に従って異なる。

ハイブリダイゼーション条件及び配列相同性の議論のためには、たとえばＪ、Ｇ 、Ｗｅｔｍｕｒａｄ　Ｄａｖｉｄｓｏｎ。

Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、３１：３４９〜３７０　（１９６８）；及びに、Ｋａｎ ｅｈｉｓａ、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１２：２０３〜２１３　（１９８４）（これらは引用により本明細書中に組込ま れる）を参照のこと。

精製されたニワトリｂＦＧＦ−Ｒの２種のトリプシンペプチドのアミノ酸配列に 基づくオリゴヌクレオチドプローブが、低い緊縮条件下で、ニワｌ−ＩＪ胚（６ 日目）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするために使用された。市販の自動オ リゴヌクレオチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍＳ）を用いて調 製された、ＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＶＣＫ及びＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫに対応 する配列が、第３図に示されるニワトリｂＦＧＦ受容体クローンを得るために使 用された。このクローン又はそれに由来する配列は、他の種におけるｂＦＧＦ− Ｒ及び標的種における他のＦＧＦ−Ｒを単離するために使用され得る。

ニワ）ｌＪｂＦＧＦ−Ｒを単離するために使用された上記プローブはまた、ヒ） ｂＦＧＦ受容体ｃＤＮＡクローンを単離するためにも使用された。

本発明によれば、ＦＧＦ−Ｒ完全構造配列をコードするいづれかの単離されたＤ ＮＡ配列が、プローブとして使用され得る。他方、ＦＧＦ−Ｒ疎水性シグナル配 列及びその翻訳開始部位をコードするいづれかのＤＮＡ配列が使用され得る。

ＦＧＦ−Ｒ活性（たとえばリガンド結合又はＦＧＦ−Ｒ結合）をコードするいづ れかの単離された部分的ＤＮＡ配列もまた、本発明の一部である。好ましいプロ ーブは、個々の単離されたＦＧＦ受容体のｃＤＮＡクローンである。

本発明に使用されるＤＮＡ配列は通常、少なくとも約５個のコドン（１５個のヌ クレオチド）、より通常には少なくとも約７個のコドン、典型的には少なくとも 約１０個のコドン、好ましくは少なくとも約１５個のコドン、より好ましくは少 なくとも約２５個のコドン及び最っとも好ましくは少なくと受容体と特異的にハ イブリダイズする好結果をもたらすプローブのために必要とされる最少の長さで ある。たとえば、ＦＧＦ−Ｒの特徴的なエピトープは、短いペプチドにコードさ れ得る。通常、野生型配列が使用され、ある場合、１又は複数の突然変異、たき えば不活性突然変異を提供し、制限部位を変性し、又は特異的突然変異を提供す るためにアミノ酸配列における変化をもたらす欠失、置換、挿入又は逆位が導入 され得る。ゲノム配列は通常、約２００ｋｂを越えず、より通常には、約１００ ｋｂを越えず、好ましくは０．　５ｋｂよりも多くない。

ＦＧＦ受容体をコードするＤＮＡ配列からの少なくとも約１５個のヌクレオチド 及び約６ｋｄよりも少ない、通常的１゜０ｋｂよりも少ない配列を有するＤＮＡ 配列の部分が、ブローブとして好ましい。そのプローブはまた、特異的ＦＧＦ− ＲをコードするｍＲＮＡが細胞又は種々の組織に存在するかどうかを決定するた めにも使用され得る。

所望する繊維芽細胞成長因子受容体フラグメントをコードする天然又は合１ｉｉ ＤＮＡフラグメントが、インビトロ細胞培養物に導入し、そしてそこで発現する ことができるＤＮＡ構造体中に組込まれるであろう。通常、そのＤＮＡ構造体は 、単細胞宿主、たとえば酵母又は細菌中での複製のために適切であり、そしてま た、ゲノム内での組込みを伴って及び伴わないで、培養された哺乳類又は植物又 は他の真核細胞系への導入のためにも意図され得る。細菌又は酵母中への導入の ために調製されたＤＮＡ構造体は、典型的には、宿主により認識される複製シス テム、所望する受容体ポリペプチドをコードする意図されたＤＮＡフラグメント 、ポリペプチドコードセグメントに操作可能的に結合される転写及び翻訳開始調 節配列及びポリペプチドコードセグメントに操作可能的に結合される転写及び翻 訳終結調節配列を含むであろう。転写調節配列は、典型的には、宿主により認識 される異種エンハンサ−又はプロモーターを含むであろう。適切なプロモーター の選択は、宿主に依存するが、しかしプロモーター、たとえばｔｒｐ、ｌａｃ及 びファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター及び解糖酵母プロモーターが知 られている。Ｓ　ａ　ｍ　ｂｒｏｏｋなど、（１９８９）を参照のこと。複製シ ステム及び転写及び翻訳調節配列並びに繊維芽細胞成長因子受容体ＤＮＡ配列の ための挿入部位を含む便利に利用できる発現ベクターが使用され得る。細胞系及 び発現ベクターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、（１９８９）に記載されており ；また、Ｍｅｔｚｇｅｒなど、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ３３４：３１〜３６ も参照のこと。

これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、たとえば複製の起点、プ ロモーター、エンハンサ−及び必要なプロセッシング情報部位、たとえばリポソ ーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネー タ−配列を含む。好ましくは、エンハンサ−又はプロモーターは、多くの場合、 他のものが同等に又はより適切であることが理解されるが、繊維芽細胞成長因子 受容体をコードする遺伝子に天然において関与するものであろう。他の好ましい 発現制御配列は、ウィルス、たとえばＳＶ４０、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウ ィルス及び同様のものに由来するエンハンサ−又はプロモーターである。

同様に、好ましいプロモーターは、免疫グロブリン産生細胞に天然において見出 されるものであるが〔アメリカ特許第４、６６３．２８１号（引用により本明細 書に組込まれる）を参照のこと〕、シかしＳＶ４０、ポリオーマウィルス、サイ トメガロウィルス（ヒト又はネズミ）及び種々のレトロウィルス（たとえばネズ ミ白血病ウィルス、ネズミ又はＲｏｕｓ肉腫ウィルス及びＨＩ　Ｖ’）からのＬ ＴＲが利用され得、並びにＦＧＦ−Ｒ遺伝子に対して内因性のプロモーターでも あり得る。

Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ　ａｎｄ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、、１ ９８３　（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。

対象のＤＮＡセグメント（たとえば繊維芽細胞成長因子受容体遺伝子又はｃＤＮ Ａ配列又はその一部）を含むベクターが、良く知られた方法により宿主細胞中に トランスファーされ、これは細胞宿主のタイプに依存して変化する。たとえば塩 化カルシウムトランスフェクションは通常、原核細胞のために利用され、ところ がリン酸カルシウム処理は、他の細胞宿主のために使用され得る。Ｓａｍｂｒｏ ｏｋなど、（１９８９）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（’３に２版）、Ｃ３ＨＰｒｅｓｓ　（１９８９ ）（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。用語“形質転換された細 胞”とは、形質転換された細胞の子孫をまた含むことを意味する。

精製されたポリペプチドに関しては、リガンド結合セグメント、細胞内ドメイン 及び細胞外ドメインに関与する核酸セグメントが特に有用である。これらの遺伝 子セグメントは、これらの遺伝子の制御要素もまた重要な要素であるが、類似す る生物学的活性を示す新規の遺伝子についてスクリーンするためのプローブとし て使用されるであろう。

ＩＶ、ＦＧＦ受容体を製造するための方法ＤＮＡ配列はまた、ＦＧＦ受容体活性 を示し、又は阻害するポリペプチドを発現するために使用され得る。たとえば、 約２１個のヌクレオチド（約７個のアミノ酸）〜約２．１ｋｂ（約７００個のア ミノ酸）のＤＮＡ配列は、ＦＧＦ受容体特異的活性、典型的にはりガント結合を 有するポリペプチドを発現するために使用され得る。

発現ビークルに含まれる全受容体又は受容体の一部を発現することによって調製 され得る。発現ビークルは、当業界において良く知られている方法、たとえばリ ン酸カルシウム沈殿（下記に論ぜられている）、リポフエクション、エレクトロ ポレーション又はＤＥＡＥデキストラン法を用いて、細胞中に導入され得る。

通常、哺乳類細胞宿主は、不滅化された細胞系であろう。

ＦＧＦ−、Ｒ及びその対応する成長因子の特徴を研究するためには、シグナル配 列が細胞膜中にペプチドを向ける場合、低レベルのＦＧＦ受容体を欠くか又は有 する哺乳類細胞をトランスフェクトすることが有用であろう。有意なＦＧＦ受容 体を有さない細胞は、リンパ球、ミオサイト、グリーンモンキーｃｏｓ−７細胞 及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を包含する。形質転換された、 又はトランスフェクトされた、等の細胞は、野生型受容体に機能的に等しい受容 体をコードし、そして細胞に対してＦＧＦ−感受性マイトジェン応答を付与する 。そのような細胞は、種々の生来のＦＧＦの結合性質の分析を可能にする。トラ ンスフェクトされた細胞はまた、ＦＧＦ拮抗剤又は作用剤としての組成物又は薬 物の有効性を評価するためにも使用され得る。受容体チロシンキナーゼ活性のレ ベル又は核酸合成の速度は、トランスフエクトされた細胞と薬物とを接触せしめ 、そして薬物処理された細胞ＶＳ対照に対するＦＧＦ又はそれらの類似体の効果 を比較することによって決定され得る。宿主として使用されるがまた使用され得 る。本発明のＤＮＡ配列、たとえば完全な受容体、受容体の一部又はＦＧＦ−Ｒ 活性を有するポリペプチドをコードする配列のフラグメント又は一部は、ＦＧＦ −Ｒ又はＦＧＦ−Ｒ活性を有するポリペプチドのための発現ビークル又は構造体 を調製するために使用され得る。通常、対照配列は、哺乳類細胞における発現の ための真核生物プロモーターであろう。いくつかのビークルにおいては、受容体 自体の対照配列がまた使用され得る。Ｅ、コリを形質転換するための通常の原核 生物プラスミドベクターは、ｐＢＲ３２２又はその誘導体くたとえばプラスミド ｐｋｔ２７９（Ｃ１゜ｎ　ｔ　ｅｃｈ））（Ｂｏ　Ｉ　ａｖａ　ｒなど、、Ｇｅ ｎｅ、２：９５（１９７７））。原核生物ベクターはまた、転写開始のための原 核生物プロモーター、場合によってはオペレーターを含むことができる。最っと も通常使用される原核生物プロモーターの例は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナ ーゼ）及びラフトロモーター及びＮ−遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔ 　ａ　ｋ’ｅなど、、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：１２８　（１９８１））を包含す る。

酵母と一緒に使用されるプロモーターは、エノラーゼ遺伝糖酵素、たとえば３〜 ホスホグリセレートキナーゼの合成ノ適切な非生来性哺乳類プロモーターは、Ｓ Ｖ４０からの初期及び後期プロモータ（Ｆｉｅｒｓなど、、Ｎａｔｕｒｅ。

２７３：１１３　（１９７８））又はマウス白血病ウィルス、マウス乳癌ウィル ス、鳥類肉腫ウィルス、アデノウィルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウィルス又はポリオー マに由来するプロモーターを包含する。さらに、その構造体は、複数コピーのＦ ＧＦ受容体遺伝子が製造され得るように、増幅可能な遺伝子（たとえばＤＨＦＲ ）に連結され得る。

原核生物は、種々の方法、たとえばＣａＣ］ｚ　（Ｃｏｈｅｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（１９ｇ２））を用いて形質転換され得る。酵母は、Ｖａｎ 　Ｓｏｌｉｎｇｅｎなど、。

Ｌ、Ｈｓｉａｏなど、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７ ６：３８２９　（１９７９）により記載される方法を用いて形質転換され得る。

真核生物に関しては、哺乳類細胞は、（Ｑｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ 　Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：５４６　（１９７８））により記載されるリ ン酸カルシウム沈殿法を用いて、又はリポフェクチン（ＢＰＬ）又はレトロウィ ルス感染（Ｅ、　Ｇｉ　］　ｂｏａ。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐａｌａｔｉｏｎ　。

ｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　チャプター９．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ ｒｅｓｓ、１７５ページ（１９８３））によりトランスフェクトされ得る。適切 な配列を含む実際の発現ベクターは、連結及び制限酵素を包含する標準技法に従 って調製され得る（たとえばＭａｎｉａｔｉｓ、前記を参照のこと）。ＤＮＡの 特定部位を切断するための市販の制限酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、Ｗａｌｔｈａｍ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手できる。

クローンは、ベクター構成の態様に依存するマーカーを用いて選択される。マー カーは、同じ又は異なったＤＮＡ分子上に存在し、好ましくは同じＤＮＡ分子上 に存在する。哺乳類細胞に関しては、受容体遺伝子自体が最良のマーカーであり 得る。原核宿主においては、形質転換体がアンピシリン、テトラサイクリン又は 他の抗生物質に対する耐性により選択され得る。感温性に基づく特定の生成物の 製造は、また適切なマーカーとしても作用する。種々の方法が、ＦＧＦ−Ｒ受容 体タンパク質又はペプチドフラグメントを収穫し、そして精製するために使用さ れ得る。ペプチドは、宿主の溶解物から単離され得る。ペプチドは、それが分泌 される場合、細胞上清液から単離され得る。次に、ＦＧＦ−Ｒペプチドは、ＨＰ ＬＣ１電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー（好ましくは、イノムアフ ィニティー又はリガンドアフィニティー）を用いて、上記のようにしてさらに精 製される。

ＦＧＦ−Ｒ関連種類のｃＤＮＡクローンを単離するために使用され得るもう１つ の方法は、ポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の使用を包含する（Ｓａｉｋｉ、Ｒ， に、、など、５ｃｉｅｎｃｅ２３０　：１３５０　（１９８５））。このアプロ ーチにおいては、ＦＧＦ−Ｒ配列の明確な領域に対応する２つのオリゴヌクレオ チド（２７マー）が合成され、そして次に、ｒｎＲＮＡ源から受容体関連ｍ　Ｒ Ｎ　Ａ転写体を増幅するためにＰＣＲ反応に使用される。オリゴヌクレオチドの アニーリング及びＰＣＲ反応条件は、例２に記載されるように、減じられた緊縮 条件下で行なわれる。得られる増幅されたフラグメントはサブクローン化され、 そしてその得られる組換えコロニーが、高い及び低い緊縮条件を用いて、３２ｐ によりラベルされた十分な長さのＦＧＦ−ＲｃＤＮＡによりプローブされる（例 ２及び３を参照のこと）。低いが、しかし高くない緊縮条件下でハイブリダイズ するクローンは、ＦＧＦ−Ｒ関連ｍ　ＲＮ　Ａ転写体を示す。さらに、このアプ ローチは、スプライシングの結果として生じる変異体ＦＧＦ−ＲｃＤＮＡ種を単 離するために使用され得る（Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍ、Ａ、。

など、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８５：８９９８　（１９８８）を参照のこと）。

■、抗体 種々のＦＧＦ受容体及びペプチドフラグメントに対するポリクローナル及び／又 はモノクローナル抗体がまた調製され得る。用語抗体とは、均質分子実在物、又 は混合物、たとえば多くの異なった分子実在物から製造された血清生成物を言及 するために使用される。ペプチドフラグメントは、ペプチド合成機で合成的に調 製され、そして、キャリヤー分子すなわちキーホールリンペットヘモシアニン） に結合され、そして数か月間にわたってウサギに注射される。ウサギ血清は、Ｆ ＧＦ受容体又はフラグメントに対する免疫反応性について試験される。モノクロ ーナル抗体は、ＦＧＦ−Ｒタンパク質、ＦＧＦ−Ｒポリペプチド又はその細胞表 面上で高レベルのクローン化されたＦＧＦ受容体を発現するマウス細胞をマウス に注射することによって製造され得る。モノクローナル抗体は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ によりスクリーンされ、そしてＦＧＦ受容体タンパク質又はそのポリペプチドと の特異的免疫反応性について試験される。Ｅ、Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄ、Ｌａ ｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃ３Ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（１９８８）（引用により本明細書に組込まれる） を参照のこと。これらの抗体は、アッセイ並びに医薬に有用であろう。

所望する繊維芽細胞成長因子受容体ポリペプチドの十分な量が得られた後、すぐ にそのタンパク質は種々の目的のために使用され得る。典型的な使用は、これら の受容体への結合に対して特異的な抗体の産生である。これらの抗体はポリクポ リクローナル抗体の産生のためには、適切な標的免疫システム、典型的にはマウ ス又はウサギが選択される。実質的に精製された抗原が、動物及び免疫学者に良 く知られている他のパラメーターのために適切な方法により決定される態様で免 疫システムに付与される。注射のための典型的な部位は、足パッド、筋肉内、腹 腔内又は皮下である。もちろん、他の種も、マウス又はウサギのために代用され 得る。

免疫学的応答は通常、イムノアッセイによりアッセイされる。通常そのようなイ ムノアッセイは、同じ細胞により及び抗原が生成される同じ態様で産生される抗 原の源の精製を包含する。イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素結合 アッセイ　（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　、蛍光アッセイ又は多くの他の選択のいづれか であり、これらのほとんどは、機能的に同等であるが、しかし特定条件下で利点 を示すことができる。

１０’Ｍ−’、好ましくは１０９〜１０１０又はそれ以上の親和性を有するモノ クローナル抗体が、典型的には、Ｈａｒｌｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙ、ｏｒｋ　（１９８ ６）（これらは引用により本明細書に組込まれる）に記載されるような標準方法 により製造されるであろう。手短に言えば、適切な動物が選択され、そして所望 する免疫化手段が実施される。適切な期間の後、そのような動物の肺臓が切り取 られ、そして個々の肺臓細胞が適切な選択条件下で不滅化された骨髄細胞に融合 される。

その後、細胞がクローン的に分離され、そして個々のクローンの上清液が抗原の 所望する領域に対して特異的な適切な抗体のそれらの産生について試験される。

露を包含する。Ｈｕｓｅなど、、“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ　ａ　Ｌａｒｇｅ 　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏ ｇｌｏｂｕｌｉｎＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｉｎ　Ｐｈａｇｅ　Ｌａｍｂｄａ、” ５ｃｉｅｎｅ、２４６＋１２７５〜１２８１　（１９８９）（引用により本明細 書に組込まれる）を参照のこと。本発明のポリペプチド及び抗体は、変性を伴っ て又は伴わないで使用され得る。時々、ポリペプチド及び抗体は、検出可能なシ グナルを提供する物質を共有又は非共有結合することによってラベルされるであ ろう。広範囲の種類のラベル及び結合技法が知られており、そして科学文献及び 特許文献の両者に多く報告されている。適切なラベルは、放射性核種、酵素、基 質、補因子、インヒビター、蛍光物質、化学ルミネセンス物質、磁気粒子及び同 様のものを包含する。そのようなラベルの使用を教授する特許は、アメリカ特許 第３．８１７．８３７号；第３、８５０．７５２号；第３．９３９．３５０号； 第３．９９６．３４５号；第４．２７７、４３７号：第４．２７５．１４９号； 及び第４．３６６、２４１号を包含する。また、組換え免疫グロブリンも生成さ れ得る。（：ａｂｉｌｌｙ、アメリカ特許第４．８１６．５６７号を参照のこと 。

ｖｌ、使用方法 本発明は、繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦ−Ｒ）精製方法及び細胞内でＦＧ Ｆ受容体を合成するための方法を提供する。また、これらの方法により生成され る均質受容体、受容体又は受容体の一部をコードする核酸配列及びこれらの配列 を含む発現ビークル、ＦＧＦ−受容体を含んで成る細胞並びに受容体に対する抗 体が提供される。ＦＧＦを結合するために受容体と競争することができる結合部 位を有する、受容体の可溶形が特に興味の対象である。

しかしながら、上記で示されたように、ＦＧＦ−Ｒはたぶん二量体状態で機能す る。受容体の可溶形は、二量体を妨害し、そしてＦ　Ｇ　Ｆ　Ｕガントのための 競争的親和性とは異なる機構によるシグナルトランスダクションの阻止において 効果的である。種々の受容体形の可溶性又は細胞内又はトランスメンブランフラ グメントは、二量体形成を妨害することが予測され、そして従って、シグナルト ランスダクションの少なくともいくつかのタイプ又はそのある両分を阻止するよ うに作用することができる。

この観察は、繊維芽細胞成長因子受容体に結合する繊維芽細胞成長因子を阻害す るのに効果的な多量の繊維芽細胞成長因子受容体阻止剤を患者に投与することを 含んで成る、繊維芽細胞成長因子受容体変性活性をインビボで変性するための方 法を提供する。上記で論ぜられたように、ＦＧＦ種類のタンパク質は、多くの重 要な生理学的工程を調節することに有意な役割を有する。可溶性ＦＧＦ−Ｒポリ ペプチドは、これらの工程のＦＧＦ産生の程度の変性において効果的である。

この理由のために、受容体の可溶性形は、ＦＧＦのための競争結合部位として使 用され得る。同様に、切断されたＦＧＦ結合部位又は突然変異誘発された結合部 位、特に記載されるヒト形からの部位は、経済的及び投与に基づく医学的な副作 用の点で、同等に効果的であり得る。

本発明で提供される試薬は、ＦＧＦ産生又はＦＧＦ−Ｒ産生のいづれかの診断に おいて使用されるであろう。種々の医学的条件が、ＫａｐｏｓｉＦＧＦを産生す るＫａｐｏｓｉ肉腫及び糖尿病性網膜症が関与するこれらのタンパク質の異常レ ベルでの産生により示される。従って、これらの試薬に依存する診断試験が利用 できる。

異なったＦＧＦタイプに関しては、種々のりガントのための親和性に変動を有す る異なったタイプの受容体が存在する傾向がある。本発明の遺伝子及びタンパク 質に関しては、種々の受容体タイプ間に差異が見出されるであろう。従って、組 織マーカーが利用できるようになる。

腫瘍増殖は、微小脈管形成に依存するので、ＦＧＦ−Ｒの投与はそのような腫瘍 増殖を妨げるように作用し、そしてそのような腫瘍増殖の抑制をもたらす。ＦＧ Ｆ活性化の防止により、本発明は、腫瘍増殖を攻撃するための手段物質に重要な 付加物を提供する。

ウィルス感染はまた、侵入工程のために特定の受容体への結合に依存する。Ｈ３ Ｖ　（ヘルペス単純ウィルス）はＦＧＦ−Ｒタンパク質に結合することによって 感染する示唆的な証拠が存在する。従って、治療的に有効な量のＦＧＦ−Ｒ可溶 形又はフラグメントの投与は、細胞侵入のためのこの機構を使用するこのウィル ス又は他のウィルスへの暴露の危険性を最少にするために予防的手段として作用 することができる。

再び、保護機構は、競争的結合、二量体構造の破壊、それらの組合せ又は他のも のに依存する。

効果的な治療のために必要な試薬の量は、多くの異なった要因、たとえば投与の 手段、標的部位、患者の生理学的状態及び投与される他の医薬に依存するであろ う。従って、特定の状態の処理のための用量を滴定すべきである。典型的には、 インビトロで使用される用量は、これらの試薬の現場投与のために有用な量での 有用な誘導を提供する。特定の疾患の処理のための用量の動物試験は、ヒト用量 の予測的示唆をさらに提供するであろう。種々の考慮が、Ｇｉｌｍａｎなど、。

Ｙｏｒｋ　（１９８５）（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。Ｆ ＧＦとその受容体との間の高い親和性結合のために、これらの試薬の低い量が初 めに効果的であると予測される。従って、用量範囲は、適切なキャリヤー中にお いて、１ｍＭ以下の濃度の量、典型的には約１０μＭａ度以下、通常約１１００ ｎ！度以下、より通常には約１ｎＭｍ度以下、好ましくは約１０ｐＭ！度以下、 より好ましくは約１０１００ｆフエトモル）ａ度以下及び最っとも好ましくは約 １ｆＭ以下の濃度の量で存在することが通常予測される。

本発明は、次の例示的な例により、さらに理解されるであまず１２Ｓ１−標識化 ｂＦＧＦをスイス３Ｔ３細胞に競合的に結合させた。図１　（Ａ＞において示す 通り、　１′■−標識化ｂＦＧＦ　（２Ｃｉ／、ｃｚｍｏｌ　）を集密３Ｔ３細 胞（１０５個の細胞当り６ｆｍｏｌの＋２ｓｉ−標識化ｂＦＧＦ）に、表示した 濃度の未修飾ｂＦＧＦ　（−Ｘ−）；ビオチン−ｂＦＧＦ　（べた塗りの四角） ；ビオチン−ｂＦＧＦをアビジン−アガロースとインキュベートした後の未結合 画分（白抜きの四角）；ｂＦＧＦをアビジン−アガロースとインキュベートした 後の未結合画分（白抜きの三角）の存在下において加えた。結合は、ゼラチン０ ．　２％及びヘパリン（１５Ｕ／ｍｌ）を含む培養培地（ＤＭＥ　Ｈ２１）中で 、３７℃で３０分間行った。

この細胞を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，４）　、０．２％のゼラチン、及 び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液により３回洗浄した。存在する放射能はベ ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ガンマ−カウンターにおいて測定した。最大の結合 （阻害０％）は５７００ｃｐｍの特異的結合を示す（非特異的結合は６００ｃｐ ｍであった）。全ての測定は三重測定で行った。組換１ｅｒｃｅ）を用いてヨー ド化せしめた。このｂＦＧＦは、ＩＲのＦＧＦ、０．２ＭのＮａＰｉ、ｐｔ１７ ．４、ｌ０ＤＯＢＥＡＤＳ２個当り０．５−１ｍＣ１の１２５１を用い、室温で １５分間インキュベートし、Ｎａメタビスルフィット及び過剰量のＫＩによるク エンチによりヨード化させた。ヨード化ｂＦＧＦを、０．２ＭのＮａリン酸塩、 ｐＨ７，５，０，２ＭのＮａＣ１，０，２％ゼラチンにより平衡化したＰＤＩＯ カラムでのゲル濾過によって未反応の遊離ヨウ素から分けた。このｂＦＧＦをＹ 　ａ　ｍ　ａ　ｍ　ｏ　ｔ　ｏらのＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１７６：７５　（１９ ８４）の方法に従って、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，ｏ＞中において 、ヨードアセチル−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）をシスティン残基より４： １の過剰な量にて、４℃で５時間かけてビオチニル化させた。未反応ビオチンを 前記の通りＰＤＩＯカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によるゲル濾過によって除去 した。この精製工程の間、修飾ｂＦＧＦは、　１′■−標識化ｂＦＧＦのスイス ３Ｔ３細胞における高親和性ｂＦＧＦ！Ｊセブターへの結合を阻害する能力にお いて、そしてｂＦＧＦ誘発性チロシンキナーゼ活性の基質として知られる９０ｋ Ｄのタンパク質のリン酸化を刺激するその能力において未修飾ｂＦＧＦと区別さ れない。図１　（Ａ）参照のこと。アビジン−複合化アガロースへの結合による 測定により、このビオチニル化反応は９０から９５％のｂＦＧＦ分子を修飾せし めた。

図１　（Ｂ）において示す通り、細胞におけるｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセプターは 標識化ｂＦＧＦと架橋している。　′２５Ｉ＝標識化ビオチアーｂＦＧＦ又は＋ ２５１　．１９識化ｂＦＧＦ　（０，１ｐｒｎｏｌ）を、表示の通りに未標識ｂ ＦＧＦの存在下又は非存在下においてスイス３Ｔ３細胞（５Ｘ１０Ｓ個の細胞） に加えた。この細胞を洗浄し、そして０．１５Ｍのジスクシニミジルスベレー） 　（ＤＳＳ＞（Ｐ　ｉ　ｅ　ｒ　ｃ　ｅ）と架橋させた。次にこの細胞を溶解し 、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけ、そして１２５Ｉ −標識化タンパク質をオートラジオグラフィーにより検定した。　′２５Ｉ−標 識化ビオチンーｂＦＧＦは高い親和力でスイス３Ｔ３細胞におけるｂＦＧＦリセ ブターに結合しており（解離定数１ｎＭ）、そして＋２５Ｉ−標識化ｂＦＧＦに 架橋しているｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセブターと共に泳動する１３０ｋＤのタンパ ク質と架橋していた。

精製ニワトリｂＦＧＦリセプターを、新鮮な６日目のニワトリ胚（段階２９−３ ０）を、プリンクマンポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　ｐｏｌｙｔｒｏｎ）に より；（１５００個の胚／バッチ）；最終濃度が０．２５Ｍのスクロース、５０ ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐ）１７．５）　、２ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＦ 、１５０ＩＭのナトリウムオルソバナデート（ｓｏｄｉｕｍ　ｏｒｔｈｏｖａｎ ａｄａｔｅ＞、３０ｍＭのナトリウムピロホスフェート、１ｍＭのフェニルメチ ルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）　、アプロチニン（２０から３０のカソク レイン国際単位（Ｋ　Ｉ　Ｖ）　／ｍｌ＞　、ロイペプチン（Ｌｏｚ／ｍｌ）及 びペプスタチン（１ｇ　／ｍｌ）中で（１：１ｖ／ｖ）、ホモナイズすることに より調製した。このホモジネート品を４℃で４５分間、１７．７００ｇで遠心し た。

このパレットをホモシネ−ジョン用緩衝液（３００ｍｌ）に再懸濁し、そして得 られる懸濁物を膜画分（Ｍｂ）と称する。

次にこの膜画分を等容最の２Ｘの溶菌緩衝液（ＩＸの溶菌緩衝液は１０ｍＭのト リス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）より成る）、５０ｍＭのＮａＣ１，５ｍＭのＥＤ ＴＡ、１％のトリトンＸ−１００，５０ｍＭのＮａＦ、１５０ＩＭのナトリウム オルソバナデート、３０ｍＭのナトリウムピロホスフェート、１ｍＭのＰＭＳＦ 、アプロチニン（２０から３０のＫＩＩＪ／ｍｌ）、ロイペプチン（１０ｇ／１ １＋１）及びペプスタチン（ｌｘ／ｍｌ）に４℃で３０分間インキュベートし、 その後３１．０００ｇで３０分間遠心した。この上清液をバッチ方式で１５０ｍ １のＷＧＡ−セファロース４Ｂカラムに適用し、３００ｍ１の溶菌緩衝液で洗浄 し、次に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０％の グリセロール、０．１％のトリトンＸ−１００，５０ｍＭのＮａＦ、１５０．ｃ ｚＭのナトリウムオルソバナデー）、３０ｍＭのナトリウムピロホスフェート、 １ｍＭのＰＭＳＦ、アプロチニン（２０から３０ＫＩｔｌ／ｍ１）、ロイペプチ ン（Ｌｏｐｓ／ｍｌ）及びペプスタチン（１〜／ｍｌ）を含むカラム緩衝液５０ ０ｍ１により洗浄した。このカラムを、０．５ＭのＮ−アセチルグルコサミンを 含むカラム緩衝液により溶出せしめた。ピークタンパク質を含む画分を混合し、 そして−７０℃で保存した。

胚膜及びＷＧＡ溶出液中のＦＧＦ−Ｒの存在を調べるため、ニワトリ胚膜画分（ Ｍｂ）１０／ｎ又はＷＧＡ−セファロース４Ｂカラムからの溶出液１００Ｉを、 　＋′Ｉ−標識化ｂＦＧＦ−Ｒ（０，１ｐｍｏｌ）と２００倍過剰量の未標識ｂ ＦＧＦの存在下（＋）又は非存在下（−）において３７℃で３０分間インキュベ ートすることにより、ニワトリｂＦＧＦリセプターを架橋せしめた（図２（Ａ） 参照）。ＤＳＳを０．１５ｍＭの濃度となる迄加え、そしてこの反応混合物を氷 上で１０分間インキュベートした。サンプルを５ＤＳＰＡＧＥにかけ、そして次 にオートラジオグラフィーにかけた。　１２５■−ｂＦＧＦの粗ニワトリ胚膜画 分への特異的な結合及び架橋は、１５０ｋＤａの単一タンパク質バンドのみを示 した（図２　（Ａ））。

ｂＦＧＦの分子質量を差し引いた後のニワトリｂＦＧＦリセブター〇推定サイズ は１３０−１３５ｋＤａであった。

図２（Ｂ）に示す通り、２通りの大量スケールリガンドアフィニティー精製を行 った（それぞれは２０．０００個の胚からの材料を用いている）。ＷＧＡ−セフ ァロース４Ｂカラムからの溶出液を、前記の通りに調製したビオチン−ｂＦＧＦ （リガンドのりセブターに対する比が１０＝１の過剰量）及び１５０／ｍｌの濃 度のヘパリン（低親和性結合を引き下げるため）と共に４℃で３０分間インキュ ベートした。次にこの混合物を１０ｍ１のアビジン−アガロースカラム（ｂＦＧ Ｆ−アガロース）に２回通過させた。タンパク質のアビジン−アガロースへの非 特異的結合（コントロール）を測定するため、ＷＧＡ−セファロース４Ｂカラム からの溶出液をビオチン−ｂＦＧＦの非存在下においてアビジン−アガロース循 還サセタ（コントロール）。このカラムを、０．２ＭのＮａＣ１を含む前記のセ ファロースカラムに用いたカラム緩衝液２００ｍ１で洗浄し、次にＮａＣｌを含 まないカラム緩衝液（３００ｍｌ）で洗浄し、その後カラム緩衝液中の１０ｍＭ のスラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）により溶出せしめた。４つの連続する画分を集め （画分１−４）そして各画分のサンプルを５ＤＳＰＡＧＥにかけ、そして硝酸銀 により染色した。図２　（Ｂ）において示す通り、ＦＧＦ依存状態において一種 のタンパク質のみがアビジンアガロースに結合し、そしてこれはｂＦＧＦリセプ ターの推定サイズ（１３０ｋＤａ）で泳動した。

溶出タンパク質をアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、そしてクマジーブ ルーにより染色した。ｂＦＧＦリセプターに相当するバンドを切り出し、そして そのタンパク質をさせた。この方法は全回収率５％にて、１個のニワトリ胚当り ２から５％ｇの純粋なＦ　Ｇ　Ｆ　Ｕセプターの精製をもたらした。

リセブターの更なる特徴付けのため、タンパク質をトリプシンにより消化せしめ た。ペプチドフラグメントを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ り単離し、そしてＹａｒｄｅｎら（前記）詳細の通り気相シーケンシングにより 分析した。２つの独立した調製品から、図３に示す通りの１４種のペプチドのア ミノ酸配列が得られた。これらのペプチドのうちの３種は画調製品に共通してお り、２つの独立の単離品の間の同一性を示唆した。４種のトリプシンペプチド（ ＬＩＬＧＫＰＬＧＥＧＣＦＧＱＶＶＬＡ、ＩＡＤＦＧＬＡＲ，ＭＡＰＥＡＬＦＤ Ｒ及びＩＹＴＨＱＳＤＶＷＳＦＧＶ　；表１及び図３参照）はチロシンキナーゼ ドメインについての一致配列に相当した（図６）。このことは、チロシンキナー ゼ活性がＨｕａｎｇ及びＨａｕｎｇ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ匹、２６１；９５６ ８　（１９８６）に記載の通りｂＦＧＦリセブターに関連している発見と一致す る。従って、この精製タンパク質は精製ｂＦＧＦリセプターであることが分った 。

その理由は、ｂＦＧＦと結合しているそれはりセブターの予想される分子量であ り、そしてチロシンキナーゼ配列を含むことによる。

前述した通り、これら１４種のペプチドのうちの１１種のアミノ酸配列は、先に 公開されている、ｆｌｇ（ｆｍｓ様遺伝子）と呼ばれる部分的ヒ）　ｃＤＮＡク ローンの配列と同一であった。ＲｕｔａらのＯｎｃｏｇｅｎｅ、３：９（１９８ ８）を参照のこと。この配列はそれらのかん原遺伝子配列と同一性に基づいて単 離される。これは今迄トランスメンブランリセブタータンバク質をコード化する ものとは知られていニワトリ胚（６日目）ｃＤＮＡライブラリーをサイズ選別し たポリＡ”ｍＲＮＡから組立てた。２００■のポリＡ”ｍＲＮＡを１０％−３０ ％のスクロース勾配上でサイズ分画し、そして３．５ｋｂ以上のｍ　ＲＮ　Ａを 含む画分をプールした。５ｎのサイズ分けしたｍ　ＲＮ　Ａを、Ｕ、Ｇｕｂｌｅ ｒ及びＢ。

Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ２５：２６３　（１９８３）の方法に従い、ファルマ シアからのｃＤＮＡ合成キット（カタログ＃２７−９２６０−０１）を用いてｃ ＤＮＡを作るために利用した。この合成ｃＤＮＡを、２．０ｋｂ以上のｃＤＮＡ についてサイズ選別し、そしてこのサイズ分けしたｃＤＮＡを次にバタテリオフ ァージベクターＺａｐＩ　Ｉ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ＃２３６２１ １）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化せしめた。得られたｃＤＮＡライブラリーは ２．０×１０６個の独立組換体を含んでいた。

このライブラリーを、図３において示す２種類の連続ベブｆＹ　（ＴＶＡＬＧＳ ＮＶＥＦＶＣＫ及びＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫ）をコード化する３２Ｐ−標識 化オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーンせしめた。このオリゴヌクレオ チドは市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製した。１２個の塩基 重複相補性配列を含む２種類の４３−４５塩基のヌクレオチドをアニール化し、 そしてｄＮＴＰ（−ｄＣＴＰ）　、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントによる埋め合わせにより標識化し、７０ ｂｐの標識化プローブが得られた。フィルターを低い緊張条件（２０％のホルム アミド、５ｘの標準食塩水クエン酸（ＳＳＣ）及び５Ｘのデンハージ（Ｄｅｎｈ ａｒｄｔ）溶液にて４２℃で）のもとてハイブリダイズ化し、そして４２℃で０ ．２ｘのＳＳＣにより洗浄した。２５個の陽性クローンが３回のプラーク精製の 後に単離された。２５個の陽性クローンのうち、１１個が高緊張状態にてヒトＦ ＧＦ−ＲｃＤＮＡ標識物とニックトランスレーションによりハイブリダイズされ 、そしてこれをプローブとして利用した（例３参照）。

１１個のクローンのうちの全てが、そのクローンの５′末端での長さにおける変 化以外実質的に同一であった。最も大きいクローン（３，２ｋｂ）のアミノ酸配 列は、前記のタンパク質精製において得られる１４種のりセプターペプチドの全 ての配列を含み（図３参照）そしてＦＧＦ−Ｒの完全なコード化配列を含んだ。

トランスメンプラン領域及び疎水性シグナル配列は、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔ ｔｌｅのヒドロハシ−（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）分析により同定した（Ｋｙｔｅ 及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、、１５７：１０５　（１９８ ２））。

約３．　５ｋｂの一本のハイブリダイズバンドを、ニワトリ胚ポリ　（Ａ）　＋ ＲＮＡ　（５ｆｆ）を全長ニワトリｂＦＧＦリセブターｃＤＮＡにより高緊張条 件（５０％のホルムアミド）、即ち、５Ｘデンハーツ溶液及び５ｘのＳＳＣにて ４２℃のもとてプローブ化することにより同定した。次にフィルターを０．２Ｘ のＳＳＣにより６５℃で洗浄した。ＲＮＡプロット分析により同定した３、５ｋ ｂの単一ハイブリダイズバンドを図５　（Ａ）に示す。このクローンの５′末端 付近の配列に相補性のオリゴヌクレオチドによるプライマー伸長実験を行った。

ニワトリ胚ポリ　（Ａ）　＋ＲＮＡ　（５Ｎ）を１０ｍＭのメチル化水銀により 変性せしめ、３２Ｐ−標識化プライマー（５′−ＣＴＧＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＣ ＧＣＡ−３’　）へとアニール化せしめ、そしてマウスモロニー（Ｍｏｌｏｎｅ ｙ）白血病ウィルス逆転写酵素により伸長せしめた（図５（Ｂ）参照二列（Ｓ） は３２ｐ−標識化ＤＮＡ分子量標準品（１ｋｂ）を表わし；列（Ｅ）は伸長化フ ラグメント（５２３個のヌクレオチド）を表わし；列（Ｇ、　Ａ、　Ｔ及びＣ） は５％のアクリルアミドシーケンシングゲルを表わす。このデーターからこのリ セプターのｍＲＮＡは単離したクローンよりも４８個のヌクレオチド分長いこと を示唆する。

最も長い解読フレーム（２，４ｋｂ）のアミノ酸配列は、フレーム内（ｉ　ｎ８ −　ｆ　ｒ　ａｍｅ）停止コドン（アミノ酸残基−１２）、その後に続く開始メ チオニン（残基１）及びリセブター全体をコード化する配列を含む（図３）。こ のｃＤＮＡは、種々の周知の成長因子リセブターにおいて見出せる特徴を有する 推定分子質量９１．７ｋＤを有すタンパク質をコード化した。これは単相膜スパ ニング領域、ＮＨ２−末端疎水性シグナル配列、３種の細胞外イムノグロブリン 様ドメイン及び細胞間チロシンキナーゼドメインを含んだ（図６）。１１個の潜 在性Ｎ−結合グリコシル化部位も見い出された。ニワトリｂＦＧＦ’Ｊセブター のＮ−と〇−結合グリコシル化は、ｂＦＧＦのりセプターの見い出されたサイズ とｃＤＮＡ配列から予想されるサイズとの間の相違によるであろう。

予想される細胞外領域における三種のイムノグロブリン様ドメインを３つの評価 に基づいて同定した：　（１）各ドメインにおける２つの特徴的なシスティン残 基の存在；　（ｉｉ）各イムノグロブリン様ドメインにおける第１システイン残 基のＣ０ＯＨ末端側上の１１から１２のアミノ酸での一致するトリプトファン残 基の存在；そして＜１ｉｉ）各イムノグロブリン一様ドメインにおける第２シス テイン残基のＮＨ２末端末端側御致配列ＤＸＧＸＹＸＣの存在。インターロイキ ン−１（ＩＬ−１）　リセブターも３種のイムノグロブリン様ドメインヲ有シ、 そしてｂＦＧＦはＩＬ−１と２５−３０％一致する配列を有する。血小板由来成 長因子（ＰＤＧＦ）及びコロニー刺激因子−Ｉ　（Ｃ３Ｆ−１）に対する５種の イムグロブリン様ドメインがこのリセブターに存在する。

第１と第２イムノグロブリン一様ドメインとの間に、このｂＦＧＦリセプターは 他のイムノグロブリンスーパーファミリーの構成員には見い出されていない特徴 を有した。８個の一連の連続する産生残基（ＥＤＤＤＤＥＤＤ）　、その後に続 く３個のセリン残基及び２個の更なる酸性残基が存在する（図３）。中断されて いない７から３５個の酸性残基の鎖が複数の細胞間タンパク質、特に核タンパク 質について述べられているにもかかわらず、このような酸性領域はトランスメン プランリセブタータンパク質の細胞外領域においては異常である。

他の異常な特徴は傍膜（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）領域、即ち、膜スバニン グセグメントとキナーゼドメインの間の領域の長さにある。この領域は通常リセ プターチロシンキナーゼの中に保存されている。例えば、ＰＤＧＦＳＣ３Ｆ−１ 、表皮成長因子（ＥＧＦ）　、ヒト表皮成長因子−２（ＨＥＲ２）及びインスリ ンのためのりセプターにおける長さにおいて、この傍膜領域は一貫して４９から ５１個の残基である。

このｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　＋Ｊセプターは約８７個の残基の異常に長い傍膜領域を有 する。

このアミノ酸配列の細胞質領域は約４２４個の残基の長さであり、そしてチロシ ンキナーゼ配列を含む（およそ４８２から７５９での残基）。全体にわたり、こ のｂＦＧＦリセプターのキナーゼ領域は、ＰＤＧＦ及びＣ３Ｆ−１リセプターと の最も同一性の高い配列（約５１から５３％）を分担する。

このｂＦＧＦリセブターは、ＧＸＧＸＸＧのモチーフ及び保護されたりジン残基 （約５１２での残基）であって、チロシンキナーゼのアデノシン５′−３リン酸 （Ａ、ＴＰ）結合部位の一部を形成するものを含む。このｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　ＩＪ セブターは二つの特徴的なチロシンキナーゼモチーフ、ＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬ及 びＤＦＧＬＡＲ，並びにチロシンを（約６５１番目の残基）ｐｐ６０ｖ−％１ｃ の主たるリン酸化部位に類似する位置（およそＴｙｒ４１６）にて有する。

その他のチロシンキナーゼとの同一性により定義される、このｂＦＧＦリセブタ ーのキナーゼをコード化する配列は、１４個のアミノ酸の挿入により分断されて いる。このキナーゼ領域における挿入部の長さはＰＤＧＦ及びＣ３Ｆ−４に対す るリセプターにおいて見い出せる（ぞれぞれ１０４及び７０個のアミノ酸）もの よりも短く、そしてインスリン及びインスリン様成長因子−Ｉに対するリセプタ ーにおける挿入配列の長さに類似している。

ヒトＦＧＦリセブターｃＤＮＡクローンを、Ｅ、５ａｄｌｅｒ　（Ｒ，Ｄ、　Ｙ ｅ　Ｔ−ＣＷｕｎ及びＪ、Ｅ、５ａｄｌｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６ ２：３７１８−３７２５（１９８７））から得られるヒト内皮細胞ｃＤＮＡライ ブラリーから、例２記載と同一のオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離した 。

この内皮ライブラリーを高緊張のもとでＩ　Ｘ　１０　”ｃｐｍ／ｍｌの４Ｊ＆ プローブとハイブリダイズせしめた（５０％のホルムアミド、５ＸのＳＳＣ，５ Ｘのデンハージ、１０ｍＭのＮａＰ　Ｑ４　、ｐｔ１６．　５．１００Ｒ／ｍｌ のサケ精子ＤＮＡで４２℃（１６−２４時間）、そして０．２ｘＳＳＣ，０，１ ％のＳＤＳによる６５℃で洗浄）。

ヒト内皮細胞ｃＤＮＡライブラリーの第１スクリーニングより、４個のクローン が同定され、そして３回のプラーク精製を通じて精製した。これらのクローンの うちの３個からのＣＤＮＡ［入物が同一の配列を作り、そして精製ニワトリｂＦ ＧＦ−Ｒ由来のトリプシンフラグメントの配列と同一性の高い配列を含んでいた 。最も大きいクローン（約３．　６ｋｂ）のアミノ酸配列及び核酸配列を図４に 記載する。およそ１−２１のアミノ酸は疎水性シグナル配列を表わし、およそ２ ２−２８５のアミノ酸はりガント−結合ドメインを含む細胞外領域を表わし、お よそ２８６−３０６のアミノ酸はトランスメンプラン領域を、そしておよそ３０ ７−７３１のアミノ酸はチロシンキナーゼドメインを含む細胞質領域を含んだ。

この方法は、その他の親近性の高いヒトＦＧＦリセプターも単離せしめた。

ヒト内皮細胞又は胎盤のライブラリーを、全長ＦＧＦ−Ｒプローブ又はＦＧＦ− Ｈについての配列部分を含むプローブによりスクリーンした。ハイブリダイゼー ションは低緊張条件にて行い、そして緊張度の高いインクレメントにおいて洗浄 した。例２及び例３に記載の低及び高緊張条件を続げた。

各インクレメントの間、オートラジオグラフィーを行った。

最も高い緊張条件にわたり陽性であるクローンが例２及び３に既に記載のｂ　Ｆ 　Ｇ　Ｆ　Ｕセブターに最も親近である。緩和された緊張条件で陽性であるが、 高い緊張条件では陽性でないクローンは親近性が遠い。親近ではあるが同一でな い全て（図４）のクローンを制限地図化及びＤＮＡシーケンシングにより決定し た。親近する全てのクローンを選別し、サブクローン化し、そして発現させた。

発現したＦＧＦ−親近ｃＤＮＡを次にその種々のＦＧＦ、即ち、酸性ＦＧＦとの 結合能力のために試験した。

他方、二種のプローブをデザインした。一方のプローブは細胞間ＦＧＦ−Ｒ配列 を含み、そして他方は細胞外ＦＧＦ−Ｒ配列を含んだ。三重のフィルターを作り 上げた。１つのフイルターは高緊張度（例２及び３参照）にて細胞間ＦＧＦ−Ｒ プローブとハイブリダイズさせた。２つのフィルターは細胞外プローブとハイブ リダイズさせ、一方のフィルターは高緊張度にて、そして他方は低緊張度による 。酸性及び塩基性ＦＧＦは５５％の配列の同一性しか有さないため、これらのり セプターもそのリガンド−結合ドメインにおいて約５５％の配列同一性を示すで あろう。細胞間プローブに対して高緊張度にて陽性であり、且つ細胞外プローブ に対して低緊張度にてのみ陽性であるクローンがＦＧＦ−Ｒ親近性リセブターで ある。これによりクローンを選別し、制限地図化を行い、シーケンス化し、そし て発現させた。発現したりセプターを、それらの種々のＦＧＦ例えば酸性ＦＧＦ への結合能力について試験した。

プラスミドの組立て。

感染実験のため、４６個のヌクレオチドの５′非翻訳配列及び３′非翻訳配列全 体を含む全長ニワＩ−ＩＪ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセブタ−ｃＤＮＡ、並びに１３個 のヌクレオチドの５′非翻訳配列及び３′非翻訳配列全体を含む全長ヒ）ｈ２ｃ ＤＮＡを、それぞれ哺乳類発現ベクターｐＳＶ７ｄ　（Ｐ、Ｌｕｃ　ｉｗ、Ｃｈ ｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｓ　ａＩＩ部位 にサブクローン化せしめた。これは、リセプターＣＤＮＡフラグメントを、ＳＶ ４０プロモーター構成要素から下流に適切な配向性において直接位置せしめた。

試験管内にて転写ＲＮＡを作るための鋳型として利用する構造物を調製するため 、全長ニワトリＦＧＦＩＪセブターＣＤＮＡをブルースクリプトＳＫ　（Ｂｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ／Ｓａ　Ｉ　ｆ部 位にサブクローン化し、そして全長ヒトＦＧＦリセブターｃ　ＤＮＡ（ｈ２及び ｈ３）をブルースクリプトＫＳのＰ　ｓ　ｔ　Ｉ　／　Ｓ　ａ１■部位にサブク ローン化した。これはりセプター配列を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター 構成要素から下流に直接位置せしめる。効率的な翻訳の率を高めるため、開始メ チオニン残基上流のＡＴＧ配列をサブクローン化前に除去した。

ニワトリ及びヒト構造的について、それぞれインタクト５′非翻訳配列の４６個 及び１３個のヌクレオチドを残している。

細胞系及び感染。

ラット上６骨格筋筋芽細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１４５８）を、１０％の仔牛血清 を含むＤＭＥ　Ｈ２１中で生育させ、そして感染の寸前にＯｐ　ｔ　ｉ　−ＭＥ Ｍ　（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ）の中に移し入れた。平板培養してから２４時以内にｌＸ ｌ０’個の細胞を２０〜の適当な発現構造物（ｃＦＧＦＲ／ｐｓＶ７ｄ又はｈ２ ＦＧＦＲ／ｐＳＶ７ｄのいづれか）及びネオマイシン耐性遺伝子（ｐＳＶ２ｎｅ ｏ）を含む１鱈のベクターにより同時感染せしめた。細胞を、リポフエクチン（ Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ：Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）５０ｐｇを用い、この製造者により付与されているプロトコールに 従って感染せしめた。１６時間、２０％の仔牛血清を含む等容量のＤＨＥＩ−Ｉ ２１培地を加えた。４８時間後、細胞を収穫し、そして選択培地（ＤＭＥＨ２１ ，１０％の仔牛血清、５００ｘ／ｍｌのゲネチシン（ＧＩＢＣＯ））に縫代培養 した（１　：　１０）。感染コロニーを、抗−リセブターペプチドポリクローナ ル抗血清によるイムブロッティングにより、ＦＧＦリセブターの発現ついてのア ツセイした。

親和性標識。

組換ヒトａＦＧＦ及びヒトｂＦＧＦがＣｈｉｒｏｎ社の好意により提供され、そ して標識した。親和性標識のため、５×１０６個の細胞を３７℃で３０分間、２ ００倍過剰量の関連する未標識リガンドの存在下は非存在下において０．１ｐｍ ｏ　Ｉの１２Ｊ−ａＦＧＦ又は１２５Ｉ−ｂＦＧＦとインキュベートした。次に この細胞を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７，４，０，２％のゼラチンを含む水冷 ＤＭＥ　Ｈ２１により一回洗浄し、そして水冷ＰＢＳで２回洗浄した。最終濃度 が０．１５Ｍとなる迄ジスクシニミジルスベレートを加え、そして４℃で１５分 間インキュベーションを行った。次にこの架橋剤を除去し、そしてこの細胞を、 １００ｍＭのジチオスレイトールを含むサンプル緩衝液に再懸濁し、５分間煮沸 し、そして５ＤＳＰＡＧＥにかけ、続いてオートラジオグラフィーにかけた。

ＲＮＡの試験管内転写。

転写前に、プラスミド構造物をＸｈｏＩにより直線化せしめた。５００ＩＭのｒ ＮＴＰ　（２００ＩＭのｒＧＴＰ）及び５００ＩＭの５°ＧｐｐｐＧ”（ファル マシア）の存在下においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、この直線状鋳型か らＲＮＡを転写した。４℃で２時間のインキュベーションに続き、転写反応物を 無ＲＮＡ５ｅのＤＮＡ５ｅで処理し、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、乾 燥し、そして水に再懸濁させた。

卵母細胞の注入 動物を０．０６％のエチルｐ−アミノベンゾエートの溶液において麻酔した。卵 母細胞を手術的に除去し、そして手操作により１０−２０個の卵母細胞を含むク ラスターへと切開した。クラスターを改良パース食塩水（Ｂａｒｔｈ　Ｓａｔｉ ｎｅ）（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓらの、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ＣＩｓ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８ ２）を参照のこと；本明細書に参考文献として組入れている）ＭＢＳＨであって １ｍｇ／ｍｌのタイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含むものの中で室温で ２時間インキュベートし、その後よく、２ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳ Ａ）を含むＭＢＳＨにより洗浄した。個々の卵母細胞をＭＢ　Ｓ　Ｈ（１ｍｇ／ ｍｌのＢＳＡ）中で１９℃にて保存した。

卵母細胞に、５０ｎ１の水又はＲＮＡ溶液（水中にて１　ｎｇ／ｄ）を植物極に おいて注射した。注射後、４５Ｃａ″′＋流出アッセイを行う前に１９℃で４８ 時間インキュベートした。

”Ｃａ　”＋流出アッセイ 注射された卵母細胞５０個のグループを２４ウエルプレートの単一ウェルに入れ 、そしてＢＳＡを含まない無Ｃａ　”ＭＢＳＨ溶液０．　５ｍｌで４回洗浄した 。次に卵母細胞を、４５Ｃａ　Ｃ１２（１００μｃｉ／　ｍｌ）を含む洗浄溶液 ０．　５ｍｌ中に１９℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、 卵母細胞を０．　５ｍｌのＭ　Ｂ　Ｓ　Ｈ（１ｏ＋ｇ／ｍｌのＢＳＡ）により６ 回洗浄し、次に他の２４ウエルプレートに移した（各ウェル当り５個の卵母細胞 ）。その後の洗浄及びインキュベーションの全ては１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む ０．　５ｍｌのＭＢＳＨを用いて行った。１０分間のインターバルにて、コンデ ィショニングした上清を各ウェルから除去し、そして新鮮な培地に移し入れた。

このコンディショニングされたサンプルをそれぞれベックマンシンチレーション カウンターにより測定した。

バックグランド流出が安定したら、リガンドを特定の濃度迄加え、そして培地収 集を続けた。

１６回の実験のうちで２回、水を注入されそしてａ　ＦＧＦ又はｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ のいづれかにより刺激された卵母細胞が、ＦＧＦ　ＩＪセプターＲＮＡを注入さ れた卵母細胞由来の４ＳＣａ＋４溶出レベルと類似のそれを示した。これらの予 想されなかった応答についての理由を我々はまだ分っていないが、しかしこれは 夾雑している卵母細胞又は卵母細胞自体の表面上の内因性Ｆ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセブ ターの発現に起因することが考えられる。その他の全ての実験において、水の注 入された卵母細胞は有意な溶出応答を有さず、しかるにリセブターＲＮＡのＦＧ Ｆに対する応答性は基底値の１０から４０倍であった。

注射された卵母細胞におけるリセブターのレベルは測定しておらず、その理由は 我々の抗−リセプターボリクローナル抗血清は、ウェスタンプロットに基づ＜Ｆ ＧＦリセブターとほぼ同じ分子量の豊富な卵母細胞タンパク質を非特異的に認識 するからである。更に、卵母細胞において発現する外因性リセブターのレベルも 比較的低い。

ヒ）ｃＤＮＡクローンの単離反び特徴付け。

ヒト胎盤及びヒトへそ静脈内皮細胞由来の相補性ＤＮＡライブラリーをＪ、Ｅｖ ａｎ　５ａｄｌｅｒ　（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｈ ｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ）の好意により提供された 。

このライブラリーを、ニワトリＦＧＦリセプターｃＤＮＡクローンを同定するた めに先に用いたものと同一の３２ｐ−標準化オリゴマーによりスクリーンした。

フィルターをハイブリダイズ化し、そして標準の方法を用いて高緊張条件のもと で洗浄した。総計７個の陽性クローンが、両ライブラリー由来の２５０．０００ 個のファージをスクリーンした後に単離された。本明細書に記載の４つのクロー ン（ｈ２．ｈ３．ｈ４及びｈ５）はジデオキシ連鎖停止方法によりシーケンス化 （Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）系（Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてシーケンス化した。クローンｈ２．ｈ３ 及びｈ４は内皮細胞ライブラリーから得られ、そしてクローンｈ５は胎盤ライブ ラリーから得られた。ヌクレオチド配列分析は、これら４つのクローン全てが同 一の５′非翻訳配列を含み、そしてボＩＪ−Ａ部分をその３′末端に有すること を示した。しかしながら、ｈ２の３′末端のボＩＪ−Ａ部分のみの上流に一致し たポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ　；　３７）があり、これは内部 プライミングがその他のクローンの３′末端のポリＡ部分に重要であることを示 唆する。ｈ２．ｈ３．ｈ４及びｈ５ｃＤＮＡはそれぞれ０．　９３ｋｂ、　０． 　７８ｋｂ、　０．　９５ｋｂ及び０．２ｋｂの３′非翻訳配列を含んだ。ｈ２ 及びｈ３の３′非翻訳配列は同一であり、そしてｈ４及びｈ５の３′非翻訳配列 も同一であった。一方、ｈ　２／ｈ　３の３′非翻訳配列はｈ　４／ｈ　５の３ ′非翻訳配列と全体的に異なったいた。

ヒト高酸性領域に相当する１種のプライマー（ｈ２における、およそ４４−５２ アミノ酸；　５’　ＧＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴ−３ ’　）及びニワトリＦＧＦリセブターのＩｇＩドメインに相当する変性プライマ ー（およそ５８−６９のアミノ酸；　５’　−ＧＡ　（ＴＣ）ＧＡＣＧＴＧＣＡ Ｇ　（Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ｃ）ＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＧＡＴＧＧ−３’ 　）を用い、増幅反応（４２）を実施した。

更なる反応において、我々はヒト高酸性領域に由来するプライマー及びヒトＦＧ Ｆリセプター（５’　−ＧＡＧＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＡ− ３’　）の５′非翻訳領域由来の第２プライマーを利用した。反応混合物は、７ ５０ｎｇのヒト遺伝子ＤＮＡ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、２００μＭの４種 のｄＮＴＰのそれぞれ、及び１０ｍＭのトリス−ＨＣ１，ｐＨ８，３，５０丁ｎ ＭのＫＣＩ、１，５ｒｎＭのＭｇＣ１２，１００ｎｇ／ｍｌのＢ５Ａ３０ｔｄ中 の１ユニツトのＴａｇポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ） を含んだ。反応はエリコンブツインブロックシステム（Ｅｒｉｃｏｍｐ　ｔｗｉ ｎ　ｂｌｏｃｋ　ｓｙｓｔｅｍ）において行った。９４℃で５０秒間の変性、６ ５℃で１分間のアニール化及び７２℃で３分間の伸長よりなるサイクルを３１回 行った。

四種の固有ヒ）　Ｆ　Ｇ　Ｆ　！ＪセプターｃＤＮＡの単離反び特徴付け。

このニワトリ塩基性ＦＧＦリセプターは単一のトランスメンブランドメイン、３ Ｉｇ一様ドメイン及び高酸性ドメインを含む細胞外領域、並びにスプリットチロ シンキナーゼドメインを含む細胞間領域を含む。このニワ）　Ｕ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　 ＩＪセプターは、既に公開されているチロシンキナーゼをコード化する部分的ｃ ＤＮＡ　（ｈ　ｆ　Ｉ　ｇ＞（この記載時には、その機能は分っていなかった） との同一性が高い。ニワ）　ＩＪ　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセる。全長ヒトＦＧＦ リセプターｃＤＮＡを得るため、ヒトへそ静脈内皮細胞ｃＤＮＡライブラリー及 びヒト胎盤ｃ　ＤＮＡライブラリーをスクリーンするためにｈｆ１ｇｃＤＮＡ配 列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを利用した。各ライブラリー由来の２５ ０．０００個のプラークの第１スクリーニングから、４個の陽性クローンが内皮 細胞ライブラリーより単離され、そして３個の陽性クローンが胎盤ライブラリー から単離された。

このｃＤＮＡクローンは、３′末端での制限地図の異なるパターンに基づく２つ のクラスへと分類できる。これらのりラスのうち１つは長さの短いｃＤＮＡクロ ーンに由来する。

各クラスの代表例はいづれかのライブラリーから単離されクローンの中に存在す る。大きいめのｃＤＮＡクローンのクラスを代表する２つのクローン（ｈ２及び ｈ３）、並びに短めのｃＤＮＡクローンのクラスを代表する２つのクローン（ｈ ４及びｈ５）を、それらの全体にわたりシーケンス化した。

４種のヒトリセプター型の予想アミノ酸配列を、ニワトリＦＧＦリセブター配列 と比較して図７に示す。異なるリセプター形態の図示例を図８に示す。

ｈ２及びｈ３クローンの予想されるアミノ酸配列は本質的に同一であり、そして ３個のアミノ酸によってのみ違う（ｈ２におけるアミノ酸５９．６０及び１０３ 、図７）。ヌクレオチドルベル（にて、ｈ２．及、び市：３．はこれら３個のア ミノ酸残基゛をコード化する位・置のみ゛にて相違する。このｈ　２／ｈ　３解 放解読クレームは、公開されているニワトリＦＧＦリセブタ−ｃＤＮＡの配列に おいて最初に記載された、疎水性シグナル配列及び異常酸性ドメイン（随行する 残基を伴う８個の連続アミノ酸）を含む。ｈ２及びｈ３の細胞外ドメインはニワ トリＦＧＦリセプターと同一性が高いが、但しｈ２及びｈ３は１つのＩｇ一様ド メインの配列（図８においてＩで表示）を欠如している。このトランスメンプラ ン領域及び細胞質ドメインは、ニワトリＦＧＦリセプターの関連ドメインと同一 性が高い。

短いｃＤＮＡクローン、ｈ４及びｈ５のコード化配列は２個のアミノ酸によって のみ異なる（ｈ４における位置５９及び６０；ｈ４及びｈ５のヌクレオチド配列 は、これら２つの残本をコード化する位置のみにて異なる）。このシグナル配列 、酸性領域及びｒｇ一様ドメインの１つ（Ｉｇｌｌ）は、関連するｈ２及びｈ３ の領域と実質的に同一である。ｈ４及びｈ５の明白な特徴は、トランスメンプラ ンに近いＩｇ一様ドメイン（Ｉｇｌｌｌ）にある。このドメインのおよそ半分は 関連するｈ２及びｈ３の配列と同一である。しかしながら、このＩｇ一様ドメイ ンのカルボキシル末端側の半分はｈ２及びｈ３配列と無関係である。ｈ２．ｈ３ 及びニワトリＦ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセプターｃＤＮＡと異なり、ｈ４及びｈ５は疎水 性膜スバニング領域又は細胞質ドメインをコード化しない。

単離した全てのヒ）ｃＤＮＡの配列は２つのＩｇ一様ドメインのみを含んだ。こ のヒトＦＧＦリセプター遺伝子が第１Ｉｇ一様ドメイン（ＩｇＩ）をコード化す る配列を含むかを調べるため、ポリメラーゼ連鎖反応をヒト包皮繊維芽細胞（Ｈ ＦＦ）から単離したゲノムＤＮＡにおいて行った。これらの実験のため、我々は ニワトリリセブターのＩｇＩドメイン（アミノ酸５　ｇ−６９に相当）の配列に 基づく１つの増幅プライマー、及びヒトリセブターの酸性領域（ｈ２におけるア ミノ酸４４−５２）由来の配列に基づく第２プライマーを利用した。これらのプ ライマーを用い、単一の１．３’ｋ・ｂ、のゲノムフラグメントを増幅させた。

図９において示す通り、このフラグメントは、ニワトリＦＧＦリセブターのＩｇ Ｉドメインと類似のコード化配列（約８３％のアミノ酸の同一性）を含んだ。更 に、約１．Ｏｋｂのイントロン配列がこれらのコード配列をこのリセプターの高 酸性領域をコード化する配列から分離している。従って、このヒトＦＧＦリセプ ター遺伝子は明らかに、ヒ）ｃＤＮＡクローンにおいては見い出せないＩｇＩド メインをコード化する配列を含む。更に、ＩｇＩドメイン配列と酸性領域配列と の間のイントロンの存在は、２又は３Ｉｇドメイン型の発現が択一的なスプライ シングにより制御されうろことを示唆する。

リセプターの３Ｉｇドメイン型がＨＦＦ細胞内で発現されるかを調べるため、我 々はＨＦＦｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡにおいてＰＣＲを行った。前記のプラ イマーを用い、一本の０．２４ｋｂフラグメントをＨＦＦｃＤＮＡから増幅させ た。このフラグメントはＩｇＩドメイン及び酸性領域をコード化する配列を含む が、イントロン配列は含まなかった。従って、ＨＦＦ細胞はりセプターの３Ｉｇ ドメイン型を転写するものと我々は考えた。ＨＦＦ細胞がこのリセプターの２１ ｇドメイン型を発現するかも調べるため、我々は酸性領域プライマー及びヒ）Ｆ ＧＦＩＪセプターの５′非翻訳領域由来の配列に基づく第２プライマーを利用し た。これらの反応において、０．．２３ｋｂのフラグメントを我々のｃＤＮＡク ローンと同様の方法において増幅し、これはＩｇＩドメインに相当する配列を欠 如していた。従って、このリセブター〇Ｉｇドメイン型もＨＦＦ細胞内で転写さ れる。

３Ｉｇ一様及び２Ｉｇ一様ドメイン結合酸性ＦＧＦ及び塩基性ＦＧＦを含むリセ ブター。

この３Ｉｇ一様ドメインリセプタ−にワトリｃＤＮＡライブラリーから最初に単 離）はその塩基性ＦＧＦに対する親和性に基づいて精製されるため、このリセプ ターが酸性ＦＧＦにも結合するかを調べることに興味がもたれた。この問題に答 えるため、この３Ｉｇドメインニワトリリセブターをラッ）Ｌ６筋芽細胞、即ち 、Ｆ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセブターを通常発現しない細胞系内で発現させた。他に、こ の２Ｉｇドメインヒトｈ２リセプターもＬ６細胞において発現させた。図１０は 感染細胞で行った親和性標識実験を示す。細胞を”Ｊ−ａＦＧＦ又は”５Ｉ−ｂ ＦＧＦのいづれかと共にインキュベートし、そして結合性リガンドをジスクシニ ミジルスベレート　（０゜１５Ｍ）の存在下において架橋させた。いづれかのリ ガンドを用い、一本の架橋化バンドがリセブターｃＤＮＡにより感染されている 細胞において見られたが（列１．　３．　７及び９）、しかし、ベクター単独で 感染されている細胞には見られなかった（列５．　６．　１１及び１２）。架橋 化複合体のサイズからＦＧＦ（１７ｋｄ）の分子量を差し引くことにより、この リセプターの３Ｉｇドメイン型については１４５　ｋｄ、そしてこのリセブター の２Ｉｇドメイン型については１２５ｋｄの推定分子量が得られた。過剰の未標 識リガンドは架橋化複合体の形成を妨げた（列２．　４．　８及び１０）。これ らの結果が示すには、このＦＧＦリセブターの３Ｉｇドメイン型及び２１ｇドメ イン型の両方が、酸性又は塩基性ＦＧＦと結合可能である。スキャッチャード結 合分析は、”Ｊ−ａＦＧＦの３Ｉｇドメイン型、又は２Ｉｇドメイン型のいづれ かへの半一最大（ｈ　ａ　１　ｆ−ｍａ　ｘ　ｉｍａ　ｌ）結合が０．０５ｎＭ の濃度で起きることを示唆する。同様に１２Ｊ−ｂＦＧＦの３１ｇドメイン型又 は２部ｇドメイン型への半一最大結合は０゜１部Ｍにて起きる。

酸性及び塩基性ＦＧＦへの３部ｇドメインＦ　Ｇ　Ｆ　Ｕセブター及び２部ｇド メインＦ　Ｇ　Ｆ　Ｕセプター中介生物学的応答。

ＦＧＦリセブターのいづれかの膜スバニング型がａＦＧＦ又はｂＦＧＦのいづれ かによって活性化されるかを調べるため、これらのりセプターをアフリカッメガ エル（Ｘ　ｅ　ｎ　ｏ　ｐＵＳ）の卵母細胞において発現させ、そして感受性Ｃ ａ”＋流出アッセイを用いてリセプターの活性化を測定した。このアッセイは、 コレシストキニン、ボンベシン、パップレシン及びアンジオテンシンＩＩを含む その他のＣａ”＋動員リガンドについてのりセプターの発現を試験するために利 用されている。

リガンド−誘発性流出は、高いレベルの細胞間Ｃａ４４及び促進された流出から 導かれる、細胞間貯蔵物からのＣａ−の動員に反映する。我々の実験のために、 全長ｃＤＮＡを試験管内で転写し、そしてキャップせしめたｍＲＮＡアフリカッ メガエルの卵母細胞に注入した。４８時間後、この注射された卵母細胞に４５Ｃ ａＣ１□を加え、そしてリガンド依存性カルシウム動員を４　Ｓ　Ｃａ　＋＋の 溶出によりアッセイした（図１１）。

ａＦＧＦ　（Ａ及びＢ）又はｂＦＧＦ　（Ｃ及びＤ）のいづれかの添加は、ニワ トリＦＧＦリセプターをコード化するＲＮＡ（Ａ及びＣ）又はヒトｈ２リセブタ ーをコード化するＲＮＡ（Ｂ及びＤ）により注射された卵母細胞から迅速且つ大 量の４５Ｃａ＋″′の流出を誘発させた。一方、ヒトｈ３ＲＮＡ（Ｂ及びＤ）又 は水のみ（Ａ−Ｄ）の注射された卵母細胞はａＦＧＦ又はｂＦＧＦに対して何ら 応答を示さなかった。陽性コントロールとして、カルバコールを１００分経過後 に加えた。

卵母細胞はカルバコールに対する内因性リセプターを発現し、モしてＦ　Ｇ　Ｆ 　ＵセプターＲＮＡ又は水のいづれかの注射された卵母細胞はカルバコール刺激 の後に陽性の応答を示した。

ＦＧＦリセプターの３部ｇドメイン型（ｃＦＧＦ−Ｒ）及び２部ｇドメイン型の 両方が、両酸性及び塩基性ＦＧＦに対して生物学的に応答性であるものと我々は 考える。従って、酸性及び塩基性ＦＧＦに対するリガンド結合性ドメインは、高 酸性ドメイン並びにＩｇｌｌ及びＩｇｌｌｌ　ドメインを包含するりセプター領 域にあることが見い出せた。

ヒトｈ２リセブターは明らかに両方のりガントに応答するが、ｈ３リセプター型 をコード化するＲＮＡの注射された卵母細胞においては何ら応答が見い出されな かった。ｈ２及びｈ３の間の３個のアミノ酸の相違がこのようなタンパク質を異 なるように応答させることを引き起こすものと考えられる。

他方、ｈ３ＲＮＡの注射されている卵母細胞における応答性の欠如は、ｈ３タン パク質の異常に低い発現レベルに起因することもありうる。残念ながら、卵母細 胞におけるリセプタータンパク質発現レベルを我々はまだ調べていない。

２又は３細胞外Ｉｇ一様ドメインのいづれかを有するＦＧＦ−Ｒ型は、両酸性及 び塩基性ＦＧＦと結合且つ応答する。

ＦＧＦリセブターｍＲＮＡのいくつかの型はＦ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセブターの細胞外 ドメイン、即ち、細胞から分泌される傾向にあるタンパク質のみをコード化する 。

ＦＧＦリセブター〇２Ｉｇ一様ドメイン型（ｈ２）が高い親和力で両ａＦＧＦ及 びｂＦＧＦと結合する事実は、高酸性領域並びにＩｇｌｌ及びＩｇｌｌｌ　ドメ インを包含する領域へのこれらのリガンドの結合ドメインを位置決めすることを 我々に可能とする。

このｈ４及びｈ５リセブター型はトランスメンブラン配列を欠如し、そしておそ ら＜ＦＧＦリセプターの分泌型を示す。

先のデーターは、ｈ４ｃＤＮＡの感染した細胞が、抗−ＦＧＦ−Ｒポリクローナ ル抗血清により認識される７０ｋｄのタンパク質を分泌することを示唆している 。

Ｆ　Ｇ　Ｆ　Ｕセプターの分泌型の役割は不明である。この分泌型は細胞外ＦＧ Ｆのレベルの制御のために働くことがあり、従ってＦＧＦの細胞表層Ｆ　Ｇ　Ｆ 　ＩＪセプターへの適用性を制御する。他方、この分泌Ｆ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセブタ ーは、ＦＧＦを特定の場所に保存且つ隔離するために働きうる。その他の可能性 は、この分泌型は細胞間の仕切においてＦＧＦと結合することがあり、そしてそ の後因子を分泌するための手段として働くことがある。このことは、ａＦＧＦ及 びｂＦＧＦがシグナル配列を含まず、そしてその分泌のメカニズムが分っていな い観点から重要な考察である。

リセブター〇多彩性は択一的なスプライシングにより発生するものと我々の結果 は示唆している。我々は全部で５つの異なるＦＧＦ！ＪセブターｃＤＮＡ種類を 単離した。アミノ酸配列の比較は、５種類の全てが同一の遺伝子に由来すること を強く示唆する。ヒ）　ＩＪセプター型の他の興味ある特徴は、細胞外ドメイン におけるＡｒｇＭｅｔ配列（ｈ２及びｈ４におけるアミノ酸５９と６０）の有無 である。

＋２５Ｉ−ａＦＧＦ又は”Ｉ−ｂＦＧＦのいづれかを用いる親和性標識実験は、 Ｆ　Ｇ　Ｆ　ＩＪセプターの３部ｇドメイン型を発現する感染細胞における単一 １４５ｋｄＵセブタータンパク質及びＦ　Ｇ　Ｆ　！Ｊセプターの２ドメイン型 を発現する感染細胞における単一１２５ｋｄリセプタータンパク質を同定する（ 図１１）。２種類のりセプターの存在は、このリセプターの３１ｇドメイン及び ２部ｇドメイン型の同時発現を反映しうる。我々のデーターは、単一のＦ　Ｇ　 Ｆ　１，１セプタ一種は高親和力でａＦＧＦ及びｂＦＧＦの両方に結合でき、そ してこれらの因子の生物学的効果を中介できることを明らかにした。

我々はこれらの実験において酸性及び塩基制御ＦＧＦを用いたが、その理由はそ れらがＦＧＦファミリーの中で最も特徴付けられている構成員であり、そして組 換の型において容易に入手できるからである。

ＦＧＦ−Ｈの細胞外、リガンド結合性ドメイン（即ち、図３のアミノ酸２２−３ ７４又は図４のアミノ酸２２−２８５を含むもの）又はそれらの類似体の全ても しくは１部を含むフラグメントを宿主細胞（例えば哺乳類細胞又はバクロウィル スの感染した昆虫細胞）において発現させ、そして例１に記載の通りに精製した 。他方、リガンド結合性ドメインのフラグメントをペプチド合成装置＜Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて作り、ＨＰＬＣにより精製した。異な る濃度のＦＧＦ−Ｒフラグメント又はその類似体（ＦＧＦ−Ｒｅ　ｘ）を、スイ ス３Ｔ３細胞への１２５Ｉ−ＦＧＦの結合をブロックするそれらの能力のために 試験した。競合的結合は例１における図ＩＡに記載の通りに行い、未標識リガン ドの代りにＦＧＦ−Ｒｅｘｓを用い、そして競合的結合性を測定した。

ＦＧＦ−Ｒｅｘは、それらのＦＧＦ−誘発性分裂を阻害する能力についても試験 した。これは細胞の中に取り込まれる３Ｈ−チミジンにより、細胞の数を数える ことにより測定される。細胞表面リセプターに対するＦＧＦの結合をブロックす るＦＧＦ−Ｒｅｘは拮抗薬として働くことがあり、そして３Ｈ−チミジンの取り 込み及びＦＧＦにより誘発される細胞数における増大をブロックする。ＦＧＦ− Ｒｅｘは作動薬として働くことがあり、即ち、細胞表層のりセブターと二量体を 形成し、リガンド−中介リセブターーリキャプター相互作用を擬態しうる。この ような場合において、ＦＧＦ−Ｒｅｘはリガンドの非存在下において有糸分裂を 刺激するか、又はＦＧＦが中介する有糸分裂応答を高めうる。

ＦＧＦ−Ｒｅｘは、スイス３Ｔ３細胞における９０基質タンパク質のＦＧＦ誘発 性チロシンリン酸化又は細胞性ＦＧＦ−Ｒの自己リン酸化を阻害もしくは活性化 せしめる能力についても試験された。ＦＧＦ誘発性チロシンリン酸化をブロック するＦＧＦ−Ｒｅｘは拮抗薬である。ＦＧＦの非存在下において自己リン酸化を 活性化するＦＧＦ−Ｒｅｘは作動薬である。

ＦＧＦ−Ｒｅｘは、それらの抗−血管形成活性についても試験された。ＦＧＦ− Ｒｅｘは第１に試験管内で、それらのＦＧＦ−誘発性成長及び内皮細胞の血管へ の動員を阻害する能力について試験された。血管形成は、大動脈環アッセイを用 い、試験管内でアッセイした。大動脈環を、ＦＧＦ及びＦＧＦ−Ｒｅｘの存在下 又は非存在下において形成したコラーゲンマトリックスに移した。内皮細胞はこ の大動脈環からＦＧＦの存在下において数日以内に生長し、そして血管を形成す る。前記のアッセイにおいて拮抗薬であるＦＧＦ−Ｒｅｘの添加は、ＦＧＦ誘発 性の毛管の生長の育成を阻害する。ＦＧＦの非存在下においてさえも血管形成誘 発性であるＦＧＦ−Ｒｅｘは作動薬である。

ＦＧＦ類似体、血管形成因子、抗−血管形成因子及びＦＧＦ−Ｈの細胞外部分に 対する抗体を、精製したもしくは発現させたＦＧＦ−Ｈに対する結合のためのそ れらの直接的な結合能力又は天然ＦＧＦの結合に対する競合能力について試験し た。更にこれらは、それらの有糸分裂を刺激する能力（作動薬）又はＦＧＦ依存 依存県有系分裂害する能力（拮抗薬）並びにＦＧＦ−Ｒを発現せしめる細胞にお けるチロシンリン酸化の能力についても試験された。これらの研究は、血管形成 及び抗血管形成因子等のそれぞれがリセプター中介性であるかを調べるためにお いて、並びに血管形成及び抗血管形成因子に対するリセブターの特異性（即ち、 酸性対塩基性のＦＧＦ−Ｒ）が存在するかを調べるためにおいて重要である。

、ＦＧＦ類似体を放射性標識し、そして結合は標識化リガンド、精製又は発現せ しめたりセブターにより適当な生理緩衝液（即ち、培養培地又はリン酸緩衝化食 塩水（ＰＢＳ））の中で３７℃で０．　５時間もしくは４℃で２−２４時間行っ た。

この複合物を沈殿せしめ（５−１０％のポリエチレングリコール、１ｍｇ／ｍｌ のＩｇＧ）、そしてフィルター（即ち、ｗｈｉｔｍａｎ　ＧＦＡ）を通して濾過 し、そして結合した放射活性を測定した。

本発明をある特定の態様に関連付けて説明してきたが、当業者による種々の改良 は添付した請求項により定義される本発明の範囲に属することが明らかである。

浄書・′内容に変更なし） ＦＩＧ、１．Ａ 訳 ＦＩＧ、Ｌ、Ｓ ↓ ＦＩＧ、ｊＢ。

浄書（内容に変更なし） ｌ　ＧＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＴＣＣＧＧＴＣＣＧＡＧＣＴＣ ＧＧＧＧＣＧＣＣ４２４３ＣＣＧＣＡＣＣＧＧＧＡＣＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＣＴ ＧＣＡＧＴＣＧＧＧＣＡＣＧＣＣＧＣＧ　１１４８５　ＧＧＣＣＣＧＣＣＧＧＧ ＧＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＣＴＧＣＡ　１２６１ ２７　＾ＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＧ ＧＡＧＧＧＧＧＧＣ１６８１６９ＡＣＡＡＧｆ；ＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＧＧ ＧＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＧＣＣＣＴＣＣＣＣ２１０２１１ＣＣＧＣＣＣＣＧ ＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣ２５ ２２５３ＧＣＣＣＧＧＧＣ丁ＨＧＡＧＧＣＧＣＣｆ；＾ＧＣＡＣＣＧＡＧＣＧＣ ＣＧＣＣＧＧＧＡＧＴＣ２！）４２９５　ＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧ ＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＡＣＣＣＣＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＸ３ｆｉ３３了ＧＡＡＣ ＡＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＧ ＧＣ３７δ３′７９　ＡＣＡＣＧＣＣＣＧＣＴＣＧＣＡＣ＾＾ＧＣＣＡＣＩ；Ｇ ＣＧＧＡＣＴＣＴＣＣＣＧＡＧＧＣＧ　４２０４２１　ＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＧ ＣＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＡ＾＾ＡＧＧＡＧＧＡＴＣ４６２４６ ３ＧＡＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡ丁ＧＴＧＧＡＧＣ ＣＴＴＧＴＣＡ５０４ＦＩＧ、Ｊ、１ ＦＩＧ、４．２ ＦＩＧ、ｊ３ ２７３１　ＣＣＣＡＣＡＣＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＧ ＣＴＧＴＡＡＣＣＣＴＣ２７７２２７７３ＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＣ丁ＧＣＴＧ ｆ；ＧＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＣＧＴＣＣＣＴＧＴＣ２８＋４２１！１５　 ＣＣＣＴＴＴＣＣ丁ＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＴＡＣＣＡＧＧ ＧＧＣＣ丁Ｔ　２８５６ＦＩＬ４．４ ３Ｇ＋３　ＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＣＡＡＡＧＧＡ　３６３５ＦＩＧ 、−４，５ ｋｂ　９ＥＱＡＴＣ ＦＩＧ、−５，Ａ　ＦＩＧ、−５，８ １゛〉１内容に変更なし） ４５００　５１００　６３（１Ｇ ＋９１　１９１　＋ｇｍ ＦＩＧ、−６゜ ＦＩＧ、Ｊ。

４０口０ロ　の〜口〜ロ　！Ｐ−昨−昨　のＣ％ｌ　ＣＨＩ　ｅ％Ａ　。

Ｐ＋　′？″″’ｌ　ｌ”１　？　′ｇ″ｔ　（Ｊ）′　た：２＝；コ　＝＆Ｑ ＆掲曽Ｐ−４Ｎの　ω〜０〜ロ　曽−の　［Ｆ］〜ｅｌ　ｗ−’５　０〜ロ　の 噂−１＋旬Ｗｅ句菅ψψ０ロ　〜１１　の−−Ｊ−−一旬　曽のψ　一つつげＩ 〜〜〜〜　曽１つげ１つつ　「１菅」ｔ　−ば１ｎ　μｍ７）＋７）　トψψ　 眠１−１−浄書（内容に変更なし） Ｉ　２　３４　５　６　７　８９１０１１１２浄害ｒ内容に変更なし） 分　分 手続補正書（方式） 平成４年り月″２卑日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．繊維芽細胞成長因子受容体に結合する繊維芽細胞成長因子を阻害するのに有 効な繊維芽細胞成長因子受容体阻止剤の量を患者に投与することを含んで成る、 繊維芽細胞成長因子受容体調節活性をインビボで変性するための方法。 ２．前記阻止剤がヒト繊維芽細胞成長因子受容体又はその一部を含んで成る請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．前記繊維芽細胞成長因子受容体又はその一部が、ａ）第３又は４図における ＤＮＡ配列；ｂ）第３，４又は５図のポリペプチドをコードする配列；及び ｃ）第３又は４図の配列に実質的に相同な配列から成る群から選択された配列の 少なくとも約１５個の塩基を含む核酸により形質転換された細胞に生成される請 求の範囲第２項記載の方法。 ４．前記阻止剤が、チロシンキナーゼ領域を有さない繊維芽細胞成長因子受容体 細胞外ドメインを含んで成る請求の範囲第２項記載の方法。 ５．溶液に存在する繊維芽細胞成長因子と繊維芽細胞成長因子受容体との間の結 合を阻害するための方法であって、前記溶液に繊維芽細胞成長因子受容体ペプチ ドを添加する段階を含んで成る方法。 ６．前記繊維芽細胞成長因子受容体ペプチドが第３，４又は７図に示される配列 に相同である請求の範囲第５項記載の方法。 ７，ヒト繊維芽細胞成長因子受容体細胞外ドメインからの約２００〜５００の隣 接アミノ酸を有する可溶性ポリペプチドを含んで成る組成物。 ８．前記ポリペプチドがＩｇＩＩ又はＩｇＩＩＩドメインを含んで成る請求の範 囲第７項記載の組成物。 ９．前記細胞外ドメインが第７図のヒト繊維芽細胞成長因子受容体の残基１〜２ ８７からの約８０個のアミノ酸を含んで成る請求の範囲第８項記載の組成物。 １０．前記ＩｇＩＩドメインが第７図のヒト配列の残基８５〜１４１からの約７ 個のアミノ酸を含んで成る請求の範囲第７項記載の組成物。 １１．前記ポリペプチドがＩｇＩＩ及びＩｇＩＩＩドメインの両者を含んで成る 請求の範囲第７項記載の組成物。 １２．前記ポリペプチドが、第７図の可溶性ヒトタンパク質の残基２２２〜３０ ０からの７９個のアミノ酸配列に実質的に相同であるカルボキシ末端配列をさら に含んで成る請求の範囲第１１項記載の組成物。 １３．ｈ４又はｈ５から実質的に成る請求の範囲第１２項記載の組成物。 １４．繊維芽細胞成長因子受容体の繊維芽細胞成長因子一結合ドメインを含んで 成る、約８５ｋＤａ以下の実質的に純粋なポリペプチドを含んで成る組成物。 １５．前記ポリペプチドが可溶性である請求の範囲第１４項記載の組成物。 １６．前記ポリペプチドが、シグナルセグメント、ＩｇＩセグメント、酸性セグ メント、ＩｇＩＩセグメント、ＩｇＩＩｌセグメント、ＩｇＩＩＩＴセグメント 及びトランスメンブランセグメントから成る群から選択されたセグメントをさら に含んで成る請求の範囲第１４項記載の組成物。 １７．前記ポリペプチドが第３，４又は７図に示される配列に相同である請求の 範囲第１４項記載の組成物。 １８．前記ポリペプチドがタンパク質の複数鎖複合体で存在する請求の範囲第１ ７項記載の組成物。 １９．前記繊維芽細胞成長因子結合ドメインが、ＩｇＩＩ及びＩｇＩＩＩドメイ ンの個々の少なくとも約３０個のアミノ酸を含む請求の範囲第１４項記載の組成 物。 ２０．前記繊維芽細胞成長因子受容体がニワトリ繊維芽細胞成長因子受容体であ る請求の範囲第１４項記載の組成物。 ２１．細胞内ドメインを実質的に欠くヒト繊維芽細胞成長因子受容体をコードす る単離された核酸。 ２２．前記受容体が第７図に示されるＩｇＩＩドメインに相同である配列を含ん で成る請求の範囲第２１項記載の単離された核酸。 ２３．繊維芽細胞成長因子受容体の実質的に完全な長さのＩｇＩＩドメインをコ ードする単離された核酸。 ２４．シグナルセグメント、ＩｇＩセグメント、酸性セグメント、ＩｇＩＩｌセ グメント、ＩｇＩＩＩＴセグメント、トランスメンプランセグメント及びチロシ ンキナーゼセグメントから成る群から選択された少なくとも１つの追加のペプチ ドセグメントをさらにコードする請求の範囲第２３項記載の単離された核酸。 ２５．前記追加の配列が第３，４又は９図に示される対応配列に相同である請求 の範囲第２４項記載の単離された核酸。 ２６．前記ＩｇＩＩペプチド配列がヒト生来のものである請求の範囲第２３項記 載の単離された核酸。 ２７．転写プロモーター配列をさらに含んで成る請求の範囲第２３項記載の単離 された核酸。 ２８．可溶性ヒト繊維芽細胞成長因子受容体をコードする単離された核酸。 ２９．前記可溶性ヒト成長因子受容体がｈ４又はｈ５に相同である請求の範囲第 ２８項記載の単離された核酸。 ３０．請求の範囲第２９項記載の単離された核酸を発現することによって製造さ れたタンパク質。 ３１．請求の範囲第２１，２３、又は２８項記載の単離された核酸を発現するこ とによって製造された繊維芽細胞成長因子受容体セグメントを含んで成る組成物 。 ３２．請求の範囲第２１，２３、又は２８項記載の単離された核酸を発現するこ とを含んで成る、繊維芽細胞成長因子受容体セグメントを含んで成るタンパク質 の製造方法。 ３３．レポーター分子に結合される、請求の範囲第２１，２３、又は２８項記載 の核酸を含んで成る組成物。 ３４．繊維芽細胞成長因子受容体ペプチドを製造するための方法であって、前記 ペプチドが、 ａ）第３，４又は９図におけるＤＮＡ配列；ｂ）第３，４又は７図のポリペプチ ドをコードする配列；及び ｃ）第３，４又は９図の配列に実質的に相同な配列から成る群から選択された配 列の少なくとも約２０個の塩基を含む核酸により形質転換された細胞に生成され ることを特徴とする方法。 ３５．繊維芽細胞成長因子受容体フラグメントに対する抗体を生成するための方 法であって、第３，４又は７図に示される少なくとも６個の隣接するアミノ酸の 配列に相同のポリペプチドエピトープに対する抗体を産生する段階を含んで成る 方法。 ３６．前記エピトープが、シグナルセグメント、ＩｇＩセグメント、酸性セグメ ント、ＩｇＩＩセグメント、ＩｇＩＩＩセグメント、及びＩｇＩＩＩＴセグメン トから成るタンパク質セグメントの群から選択される請求の範囲第３５項記載の 方法。 ３７．標的サンプルにおける繊維芽細胞成長因子又は繊維芽細胞成長因子受容体 を測定する方法であって、前記標的サンプルと繊維芽細胞成長因子受容体セグメ ントとを組合し；そして 前記セグメントと前記サンプルとの間の結合の程度を決定する段階を含んで成る 方法。 ３８．繊維芽細胞成長因子受容体の少なくとも一部に相同のポリペプチドを発現 することができる形質転換された細胞。 ３９．前記ポリペプチドが、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体の完全な膜結合形に 対して実質的に相同である請求の範囲第３８項記載の形質転換された細胞。 ４０．前記ポリペプチドが、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体の完全な可溶形に対 して実質的に相同である請求の範囲第３８項記載の形質転換された細胞。 ４１．前記細胞が、ヒト繊維芽細胞成長因子受容体を分泌できる請求の範囲第４ ０項記載の形質転換された細胞。