JPH04506800A

JPH04506800A - ソマトトロピン類似体

Info

Publication number: JPH04506800A
Application number: JP2509610A
Authority: JP
Inventors: リールマン，シャーウッド・ラス; ハブル，ヘンリー・エイ; タルス，ジョディ・エル; プレイステッド，スコット・エム; ブレムス，デビッド・エヌ
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1989-07-10
Filing date: 1990-06-27
Publication date: 1992-11-26
Also published as: DE69005451D1; ES2062572T3; DE69005451T2; WO1991000870A1; AU639245B2; EP0482124A1; EP0482124B1; ATE98963T1; CA2057035A1; DK0482124T3; AU5945290A; KR927003633A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ソマトトロピン類似体発明の分野本発明は、９６〜１３３残基の間の一次構造に変化を含む新規な哺乳動物ソマトトロピンまたは成長ホルモンに関する。これらの変化は、ソマトトロピン分子の疎水性またはへリックス安定性を減少させる。

発明の背景ソマトトロピンは、最初、種々の動物からの下垂体抽出物中で発見された。哺乳動物ソマトトロピンは、保存された分子であり、三次構造が同様である。

ウシソマトトロピン（ｂＳ　ｔ）を含めたソマトトロピンは、２個の分子内ジスルフィド結合を有するアミノ酸約２００個の一本鎖からなる球状蛋白である。ｂｓｔは、広範に研究された成長ホルモンである（バラディニ、エイ・／（Ｐａｌａｄｉｎｉ、Ａ、Ｃ，）ら、シーアールシー・クリティカル・レビューズ・イン・バイオケミストリー（ＣＲＣＣｒｉｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂ　ｉｏｅｈｅｍ、　）、ｌ　５　：　２５−５６（１９８３乃。特に、ｂｓｔは、１９１個のアミノ酸および２個の分子内ジスルフィド結合を含有する球状の一本鎖蛋白である。ｂｓｔの分子量は２２．　ＯＯＯダルトンである。

下垂体から抽出された天然ｂｓｔは不均一である。少な（とも６つの蛋白主要形態が記載されている。最長形態は、１９１個のアミノ酸残基およびＮＨ，末端にアラニルフェニルアラニン配列を有する。

２番目の形態は、１９０個のアミノ酸残基およびＮＨ，末端にフェニルアラニンを有する。３番目の形態は、１８７個のアミノ酸残基およびＮＨ，末端にメチオニンを有する。ｂｓｔの残りの３つの形態は、１２７位がロイシンに代えバリンで置き換えられている。この不均一性に加え、ウシソマトトロピンの不確定な不均一性も記載されている（ハートアイ・ンー（Ｈａｒｔ、　Ｉ　、Ｃ，）ら、ノクイオケミカル・ジャーナル（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、　）、２１８　：　５７３−５８１（１９８４）；７レイス、エム（Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｍ）およびディクソン、エイチ・ビー・エフ（Ｄ　１ｃｋｓｏｎ、　Ｈ，Ｂ、　Ｆ　、　）、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ　）、１００　：　５９３−６００（１９６５））。天然抽出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによって分別すると不確定な電気泳動的不均一性が見られる。はっきりとした形態がバイオアッセイで異なる相対的効力を有することが示されている。ｂｓｔの他の不確定種は、イオン交換カラム上で分別すると、ラット成長モデルにおいて種々の程度の生物活性を有することも示されている（ハートら、ならびにワレイスおよびディクソン、上記）。

生物学的変異を示す不確定な不均一性が遺伝学的変異性によるのか、ｉｎ　ｖｉｖｏ翻訳後修飾によるのか、リン酸化の差によるのかくリバティ、ノエイ・ピー（Ｌ　１ｂｅｒｔｉ、　Ｊ　、　Ｐ、）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂ　１ｏｃｈｅｔａｎｄ　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａｖ＋、　）、１２８ニア１３−７２０．１９８５）、または単離により手の加わったことによるのかは未知である。

組換え微生物（ｒｂＳ　ｔ）によって産生された、または下垂体組織から抽出されたつ／ソマトトロピンは、商業的に重要である。乳牛で乳汁分泌を増加させ、肉牛でサイズおよび肉生産を増大させる。商業的に許容される生産改良を生じるのに、１日当たり動物１頭につき２０ｚｇまでが必要であると判断される。このような用量は、効果的な投与方法を必要とするであろう。本発明において既述したようなりｓｔの効力および安定性の改良は、１日当たり各動物に投与される薬物の量を減少させることになるので有益であろう。

ブタンマドトロピンは四−ヘリックス束状蛋白（ｆｏｕｒ−ｈｅｌｉｃａｌｂｕｎｄｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の三次元構造を有する（アブデルーメギッド、ニス・ニス（Ａ　ｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ、　Ｓ　、　Ｓ　、　）、シーニー、エイチ・ニス（Ｓｈｉｅｈ、Ｈ。

Ｓ、）、スミス、ダブリュ・ダブリｓ　（Ｓ　ｗｉｔｈｅ、　Ｗ、　Ｗ、　）、ディリンガ−、エイチ・イー（Ｄ　ａｙｒｉｎｇｅｒ、　Ｈ、Ｅ　、　）、ビオランド、ビー・エヌ（Ｖ　１ｏｌａｎｄ、　Ｂ、　Ｎ、）およびベントル、エルーｘイ（Ｂｅｎｔｌｅ、　Ｌ、Ａ、０１９８７）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　ＳＡ）、８４．６４３４−６４３７）。天然コンフォメーションは、蛋白の表面から多くの疎水性アミノ酸残基を排除し、それにより溶解性を増大させる。疎水性アミノ酸残基（緩衝水溶液にほとんど溶解しないもの）は、アイセンバーブ（Ｅ　ｉｓｅｎｂｅｒｇ）によって確立された尺度を使用して分類されている。部分的に折畳みが解除されると、これらの疎水性アミノ酸は、水性媒質に暴露され、蛋白沈澱が生じ得る。その製造の間に観察されるｒｂＳｔの沈澱は、部分的にはこの機構を介して生じるらしい。

さらに、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）で異種蛋白として産生されるｂｓｔは、まず、これらの機構にも起因し得る不溶性状態で見い出される（国際特許出願国際公開ＷＯ８７００２０４および米国特許第４，５１８，５２６号）。不溶性形態のｂｓｔは、洗剤または変性剤の添加によって可溶化され得る。生物学的活性化は、制御条件下でこれらの試薬を除去した後に起こり、天然コンフォメーンヨンの形成を可能とする（国際特許出願国際公開ＷＯ８７００２０４および米国特許第４，５１８，５２６号）。一旦、天然コンフｔメーンヨンが達成されると、ｂｓｔは比較的溶解性になる。しかしながら、さらなる製造の工程において、ｒｂｓｔは、再度、天然コンフォメーンヨンを乱す条件にａ露され、しばしば沈澱に至る。例えば、ｂｓｔ溶液の界面変性は、通常に出くわすことであり、渦動または強振することによって加速される。上記に従って、得られた沈殿物は、生物学的に不活性であり、望ましくない免疫学的応答を引き起こし得る。さらに、迅速なｐＨ変化または温度〉７５℃への加熱によって、ｂｓｔの相当の沈殿を起こし得る（バーガー、エイチ・ジー（Ｂｕｒｇｅｒ、　Ｈ，Ｇ、）、ニブルホラ乙エイチ（Ｅ　ｄｅｌｈｏｃｈ、　Ｈ、）およびフンドリッフェ、ビー・ジー（ＣｏｎｄｌＨｆｅ、　Ｐ、Ｇ、）、（１９６６）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋、）、２４１．４４９− ４５７）。

従前のｂｓｔの折畳みの折畳み論的研究によって、部分的な変性に際し形成され、高蛋白濃度で凝集する（凝集および自己会合または単なる会合という用語は、本明細書において同様に使用する）安定な折畳み中間体が同定された（）＼ベル、エイチ・エイ（Ｈａｖｅｌ、　Ｈ，Ａ、）、カウフマン、イー・ダブリ−Ｌ　（Ｋ　ａｕｆ　ｆｉａｎ、　Ｅ　、　Ｗ、　）、プレイステッド。

ニス・エム（Ｐ　１ａｉｓｔｅｄ、　Ｓ　、　Ｍ、　）およびブレムズ、ディー・エヌ（Ｂ　ｒｅｍｓ、　Ｄ、　Ｎ、）（１９８６）、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５．６５３３−６５３８、ならびにブレムズ、ディー・エヌ（Ｂ　ｒｅｍｓ、　Ｄ、　Ｎ）、プレイステッド、ニス・エム（Ｐ　１ａｉｓｔｅｄ、　Ｓ　、　Ｍ、　）、カウフマン、イー・ダブリュ（Ｋ　ａｕｆｆｍａｎ、　Ｅ　、　Ｗ、　）およびノーベル、エイチ・エイ（Ｈａｖｅｌ、Ｈ，Ａ、Ｘｌ　９８６）、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５．６５３９−６５４３）。この凝集した蛋白種は、天然または変性コンフォメーションより溶解性が低い（ブレムズ（Ｂ　ｒｅｍｓ）、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８８）。選択的に沈殿させ、凝集した中間体を定量するための方法が開発された。

凝集中間体は、高蛋白濃度でｂｓｔの動力学釣書折畳みの間に一時的に存在することが示されている。再折畳みがこの蛋白種を可溶化しない溶液中で行われると、ｂｓｔの大部分が沈殿する。再折畳みが凝集中間体を可溶化する溶液中で行われると、天然蛋白が定量的に得られる（ブレムズ、ディー・エヌ（Ｂ　ｒｅｍｓ、　Ｄ、　Ｎ）、プレイステッド。

ニス・エム（Ｐ　Ｉａｉｓｔｅｄ、　Ｓ　、　Ｍ、　）、グウノ＼−ティ、プレイ・プレイ・ジュニア（Ｄ　ｏｕｇｈｅｒｔｙ、　Ｊ　、　Ｊ　、　Ｊ　ｒ、　）およびホルツマン、ティー・エフ（Ｈｏｌｚｎａｎ、Ｔ、Ｆ、）（１９８７）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、ＢｉｏＬ、Ｃｈｅｍ、）、２６２．２５９０−２５９６）。

動力学的研究によって、ｂｓｔ折畳みを記載する以下のモデルが導式１％式％［式中、Ｎ＝天然ｒｂＳ　ｔ、■＝単量体折畳み中間体、Ｉ　ｎｓｇｏ。＝会合中間体、Ｕ−折畳み解除ｒｂｓｔ、　Ｋ、、、。。−自己会合に関する平衡定数、Ｉ　ｐｅｒ＝＝沈殿蛋白］。

＃集中量体を定量する便利な選択的方法が開発された。例えば、凝集の形成を導く条件下で、ｂｓｔの近紫外円偏光二色性（ＣＤ）は、３００ｎｍでユニークなスペクトル帯を有する（バベル、エイチ・エイ（ＨａｖｅＩ、　Ｈ、Ａ、　）、カウフマン、イー・ダブリｘ　（Ｋ　ａｕｆ　ｆｍａｎ、、　Ｅ　、　Ｗ、　）、プレイステッド、ニス・エム（Ｐ　１ａｉｓｔｅｄ、　Ｓ　、　Ｍ、　）およびブレムズ１ディー・エヌ（ＢｒｅＩＩｌｓ、Ｄ、Ｎ、）（１９８６）、バイオケミストリー（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５．６５３３−６５３８）。

凝集は、単一トリブト【　ファンのＣＤスペクトルを変え、これが負の楕円率となる。凝集中間体の存在は、変性遷移平衡も変える（ハベル、エイチ・エイ（Ｈａｖｅｌ。

Ｈ，Ａ、）、カウフ７７．イー・ダブリｘ（Ｋａｕｆｆｍａｎ、　Ｅ、Ｗ、）、プレイステッド、ニス・エム（Ｐ　Ｉａｉｓｔｅｄ、　Ｓ　、　Ｍ、　）およびブレムズ、ディー・エヌ（Ｂ　ｒｅｍｓ、　Ｄ、　Ｎ）（１９８６）、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ）、２５．６５３３−６５３８、ならびにブレムズ、ディー・エヌ（Ｂ　ｒｅｔａｓ、　Ｄ、　Ｎ）、プレイステッド、ニス・エム（Ｐ　１ａｉｓｔｅｄ、　Ｓ　、　Ｍ、　）、カウフマン、イー・ダブリｘ　（Ｋ　ａｕｆｆｍａｎ、　Ｅ　、　Ｗ、）およびハベル、エイチ・エイ（Ｈａｖｅｌ、　Ｈ，Ａ、Ｘ　１９８６）、バイオケミストリー（旧。−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５．６５３９−６５４３）。ｂｓｔ１０７〜１２７残基にわたる領域は、両親媒性α−ヘリ・ククスを形成し、凝集中間体の形成に関与する臨界領域と定義された。再折畳みの間にｒｂＳｔに対して過剰量の１０９〜１３３または９６〜１３３断片を含ませることによって、会合中間体の形成は妨げられ、結束として沈殴物か形成されない（ブレムズ、ディー・エヌ（Ｂ　ｒｅｍｓ、　Ｄ　、　Ｎ　）、プレイステッド、ニス・エム（Ｐ　１ａｉｓｔ、ｅｄ、　Ｓ　、　Ｍ、　）、カウフマン、イー・ダブリュ（Ｋ　ａｕｆ　ｆｍａｎ、　Ｅ　、　Ｗ、　）お１よびハベル、エイチ・エイ（Ｗａｖｅｌ、Ｈ，Ａ、）（１９８６）、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５．６５３９−６５４３）。Ｌｙｓ　ｒ　１２−ｒｂＳ　ｔ（すなわち、１１２位にリンン残基を有するｂＳｔ）が部位特異的突然変異誘発によってロイシン残基に変わるとくすなわち、１１２位にロイシン残基を有するｂｓ　ｔ）、両親媒性へ’Ｊ　ノクスの疎水性部分が拡大され、その結果、１凝集中間体の安定化が生じ、それにより、上記機構を介してより多くの沈殿が行われる。

我々は、それらの生物学的活性を維持または増強させつつ、疎水性減少による凝集が少ないアナログを合成することにより粗蛋白より自己会合または凝集の程度が低いｂｓｔおよびｐＳｔのアナログを設計することによってこれらの問題点を解決すべく企図した。さらに、我々は、１０９〜１２７残基の間にα−へリノクス形成能をあまり含まず、従って疎水的相互作用または部分的変性に関するこの領域のポテンンヤルを減少させるアナログを設計した。

情報開示ｂｓｔのアナログは公知である（例えば、欧州特許出願第７５．４４４号、第１０３，３９５号および第１９３，５１５号ならびにヌクレイツク・アシッド・レス（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）、１ｏ（２０）：８４８７（１９８２）、ならびにエヌ・イー・ダウン（Ｎ、　Ｅ、　Ｄｏｗｎ）ら、カナディアニ／・ジャーナｌし・オブ・フィッシャシーズ・アンド・アクアティック・サイエンシズ（Ｃａｎ、　Ｊ　、　Ｆ　ｉｓｈ、　Ａ　ｑｕａｔ−Ｓ　ｃｉ、　）、４６、第１７８〜８３頁、（１，９８９））。

ジー・ウィンター（Ｑ、Ｗｉｎｔｅｒ）およびエイ・アール・ファ・−シュラ（Ａ　、　Ｒ、Ｆ　ｅｒｓｈｔ）、ティー・アイ・ビーーｚス（ＴＩＢＳ）、２、第１１５頁（１９８４）には、キイとなる配列位置でアミノ酸組成を変化させることによる酵素活性の変化が総括されている。

ビー・レイ・チョウ（Ｐ、Ｙ、Ｃｈｏｕ）およびジー・ディー・ファスマン（Ｇ　、　Ｄ　、　Ｆ　ａｓｍａｎ）、Ａ　ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂ　１ｏｃｈｅａ、、４７、第２５１〜７６頁（１９７Ｂ）ならびにピー・ワイ・チョウ（Ｐ、Ｙ、Ｃｈｏｕ）およびジー・ディー・ファスマン（Ｇ、　Ｄ、　Ｆ　ａｓｍａｎ）、ジャーナル・オブ・モレ牛ニラ−・バイオロジー（Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、　）、１１５、第１３５〜７５頁（１９７７）は、蛋白の二次的なものを予想するためのアミノ酸配列の使用に言及している。エイチ・エイ・ハベル（Ｈ，Ａ。

Ｈａｖｅｌ）ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５、第６５３３〜３８頁（１９８６）およびディー・エヌ・ブレムズ（Ｄ　、、Ｎ　、　Ｂ　ｒｅｍｓ）ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５、第６５３９〜４３頁（１９８６）は、高濃度でｒｂＳｔの部分的変性によって得られる自己会合種の特徴に言及している。

ディー・エヌ・ブレムズ（Ｄ、　Ｎ、　Ｂ　ｒｅｍｓ）ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２６、第７７７４〜７８頁（１９８７）は、アミノ酸９６〜１３３および１０９〜１３３からなるｂｓｔ断片の自己会合に関する。

ディー・エヌ・ブレムズ（Ｄ、　Ｎ、　Ｂ　ｒｅｍｓ）、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２７、第４５４１〜４６頁（１９８８）は、ｂｓｔの様々な折畳みコンフォメー７ヨン体の溶解性に言及している。自己会合ｒｂｓＬは、高濃度で、変性剤の迅速な希釈の後に容易に沈殿する。さらに、９６〜１３３断片は、ｒｂｓｔの自己会合および沈殿を抑制することが示されている。

ディー・エヌ・ブレムズ（Ｄ、　Ｎ、　Ｂ　ｒｅｍｓ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、８５、第３３６７〜７１頁（１９８８）は、ｂｓｔの１１２リシン残基のロイシンでの部位特異的置換によるｂｓｔ会合折畳み中間体の安定化に言及している。彼らは、会合中間体の安定性の増大および突然変異ペプチドのヘリ、ゲス形成性の増大がこのｂｓｔ領域と他の蛋白分子との間の疎水性相互作用の増大によるということを説明している。

これらの文献いずれも、本発明の特別の哺乳動物ソマトトロピンアナログ、特に、ｂｓｔおよびｐＳｔアナログまたは自己会合問題を解消するためのこのようなアナログの使用を、開示または示唆しない。

本発明は、天然ｂｓｔのアミノ酸１０９〜１３３残基の間の単一もしくは慢数アミノ酸残基または池のソマトトロピンの関連残基を置換することによって生物活性を増強させるかまたは処理の間の凝集を減少させるかあるいはその両方を実現するソマトトロピン、特にｂｓｔおよびｐＳｔのアナログに関する。これらのアナログは、この蛋白領域の疎水性またはヘリックス安定性を減少させ、その結果、部分変性蛋白の凝集および沈殿指向性を低下させる。この領域内でα−ヘリックスの安定性を減少させるが蛋白の疎水性を減少させない他の変化が含まれる。

これらの後者の化合物は、組織された疎水性領域の形成が小さく、したがって、凝集の減少を受ける。同様の変化は、他の動物、特にブタ、ヒツジ、ウマ、う・ノド、サルおよびヒトを含む哺乳動物由来のソマトトロピンにおいて行い得る。

さらに詳細に、かつ好ましくは、アミノ酸１２１残基にあるロイシン（Ｌｅｕ− １２１）が、特にグルタミンを含む別のアミノ酸残基と置換されている（Ｇｉｎ −１２１）か、またはａｒｇ−１２５およびｇｌｕ−１２６が各々グリシンおよびアルギニンによって置換されているｂｓｔ様化合物種である。

さらに詳細には、動物ソマトトロピンは、ウシ、ブタ、サカナ、ヒツジ、ウマ、ラット、サル、およびヒトソマトトロピンからなる群から選択される。

さらに詳細には、動物ソマトトロピンは、ウシまたはブタソマトトロピン、特にウシソマトトロピンである。

他の特別に特許請求した分子は、以下の置換からなる群から選択されたものを含む（対応する位置はチャート１を参照することによって決定できる）：Ｌｅｕ−１１３置換：　Ａｒｇ−１１３、Ｌｙｓ−１１３、Ａｓｐ−１１３、Ｇｌｎ−１１，３、Ａｓｎ−１１３、Ｇｌｕ−１，１３、Ｈｉｓ−１１３、Ｓ　ｅｔ−１１３、Ｔｈｒ−１１３、Ｐｒｏ−１１３、Ｔｙｒ−１１３、ｃｔｙ−ｚ３、Ａｌａ−１１３、Ｍｅｔ−１１３、Ｔｒｐ−１１３、Ｐｈｅ−１１３、Ｔｉｅ −１１３、Ｖａｌ−Ｌ　１３　；　Ｌｅｕ−１１６置換：　Ａｒｇ−１１６、Ｌｙｓ−１１６、Ａｓｐ−１１８、Ｇｌｎ−１１６、Ａｓｎ−１１６、Ｇｌｕ−１１６、Ｈｉｓ−１１６，５ｅｒ−１１６、Ｔｈｒ−１１６、Ｐｒｏ−１１６、Ｔｙｒ−１，１６、Ｇｌｙ−１１６、Ａｌａ−１１６、Ｍｅｔ−１１６、Ｔｒｐ− １１６、Ｐｈｅ−１１６、Ｈｅ−１１６、Ｖａｌｌ　１６　；　Ｉ　Ｉｅ−１２０置換：Ａｒｇ−１２０、Ｌｙｓ−１２０，Ａｓｐ−１２０、Ｇｌｎ−１２０、Ａｓｎ−１２０、Ｇｌｕ−１２０、Ｉ（ｉｓ−１２０，５ｅｔ−１２０，Ｔｈｒ −１２０、Ｐｒｏ−１２０；Ｌｅｕ−１２３置換：Ａｒｇ−１２３、Ｌｙｓ−１２３、Ａｓｐ−１２３、Ｇｌｎ−１２３、Ａｓｎ−１２３、Ｇｌｕ−１２３、Ｈｉｇ−１２３，５ｅｒ−１２３、Ｔｈｒ−１２３、Ｐｒｏ−１２３、Ｔｙｒ−１２３、Ｇｌｙ−１２３、Ａ　ｌａ−１２３、Ｍｅｔ−１２３、Ｔｒｐ−１２３、Ｐｈｅ−１，２３、ｌ１ｅ−１２３、Ｖａｌ−１２３：　Ｌｅｕ−１２７置換：Ａｒｇ−１２７、Ｌｙｓ−１２７、Ａｓｐ−１２７、Ｇ］ｎ１２７、Ａｓｎ−１２７、Ｇｌｕ−１２７、Ｈｉｓ−１２７，５ｅｒ−１，２７、Ｔｈｒ−１２７、Ｐｒｏ−１２７、Ｔｙｒ−１２７、Ｇ　ｉｙ−１２７、Ａｌａ−１２７、Ｍｅｔ −１２７、Ｔｒｐ−１２７、Ｐｈｅ−１２７、＋１ｅ−１２７、Ｖａｌｌ　２７　；　Ｉ　１ｅ−１１６置換：　Ａｒｇ−１１６、Ｌｙｓ−１１６、Ａｓｐ−１１６、Ｇｌｎ−１１６、Ａｓｎ−１１６、Ｇｌｕ−１１６、Ｈｉｓ−１１６、Ｓ　ｅｔ−１，１６、Ｔｈｒ−４１６、Ｐｒｏ−１１，６、Ｔｙｒ−１１６、Ｇｌｙ−１１６、Ａｌａ−１１６、Ｍｅｔ−１１６、Ｔｒｐ−１１６、Ｐｈｅ−１１６、Ｖａｉｌ　ｌ　６　；　Ｌｅｕ−１２１置換：　Ｔｒｐ−１２１、Ｍｅｔ＝１２１、Ａｌａ−１２１、Ｇｌｙ−１２１、Ｔｙｒ−１２１、Ｐｒｏ−１２１゜Ｔｈｒ−１，２１，５ｅｔ−１２１、Ｈｉｓ−１２１、Ｇｌｕ−１２１，Ａｓｎ −１２１、Ｇｌｎ−１２１、Ａｓｐ−１２１，Ｌｙｓ−１２Ｌ　Ａｒｇ−１２１；Ｌｙｓ−１１２置換：　Ａｒｇ−１１２、Ｖａｌ−１１２，１ｉｅ−１１２、Ｐｈｅ−１１２、Ｔｙｒ−１１２、Ｔｒｐ−１ｉ　２、Ｔｈｒ−１１２、ｃｔｙ −ｉ　１２．５ｅｒ−１１２、Ａｓｐ−１１２、Ａｓｎ−１１２、Ｐｒｏ−１１２およびこれらの置換の組合せ。

さらに、変性を誘発するためにより厳格な処理を必要とする哺乳動物ソマトトロピンのアナログは、凝集度が低いであろうと予測される。これは、中間体折畳み単量体を形成する蛋白量が天然状態に対し、減少するためである。我々および他の者は、ヒトソマトトロピンか折畳みの解除にかなり多量の変性剤を必要とすることを観察した。後者の蛋白は、安定な折畳み中間体を形成せず、この機構の結果として沈毅しない。したがって、対応するヒト配列と適合させるためにｂｓｔ配列の一次構造を変えることによって、つンフォメーンョン安定性を増強させ、観察される凝集量を減少させ得る。これらとしては、以下の置換のうち１つまたはそれ以上を含有する以下のアナログが挙げられる　Ａｌａ−４→Ｔｈｒ：　Ｍｅｔ−５→１１ｅ；　５ｅｒ−６→Ｐｒｏ；　Ｇｌｙ−９→Ａ　ｒｇ　；　Ａｌａ−１−２−”Ａｓｐ；　Ｖａｌ−１５−＊Ｍｅｔ　；　Ｇｌｎ−１９→Ｈｉｓ；　Ｈｉｓ−２０−Ａｒｇ；　Ａｌａ−２６−＋Ｐｈｅ；　Ｐｈｅ−２９→Ｔｙｒ；　Ｌｙｓ−３０−”Ｇ１ｎ１　；　Ａｒｇ−３４−＋Ｇ１ｕ；　Ｔｈｒ−３５’−＋Ａｌａ；Ｇｌｕ−３９崎Ｌｙｓ　；　Ｇｌｙ−４０→Ｇｌｕ；　Ａｒｇ −４２→Ｌｙｓ　；　Ｉ　１ｅ−４５−”Ｌｅｕ；　Ｔｈｒ−４８→Ｐｒｏ；　Ｖａｌ−５０−＋Ｔｈｒ；　Ａｌａ−５１→Ｓｅｒ；Ｐｈｅ−５２−＋Ｌｅｕ　；　Ｔｈｒ−５７−＋Ｓ　ｅｒ　：　Ａ　１ａ−６０−Ｔｈｒ　；　Ｔｈｒ−６２−＋Ｓｅｒ；　Ｇｌｙ−６３−Ａｓｎ；　Ｌｙｓ−６４−”Ａｒｇ；　Ａｓｎ −６５４ＧＩＬＩ＋Ａｌａ−６７−＋Ｔｈｒ；　Ａｓｐ−７２−＞Ａｓｎ　；　Ｇｌｙ−８８→Ｇ］ｕ；　Ｌｅｕ−９０→Ｖａｌ　：　５ｅｒ−９４→Ａｒｇ＋　Ａｒｇ−９５→Ｓｅｒ；　Ｔｈｒ−９８−”Ａｌａ；Ｐｈｅ−１０３−”Ｔｙｒ：　Ｔｈｒ−１０５−Ａｌａ：　Ａｒｇ−１０８−”Ｓｅｒ：Ａｌａ−１３４ −”Ｔｂｒ；　Ｌｅｕ４３８−ｐＰｈｅ：　Ａｓｐ−ｔ　４３−＋Ｓｅｒ：Ｍｅｔ−１４９−＋Ｓｅｒ：　Ａｒｇ−１５０−＋Ｈｉｓ；　５ｅｒ−１５１−＋Ａｓｎ；５ｅｒ−１６３−”Ｔｙｒ；　Ｌｅｕ−１６９−”Ｍｅｔ；　Ｈｉｓ−］　７０−”Ａｓｐ；Ｔｈｒ−１７２−”Ｖａｌ　；　Ｌ、ｙｓ−１８０−＊Ｇｌｎ　；　Ｐｈｅ−１８４−＋Ｓｅｒ；Ｇｌｙ−１８５→Ｖａｔ　：　Ａｌａ−１８７→Ｇｌｙ　；　Ａｌａ−１９０−４Ｇｌｙ　；　４４および４５残基間へのＰｈｅの挿入；１０８および１０９残基間へのＡ、ｓｎの挿入：　Ａｒｇ−１８２の欠失。

さらに、他の構造変化は構造安定性の増強を生じることが予想される。例えば、 α−へリノクスにわたるアミノ酸７〜３４．７５〜９５および１．５０〜１８３残基の安定性の増強は、同様に、凝集を減少させる。これらのへワックスのコンフォメーション安定性の増強は、例えば、これらの領域内のα−へワックス形成力が低いアミノ酸を、α−へワックス形成力が高いアミノ酸と置き換えることによって行い得る。後者の例としては、Ｇｌｙ−９→Ｇｌｕ；　Ｖａｌ−１５→Ｌｅｕ　＋　Ａｓｐ−２７−＋Ｇ　ｌｕ　；　Ｐｈｅ−２９→Ｌ、ｅｕ　：　Ｉ　１ｅ−７８−＋Ｌｅｕ　；Ｐｈｅ−９２−＋Ｌｅｕ　：　Ｓ　ｅｒ−１８３４０Ｉｒ＋　；　Ａｒｇ−１６６−＊Ｌｙｓ　；　Ｔｈｒ−１７２−”ＧＩＬＩ：　Ｔｙｒ−１７５→Ｌｅｕ；　Ａｒｇ−１７７−＋Ｌｙｓ：　Ｖａｌ１７８→Ｌｅ υが挙げられる。

本発明の種々のアナログを記すために短縮表示を用いた。例えば、Ｇｌｎ−１２１は、特にチャート１で例示するようなりｓｔ分子の１２１位のロイシンがグルタミンで置き換えられたソマトトロピンアナログを表す。

ソマトトロピンの分子異質性によって、種々のソマトトロピン内のアミノ酸残基の番号付けが異なり得る。“天然哺乳動物ソマトトロピン”なる語は、これらの天然に生じる種を含む。チャー　ト１には、これら天然ｂｓｔ種の１つを示す。

他の種または他のアナログが含まれる他のソマトトロピンの番号付けは異なり得る。チャート１に記載したｂｓｔのロイシン１２１を使用して、当業者は、他の動物ソマトトロピン、例えば、哺乳動物ソマトトロピン、例えば哺乳動物ソマトトロピンのロイシン１２１またはそれらのアナログにおける対応するアミノ酸を容易に位置決めして、処理間の所望の凝集減少（減少した疎水性またはヘリックス安定性による）および生物活性の増強を達成することができる。

ｂｓｔの凝集折畳み中間体（上記参照）と種々の製造条件におけるｂｓｔの溶解性との間に明らかな関係が存在する。ｂｓｔの溶解性の改良が望ましいので、本明細書において例示するように１０９〜１３３残基の間の一次構造変化を含むアナログを合成し、改良されたｂｓｔ分子を得た。天然ｂｓｔよりも溶解するアナログは、固体および溶液状態における安定性も増大される。

ｂｓｔおよび他のソマトトロピンのアミノ酸１０９〜１３３残基の化学的および遺伝学的修飾体は、共に本発明に包含される。

好ましい遺伝学的修飾体は、天然アミノ酸配列を他のアミノ酸残基に置換することに関する選択的単点突然変異法によって合成された。

本発明のアナログの製造において、以下の因子が、ｂｓｔ主配列の１０６〜１２７残基の間で通常見られるα−へワックスの安定性を減少させると予想される：（ｉ）両親媒性ヘリックスの疎水性面への極性残基の挿入。

この両親媒性ヘリックスの疎水性面は以下の残基からなる：Ｔｙｒ−１１０、Ｌｅｕ４１３、Ｌｅｕ−１１６、Ｇｌｙ−１１７（疎水性ではなく疎水性面にある）Ｉ　１ｅ−１２０，Ｌｅｕ−１２１、Ｌｅｕ−１２３、Ｍｅｔ−１２４、およびＬｅｕ−１２７゜ブタソマトトロピンは、１２１位の疎水性アミノ酸残基を含まない。以下のアミノ酸のいずれかで疎水性残基のいずれか（Ｇｌｕ−１１７を除くすべて）を置換することによって、自己会合を介してα−ヘリックス形成を推進するこの領域の能力を減少させることが予想される：アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、トレオニン、およびプロリン。

（１１）α−へワックスにわたる１０６〜１２７残基のＮＨ，またはＣｏｔＨ末端付近への、α−へワックス双極子による反発相互作用のため二次構造のこの領域を不安定化するアミノ酸残基の挿入。

α−へワックス形成の安定化におけるヘリックス双極子の役割が探査された（マーカス（Ｍａｒｃｕｓｅ）およびパルドウイン（Ｂａｌｄｖｉｎ乃。

例えば、α−ヘリ、クスのカルボキシル末端付近に配置された負荷電アミノ酸（例えばグルタミン酸）は、α−ヘリックス形成の不安定化に資する。したがって、アスパラギン酸またはグルタミン酸によるＬｅｕ−１２７の、またはより小さい範囲でＡｒｇ−１２５の置換、あるいはり／ンまたはアルギニン残基による１０４〜１０９残基の置換は、α−ヘリックス安定性を減少させると予想される。

特に、塩基性アミノ酸残基によるＡｓｐ−１０７の置換は、ヘリ・ノクス安定性を減少させることが予想される。

（ｉｉｉ　）このタイプの二次構造についての指向性が小さいアミノ酸残基によるα−ヘリックス形成についての指向性が強いアミノ酸残基の置換。

α−へリソクス安定性を減少させることが予想されるアミノ酸置換を以下に詳細に挙げる。これらの予想はレビット、エム（Ｌｅｖｉｔｔ。

Ｍ、）（１９７８）バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１７．４２７７−４２８５で定義されている相対的α−へワックス指向性に基づいて行う。

５ｅｔ−１０６→グリシンまたはプロリン。

Ｖａｌ−１０９−”　トレオニン、チロシン、グリシン、セリン、またはプロリン。

Ｔｙｒ−１１０→クリシンまたはプロリン。

Ｇｌｕ−１１１、Ｇｌｕ−１１７；　ｑｊｕ−１１１８、Ｇｌｕ−１２６−”アラニへ７スオイン、「ロイシンζグル２ミへヒスチジン、リジン、バリン、インロイ７ン、フェニルアラ、ニン、チロシン、トリプトファン、トレオニン、グリシ、ン、セ、リン、アスパラギン酸、アスパラギン、５プロリン、またはアルギニン。

Ｌ　ｙｓ７．、．１．　、　ｊ　２、Ｌ　ｙｓｙ、１１４　→　システィン、バリン、インロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、トレオニン、Ｌｅｕ−１１，３、Ｌｅｕ−１１６、Ｌｅｕ−１２１、Ｌｅｕ−，１２３、Ｌ　ｅｕ−１２７→アラニン、システィン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、トレオニン、クリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、またはアルギニン。

Ａ　Ｓｐ−１０，，７、Ａｓｐ−１１５，→バリン、インロイシン、チロシン、トリプトファン、トレオニン、グリシン、セリン、アスパラギン、プロリン、またはアルギニン。

Ｇ’４ｙ−１１９→プロリン。

ｌｌ５−１２０　→バリン、チロシン、スレオニン、クリシン、セリン、アスパラギン、またはプロリン。

Ａｌａ−１２２→システイン、ヒスチジン、リジン、バリン、インロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、トレオニン、グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、またはアルギニン。

Ｍｅｔ−１２４→ほかの天然アミノ酸残基いずれでも。

Ａｒｇ−１０８、Ａ、ｒｇ−１２５４バリン、チロシン、トレオニン、グリシン、セリン、アスパラギン、またはプロリン。

前記のものを含む複数の置換も考えられる。例えば、好ましい具体例は、Ａｒｇ −１２５に代えて置換したグリシンおよびＧｌｕ−１２６に代えて置換したアルギニンを有するものであって、Ｇｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６と示される。

“動物ツマ１−１−ロビン”なる語は、動物、例えば哺乳動物起源のソマトトロピンをいい、天然源、例えば下垂体組織、またはソマトトロピンの天然型を産生ずるために組換え遺伝学によって形質転換された微生物のいずれかから誘導されたツマ・トトロピンを含む。ウシソマトトロピンまたはウシ起源ソマトトロピンのように特定の哺乳動物源を命名する場合、該ソマトトロピンは、天然源または形質転換微生物いずれから誘導されたものも含む。

“微生物”なる語は、本明細書においては、細菌、酵母、放線菌の如き単細胞原核および真核微生物、ならびに細胞培養で増殖させた高等植物および高等動物由来の単一の細胞を共に含ませて使用する。

“天然”なる語は、天然源、例えば下垂体組織、またはソマトトロピンの天然型と同一のアミノ酸配列を有するソマトトロピンを産生ずるために組換え遺伝学によって形質転換された微生物のいずれかから誘導されたソマトトロピンの天然型をいう。

哺乳動物ソマトトロピンは、アミノ酸配列および物理学的構造において非常に類似する。実施例に示す構造変化はｂｓｔ内で行ったが、該プロセスは、いずれの動物ソマトトロピン、例えば置換に利用可能な所要アミノ酸残基を有する哺乳動物ソマトトロピン、例えばブタソマトトロピンにも同等に適用できる。

本発明のｂｓｔアナログの相対的能力は、下垂体切除ラットを用いて容易に測定される。エバンズ、エイチ・エム（Ｅｖａｎｓ、　Ｈ，Ｍ、）およびロング・ジェイ・エイ（Ｌｏｎｇ　Ｊ、Ａ、）、アナトミカル・レコード（Ａ　ｎａｔ、　Ｒｅｃ、　）、２１：６１．１９２１゜全体重の相対的増加は、本発明の下垂体ｂｓｔ％ｒｂＳｔおよび種々のｂｓｔアナログを用いて記録する。

部位特異的突然変異誘発二部位特異的突然変異誘発に関するい（つかの技術が、ＤＮＡ配列に特異的な変化を導入するために開発されており、本発明の化合物を産生ずるために使用され得る（クレイマー、ダブリｘ　（Ｋ　ｒａＩＩｌｅｒ、　Ｗ　）ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１２、第９４４１〜５６頁（１９８４）；７ンデノキ、タブリュ（Ｍａｎｄｅｃｋｉ、　Ｗ、　）。

プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８３、第７１７７〜８１頁（１９８６）；シラー、エム・ジエイ（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ。

Ｊ、）およびスミス、エム（Ｓｍｉｔｈ、Ｍ、）、ＮｕｃＬ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１０、第６４８７頁〜第６５００頁（１９８２）；ノーラング−、ジエイ（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ　、　）ら、ジーン（Ｇ　ｅｎｅ）、２６、第１０１頁〜第１０６頁（ｔ９８３）＋クンケル、ティー・エイ（Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、　Ａ、）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８２第４８８〜９２頁（１９８５）；ショールド、エイ（Ｓ　ｃｈｏｌｄ、　Ａ　）ら、ＤＮＡ、３、第４６９〜７７頁（１９８４）；マロツテイ、ケイ・エム（Ｍａｒｏｔｔｉ、　Ｋ、Ｍ、）およびトミッチ、シー・ニス・シー（Ｔ　ｏｍｉｃｈ、　Ｃ−Ｓ、Ｃ，）、ジーン・アナリシス・テクニクス（’Ｇ　ｅｎｅ　Ａ　ｎａｌ、　Ｔ　ｅｃｈ、　）（印刷中））。我々は、突然変異反応用の唯一のプライマーおよび突然変異誘発効率を増大させる遺伝子３２蛋白を使用して、マロノティ（Ｍａｒｏｔｔｉ）およびトミ・ノチ（Ｔｏｎｉｃｈ）のプライマー特異的突然変異誘発法を用いた。

コロニーフィルターハイブリダイゼーション：フィルターハイブリダイゼーシゴンのスクリーニング法は、その相補配列の位置を探し出し、ハイブリダイズして二本鎖セグメントを形成する、ＤＮＡの一本鎖セグメントの能力に基づく。ハナハン、ディ（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ　、　）およびメセルソ７．エム（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、　Ｍ、　）、Ｍｅｔｈ、　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、、１００、第３３３〜４２頁（１９８３）。この結合の熱安定性は、二本鎖領域内に含まれる対合および誤対合の数による。より多くの誤対合が含まれるほど、塩基対結合は弱くなり、かつＤＮＡ結合を破壊するのに必要な温度は低くなる。この温度差は、コロニーフィルターハイブリダイゼーションの間に利用する。ブリャン、アール（Ｂ　ｒｙａｎ。

Ｒ，）ら、マイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）（１９８６）。

天然および突然変異配列の間の温度差を最大にする突然変異オリゴマーを構築することによって、より低温でハイブリダイズさせて、対合されたかまたはほぼ対合された配列にプローブを結合させることができる。高温度で洗浄すると、誤対合ブローブーＤＮＡ二重鎖は、不安定になり、脱会合するが、完全に対合した二重鎖は結合されたままである。次に、対合した二重鎖は、オートラジオグラム上で最も暗い信号を生じ、したかって、所望の配列を含むコロニーに関する検出法となる。次いで、このコロニーからＤＮＡを単離し、配列決定することができる。

フィルター調製については、プレート上にニトロセルロースフィルターを重層する。該フィルターおよびプレートを向きについてマークし、次いて、プレートからフィルターを注意深く取り上げる。

マスタープレートを室温で一晩インキユベートして、コロニーを再増殖させる。

該フィルターは、０．５ＭＮａＯＨ１ＬＳＭＮａＣＱ中に１０分間ｉ＋ｆｆｉしたワットマン紙（Ｗｈａｔｍａｎ　ｐａｐｅｒ）上に１枚ずつそれらを重層することによって変性し、１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７゜４．１．５ＭＮａＣ＆中に、各々、少なくとも１０分間浸漬したワットマン紙を２〜３回順次取り換えて中和し、新しいワットマン紙上で３０分間風乾する。次いで、それらを、真空下、８０℃で２時間加熱する。

プローブとして使用するオリゴヌクレオチドを放射線標識するキナーゼ反応は以下のとおりである。オリゴヌクレオチド２μ９．１ＯＸ＋ナカー緩衝液２ｔｔＱ、ａ３２−Ｐ　ＡＴＰ　ｌｏｏμｃｉ、Ｔ４キナーゼ２μＱおよび全量を２０μ Ｑにする水を混合し、３７℃で１時間インキュさ一トする。１ｊＩＱカラムに、１０３１１！の使捨てカラムに入れたＤＥＡＥ−セファセル（Ｓ　ｅｐｈａｃｅｌ）を充填し、高塩緩衝液（ＴＥ中１．５Ｍ　ＮａＣＱ）２〜３ｘＱで平衡化させ、次いで低塩緩衝液（ＴＥ中０．２Ｍ　ＮａＣｆ２）２〜３村で平衡化させる。キナーゼ反応を低塩緩衝液２００μＣで希釈し、カラム中に直接負荷する。該カラムからカウントがさらに溶出しなくなるまで、該カラムを低塩緩衝液５１ＲＱ以上で洗浄する。プローブを高塩緩衝液４〜６酎中で溶離する。

ハイブリダイズさせるには、フィルターを結晶化皿中に置き、４０°Ｃで１〜２時間、５Ｘデンハーツ（Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔｓ）　（１％ＢＳＡ、Ｌ％フィコール（Ｆ　１ｃｏｌｌ）および１％ＰＶＰ）、５Ｘ　５ＳＣ（０，７５Ｍ　ＮａＣＱ、０．０７５Ｍ　クエン酸ナトリウム）および０．１％ＳＤＳ中でバッチ予備ハイブリダイズする。ノ＼イブリダイセーション溶液を取り換え、プローブを添加する。この皿に蓋をし、ゆっくりとかき混ぜながら一晩ハイブリダイゼーションを行う。次いで、フィルターを５Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで数回換えて洗浄する。フィルターをこの溶液中に置く一方、水浴および洗浄溶液（５Ｘ　ＳＳＣ。

０．１％５ＤＳ）を適当な洗浄温度まで加熱する。順次、フィルターを、洗浄溶液を入れた新しい結晶北国に移し、３×２０分洗浄し、各洗浄後に皿を換える。

次いで、ワットマン紙上で風乾し、サランラップ（Ｓ　ａｒａｎ　ｗｒａｐ）に包み、Ｘ線フィルムに暴露する。

ベクターＤＮＡＭ製、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク（１９８２）に開示されている方法に従って、配列決定のためのＤＮＡを得る。

配列決定ゲル下のプロトフルに従って、二本鎖配列決定を行う。

２ＮＮａＯＨ１２ｘＭ　ＥＤＴＡ　３ｕＱをＤＮＡ　１２μｆ２（２μ９）に添加し、１５分間インキュベートする。３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　６μＱ１　プライマー１μａおよび９５％エタノール１００μＱを添加し、ドライアイス上で２０〜３０分間ＤＮＡを沈殿させる。ベレットを回収し、洗浄し、真空乾燥する。水１３ μＱおよび緩衝液（０，３Ｍ　トＩＪス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、ｐＨ８，３，０，３７５Ｍ　ＮａＣ１２，３７，５ｚＭＭ　ｇ　ＣＱ　ｘ、２．５ｔＭ　ＤＴＴ）４μＱに溶解し、α３２Ｐ　ｄＣＴＰ　２μＱ（２０μＣｉ）および逆転写酵素１μｇを添加する。この混合物４μＱを、各々Ｇ混合物、Ａ混合物、Ｔ混合物またはＣ混合物１μＱを含有する４本のエッペンドルフ管にビベ・ノドで入れる。該管を４２°Ｃで１０分間インキュベートする。追跡混合物（０，２５ｘＭ　ｄＮＴＰｓ）１μＱを添加し、それらをさらに５分間インキュベートする。

停止溶液（８０％ホルムアミド、１０１Ｍ　ＮａＯＨ，ＩＩＩＭ　ＥＤＴＡ。

０．１％キンレンシアノールおよび０，１％ブロムフェノールブルー）１０μＱを添加し、該反応を３分間沸騰させ、各々３μＱを配列決定ゲルに負荷する。

誘導プロトコルおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析：ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８を参照。

トリプトファンプロモーター系と一緒に、適当な遺伝子配列か挿入された温度感受性ランナウェイ−複製−プラスミドを担持するイー・フリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）から組換えＤＮＡ誘導ｂｓｔを得た。ンーーエス・シー・　トミ　ノチ（Ｃ−Ｓ、Ｃ，Ｔｏｍｉｃｈ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１７、第３１７９〜９７頁（１９８９）。ｂｓｔの発酵および単離は、エバンズ（Ｅ　ｖａｎｓ）およびヌース（Ｋ　ｎｕｔｈ）によって開示された方法（特許出願国際公開Ｗ０８７００２０４号）に準じた。

上記のマロツティ（Ｍａｒｏｔｔｉ）およびトミッチ（Ｔ　ｏｍｉｃｈ）の方法に従い、プラスミドＤＮＡ上のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって、Ｇｌｎ−１２１ｂｓｔおよびＬｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂｓｔを得た。

Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔを生じさせるために野生型Ｄ　Ｎ　Ａ配列上で、そしてＬｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳ　ｔを生じるためにＬｅｕ−１１２ＤＮＡ配列上で、５’ＧＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣを有するオリゴヌクレオチドを使用した。コロニーハイブリダイセーンヨン（マニアナイス、ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、）、フリッチｓ　（Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ）ら、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８２）によって突然変異体を検出した。二本鎖鋳型に関する鎖停止法（ワレイス、アール・ビー（Ｗａｌｌａｃｅ、Ｒ，Ｂ、）ら、ジーン（Ｇ　ｅｎｅ）、１６．２１〜２６（１９８１））によってＤＮＡを配列決定することによって該突然変異体を確認した。形質転換およびプラスミド調製は、上記のマニアティス、ティーによって開示された方法に従った。突然変異体ｂｓｔは、イー・コ！Ｊ（Ｅ、ｃｏｌｉ）の同−株から得られ、野生型組換え誘導ｂｓｔと同一の方法で発酵培養培地から単離した。

シュバルツ（Ｓ　ｃｈｗａｒｔｚ）／マン（Ｍａｎｎ）からの塩酸グアニジン（Ｇｄｎ　ＨＣｆ２）は、極めて純度が高かった。他の試薬は分析グレードであった。

ｂｓｔ１２ｉｔ、１５．２７０Ｍ−’ノ吸光係数を用い、２７８　ｎｏ（７）吸光度によって決定した（バーガー、エイチ・ジー（Ｂｕｒｇｅｒ、　Ｈ，Ｇ、）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２４１、第４４９頁〜第４５７頁（１９６６））。吸光度測定は、ｒ８Ｍ９４２０分光計で行った。ＣＤ測定は、ジャスコ（Ｊ　ａｓｃｏ）　Ｊ−５００Ｃ分光偏光計を用いて行った。結果は、平均残留楕円率（ｍｅａｎ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）（ＭＲＥ）（度ｃｍ”　ｄｏ＋ｏｌ−’）として示し、１１５の平均残存重量（ｍｅａｎ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ｗｅｉｇｈｔ）を用いて算出した。

前記に従って、平衡変性法、等電点電気泳動法、速度論的研究および逆相ＨＰＬＣの結果が得られた（ハベル、エイチ・エイ（Ｗａｖｅｌ、Ｈ。

Ａ、）ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５、第６５３３頁〜第６５３８頁（１９８６）、ブレムズ、ディー・エヌ（Ｂ　ｒｅｍｓ、　Ｄ　。

Ｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５、第６５３９頁〜第６５４３頁（１，９８６）：ブレムズ、ディー・ニス（Ｂｒｅｍｓ、Ｄ。

Ｎ、）、ジャーナル・オン・バイオロジカノいケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　）、２６２、第２５９０頁〜第２５９６頁；ブレムズ、ディ・エヌ（Ｂ　ｒｅｍｓ、　Ｄ、　Ｎ　、　）ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２４、第７６６２頁〜第７６６８頁（１９８５））。トリプシンのマツピングは、ハートマン、ビー・エイ（Ｈａｒｔｍａｎ、　Ｐ、　Ａ、）ら、ジャーナル・オン・クロマトグラフィー　（Ｊ　、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　）、３６０、第３８５頁〜第３９５頁（１９８６）に従った。

会合中間体の検出に関する２工程法は、以下のとおりである：第１工程において、３．５Ｍ　Ｇｄｎ　ＨＣＱ、ｐＨ８，５に様々な濃度の突然変異体または野生型蛋白を溶解することによって、様々な濃度の会合中間体が生じる。平衡化の後、０．８Ｍ　Ｇｄｎ　ＨＣｉ２および蛋白濃度０．１　Ｂａｇ／ｘＱ＜８．２μ Ｍ）に試料を希釈することによって、凝集した蛋白を沈殿させた。３０分後、該反応混合物を、４５０ｎｏ＋で濁度を測定するためにキュベツトに加えるか、遠心分離によって沈降させ、０．４５μ肩の濾過器を介して濾過する。残存する可溶性蛋白含有量を２７８止でＵＶ吸光度によって測定する。

凝集形成の見かけの平衡定数は、ＡＳ、ＹＳＴ（マクミラン・ソフトウェア（ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ））において利用可能である非線形最小自乗曲線適合法（ｎｏｎ−１ｉｎｅａｒ　１ｅａｓｔ　５ｑｕｒｅｓ　ｃｕｒｖｅ　ｒｉｔｔｉｎｇｒｏｕｔ　１ｎｅｓ）を使用することによって算出する。これらの定数の正確な決定は、このソフトウェアパッケージを使用することに依存しない。検量線は、−世体一対一二量体平衡を想定することによって決定される：　Ｍ　＋　Ｍ−−ｏ　；　Ｋａｌｌ、Ｏ，、、−［Ｄ］／［Ｍ３’　；および［蛋白］、。ｌａｌ　＝＝　２［Ｄ］　＋　［Ｍ］　（式中、［Ｄ］は二重体の濃度であり。

［Ｍ］は二重体の濃度であり：　Ｋａｓｍｏｃは会合定数である）。会合をモニターするために、蛋白濃度を変化させ、３００ｎｍでのより負のＭＲＥは、二量体形成に比例すると仮定される。算出されたＭＲＥ＝　ＭＲＥＭ［Ｍ］　＋　ＭＲＥｏ［Ｄ］　（式中、Ｍ　ＲＥ　Ｎは二重体ｊこ関する平均残留楕円率であり、Ｍ　ＲＥ　ｏは二量体ζこ関する平均残留楕円率である）。

動的データは、オン−ライン・インストウルメント・システムズ（Ｏｎ−Ｌ　ｉｎｅ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｓ　ｙｓｔｅＩＩｌｓ）（ＯＬ　Ｉ　Ｓ　、ジエファー゛ノン（Ｈｅｆｆｅｒｓｏｎ）、ジョーシア州）３９２０Ｚ　データ収集および装置制御システムによって分析される。このシステムに関して、データは単一の反応速度指数函数方程式に適合する。速度論的結果（ま時定数または速度−１として表す。

実施例Ｉ　Ｇｌｎ−１２１ｂＳＴの生産二本鎖プライマー伸長法に関する部位特異的突然変異誘発法を使用して、ｂＳｔ　ｃＤＮＡ　ｍ４遺伝子においてアミノ酸１２１位のグルタミンに関し変化させたコドンを誘発する（国際特許出願ＰＣＴ／Ｕ　Ｓ　８　Ｂ１０　Ｏ３２８号、１９８８年１月２７日出願であり、本明細書に資料として引用記載する）。この方法において、標的配列は、適切なプラスミドにクローン化し、プラスミドＤＮＡを調製する。

該プラスミドＤＮＡをＮ　ａ　ＯＨで処理することによって変性し、ＤＮＡ分子デオキシリボース−リン酸骨格において“ニック”を生じる。これは、ＤＮＡを弛緩させ、所望の配列変化を含有するオリゴマーがｂｓｔの位置１２１残基を含有するプラスミド配列にｌ＼イブリダイズするのを可能とする。プライマーを伸長させ、突然変異誘発性オリゴマーを含有する新しいＤＮＡ鎖を合成し、正常な相補鎖と置換する逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性用のプライマーを、オリゴマーの３°末端に生じさせる。伸長反応は、オリゴマー指間変化の取り込みの可能性を増大させる。ＤＮＡをコンピテント細胞に形質転換し、得られたコロニーをコロニーフィルターノ・イブリダイゼーンヨンによってスクリーニングする。プラスミドＤＮＡを、陽性候補体から単離および配列決定する。

ｂｓｔａ４遺伝子における１２１位グルタミン変化を構築するのに使用したオリゴマーは、既述の技術（ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８）によって生産される。

このようにして産生された前記のオリゴヌクレオチドは、適正な変化を含む。

実施例２　Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−４２１ｂＳｔの生産所望のアミノ酸をコードする適切なオリゴマーに代えた以外は、実施例１の方法に従って、１１２位にロイシンを有し、１２１位にグルタミンを有するｂｓｔアナログを構築する。

実施例３　Ｇｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳｔの生産所望のアミノ酸をコードする適切なオリゴマーに代えた以外は、実施例１の方法に従って、１２５位にグリシンを有し、１２６位にアルギニンを有するｂｓｔを構築する。

実施例４　Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔ、　Ｌｅｕ−１１２＋Ｇｌｎ−Ｌ　２　ＬおよびＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳｔの特徴付は野生型およびｂｓｔアナログ試料の逆相ＨＰＬＣ分析によって単一のクロマトグラフィーピークを得る。使用したグラジェント系において、リシン１１２の代わりにロイシンを用いると、保持時間の有意な増加（約８．５分）が生じるが、一方、１２１位での変化は、保持時間の僅かな減少（約１．４分）を生じる。１１２および１２１位での二重突然変異によって保持時間への付加的効果が生じる。

野生型およびｂｓｔアナログ試料の等電点電気泳動によって主成分に関する以下のｐＩ値が得られる：　８．１５（野生型）、７．０（Ｌｅｕ−１１２）、８．２５（Ｇｉｎ−ｆ　２１）、７．０５（Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１）、８．７ぐＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６）。これらの値は、野生型ｂｓｔにおける（塩基性）リシン残基のＬｅｕ−１１２ｂＳｔおよびＬ　ｅｕ−１１２＋０１ｎ−１２１ｂＳｔにおける（天然）ロイシン残基との置換ならびに（酸性）グルタミン酸残基のＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ４２６　ｂＳｔアナログにおけるグリシンとの正味の置換と一致する。

正しいアミノ酸変化がＧｌｎ−１２１ｂＳｔ、　Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１、およびＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳｔにおいて行われたことの確認は、酸化された蛋白のペプチドマ／ピングによって確立された。突然変異体の予想されるペプチド断片かマツプから欠けており、クロマトグラムにおいて新しいピークか観察され、これらは置換されたアミノ酸を有するペプチドに一致する。

ペプチド保持時間の変化は、ペプチドの疎水性の変化と相互関係がある。

突然変異蛋白のトリプシンマツプに現れる新しいピークもアミノ酸配列決定に付した。　Ｇｌｎ−１，２１ｂＳｔ、　Ｌｅｕ−１１，２＋０１ｎ−１２１、およびＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳ　ｔに関して、正しいアミノ酸配列が得られる。

Ａ、　低蛋白濃度ではＧ１ｎ４２１　ｂＳｔが野生型ｂｓｔのように変性するか、高蛋白濃度ではＬｅｕ−１１２ｂＳｔおよびＬｅｕ−１１２十〇Ｉｎ−１２１ｂＳｔが野生型ｂｓｔのように変性する。

野生型およびｂｓｔアナログの低蛋白濃度での平衡変性を測定した。

Ｇｌｎ−１２１および野生型ｂｓｔに関して、第２誘導ＵＶ吸収およびＣＤ検出された変性転移は、対称的であり、かつ同一である。しかしながら、Ｌｅｕ−１１２ｂＳｔおよびＬｅｕ−１１２＋０１ｎ−１２１ｂＳｔに関して、ＣＤ検出転移は、二相性であり、第２誘導ＵＶ吸光度検出転移は、非対称的である。これらのタイプの転移は、高濃度の野生型ｂｓｔに関して既に報告された（ハベル、エイチ・エイ）ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２Ｓ、第６５３３頁〜第６５３８頁（１９８６）、ブレムズ、ディー・エヌ（Ｂｒｅｆｆｌｓ、　Ｄ、Ｎ、）ら、バイオケミストソー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５、第６５３９頁〜第６５４３頁（１９８６））。二相性および非対称的な変性転移は、会合中間体の存在に帰せられている（ハベル、エイチ・エイ（Ｈａｖｅｌ、　Ｈ，Ａ、）ら、上記文献：およびブレムズ、ディー・エヌ（Ｂｒｅｆｆｉｓ、　Ｄ、　Ｎ、）う、上記文献）。変性結果によって、０，０４群／ｘＱ（１，８μＭ）では、野生型、Ｇｌｎ−１２１およびＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ− １２６ｂＳｔが会合中間体の有意な集団を示さないが、Ｌｅｕ−１１２ｂＳｔおよびＬ　ｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳｔは会合されることが分かる。これらの結果は、会合定数がＬｙｓ−１１２をＬｅｕに置き換えることによって増大したことを示唆する。

Ｂ、Ｇｌｎ−１２］およびＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳｔは会合した折畳み中間体を不安定にし、Ｌｅｕ−］、　ｌ　２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳｔはそれを安定化する。

３００　ｎｍでのＣＤ測定によって、種々のｂｓＬ種に関する会合中間体の集団が以下の順序であることが分かる：Ｌｅｕ−１１２　ｂＳｔ＞Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳｔ＞野生型ｂＳｔ＞Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔ＞Ｇｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６１１９／ｚＱ＜４５μＭ）以下の蛋白濃度では、これらの蛋白において会合した種類の量（より負の楕円率から測定した）は、以下の順序である。

Ｌｅｕ−１１２ｂＳｔ＞Ｌｅｕ−１１２＋０１ｎ−１２１ｂＳｔ＞野生型ｂＳｔ＞Ｇｌｎ−１２］、ｂＳｔ＞Ｇｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳｔ２ｆｆ？／ｄ（９１μＭ）以上の濃度では、野生型ｂｓｔは、Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１，ｂＳｔよりも負の楕円率を有するが、Ｌｅｕ−１１２ｂｓｔはど負ではない楕円率を有し、会合した種の量に関する順序は以下のとおりである：Ｌｅｕ−１１２ｂｓｔ＞野生型ｂＳｔ＞Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂｓｔ＞Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔ＞Ｇｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂｓｔ濃度依存性効果は、野生型ｂｓｔに対する会合中間体の安定性を、Ｌｅｕ−１２１のＧｌｎへの変化は減少させ、Ｌｙｓ−１１２のしｅｕへの変化は増加させることを示す。

さらに、Ａｒｇ−１２５をグリシンに、Ｇｌｕ−１２６をアルギニンに代えると、野生型ｂｓｔに対する会合中間体の安定性を減少させる。Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳｔに関して、野生型ｂｓｔに対する会合中間体の安定性への正味の影響は、蛋白濃度に依存する。

Ｃ，Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔおよびＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳｔは野生型ｂｓｔはとには沈殿せず、Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳｔはそれよりも沈殿する。

会合中間体は、天然または変性のコンフォメーションはど可溶性ではない。これは、２工程法＝１）会合中間体は最大数に関する溶媒条件を調節することによって存在すること、および２）溶媒条件を変化させて、会合形態を選択的に沈殿させることによって野生型蛋白に関して示される。この２工程法は、突然変異体および野生型ｂｓｔに関する会合中間体の安定性と比較するのに利用される。種々の蛋白の沈殿量は、以下の順序である。

Ｌｅｕ−１１２ｂｓＬ＞Ｌｅｕ−１１２４Ｇｌｎ−１，２１ｂｓｔ＞野生型ｂＳｔ＞Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔ＞Ｇｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂｓｔ結果は、Ｇｌｎ−１２］、ｂＳｔおよびＧｌｙ−１，２５＋Ａｒｇ−１２６ｂｓｔで見られた沈殿が野生型ｂｓｔよりも約３６％および７２％少ないことを示す。形質転換イー・コリ（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）からの活性ｂｓｔの回収は、１ｎ−ｖｉｔｒｏ折畳み工程を必要とする。折畳みの間の蛋白の沈殿が低い回収率で得られるので、Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔおよびＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳｔは、形質転換イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）から可溶性活性ｂｓｔが高収率で得られるであろう。

Ｄ　低蛋白濃度ではＧｌｎ−１２１ｂＳｔおよびＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳ　＊は野生型ｂｓｔと同一の速度で再度折り畳まれるが、高い蛋白濃度ではそれらはより速く折り畳まれ、他方、Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳｔはゆつ（つと再度折り畳まれる。

ｂｓｔ再折畳みの反応速度は蛋白濃度に依存し、濃度の増加に伴ってより遅い反応速度が得られる（ブレムズ、ディー・エヌ（Ｂｒｅｗｓ、Ｄ。

Ｎ、）ら、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２６２、第２５９０頁〜第２５９６頁（１９８７））。

ごの濃度依存性効果は、平衡状態で観察されるものと同一または類似の一過性会合中間体の存在に起因する（ブレムズ、ディー・エヌ（Ｂｒｅｍｓ、　Ｄ、Ｎ、）ら、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６２、第２５９０頁〜第２５９６頁（１９８７））。折畳みの間の会合中間体の存在は、この中間体が天然状態への経路上に直接位置しないので速度を遅くする。Ｎ←・Ｉ反応によって、２９０ｎ＋＋＋でのＵＶ吸光度変化が観察される。２９０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出される再折畳みは、Ｉ　ａ　ＬＩ＋　＠　Ｏｅ　＋の解離によって速度制限されるであろう。低蛋白濃度（＜　０　、３１９／　ｚ（１，１４μＭ）で、Ｇｌｎ−１２１ｂｓｔは、野生型ｂｓｔと同一速度（各々、時定数７２秒および７５秒）で再度折り畳まれるが、Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳｔおよびＬｅｕ−１１２ｂｓｔの再折畳みは非常に遅い（各々、時定数１１３および１３０分）。高蛋白濃度では、多少の会合中間体が野生型およびＧｌｎ−１２１ｂＳｔで存在し、再折畳みは遅い。

低蛋白濃度（＜　０　、３１９／　ｗＱ、１４μＭ）では、野生型ＧＩｎ−１２１ｂｓｔおよびＧｌｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６ｂＳｔは、同程度の速度で再度折り畳まれるが、高蛋白濃度（＞０．５ｕ／ｘｃ、２３μＭ）では、Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔおよびＧｌｙ４２５＋Ａｒｇ−１２６は、野生型よりも再折畳みは速い。

ｒｂＳｔのへリノクスの疎水性面は、Ｌｅｕ−１２１をＧｌｎに代えることによって減少し、Ｌｙｓ−１１２およびＬｅｕ−１２１を、各々、ＬｅｕおよびＧｌｎに代えることによってシフトする。Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔは会合中間体の安定性を減少させ、Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳｔは増加させる。会合中間体の安定性のこの変化の結果、再折畳み間に生じる沈殿が減少し、Ｇｌｎ−１２１ｂＳｔの再折畳み速度が増大する一方、Ｌｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂＳｔは逆効果を有する。他方、Ａｒｇ４２５およびＧｌｕ−１２６を、各々、グリシノおよびアルギニンに代えることによって野生型ｂｓｔの１０６および１２７残基の間で見い出されるヘリ、クスのＣ−末端部分の不安定化が起こるようである。これにより、この両親媒性ヘワックスの疎水性相互作用に関与する疎水性アミノ酸残基が少ないので、後者の蛋白の溶解性が間接的に増加する。これらの結果は、溶解性および安定性が大のｂｓｔアナログが得られることを示す。

実施例５　ＧＩｎ−１２１ｂＳｔおよびＬｅｕ−１１２＋Ｇ１ｎ−１２１ｂｓｔの活性様々な位置アナログの活性を証明した。測定したパラメーターは、天然ｒｂＳｔ、　Ｇｌｎ−１２１ｒｂＳｔおよびＬｅｕ−１１２ｒｂｓｔを筋肉内注射した乳牛の３．５％脂肪補正乳収１：（Ｆ　ＣＭ）の差を評価するためのものであった。ホルスタイン牛（４５）を、ｒｂｓＬ注射の開始の３および２日前の乳収量に基づき、高札収量から低乳収量までランク付けした。乳収量に基づき、複数連にてウシをランダムに割り当てた：注射なしく対照）、毎日５麗９および１５１９のＬｅｕ−１１２、毎日５Ｒ９および１５Ｒ９のＧｌｎ−１２１、ならびに毎日５１１ｇおよび１５ｍ９（臨床学的ｒｂＳｔ）。ウシには、毎日−回、７日間、半鍵様筋に筋肉内注射した。注射開始前３日間、注射中７日間、および最終注射後５日間、毎日２回乳重量を記録した。ｒｂＳｔの濃度は１０μｇ／ｚ（１であると予想された。

比色法で測定した残存する注射後ｒｂＳｔ溶液の濃度は、平均して、臨床的ｒｂＳｔで１０．０、Ｇｌｎ−１２１ｒｂｓｔで１２３およびＬ　ｅｕ−１１２ｒｂＳｔで１１．８であった。

実験グループ間のＦＣＭの統計的解析は、共変量として注射開始前３日を使用し、注射１〜７日間の平均口ＦＣＭに基づくものであった。

統計学的に有意な効果が、ｒｂＳｔフオーム（Ｐ＝　、０００４＞およびドース（Ｐ＝　、０３）に関して検出され；ｒｂｓｔフオームとｒｂＳｔドースとの相互関係の統計学的に有意な効果はなかった（Ｐ−，７３）。Ｇｌｎ−１２１ｒｂＳｔを摂取したウシに関する平均口ＦＣＭ（２８，０Ｋｇ）は、臨床学的ｒｂＳｔを摂取しているウシよりも僅かに増加しく２６．８Ｋｇ５Ｐ＝　、０８）、Ｌｅｕ−１１２ｒｂＳｔを摂取しているウシのそれ（２５，５Ｋｇ、Ｐ＝　、０００７）または注射なしの対照ウシのそれ（２４，６、ｐ＝　、０００２）よりも有意に大であった。

臨床学的ｒｂＳｔを摂取しているつ／と比較して、Ｇｌｎ−１２１ｒｂＳｔを摂取しているウシのＦＣＭの明らかな増加の一部は、臨床学的ｒｂＳｔに対しＧｌｎ−１２１ｒｂＳｔの投与量が多いことによるものであった。臨床学的ｒｂＳｔを摂取するウシの平均口Ｆ　ＣＭ（２６，８Ｋｇ）はＬｅｕ−１１２ｒｂＳｔを摂取しているウシのそれ（２５，５Ｋｇ５Ｐ−。

０６３）および非注射対照体のそれ（２４，６Ｋｇ、Ｐ−，０１）よりも大のようだった。Ｌｅｕ−１１２ｒｂｓｔを摂取しているウシの平均口Ｆ　ＣＭ（２５，５Ｋｇ）は、対照ウシのそれ（２４，６Ｋｇ５Ｐ＝　、２５、Ｐ＝　、５５）と有意に差はない。注射後に基線に戻るＦＣＭを表す線の傾きは異ならず、実験群のウシ間のＦＣＭ衰弱速度の検出可能な差を示さない。Ｌｅｕ−１１２ｒｂＳｔの生物学的活性減少の結果は、う／ト成長アッセイおよび前記乳牛バイオアッセイの前記結果と一致する。ウシは、毎日の注射に対して耐性があり、御し難くならなかった。これらのウシにおいて、ｒｂＳｔまたはｒｂＳｔアナログを投与した結果としての副作用は検出されなかった。ｒｂＳｔ注射したウシが属するロットのウシは、ｒｂｓｔ注射なしで予想されるより実施例６　他のアナログ適当に修飾したこれまでの実施例の教示に従い、適当なアミノ酸残基で置き換えることにより、ブタ、ヒト、ヒツジ、ウマ、ラット、サルおよびトリのソマトトロピンに対する同様のアナログも生産し得る（ニスーｘス・アブデルーメグイノド（Ｓ　、　Ｓ　、　Ａ　ｂｄｅｌ　−Ｍｅｇｕｉｄ）ら、プロシーディンゲス・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｐＳＡ）、８４、第６４３４〜３７頁（１９８７））。

乳牛へのｂｓｔアナログの投与は、動物循環系に所要の用量を送達するのに効果的な経路を使用する公知の方法に従う。投与形態としては、経口、筋肉内注射、皮下注射、および限時放出性移植（ｔｉａ＋ｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｍｐｌａｎｔｓ）の使用が挙げられる。好ましい投与形態は、限時放出性移植を使用する皮下注射による。適当な注射用賦形剤としては、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸アンモニウム溶液のような生理学的に適合する緩衝液が挙げられる。限時放出性移植は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第４．３３３，９１９号。

効果的な投与量範囲は、１日当たり動物１匹につき１．０〜２００ミリグラムである。与えるｂｓｔの量が多いほど、得られる成長、乳汁分泌、または哺乳動物実質細胞数の増加も大きい。最も好ましくは、投与量範囲は、１日当たり５〜５０ミリグラムである。

哺乳動物成長ホルモンは、そのアミノ酸配列が非常に類似しており、ある動物源由来のホルモンは、非類縁動物種（例えばラット）の成長を増強できる場合がある。動物の成長速度を増大させるために、本発明のアナログは、天然ｂｓｔがウシ、ヒツジ、ラット、サーモンおよびニワトリのような成長関連バイオ活性を有することが示されている同動物種の成長を増大させるために使用され得る。好ましい動物は、雄ウシ（ｂｕｌｌｓ）、雌ウシ（ｈｅｉｆｅｒｓ）または雄子ウシ（ｓｔｅｅｒｓ）のような食肉用に用いられるウシである。

肉牛は、充分な成熟度および大きさに達する直前に層殺する。本発明のｂｓｔアナログは、離乳から層殺まで間のいずれかの時期に投与することによって、肉牛の成長速度を増大させるのに使用することかできる。ｂｓｔは、所望の屠殺時期に応じ、最低３０日問および最高４５０日間、肉牛に投与する。子ウシの肉（ｖｅａｌ）用に使用する動物は典型的には約６月齢で層殺し、成長速度の所望の増大を達成するために層殺の齢まで１０〜３０ｏ／日のｂｓｔアナログを投与する。

ウシ、特に乳牛で乳汁分泌を増加させるために、ｂｓｔを産後３０〜９０日間投与し、３００日までの間継続する。ｂｓｔアナログは、ヤギおよびヒツジのような他の商業釣札生産動物における乳汁分泌も増加させるであろう。

チャートｌ　ウメソマトトロピンのアミノ酸配列ａｉｍ　ｐｈａ　ｐｒｏ　ａｌａ　＋！ｌｅｅ　ｓａｒ　Ｌａｕ　ｓｅｒ　ｇａｙ　ｌａｕ　ｐｈａ　ａｈａ　ａｓｎ　ａｈａ　ｖａＬｇｌｎ　ａｇｎ　セｈｒ　ｇｉｎ　ｖａＬ　ａｈａ　ｐｈａ　ａｙｓ　ｐｈ＠　ｓｉｒ　ｇｌｕ　セｈｒ　１ｌ−ａ　ｐｒｏ　ａｌａｐｒｏ　ｅｈｒ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　＊ｓｎｇｌｕ　ａｌａ　ｇｉｎ　ｇｕｎ　ＬＹＩＩ　ｓａｔ　ＪＬＩＩＰ　Ｌａｕ　ｇｌｕ　１ａｕｓｉｒ　ａｓｐ　ａｒｇ　ｖａｌ　ａｙ　ｇＬｕ　ｌｙｅ　ｔａｕ　Ｌｙｓ　ａｍｐ　ｌｓｕ　ｇＬｕ　ｇｌｕ　ｇｌｙ　１１ｎＬｎｕ　ａｈａ　ｔａｕ　ｔａｕセ　ａｒｇ　ｇｌｕ　ｔａｕ　ｇＬｕ　ｙｐ　ｇａｙ　ｃｈｒ　ｐｒｏ　ａｒｇ　ａｈａ　ｇｌｙａｒｇ　ｌｙｇ　ａｓｐ　１＊ｕ　ｈｉｊ　Ｌｙｓ　ｔｈｒ　ｇＬｕ　ｅｈｒ　ｅｙｒ　１ａｕ　ａｒｇ　ｖａＬ　ｍｅ　ｌｙｓ国際調査報告 −ｍ＊ｍ１ｌｎｅｊｌ＾ＩＩ＠Ｉ□ｃＮＩ劃ＩＩＣ−ＰＣＴｌυ５９０１０３５５０国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）チャート１に例示した天然ソマトトロピンの９６〜１３３残基に対応するアミノ酸残基において変化を有し、該変化がソマトトロピンの疎水性またはヘリックス安定性を減少させることを特徴とする動物ソマトトロピン。
（２）【配列があります】からなる群から選択される請求項１記載の動物ソマトトロピン。
（３）Ｇｌｎ−１２１である請求項２記載の哺乳動物ソマトトロピン。
（４）Ｇ１ｙ−１２５＋Ａｒｇ−１２６である請求項２記載の哺乳動物ソマトトロピン。
（５）ウシ、ブタ、サカナ、ヒツジ、ウマ、ラット、サル、およびヒトソマトトロピンからなる群から選択される請求項１記載の動物ソマトトロピン。
（６）ウシソマトトロピンである請求項１記載の動物ソマトトロピン。
（７）ウシソマトトロピンである請求項２記載の動物ソマトトロピン。
（８）ブタソマトトロピンである請求項１記載の動物ソマトトロピン。
（９）ウシソマトトロピンである請求項３記載の動物ソマトトロピン。
（１０）ウシソマトトロピンである請求項４記載の動物ソマトトロピン。
（１１）請求項１記載のソマトトロピンの有効量を動物に投与することを特徴とする動物の成長増強方法。
（１２）動物がウシである請求項１１記載の方法。
（１３）請求項２記載のソマトトロピンの有効量を動物に投与することを特徴とする動物の成長増強方法。
（１４）動物がウシである請求項１３記載の方法。
（１５）請求項３記載のソマトトロピンの有効量を動物に投与することを特徴とする動物の成長増強方法。
（１６）動物がウシである請求項１５記載の方法。
（１７）請求項１記載の動物ソマトトロピンの有効量をウシに投与することを特徴とするウシの乳生産増加方法。
（１８）請求項２記載の動物ソマトトロピンの有効量をウシに投与することを特徴とするウシの乳生産増加方法。
（１９）請求項３記載の動物ソマトトロピンの有効量をウシに投与することを特徴とするウシの乳生産増加方法。
（２０）請求項４記載の動物ソマトトロピンの有効量をウシに投与することを特徴とするウシの乳生産増加方法。