JPH025877A - フェノールオキシダーゼ遺伝子（２） - Google Patents
フェノールオキシダーゼ遺伝子（２）Info
- Publication number
- JPH025877A JPH025877A JP63149103A JP14910388A JPH025877A JP H025877 A JPH025877 A JP H025877A JP 63149103 A JP63149103 A JP 63149103A JP 14910388 A JP14910388 A JP 14910388A JP H025877 A JPH025877 A JP H025877A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phenol oxidase
- gene
- dna
- phenol
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業の利用分野〕
本発明は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）に関す
るものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダーゼ
産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラタ
ケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ ＩＦＯ４９
１７） ）のメツセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡと
略す）由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）に
関する。
るものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダーゼ
産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラタ
ケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ ＩＦＯ４９
１７） ）のメツセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡと
略す）由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）に
関する。
本フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）はイントロン
を含んでおらず種々の生物に組換えることにより、バイ
オロジカルパルピングやバイオブリーチングや工場廃水
の脱色や木材糖化の前処理や臨床試験用試薬として利用
することができるフェノールオキシダーゼを生産するこ
とができる。
を含んでおらず種々の生物に組換えることにより、バイ
オロジカルパルピングやバイオブリーチングや工場廃水
の脱色や木材糖化の前処理や臨床試験用試薬として利用
することができるフェノールオキシダーゼを生産するこ
とができる。
フェノールオキシダーゼは分子状酸素の存在下でフェノ
ール類を酸化し、０−キノンあるいはｐ−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一部の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。
ール類を酸化し、０−キノンあるいはｐ−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一部の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。
白色腐朽菌は木材等のリグノセルロース物質中のリグニ
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させバルブを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試みがなされている （特開昭５０−４６９
０３号）。しかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだ
けでな（、パルプの原料となるセルロースやヘミセルロ
ースをも分解する能力を有しており、バルブ収率の低下
という問題点を持っている。また、白色腐朽菌のリグニ
ン分解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかか
るという問題点もあった。
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させバルブを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試みがなされている （特開昭５０−４６９
０３号）。しかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだ
けでな（、パルプの原料となるセルロースやヘミセルロ
ースをも分解する能力を有しており、バルブ収率の低下
という問題点を持っている。また、白色腐朽菌のリグニ
ン分解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかか
るという問題点もあった。
白色腐朽菌のリグニン分解力は、白色腐朽菌が生産分泌
するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考え
られており、その遺伝子をクローニングする試みも行な
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類似の活性を持っている
ラフカーゼについては、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）のラッカーゼ遺伝子の
クローニング（Ｕ、Ｓ。
するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考え
られており、その遺伝子をクローニングする試みも行な
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類似の活性を持っている
ラフカーゼについては、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）のラッカーゼ遺伝子の
クローニング（Ｕ、Ｓ。
Ｇｅｒｍａｎｎ、に、Ｌｅｒｃｈ；（１９８８） Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６３＋ ８８５５９６）が報
告されているが、そのアミノ酸配列は本発明のフェノー
ルオキシダーゼのアミノ酸配列とは、異なるものであり
、ノイロスポラ・クラッサのラッカーゼによるリグニン
分解についても、まだ報告されていない。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６３＋ ８８５５９６）が報
告されているが、そのアミノ酸配列は本発明のフェノー
ルオキシダーゼのアミノ酸配列とは、異なるものであり
、ノイロスポラ・クラッサのラッカーゼによるリグニン
分解についても、まだ報告されていない。
本発明は、前述の従来の問題点を解消し、フェノールオ
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。
自然界におけるリグニンの生分解は、数種の酵素が関与
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。
したがって、リグニン分解能力だけを効率的に発現する
新規生物としてフェノールオキシダーゼ生産能力を付与
した生物が考えられ、本発明は、フェノールオキシダー
ゼ生産能力を付与する為に必要な白色腐朽菌のｍＲＮＡ
由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）を提供す
るものである。
新規生物としてフェノールオキシダーゼ生産能力を付与
した生物が考えられ、本発明は、フェノールオキシダー
ゼ生産能力を付与する為に必要な白色腐朽菌のｍＲＮＡ
由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）を提供す
るものである。
本発明は、次式、
ＶａｌＡｓｎＡｓｐＧｌｎ
ＰｈｅＳｅｒｌ １ ｅＡｓｐＧ ｌ ｙＨｉ ５Ａｓ
ｐＬ、ｅｕＴｈｒｌ Ｉ ｅｌ Ｉ ｅＧｌ ｕ Ｖａ
１Ａｓｐｓｅｒ〔式中Ｘは、ＡｌａまたはＰｒｏ ） のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるフェノール
オキシダーゼ遺伝子（Ｉｆ）に関する。
ｐＬ、ｅｕＴｈｒｌ Ｉ ｅｌ Ｉ ｅＧｌ ｕ Ｖａ
１Ａｓｐｓｅｒ〔式中Ｘは、ＡｌａまたはＰｒｏ ） のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるフェノール
オキシダーゼ遺伝子（Ｉｆ）に関する。
なお、上式におけるＸがＡｌａのものをフェノールオキ
シダーゼ遺伝子（ＩＩ） （ＯＪ−ＰＯＭ ５）とし、
ＸがＰｒｏのものをフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ
Ｉ）（ＯＪ−ＰＯＭ ２）とする。
シダーゼ遺伝子（ＩＩ） （ＯＪ−ＰＯＭ ５）とし、
ＸがＰｒｏのものをフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ
Ｉ）（ＯＪ−ＰＯＭ ２）とする。
さらに本発明は、上記ＤＮＡにハイブリッドするＤＮＡ
配列であって、天然、合成、もしくは半合成によって得
られるものであり、請求項１記載のＤＮＡ配列に対して
、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
オチド配列の逆位その他の変異によって関連づけられて
おり、かつ、フェノールオキシダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡからなるフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（ＩＩ）に関する。
配列であって、天然、合成、もしくは半合成によって得
られるものであり、請求項１記載のＤＮＡ配列に対して
、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
オチド配列の逆位その他の変異によって関連づけられて
おり、かつ、フェノールオキシダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡからなるフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（ＩＩ）に関する。
さらに、本発明は上記フェノールオキシダーゼ遺伝子（
ＩＩ）をベクターＤＮＡに連結した組換えＤＮＡに関す
る。
ＩＩ）をベクターＤＮＡに連結した組換えＤＮＡに関す
る。
さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝（ｎ）
が次式
％式％
［
ＴＣＧＧＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＧＣＣＡＡ
ＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡまたは、 次式（ＯＪ ０Ｍ ＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧ ＧＣＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＴＣＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡ
ＡＴＧにＣＧＡＣにＡ６６Ａｌ；６ＴＣＧＧＴＡＡＣＴ
ＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＴＴ
ＣＧＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧ のＤＮＡ配列を有するものであるフェノールオキシダー
ゼ遺伝子（Ｉｆ）に関する。
ＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡまたは、 次式（ＯＪ ０Ｍ ＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧ ＧＣＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＴＣＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡ
ＡＴＧにＣＧＡＣにＡ６６Ａｌ；６ＴＣＧＧＴＡＡＣＴ
ＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＴＴ
ＣＧＧＣＡＡＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧ のＤＮＡ配列を有するものであるフェノールオキシダー
ゼ遺伝子（Ｉｆ）に関する。
次に本発明の詳細な説明する。
（ＤＮＡプローブの合成〉
白色腐朽菌のｍＲＮＡの中にフェノールオキシダーゼ遺
伝子（ＩＩ）由来のｍＲＮＡが含まれることを確認する
為とｃＤＮＡライブラリーからフェノールオキシダーゼ
遺伝子をクローニングする為に必要となるＤＮＡプロー
ブは、フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をも
とに合成する。
伝子（ＩＩ）由来のｍＲＮＡが含まれることを確認する
為とｃＤＮＡライブラリーからフェノールオキシダーゼ
遺伝子をクローニングする為に必要となるＤＮＡプロー
ブは、フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をも
とに合成する。
フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列は、特開昭
６１−２８５９８９号、特開昭６２−２２０１８９号及
び特開昭６２−２２０１９０号の方法で生産、精製した
フェノールオキシダーゼのＮ末端からのアミノ酸配列と
精製したフェノールオキシダーゼをＢｒＣＮ分Ｍ［Ｃｏ
１ｅ、Ｒ，Ｄ、： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、
１１，３１５−３１７ （１９６７）］またはトリプ
シン分解（Ｌｉｎ、Ｌ、−Ｎ、＆ Ｂｒａｎｄｔｓ。
６１−２８５９８９号、特開昭６２−２２０１８９号及
び特開昭６２−２２０１９０号の方法で生産、精製した
フェノールオキシダーゼのＮ末端からのアミノ酸配列と
精製したフェノールオキシダーゼをＢｒＣＮ分Ｍ［Ｃｏ
１ｅ、Ｒ，Ｄ、： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、
１１，３１５−３１７ （１９６７）］またはトリプ
シン分解（Ｌｉｎ、Ｌ、−Ｎ、＆ Ｂｒａｎｄｔｓ。
Ｊ、Ｆ、： Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２．５５３
（１９８３）） Ｌ／、分離したポリペプチドのＮ末端
からのアミノ酸配列をエドマン分解法（Ｈｄｍａｎ、Ｐ
、＆ １ｌｅｎｓｃｈｅｎ、Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−５ｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ、 ２
’ｎｄ ｄｅ、、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
、Ｂｅｒｌｉｎ、 ｐｐ ２３２〜２７９（１９７５）
参照〕によって決定する。
（１９８３）） Ｌ／、分離したポリペプチドのＮ末端
からのアミノ酸配列をエドマン分解法（Ｈｄｍａｎ、Ｐ
、＆ １ｌｅｎｓｃｈｅｎ、Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−５ｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ、 ２
’ｎｄ ｄｅ、、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
、Ｂｅｒｌｉｎ、 ｐｐ ２３２〜２７９（１９７５）
参照〕によって決定する。
ＤＮＡプローブの合成は、フォスフオシエステル法、フ
ォスフオトリエステル法、フォスファイト法およびその
改良法のアミダイト法のいずれかの方法でも行なうこと
ができる。
ォスフオトリエステル法、フォスファイト法およびその
改良法のアミダイト法のいずれかの方法でも行なうこと
ができる。
（ｍＲＮＡの調製〉
本発明に用いることができる生物は、フェノールオキシ
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９
１７）、カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタ
ケ（ＩＦＯ８７１４） ）が良い。
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９
１７）、カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタ
ケ（ＩＦＯ８７１４） ）が良い。
白色腐朽菌を生育繁殖させる培地の組成は、白色腐朽菌
がフェノールオキシダーゼを生産する培地であればどの
ような培地でも良い。
がフェノールオキシダーゼを生産する培地であればどの
ような培地でも良い。
主炭素源としては、グルコースを使用するが白色腐朽菌
が資化可能な他の炭素源を使用してもよく、主窒素源と
しては酵母エキス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽
菌が資化可能なアンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素
化合物、尿素、カゼインなどの有機窒素含有物も使用す
ることができる。その他、カルシウム塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩
などの無機塩やコーンステイープリカー、ビタミン類、
アミノ酸類、核酸類などの栄養物質、生長促進物質を添
加することも可能である。
が資化可能な他の炭素源を使用してもよく、主窒素源と
しては酵母エキス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽
菌が資化可能なアンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素
化合物、尿素、カゼインなどの有機窒素含有物も使用す
ることができる。その他、カルシウム塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩
などの無機塩やコーンステイープリカー、ビタミン類、
アミノ酸類、核酸類などの栄養物質、生長促進物質を添
加することも可能である。
前期の培地に白色腐朽菌を接種し、培養する。
培養液中のフェノールオキシダーゼ活性が最大になった
時、集菌し、液体窒素中で凍結する。
時、集菌し、液体窒素中で凍結する。
白色腐朽菌から、フェノールオキシダーゼ等の蛋白質に
対応する全ｍＲＮＡの抽出は、常法によって行なえばよ
い。たとえば、白色腐朽菌体を２〜５容のＮＰ−４０，
ＳＯ５，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤と
フェノール溶液を混合してホモジナイザーや凍結融解な
どの物理的方法を用いて細胞を破砕。
対応する全ｍＲＮＡの抽出は、常法によって行なえばよ
い。たとえば、白色腐朽菌体を２〜５容のＮＰ−４０，
ＳＯ５，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤と
フェノール溶液を混合してホモジナイザーや凍結融解な
どの物理的方法を用いて細胞を破砕。
可溶化し、遠心した後の上清に冷エタノールを加えてＲ
ＮＡを沈澱させる方法がある。また、グアニジンチオシ
アネート溶液中で組織を破砕し、エタノール沈澱後に、
塩酸グアニジンで沈澱の溶解をくり返して全ｍＲＮＡを
抽出するＧＴＣ法等もある。また、Ｂｒｏｄａ等の方法
（Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｍｅ−ｔｈｏｄｓ、 ４
．（１９８５） １５５−１６２ ）や市販のＲＮＡ抽
出キット〔アマジャム・ジャパン■社製ＲＰＮ、１２６
４ ）を用いて、全ｍＲＮＡを抽出することもできる。
ＮＡを沈澱させる方法がある。また、グアニジンチオシ
アネート溶液中で組織を破砕し、エタノール沈澱後に、
塩酸グアニジンで沈澱の溶解をくり返して全ｍＲＮＡを
抽出するＧＴＣ法等もある。また、Ｂｒｏｄａ等の方法
（Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｍｅ−ｔｈｏｄｓ、 ４
．（１９８５） １５５−１６２ ）や市販のＲＮＡ抽
出キット〔アマジャム・ジャパン■社製ＲＰＮ、１２６
４ ）を用いて、全ｍＲＮＡを抽出することもできる。
また、必要に応じてフェノールオキシダーゼに対応する
抗体を用いてフェノールオキシダーゼ合成途上のポリゾ
ームを沈澱させ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで
抽出する方法も行なうことができる。
抗体を用いてフェノールオキシダーゼ合成途上のポリゾ
ームを沈澱させ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで
抽出する方法も行なうことができる。
本発明のポリ （Ａ） ｍ ＲＮ Ａの精製については
、オリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セルロースな
どの吸着カラムによる精製法、シｇ糖密度勾配遠心法に
よる分画等によって行なうことが出来る。
、オリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セルロースな
どの吸着カラムによる精製法、シｇ糖密度勾配遠心法に
よる分画等によって行なうことが出来る。
上記の如くして得られた全ｍＲＮＡの中に、目的とする
フェノールオキシダーゼに対応するｍＲＮＡの存在を確
認するためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させ、そ
の抗体等を用いてそのタンパク質を同定する等の方法を
行なえばよい。たとえば、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳
するのによく用いられる系であるＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙ
ｔｅ−１ｙｚａｔｅ（ｍ状赤血球ライゼート）、 Ｗｈ
ｅａｔ ｇｅｒｍ（コムギ胚芽）などの無細胞系でタン
パク質に翻訳させ、フェノールオキシダーゼに対応する
ｍＲＮＡが活性を有することを確認することが可能であ
る。
フェノールオキシダーゼに対応するｍＲＮＡの存在を確
認するためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させ、そ
の抗体等を用いてそのタンパク質を同定する等の方法を
行なえばよい。たとえば、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳
するのによく用いられる系であるＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙ
ｔｅ−１ｙｚａｔｅ（ｍ状赤血球ライゼート）、 Ｗｈ
ｅａｔ ｇｅｒｍ（コムギ胚芽）などの無細胞系でタン
パク質に翻訳させ、フェノールオキシダーゼに対応する
ｍＲＮＡが活性を有することを確認することが可能であ
る。
また、フェノールオキシダーゼのＤＮＡプローブを用い
たドツト・ハイブリダイゼーションまたは、ノーザン・
プロット・ハイブリダイゼーションを行なうことによっ
ても確認することが可能である。
たドツト・ハイブリダイゼーションまたは、ノーザン・
プロット・ハイブリダイゼーションを行なうことによっ
ても確認することが可能である。
上述のようにして得られたｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒ
。
。
でｃＤＮＡを合成し、適当なベクターなどに組み込み、
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）をクローニングす
るためのｃＤＮＡライブラリーを構築するのに使用する
ことができる。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）をクローニングす
るためのｃＤＮＡライブラリーを構築するのに使用する
ことができる。
（ｃＤＮＡの合成〉
ｃＤＮＡの合成法としては、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍ
ａｎの方法、ランド法、岡山・Ｂｅｒｇ法やこれらの変
法などがある。たとえば、試験管内で次のような方法で
行なうことができる。上記のｍＲＮＡを鋳型とし、オリ
ゴ（ｄＴ）をプライマーとして、ｄＮＴＰ（＝ｄＡＴＰ
、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰ）の存在下で逆
転写酵素〔全酒造■社製２６１０Δ〕によりｍＲＮＡと
相補的な単鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、ＲＮａｓｅ
Ｈ（全酒造■社製２１５０＾〕でｍＲＮＡに切れ目を入
れ、ｍＲＮＡをプライマーとし、ｄＮＴＰの存在下でＤ
ＮＡポリメラーゼＩ〔全酒造■社製２１４ＯＡ）を用い
て二重鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成法はｃＤＮＡ合
成キットとして、アマジャム・ジャパン■（ＲＰＮ、
１２５６Ｙ） 、ベーリンガー・マンハイム山之内■（
１０１３８８２） 、よ・り市販されており、使用する
ことができる。
ａｎの方法、ランド法、岡山・Ｂｅｒｇ法やこれらの変
法などがある。たとえば、試験管内で次のような方法で
行なうことができる。上記のｍＲＮＡを鋳型とし、オリ
ゴ（ｄＴ）をプライマーとして、ｄＮＴＰ（＝ｄＡＴＰ
、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰ）の存在下で逆
転写酵素〔全酒造■社製２６１０Δ〕によりｍＲＮＡと
相補的な単鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、ＲＮａｓｅ
Ｈ（全酒造■社製２１５０＾〕でｍＲＮＡに切れ目を入
れ、ｍＲＮＡをプライマーとし、ｄＮＴＰの存在下でＤ
ＮＡポリメラーゼＩ〔全酒造■社製２１４ＯＡ）を用い
て二重鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成法はｃＤＮＡ合
成キットとして、アマジャム・ジャパン■（ＲＰＮ、
１２５６Ｙ） 、ベーリンガー・マンハイム山之内■（
１０１３８８２） 、よ・り市販されており、使用する
ことができる。
（ｃＤＮＡライブラリーの構築〉
上記二本鎖ｃＤＮＡは、両末端に合成リンカ−を連結す
るかまたは、ターミナルトランスフェラーゼ〔全酒造■
社製２２３０Ａ ）で適切な尾部（例えば、ポリＣ）を
付加し、プラスミドベクターやλフアージベクターに結
合させ、ｃＤＮＡライブラリーを構築することができる
。
るかまたは、ターミナルトランスフェラーゼ〔全酒造■
社製２２３０Ａ ）で適切な尾部（例えば、ポリＣ）を
付加し、プラスミドベクターやλフアージベクターに結
合させ、ｃＤＮＡライブラリーを構築することができる
。
例えば、二本鎖ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ Ｌｉｎｋｅｒを
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼで連結し、次いで制
限酵素ＥｃｏＲＩ （全酒造■社製１０４０Ｓ：ｌで
切断し、ＥｃｏＲＩ粘着末端を持った二本鎖ｃＤＮＡと
し、ファージベクターλｇｔｌｌのＥｃｏＲ１部位に組
込み、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング〔アマジャム・
ジャパン■社製Ｎ、３３４Ｙ、プロメガ・バイオチック
社製Ｐ３１５１ ）を行なうことによりｃＤＮＡライブ
ラリーを構築する。
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼで連結し、次いで制
限酵素ＥｃｏＲＩ （全酒造■社製１０４０Ｓ：ｌで
切断し、ＥｃｏＲＩ粘着末端を持った二本鎖ｃＤＮＡと
し、ファージベクターλｇｔｌｌのＥｃｏＲ１部位に組
込み、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング〔アマジャム・
ジャパン■社製Ｎ、３３４Ｙ、プロメガ・バイオチック
社製Ｐ３１５１ ）を行なうことによりｃＤＮＡライブ
ラリーを構築する。
また、市販されているλｇｔｌｌやλｇｔｌＯのｃＤＮ
Ａライブラリー・キット〔アマジャム・ジャパン■社製
ＲＰＮ、１２８０． ＲＰＮ、１２５７．プロメガ・バ
イオチック社製Ｐ３０１０）も使用することができる。
Ａライブラリー・キット〔アマジャム・ジャパン■社製
ＲＰＮ、１２８０． ＲＰＮ、１２５７．プロメガ・バ
イオチック社製Ｐ３０１０）も使用することができる。
〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）のクローニン
グ〉 ｃＤＮＡライブラリーから放射性同位元素で標識化した
フェノールオキシダーゼのＤＮＡプローブを用いて、プ
ラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイ
ゼーションによりフェノールオキシダーゼのｍＲＮＡ由
来ｃ由来Ａをクローニングする。
グ〉 ｃＤＮＡライブラリーから放射性同位元素で標識化した
フェノールオキシダーゼのＤＮＡプローブを用いて、プ
ラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイ
ゼーションによりフェノールオキシダーゼのｍＲＮＡ由
来ｃ由来Ａをクローニングする。
〈サブクローニング〉
得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）のサブ
クローニングは以下のように行なう。フェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（Ｉｆ）を含むＤＮＡ及びベクターＤＮＡ
を制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ
断片を調製する。次いで両者の混合物を７４ＤＮＡリガ
ーゼ〔全酒造■社製２０１１Ａ）で処理する。用いられ
るベクターＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃｌＢ
、ｐＵｃ１９、ｐＵｃ１１８（全酒造■社製３０５０．
３２１８．３２１９．３３１８）等があげられる。また
制限酵素としては旧ｎｄＩＩ［、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ 、Ｂａｍ１ｌ Ｉ等〔全酒造■社製１０６０Ｓ、
１０４０Ｓ。
クローニングは以下のように行なう。フェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（Ｉｆ）を含むＤＮＡ及びベクターＤＮＡ
を制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ
断片を調製する。次いで両者の混合物を７４ＤＮＡリガ
ーゼ〔全酒造■社製２０１１Ａ）で処理する。用いられ
るベクターＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃｌＢ
、ｐＵｃ１９、ｐＵｃ１１８（全酒造■社製３０５０．
３２１８．３２１９．３３１８）等があげられる。また
制限酵素としては旧ｎｄＩＩ［、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ 、Ｂａｍ１ｌ Ｉ等〔全酒造■社製１０６０Ｓ、
１０４０Ｓ。
１０７３５、 ｌ０ＩＯＳ）があげられる。
くフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）の塩基配列の
決定〉 クローニングしたｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐＵ
ｃ１１８またはｐＵｃ１１９、またはｐＵｃｌＢ、 ｐ
Ｕｃ１９またはＭ１３ファージにサブクローニングする
。
決定〉 クローニングしたｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐＵ
ｃ１１８またはｐＵｃ１１９、またはｐＵｃｌＢ、 ｐ
Ｕｃ１９またはＭ１３ファージにサブクローニングする
。
サブクローニングしたＤＮＡ断片は、原理的にＨｅｎ１
ｋｏｆｆの方法およびＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎの
方法〔■ｅｎｉｋｏｆｆ、Ｓ、（１９８４）Ｇｅｎｅ、
２８，３５１〜３５９ Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ＋Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ
、Ｊ、（１９８５）Ｇｅｎｅ。
ｋｏｆｆの方法およびＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎの
方法〔■ｅｎｉｋｏｆｆ、Ｓ、（１９８４）Ｇｅｎｅ、
２８，３５１〜３５９ Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ＋Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ
、Ｊ、（１９８５）Ｇｅｎｅ。
３３．１０３〜１１９ ）でデリーションミュータント
を作成するが市販のデリーシゴン・キット〔全酒造■社
製６０３０ ）も使用できる。
を作成するが市販のデリーシゴン・キット〔全酒造■社
製６０３０ ）も使用できる。
デリーションミュータントは、ジデオキシ法（Ｓａｎｇ
ｅｒ、Ｐ、（１９８１） ５ｃｉｅｎｃｅ、２１４．１
２０５〜１２１０）により塩基配列を決定する。市販の
シーフェンシング・キット〔全酒造■社製６０１０Ａ、
６０１５Ａ、ニラポン・ジーン■社製３１７−０１１
２１ ）も使用できる。
ｅｒ、Ｐ、（１９８１） ５ｃｉｅｎｃｅ、２１４．１
２０５〜１２１０）により塩基配列を決定する。市販の
シーフェンシング・キット〔全酒造■社製６０１０Ａ、
６０１５Ａ、ニラポン・ジーン■社製３１７−０１１
２１ ）も使用できる。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）を含むアラゲカワ
ラタケのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡはプラスミドｐＵｃ１
９または、ｐＵｃ１１８のマルチクローニング部位内の
ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした形態で大腸菌Ｊ
Ｍ１０９またはＭＶ１１８４に常法〔例えば、Ｌｅｄｅ
ｒｂｅｒｇ、Ｅ、Ｍ、＆ Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ、 １旦
、 １０７２〜１０７４（１９７４））により形質転換
し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。
ラタケのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡはプラスミドｐＵｃ１
９または、ｐＵｃ１１８のマルチクローニング部位内の
ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした形態で大腸菌Ｊ
Ｍ１０９またはＭＶ１１８４に常法〔例えば、Ｌｅｄｅ
ｒｂｅｒｇ、Ｅ、Ｍ、＆ Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ、 １旦
、 １０７２〜１０７４（１９７４））により形質転換
し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。
この形質転換大腸菌ＯＪ−ＰＯＭ−５，ＯＪ−ＰＯＭ−
２は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、それぞ
れその寄託番号は、微工研菌寄第１００５５号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１００５５）及び微工研菌寄第１００６１号（
ＦＥＲＭ Ｐ−１００６１）である。
２は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、それぞ
れその寄託番号は、微工研菌寄第１００５５号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１００５５）及び微工研菌寄第１００６１号（
ＦＥＲＭ Ｐ−１００６１）である。
〈組換えＤＮＡ）
このようにして得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子
（ＩＩ）の利用法は、微生物（特に原核生物）、植物お
よび動物のベクターＤＮＡ等に組込み、微生物、植物お
よび動物に導入し、フェノールオキシダーゼまたは、こ
の改良タンパク賞を著量生産する新規な生物を作成する
ことを可能ならしめることにある。フェノールオキシダ
ーゼ遺伝子（ｎ）をベクターに組込む方法はベクターを
適当な制限酵素で切断し、必要により適当なリンカ−ま
たはアニーリング可能な組み合せの塩基を複数個重合せ
しめる。このように加工した二重鎖Ｄ Ｎ Ａとベクタ
ーＤＮＡを混合し、リガーゼを用いて接続せしめる。
（ＩＩ）の利用法は、微生物（特に原核生物）、植物お
よび動物のベクターＤＮＡ等に組込み、微生物、植物お
よび動物に導入し、フェノールオキシダーゼまたは、こ
の改良タンパク賞を著量生産する新規な生物を作成する
ことを可能ならしめることにある。フェノールオキシダ
ーゼ遺伝子（ｎ）をベクターに組込む方法はベクターを
適当な制限酵素で切断し、必要により適当なリンカ−ま
たはアニーリング可能な組み合せの塩基を複数個重合せ
しめる。このように加工した二重鎖Ｄ Ｎ Ａとベクタ
ーＤＮＡを混合し、リガーゼを用いて接続せしめる。
得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主微生物に導入す
る。宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ等のエシェ
リヒア属の微生物、バチルス・ズブチリス等のバチルス
属の微生物、サツカロミセス・セレビシェ等のサツカロ
ミセス属の微生物などが好適である。これらの微生物に
使用されるベクターを以下に例示する。（蛋白質核酸酵
素、２８巻、４号（１９８１）参照）。
る。宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ等のエシェ
リヒア属の微生物、バチルス・ズブチリス等のバチルス
属の微生物、サツカロミセス・セレビシェ等のサツカロ
ミセス属の微生物などが好適である。これらの微生物に
使用されるベクターを以下に例示する。（蛋白質核酸酵
素、２８巻、４号（１９８１）参照）。
ＥＫ系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓｃｌｏｌ、 ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６． ｐＲ
Ｋ２４８． ｐＤＦ４１等、ＥＫ系プラスミドベクター
（リラックスト型）のＣａ１Ｅ１゜ｐＶＨ５１，ｐＡｃ
１０５． Ｒ５Ｆ２１２４． ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９．
ＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３
２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９゜
ｐＫＹ２７００． ｐＫＮ８０． ｐＫＣ？、 ｐＫＢ
１５８． ｐＭＸ２００４． ｐＡｃＹｃｌ。
ｓｃｌｏｌ、 ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６． ｐＲ
Ｋ２４８． ｐＤＦ４１等、ＥＫ系プラスミドベクター
（リラックスト型）のＣａ１Ｅ１゜ｐＶＨ５１，ｐＡｃ
１０５． Ｒ５Ｆ２１２４． ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９．
ＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３
２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９゜
ｐＫＹ２７００． ｐＫＮ８０． ｐＫＣ？、 ｐＫＢ
１５８． ｐＭＸ２００４． ｐＡｃＹｃｌ。
ｐＡｃＹｃ１８４． λｄｕ１等、λｇｔ系７フージ
ベクターノλｇｔ・λＣ，λｇｔ・λＢ、λＷＥＳ ・
λＢ、λＺＪｖｉｒ・λＢ、λＡＬＯ・λＢ、λ−ＢＳ
−Ｔｓ６２２．λＤａｍ、λｇｔｌ１等、シャロンベク
ターのシャロン４Ａ、シャロン３Ａ、 シャロン１６Ａ
、シャロン、１３Ａ、シャロン１４Ａ、シャロン１５Ａ
、シャロン８、シャロン１０．シャロン１７．シャロン
２０等、チオライス（Ｔｉｏｌａｉｓ）グループベクタ
ーのＬ５１２．λＺＥＱＳ。
ベクターノλｇｔ・λＣ，λｇｔ・λＢ、λＷＥＳ ・
λＢ、λＺＪｖｉｒ・λＢ、λＡＬＯ・λＢ、λ−ＢＳ
−Ｔｓ６２２．λＤａｍ、λｇｔｌ１等、シャロンベク
ターのシャロン４Ａ、シャロン３Ａ、 シャロン１６Ａ
、シャロン、１３Ａ、シャロン１４Ａ、シャロン１５Ａ
、シャロン８、シャロン１０．シャロン１７．シャロン
２０等、チオライス（Ｔｉｏｌａｉｓ）グループベクタ
ーのＬ５１２．λＺＥＱＳ。
λＺＹＶ５φ、λＺＵＶ φ２．λＺＵＶ φ３． λ
ＹＥＱＳ φ１． Ｊ ＹＥＱＳ φ。
ＹＥＱＳ φ１． Ｊ ＹＥＱＳ φ。
λＹＥＱＳφ３．λＢａａ＋、λＳ５１等、枯草菌のプ
ラスミドベクターｐＴＡ１０１５． ｐＬｓ１５． ｐ
ＴＡ１０２０． ｐＬＳ２８． ｐＬｓ１３゜ｐＴＡ１
０５０． ｐＴＡ１０６０． ｐＴＴｉ０３０． ｐＴ
Ａ１０３１等、スタフィロコッカス由来のプラスミドベ
クターｐＴ１２７． ｐｃ１９４、 ｐｃ２２１． ｐ
Ｃ２２３，ｐＵＢ１１２． ｐＵＢｌｌｏ、 ｐｓＡＯ
５０１，ｐｓＡ０５０１、 ｐｓＡ２１００． ｐＥ１
９４． ｐＴＰ４． ｐＴＰ５等、酵母ベクタｐＪＤＢ
２１９． ＹＥｐ１３． ＹＲｐ７． Ｙｌｐｌ、 ｐ
ＹＣ，ｐＴＣ２゜微生物のベクター、例えばｐＢＲ３２
２などのＰｓｔＩあるいはＥｃｏＲＩ ５ｉｔｅなど目
的に応じた個所に大腸菌由来のプロモーター領域、例え
ばｌａｃ、 ｔｒｐおよびｔａｃなどにｉｎ−ｆｒａｍ
ｅに接続し組み込み、適当な宿主に形質転換してそのフ
ェノールオキシダーゼを宿主中で発現させることができ
る。
ラスミドベクターｐＴＡ１０１５． ｐＬｓ１５． ｐ
ＴＡ１０２０． ｐＬＳ２８． ｐＬｓ１３゜ｐＴＡ１
０５０． ｐＴＡ１０６０． ｐＴＴｉ０３０． ｐＴ
Ａ１０３１等、スタフィロコッカス由来のプラスミドベ
クターｐＴ１２７． ｐｃ１９４、 ｐｃ２２１． ｐ
Ｃ２２３，ｐＵＢ１１２． ｐＵＢｌｌｏ、 ｐｓＡＯ
５０１，ｐｓＡ０５０１、 ｐｓＡ２１００． ｐＥ１
９４． ｐＴＰ４． ｐＴＰ５等、酵母ベクタｐＪＤＢ
２１９． ＹＥｐ１３． ＹＲｐ７． Ｙｌｐｌ、 ｐ
ＹＣ，ｐＴＣ２゜微生物のベクター、例えばｐＢＲ３２
２などのＰｓｔＩあるいはＥｃｏＲＩ ５ｉｔｅなど目
的に応じた個所に大腸菌由来のプロモーター領域、例え
ばｌａｃ、 ｔｒｐおよびｔａｃなどにｉｎ−ｆｒａｍ
ｅに接続し組み込み、適当な宿主に形質転換してそのフ
ェノールオキシダーゼを宿主中で発現させることができ
る。
また、植物においてはＴｉ−プラスミド由来のＴ−ＤＮ
Ａのｔｍｒ領域を含むｐＡＬ１０５０ベクターなどこれ
に類する方法を用いて遺伝子を植物に導入する。
Ａのｔｍｒ領域を含むｐＡＬ１０５０ベクターなどこれ
に類する方法を用いて遺伝子を植物に導入する。
組み変えＤＮＡを挿入する場合、ｔｎ＋ｒのリーダー配
列にｉｎ−ｆｒａｍｅに接続し、終止コドンもｔｍｒの
ものを利用する。
列にｉｎ−ｆｒａｍｅに接続し、終止コドンもｔｍｒの
ものを利用する。
本発明において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢ Ｎ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢ Ｎ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
Ａｌａ Ｌ−アラニン
Ａｒｇ Ｌ−アルギニン
Ａｓｎ Ｌ−アスパラギン
Ａｓｐ Ｌ−アスパラギン酸
Ｃｙｓ Ｌ−システィン
Ｇｉｎ Ｌ−グルタミン
Ｇｌｕ Ｌ−グルタミン酸
ｃｔｙ グリシン
Ｈｉｓ Ｌ−ヒスチジン
１１ｅ Ｌ−イソロイシン
Ｌｅｕ Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ Ｌ−リジン
Ｍｅｔ Ｌ−メチオニン
Ｐｈｅ Ｌ−フェニルアラニン
Ｐｒｏ Ｌ−プロリン
Ｓｅｒ Ｌ−セリン
Ｔｈｒ Ｌ−スレオニン
Ｔｒｐ Ｌ−）リプトファン
Ｔｙｒ Ｉ、−チロシン
Ｖａｌ Ｌ−バリン
また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
下記の略号を用いる。
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
下記の略号を用いる。
Ａ アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す、）Ｇ グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ チミン （デオキシチミ
ジル酸を示す。）〔実施例〕 以下実施例により、白色腐朽菌のｍＲＮＡ由来のフェノ
ールオキシダーゼ遺伝子（１１）のクローニング及び塩
基配列の決定について詳細に説明する。
ン（デオキシシチジル酸を示す、）Ｇ グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ チミン （デオキシチミ
ジル酸を示す。）〔実施例〕 以下実施例により、白色腐朽菌のｍＲＮＡ由来のフェノ
ールオキシダーゼ遺伝子（１１）のクローニング及び塩
基配列の決定について詳細に説明する。
実施例１
（ＤＮＡプローブの合成）
ＤＮＡプローブの合成は、アミダイト法により、ＤＮＡ
合成機（日本ゼオン、ＧｅｎｅｔＡ −ｍ ）を用いて
行なった。
合成機（日本ゼオン、ＧｅｎｅｔＡ −ｍ ）を用いて
行なった。
３種の白色腐朽菌〔アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７
）。
）。
カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタケ（ＩＦ
Ｏ８７１４））から精製したフェノールオキシダーゼの
Ｎ末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法で２５段目
まで分析した結果を次に示す。
Ｏ８７１４））から精製したフェノールオキシダーゼの
Ｎ末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法で２５段目
まで分析した結果を次に示す。
Ｎ末１段目
カワラタケ Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−へ１ａ
−Ｖａｌカイガラタケ へ！ａ−へｒｇ−Ｇｌｎ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−上記配列の１７段目のＰｒｏから２
５段目のＶａｌに対応するように、次のＤＮＡプローブ
を合成した。
−Ｖａｌカイガラタケ へ！ａ−へｒｇ−Ｇｌｎ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−上記配列の１７段目のＰｒｏから２
５段目のＶａｌに対応するように、次のＤＮＡプローブ
を合成した。
但しＩはデオキシイノシン。
２６＋ｗｅｒ−Ｃ（１６＋ｍ１ｘ） ３’−ＣＣＩ−Ｇ
ＡＣ−ＧＧＩ−ＴＴＣ−ＧＣＩ−＾ＧＡ−ＣＡＡ−ＧＣ
Ｉ−ＴＧＧ ＧＴ−５゜ また、３種の白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをＢ
ｒＣＮで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー（
溶出条件、カラム： Ｐｈｅｎｙｌ−５Ｐｉ４ ＲＰ（
東洋ソーダ社製）、 溶出液２０％アセトニトリル１０
．１％ＴＦＡから７５％アセトリトリル１０．１％ＴＦ
Ａへの濃度勾配溶出、室温〕で分離したポリペプチドの
アミノ酸配列をエドマン分解法で分析した結果を次に示
す。
ＡＣ−ＧＧＩ−ＴＴＣ−ＧＣＩ−＾ＧＡ−ＣＡＡ−ＧＣ
Ｉ−ＴＧＧ ＧＴ−５゜ また、３種の白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをＢ
ｒＣＮで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー（
溶出条件、カラム： Ｐｈｅｎｙｌ−５Ｐｉ４ ＲＰ（
東洋ソーダ社製）、 溶出液２０％アセトニトリル１０
．１％ＴＦＡから７５％アセトリトリル１０．１％ＴＦ
Ａへの濃度勾配溶出、室温〕で分離したポリペプチドの
アミノ酸配列をエドマン分解法で分析した結果を次に示
す。
アラゲカフラタケ Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅカワラタケ Ｍｅｔ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅカイガラタケ Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ上記アミノ酸配
列に対応するように次のＤＮＡプローブを合成した。
ｓｎ−Ｐｈｅカワラタケ Ｍｅｔ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅカイガラタケ Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ上記アミノ酸配
列に対応するように次のＤＮＡプローブを合成した。
１５ｍｅｒ−八（１６ｍｉｘ） ３’−ＴＡＣ−ＣＧ
Ａ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−ＡＡＡ−５’ＧＧＧ １５ｎ＋ｅｒ−Ｂ（１６ｍｉｘ） ３’−ＴＡＣ−Ｃ
ＧＣ−八ＡＡ−ＴＴＡ−ＡＡＡ−５’ＧＧＧＧ 以上の結果から白色腐朽菌が生産、分泌するフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するＤＮＡプローブを用いることにより、い
かなる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ
Ｉ）をもクローニングすることができる。したがって以
下の実施例では、アラゲカワラタケのフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（ＩＩ）のクローニング方法について説明
する。
Ａ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−ＡＡＡ−５’ＧＧＧ １５ｎ＋ｅｒ−Ｂ（１６ｍｉｘ） ３’−ＴＡＣ−Ｃ
ＧＣ−八ＡＡ−ＴＴＡ−ＡＡＡ−５’ＧＧＧＧ 以上の結果から白色腐朽菌が生産、分泌するフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するＤＮＡプローブを用いることにより、い
かなる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ
Ｉ）をもクローニングすることができる。したがって以
下の実施例では、アラゲカワラタケのフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（ＩＩ）のクローニング方法について説明
する。
実施例２
（ｍＲＮＡの調製）
アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７）を１ｆｆｉのＹＰ
Ｄ培地（酵母エキスＬｏｇ／ ｌ 、ポリペプトン２０
ｇ／ ｌ 、グルコース２０ｇ／ ｌ ）が入った５１
容三角フラスコに植菌し、２７℃、６日間振盪培養した
。培養液中にフェノールオキシダーゼを生産１分泌して
いることを確認した後、集菌し、液体窒素中で凍結した
結果、約２０ｇの凍結菌体を得た。
Ｄ培地（酵母エキスＬｏｇ／ ｌ 、ポリペプトン２０
ｇ／ ｌ 、グルコース２０ｇ／ ｌ ）が入った５１
容三角フラスコに植菌し、２７℃、６日間振盪培養した
。培養液中にフェノールオキシダーゼを生産１分泌して
いることを確認した後、集菌し、液体窒素中で凍結した
結果、約２０ｇの凍結菌体を得た。
Ｂｒｏｄａ等の方法により、凍結菌体５ｇから１１■の
全ｍＲＮＡを抽出した。凍結菌体５ｇを液体窒素を加え
た１００ｒｄのワーリングプレンダーで破砕し、３倍量
のＴＮＳ緩衝液〔１χｔｒｉ−１ｓｏ−Ｐｒｏｐｙｌｎ
ａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ５ｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ
、 ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
全ｍＲＮＡを抽出した。凍結菌体５ｇを液体窒素を加え
た１００ｒｄのワーリングプレンダーで破砕し、３倍量
のＴＮＳ緩衝液〔１χｔｒｉ−１ｓｏ−Ｐｒｏｐｙｌｎ
ａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ５ｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ
、 ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
２５ｍＭ ＥＧＴＡ （ｐＨ７，８）、２５０ｍＭ Ｎ
ａＣ１）に溶かす。遠心分離によりベレットを除き、上
清１−につき、０．５ｇのフェノールを加え、５〜１５
℃に保ち溶解する。全てのフェノールが溶けたらＡ量の
クロロホルムを加え、遠心分離後、上清を回収し、クロ
ロホルムで２回抽出した後、エタノール沈澱により全ｍ
ＲＮＡ１１ｍｇを回収した。
ａＣ１）に溶かす。遠心分離によりベレットを除き、上
清１−につき、０．５ｇのフェノールを加え、５〜１５
℃に保ち溶解する。全てのフェノールが溶けたらＡ量の
クロロホルムを加え、遠心分離後、上清を回収し、クロ
ロホルムで２回抽出した後、エタノール沈澱により全ｍ
ＲＮＡ１１ｍｇを回収した。
また、市販のＲＮＡ抽出キット〔アマジャム・ジャパン
■社製〕を用いた場合は、３ｇの凍結菌体から６．７■
の全ｍＲＮＡを抽出することができた。
■社製〕を用いた場合は、３ｇの凍結菌体から６．７■
の全ｍＲＮＡを抽出することができた。
上述の２方法で回収した全ｍＲＮＡは、フェノールオキ
シダーゼのＤＮＡプローブによるノーザン・プロット・
ハイブリダイゼーション法（Ｔｈｏ−ｍａｓ、Ｐ、Ｓ、
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ
７７、 ５２０１ （１９８０）〕により、フェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（■）由来のｍＲＮＡを含むこと
を確認した。
シダーゼのＤＮＡプローブによるノーザン・プロット・
ハイブリダイゼーション法（Ｔｈｏ−ｍａｓ、Ｐ、Ｓ、
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ
７７、 ５２０１ （１９８０）〕により、フェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（■）由来のｍＲＮＡを含むこと
を確認した。
全ｍＲＮＡ５■をオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを使
用するＭａｎｉａｔｉｓ等の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ他
ｍ１Ｍ０１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９７〜１９９．１９
８２）を用いてポリ （Ａ） ｍ ＲＮ Ａの分離・精
製を行ない、約１００μｇのポリ （Ａ） ｍ ＲＮ
Ａを精製した。
用するＭａｎｉａｔｉｓ等の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ他
ｍ１Ｍ０１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９７〜１９９．１９
８２）を用いてポリ （Ａ） ｍ ＲＮ Ａの分離・精
製を行ない、約１００μｇのポリ （Ａ） ｍ ＲＮ
Ａを精製した。
実施例３
（ｃＤＮＡの合成〉
白色腐朽菌アラゲカワラタケ由来ポリ （Ａ） ｍ Ｒ
ＮＡよりｃＤＮＡの合成は、ＧｕｂｌｅｒとＩｌｏｆｆ
ｍａｎの方法（Ｕ、Ｇｕｂｉｅｒ ＆ Ｂ、Ｊ、Ｈｏｆ
ｆｔａａｎ ： Ｇｅｎｅ、２５，２６３〜２６９（１
９８３）参照〕に従い、アマジャム・ジャパン製ｃＤＮ
Ａ合成キットを用いておこなった。
ＮＡよりｃＤＮＡの合成は、ＧｕｂｌｅｒとＩｌｏｆｆ
ｍａｎの方法（Ｕ、Ｇｕｂｉｅｒ ＆ Ｂ、Ｊ、Ｈｏｆ
ｆｔａａｎ ： Ｇｅｎｅ、２５，２６３〜２６９（１
９８３）参照〕に従い、アマジャム・ジャパン製ｃＤＮ
Ａ合成キットを用いておこなった。
５μｇのポリ （Ａ） ｍ ＲＮ Ａに５０ユニツトの
ヒト胎児由来ＲＮａｓｅ阻害酵素（ＨＰＲＩ）の存在下
５μｇの０１１ｇｏ（ｄＴ） １２〜１Ｂ（ファルマシ
ア社製２７−７８５８−０１）を加え１００ユニツトの
逆転写酵素を４２°Ｃで１．５時間反応させて約３０％
の収率で１末鎖ｃＤＮＡを合成した。この反応液に４ユ
ニツトの大腸菌リボヌクレアーゼＨと１１５ユニツトの
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを加え１２”Ｃで１時間、
２２’Ｃで１時間反応させた後７０°Ｃで１０分間放置
して酵素を失活させた。その後１０ユニツトの７４ＤＮ
Ａポリメラーゼを加え３７°Ｃで１０分間反応させて、
約９５％の収率で２末鎖ｃＤＮＡを得た。
ヒト胎児由来ＲＮａｓｅ阻害酵素（ＨＰＲＩ）の存在下
５μｇの０１１ｇｏ（ｄＴ） １２〜１Ｂ（ファルマシ
ア社製２７−７８５８−０１）を加え１００ユニツトの
逆転写酵素を４２°Ｃで１．５時間反応させて約３０％
の収率で１末鎖ｃＤＮＡを合成した。この反応液に４ユ
ニツトの大腸菌リボヌクレアーゼＨと１１５ユニツトの
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを加え１２”Ｃで１時間、
２２’Ｃで１時間反応させた後７０°Ｃで１０分間放置
して酵素を失活させた。その後１０ユニツトの７４ＤＮ
Ａポリメラーゼを加え３７°Ｃで１０分間反応させて、
約９５％の収率で２末鎖ｃＤＮＡを得た。
実施例４
（ｃＤＮＡライブラリーの構築〉
市販のλｇｔｌｌクローニングシステム〔アマジャム・
ジャパン■社製〕を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構
築した。
ジャパン■社製〕を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構
築した。
１００ ｕ ｇの２末鎖ｃＤＮＡを２０ニーｙトのＥｃ
ｏＲＩメチラーゼを３７°Ｃで１時間反応させた後、Ｅ
ｃｏＲＩリンカ−を結合させた、これに１６ユニツトの
１ＥｃｏＲＩを加え３７°Ｃで２時間反応させた後、５
ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラムを通し、純化した
。λｇｔｌｌアーム１μｇとの連結反応後、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏパッケージング（Ａ。
ｏＲＩメチラーゼを３７°Ｃで１時間反応させた後、Ｅ
ｃｏＲＩリンカ−を結合させた、これに１６ユニツトの
１ＥｃｏＲＩを加え３７°Ｃで２時間反応させた後、５
ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラムを通し、純化した
。λｇｔｌｌアーム１μｇとの連結反応後、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏパッケージング（Ａ。
Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｍ、Ｇｏｌｄ；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ７２＋５８１ （１９
７５）参照〕を行ない、１０６個の組換え体λファージ
を得て、アラゲカワラタケのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡラ
イブラリーとした。
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ７２＋５８１ （１９
７５）参照〕を行ない、１０６個の組換え体λファージ
を得て、アラゲカワラタケのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡラ
イブラリーとした。
実施例５
くフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ［）のクローニン
グ〉 実施例４で得られたアラゲカワラタケのｍＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ
、プラークを形成させた。
グ〉 実施例４で得られたアラゲカワラタケのｍＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ
、プラークを形成させた。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉｆ）を含むクローン
は、放射性同位元素〔γ−””ＰＩＡＴＰ〔アマジャム
・ジャパン■社製ＰＢ１０１６８ ）とＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ〔宝酒造■社製２０２１Ａ）を用いて標
識化（Ｒｉｃｈａｒｄ ｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，（１９６５）
、 Ｐｒｏｃ。
は、放射性同位元素〔γ−””ＰＩＡＴＰ〔アマジャム
・ジャパン■社製ＰＢ１０１６８ ）とＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ〔宝酒造■社製２０２１Ａ）を用いて標
識化（Ｒｉｃｈａｒｄ ｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，（１９６５）
、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ５４．
１５８〜１６１参照〕した実施例１の合成りＮＡプロー
ブを用いてＢｅｎ ｔｏｎとＤａｖｉｓのプラークハイ
ブリダイゼーション法〔Ｗ。
１５８〜１６１参照〕した実施例１の合成りＮＡプロー
ブを用いてＢｅｎ ｔｏｎとＤａｖｉｓのプラークハイ
ブリダイゼーション法〔Ｗ。
口、Ｂｅｎｔｏｎ ＆ Ｒ，Ｗ、 Ｄａｖｉｓ；
５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６ １８０（１９７７
）参照〕に従って２種のクローンを選別した。
５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６ １８０（１９７７
）参照〕に従って２種のクローンを選別した。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）を含むλｇ ｔｌ
ｌファージからのＤＮＡの精製は、ＴｈｏｍａｓとＤａ
ｖｉｓの方法（Ｍ、Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｒ，Ｗ、Ｄａｖ
ｉｓ ； Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ９１，３１５（１９７４）参照〕に
より行なった。
ｌファージからのＤＮＡの精製は、ＴｈｏｍａｓとＤａ
ｖｉｓの方法（Ｍ、Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｒ，Ｗ、Ｄａｖ
ｉｓ ； Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ９１，３１５（１９７４）参照〕に
より行なった。
実施例６
くフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）の塩基配列の
決定〉 実施例５で得られたフェノールオキシダーゼ遺仕丁（Ｉ
Ｉ）を含む２クロ一ンλｇｔｌｌ Ｄ Ｎ Ａを制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、挿入されていたフェノールオキ
シダーゼ遺伝子を切り出し、プラスミドベクターｐＵｃ
１９とｐＵｃ１１８のＥｃｏＲ１部位にサブクローニン
グした。
決定〉 実施例５で得られたフェノールオキシダーゼ遺仕丁（Ｉ
Ｉ）を含む２クロ一ンλｇｔｌｌ Ｄ Ｎ Ａを制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、挿入されていたフェノールオキ
シダーゼ遺伝子を切り出し、プラスミドベクターｐＵｃ
１９とｐＵｃ１１８のＥｃｏＲ１部位にサブクローニン
グした。
１）ＵＣｌ３にサブクローニングしたクローンをＯＪ−
ＰＯＭ５としｐＵｃ１１８にサブクローニングしたクロ
ーンをＯＪ−ＰＯＭ２とした。
ＰＯＭ５としｐＵｃ１１８にサブクローニングしたクロ
ーンをＯＪ−ＰＯＭ２とした。
サブクローニングしたｃＤＮＡの制限酵素切断地図を常
法により作成し、図１に示す。
法により作成し、図１に示す。
ＯＪ−ＰＯＭ５とＯＪ−ＰＯＭ２の制限酵素地図は同じ
であった。
であった。
サブクローニングしたｃＤＮＡから市販のプリージョン
キット〔宝酒造■社製〕を用いてデリーションミュ７タ
ントを作製し、市販のＭ１３シークエンシングキット〔
宝酒造■社製〕を用いてジデオキシ法によりフェノール
オキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）の塩基配列を決定した。同
時にフェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列も決定し
た。フェノールオキシダーゼの塩基配列と全アミノ酸配
列を第２図（ＯＪ−ＰＯＭ ５）及び第３図（ＯＪ−Ｐ
ＯＭ ２）に示す。
キット〔宝酒造■社製〕を用いてデリーションミュ７タ
ントを作製し、市販のＭ１３シークエンシングキット〔
宝酒造■社製〕を用いてジデオキシ法によりフェノール
オキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）の塩基配列を決定した。同
時にフェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列も決定し
た。フェノールオキシダーゼの塩基配列と全アミノ酸配
列を第２図（ＯＪ−ＰＯＭ ５）及び第３図（ＯＪ−Ｐ
ＯＭ ２）に示す。
ＯＪ−ＰＯＭ５とＯＪ−ＰＯＭ２は、１７個の塩基が異
なっていたが、アミノ酸は、１つ異なっているだけであ
った。
なっていたが、アミノ酸は、１つ異なっているだけであ
った。
本発明により、次の効果がある。
■ フェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列の提供に
よりリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役
割が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる
。
よりリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役
割が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる
。
■ フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡは
、他の生物に様々な方法（例えば、プラスミド、コスミ
ド、ファージ、ウィルスなどのベクターに連結し、形質
転換や形質導入で組換え体を作成する方法、または、Ｄ
ＮＡ断片を直接エレクトロポレーションなどで導入し組
換え体を作成する方法）で組換えることができ、フェノ
ールオキシダーゼを著量生産する新規な生物を作成する
ことができる。
、他の生物に様々な方法（例えば、プラスミド、コスミ
ド、ファージ、ウィルスなどのベクターに連結し、形質
転換や形質導入で組換え体を作成する方法、または、Ｄ
ＮＡ断片を直接エレクトロポレーションなどで導入し組
換え体を作成する方法）で組換えることができ、フェノ
ールオキシダーゼを著量生産する新規な生物を作成する
ことができる。
■ フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡを
組換えた新規生物を用いて著量生産したフェノールオキ
シダーゼはセルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、
バイオロジカルパルピングに利用でき、かつ、パルプ収
量の低下がない。
組換えた新規生物を用いて著量生産したフェノールオキ
シダーゼはセルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、
バイオロジカルパルピングに利用でき、かつ、パルプ収
量の低下がない。
■ フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡを
組換えた新規生物で生産させたフェノールオキシダーゼ
は、純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビリ
ルビン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれた
品質の酵素として利用できる。
組換えた新規生物で生産させたフェノールオキシダーゼ
は、純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビリ
ルビン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれた
品質の酵素として利用できる。
第１図は、アラゲカワラタケのｍＲＮＡ由来のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（ｎ）の制限酵素切断地図を示す
。斜線部分にフェノールオキシダーゼがコードされてい
る。 第２図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）（Ｏ
Ｊ−ＰＯＭ ５）の塩基配列と全アミノ酸配列を示し、
第３図はフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉｆ ’）
（ＯＪ−ＰＯＭ ２）の塩基配列と全アミノ酸配列を示
す。 第 図 （その ＰｒｏＧ１ｎＡ１ａＴｒｐｓｅｒＡｓｐＬｅｕ（；ｙｓ
Ｐｒｏ１１ｅ＋ＴｙｒＡｓｐＡ１ａＬｅｕＡｓｐＶａＩ
ＡｓｎＡｓｐＧ１ｎ第 図 （その １ｅＳｅｒＡｓｎＡ１ａＧ１ｕＶａＩＳｅｒＰｒｏＡｓ
ｐＧ１ｙＰｈｅａＩＴｈｒＰｒｏＧ１ｙＰｒｏＬｅｕＶ
ａＩＡ１ａＧ１ｙＡｓｎＬｙｓｓｐＡｓｎＬｅｕＴｈｒ
ＡｓｎＨｉｓＴｈｒＭｅｔＬｅｕＬｙｓＳｅｒ１ｎＬｙ
ｓＧ１ｙＴｈｒＡｓｎＴｒｐＡ１ａＡｓｐＧ１ｙＰｒｏ
Ａ１ａＴｈｒＡ１ａＡ１ａＡｓｐＬｅｕＡｌａＶａＩ
Ｉ１ｅＡｓｎＶａＩＴｈｒＬｙｓＧ１ｙＬｙｓＡｒｇＴ
ｙｒＡｒｇＰｈｅＡｒｇＬｅｕ第 ３ 図 （その２） ＶａＩＳｅｒＬｅｕＳｅｒＣｙｓＡｓｐＰｒｏＡｓｎＨ
ｉｓＴｈｒＰｈｅＳｅｒｌｌｅＡｓｐＧｌｙＨｉｓＡｓ
ｐＬｅｕＴｈｒｌｌｅＩ １ｅＧ １ ｕＶａ Ｉ Ａ
ｓｐＳｅｒＩ １ ｅＡｓｎｓｅｒＧｌｎＰｒｏＬｅｕ
Ｖａ ＩＶａ Ｉ ＡｓｐＳｅｒＩ １ｅＧ ｉｎ Ｉ
１ｅＰｈｅＡ ｌａＡ １ ａＧ １ ｎＡｒｇＴｙ
ｒＳｅｒＰｈｅＶａ Ｉ ＬｅｕＡｓ ｎＡ １ ａＡ
ｓ ｐＧ １ ｎＡｓ ｐＶａ Ｉ Ｇ １ ｙＡｓ
ｎＴｙｒＴｒｐ Ｉ １ ｅＡｒｇＡｌ ａＡｓｎＰｒ
ｏＡｓｎＰｈｅＧｌｙＡｓｎＶａＩＧｌｙＰｈｅＡｌａ
ＧｌｙＧｌｙｌｌｅＡｓｎＳｅｒＡｌａｌｌｅＬｅｕＡ
ｒｇＴｙｒＡｓ ｐＧ １ ｙＡ １ ａＡｓ ｐＰｒ
ｏＶａ Ｉ Ｇ １ ｕＰｒｏＴｈｒＴｈ ｒＴｈ ｒ
Ｇ １ ｎＴｈｒＴｈｒＰｒｏＴｈｒＬｙｓ ＰｒｏＬ
ｅｕＡｓ ｎＧ １ ｕＶａ Ｉ Ａｓ ｐＬｅｕＨｉ
ｓ ＰｒｏＬｅｕＡ ｌ ａＴｈｒＭｅ ｔＡ １ ａ
Ｖａ Ｉ ＰｒｏＧ １ ｙｓｅｒＰｒｏＶａ Ｉ Ａ
１ ａＧ １ ｙＧｌｙＶａＩＡｓｐＴｈｒＡｌａｌ
ｌｅＡｓｎＭｅｔＡｌａＰｈｅＡｓｎＰｈｅＡｓｎＧｌ
ｙＴｈｒＡｓｎＰｈｅＰｈｅｌｌｅＡｓｎＧ １ ｙ
Ａ １ ａＳｅｒＰｈｅＶａ Ｉ ＰｒｏＰｒｏＴｈｒ
Ｖａ Ｉ ＰｒｏＶａ Ｉ ＬｅｕＬｅｕＧ １ ｎ
Ｉ １ ｅ Ｉ １ ｅＳｅｒＧ １ ｙＡ １ ａＧ
１ ｎへ５ｎＡ１ａＧ１ｎＡｓｐＬｅｕＬｅｕＰｒｏ
ＳｅｒＧ１ｙＳｅｒＶａＩＴｙｒＳｅｒＬｅｕＰｒｏＳ
ｅｒＡｓｎＡ１ａＡｓｐ１１ｅＧｌｕ工１ ｅｓｅｒＰ
ｈｅＰｒｏＡ １ ａＴｈｒＡ １ ａＡ １ ａＰｒ
ｏＰｒｏＧ １ ｙＡ １ ａＰｒｏＨｉ ｓ Ｐｒｏ
ＰｈｅＨｉ ｓ ＬｅｕＨｉ ｓ第 図 （その３
ルオキシダーゼ遺伝子（ｎ）の制限酵素切断地図を示す
。斜線部分にフェノールオキシダーゼがコードされてい
る。 第２図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）（Ｏ
Ｊ−ＰＯＭ ５）の塩基配列と全アミノ酸配列を示し、
第３図はフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉｆ ’）
（ＯＪ−ＰＯＭ ２）の塩基配列と全アミノ酸配列を示
す。 第 図 （その ＰｒｏＧ１ｎＡ１ａＴｒｐｓｅｒＡｓｐＬｅｕ（；ｙｓ
Ｐｒｏ１１ｅ＋ＴｙｒＡｓｐＡ１ａＬｅｕＡｓｐＶａＩ
ＡｓｎＡｓｐＧ１ｎ第 図 （その １ｅＳｅｒＡｓｎＡ１ａＧ１ｕＶａＩＳｅｒＰｒｏＡｓ
ｐＧ１ｙＰｈｅａＩＴｈｒＰｒｏＧ１ｙＰｒｏＬｅｕＶ
ａＩＡ１ａＧ１ｙＡｓｎＬｙｓｓｐＡｓｎＬｅｕＴｈｒ
ＡｓｎＨｉｓＴｈｒＭｅｔＬｅｕＬｙｓＳｅｒ１ｎＬｙ
ｓＧ１ｙＴｈｒＡｓｎＴｒｐＡ１ａＡｓｐＧ１ｙＰｒｏ
Ａ１ａＴｈｒＡ１ａＡ１ａＡｓｐＬｅｕＡｌａＶａＩ
Ｉ１ｅＡｓｎＶａＩＴｈｒＬｙｓＧ１ｙＬｙｓＡｒｇＴ
ｙｒＡｒｇＰｈｅＡｒｇＬｅｕ第 ３ 図 （その２） ＶａＩＳｅｒＬｅｕＳｅｒＣｙｓＡｓｐＰｒｏＡｓｎＨ
ｉｓＴｈｒＰｈｅＳｅｒｌｌｅＡｓｐＧｌｙＨｉｓＡｓ
ｐＬｅｕＴｈｒｌｌｅＩ １ｅＧ １ ｕＶａ Ｉ Ａ
ｓｐＳｅｒＩ １ ｅＡｓｎｓｅｒＧｌｎＰｒｏＬｅｕ
Ｖａ ＩＶａ Ｉ ＡｓｐＳｅｒＩ １ｅＧ ｉｎ Ｉ
１ｅＰｈｅＡ ｌａＡ １ ａＧ １ ｎＡｒｇＴｙ
ｒＳｅｒＰｈｅＶａ Ｉ ＬｅｕＡｓ ｎＡ １ ａＡ
ｓ ｐＧ １ ｎＡｓ ｐＶａ Ｉ Ｇ １ ｙＡｓ
ｎＴｙｒＴｒｐ Ｉ １ ｅＡｒｇＡｌ ａＡｓｎＰｒ
ｏＡｓｎＰｈｅＧｌｙＡｓｎＶａＩＧｌｙＰｈｅＡｌａ
ＧｌｙＧｌｙｌｌｅＡｓｎＳｅｒＡｌａｌｌｅＬｅｕＡ
ｒｇＴｙｒＡｓ ｐＧ １ ｙＡ １ ａＡｓ ｐＰｒ
ｏＶａ Ｉ Ｇ １ ｕＰｒｏＴｈｒＴｈ ｒＴｈ ｒ
Ｇ １ ｎＴｈｒＴｈｒＰｒｏＴｈｒＬｙｓ ＰｒｏＬ
ｅｕＡｓ ｎＧ １ ｕＶａ Ｉ Ａｓ ｐＬｅｕＨｉ
ｓ ＰｒｏＬｅｕＡ ｌ ａＴｈｒＭｅ ｔＡ １ ａ
Ｖａ Ｉ ＰｒｏＧ １ ｙｓｅｒＰｒｏＶａ Ｉ Ａ
１ ａＧ １ ｙＧｌｙＶａＩＡｓｐＴｈｒＡｌａｌ
ｌｅＡｓｎＭｅｔＡｌａＰｈｅＡｓｎＰｈｅＡｓｎＧｌ
ｙＴｈｒＡｓｎＰｈｅＰｈｅｌｌｅＡｓｎＧ １ ｙ
Ａ １ ａＳｅｒＰｈｅＶａ Ｉ ＰｒｏＰｒｏＴｈｒ
Ｖａ Ｉ ＰｒｏＶａ Ｉ ＬｅｕＬｅｕＧ １ ｎ
Ｉ １ ｅ Ｉ １ ｅＳｅｒＧ １ ｙＡ １ ａＧ
１ ｎへ５ｎＡ１ａＧ１ｎＡｓｐＬｅｕＬｅｕＰｒｏ
ＳｅｒＧ１ｙＳｅｒＶａＩＴｙｒＳｅｒＬｅｕＰｒｏＳ
ｅｒＡｓｎＡ１ａＡｓｐ１１ｅＧｌｕ工１ ｅｓｅｒＰ
ｈｅＰｒｏＡ １ ａＴｈｒＡ １ ａＡ １ ａＰｒ
ｏＰｒｏＧ １ ｙＡ １ ａＰｒｏＨｉ ｓ Ｐｒｏ
ＰｈｅＨｉ ｓ ＬｅｕＨｉ ｓ第 図 （その３
Claims (5)
- （１）次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるフ
ェノールオキシダーゼ遺伝子（III）。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 〔式中Ｘは、ＡｌａまたはＰｒｏ〕 - （２）請求項１記載のＤＮＡにハイブリッドするＤＮＡ
配列であって、天然、合成、もしくは半合成によって得
られるものであり、請求項１記載のＤＮＡ配列に対して
、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
オチド配列の逆位その他の変異によって関連づけられて
おり、かつ、フェノールオキシダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡからなるフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（II）。 - （３）請求項１乃至２のいずれかの項に記載のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（II）をベクターＤＮＡに連結し
た組換えＤＮＡ。 - （４）フェノールオキシダーゼ遺伝子（III）が次式（
ＯＪ−ＰＯＭ５）のＤＮＡを有するものである請求項１
記載のフェノールオキシダーゼ遺伝子（II）。 【遺伝子配列があります】 - （５）フェノールオキシダーゼ遺伝子（II）が次式（Ｏ
Ｊ−ＰＯＭ２）のＤＮＡを有するものである請求項１記
載のフェノールオキシダーゼ遺伝子（II）。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63149103A JPH0685717B2 (ja) | 1988-06-16 | 1988-06-16 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（▲ｉｉ▼） |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63149103A JPH0685717B2 (ja) | 1988-06-16 | 1988-06-16 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（▲ｉｉ▼） |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH025877A true JPH025877A (ja) | 1990-01-10 |
| JPH0685717B2 JPH0685717B2 (ja) | 1994-11-02 |
Family
ID=15467762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63149103A Expired - Fee Related JPH0685717B2 (ja) | 1988-06-16 | 1988-06-16 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（▲ｉｉ▼） |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0685717B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6008029A (en) * | 1995-08-25 | 1999-12-28 | Novo Nordisk Biotech Inc. | Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same |
| US10190364B2 (en) | 2012-03-30 | 2019-01-29 | Tachikawa Corporation | Horizontal blind and method for manufacturing horizontal blind |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61285989A (ja) * | 1985-06-13 | 1986-12-16 | Oji Paper Co Ltd | フエノ−ルオキシダ−ゼおよびその製造方法 |
-
1988
- 1988-06-16 JP JP63149103A patent/JPH0685717B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61285989A (ja) * | 1985-06-13 | 1986-12-16 | Oji Paper Co Ltd | フエノ−ルオキシダ−ゼおよびその製造方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6008029A (en) * | 1995-08-25 | 1999-12-28 | Novo Nordisk Biotech Inc. | Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same |
| US10190364B2 (en) | 2012-03-30 | 2019-01-29 | Tachikawa Corporation | Horizontal blind and method for manufacturing horizontal blind |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0685717B2 (ja) | 1994-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hirayoshi et al. | HSP47: a tissue-specific, transformation-sensitive, collagen-binding heat shock protein of chicken embryo fibroblasts | |
| Tosi et al. | Molecular cloning of human C1 inhibitor: sequence homologies with α1-antitrypsin and other members of the serpins superfamily | |
| JPH07503853A (ja) | トレハロースシンターゼに対する構造遺伝子類の組み合わせにより生物体を形質転換することによる生物体のトレハロース含量増加 | |
| IL180694A (en) | A toxin-removing substance that has the sub-activity of aflatoxin and its genetic coding | |
| Villanueva et al. | Characterization of the wound-induced metallocarboxypeptidase inhibitor from potato: cDNA sequence, induction of gene expression, subcellular immunolocalization and potential roles of the C-terminal propeptide | |
| Borovsky et al. | Molecular Sequencing and Modeling of Neobellieria bullata Trypsin: Evidence for Translational Control by Neobellieria Trypsin‐Modulating Oostatic Factor | |
| KR20030031993A (ko) | 무세포 단백질 합성용 전사주형의 설계와 구축 및 이를이용하는 희석회분식 밀배아 무세포 단백질 합성방법 | |
| Xu et al. | Developmental and hormonal regulation of the Xenopus liver‐type arginase gene | |
| Noma et al. | cDNA cloning and tissue-specific expression of the gene encoding human adenylate kinase isozyme 2 | |
| Hartl et al. | The N terminus of laminin A chain is homologous to the B chains | |
| KR102043356B1 (ko) | 마크로포미나 파세올리나로부터의 리그닌 분해 효소 및 이의 용도 | |
| JPH1017600A (ja) | 血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびその遺伝子 | |
| JPH025877A (ja) | フェノールオキシダーゼ遺伝子（２） | |
| JP6991423B2 (ja) | グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ及びその遺伝子ならびに使用 | |
| JPH04506800A (ja) | ソマトトロピン類似体 | |
| JPH0227986A (ja) | フェノールオキシダーゼ遺伝子（２） | |
| JPH03297388A (ja) | 新規なｔｎｆ変異体、その製造法及びそれを有効成分とする抗腫瘍剤 | |
| US5459063A (en) | Plasmodium falciparum ribonucleotide reductase DNA | |
| Kumar et al. | A dual-specificity isoform of the protein kinase inhibitor PKI produced by alternate gene splicing | |
| JP3356350B2 (ja) | アーモンドｎ−グリコシダーゼ遺伝子 | |
| JP3197355B2 (ja) | アスパラギニルエンドペプチダーゼ遺伝子 | |
| JP2623807B2 (ja) | セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子 | |
| HUT75554A (en) | Endothelin-converting enzyme | |
| KR940011339B1 (ko) | 세린프로테아제억제제의 제조를 위한 dna 재조합 방법 | |
| JPH0568571A (ja) | ヒト由来グリオキサラ−ゼｉをコ−ドするｄｎａ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |