JPH04507045A - 誘導性発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 誘導性発現ベクター 発明の背景 本発明はＢ、ズブチリス及び他のダラム陽性菌に有用な調節可能で複製可能な発 現及び分泌ベクターに関する。

バチルス・ズブチリスにおける異種タンパク質生産用のいくっがの発現及び分泌 ベクターが報告されている。これらはα−アミラーゼ［Ｐａ１ｖａ　ら、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　５５８２−５５８ ６（１９７２）ＨＰｌａｖａら、Ｇｅｎｅ、２２：２２９−２３５　（１９８３ ）、及びＧＢ２０９１２６８Ｂ］及びプロテアーゼ遺伝子ベースのベクター［Ｖ ａｓａｎｔｈａら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６５　：　８３７−８４２ 、（１９８６）；Ｈｏｎｊｏら、Ｊ、　ＢＬｏｔｅｃｈ、　４　：　６３　７１ 　（１９８６）　、及びＮａｇａｒａｊａｎら、米国特許４８０１５３７］を包 含する。これらのベクターの利点はこれらの発現が調節されておらず、異種遺伝 子が始終生産されることである。Ｂ、ズブチリスからのレバンスクラーゼ（１ｅ ｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）遺伝子（ｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕ］　）の基地となるＢ、 ズブチリス分泌ベクターもＧａｎｅｓａ口及びＨｏｃｈ編、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ：　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｆｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙＡｐｐｌｉｃａｔｆｏｎｓ　（＾ｃａｄｅｍｆｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８ ６　）中４７９−４９３でＪｏｙｅｔらによって報告された。Ｅｄｅｌｍａｎら 、ＦＥＭＳ　Ｍｆｃａｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　５２：１１７−１２ ０　（１９８８）は複製可能なかかるベクターを開示している。しかしながら、 多重コピー（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ）プラスミドベクター上のレバンスクラーゼ遺 伝子はＢ、ズブチリス細菌の染色体ｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕ］遺伝子に相同であり 、従って、広範囲に亘る組換えが起こり、プラスミドが不安定になる可能性があ る。従って、安定で調節可能な発現ベクターのためには、異種遺伝子をこれらの 不利益を克服することができるＢ。

ズブチリス及び他のグラム陽性菌中にクローン化する必要がある。

バチルス・ズブチリスレバンスクラーゼ発現系は調節可能な発現系をデザインす る土台としていくつかの利点を有している。該発現系は安価でタンパク質産物か ら容易に精製され、スクロースによって調節可能である。しかしながら、レバン スクラーゼ発現系の遺伝子工学に関する主たる障害はその複雑さである。レバン スクラーゼレギユロンには少なくとも２つの他の遺伝子、ｓａｃ　Ｓ及びｓａｃ 　Ｕ　（これらは該遺伝子の発現の制御に関与する）がある。（Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆｌｌｔｃｒｏｂｉｌｏ ｇｙ）　［１９７６］　中のＬｅｐｅｓａｎｔ　ら、Ｄｅｂａｒｂｏｕｉｌｌｅ ら、ＦＥＭＳｌ［ｆｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、４１．１３７−１４０　［１ ９８７］　）、その構造遺伝子は、よく分っていない方法であって、恐らく、転 写開始配列と翻訳開始配列の間の、遺伝子の調節領域での特定構造の形成に関与 する方法で転写的に調節される。これらの構造はスクロースの存在下でのｓａｃ 　Ｓ及びｓａｃ　Ｕ遺伝子の生産物の間の非常に精密でデリケートな相互作用に よって不安定になり、かくして抗転写終結及び読み過しを起こして構造遺伝子内 に入る（Ｓｈｉｍｏｔｓｕら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６３　：　３８０ −３８８　［１９７６］　）。このようにレバンスクラーゼ発現系を遺伝子的に 工作する試みはいずれもこの複雑なレギユロンとの適合性を考慮する必要性によ って複雑化される。

ｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕ］のスクロース調節の機構はＳｈｉｍｏｔｓｕら、既出に よって研究された。翻訳のプロモーターと開始部位の間の調節領域のＤＮＡ配列 は逆方向反復よりなっていた。従ってそのＲＮＡ構造は長いステムと短いループ 構造を形成する可能性を有している。５ｈｉｉｏｔｓｕらはまたもはやスクロー スによって調節されない（レバンスクラーゼがスクロースと無関係に発現される ）、２つのＢ、ズブチリス変異株のＤＮＡ配列を決定した。２つの場合における 変異は調節領域における１個の塩基変化であることが見い出された（図４参照） 。このようにレバンスクラーゼの調節がＢ、ズブチリス中のこの調節領域の特定 のＤＮＡ配列によって非常に厳重に制御されているというしるしがあった。

バチルスの少なくとも１つの他のスピーシーズ、例えばバチルス・アミロリクエ ファシェンス（Ｂ、　ａｍｙｌｏＨｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）がレバンスクラーゼ を生産することも知られていた０１ａｎｔｓａｌａ、　Ｐ、及び菫、Ｐｕｎｔａ ｂ、　ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、１３．３９５−３９９　［１ ９８２］　’）、しかしながら、それがＢ、アミロリクエファシェンス中で調節 されるのかどうか、またはもしそうだとしても、Ｂ、アミロリクエファシェンス 遺伝子の発現要素がＢ、バチルススクロースレギユロンの他の遺伝子と適合し得 るのかどうかは知られていなかった。

発明の概要 かくして、１つの面において、本発明はグラム陽性宿主微生物、好ましくはＢ、 ズブチリス中の外来タンパク質またはポリペプチドを発現するのに有用な調節可 能で複製可能なベクターであって：Ｂ、アミロリクエファシェンスのレバンスク ラーゼ遺伝子からの発現要素（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｅｌｅｍｅｎｔｓ）　（プ ロモーター及び調節配列）（プロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼの結合を制 御し、調節配列は転写がスクロースが存在するときにのみ起こるようにすること により転写を調節する）、及び該発現要素に機能し得るように結合した、タンパ ク質またはポリペプチドをコード化した配列を有するベクターを提供する。好ま しい面はグラム陽性微生物、好ましくはＢ、ズブチリス中の外来タンパク質また はポリペプチドを発現するのに有用な調節可能で複製可能な発現ベクターであつ ｒ；Ｂ、７ミロリクエフアシエンスのレバンスクラーゼ遺伝子からの発現要素、 例えばＢ、アミロリクエファシェンスからの、シグナルペプチドをコード化した ＤＮＡ配列であって調節配列の下流に位置したＤＮＡ配列、及び該シグナル配列 に隣接し、その下流に位置した制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有する発現ベ クターである。この制限エンドヌクレアーゼ切断部位は外来タンパク質またはポ リペプチドをコード化した異種ＤＮＡ配列がシグナル配列に隣接してそれとの適 当な読取り枠において位置することを常用技術によって容易に可能にする。本発 明の好ましいベクターで形質転換したダラム陽性菌、好ましくはバチルス、好ま しくはＢ、ズブチリスは目的とするタンパク質またはポリペプチドを生産し、分 泌することができる。

別の好ましい面の本発明はＢ、アミロリクエファシェンスからのレバンスクラー ゼ遺伝子（ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａ菖ＰＩ　）からのＤＮＡ断片であって、多重コピ ープラスミド上に維持できる安定で調節可能なベクターの構築を可能にするＤＮ Ａ断片を提供する。Ｂ、ズブチリス中に形質転換するとき、多重コピープラスミ ド上のベクターはスクロースによって調節可能である。　ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ 　Ｐ］遺伝子はｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕ］遺伝子と相同性を有しているとしてもそ の相同性はｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐｌが染色体ｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕ］位置と 再結合するには十分でない。か（して、本発明のベクターは種々の異種ポリペプ チドを、菌体内または菌体外に、安定で調節された仕方で生産するのに用いるこ とができる。

本発明のさらに別の面によると、グラム陽性菌中の異種ポリペプチドを調節可能 に発現する方法であって；酵素レバンスクラーゼをコード化したＢ、アミロリク エファシェンス遺伝子から発現要素を有するＤＮＡ断片を単離し、該ＤＮＡ断片 を修飾して適切に配置された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有せしめ、該 断片を、ダラム陽性菌、特にＢ。

ズブチリス中で存在でき、かつ複製できるプラスミドに加え、それによって、ベ クターであって、それで形質転換したダラム陽性菌が、スクロースの存在下に、 タンパク質であってその遺伝情報がベクター中の該断片に機能し得るように結合 したタンパク質を菌体内に生産するか及び／または培地中に分泌するようにする ベクターを生産することを特徴とする方法が提供される。

本発明の別の面によると、本発明のベクターを、該ベクターの調節要素と適合性 がある調節要素を有さない宿主微生物中に形質転換することによって、構成的（ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）で、調節されないやり方で異種ポリペプチドを発現 する方法が提供される。

図面の簡単な説明 本発明の他の種々の目的、特徴及び付随の利点は添付の図面と共に考えるときよ り良い理解を伴って十分に知覚されるであろう。

図１（上）：ｐＢＥ３０１のプラスミド地図。−はｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐｌ を示し、△△△はＢ、アミロリクエファシェンスＤＮＡを示し、−はＢｌｕｅ　 ５ｃｒｉｐｔベクターＤＮＡを示し、０はｐＢＲ３２２の複製開始点を示す。

図１（下）：Ｂ、アミロリクエファシェンスＤＮＡの制限地図。文字は以下の如 く制限酵素認識部位を示す：　Ｅ＝ＥｃｏＲＩＳＲｖ冨ＥｃｏＲＶ。

Ｂ＝ＢａｍｔＴＩ、　Ｐ＝Ｐｓｔｌ、５＝Ｓａｌｌ、　Ｘ＝Ｘｂａｌｌ、Ｍ＝Ｓ ｍａｌ、Ｈ＝Ｈｉｎｄｍ、Ｋ＝Ｋｐｎ０ 図２＝単離されたｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｌ１ＩＰｌ断片を配列決定するための制限 地図及び配列決定計画。矢印はいくつかのクローンの各々で生じた配列を示す。

図３ａ、３ａ’及び３ａ′　：全部で、単離されたｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐコ 断片のヌクレオチド配列。コドン−２９は翻訳の開始部位である。＋１は成熟レ バンスクラーゼのＮ末端アミノ酸を示す。下線部分は推定調節配列を示す。

図３　ｂ　：　ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐコ配列の図示的表示。

図４＝図３の７０８−７３３のｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕ］　、ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａ ｍ　Ｐｌ、ｓａｃ　Ｒ３６［Ｂｓｕ］　ＤＮＡ配列及びＢ、ズブチリスＤＮＡ配 列３０５−３７０　（Ｓｔｅｆｎｍｅｔｚら、後出（ｉｎｆｒａ）　）の提案さ れた調節領域の配列及び構造をＷｉｓｃｏｎｓｔｎデータベース中のＦｏｌｄプ ログラムを用いて分析し、比較した。

図５　：　ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］シャトルベクターｐＢＥ５０１の構築。

０はｐＢＲ３２２オリ（ａｒｔ）を示し、ムはｐｃ１９４オリを示し、△はｆ１ オリを示す。

図６　：　ｐＢＥ３１１の構築。ｐＢＥ５０４はｐＢＥ５０１から部位特異的突 然変異誘発によって構築した。ｐＢＥ３１１はｐＢＥ５０４から構築した。ｐＢ Ｅ５０１及び５０４のシグナルペプチドコード化配列を示す。ｐＢＥ５０１のシ グナルペプチドコード化領域のＤＮＡ配列は独立に決定したが、ｐＢＥ３０１の それと同じであった。

図７：Ｉ）ＢＥ３１２の構築。

本明細書で用いた定義を以下に示す。

ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］　：　Ｂ、アミロリクエファシェンスからのレバン スクラーゼ遺伝子。

ｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕ］　：　Ｂ、ズブチリスからのレバンスクラーゼ遺伝子。

発現要素（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｌｅＩｌｅｎｔ）　ニブＣｌモーター及び 調節ヌクレオチド配列。

調節配列：翻訳開始部位の上流の配列であって、短い距離能れた、ステム及びル ープ構造を形成し得る逆方向反復配列よりなる配列。

プロモーター配列：翻訳開始部位の上流のヌクレオチド塩基の配列であって、Ｒ ＮＡポリメラーゼの結合する部位である配列。

シグナルペプチド：分泌されたタンパク質に先行するアミノ末端ポリペプチドで あって、切断されて成熟タンパク質には存在せず、該タンパク質を菌体膜の方向 に向かわせ、それを通って移動させる機能を有する該ポリペプチド。

成熟タンパク質：最終タンパク質産物（すなわち、シグナルペプチドを有さない ）。

上流の配列二発現とは逆の方向に向かう配列下流の配列：発現の方向に向かう配 列 スクロース：該ベクターに含まれる調節配列を活性化する、スクロース、チオス クロース、関連三糖類及び炭水化物、及びそれらの類縁体を包含する。

異種ＤＮＡ配列：本発明のベクターを含有する細菌以外のいずれかの微生物（ｏ ｒｇａｎｉｓｍ）からのＤＮＡ配列。

外来タンパク質：本発明のベクターを含有させる細菌によっては正常には生産さ れないタンパク質。

組換え：例えばプラスミド上に位置したＤＮＡ配列が例えば染色体上に位置した 相同配列と交換されるプロセス。

Ｃｍ　：クロラムフエニコール ｋａｎ　：カナマイシン ファゲミド（Ｐｈａｇｅｍｉｄｓ）　：　Ｍ　１３複製開始点を有するプラスミ ド。

「タンパク質」と「ポリペプチド」は交換可能に用いる。

細菌培養菌の増殖及び維持については当業者に周知の標準的な微生物学的方法を 用いることができる。遺伝子工学の適当な方法はＭａｎｉａｔｉｓら、１ｌｏｌ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ニューヨーク：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　［１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、　１９８２）　、及び市販の遺伝子工学キットに添付の指示書に記載され ている。本発明を行うのに必要な細菌培養菌及びプラスミドは市販されており、 以下の記述においてそれらの起源に沿って同定する。

誘導化合物、例えばスクロース及びその類縁体の適当量は当業者によってルーチ ンに決定し得る。

本発明のベクターに適した宿主細菌は一般にグラム陽性であり、特にバチルス属 に属する細菌である。かかる適当な宿主細菌の非制限的例としてＢ、プレビス（ ｂｒｅｖｉｓ）　、　Ｂ、リケニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ）　、及 びストレプトマイセス属のスピーシーズが挙げられる。さらに、調節要素が本発 明のベクターの調節要素と適合性がないような、例えばＥ、コリ等の非グラム陽 性スピーシーズを含む他の細菌も、例えば一時的にさらなるクローニングのため にまたはポリペプチドの発現の調節を望まない場合に適当な宿主となり得る。か かる他の細菌中では、発現の調節はベクターをバチルス等のグラム陽性菌中に形 質転換する場合はど機能し得ない。さらに、本発明のベクターは該ベクター上に 保持された（ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｎ）ポリペプチドを天然に生産する宿主細菌中 に形質転換することができる。好ましくは、該宿主細菌株は該ポリペプチドをコ ード化した染色体遺伝子を除去されているか、該ベクターと染色体遺伝子の間で 組換えが起こらないように、すなわち該ベクターが安定であるように変異処理さ れている。

本発明において好ましい安定なベクターは、例えば、宿主微生物中に多重、例え ば１０以上のコピーで形質転換した場合に１０世代後にそれらのコピーの半分以 上を、特に組換えの結果として、失わないベクターとして定義できる。本発明の ベクターを、一般に、先行技術における同様のベクターと対比して、染色体ＤＮ Ａとの間のかなりの（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）組換えまたは組込みなしに、多 重コピープラスミドとして複製できることは本発明の驚くべき一面である。しか しながら、本発明のベクターを本発明の発現系が染色体に組み込まれる細菌に用 いることも可能である。

適当なベクターは一般に該ベクターが形質転換する微生物と適合性があるベクタ ーである。かくして、例えば、それらは適合性ある調節配列及び複製開始点を有 し、好ましくは多重コピー性であり、また選択し得るマーカー遺伝子、例えば抗 生物質耐性をコード化した遺伝子を有する。

これらはファージ、プラスミド、コスミド及び染色体組込みベクターを包含し得 る。さらに、本発明の発現ベクターは該発現要素及び異種遺伝子配列を常用技術 によって宿主の染色体に組み込むために用いることができる（Ｓａｕｎｄｅｒｓ ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５ヱ、７１８−７２６　［１９８４］）。何 らの制限を意図することなく、発現要素及び他の関連配列を有する断片を受け取 るのに適したプラスミドの例としてＡＴＣＣ３９２９４，３７２７８，３７２７ ７，３７１０５，３７２８０及び３７１０８のプラスミドが挙げられる。本発明 のプラスミドで形質転換した場合、グラム陽性菌、特にＢ、ズブチリスはスクロ ースが存在するときのみレバンスクラーゼを生産する。かくして、例えば、本発 明のベクターは自律的プラスミドとして、エシェリキア・コリ及びＢ、ズブチリ スの両方で存在でき、異種タンパク質の発現はＢ、ズブチリス中でのスクロース の存在または不存在によって調節される。ベクターは外来タンパク質及びポリペ プチドをコード化したＤＮＡ配列の容易な挿入のための唯一の制限エンドヌクレ アーゼ切断部位を持つよう工作することができる。外来タンパク質をコード化し た配列を適切に配置した、かつシグナルペプチドをコード化した適切なりＮＡ配 列を有するベクターで形質転換したＢ、ズブチリスはスクロースの存在下で培地 中に該外来タンパク質を分泌する。適当に挿入した制限エンドヌクレアーゼ部位 は該ベクターの残りに対し、好ましくは、唯１つである部位であり、かつコード 化されたタンパク質または調節またはシグナルペプチド配列の機能に悪影響を与 えないアミノ酸配列をコード化した部位である。さらに制限部位は他の制限部位 を公知の技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ、既出）を用いて他のリンカ−配列の使用によ って作出する（ｃｒｅａｔｅ）のに用いることができる平滑末端部位であること ができる。

適当なシグナルペプチドは発現要素と同じまたは異なる遺伝子に由来することが でき、異種ポリペプチドコード化配列と同じまたは異なる遺伝子に由来すること ができ、または宿主及び排せつされるポリペプチドにもつとも適するように、既 知技術によって、修飾するか合成配列仕立てすることができる。例えば分泌を達 成する困難さは、既知の手法によって、いくぶん疎水性のアミノ酸を配列のコア または端に有するシグナルペプチドを代わりに用いるか、シグナルペプチドをよ り長くまたはより短くするか、または荷電残基を加えるか取り除くことによって 処理できる。好ましいシグナルペプチドは既知の技術（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ７０．３５１−３６１　［１９８８］　）を用いて単離でき、また例えばＢ、ア ミロリクエファシェンスのアミラーゼ、アルカリプロテアーゼまたは中性プロテ アーゼから導かれる。

適当なポリペプチドは宿主微生物と適合性があるポリペプチドである。

それらは、例えば、ウィルス、細菌、真菌、植物、昆虫または哺乳類をはじめと する背椎動物起源のポリペプチドである。それらは、例えば、構造タンパク質、 酵素またはペプチドである。非制限的例示として小麦α−アミラーゼ、Ｈｉ　Ｖ プロテアーゼ、エラスヂ〉及び免疫グロブリンが挙げられる。

周知のごとく、本発明の方法によって生産されるポリペプチドはその配列が由来 する微生物６ごよって生産されるポリペプチドと同じでもよいし、本来のタンパ ク宵より１Ｊ以上のアミノ酸はど長いか短くてもよいし、または別様に変えられ ていてもよい。このことは、例えば、発現要素またはシグナルペプチドコード化 配列とポリペプチドコード化配列の間に結合を置くことであるか、またはポリペ プチドを他の目的のために修飾することである。このような修飾を行う方法は常 用されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら１、既出及びＳｍ１ｔｈ、　Ｍ、、 　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、］　９．４２３−４６２　［１，９８５］ 　）。例えば、本発明の実施例４で構築された分泌ベクターはレバンスクラーゼ のＮ末端をコード化したＤＮＡ配列中に二次的な制限部位をコード化した６塩基 の挿入物をクローン化することによって作成した、得られたレバンスクラーゼは この挿入物によってコード化された。レバンスクラーゼの活性に影響を与えない ２つの付加的アミノ酸、アスパラギン酸及びイソロイシンを含有する。

本発明において、「機能し得るように結合したＪ　（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎ ｋｅｄ）は異種ポリペプチドの合成、発現及び／または分泌がレバンスクラーゼ 発現要素によって調節されることを意味する。かくして異種遺伝子の融合は転写 または翻訳の遺伝子融合であることができる。

本発明において、「実質上相同のＪ　（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｈｏｍｏ ｌｏｇｏｕｓ）は発現要素が第一のバチルス・スピーシーズに由来するか、それ が発現要素自体と等価に機能するように修飾されるか、または等価に機能する合 成的に作り出した配列であることができることを意味する。

本発明において、「単離された」は発現要素がその天然に存在する環境から分離 されたことを意味する。

Ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｎ＋　Ｐ］遺伝子を有する断片を単離するＤＮＡ源は、例え ばバチルス・アミロリクエファシェンスであり得る。これらの細菌はアメリカン タイプカルジャーコレクション、１２３０１バークローンドライブ、ロックヴイ レ、ＭＤ２０８５２から得られる。かかる培養菌の非制限的−例はＡＴＣＣ２３ ８４４である。Ｂ、アミロリクエファシェンスは細菌学者に周知の方法によって 増殖させることができる。ライブラリーをつ（るクローニングに適した、例えば Ｂ、アミロリクエファシェンスからの細菌ＤＮＡは常法により、例えば以下に記 述するようにして得ることができる。常用の手段、例えばλ−ＺＡＰ　ＤＮＡ、 Ｇｉｇａバックプラス（ｐａｃｋ　ｐｌｕｓ）　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、１１ ０９９　Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏｒｒｅｙ　ＰｉｎｅｓＲｏａｄ、　Ｌａ　Ｊｏｌ、１ ａ、　ＣＡ　９２０３７　）等の市販のキット用の製造者の指示書を人手してこ れに従うという手段もかかるライブラリー・を生産するのに用いることができる 。

レノし・スクラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡのクローンを選び取るために、↑３ 以りの（ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　ｌ　３）塩基よりなるオリゴヌクレオチドブロー ブであって、その塩基配列がＢ、ズブチリス中のレバンスフう一ゼをコード化し た塩基配列（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら、）ｌｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ　２０ ０　：　２２Ｏ−２２８ｏｑｓ５）］またはＢ、アミロリク７ゴーファシエニ／ ス中のレバンスクラーゼコー・ド化塩基配列（図３参照）がら選抜されるオリゴ ヌクレオチドブローブを作ることができる。かかるプローブは標準的方法によっ て合成するか、商業的に購入する、：とができる。用い得るプローブの例とし７ て以下の配列を有するプローブが挙げられる・ＧＡＣＧＴＴＴＧＧＧＡＣＡＧＣ ＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣＡＡ＾＾Ｃ及び＾ＴＧ＾＾ＣＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＣ ＴＧＴＴＣＡＣＴＧＡＣ０単離さねた断ハがＥｃｏＲＩ制限工：ノドヌクレアー ゼ部位で始まる５′末端から３′の方向に少なくとも８り３のヌクレオチド対を 含有することが重要である。その理由はそこに含まれるヌクレオチドが発現要素 及びレバンスクラーゼ遺伝子のシグナルペプチドのための配列を構成するからで ある。

目的とする配列を得るためには、発現要素のみならず、シグナルペプチドをコー ド化した配列、成熟ｌノバンスクラーゼ遺伝子及びひよっとしてクローニングベ クターからの２〜３塩基対も含有するより大きな断片を単離するのがよい。これ はライブラリーから特定のプローブ及び標準的な微生物学的選択方法によって同 定し、単離したファージクローンを、製造者の指示に従ってＢ］、ｕｅ　５ｃｒ ｉｐｔプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ。

既出）に変換することによって行うことができる。目的とする発現要素及びシグ ナルペプチド及び成熟レバンスクラーゼをコード化した配列を含有するＤ　Ｎ　 Ａ断片はＢｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔプラスミドから、それをＥｃｏＲＶ及びＸｂａ ｌで消化し、少な（とも２３５０のヌクレオチド対を含有する断片を単離し５、 回収することによって単離することができる。得られる断片はグラム陽性菌中で 多重コピープラスミドとして存在することができるベクター中に挿入することが でき、本発明の１つの面を表す。

本発明の１つの好ましい態様は２３５０塩基対の断片を、その最初の８９３の塩 基対の３′末端（すなわち、２９塩基対のシグナル配列の３′末端）で成熟レバ ンスクラーゼの開始コドンの近くに１以上の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を 挿入することによって、さらに修飾することによって構築したベクターである。

かかる制限エンドヌクレアーゼ部位の１つはＥｃｏＲＶのそれである。それは市 販の突然変異誘発キット、例えばＢｉｏＲａｄ、　１４１４　Ｈａｒｂｎｕｒ　 Ｗａｙ　５ｏｕｔｈ、リッチモンド、ＣＡ９４８９４からのＭｕｔａ−遺伝子フ アゲミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）インビトロ突然変異誘発キットに付帯の指示に従 って部位特異的突然変異誘発によって挿入できる（Ｓｗｉｔｈ　［１９８５］　 、既出）。挿入された制限エンドヌクレアーゼ切断部位（ｓｉｔｅ　ｏｒ　５ｉ ｔｅｓ）は興味ある外来タンパク質をコード化した遺伝情報を挿入し、該遺伝情 報の発現を先行する発現要素の制御下に置く便利な方法を提供する。ついで、バ チルス・スピーシーズ、好ましくはＢ、アミロリクエファシェンスからの発現、 調節及びシグナル配列を有する修飾断片をグラム陽性菌中で多重コピープラスミ ドとして存在できるプラスミドベクター中に挿入することによって好ましい型の ベクターを作る。本発明のベクター（すなわち、シグナル配列及び適当な読取り 枠でそれに結合したポリペプチドコード化ＤＮＡ配列のすぐ下流に制限エンドヌ クレアーゼ切断部位を含むように修飾した、好ましくは２３５０塩基対の断片） で形質転換したダラム陽性菌、特にＢ、ズブチリスは、挿入された制限エンドヌ クレアーゼ部位（ｓｆｔｅ　ｏｒ　５ｉｔｅｓ）によって修飾された断片に機能 し得るように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）結合した遺伝配列（ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｅｑ ｕｅｎｃｅ）によってコード化されたいずれのタンパク質をも、スクロースの存 在下に、そのときだけに、生産し、培地中に分泌する。

Ｂ、アミロリクエファシェンスライブラリーからのｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］ 遺伝子を含有する適当なりローンを選抜する常用の技術、例えば予想されたＢ、 アミロリクエファシェンスの既知のＢ、ズブチリスレバンスクラーゼ遺伝子の配 列との相同性に基いて合成プローブを作って該クローンを選抜する技術を用いる ことができるが、２つのスピーシーズからの遺伝子の間には、宿主菌体の染色体 遺伝子と本発明によって工作され、多重コピープラスミド上にコード化された異 種遺伝子との間に好ましくない（ｄｅｌｅｔｅｒｆｏｕｓ）組換えが起こるのを 防ぐ異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が依然として十分にある。かくして 本発明のベクターの使用によりプラスミドの不安定性がさけられる。

本開示に含まれる情報によると、バチルス・スピーシーズを通して実質上相同で ある、レバンスクラーゼ遺伝子及びその発現要素の領域に対応する１セツトのプ ローブ、例えば２−４個のプローブをデザインできる。遺伝子工学の標準的技術 を用いて、いずれかのバチルス・スピーシーズから構築したライブラリーをルー チンにスクリーニングして本発明の遺伝子に相同な目的とする遺伝子、または同 様に相同な、他の発現要素及びシグナルペプチドＤＮＡ配列をルーチンに見つけ 出すことができる。発現系のソース（ｓｏｕｒｃｅ）として用いられる他の可能 性があるバチルス・スピーシーズとして、Ｂ、バミリス（ｐｕｍｉｌｉｓ）　、 Ｂ、プレビス（ｂｒｅｖｉｓ）　、Ｂ　リケニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ ｍｉｓ）及びＢ、ステアロサーモフィラス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ ｕｓ）が挙げられる。さらに、バチルスにおける遺伝子の高度保存領域を決定す ることによって、関連した漠のレバンスクラーゼ遺伝子を見つけ出すプローブを ルーチンにデザインできる。

かくして、本発明のベクター及び方法を用いて、今や、本発明の安定なベクター で広範囲の細菌宿主を、異種ポリペプチドをそこで発現させるため、形質転換す ることができることがわかる。さらに、宿主スピーシーズがベクター上の発現要 素の調節要素と適合し得る調節要素を含有している場合には、かかる発現を調節 することが可能である。さらに、当業者に公知の技術を用いて、本発明のベクタ ーの調節された発現に必要とされ得る調節要素を、これらの調節要素を欠くスピ ーシーズ中に、付加的に共形質転換する（（：ｇ−ｊｒＢｎｓｆｏｒｍ）ことが 可能である。その結果、望まれる場合には、本発明のベクターをこれらの調節要 素を正常には含まないスピーシーズ中に調節された仕方で発現することができる 。かくして本発明の好ましい面は異種ポリペプチドをバチルス株中に、調節され た仕方で、菌体内にもしくは培養培地中に分泌して生産するための、ベクター、 細菌株及び方法を提供する。本発明の別の好ましい面は異種ポリペプチドを非バ チルス、好ましくは、しかし必須ではなく、グラム陽性菌中に、調節されない仕 方で、菌体中にもしくは培養培地に分泌して生産するための、ベクター、細菌株 及び方法を提供することである。

さらなる骨折りなしに、当業者は上記説明を用いて、本発明をその最高程度まで 利用することができると思われる。従って、以下の好ましい具体的態様は単に例 示的なものとして本開示の残りについて制限的でなく解されるべきである。

上記において及び以下の実施例において、すべての温度はセ氏で補正されないも のとして示され、他に指示がなければ、すべての部及びパーセンテージは重量に よる。

本明細書で引用したすべての出願、特許及び刊行物の本文をここに参考に加入す る。

実施例 Ｂ、アミロリクエファシェンスＤＮＡの単離方法Ｂ、アミロリクエファシェンス （２５Ｊ）をＰｅｎａｓｓａｙ培地（Ｄｔｆｃｏ。

デトロイト、ミシガン）中で５時間増殖させる。細菌を遠心分離によって回収し 、５０ｍ１ｌ）リス−５０ｄＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，０）５ｍＭに再懸濁する 。リソチームを最終濃度８００μｇ／ｍｌになるように加え、得られる混合物を ３７℃で１５分インキュベートする。ドデシル硫酸ナトリウム及びプロテイナー ゼＫ（それぞれ最終濃度０．５％及び５０μｇ／−１）を加え、得られる混合物 を５分間インキュベートする。ついで試料を等量のトリス緩衝液（１００ｍＭ、 　ｐＨ８，０）飽和フェノールと混合する。フェノールの除去後、水層を等量の クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出する。得られる水 層を除去し、ＮａＣ１を最終濃度０．４Ｍになるように加える。２倍容量のエタ ノールを穏やかに加え、ＤＮＡをパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットで渦に 巻いて界面から取り出した。単離したＤＮＡを７０％エタノール溶液ですすぎ、 真空乾燥した。単離したＤＮＡを１０ｍＭ）リスー１ｍＭＥＤＴＡ中で可溶化し 、その濃度を当業者に周知の方法を用いて決定した。

実施例１ ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａ１ｌＩＰ］遺伝子の単離レバンスクラーゼ（ｌｖｓ）をコー ド化した、Ｂ、アミロリクエファシェンスｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］遺伝子を 、適切な配列を含有するクローンを同定する手段としてオリゴヌクレオチドプロ ーブを用いて、Ｂ、アミロリクエファシェンスのλＺＡＰライブラリーから単離 した。Ｂ、アミロリクエファシェンススライブラリ−は市販のＥｃｏＲＩ消化λ ＺＡＰ　ＤＮＡ及びＧｉｇａパックプラス（ｐａｃｋ　ｐｌｕｓ）　（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ、　１１０９　ＮｏｒｔｈＴｏｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｏａｄ、 　ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ　９２０３７）を用い製造者の指示に従って構築した 。

Ａ　オリゴヌクレオチドプローブの合成各々３０塩基の２つのオリゴヌクレオチ ドプローブであって、それらの配列がＢ、ズブチリス（ｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕ］ 　）遺伝子（Ｓｔｅｉｎａ＋ｅｔｚら、既出）についての報告されたヌクレオチ ド配列に基づいている該プローブを合成した。各オリゴヌクレオチドプローブの 配列を以下に示す。

プローブ番号　ヌクレオチド配列 ５２１４２−２ＮＰ　ＧＡＣＧＴＴＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣ＾＾ ＾ＡＣ３２１４２−３ＮＰ　ＡＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＣＴＧＴＴ ＣＡＣＴＧＡＣ各プローブの試料１μｍ　（４００ｎｇ）を、標準的プロトコル （ｐｒｏｔｏｃｏｉ）　（ｉｌａｎｉａｔｉｓら、既出、１２２頁）に記載され たようにして、３２ＰλＡＴＰで５′末端標識した。該２つのプローブ（５２１ ４２−２ＮＰ及び５２１４２−３ＮＰ）の等量をプールしくｐｏｏｌｅｄ）　、 さらなる使用のため混合した。

Ｂ　宿主菌体の感染及びＢ、アミロリクエファシェンスライブラリーのスクリー ニング 用いた方法は本質的にＭａｎｉａｔｉｓら、同上に記述されたのと同じであった 。Ｅ、コリ株ＢＢ４を宿主菌体として用い、Ｂ、アミロリクエファシェンスλＺ ＡＰファージプラーク／プレーｈ　５　ｉｔ　ｌで感染させた。感染菌体を、８ ＮＺＹＭ平板（ｐｌａｔｅｓ）上で、ＮＺＹＭｈツブアガー３．０曽Ｃを用いる ボアプレート法（ｐｏｕｒ　ｐｌａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ）によって１０００−１ ５００の濃度に平板培養した。平板を３７℃で一夜インキユベートした。得られ るプラークからのＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移した。ついでフィル ターをＢ、アミロリクエファシェンスｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］遺伝子の存在 について上述の放射標識オリゴヌクレオチドプローブ（５２１４２−ＮＰ及び５ ２１４２−３ＮＰ）を用いてスクリーニングした。

全部で１１２００のプラークをスクリーニングした。

標識したオリゴヌクレオチドプローブ（５２１４２−２ＮＰ及び５２１４２−Ｎ Ｐ）（６０ｎｇ）を５ｘＳＳＣ１０，５％ＳＤＳ緩衝液中ニトロセルロースフィ ルターに３７℃で１６時間ハイブリッドした。ニトロセルロースフィルターを５ ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ緩衝液で洗浄した。最初の洗浄（ｗａｓｈ）は室温で ２回目は３７℃で行った。引き続いてのフィルターのオートラジオグラフはプロ ーブとハイブリッドした５つのクローンを明らかにした。しかしながら、高いバ ックグラウンド活性があったので、フィルターを３７℃で再洗浄した。得られた フィルターのオートラジオグラフはプローブにハイブリッドしたＤＮＡを含有す る可能性のある２つのクローン（２Ａ及び２Ｃと名づけた）があることを示した １、 Ｃｓａｃ　Ｂ　［ＢａＩＩＩＰＩ断片を含有するファージプラークの単離及び精 製プローブとハイブリッドしたプラークを単離し、そこにあるファージを１ｌａ ｎｉａｔｉｓら、既出によって精製した。感染及びスクリーニング操作を繰り返 した（二次スクリーン）。二次スクリーンではファージクローン２Ａ及び２Ｃか らのプラークのそれぞれ約２０％及び８０％がプローブとハイブリッドした。こ れらの二次スクリーンから陽性プラークを選抜し、ファージを生産し、ついでさ らにスクリーニングした。三次スクリーンからのオートラジオグラフはすべての プラークがオリゴヌクレオチドプローブにハイブリッドすることを示した。クロ ・−ン２Ａ及び２Ｂ共スクリーニングした。

Ｄ　λＤＮＡの単離及びファゲミド（Ｂｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔ）の切除推定上の Ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］遺伝子配列を有するλＺＡＰファージクロー７２Ａ 及び２Ｃを製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示に従ってＢｌｕｅ　５ｃｒｉ ｐｔプラスミドベクターに変換した。得られたλＺＡＰ　２Ａクローン及びλＺ ＡＰ　２ＣクローンからのＢｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔプラスミドをそれぞれｐＢＥ ３００及びｐＢＥ３０１と命名した。

Ｅ　クローン化したＢ、アミロリクエファシェンスＤＮＡ断片の性格づけ Ｓｔｒａｔａｇｅｎの指示に従ってｐＢＥ３００及びｐＢＥ３０１から別々にプ ラスミドＤＮＡを単離した。各プラスミドからのＤＮＡ（５μｉ）を総容量２　 Ｏｔｔ　ｌ中のＥｃｏＲＩで消化した。得られた制限断片を、Ｍａｎｉａｔｉｓ ら、既出、６４頁に記録されたように、１８％ゲルを用いるポリアクリルアミド ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した。ｐＢＥ３００のＥｃｏＲＩ消化物 は３．０及び１．５ｋｂサイズの断片に相当する２つのバンドを生じ、他方ｐＢ Ｅ３０１のＥｃｏＲＩ消化物は、ｐＢＥ３００の場合と同様、３．０及び１．． ５ｋｂザイズのＤＮＡ断片、及びさらに０゜６ｋｂの断片に相当するバンドを生 じた。放射標識したオリゴヌクレオチドプローブ（５２１４２−２ＮＰ及び５２ １４２−３ＮＰ）をＭａｎｉａｔｉｓら、既出に記載されたサザンハイプリダイ ゼーション法に従って該断片にハイブリッドさせた。プローブは１．５ｋｂ断片 とのみハイブリッドした。このことはそれがｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐｌ遺伝子 を含有することを示唆する。制限マツピング（ｍａｐｐｉｎｇ）は０．６ｋｂ断 片が１．５ｋｂ断片に対し５′に配向している（ｗａｓ　ｏｒｉｅｎｔｅｄ　５ ’　ｔｏ　ｔｈｅ　１．５　ｋ　ｂｆｒａｇｍｅｎｔ）ことを実証した。３．Ｏ ｋｂ断片はＢｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔベクター（２，９ｋｂ）の大きさに相当する 。ＤＢＥ３０１の詳細な制限地図を図１に示す。

両ＥＣ０ＲＩ断片の配列決定計画の概要を図２に示す。種々の制限断片をファー ジベクターＭ１３ｍ、ｐ１８及びＭ　１３　ｍ　ｐ　１９　（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ。

Ｉｎｃ、、　８００　Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ＾ｖｅｎｕｅ、　Ｐｉｓｃａｔａｖ ａｙ、　ＮＪ　０８８５４から購入）中にクローン化した。ＤＮＡ配列をＵｎｉ ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ、、Ｐ、０．Ｂｏｘ２ ２４００、クリーブランド、オハイオから購入したＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ配列 決定用キットを用いて得た。２つの鎖（ｓｔｒａｎｄｓ）のいくつかの重なるク ローンを配列決定した。そのデータは０．６’ｋｂ及び１．５ｋｂ断片がそれぞ れ長さ８０１ｂｐ及び１５４９ｂｐであることを明らかにした。か＜１２で、連 続した（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）　２３５０塩基のヌクレオチド配列が生成した （ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）　（図３ａ参照）。配列の分析は４７２のアミノ酸をコ ード化した大きな読取り枠を示した。成熟タンパク質に先行する−３１及び−２ ９に２つの可能な開始コドンがあった。しかしながら、コドン−２９のみがバチ ルスリポソーム結合部位［Ｍｅｈａｕｇｈｌｉｎ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、２５６：１１２８３　１１２９１（１９８１）］によって先行された。このよ うに、レバンスクラーゼについてのシグナルペプチドは恐らく長さ２９のアミノ 酸であり、成熟タンパク質は４４３個のアミノ酸を含む。コード領域から上流に 向かうＤＮＡ配列の分析はＢ、ズブチリスＲＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇ　Ａ）　 ［Ｌｏｓｉｃｋら、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｇｅｎ、２０　：　６２５　６６９　（ １９８６）　］の主形態によって認識されると考えられるプロモーター配列に似 たＤＮＡ配列によって先行された調節配列（ｂｐ７０６−ｂｐ７６４）を明らか にする。コード領域の末端はρ−独立転写ターミネータ−（ｒｈｏ−ｉｎｄｅｐ ｅｎｄｅｎｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｆｏｎａｌ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）に似 た逆方向反復を有する。コノ分析ノ図示的表示を図３ｂに示す。

ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｏ＋　Ｐ］及びｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕｌのヌクレオチド配列 をＷｔｓｃｏｎｓｉｎデータベースＧａｐプログラムを用いて比較した。８２． ６％の相同性が観察された。成熟タンパク質の推定アミノ酸配列は９０％の相同 性を示す。

ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］の推定調節領域におけるステム及びループ構造の自 由エネルギーＢスブチリスｓａｃ　Ｂ遺伝子及び２つの構成的調節変異体につい てのＳｈｉ、ｍｏｔｓｏら（既出）のデータと、調節と自由エネルギーの間に何 らかの相関々係が見い出されるかどうかを見るため、比較した（自由エネルギー が高いほど、調節がよくなる）。自由エネルギー計算はＳａｃ　Ｂ　［ＢａνＰ ］がＢ、ズブチリス中でスクロースによって調節されると予見できるかどうかを 明らかにしなかった。

実施例２ Ｂ、ズブチリス中でのＢ、アミロリクエファシェンスレバンスクラーゼの調節可 能な発現 ｐＢＥ３０１からのｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］のＥｃｏＲＶ　−ＸｂａＩ断片 を図５の概略に従ってプラスミドｐＢＥ２０中にクローン化して新規ベクターｐ ＢＥ５０１を得た。ｐＢＥ２０はＦ１開始点を含有するＥ、コリーＢ、ズブヂリ スシャトルベクターである。ｐＢＥ２０はＥ、コリについての複製開始点、Ｆ１ オリ及び抗生物質耐性マーカーａｒｎｐＲを含有するｐＴＺ１８Ｒ（ファーマシ ア）のＢｉｎｄｌｌＩ消化物と、Ｂ、ズブチリス中の多重コピープラスミドであ ってＢ、ズブチリス中での選抜のためのフロラ１１フエニコール耐性マーカーを 含有するスタフイロコッメス・アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）プラスミドである、 ｐＣ１９４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、オハイオ州立大学 、Ｃｏ１１．ｕｍｂｕｓ、　ＯＨ４３２１０）のｌ１ｆｎｄｌＩ［消化物とを連 結することによって構築した。ＤＢＥ５０１もＥ、コリーＢ、ズブチリスシャト ルベクターであり、ｐＢＥ５０１及びｐＢＥ２０でＢ、ズブチリス株ＢＥＩＯＩ Ｏを形質転換した。各プラスミドで形質転換した細菌の培養物についてレバンス クラーゼレベルを測定した。各形質転換培養菌を５０μ１．ＭｎＣｊ、含有Ｐｅ ｎａｓｓａｙ培地中、２％スクロースノ存在及び不存在下で８時間増殖させた。

菌体を上清から分離味プロテアーゼ阻害剤（フェニルメチルスルホニルフルオラ イド）を加えた（　１．　ｄ最終濃度）。酢酸の添加によ゛って上清の市を４． ２に調節し、ついで等量のエタノールを加え、十分に混合した。４℃で一夜イン ギュベート後、沈殿タンパク質を３９０００ｘｇで３０分の遠心分離によって回 収した。

タンパク質を５９ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）中で可溶化した。

スクロースから放出されるグルコースの量を測定することによってレバンスクラ ーゼ活性をめた。酵素は１％スクロースを含有する５０１！１Ｍリン酸カリウム 緩衝液（ｐＨ６，０）中でこれを３７℃で３０分インキュベートすることによっ てアッセイした。７０℃での加熱によって酵素を不活性化し、グルコース員をシ グマからのＧｌｕｃｏｓｅ　ＴｒｉｎｄｅｒＴＭキット（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ、　Ｐ、０．ボックス１４５０８、セントルイス、１１０６３１７８ 、Ｃａｔ、　Ｎｏ　３１５　１００）を用いて測定した。活性は培養物１−Ｃあ たり３７℃で１時間に放出されたグルコースの量として表す。１単位は培養上清 １−あたり１時間に放出された１μｇのグルコースに相当する。

表１に示すごとく、菌株をスクロースの存在下に増殖させた場合にのみレバンス クラーゼ活性が検出された。ｐＢＥ２０で形質転換した細菌の培養物中に観察さ れた活性はＢ、ズブチリス中に正常に存在する５ａｃＦｌ　［Ｂｓｕｌの発現に よる。

ｐＢＥ２０　（ベクター）　５８．２本　４．７ｐＢＥ５０１（ｓａｅＢ［Ｂａ ｍＰ］）　２８７．０　２．２京これは染色体ｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕｌによる活 性単位を表す。

（染色体ｓａｃ　Ｂ　［Ｂｓｕｌに突然変異を有するＢ、ズブチリス株■　５１ ９４もｐＢＥ２０及びｐＢＥ５０１−で形質転換した。レバンスクラーゼ活性は スクロースの存在下でのみ及びｐＢＥ５０］で形質転換した細菌の培養物におい てのみ検出された。） 実施例３ Ｂ、アミロリクエファシェンスのレバンスクラーゼ遺伝子のクローン化された発 現要素の調節可能な機能性の実証Ｗｉｌｌｉａｉｓ　ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌ、１４６　：　１．１６２−１１６５　（１９８１）　（Ｂａｅｆｌｌｕｓ　 ５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）によって記載された、プロモーターを欠（ｃ　ａ、 　ｔ　８６遺伝子（クロラムフェニコール耐性）を含有するプロモータークロー ニング用ベクターｐＰＬ７０３をｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］プロモーター／調 節領域のスクロースで誘導される性質をさらに評価するために用いた。ｐＢＥ３ ０１の０．８　ｋ　ｂ　ＥｃｏＲＩ断片をｐＰＬ７０３のＥｃｏＲＩ部位でクロ ーン化してｐＢＥ３０５を得た。Ｂ、ズブチリスＢＲ１５１をｐＢＥ３０５で形 質転換し、トリプトース血液寒天ベース平板（ｔｒｙｐｔｏｓｅ　ｂｌｏｏｄ　 ａｇａｒ　ｂａｓｅ　ｐｌａｔｅｓ）　［ＴＢＡＢアガー（Ｄｆｆｃｏ、デトロ イト、ミシガン）　＋Ｋ　ａ　ｎ　（２０μｇ／Ｊ）　］上で培養した（ｐｌａ ｔｅｄ）。

コロニーを選び取り（ｐｔｃｋｅｄ）　、ＴＢＡＢ＋ｃｍ　（１０μｇ／Ｊ）を 含有する寒天平板、及びＴＢＡＢ＋２％スクロース十ｃ　ｍ　（１０ｕｇ／ｍＮ ）を含有する寒天平板に乗せた（ｐａｔｃｈｅｄ）　、クロラムフェニコール耐 性はスクロースを含有する平板についてのみ観察された。ｐＰＬ７０３のみテ形 質転換したＢ、ズブチリスはスクロースの存在にかかわらず検出し得るＣＡＴ活 性を有さなかった。このように、ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐ］プロモーターは多 重コピープラスミド上でスクロースによって調節し、Ｂ、ズブチリスにおける菌 体内タンパク質発現に用いることができる。

実施例４ 制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有する調節可能ｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｗ　Ｐｌ ベース分泌ベクターの構築 Ｂ、ズブチリス中の分泌ベクターは以下の発現要素を提供しなければならない： 転写及び翻訳開始部位及びシグナルペプチドコード領域。異種遺伝子融合物（ｆ ｕｓｉｏｎ）を容易に構築するため、図６に示すごと（、ｓａ、ｃ　Ｂ　［Ｂａ ｍ　Ｐ］中にシグナルペプチドコード領域の３′末端から２コドン下流にＥｃｏ ＲＶ部位を作出した。Ｍｕｔａ遺伝子遺伝デフアゲミドインビトロ突然変異誘発 キットｏＲａｄ、Ｉ　４１４　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｗａｙ　５ｏｕｔｈ、リッチセ ント、（Ａ９４８０４）を用いて部位特異的突然変異を誘発した。ｐＢＥ５０４ 　（ｐＢＥ５０４は、シグナルペプチド中に２つのさらなるサイレント突然変異 を有することを除き、ｐＢＥ５０１と同様である）から一本鎖鋳型を作り、オリ ゴヌクレオチド（ＣＴＴＣＧＣＧＡ、ＡＡＧＡ醇江λｒＣＡＡＴＡＡＣＣＡＡＡ ＡＡＧＣ）を用いて６塩基挿入物によるＥｅｏＲＶ部位を作出した。ＥｃｏＲＶ 部位の存在は制限消化によって決定し、後でＤＮＡ配列決定によって確認した。

得られたプラスミドをｐＢＥ３１１　（図６参照）と名づけた。Ｂ。

ズブチリス株ＢＥＩＯＩＯをｐＢＥ３１１で形質転換し、培養上清中のレバンス クラーゼ活性を測定した。その結果、６つの塩基の挿入によってコード化された ２つのアミノ酸（アスパラギン酸及びイソロイシン）の導入が酵素活性に影響を 与えなかったことが明らかとなった。

実施例５ 外来遺伝子産物の調節可能な分泌 その生産物がその遺伝子の本発明の好ましいベクターへの挿入によって調節可能 に生産できる異種遺伝子の例はブドウ球菌タンパク質の（±）についての例であ った。±遺伝子はファーマシア、８００Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ　Ａｖｅｎｕｅ、 　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ　０８８５４から購入したプラスミドｐＲＩＴ ５から得た。ｐＲＴ１５からのｓｐａ遺伝子はｐＢＥ３１１のＥｃｏＲＶ部位に 融合できる便利な制限部位を含有していない。ｓａｃ　Ｂ［Ｂａｍ　Ｐｌに融合 したときプロティンＡが分泌されるかどうかは演鐸的に（ａ　ｐｒｉｏｒｉ）知 られていなかった。しかしながら、Ｂ、アミロリクエファシエンスアルカリブロ テアーゼシグナルベブチドがプロティンＡを変位させる（　ｔｒａｎｓｌｏｃａ ｔｅ）ことができることは実証されていた（Ｖａｓａｎｔｈａ、　Ｎ、及びＴｈ ｏＩｌｌｐｓｏｎ、　Ｌ、Ｄ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｌ旦旦、８３７ −８４２　［１９８６］　）。ｐＢＥ２０をベースにしたベクターであるｐＢＥ ２６はＢ、７ミロリクエフアシエンスからのアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐ ｒ）　（Ｖａｓａｎｔｈａ、同）及びアルカリプロテアーゼシグナルペプチドコ ード領域から２コドン下流の唯一のＥｃｏＲＶ部位を含有する。ｐＢＥ２６をＥ ｃｏＲＶ及びＰｓｔで消化し、予めＢｃｌｌで消化したｐＲＩＴ５に連結した。

５′突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）をうめてＥｃｏＲＶと適合し得る平滑末端とし た。得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断した。正しいプラスミドをｐＢＥ３５ と名づけたが、このものはＢａ１１部位及びＥｃｏＲＶ部位を失っていた。Ｂａ １１．−ＥｃｏＲＶ接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に部位特異的突然変異誘発によ ってＥｃｏＲＶ部位を再作出した。得られたプラスミドをｐＢＥ４５と名づけた 。かくしてｐＢＥ４５は成熟プロティンＡ配列中のＢｃｌ　１部位が部位特異的 突然変異誘発によってＥｃｏＲＶ部位に変換されたａｐｒ−ｓｐａ融合物（ｆｕ ｓｉｏｎ）を含有する。ｐＢＥ４５及びｐＢＥ３１１をＫｐｎ−ＥｃｏＲＶで消 化し、連結した。正しい制限パターンを有するプラスミドを選抜し、ｐＢＥ３１ ２　（図７参照）と名づけた。融合接合部を通っての（ａｃｒｏｓｓ）　ＤＮＡ 配列は正しいｓａｃ　Ｂ　［Ｂａｍ　Ｐｌ　−５ｐａ配列が得られていたことを 示した。

Ｂ、ズブチリス株ＢＥＩＯＩＯ（△ａｐｒＥ、△ｎｐｒＳ　ｔｒｐＣ，、ｍｅｔ Ｂｌｏ、Ｉ　ｙ　ｓ　３）の培養菌をｐＢＥ３１２またはｐＢＥ２０で別々に形 質転換し、ニトロセルロース及び酢酸セルロースフィルター（ｆｆｌｔｅｒｓ） で覆ったＴＢＡＢ＋２％スクロース十ｃｍ　（５μｇ／ｍｌ）上で平板培養した 。平板を一夜インキユベートした。ついでニトロセルロースフィルターを取り外 して、コロニーイムノアッセイ［５ａｕｎｄｅｒｓら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ Ｌ、１６９　：　２９１７−２９２５　（１９８７）　］によって処理した（ｐ ｒｏｃｅｓｓｅｄ）。プロティンＡ陽性の表現型を有するコロニーはスクロース を細菌培地中に存在させておいた場合にのみ観察された。さらに、ｐＢＥ３１２ で形質転換したＢ、ズブチリス株ＢＥＩＯＩＯの培養菌をスクロースの存在下及 び不存在下で増殖させた。両者の菌体及び培養上清画分のプロティンＡをイムノ ブロッティングによって分析した。

プロティンＡはスクロースと共にインキュベートした培養物の培養上清中に主と して（〉９５％）見い出され、菌体物質に関して見い出されたのは少量（く５％ ）にすぎなかった。スクロースの不存在下でインキュベートした培養物は発現ベ クターのごくわずかな構成的読み過しによる、非常に低いレベルのプロティンＡ しか有さないことが判明した。

上記実施例は本発明の一般的にまたは具体的に説明した反応体及び／または操作 条件を上記実施例で用いたそれらと置き代えることによっても同様な成功下に繰 り返すことができる。

上記説明から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確認することができ、また その精神及び範囲を逸脱することな（、本発明に種々の変化及び修飾を加えて種 々の用法及び条件に適合させることができる。

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２、発現要素がレバンスクラーゼ遺伝子に由来する請求項１のベクタ３、レバン スクラーゼ遺伝子がバチルス・アミロリクエファシェンスに由来する請求項２の ベクター。

４、ポリペプチドがレバンスクラーゼである請求項１のベクター。

５、レバンスクラーゼがバチルス・アミロリクエファシェンスからのものである 請求項４のベクター。

６、ポリペプチドが発現要素に対し異種である請求項１のベクター。

７、スクロース類縁体がチオスクロースである請求項１のベクター。

８、ベクターがプラスミドである請求項１のベクター。

９、シグナルペプチドをコード化したＤＮＡ配列を特徴とする請求項１のベクタ ー。

１０、シグナルペプチドをコード化したＤＮＡカルパンスクラーゼ遺伝子に由来 する請求項９のベクター。

１１、シグナルペプチドをコード化したＤＮＡが発現要素に対し異種の遺伝子に 由来する請求項９のベクター。

１２４発現要素の下流に唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含有す る請求項１のベクター。

１３、シグナルペプチドをコード化したＤＮＡ配列の下流に、機能し得るように 該シグナルペプチドに結合した唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに 含有する請求項９のベクター。

１４　請求項１の、スクロースで調節し得る発現ベクターで形質転換したバチル ス・ズブチリス。

１５、シグナルペプチドをコード化したＤＮＡをさらに含有する請求項１４のバ チルス・ズブチリス。

１６□　シグナルペプチドがレバンスクラーゼ遺伝子に由来する請求項１５のバ チルス・ズブチリス。

１７、バチルス・ズブチリス中の異種遺伝子によってコード化されたポリペプチ ドを調節可能に生産する方法であって、ａ）請求項１４の形質転換バチルス・ズ ブチリスを適当な栄養培地中鎖異種遺伝子が発現される条件下に増殖させ、つい でｂ）該ポリペプチドを単離する ことよりなる方法。

１８、バチルス・ズブチリス中の異種遺伝子によってコード化されたポリペプチ ドを調節可能に生産する方法であって、ａ）　請求項１５の形質転換バチルス・ ズブチリスを適当な栄養培地中鎖異種遺伝子が発現される条件下に増殖させ、つ いでｂ）該ポリペプチドを単離する ことよりなる方法。

１９、発現要素がレバンスクラーゼ遺伝子に由来し、発現を可能にする条件が栄 養培地にお１ブるスクロースまたはスクロース類縁体の存在である請求項１６の 方法。

２０、ポリペプチドがレバンスクラーゼである請求項１９の方法。

２１゜ ａ）ｉ）ブロモ−クー配列、及び ｎ）スクロースまたはスクロース類縁体によって調節可能な調節配列 よりなるスクロースによって調節可能な発現要素、及びｂ）ポリペプチドをコー ド化したＤＮＡ配列であって、該発現要素が機能し得るように結合したＤＮＡ配 列 よりなるＤＮＡ断片であって、宿主バチルス・ズブチリス中でスクロース調節下 に発現可能であり、かつ該宿主以外の微生物に由来するＤＮＡ断片。

２２、各々請求項１のベクターである、プラスミドｐＢＥ３００、ｐＢＥ３０１ 、ｐＢＥ５０１、ｐＢＥ３０５、ｐＢＥ５０４、ｐＢＥ３１１及びＩ）ＢＥ３１ ２゜ 国際調査報告 国際調査報告 υＳ　９００３３４８ Ｓ＾　３８６９０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．バチルス・スピーシーズを形質転換するのに有用な、スクロースで調節でき る複製可能な組換え発現ベクターであって；バチルス・ズブチリス以外の第一の バチルス・スピーシーズからの、スクロースで調節できる発現要素、またはそれ と実質上均質な、スクロースで調節できる発現要素を含有する該ベクターであっ て；かつ該ベクターが該発現要素が機能し得るように結合したポリペプチドをコ ード化したＤＮＡ配列を含有する場合、スクロースによって調節可能で、かつ該 第一のバチルス・スピーシーズとは異なる少なくとも１つのバチルス・スピーシ ーズ中に形質転換したとき複製可能である該ベクター。 ２．発現要素がプロモーター配列及びスクロースによつて調節し得る調節配列を 含有する請求項１のベクター。 ３．ポリペプチドをコード化した、機能し得るように結合したＤＮＡ配列をさら に含有する請求項１のベクター。 ４．第一のバチルス・スピーシーズがバチルス・アミロリクエフアシエンスであ る請求項３のベクター。 ５．発現要素がバチルス・アミロリクエフアシエンスのレバンスクラーゼ遺伝子 に由来する請求項４のベクター。 ６．ポリペプチドがバチルス・アミロリクエフアシエンスからのレバンスクラー ゼである請求項５のベクター。 ７．ポリペプチドが発現要素に対し異種である請求項３のベクター。 ８．チオスクロースまたはその類縁体によつても調節可能な請求項３のベクター 。 ９．ベクターがプラスミドである請求項３のベクター。 １０．シグナルペプチドをコード化したＤＮＡ配列をさらに含有する請求項３の ベクター。 １１．シグナルペプチドをコード化したＤＮＡがレバンスクラーゼ遺伝子に由来 する請求項１０のベクター。 １２．シグナルペプチドをコード化したＤＮＡが発現要素のそれと異種の遺伝子 に由来する請求項１０のベクター。 １３．発現要素の下流に唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含有す る請求項３のベクター。 １４．シグナルペプチドの下流に、機能するようにそれに結合した、唯一の制限 エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含有する請求項１０のベクター。 １５．バチルス・スピーシーズを形質転換するのに有用な、スクロースで調節で きる複製可能な組換え発現ベクターであつて；第一のバチルス・スピーシーズか らの、スクロースで調節できる発現要素、またはそれと実質上均質な、スクロー スで調節できる発現要素を含有する該ベクターであつて；かつ該ベクターが該発 現要素が機能し得るように結合したポリペプチドをコード化したＤＮＡ配列を含 有する場合、スクロースによつて調節可能で、かつ該第一のバチルス・スピーシ ーズとは異なる少なくとも１つのバチルス・スピーシーズ中に形質転換したとき 複製可能である該ベクターで形質転換したグラム陽性菌株であつて、該第一のバ チルス・スピーシーズとは異なる菌株。 １６．ベクターがポリペプチドをコード化した、機能し得るように結合したＤＮ Ａ配列をさらに含有する請求項１５のグラム陽性菌株。 １７．バチルス属の請求項１５の菌株。 １８．シグナルペプチドをコード化したＤＮＡがレバンスクラーゼ遺伝子に由来 する、バチルス属の請求項１５の菌株。 １９．請求項１のベクターによって形質転換されたバチルス・ズブチリス株。 ２１．グラム陽性菌中の異種遺伝子によつてコード化されたポリペプチドを調節 可能に生産する方法であつて、請求項１５の形質転換菌株を適当な栄養培地中該 遺伝子が発現される条件下に増殖させることよりなる方法。 ２２．グラム陽性菌中の異種遺伝子によつてコード化されたポリペプチドを調節 可能に生産する方法であって、請求項１６の形質転換菌株を適当な栄養培地中該 遺伝子が発現される条件下に増殖させ、ついで生産されたポリペプチドを単離す ることよりなる方法。 ２３．グラム陽性菌中の異種遺伝子によつてコード化されたポリペプチドを調節 可能に生産する方法であつて、請求項１８の形質転換菌株を適当な栄養培地中該 遺伝子が発現される条件下に増殖させ、ついで生産されたポリペプチドを単離す ることによりなる方法。 ２４．発現要素がレバンスクラーゼ遺伝子に由来し、発現を可能にする条件が栄 養培地中におけるスクロースまたはその類縁体の存在である請求項２１の方法。 ２５．ポリペプチドがレバンスクラーゼである請求項２４の方法。 ２６．バチルス・ズブチリス以外の第一のバチルス・スピーシーズからの単離さ れた、スクロースで調節可能な発現要素、またはそれと実質的に均質な、スクロ ースで調節可能な発現要素であつて；ポリペプチドをコード化したＤＮＡ配列に 、機能し得るように結合させたとき、スクロースによつて調節することができ、 かつ第一のバチルス・スピーシーズとは異なるバチルス・スピーシーズ中に形質 変換した場合に複製し得る発現要素。 ２７．細菌菌株を形質転換する方法であつて、該菌株を請求項１のベクターで形 質転換することよりなる方法。 ２８．第一のバチルス・スピーシーズとは異なるバチルス・スピーシーズがバチ ルス・ズブチリスである請求項１のベクター。 ２９．各々請求項１のベクターである、プラスミドｐＢＥ３００、ｐＢＥ３０１ 、ｐＢＥ５０１、ｐＢＥ３０５、ｐＢＥ５０４、ｐＢＥ３１１及びｐＢＥ３１２ 。