JPH0376580A - 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法 - Google Patents
大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法Info
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- JPH0376580A JPH0376580A JP1210767A JP21076789A JPH0376580A JP H0376580 A JPH0376580 A JP H0376580A JP 1210767 A JP1210767 A JP 1210767A JP 21076789 A JP21076789 A JP 21076789A JP H0376580 A JPH0376580 A JP H0376580A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、オシロイバナ由来の抗ウイルス性タン／ツク
質（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ＡｎＨｖｉｒａｌ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ；以下。
質（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ＡｎＨｖｉｒａｌ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ；以下。
ＭＡＰと略す）の製造方法に関する。
［従来の技術および発明が解決しようとする課題］本件
出願人は、先にオシロイバナ属の植物から新規な塩゛基
性タ／バク質ＣＭＡＰ ） を単離し、該タン・ぞり質
が抗ウィルス作用を示すことを見出した。
出願人は、先にオシロイバナ属の植物から新規な塩゛基
性タ／バク質ＣＭＡＰ ） を単離し、該タン・ぞり質
が抗ウィルス作用を示すことを見出した。
このＭＡＰについては、既に特許出願済である（特開１
＠６０−２４３１００号）、また、オシロイバナの組織
培養によ、６ ＭＡＰを製造することに成功し、この製
造方法についても既に特許出願済である（％開昭６２−
１２５３８２号、特開昭６１−２６９７１０号）。
＠６０−２４３１００号）、また、オシロイバナの組織
培養によ、６ ＭＡＰを製造することに成功し、この製
造方法についても既に特許出願済である（％開昭６２−
１２５３８２号、特開昭６１−２６９７１０号）。
ところで、ＭＡＰ ｆｔ工業的に製造する最も簡単な方
法は、大量に栽培したオシロイバナ植物から抽出するこ
とである。しかし、この方法ではオシロイバナ植物の栽
培に長時間を要し、また広大な作付は面積を必要とする
問題がある。′ｔた、出願人の提案にある組織培養によ
る方法に訃いても、細胞の培養には１２日程度という長
時間金要する。
法は、大量に栽培したオシロイバナ植物から抽出するこ
とである。しかし、この方法ではオシロイバナ植物の栽
培に長時間を要し、また広大な作付は面積を必要とする
問題がある。′ｔた、出願人の提案にある組織培養によ
る方法に訃いても、細胞の培養には１２日程度という長
時間金要する。
一方、近年にお・ける遺伝子組換え技術、クローニング
技術等の急速な発展に伴い、微生物の遺伝子操作による
有用物質の生産が試みられ、数々の成功が納められてい
る。また、タン・ぞり質化学の分野においては、基礎的
データの蓄積による解析技術の発展およびＤＮＡ合成技
術の発展を背景εして、新規タン／４’り質の研究にか
いて遺伝子レベルでのアプローチが重要な手段にな９つ
つある。
技術等の急速な発展に伴い、微生物の遺伝子操作による
有用物質の生産が試みられ、数々の成功が納められてい
る。また、タン・ぞり質化学の分野においては、基礎的
データの蓄積による解析技術の発展およびＤＮＡ合成技
術の発展を背景εして、新規タン／４’り質の研究にか
いて遺伝子レベルでのアプローチが重要な手段にな９つ
つある。
このような背景を考慮すると急、 ＭＡＰのタン・ぞり
質化学的研究にふ・いては、その構造を解析し。
質化学的研究にふ・いては、その構造を解析し。
これに基づいてＭＡＰ遺伝子をデザインふ・よび合成す
ることが課題となる。この課題を解決し、遺伝子組換え
技術を駆使したＭＡＰの製造方法も、既に特許出願流で
ある（特願昭６３−９３４９４号）。
ることが課題となる。この課題を解決し、遺伝子組換え
技術を駆使したＭＡＰの製造方法も、既に特許出願流で
ある（特願昭６３−９３４９４号）。
しかしながら、遺伝子組換え技術金駆使し、外来遺伝子
によって、大勝菌内でＭＡＰ ’１生産させると、 Ｍ
ＡＰが大ｇｌ菌のタン／４’り質生合成を阻害してしま
い大腸菌の成育が妨害されるという欠点があった。この
ため大勝菌内で生産され、ｂ ＭＡＰ量には限界があっ
た。
によって、大勝菌内でＭＡＰ ’１生産させると、 Ｍ
ＡＰが大ｇｌ菌のタン／４’り質生合成を阻害してしま
い大腸菌の成育が妨害されるという欠点があった。この
ため大勝菌内で生産され、ｂ ＭＡＰ量には限界があっ
た。
従来より、大腸菌内に溜ったタンノック質を取り出す方
法と１−で、発現遺伝子にシグナルペプチドを結合させ
、タンノック質を分泌させる方法が知られている。？：
、のようなシグナルペプチドは数多く知られているが、
所望の効果が得られるかどうかは実際に行ってみなけれ
ば分からないのが現状である。
法と１−で、発現遺伝子にシグナルペプチドを結合させ
、タンノック質を分泌させる方法が知られている。？：
、のようなシグナルペプチドは数多く知られているが、
所望の効果が得られるかどうかは実際に行ってみなけれ
ば分からないのが現状である。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり。
大腸菌の成育金妨害することなく、確実に外来遺伝子を
発現させ、さらにシグナルペプチドを用いてＭＡＰを大
腸菌外に分泌させるＭＡＰ ｍ遣方法を提供し、 ＭＡ
Ｉ）の大量生産を実現することを目的とする。
発現させ、さらにシグナルペプチドを用いてＭＡＰを大
腸菌外に分泌させるＭＡＰ ｍ遣方法を提供し、 ＭＡ
Ｉ）の大量生産を実現することを目的とする。
［課ｍｔ解決するための手段］
本発明の目的は、ＭＡＰ遺伝子（第２図）の上流側に大
９Ｊ菌外展タンパク質ｏｒｎｐ Ａシグナルペプチドを
コードする遺伝子（第１図）を結合させた遺伝手金構築
するにとど、該遺伝子を大腸菌プラスミドに導入したＤ
ＮＡベクターを構築することによって達成される。
９Ｊ菌外展タンパク質ｏｒｎｐ Ａシグナルペプチドを
コードする遺伝子（第１図）を結合させた遺伝手金構築
するにとど、該遺伝子を大腸菌プラスミドに導入したＤ
ＮＡベクターを構築することによって達成される。
本発明に用いられる大腸菌プラスミドは、大勝必要があ
る。これらの大腸菌ｆ−ｙスミドには、例えばｐＵＣ１
，９％ｐＢＢＲ３２２，ｐＫＫ２２３−３．３よびｐＴ
ＴＱ １９などのグラスミド、筐たはこれらを城 Ｖ合あるいは部分的に欠失させた誘導体を用いることが
できる。
る。これらの大腸菌ｆ−ｙスミドには、例えばｐＵＣ１
，９％ｐＢＢＲ３２２，ｐＫＫ２２３−３．３よびｐＴ
ＴＱ １９などのグラスミド、筐たはこれらを城 Ｖ合あるいは部分的に欠失させた誘導体を用いることが
できる。
例えば、ｐＵＣ１９の複製開始領域（ｏｒｉ ）とアン
ピシリン耐性遺伝子領域（Ａｐ ）の一部を含む領域（
すなわち制限酵素ｐｖｕｌ＄＞よびｐｖｕ ＩＩによっ
て切断される断片）と、ｐＫＫ２２３−３のアンピシリ
ン耐性遺伝子の一部とｔａｅ ７’ロモーターｒｒｎＢ
ＴｉＴ２ターミネータ−領域（すなわち制限酵素Ｐｖｕ
Ｉの完全分解とＢａｒｒ＋ＨＩの部分分解とによって
切断される断片）を融合したグラスミドを用いることが
できる。
ピシリン耐性遺伝子領域（Ａｐ ）の一部を含む領域（
すなわち制限酵素ｐｖｕｌ＄＞よびｐｖｕ ＩＩによっ
て切断される断片）と、ｐＫＫ２２３−３のアンピシリ
ン耐性遺伝子の一部とｔａｅ ７’ロモーターｒｒｎＢ
ＴｉＴ２ターミネータ−領域（すなわち制限酵素Ｐｖｕ
Ｉの完全分解とＢａｒｒ＋ＨＩの部分分解とによって
切断される断片）を融合したグラスミドを用いることが
できる。
一般に、外来遺伝子を大腸菌内で発現させるために、大
腸菌に導入されるベクターは遺伝子以外に次のＤＮＡ配
列を必要とする。
腸菌に導入されるベクターは遺伝子以外に次のＤＮＡ配
列を必要とする。
（ａ） 転写全制御する領域（オペレーター）（ｂｌ
遺伝子の転写開始音指示する領域（ブロモ−ター） 大腸菌で発現されるブロモ−ターには、大腸菌ファージ
に由来するＮ２５プロモーター及びＰＬプロモーター等
が知られている。たとえば、ＰＬプロモーターは大腸菌
λ７アージ由来の７’ｏモーターでｃｌと称す制御タン
／’Ｐり質によって、その発現が抑制されている。さら
にその温度感受性変異体であるｃ１８５７．！：称する
制御タン−ぐり質は、３０℃に釦いてはｅ［と同様にＰ
Ｌ７’ロモーターの発現を抑制し、４２℃にふ・いては
その抑制能力は失われＰＬ７’ロモーターが発現誘導さ
れる。
遺伝子の転写開始音指示する領域（ブロモ−ター） 大腸菌で発現されるブロモ−ターには、大腸菌ファージ
に由来するＮ２５プロモーター及びＰＬプロモーター等
が知られている。たとえば、ＰＬプロモーターは大腸菌
λ７アージ由来の７’ｏモーターでｃｌと称す制御タン
／’Ｐり質によって、その発現が抑制されている。さら
にその温度感受性変異体であるｃ１８５７．！：称する
制御タン−ぐり質は、３０℃に釦いてはｅ［と同様にＰ
Ｌ７’ロモーターの発現を抑制し、４２℃にふ・いては
その抑制能力は失われＰＬ７’ロモーターが発現誘導さ
れる。
すなわち、ＰＬｆロモーターとｅｒ ８５７遺伝子を兼
ね備え、これによって発現調節を行うここのできる発現
ベクターは、大腸菌内に釦いて、３０℃の培養において
はその生育妨げない。さらに４２℃の培養条件下で培養
することによって、遺伝子の高発現が期待される。
ね備え、これによって発現調節を行うここのできる発現
ベクターは、大腸菌内に釦いて、３０℃の培養において
はその生育妨げない。さらに４２℃の培養条件下で培養
することによって、遺伝子の高発現が期待される。
ＰＬプロモーターは、λフアージ遺伝子もしくは、公知
のｐＰＬ１ａｍｂｄａプラスミドＤＮＡから制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ 、 Ｈｐａ Ｉの分解によって切シ出すこと
によシ、得ることができる。またｃｒ８５７遺伝子は。
のｐＰＬ１ａｍｂｄａプラスミドＤＮＡから制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ 、 Ｈｐａ Ｉの分解によって切シ出すこと
によシ、得ることができる。またｃｒ８５７遺伝子は。
変異体λフアージ（ｃ１８５７、Ｓａｍ ７ ）遺伝子
から、制限酵素Ｂｇｌ ［、Ｂａｎ ｍによる分解によ
って得ることができる。
から、制限酵素Ｂｇｌ ［、Ｂａｎ ｍによる分解によ
って得ることができる。
（ｃ） 転写終了を指令する領域（ターミネータ−）
ターミネータ−としては、大腸菌ファージに由来するｔ
ＬＩターミネータ−１大腸菌のりポゾーム遺伝子に由来
するｒｒπＢＴｉＴ２ターミネータ−等が知られている
。
ターミネータ−としては、大腸菌ファージに由来するｔ
ＬＩターミネータ−１大腸菌のりポゾーム遺伝子に由来
するｒｒπＢＴｉＴ２ターミネータ−等が知られている
。
（ｄ） ｍＲＮＡに転写されてから翻訳開始位置を指
示する領域（ＳＤ配列） ＳＤ配列としては、大腸菌の構成遺伝子に共通な配列が
提案されている。
示する領域（ＳＤ配列） ＳＤ配列としては、大腸菌の構成遺伝子に共通な配列が
提案されている。
（ｅ）ＳＤ配列と連動し、翻訳の読み初めとなるメチオ
ニンコドン（ＡＴＧ ） 大腸菌発現ベクターの構築 プラスミドＤＮＡ ’ｉ切断、欠失、挿入、融合させ発
現ベクターを構築する際、適宜合成ＤＮＡ断片を用い、
プラスミドＤＮＡ上にはない制限酵素サイトやＳＤ配列
、タン／ぞり質のアミノ酸配列の遺伝子を導入すること
が可能である。
ニンコドン（ＡＴＧ ） 大腸菌発現ベクターの構築 プラスミドＤＮＡ ’ｉ切断、欠失、挿入、融合させ発
現ベクターを構築する際、適宜合成ＤＮＡ断片を用い、
プラスミドＤＮＡ上にはない制限酵素サイトやＳＤ配列
、タン／ぞり質のアミノ酸配列の遺伝子を導入すること
が可能である。
例えば、プラスミドｐＫＫ ２２３−３には存在しない
ｘｂａｌ、Ｂｉｎ！等の制限酵素サイ）１−有する第３
図のＤＮＡ断片とその相補鎖を１ｐＫＫ２２３−３のＥ
ｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｎｌの切断断片（大断片）と結合さ
せることによＦ） ｘｂａ［、Ｂａｎ１ｌの制限酵素サ
イトをｐＫＫ ２２３−３に導入することができる。こ
れによって、この制限酵素サイトをそれぞれ５’−，３
″−側に有する全合成ＭＡＰ遺伝子ｉ ｐＫＫ ２２３
−３に挿入することが可能となる。また同時に、この合
成りＮＡ断片を用いることにより、ＳＤ配列並びに大腸
菌の転写開始に必須なメチオニン残基のコド／を導入す
ることも可能である。さらに、タンパク質の転写開始の
メチオニンコドｙ （ＡＴＧ ）はＮｄｅＩの制限酵素
サイ） （ＣＡＴＡＴＧ ）に含筐れ、この制限酵素Ｎ
ｄｅｌを介した他のタ／／セク質の遺伝子の挿入も可能
となる。
ｘｂａｌ、Ｂｉｎ！等の制限酵素サイ）１−有する第３
図のＤＮＡ断片とその相補鎖を１ｐＫＫ２２３−３のＥ
ｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｎｌの切断断片（大断片）と結合さ
せることによＦ） ｘｂａ［、Ｂａｎ１ｌの制限酵素サ
イトをｐＫＫ ２２３−３に導入することができる。こ
れによって、この制限酵素サイトをそれぞれ５’−，３
″−側に有する全合成ＭＡＰ遺伝子ｉ ｐＫＫ ２２３
−３に挿入することが可能となる。また同時に、この合
成りＮＡ断片を用いることにより、ＳＤ配列並びに大腸
菌の転写開始に必須なメチオニン残基のコド／を導入す
ることも可能である。さらに、タンパク質の転写開始の
メチオニンコドｙ （ＡＴＧ ）はＮｄｅＩの制限酵素
サイ） （ＣＡＴＡＴＧ ）に含筐れ、この制限酵素Ｎ
ｄｅｌを介した他のタ／／セク質の遺伝子の挿入も可能
となる。
必要なりＮＡ断片は、ＤＮＡ合成機（アプライド・バイ
オシステムズ・ジャパン社３８１Ａ）ｆｆｉ用いること
によシ合成することができる１合成りＮＡ断片、並びに
制限酵素で切断したＤＮＡ断片、さらに適宜Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ・フレノウ・フラグ
メント（以下フレノウ・フラグメントと称す）によって
ＤＮＡの粘着末端を平滑末端としたＤＮＡ断片を用い、
これらを結合させることにより１発現ベクターを構築す
る。尚、各断片の結合はＴ４ＤＮＡりが−ゼもしくは、
このＤＮＡリガーゼを含んだ市販のライゲーシヨン・キ
ットを用いて行うことができる。
オシステムズ・ジャパン社３８１Ａ）ｆｆｉ用いること
によシ合成することができる１合成りＮＡ断片、並びに
制限酵素で切断したＤＮＡ断片、さらに適宜Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ・フレノウ・フラグ
メント（以下フレノウ・フラグメントと称す）によって
ＤＮＡの粘着末端を平滑末端としたＤＮＡ断片を用い、
これらを結合させることにより１発現ベクターを構築す
る。尚、各断片の結合はＴ４ＤＮＡりが−ゼもしくは、
このＤＮＡリガーゼを含んだ市販のライゲーシヨン・キ
ットを用いて行うことができる。
分泌型ＭＡＰ遺伝子の作製
ＯｍｐＡは大腸菌の外膜タンパク質であシ、第１図で示
される様なシグナル配列を有する。第１図には、このシ
グナル配列をコードする遺伝子の塩基配列を併記した。
される様なシグナル配列を有する。第１図には、このシ
グナル配列をコードする遺伝子の塩基配列を併記した。
このシグナル配列ばＯｍｐＡｆｔ大腸菌内から分泌させ
る働きを担っている。このシグナル配列を他の異なるタ
ン・ぞり質のＮ末端に付加させることによう、このタン
・ぞり質を大腸菌から分泌生産させることが期待される
。
る働きを担っている。このシグナル配列を他の異なるタ
ン・ぞり質のＮ末端に付加させることによう、このタン
・ぞり質を大腸菌から分泌生産させることが期待される
。
例、ｔ ハ、ＭＡＰ １このシグナルペプチドによって
大腸菌から分泌させる場合、第１図で示されるシグナル
配列をＭＡＰのＮ末端であるアラニンのすぐ上流に結合
させることによシ、ＭＡＰの分泌生産が期待される。ま
たこのシグナル配列をコードする遺伝子は、最初のメチ
オニンコドｙが上述の制限酵素Ｎｄ＠ｌサイトとなって
いるため、Ｎｄｅ）サイトをプロモーターの下流に有し
ている発現ベクターへ遺伝子の挿入が可能である。なか
、第１図にはＭＡＰ Ｎ末端の三つのアミノ酸配列と、
これに対応するＤＮＡ配列が含まれている。
大腸菌から分泌させる場合、第１図で示されるシグナル
配列をＭＡＰのＮ末端であるアラニンのすぐ上流に結合
させることによシ、ＭＡＰの分泌生産が期待される。ま
たこのシグナル配列をコードする遺伝子は、最初のメチ
オニンコドｙが上述の制限酵素Ｎｄ＠ｌサイトとなって
いるため、Ｎｄｅ）サイトをプロモーターの下流に有し
ている発現ベクターへ遺伝子の挿入が可能である。なか
、第１図にはＭＡＰ Ｎ末端の三つのアミノ酸配列と、
これに対応するＤＮＡ配列が含まれている。
大腸菌形質転換体によるＭＡＰの生産
ＰＬ７’ロモーター、ｃｒ８５７遺伝子を有し、タンパ
ク質の遺伝子を挿入した一発現ベクターは、公知の方法
例えば塩化カルシウム法によう、大腸菌を形１転洪する
ことができる。
ク質の遺伝子を挿入した一発現ベクターは、公知の方法
例えば塩化カルシウム法によう、大腸菌を形１転洪する
ことができる。
大腸菌形質転換体は炭素源、窒素源、ミネラル。
必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の微量の有機栄養源
を含む培地で培養することができる。
を含む培地で培養することができる。
培養に際しては１例えば液体培地ｉ ｐＨ６，５〜８．
５の温度範囲に維持しつつ、通気攪拌等により好気的条
件εする。これを数時間から４日培養しＭＡＰ を生産
させ、培養液中に蓄積させればよい。
５の温度範囲に維持しつつ、通気攪拌等により好気的条
件εする。これを数時間から４日培養しＭＡＰ を生産
させ、培養液中に蓄積させればよい。
上記のようにして生産されたＭＡＰ ｉ含む培養液を必
要に応じて集菌破砕し、もしくは濃縮した後、塩析、イ
オン交換クロ１トグラフイ、グル濾過、７フイニテイー
クロマトグラフイー等を適宜組み合わせるこεにより、
精製されたＭＡＰ ｆ得る己εができる。
要に応じて集菌破砕し、もしくは濃縮した後、塩析、イ
オン交換クロ１トグラフイ、グル濾過、７フイニテイー
クロマトグラフイー等を適宜組み合わせるこεにより、
精製されたＭＡＰ ｆ得る己εができる。
例えば、ＰＬプロモーター ｅ１８５７遺伝子金持った
発現ベクターに、 ＭＡＰもしくはＭＡＰとシグナル配
列の融合遺伝子を挿入し、大腸菌にて発現させＭＡＰ
を生産させようとする場合、犬＆菌形質転換体＝ｉ３０
℃にて好気的条件で培養し、大腸菌を十分に増殖させた
後、培養温度をすみや刀ｉに４２℃にかえ、好気的条件
でさらに培養するにと′によってｍｐｌ生産させること
ができる。仁うして生産きぜたＭＡＰは抗ＭＡＰ抗体を
用いた免疫学的手法を用いて定址することが可能である
。
発現ベクターに、 ＭＡＰもしくはＭＡＰとシグナル配
列の融合遺伝子を挿入し、大腸菌にて発現させＭＡＰ
を生産させようとする場合、犬＆菌形質転換体＝ｉ３０
℃にて好気的条件で培養し、大腸菌を十分に増殖させた
後、培養温度をすみや刀ｉに４２℃にかえ、好気的条件
でさらに培養するにと′によってｍｐｌ生産させること
ができる。仁うして生産きぜたＭＡＰは抗ＭＡＰ抗体を
用いた免疫学的手法を用いて定址することが可能である
。
［実施例コ
以下、本発明の実施例金石し、本発明金さらに具体的に
説明する。もつとも本発明は、下記の実施例に限定され
るものではないここは明かである。
説明する。もつとも本発明は、下記の実施例に限定され
るものではないここは明かである。
以下の実施例をよυ理解できるように、実施例にふ・け
るＤＮＡベクターの構築プロセスを第４図に示した。
るＤＮＡベクターの構築プロセスを第４図に示した。
合成りＮＡ断片ｉ ｐＫＫ ２２３−３に挿入する工程
制限酵素サイ）、ＳＤ配列、メチオニンコドン、および
ＭＡＰのＮ末端アミノ酸配列のコドンを有する合成りＮ
Ａリンカ−（第３図参照） ′ｌｔ、 ｐＫＫ２２３−
３に挿入した。
制限酵素サイ）、ＳＤ配列、メチオニンコドン、および
ＭＡＰのＮ末端アミノ酸配列のコドンを有する合成りＮ
Ａリンカ−（第３図参照） ′ｌｔ、 ｐＫＫ２２３−
３に挿入した。
１μｇのｐＫＫ ２２３−３を制限酵素Ｅｃ ｏ ＲＩ
ｅおよびＨｉｎｄｌｌ （日本ジーン社製）を、それ
ぞれ１０ユニット含んだハイ・バッファー（５０ｍＭ
）リス・塩酸（ｐＨ７，５）−１，００ｍＭ塩化ナトリ
ウム−１ｍＭ塩化マグネシウム；以下／・イ・ノ々ツフ
ァーと称す）中で、３７℃１時間反応させ切断した。そ
の後フェノール・クロロホルム処理し、エタノール沈澱
し、ＤＮＡ’ｉ回収した。尚、フェノール・クロロホル
ム処理とは、あらかじめ１０ ｍＭ トＩＪス塩酸（ｐ
Ｈ８、０） −１ｍＭ ＥＤＴＡ （Ｔ Ｅ ：以下Ｔ
Ｅと称す）にて飽和させたフェノールを１反応させたＤ
ＮＡ溶液に等量加え混合した後遠心分離し、ＤＮＡを含
む水層を回収し、さらにクロ巨ホルムを回収したＤＮＡ
溶液に等量加え、混合した後遠心分離し、ＤＮＡ ’ｉ
含む水層を回収する操作である。筐たエタノール沈澱と
は、 １／２０量の５Ｍ塩化ナトリウム並びに２倍量の
エタノールを加え、−７０℃で３０分間冷却した後、高
速で遠心分離することにより沈殿ヲ回収する操作である
。
ｅおよびＨｉｎｄｌｌ （日本ジーン社製）を、それ
ぞれ１０ユニット含んだハイ・バッファー（５０ｍＭ
）リス・塩酸（ｐＨ７，５）−１，００ｍＭ塩化ナトリ
ウム−１ｍＭ塩化マグネシウム；以下／・イ・ノ々ツフ
ァーと称す）中で、３７℃１時間反応させ切断した。そ
の後フェノール・クロロホルム処理し、エタノール沈澱
し、ＤＮＡ’ｉ回収した。尚、フェノール・クロロホル
ム処理とは、あらかじめ１０ ｍＭ トＩＪス塩酸（ｐ
Ｈ８、０） −１ｍＭ ＥＤＴＡ （Ｔ Ｅ ：以下Ｔ
Ｅと称す）にて飽和させたフェノールを１反応させたＤ
ＮＡ溶液に等量加え混合した後遠心分離し、ＤＮＡを含
む水層を回収し、さらにクロ巨ホルムを回収したＤＮＡ
溶液に等量加え、混合した後遠心分離し、ＤＮＡ ’ｉ
含む水層を回収する操作である。筐たエタノール沈澱と
は、 １／２０量の５Ｍ塩化ナトリウム並びに２倍量の
エタノールを加え、−７０℃で３０分間冷却した後、高
速で遠心分離することにより沈殿ヲ回収する操作である
。
ＤＮＡ合成機（アゲライド・バイオシステムズ◆ツヤ・
ゼン社製、３８１Ａ型）を使用し、ホスホロアミダイド
法を用いて、＃ＣＤ合成りＮＡリンカ−（−本領を２本
）を調製した０化の合成りＮＡの一本ａｔ各１μｇｌＯ
ユニットのＴ４キナーゼ（東洋紡績社製）を含んだ１０
０μＬのキナーゼ溶液（５０−トリス塩酸（ｐＨ７，６
）−１０ｍＭ塩化マグネシウｒｏＭ ＥＤＴＡ −１ｒ
ｒｉＦｉｉ ＡＴＰ ：以下キナーゼ溶ｉｔ称す）中で
３７℃１時間反応させ、その５′末端にリン酸を付加し
た。この反応液を混合し、６０℃で２０分間加温し、窒
温で２０分間放置して相補鎖をアニールするこεにより
二本鎖ＤＮＡとした。これをエタノール沈澱させた後、
１０μｔのＴＥに溶解した。
ゼン社製、３８１Ａ型）を使用し、ホスホロアミダイド
法を用いて、＃ＣＤ合成りＮＡリンカ−（−本領を２本
）を調製した０化の合成りＮＡの一本ａｔ各１μｇｌＯ
ユニットのＴ４キナーゼ（東洋紡績社製）を含んだ１０
０μＬのキナーゼ溶液（５０−トリス塩酸（ｐＨ７，６
）−１０ｍＭ塩化マグネシウｒｏＭ ＥＤＴＡ −１ｒ
ｒｉＦｉｉ ＡＴＰ ：以下キナーゼ溶ｉｔ称す）中で
３７℃１時間反応させ、その５′末端にリン酸を付加し
た。この反応液を混合し、６０℃で２０分間加温し、窒
温で２０分間放置して相補鎖をアニールするこεにより
二本鎖ＤＮＡとした。これをエタノール沈澱させた後、
１０μｔのＴＥに溶解した。
巴うして得られた合成りＮＡの二本鎖溶液５μｔに上述
のｐｌＧｃ ２２３−３分解物２．５μｔ（約０．５μ
ｇ）を加え、ライｒ−シ３ノ・キット（宝酒造社製）を
用い、１０℃２時間反応させた。これで大腸菌（ＨＢＩ
ＯＩ ）’を従来の方法に従い形質転換し、その形質転
換体からＤＮＡ ｉ精製し、合成りＮＡのリンカ−を挿
入したプラスミドｐ ＫＳ２を得た。
のｐｌＧｃ ２２３−３分解物２．５μｔ（約０．５μ
ｇ）を加え、ライｒ−シ３ノ・キット（宝酒造社製）を
用い、１０℃２時間反応させた。これで大腸菌（ＨＢＩ
ＯＩ ）’を従来の方法に従い形質転換し、その形質転
換体からＤＮＡ ｉ精製し、合成りＮＡのリンカ−を挿
入したプラスミドｐ ＫＳ２を得た。
ｐＫＳ２の複製開始領域をｐｕｃ １９型に変換すゐ工
程２μｇのグラスミドｐＫＳＺを制限酵素ＢａｍＨＩを
用いて、ハイ・バッファー５０μを中で３７℃１時間反
応させ切断した。己れをフェノール−クロロホルム処理
し、エタノール沈澱し、ＤＮＡ ’ｉ回収した。
程２μｇのグラスミドｐＫＳＺを制限酵素ＢａｍＨＩを
用いて、ハイ・バッファー５０μを中で３７℃１時間反
応させ切断した。己れをフェノール−クロロホルム処理
し、エタノール沈澱し、ＤＮＡ ’ｉ回収した。
沈澱を２ユニツトのフレノウ・フラグメント（東洋紡績
社製）を含むフレノウ溶液（５０ｍＭ ） リス・ミン
に各０．１ｍＭのｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴ
Ｐ 、 ＴＴＰを加えた溶液：以下フレノウ溶液と称す
）２５μを中で２２℃３０分間反応させ、その粘着末端
を平滑末端とした０反応終了後、７０℃で５分１間加熱
した後フェノール・クロロホルム処３１ Ｌ、エタノー
ル沈澱によってＤＮＡを回収した。さらにこのＤＮＡ
’ｉ１０ユニットの制限酵素ｐｖｕ Ｉ （東洋紡績社
製）を含むハイ・バッファー５０μｔに溶かし、３７℃
１時間反応させ切断した。フェノール・クロロホルム処
理し、エタノール沈澱しＤＮＡを回収した。
社製）を含むフレノウ溶液（５０ｍＭ ） リス・ミン
に各０．１ｍＭのｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴ
Ｐ 、 ＴＴＰを加えた溶液：以下フレノウ溶液と称す
）２５μを中で２２℃３０分間反応させ、その粘着末端
を平滑末端とした０反応終了後、７０℃で５分１間加熱
した後フェノール・クロロホルム処３１ Ｌ、エタノー
ル沈澱によってＤＮＡを回収した。さらにこのＤＮＡ
’ｉ１０ユニットの制限酵素ｐｖｕ Ｉ （東洋紡績社
製）を含むハイ・バッファー５０μｔに溶かし、３７℃
１時間反応させ切断した。フェノール・クロロホルム処
理し、エタノール沈澱しＤＮＡを回収した。
一方、１μｇのプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を
、それぞれ１０ユニツトの制限酵素ｐｖｕ！ （東洋紡
績社製）、釦よびｐｖｕｌｌ （日本ジーン社製）を含
む５０μｔのハイ・バッファー中で３７℃２時間反応さ
せＤＮＡを切断した。これをフェノール・クロロホルム
処理し、エタノール沈澱しＤＮＡ ′ｊｋ回収した。
、それぞれ１０ユニツトの制限酵素ｐｖｕ！ （東洋紡
績社製）、釦よびｐｖｕｌｌ （日本ジーン社製）を含
む５０μｔのハイ・バッファー中で３７℃２時間反応さ
せＤＮＡを切断した。これをフェノール・クロロホルム
処理し、エタノール沈澱しＤＮＡ ′ｊｋ回収した。
こうして得られたＤＮＡをそれぞれｌＯμｔＯＴＥに溶
解し、各々３．５μＬづつ混合し、ライダージョン・キ
ット（宝酒造社製）を用いて１０℃１時間反応させ結合
させた。これで大騒音（ＨＢ １０１株）を形質転換し
、形質転換体からｐｕＣｌ ９の複製開始領域と、上述
のｐＫＳ ２の大断片を含む領域の結合したプラスミド
ｐＫＳ ３ ｔ″得た。
解し、各々３．５μＬづつ混合し、ライダージョン・キ
ット（宝酒造社製）を用いて１０℃１時間反応させ結合
させた。これで大騒音（ＨＢ １０１株）を形質転換し
、形質転換体からｐｕＣｌ ９の複製開始領域と、上述
のｐＫＳ ２の大断片を含む領域の結合したプラスミド
ｐＫＳ ３ ｔ″得た。
ｐＫＳ ３にＰＬプロモーターを挿入する工程２ ｆｉ
ｇ ＯｐＫＳを、１０エニツ）Ｏ制限酵素ｐａｔＩ（日
本ノーン社製）を含んだ５０μＬのハイ・バッファー中
で３７℃１時間反応し切断させ、フェノール・クロロホ
ルム処理し、エタノール沈澱させＤＮＡを回収した。こ
れを２．５ユニツトのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡
績社製）を含む２０μｔの３３−０．１ ｍｇ ／ ｍ
ｔ仔牛胸腺アルデミ７に各０．１ｍＭのｄＡＴＰ 、
ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ＴＴＰを含む溶液中で、
３７℃５分間加温し、粘着末端を平滑末端にした。その
後１μｔの０．５ Ｍ ＥＤＴＡを加え、さらにフェノ
ール・クロロホルム処理し、エタノール沈澱しＤＮＡを
回収した。これを１０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨ１（
日本ジーン社）を含む５ｏμｔのハイ・バッファー中で
３７℃１時間反応させＤＮＡ を切断した。これをフェ
ノール・クロロホルム処理し、エタノール沈澱しＤＮＡ
を回収した。
ｇ ＯｐＫＳを、１０エニツ）Ｏ制限酵素ｐａｔＩ（日
本ノーン社製）を含んだ５０μＬのハイ・バッファー中
で３７℃１時間反応し切断させ、フェノール・クロロホ
ルム処理し、エタノール沈澱させＤＮＡを回収した。こ
れを２．５ユニツトのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡
績社製）を含む２０μｔの３３−０．１ ｍｇ ／ ｍ
ｔ仔牛胸腺アルデミ７に各０．１ｍＭのｄＡＴＰ 、
ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ＴＴＰを含む溶液中で、
３７℃５分間加温し、粘着末端を平滑末端にした。その
後１μｔの０．５ Ｍ ＥＤＴＡを加え、さらにフェノ
ール・クロロホルム処理し、エタノール沈澱しＤＮＡを
回収した。これを１０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨ１（
日本ジーン社）を含む５ｏμｔのハイ・バッファー中で
３７℃１時間反応させＤＮＡ を切断した。これをフェ
ノール・クロロホルム処理し、エタノール沈澱しＤＮＡ
を回収した。
他方ｐＰＬ１ａｍｂｄａ （７フルアジア社製）１μｇ
を各１０ユニフトの制限酵素ＢａｍＨＩＩ 、ＨｐａＩ
（ともに日本ゾーン社製）を含むハイ・バッファー５
ｏμを中にて、３７℃１時間反応させ切断した。これを
フェノール・クロロホルム処理し、エタノール沈Ｍして
ＰＬ７’ロモーターを含むＤＮＡ断片を回収した。
を各１０ユニフトの制限酵素ＢａｍＨＩＩ 、ＨｐａＩ
（ともに日本ゾーン社製）を含むハイ・バッファー５
ｏμを中にて、３７℃１時間反応させ切断した。これを
フェノール・クロロホルム処理し、エタノール沈Ｍして
ＰＬ７’ロモーターを含むＤＮＡ断片を回収した。
切断したｐＫＳ ３ 、 Ｐ Ｌプロモーターを含む断
片をそれぞれ１ｏμｔのＴＥに溶かし、それぞれ３．５
μｔを混合し、ライダージョン・キット（宝酒造社製）
１ｃ用いて結合した。これで大腸菌（ＨＢＩＯＩ株）を
形質転換した。得られた形質転換体よシブラスミドＤＮ
Ａを精製し、ｐＫＳ３にＰＬプロモーターが挿入された
ｐＳＨ４を得た。
片をそれぞれ１ｏμｔのＴＥに溶かし、それぞれ３．５
μｔを混合し、ライダージョン・キット（宝酒造社製）
１ｃ用いて結合した。これで大腸菌（ＨＢＩＯＩ株）を
形質転換した。得られた形質転換体よシブラスミドＤＮ
Ａを精製し、ｐＫＳ３にＰＬプロモーターが挿入された
ｐＳＨ４を得た。
λフアージ（λ、 ｃｒ８５７ 、 Ｓａｍ７ ） Ｄ
ＮＡ （宝酒造社製）２μｇを各１０ユニツトの制限酵
素Ｂｇｌｌ［（日本ジーン社製） 、 Ｂａｎ１ｌｌ
（東洋紡績社製）を含む５０μｔのハイ・バッファー中
で、３７℃２時間反応させ切断した。これをフェノール
・り゛ｂロホルム処理し、エタノール沈澱し１分解した
ＤＮＡ断片を回収した。
ＮＡ （宝酒造社製）２μｇを各１０ユニツトの制限酵
素Ｂｇｌｌ［（日本ジーン社製） 、 Ｂａｎ１ｌｌ
（東洋紡績社製）を含む５０μｔのハイ・バッファー中
で、３７℃２時間反応させ切断した。これをフェノール
・り゛ｂロホルム処理し、エタノール沈澱し１分解した
ＤＮＡ断片を回収した。
他方、１μｇのプラスミドＰＨ８Ｇ ３９７ （宝ｍ造
社製）を各ｌＯユニットの制限酵素ＢａｍＨＩ （日本
ジーン社製） 、 Ｂａｎ１ｌｌ （東洋貿易社製）を
含む５゜μｔのハイ・バッファー中で３７℃１時間反応
させ切断した。これに２μｔ（１−二ｙト）のアルカリ
・ホスファターゼ（東洋紡績社製）を加え６０’０３０
分反応させ、５°末端のリン酸を脱リン酸化した。その
後、フェノール・クロロホルム処理し、エタノール沈澱
しＤＮＡ ’ｉ回収した。
社製）を各ｌＯユニットの制限酵素ＢａｍＨＩ （日本
ジーン社製） 、 Ｂａｎ１ｌｌ （東洋貿易社製）を
含む５゜μｔのハイ・バッファー中で３７℃１時間反応
させ切断した。これに２μｔ（１−二ｙト）のアルカリ
・ホスファターゼ（東洋紡績社製）を加え６０’０３０
分反応させ、５°末端のリン酸を脱リン酸化した。その
後、フェノール・クロロホルム処理し、エタノール沈澱
しＤＮＡ ’ｉ回収した。
λフアージＤＮＡ分解物、ｐＨ５Ｇ３９７分解物のそれ
ぞπモ１０μｔのＴＥに溶解し、その３．５μｔｆ混合
し、ライダージョン・キット（宝酒造社）を用いて、１
０℃２時間反応させ、これを結合した。これで大腸菌（
Ｈ８１０１株）を形質転換し、得られた形質転換体から
プラスミドＤＮＡ ’ｉ精製し、ｐＨ５Ｇ３９７にｃＩ
８５７遺伝子領域を含む約１１００塩基対のＢｇｌｌ
−Ｂａｎ１Ｉ［断片が挿入されたグラスミドｐＨ８Ｇｃ
Ｉ８５７を得た。
ぞπモ１０μｔのＴＥに溶解し、その３．５μｔｆ混合
し、ライダージョン・キット（宝酒造社）を用いて、１
０℃２時間反応させ、これを結合した。これで大腸菌（
Ｈ８１０１株）を形質転換し、得られた形質転換体から
プラスミドＤＮＡ ’ｉ精製し、ｐＨ５Ｇ３９７にｃＩ
８５７遺伝子領域を含む約１１００塩基対のＢｇｌｌ
−Ｂａｎ１Ｉ［断片が挿入されたグラスミドｐＨ８Ｇｃ
Ｉ８５７を得た。
ｐｓＨ４にｅＩ８５７遺伝子を挿入する工程２ ｐＨの
ｐＨ３Ｇｅ１８５７を１０ユニツトの制限酵素ｘｈｏ［
（日本ター／社製）、ＢａｎｊＩ！（東洋＃積社製）を
有するハイ・バッファー５０μＬ中で３７℃ｉ時間反応
させ切断した。これ金フェノール・クロロホルム処理し
、エタノール沈澱し、ＤＮＡ ’ｉ回収した。このＤＮ
Ａ ｉ ２ ：３−ニットのフレノウ・フラグメ／トヲ
含む２５μＬのフレノウ溶液中で２２℃３０分間反応さ
せ、粘着末端を平滑末端とした。反応液を７０℃で５分
間加熱したのち、フェノール・クロロホルム処理し、エ
タノール沈奴金してＤＮＡを回収した。
ｐＨ３Ｇｅ１８５７を１０ユニツトの制限酵素ｘｈｏ［
（日本ター／社製）、ＢａｎｊＩ！（東洋＃積社製）を
有するハイ・バッファー５０μＬ中で３７℃ｉ時間反応
させ切断した。これ金フェノール・クロロホルム処理し
、エタノール沈澱し、ＤＮＡ ’ｉ回収した。このＤＮ
Ａ ｉ ２ ：３−ニットのフレノウ・フラグメ／トヲ
含む２５μＬのフレノウ溶液中で２２℃３０分間反応さ
せ、粘着末端を平滑末端とした。反応液を７０℃で５分
間加熱したのち、フェノール・クロロホルム処理し、エ
タノール沈奴金してＤＮＡを回収した。
１μｇのｐＳＨ４ｔ” １０ ”＝ ットの制限酵素Ｂ
ａｍＨｌ（日本ゾーン社製）を含む５０μ乙の７・イ・
・９ツフアー中で３７℃１時間反応させ切断した。これ
ｔ。
ａｍＨｌ（日本ゾーン社製）を含む５０μ乙の７・イ・
・９ツフアー中で３７℃１時間反応させ切断した。これ
ｔ。
７五ノ一ル台クロロホルム処ＷＬ、エタノール沈澱して
ＤＮＡ ’ｉ回収した。ＤＮＡを２ユニツトのフレノウ
・フラグメントを含む２５μｔのフレノウ溶液で２２℃
３０分反応させ、粘着末端金平滑末端にした。反応液を
７０℃で５分加熱したのち、フェノール翻クロロホルム
処理し、エタノール沈澱してＤＮＡを回収した。
ＤＮＡ ’ｉ回収した。ＤＮＡを２ユニツトのフレノウ
・フラグメントを含む２５μｔのフレノウ溶液で２２℃
３０分反応させ、粘着末端金平滑末端にした。反応液を
７０℃で５分加熱したのち、フェノール翻クロロホルム
処理し、エタノール沈澱してＤＮＡを回収した。
得られたｅ ｒ８５７遺伝子を含む断片と、切断された
ｐＳＨ４断片の沈澱を１０μｔのＴＥに溶解し、それぞ
れ３．５μｔを混合した。これをライダーシー１ノ・キ
ット（宝酒造社製）を用い１０℃２時間反応させ結合さ
せた。これで大腸菌（Ｈ８１０１株）を形質転換し、得
られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製し、ｐＳ
Ｈ４にｅ１８５７遺伝子が挿入された！ラスミドｐＳＨ
５ｆ、得た。
ｐＳＨ４断片の沈澱を１０μｔのＴＥに溶解し、それぞ
れ３．５μｔを混合した。これをライダーシー１ノ・キ
ット（宝酒造社製）を用い１０℃２時間反応させ結合さ
せた。これで大腸菌（Ｈ８１０１株）を形質転換し、得
られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製し、ｐＳ
Ｈ４にｅ１８５７遺伝子が挿入された！ラスミドｐＳＨ
５ｆ、得た。
ｐＳＨ５に全合成ＭＡＰ遺伝子を挿入する工程２μｇ
（７） ｐＳＨ５並びに２μｇのＰＭＨＩ （全合成風
Ｐ遺伝子をグラスミドｐＵｃ１９に組み込んだ合成グラ
スミド：特願昭（５３−９３４９４）を各々１０ユニツ
トの制限酵素ｘｂ耐（日本ジーン社製）、およびＢａｎ
Ｉ［Ｉ （東洋紡績社製）を含む５０μｔのハイ・バッ
ファー中で３７℃１時間反応させ切断した。これをフェ
ノールかクロロホルム処理し、エタノール沈澱しＤＮＡ
を回収した。
（７） ｐＳＨ５並びに２μｇのＰＭＨＩ （全合成風
Ｐ遺伝子をグラスミドｐＵｃ１９に組み込んだ合成グラ
スミド：特願昭（５３−９３４９４）を各々１０ユニツ
トの制限酵素ｘｂ耐（日本ジーン社製）、およびＢａｎ
Ｉ［Ｉ （東洋紡績社製）を含む５０μｔのハイ・バッ
ファー中で３７℃１時間反応させ切断した。これをフェ
ノールかクロロホルム処理し、エタノール沈澱しＤＮＡ
を回収した。
これらをそれぞれ１０μｔのＴＥに溶解し、その３３５
μｔを混合しライｒ−ショ／・キット（宝酒透社製）を
用いて１０℃１時間反応させ結合させた。
μｔを混合しライｒ−ショ／・キット（宝酒透社製）を
用いて１０℃１時間反応させ結合させた。
これで大腸菌（Ｎ９９ｅｌ十株）を形質転換した。
形質転換体からプラスミドＤＮＡ ｉ精製し、ｐＳＨ５
に全合成ＭＡＰ遺伝子のｘｂａ［とＢａｎ１ｌで切り出
された断片が挿入したグラスミドｐＳＨ６’ｉ得た。
に全合成ＭＡＰ遺伝子のｘｂａ［とＢａｎ１ｌで切り出
された断片が挿入したグラスミドｐＳＨ６’ｉ得た。
ｐＳＨ６に０ｒｎｐＡのシグナル配列遺伝子を挿入する
工程 ０２Ｉ 第■４に示すような２本の相補的ＤＮＡ断片の一本領ｆ
ｃＤＮＡ合成機（アゲライド・バイオシステムズ・ジャ
パン社製３８１Ａｉ）’ｉ使用し、ホスホロアミダイト
法にて合成した。この各々１μｇ 金１０−１−ニット
のＴ４キナーゼ（東洋紡績社製）を含む５０μ６のキナ
ーゼ溶液中で３７℃土時間反応させ、５”末端にリン酸
を付加した。これら２本の一本鎖ＤＮＡの相補鎖を含む
反応液を混合し、６０℃で２０分間加温し、続いて室温
で２０分間放置してアニールすることにより、二本鎖Ｄ
ＮＡとした。これをエタノール沈澱した後、１０μｔの
ＴＥに溶解した。
工程 ０２Ｉ 第■４に示すような２本の相補的ＤＮＡ断片の一本領ｆ
ｃＤＮＡ合成機（アゲライド・バイオシステムズ・ジャ
パン社製３８１Ａｉ）’ｉ使用し、ホスホロアミダイト
法にて合成した。この各々１μｇ 金１０−１−ニット
のＴ４キナーゼ（東洋紡績社製）を含む５０μ６のキナ
ーゼ溶液中で３７℃土時間反応させ、５”末端にリン酸
を付加した。これら２本の一本鎖ＤＮＡの相補鎖を含む
反応液を混合し、６０℃で２０分間加温し、続いて室温
で２０分間放置してアニールすることにより、二本鎖Ｄ
ＮＡとした。これをエタノール沈澱した後、１０μｔの
ＴＥに溶解した。
他方１μｇのｐＳＨＳを１０．２−ニットの制限酵素Ｎ
ｄａｌ 、 ｘｂａｌ （どちらも日本・ゾーン社製）
を含んだ５０μｔのハイバッファー中で３７℃１時間反
応させ切断した。これをフェノール・クロロホルム処理
し、■タノール沈澱した後、１０μｔのＴＥに溶解した
。
ｄａｌ 、 ｘｂａｌ （どちらも日本・ゾーン社製）
を含んだ５０μｔのハイバッファー中で３７℃１時間反
応させ切断した。これをフェノール・クロロホルム処理
し、■タノール沈澱した後、１０μｔのＴＥに溶解した
。
アニールした合成りＮＡ溶液ε切断したｐＳＨ６の溶液
をそれぞれ３．５μを混合しライダージョン・キット（
霊酒造社製）を用いて１０℃２時間反応させ結合させ、
これ金大腸菌（Ｎ９９（！Ｉ十株）に形質転振した。こ
の形質転換体からグラスミドＤＮＡ 金精製し、ｐＳＩ
（６にＯｍｐＡのシグナル配列の遺伝子が挿入されたグ
ラスミドｐＳＨ７’に得た。
をそれぞれ３．５μを混合しライダージョン・キット（
霊酒造社製）を用いて１０℃２時間反応させ結合させ、
これ金大腸菌（Ｎ９９（！Ｉ十株）に形質転振した。こ
の形質転換体からグラスミドＤＮＡ 金精製し、ｐＳＩ
（６にＯｍｐＡのシグナル配列の遺伝子が挿入されたグ
ラスミドｐＳＨ７’に得た。
ｐｓＨ６７ζ大腸菌（ＭＭ２９４株）を形質転換し、そ
の形質転換体を得た。これに５０℃ｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む５ ｍｔのＬＢ培地（１％パクト・トリプト
ン、０．５％パクト・イースト・エクストラクト、１％
塩化ナトリウム、０．１％ブドウ糖）で好気的条件下３
０″Ｃ１晩しんとう培養した。この培養液を５０μｇ／
ｍｌのアンピシリン並びに４μｇ／ｍｌの塩酸チアミン
を含むＭ９ＣＡ培地（６ｇ／を燐酸２ナトリウム、３ｇ
／′を燐酸１カリウム、 Ｑ、 ５ ｇ／４塩化ナトツ
ナトリウム／４塩化アンモニウム、２ｍＢｆｌ硫酸マグ
ネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム％２ｇ／４ブドウ
糖）に最終濃度１％になるように加え、好気的条件下３
０℃でしんとう培養した。このときこの大腸菌形質転換
体の増殖速度は、ＭＡＰ遺伝子を有していないプラス□
ドｐｓＨ５の大ｋＭｃＭＭ２９４株）形質転換体の速度
とほぼ向じてあった。
の形質転換体を得た。これに５０℃ｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む５ ｍｔのＬＢ培地（１％パクト・トリプト
ン、０．５％パクト・イースト・エクストラクト、１％
塩化ナトリウム、０．１％ブドウ糖）で好気的条件下３
０″Ｃ１晩しんとう培養した。この培養液を５０μｇ／
ｍｌのアンピシリン並びに４μｇ／ｍｌの塩酸チアミン
を含むＭ９ＣＡ培地（６ｇ／を燐酸２ナトリウム、３ｇ
／′を燐酸１カリウム、 Ｑ、 ５ ｇ／４塩化ナトツ
ナトリウム／４塩化アンモニウム、２ｍＢｆｌ硫酸マグ
ネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム％２ｇ／４ブドウ
糖）に最終濃度１％になるように加え、好気的条件下３
０℃でしんとう培養した。このときこの大腸菌形質転換
体の増殖速度は、ＭＡＰ遺伝子を有していないプラス□
ドｐｓＨ５の大ｋＭｃＭＭ２９４株）形質転換体の速度
とほぼ向じてあった。
このことからこのプラスミドｐＳＨ６は大腸口の増殖に
影響を与えないことが判明した。
影響を与えないことが判明した。
培養液の５５０ｎｍＫ：Ｔｈける吸光度が０．８となっ
た時、あらかじめ５５℃に加温して釦いた培養液と等量
のＭ９ＣＡ培地を加え脚の生産を促した。
た時、あらかじめ５５℃に加温して釦いた培養液と等量
のＭ９ＣＡ培地を加え脚の生産を促した。
その後さらに４２℃で好気的条件下しんとぅ培養しＭＡ
Ｐを蓄積させた。
Ｐを蓄積させた。
菌を遠心分離して集め培養液と当量の０．９％塩化ナト
リウム水溶液に懸濁した。さらに、これを遠心分離し、
再び当量の０．９％塩化ナトリウム水溶液に懸濁した。
リウム水溶液に懸濁した。さらに、これを遠心分離し、
再び当量の０．９％塩化ナトリウム水溶液に懸濁した。
この懸濁液を超音波破砕機を用いて菌を破砕した。この
すｙ ｆ ／Ｉ／１−ＥＬＩＩＡ法によって定量したと
ころＭＡＰが２０℃ｇ／Ｌ生産されていることがわかっ
た。
すｙ ｆ ／Ｉ／１−ＥＬＩＩＡ法によって定量したと
ころＭＡＰが２０℃ｇ／Ｌ生産されていることがわかっ
た。
プラスミドｐＳＨ７で形質転換した大腸菌を用いたＭＡ
Ｐの発現ｐＳＨ７で大腸Ｍ（ＭＭ２９４株）を形質転換
し、その形質転換体を得た。これを５０℃ｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含む５ ｍｌのＬＢ培地（１９ｂダクト・
トリプトン、０．５％パクト・イースト・エクストラク
ト、１％塩化ナトリウム、０．１優ブドウ糖）で好気的
条件下３０℃１晩しんとう培養した。この培養液ｔ″５
０μｇ ／ ｍｔのアンピシリン並びに４μｇ／ｍｌの
塩酸チアミンを含むＭ９ＣＡ培地（６ｇＡ燐酸２ナトリ
ウム、 ３ｇ、４燐酸１カリウム、０．５ ｇ／を塩化
ナトリウム、 Ｉｇ／ｚ塩イはンモニウム、２ｍＭ硫酸
マグネシウム、ｏ、 １ｍＭ 塩化刃ルシウム−２ｖ’
ｔブドウ糖）に最終濃度１％になるように加え、好気的
条件下３０℃でしんとう培養した。このときこの大腸菌
形質転換体の増殖速度は、ＭＡＰ遺伝子を有していない
グラスミドｐｓＨ５の大腸菌（ＭＭ２９４株）形質転換
体の速度とほぼ同じであった。
Ｐの発現ｐＳＨ７で大腸Ｍ（ＭＭ２９４株）を形質転換
し、その形質転換体を得た。これを５０℃ｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含む５ ｍｌのＬＢ培地（１９ｂダクト・
トリプトン、０．５％パクト・イースト・エクストラク
ト、１％塩化ナトリウム、０．１優ブドウ糖）で好気的
条件下３０℃１晩しんとう培養した。この培養液ｔ″５
０μｇ ／ ｍｔのアンピシリン並びに４μｇ／ｍｌの
塩酸チアミンを含むＭ９ＣＡ培地（６ｇＡ燐酸２ナトリ
ウム、 ３ｇ、４燐酸１カリウム、０．５ ｇ／を塩化
ナトリウム、 Ｉｇ／ｚ塩イはンモニウム、２ｍＭ硫酸
マグネシウム、ｏ、 １ｍＭ 塩化刃ルシウム−２ｖ’
ｔブドウ糖）に最終濃度１％になるように加え、好気的
条件下３０℃でしんとう培養した。このときこの大腸菌
形質転換体の増殖速度は、ＭＡＰ遺伝子を有していない
グラスミドｐｓＨ５の大腸菌（ＭＭ２９４株）形質転換
体の速度とほぼ同じであった。
このことからこのプラスミドｐｓＨ７は大腸菌の増殖に
影響を与えないことが判明した。
影響を与えないことが判明した。
培養液の５５０ｎｍにかける吸光度が０．８となった時
、あらかじめ５５℃に加温して釦いた培養液と等量のＭ
９ＣＡ培地を加え帖の生産を促した。
、あらかじめ５５℃に加温して釦いた培養液と等量のＭ
９ＣＡ培地を加え帖の生産を促した。
その後さらに４２℃で好気的条件下しんとう培養し、培
地中にＭＡＰを蓄積させた。
地中にＭＡＰを蓄積させた。
曹を遠心分離して集めこれを除き、残シの培養液を水に
透析、これｔ抗ＭＡＰ抗体を利用した免疫学的お折（Ｅ
ＬＩＩＡ）１行、えと。う１．４外培。
透析、これｔ抗ＭＡＰ抗体を利用した免疫学的お折（Ｅ
ＬＩＩＡ）１行、えと。う１．４外培。
液中に２００μｇ／Ｌ ＯＭＡＰが生産されていること
がわかった。またウェスタン・プロッティング法による
分析にかいてもＭＡＰと同じ分子量のタフノック質が検
出された。
がわかった。またウェスタン・プロッティング法による
分析にかいてもＭＡＰと同じ分子量のタフノック質が検
出された。
［発明の効果］
以上詳述したように１本発明によれば大腸菌の生育を妨
げることがなく、筐た確実に外来の遺伝子を発現させ、
さらにその遺伝子産物を蓄積することが可能な大腸菌発
現ベクターを得ることができる。またこれにより大腸菌
によってＭＡＰ を分泌生産させることも可能となシ、
顕著な効果を得ることができる。
げることがなく、筐た確実に外来の遺伝子を発現させ、
さらにその遺伝子産物を蓄積することが可能な大腸菌発
現ベクターを得ることができる。またこれにより大腸菌
によってＭＡＰ を分泌生産させることも可能となシ、
顕著な効果を得ることができる。
第１図は、 ＯｍｐＡのシグナル配列と、これをコード
する遺伝子の塩基配列を示した図、第２図は。 ＭＡＰをコードする合成遺伝子の塩基配列を示した図、
第３図は１合成りＮＡ ９７カーの塩基配列を示した図
、第４図は、実施例にかけるＭＡＰ遺伝子およびシグナ
ル配列を含むＤＮＡペク、ターの構築プロセスを示した
図。 出 願人 日本たばこ産業株式会社 第４ 図 （吃の１） １１４ 図（（ｎ２）
する遺伝子の塩基配列を示した図、第２図は。 ＭＡＰをコードする合成遺伝子の塩基配列を示した図、
第３図は１合成りＮＡ ９７カーの塩基配列を示した図
、第４図は、実施例にかけるＭＡＰ遺伝子およびシグナ
ル配列を含むＤＮＡペク、ターの構築プロセスを示した
図。 出 願人 日本たばこ産業株式会社 第４ 図 （吃の１） １１４ 図（（ｎ２）
Claims (5)
- （１）第１図に示す塩基配列を有するＯｍｐＡシグナル
配列をコードする遺伝子を、第２図に示す塩基配列を有
する遺伝子の上流側に結合させた遺伝子。 - （２）大腸菌の発現系を有するプラスミドに、請求項１
の遺伝子を組み込んだ組換えプラスミド。 - （３）大腸菌ラムダファージ由来のＰ＿Ｌプロモーター
、ｃＩ８５７リプレッサー遺伝子を有することを特長と
する大腸菌発現ベクターに、請求項１の遺伝子を大腸菌
内で発現する形で組み込んだ組換えプラスミド。 - （４）請求項２または請求項３のプラスミドを組み込ん
だ大腸菌形質転換体。 - （５）請求項４の大腸菌形質転換体を培養することによ
り請求項１の遺伝子を発現させ、産生されたＭＡＰを分
離・精製することを特徴とするＭＡＰの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1210767A JPH0376580A (ja) | 1989-08-17 | 1989-08-17 | 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法 |
| DE69013811T DE69013811T2 (de) | 1989-08-17 | 1990-08-16 | Verfahren zur Herstellung von antiviralem Protein unter Benützung von E.coli-Transformant, das Gen, das für dieses Protein kodiert und E.coli-Vektor benützt in diesem Verfahren. |
| EP90115718A EP0414134B1 (en) | 1989-08-17 | 1990-08-16 | Method for producing antiviral protein utilizing E.coli transformant, and gene and E.coli vector used in the method |
| US07/958,452 US5318900A (en) | 1989-08-17 | 1992-10-07 | Method for producing antiviral protein utilizing E. coli transformant, and gene and E. coli vector used in the method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1210767A JPH0376580A (ja) | 1989-08-17 | 1989-08-17 | 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0376580A true JPH0376580A (ja) | 1991-04-02 |
Family
ID=16594795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1210767A Pending JPH0376580A (ja) | 1989-08-17 | 1989-08-17 | 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5318900A (ja) |
| EP (1) | EP0414134B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0376580A (ja) |
| DE (1) | DE69013811T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340732A (en) * | 1991-03-22 | 1994-08-23 | Japan Tobacco, Inc. | Antiviral protein |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05219963A (ja) * | 1990-07-18 | 1993-08-31 | Applied Immune Sci Inc | 温度誘導分泌発現ベクターおよびその原核細胞での使用 |
| US5512463A (en) * | 1991-04-26 | 1996-04-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic inverse polymerase chain reaction library mutagenesis |
| WO1993012257A1 (en) * | 1991-12-12 | 1993-06-24 | Hybritech Incorporated | Enzymatic inverse polymerase chain reaction library mutagenesis |
| EP0628634A3 (en) * | 1993-05-25 | 1995-09-06 | Lilly Co Eli | Process for the preparation of serine hydromethyltransferase. |
| GB9519299D0 (en) | 1995-09-21 | 1995-11-22 | Farrar Gwyneth J | Genetic strategy |
| US8551970B2 (en) | 1996-04-02 | 2013-10-08 | Optigen Patents Limited | Genetic suppression and replacement |
| GB9606961D0 (en) | 1996-04-02 | 1996-06-05 | Farrar Gwyneth J | Genetic strategy III |
| CN1253551C (zh) * | 1997-09-10 | 2006-04-26 | 维昂药品公司 | 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌 |
| US6080849A (en) * | 1997-09-10 | 2000-06-27 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
| US6962696B1 (en) * | 1999-10-04 | 2005-11-08 | Vion Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules |
| US20080124355A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
| US8241623B1 (en) | 2009-02-09 | 2012-08-14 | David Bermudes | Protease sensitivity expression system |
| US8771669B1 (en) | 2010-02-09 | 2014-07-08 | David Gordon Bermudes | Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria |
| US8524220B1 (en) | 2010-02-09 | 2013-09-03 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria |
| US9597379B1 (en) | 2010-02-09 | 2017-03-21 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies |
| US9593339B1 (en) | 2013-02-14 | 2017-03-14 | David Gordon Bermudes | Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment |
| US10676723B2 (en) | 2015-05-11 | 2020-06-09 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4757013A (en) * | 1983-07-25 | 1988-07-12 | The Research Foundation Of State University Of New York | Cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
| JPS63102695A (ja) * | 1986-10-20 | 1988-05-07 | Chisso Corp | 大腸菌の菌体外分泌ベクタ−を用いる発光蛋白エクオリンの製造法 |
| EP0314184B1 (en) * | 1987-10-30 | 1995-12-13 | Bristol-Myers Squibb Company | Expression plasmids |
-
1989
- 1989-08-17 JP JP1210767A patent/JPH0376580A/ja active Pending
-
1990
- 1990-08-16 DE DE69013811T patent/DE69013811T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-16 EP EP90115718A patent/EP0414134B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-10-07 US US07/958,452 patent/US5318900A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340732A (en) * | 1991-03-22 | 1994-08-23 | Japan Tobacco, Inc. | Antiviral protein |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5318900A (en) | 1994-06-07 |
| DE69013811T2 (de) | 1995-06-14 |
| EP0414134B1 (en) | 1994-11-02 |
| DE69013811D1 (de) | 1994-12-08 |
| EP0414134A1 (en) | 1991-02-27 |
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