JPH04507108A - 安定化されたヘパリン溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 安定化されたヘパリン溶液 ｍ鳳二夏豊皿 この出願は、１９８８年２月１８日に出願された米国特許出願第１５７．５４７ 号の一部継続である。

艮五立互 Ｒｏｃｋの米国特許第４，３５９，４６３号には、カルシウムをキレートする抗 凝固剤（例えばＣＰＤまたはＡＣＤ）中に採取した血液中に通常存在する初期第 ■因子活性は、新たに採取した血液または血漿をカルシウムを実質上正常な生理 的レベルへ回復するのに十分な量のカルシウム−ヘパリン溶液と混合することに よって維持し得る方法が記載されている。

潰れ得るプラスチック容器中に貯蔵のためのヘパリン含有溶液は典型的にはリン 酸塩、例えばリン酸モノナトリウムで緩衝化される。

このため安定なカルシウム−ヘパリン溶液を提供しようとしてカルシウムイオン をそのようなヘパリン溶液へ添加するときは困難に遭遇する。そのような状況に おいてはリン酸カルシウムが容易に沈澱する。

しかしながらヘパリンは溶液中で安定化するためには緩衝化しなければならない 。特にヘパリンはヘパリン活性の不当な損失なしに熱滅菌およびパスツール化サ イクルに耐えるため緩衝化しなければならない。これは採取した血液または血漿 へ安全に投与することができる無菌ヘパリン溶液を提供するための先行ステップ として勿論必要である。

血液または血漿中の第■因子活性に対するヘパリンおよびカルシウムの影響を論 じた他の参照文献は、ＭＯｒｇｅｎｔｈａ　１ｅｒｅｔ　ａｌ、、”Ｉｎｆｌｕ ｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ａｎｄ　Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ 　ｏｎ　Ａｓ５ａｙ、５ｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｖｅｒ　ｏｆ　Ｆ ａｃｔｏｒ■”Ｖｏｘ　Σｌｌ■、４８　、　８−１７　（１９８５）　、およ びＲｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、”５ｒａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　■：ｃｉｎ　Ｐｌａ ｓｍａ：Ｔｈｅ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｐｒ。

ｔｅａｓｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　Ｃａｌｃｉｕｍ”Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　２９．５２１−５３５（１９８３）の論文を含む。

主発里Ω脱皿 本発明により、血液から第■因子の採取の収量および他のプロセスパラメータの 改良に使用のため、熱滅菌し得る安定なカルシウムおよびヘパリン水溶液を提供 することができる。該溶液は典型的には存在する溶液ｉあたリヘバリン、好まし くはヘパリンナトリウム５ないし１００ＯＵＳＰ単位と、そのような溶液！あた り乳酸カルシウム１０ないし２５０ミリモルを含む。これらの溶質は、カルシウ ムイオンが血液または血漿へ添加される時凝固阻害するのに十分なヘパリンが存 在する溶液へ好ましくは完全に溶解される。

存在する乳酸カルシウムは二重の作用を発揮することが判明した。

第１に、それはヘパリンに対する改良された安定剤であり、そのためそのような 溶液は慣用の滅菌サイクルのもとで熱滅菌し、そしてより少ないヘパリン活性の 損失をもって貯蔵することができる。特に、該溶液は６ケ月以上、または昇温下 ３ケ月以上多量のヘパリン損失なしに貯蔵することができる。６？Ｍ液は非毒性 であり、そして血液から治療用投与形態において第■因子を単離するための既知 の慣用プロセスにおいて改良された収量および他の改良を提供するために有用で ある。そのような治療用投与形態の製造は今日の商業的活動であり、そして良く 知られたプロセスである。Ｅあたりたった約５０ミリモルまたはそれ以下の乳酸 カルシウムの濃度はヘパリンへ良好な安定性を与えるが、第■因子を単離しそし てそれを投与形態へ転換するプロセスに使用されたカルシウム−ヘパリン溶液が ！あたり乳酸カルシウムを好ましくは１００−２５０ミリモル、しかし典型的に は！あたり約２００ミリモル未満を含有する時最善の第■：Ｃ因子収量改善が得 られることがわかった。

典型的には、本発明の溶液は、もしヘパリンの安定化が主な関心であれば、！あ たり乳酸カルシウム約１５ないし５０ミリモルを含有する。さもなければ！あた り乳酸カルシウム約５０ミリモル以上が第■：Ｃ因子収量を増加するために存在 しなければならない。また、溶液は−あたりヘパリン約２５ないし２００ＵＳＰ 単位を典型的に含有する。本発明に従ったヘパリン濃度は、ＵＳＰ公定書第２１ 巻第４８１および４８２頁に一般的に記載されているヘパリンナトリウムについ てのＵＳＰアッセイに従ってアンセイすることができる。このアッセイ方法は、 より大きい精度のため凝固程度の目視測定によるのではなく利用し得る凝固時間 装置において凝固時間を測定することによって改変することができる。本明細書 のデータはそのような改変法によって集めた。

本発明の溶液を使用のため、新たに採取した血液、または好ましくは新たに分離 した血漿（任意の慣用の手段で分離した）、例えばバクスター、トラヘノール、 ラボラトリーズ、インコーホレイテッドのフェンウオール部門によって販売され ているオートフエレーシスＣユニットを使用するプラズマフエレーシスによって 分離した血漿へ溶液を加えることができる。血液または血漿１単位あたり、本発 明の溶液２０ないし５０ｄを加えることができる。血漿１単位は体積約６００ｄ である。典型的にはこの添加ステップは、もとの血液採取プロセスからＡＣＤま たはＣＰＤのような抗凝固剤を含んでいる血漿を別々の単位へ分離直後に実施す ることができる。実質量の血漿が別々の血漿容器へ入った後本発明の溶液の添加 は、時々ある量の凝固を開始し得る血漿の当初分量が本発明の溶液の過剰濃度を 感知することを防止する。

血漿を所望量（例えば血漿１単位あたり溶液４０ｄ）の溶液と混合した後、得ら れる血漿−溶液混合物は、米国特許第３，６５２゜５３０号または第３，６３１ ，０８１号に記載されている、またはＲｏｃｋの米国特許第４．２０３，８９１ 号に記載されているような慣用窓性沈澱プロセスによって処理することができる 。本発明の溶液は溶液中のヘパリンの安定化に有意な利益を発揮するばかりでな く、治療用の抗血友病因子の単離のための多数の慣用プロセスにおいて臨床的に 使用し得る抗血友病因子（第■：Ｃ因子）の改良された収量を提供する。乳酸イ オンは一部の腹膜透析液および静脈内ｑ＃液（例えば乳酸塩添加リンゲル液）に 使用され、乳酸カルシウムはある種のプロスタグランジン組成物の安定剤として 既知（英国特許第１，５８２，１６２号）であるが、乳酸カルシウムは溶液中の ヘパリンに対する安定剤として明らかに使用されたことはなかった。

先行技術のヘパリン溶液は本発明の？ｇ　？＆よりも耐熱性および／またはシェ ルフライフにおいて安定でなく、そのため本発明の利益は以前には容易に得られ なかった。

本発明を例証するため、以下の実施例を記載する。

実施例１ 水５２ヘヘパリンナトリウム２．０７ｇ　（３０ｄあたり１８４ＩＵＳＰ）およ び塩化ナトリウム４５ｇを添加する。この溶液Ｉｌづつの３分量を以後の処理の ために分けた。１番目の１４２分量（溶液１）へ塩化カルシウム−水塩２．９４ ｇと、ｐＨを８．５へ調節するのに十分な水酸化ナトリウム溶液を加えた。２番 目の１１分量（溶液２）へはグルコン酸カルシウム−水塩８．９７ｇを加えた。

３番目の】１ｆ４液分量（溶液３）へ乳酸カルシウム五水塩６．１７ｇを加えた 。溶液１〜３のめいめいはこのため２あたりカルシウムを実質上２０ｍＭ含んで いた。

溶液１〜３の源から、主血液採取バッグ（ハクスター、インターナショナル、イ ンコーホレイテッドのフェンウオール部門）が多数のそのようなハングを提供す るように前記溶液の一つの３０蔵で各１満たされた。ハングの一部は慣用の滅菌 サイクル（１１５〜１２０″Ｃ１５０〜７５分）で滅菌された。ハングは貯蔵の ためアルミ箔でポーチされ、上に述べたアッセイ方法に従ってヘパリンの定量前 に９６°Ｃで１７０分間パスツール化された。

もとのバルク５１ヘパリン溶液は滅菌前ｒｚｌあたりヘパリン約６１．４ＵＳＰ を示した。

溶液１に関し、非滅菌溶液はｐＨ６，４０を有したが、滅菌した溶液はｐＨ４， ４４を有し、ｍ！あたりヘパリン約５８．６ＵＳＰ単位とアッセイされた。

溶Ｈ，２に関し、非滅菌溶液はｐＨ６，４２を有したが、滅菌した溶液はｐＨ４ ，４４を有し、ｄあたりヘパリン約５１．５ＵＳＰ単位とアッセイされた。

乳酸カルシウムを含む溶液３に関し、非滅菌溶液はｐＨ６，８５を有したが、滅 菌した溶液はＰＨ５，６１を有し、ｄあたりヘパリン６０．４ＵＰＳ単位とアッ セイされた。

このように、溶液３のヘパリン含量およびｐＨは、存在する活性ヘパリンの濃度 およびＰＨの有意な減少を防止し得なかった溶液１および２の結果に比較して、 滅菌プロセスを通じて保存された。

実施例２ （Ａ）上の実施例１に記載した溶液３のサンプルを前記したタイプのシールした 箔で包んだ血液バッグ中で室温で６ケ月貯蔵した。当初、滅菌した溶液ｄあたり ヘパリン約６０．４ＵＳＰ単位とアッセイされ、そしてｐＨ５，６１を有してい た。６ケ月の終りにおいて、溶液はｄあたりヘパリン約５８．．６ＵＳＰ単位と アッセイされ、そしてｐＨ５，４６を有していた。

（Ｂ）上の実施例１のように調製した溶液３の他の容器を４５゛Ｃにおいて３ケ 月貯蔵した。当初、容器はｄあたりヘパリン約６０．４ＵＳＰ単位とアッセイさ れ、ｐＨ約５，６１を有していた。３ケ月貯蔵後、容器はｄあたり・＼バリン約 ６２．２単位とアッセイされ（増加は明らかにアッセイ操作の実験誤差のためで ある）、そしてｐＨ５，３５を示した。

上昇温度においてさえも、ヘパリンまたはｐＨの劣化は貯蔵中受ししかまたは全 く生起しないことがわかる。

（Ｃ）上の実施例１のように調製した溶液３の他の滅菌サンプルは当初実施例２ （Ａ）に述べたヘパリンアッセイおよびｐＨを有していた。４５°Ｃにおいて１ ケ月貯蔵後、ヘパリンアッセイは戚あたり約６１．９８単位であり、そして溶液 はｐＨ５，４９を有し、ヘパリン含量またはｐＨの実質上皆無の劣化を示した。

反対に、同様に処理したバッグ入り溶液１のサンプルは、−あたり約６１．６Ｕ ＳＰ単位のヘパリンアッセイを示した。滅ｚ後、該溶液は−あたり約５６．４Ｕ ＳＰ単位のヘパリンアッセイを示した。このように、溶液１のシェルフライフは 溶液３のシェルフライフよりかなり短かいことがわかる。

実施例３ 血液ドナーからの血漿１単位をクエン酸ナトリウム抗凝固剤を使用してオートフ ェレーシスー〇商標機械（バクスター、インターナショナル）により全血から分 離した。

以下のように４種の異なる溶液を調製した。

溶液工：塩化カルシウム溶液（３ｍＭ）溶液２：ヘパリンナトリウム６０１　Ｕ ／ｄ含有乳酸カルシウム溶液（２０ｍＭ） 溶液３：ヘバリンナトリウム１３５１　Ｕ／ｄ含有乳酸カルシウム溶液（５０ｍ Ｍ） 溶液４：ヘパリンナトリウム１３５１　Ｕ／ｄ含有乳酸カルシウム溶液（１７０ ｍＭ） これら溶液各自のサンプルをプラスチックチューブに入れ、新鮮な採取した血漿 と溶液１．３および４についてはカルシウム溶液対血漿容積比１：２７で、そし て溶液２については同様な比１：２１で混合した。カルシウム溶液は新鮮さを保 つためそれらの採取４時間以内に添加し、そして血漿−カルシウムｆ４液サンプ ルはその直後速やかに一８０°Ｃで冷凍した。血漿−カルシウム溶液チューブは アッセイまでそのような凍結状態に保った。

約２週間貯蔵後、種々のサンプルを２°Ｃで１５時間解凍し、３５ｏＯＧにおい て２０分間遠心し、寒性沈澱を回収した。同じ血漿から添加したカルシウム溶液 なしで寒性沈澱の対照品も調製した。

各タイプの溶液の６本のチューブを前記の態様でテストした。６本の異なるサン プルの各自から回収した寒性沈澱の第■：Ｃ因子の平均値および標準偏差を以下 に記録する。各平均値はＩＵ／−で表した各サンプル中の寒性沈澱の総■：Ｃ因 子活性にダラムで表した寒性沈澱の重量を乗じ、各サンプル中の血漿の実際の体 積（−）で割った値を表わす。結果は以下のとおりである。

０．３６０　０．３４６　０．３７６　０．４１９　０．５０２標準偏差 ０．０２０　０．０２２　０．Ｏ１２０，０１６０，０１３このように、溶液２ 〜４中の乳酸カルシウムの増加量の存在は、対照および塩化カルシウムが存在し た溶液ｌと比較する時、第■：Ｃ因子活性の有意に増加した収量を提供すること が見られる。

第■：Ｃ因子活性を水浴中３７°Ｃで解凍後対照および処理血漿を収容する６本 のプラスチックチューブの５種の異なるセットで比較するとき、以下の結果が得 られる。

対称平均　溶液１　溶液２　溶ａ３　溶液４寒性沈澱活性 ０．７１５　０．７３２　０．８１３　０．７９４　０．８５３標準偏差 ０゜００８　０．０３２　０．０３９　０．０４６　０．０５１乳酸カルシウム 溶液は対照溶液および塩化カルシウムを含む溶液ｌを上層るそれらの優位性を保 有することが見られる。また、！あたり乳酸カルシウム１７０ｍＭを含む溶液４ は第■因子の収量の最良の結果を示す。

このように本発明により、約５重量％以下のヘパリン損失をもって溶液の熱滅菌 およびその６ケ月（またはそれ以上）室温貯蔵を許容する安定なヘパリン水溶液 が提供される。本発明の溶液はまたこの血液分画を単離するプロセスに使用する 時、第■因子の改良された収量を提供する。

上記は例証目的のみで提供されたものであり、請求の範囲に規定した本発明の範 囲を限定することを意図しない。

要　約　書 熱滅菌し得る安定な水溶液は、典型的にはｄあたりヘパリン５ないし１００ＯＵ ＳＰ単位と、！あたり乳酸カルシウム１ｏないし２５０ミリモルを含む。この溶 液は存在するヘパリンを安定化し、ヘパリン活性の有意な損失なしにそのパスツ ール化または滅菌を許容する。この溶液は採取した血液または好ましくは血漿へ それから第■因子活性の抽出の改良のために使用することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血液または血漿へ添加した時凝固を防止するのに有効な量のヘパリンと、溶 液ｌあたわ１０ないし２５０ミリモルの乳酸カルシウムを含有する熱滅菌し得る 安定な水溶液。 ｐＨが実質上４ないし７である請求項１の溶液。 ｌあたり乳酸カルシウム約１５ないし５０ミリモルを含有する請求項１の溶液。 ４．ｌあたり乳酸カルシウム約５０ないし２００ミリモルを含有する請求項１の 溶液。 ５．ｍｌあたりヘパリン約５ないし１０００ＵＳＰ単位が存在する請求項１の溶 液。 ６．前記ヘパリンはそのナトリウム塩である請求項５の溶液。 ７．溶液ｍｌあたりヘパリン５ないし１０００ＵＳＰ単位と、溶液ｌあたり乳酸 カルシウム１０ないし２００ミリモルを含み、実質上ｐＨ４ないし７にある熱滅 菌し得る水溶液。 ８．前記ヘパリンはそのナトリウム塩である請求項７の溶液。 ９．ｌあたり乳酸カルシウム約１５ないし５０ミリモルを含有する請求項８の溶 液。 １０．ｌあたり乳酸カルシウム約１００ないし２００ミリモルを含有する請求項 ８の溶液。 １１．溶液ｍｌあたりヘパリン２５ないし２００ＵＳＰ単位が存在する請求項８ の溶液。 １２．血液または血漿へ添加した時凝固を防止するのに有効な量のヘパリンと、 溶液ｌあたり１０ないし２５０ミリモルの乳酸カルシウムを含有する無菌の安定 な水溶液を血液または血漿１単位あたり２０ないし５０ｍｌ血液または血漿へ添 加することを特徴とする第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の抽出を改良する方法。 １３．前記溶液のｐＨは実質上４ないし７である請求項１２の方法。 １４．前記溶液は新たに分離された血漿へ添加される請求項１３の方法。 １５．溶液ｍｌあたりヘパリン約５ないし１０００ＵＳＰ単位が存在する請求項 １４の方法。 １６．溶液ｌあたり乳酸カルシウム約１５ないし５０ミリモルを含有する請求項 １４の方法。 １７．溶液ｌあたり乳酸カルシウム約１００ないし２００ミリモルを含有する請 求項１４の方法。 １８．前記ヘパリンはそのナトリウム塩である請求項１４の方法。 １９．血液または血漿へ添加した時凝固を防止するのに有効な量のヘパリンと、 約５％以下のヘパリン損失をもって溶液の熱滅菌および６ケ月室温貯蔵を許容す るのに十分な乳酸カルシウムを含む安定な水溶液。