JPH04507341A - ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳後修飾部位を有する融合タンパク質及び製造及び精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｉｎ　ｖｉｖｏ翻訳後修飾部位を有する融合タンパク質及び製造及び精製方法 この出願は、米国出願Ｎｏ、　０７７３５４．２６６号の一部継続出願である。

本明細書に記載された発明は、米国のヘルスアンドヒューマンサービスデパート メントのナショナルインスティチュートオブヘルスによるＧｒａｎｔ　Ｎｏ、２ ＲＯ１，Ａｒ１５６５０により、部分的に確立された研究の過程でなされた。米 国政府は、本発明の権利を有する。

発明の分野 本発明は、翻訳後修飾部位を含むアミノ酸配列に結合する目的のタンパク質又は ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするハイブリッドＤＮＡ配列に関す る。本発明はさらに、ハイブリッドＤＮＡ配列を含むベクター、該ベクターによ り形質転換された宿主、及び適する宿主内でハイブリッドＤＮＡを発現させるこ とにより製造された融合タンパク質にも関する。最後に、本発明は、翻訳後修飾 が行われた後にのみ融合タンパク質に結合する結合パートナ−を用いることによ り融合タンパク質を精製する方法を含む。

発明の背景 分子生物学における近年の進歩は、バクテリア、酵母、哺乳類及び他の宿主内に おいて、大量の異種タンパク質及びポリペプチドを製造することを可能にした。

これらの方法は、発現調節配列に機能的に結合した、所望のタンパク質又はポリ ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターの構築に依存している。その後 、適当な宿主をこれらのベクターで形質転換して、適当な条件下で培養すること により、所望のタンパク質の製造が可能となる。本技術の別の改良は、選択され たタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、分泌される細胞外又 はペリプラズムタンパク質からのＤＮＡ配列からなるハイブリッド遺伝子を形成 することにより、選択されたタンパク質又はポリペプチドの分泌を得ることを可 能にした。

宿主から分泌されない場合に所望のタンパク質又はポリペプチドを単離するため には、宿主細胞は粉砕されなければならず、タンパク質又はポリペプチドは他の 細胞内及び細胞外タンパク質、細胞デブリス及び他の夾雑物から単離されなけれ ばならない。分泌されたタンパク質又はポリペプチドを、細胞内タンパク質及び 細胞デブリスから分離するにもかかわらず、培地又はペリプラスミックスペース からさらに回収しなければならない。いずれの状態においても、所望のタンパク 質又はポリペプチドの回収は、通常、時間がかかり、望まれるものより単純でな い精製工程を含む。また、そのような精製工程は、しばしば生成物又は活性のロ スを招く。

特に、そのような精製工程は通常経験的である。例えば、種々のカラム分離技術 の一つを用いると、全てのフラクションをタンパク質又はポリペプチドのために 分析しなければならない。また、精製操作の多くは、特異的でなく、多くの工程 の方法の組み合わせを使用しなければならない結果となる。そのような方法に含 まれる工程と時間が多（なることにより、活性及び生成物が失われることになる 。

精製工程に用いられる一つの方法は、組み換えＤＮＡ技術を用いて、リポータ− タンパク質に結合した所望のタンパク質又はポリペプチドを含む融合タンパク質 を製造するものである。リポータ−タンパク質の分析は、融合タンパク質の精製 のため、又は融合タンパク質の単離の手段を提供するために用いられる。

多くのリポータ−タンパク質が使用されるが、方法の例は、β−ガラクトシダー ゼとの融合である。β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は、電荷、大きさ等に 基づく慣用分離技術により、分離の進行をβ−ガラクトシダーセ活性の分析によ りモニターしながら、融合タンパク質のβ−ガラクトシダーゼの原因となる第二 の検出可能なβ−ガラクトシダーゼと結合する能力を分析しながら、又は抗β− ガラクトシダーゼ抗体との反応によるβ−ガラクトシダーセ抗原決定基の存在に より、精製されうる。５ｉｌｈａｖｙ　ａｎｄ　Ｂｅｃｋｗｉｔｈ、Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、、４９，３９８−４１８（１９８５）；Ｕｌｌｍａｎ　ａｎ ｄ　Ｐｅｒｒｉｎ、　ｉｎ　Ｔｈｅ　ＬａｃｔｏｓｅＯｐｅｒｏｎ（Ｂｅｃｋｗ ｉｔｈ　ａｎｄ　Ｚｉｐｓｅｒ、ｅｄｓ、、　１９７０．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ１）ｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質も、固定さ れた抗β−ガラクトシダーゼ抗体のカラム又は、活性部位が保持される°場合に は固定された物質類似物のカラムで、精製されうる。Ｓｉ　Ｉｈａｖｙ　ａｎｄ 　Ｂｅｃｋｗｉ　ｔｈ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　、　４９．３９８ −４１８（１９８５）；Ｕｌｌｍａｎ、　Ｇｅｎｅ、　２９．２７−３１１９８ ４＞。

β−ガラクトシダーゼ以外のリポータ−タンパク質への融合は、リポータ−タン パク質は特定の抗体が要求されないように選ばれつるので、しばしば精製を良好 に促進する。そのような融合の例は、目的のタンパク質が、ＩｇＧのＦｃ部に結 合するタンパク質Ａに融合する構造である。そのような融合は、ＩｇＧのカラム 上で分離されうる。

Ｎｉ１ｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、、４．１０７５−８０（ １９８５）。

抗体、免疫グロブリン又は基質のカラムを用いたβ−ガラクトシダーゼ及びタン パク質Ａ融合タンパク質の精製方法の組み合わせは、精製カラム上のタンパク質 −タンパク質又は酵素−基質複合体を破壊するために、厳しい条件を必要とする 。これらの条件は、少なくとも部分的に融合タンパク質の所望のタンパク質又は ポリペプチドセグメントを変性することが予想される。Ｎｉ１ｓｓｏｎ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、、４．１０７５−８０（１９８５）；　Ｕｌ　Ｉ ｍａｎ、Ｇｅｎｅ、２９．２７−３１（１９８４）；ＵＩ　Ｉｍａｎ　ａｎｄＰ ｅｒｒｉｎ、　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｌａｃｔｏｓｅ　Ｏｐｅｒｏｎ（Ｂｅｃｋｗｉｔ ｈ　ａｎｃｌ　Ｚｉｐｓｅｒ、ｅｄｓ、、　！９７０゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）参照。

ビオチンは、植物、大部分のバクテリア及び一部の菌類により合成され、最初に タンパク質結合状態で細胞内に生じる小さな補酵素（ビタミンＨ）である。ビオ チン化タンパク質は、多くの必要な代謝カルボキシル化及び脱カルボキシル化反 応において酵素的役割を演じる。Ｗｏｏｄ　ａｎｄ　Ｂａｒｄｅｎ、　Ａｎｎ、 　Ｒｅｃ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　４６．３８５−４１３（１９７７）。

ビオチンは、ビオチンのカルボキシル基と特有のりジンアミノ基の間の共有結合 によるアミド結合により、アクセプタータンパク質に結合する。Ｉｄ、Ｂｉｏｔ ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎは、ビオチンリガーゼ（ビオチンホロ酵素合成と呼ばれ る）により触媒される二段階反応である（第１図参照）。ビオチンは、まずビオ チン部位−ＡＭＰに転化し、それはアクセプタータンパク質の特定のりジン残基 のε−アミノ基と反応し、ビオシチンを生成する。

種々の生物学的起源からのビオチンタンパク質のカルボキシ末端配列は、実質的 に同一であり、ビオチンリガーゼは種々の異なる生物学的起源（例えば、バクテ リアと高等真核生物）からのアクセプタータンパク質をビオチン化する。Ｍｕｒ ｔｉｆ　ａｎｄ　Ｓａｍｏｌｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣＩ＋ｅｔｎ、　、　２６２． １１８１３−１６（１９８７）；Ｓｃｈｗａｒｚ　ｅｔ　ａｔ、　、　Ｊ、　Ｂ ｔｏｌ、　Ｃｈａｍ、　２４１．２８T５（１９ ６６）。これらの配列で特に注目すべきなのは、■）高度に維持したビオシチン を含むテトラペプチドＳａｍｏｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、 、２６３゜６４６Ｊ、−６４（１９８８）；２）ビオシチンの上流のプロリン残 基または短プロリンリッチ領域の存在ＳｃｈｗａｒＺｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６３．９６４０−４５（１９８８）；及び３）ビオチ ンが結合するタンパク質のりジン残基が通常カルボキシ末端アミノ酸から３４又 は３５残基に位置するという事実、ただし、いくつかのビオチン化タンパク質は さらにカルボキシ末端から離れた位置に補酵素を結合させる。Ｓａｍｏｌｓ　ｅ ｌ、　ａｌ、、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｒｎ、　、　２６３．６４６１−６４（ １９８８）；Ｂａｉ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 １８２．２３９（１X８９）； Ｔａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６３． ２６５Ｈ１９８８）。

第２図は、出版されたリポートからコンパイルされたいくつかのビオチンタンパ ク質のカルボキシ末端部分のアミノ酸配列を示す。

該配列は、ビオチン化されるリジン残基（矢印）の位置でそろえである。該配列 は、下記のものを示す、大腸菌ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｂｉｏｔｉｎ　ｃａｒｂｏｘｙｌ　ｃａｒｒｉ ｅｒｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＣＢＣＣＰ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブ ユニット）；プロピオニバクテリウムシャーマニイトランスカルボキシラーセ（ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ　ｔｒａｎｓｃａｒ ｂｏｘｙｌａｓｅ）（ＰＳ　１．３ｓ）１．３サブユニット；サッ力ロマイセス セレビシエビルベートカルボキシラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ　ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）（ＹＰＹＣ）； ヒトピルベートカルボキシラーゼ（ＨＰＹＣ）；及びトマト（ＴＯＭ）からの配 列。

ビオチン化部位を有するトマトからのタンパク質の同定は、未知である。配列は 、ビオチンアクセプター活性により単離され、Ｐ、　ｓｈ、ｅｒｍａｎ　ｉ　ｉ 配列にホモロジーであるｏ　Ｈｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１．５．３９２８（１９８７）。

第２図において、ボックスの中の残基は、タンパク質の中に保存される残基であ る。ビオチン化タンパク質の配列の別の例は、Ｓａｍ。

Ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、２６３．６４６１−６４（１９ ８８）；及びＳｃｈｗａｒｚ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２６３．９６４０−４５（１９８８）に見出される。

ある配列のビオチン化における役割及びビオチンタンパク質のカルボキン末端部 分に位置するアミノ酸の研究がなされてきた。Ｍｕｒｔｉｆ　ａｎｄ　Ｓａｍｏ ｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６３．６４６１−６４（１ ９８８）；及びＳｃｈｗａｒｚ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、 ２６３．６４６１−６４（１９８８）。特に、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ　トランスカルボキシラーゼの１．．３Ｓサブユニツ トが研究されてきた。これは、１２３のアミノ酸の長さである。ビオチンは、カ ルボキシ末端から３４の残基に位置するりジン残基に結合している。１９−１２ ３の残基を含むトランケートした１、３３サブユニツトポリペプチドをビオチン 化する。この間に、ペヌルチメートアミノ酸（ナンバー１２２）の欠損が、タン パク質のビオチン化を妨げる。Ｍｕｒｔｉｆ　ａｎｄ　Ｓａｍｏｌｓ　ｅｔ　ａ ｌ、ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、２６２．１１８１３−１６（１９８７）；　Ｓ ａｍｏｌｓｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６３．６ ４６１−６４（１９８８）。また、ビオチン部位をフランキングするメチオニン 残基は、ビオチン化に必要ではない。

５ｈｅｎｏｙ、　ｅｔ　ａｌ、　、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　、　２．２５０５−２ ５１１．（１９８８）。

上記で論じた共有結合に加えて、ビオチンは非共有結合で非常に強固に、タンパ ク質アビジン及びストレプトアビジンにより特異的に結合する（ＫＤ　１０−” 　Ｍ）。このビオチンに対する非共有結合を利用して融合タンパク質を精製する ストレプトアビジン融合タンパク質が開発された。特にＰＣＴ出願ＷＯ８７１０ ５０２６及びＷｏ　８６１０２０７７には、ストレプトアビジンをコードするＤ ＮＡ配列が単離され、クローン化され、ストレプトアビジンに結合した目的のタ ンパク質またはポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ配列の製造に使用され たことが開示されている。Ｗｏ　８６１０２０７７及びＷＯｌｏ　５０２６は、 さらに、融合タンパク質が、融合タンパク質をビオチン又はビオチン誘導体又は 類似物と接触させることにより単離されうることを教示している。他のタンパク 質又はビオチンと結合しない夾雑物は、洗浄して除去され、融合タンパク質はビ オチンから溶離される。

しかしながら、上記出願に記載された融合タンパク質のビオチン又はビオチン誘 導体からの溶離のための条件は、非常に厳しく、目的とするタンパク質又はポリ ペプチドの少なくとも部分的な活性及び抗原性の減少を起こしうる。また、スト レプトアビジン融合タンパク質は、その細胞内ビオチン又は代謝的に必須のビオ チン化タンパク質への結合性のため、宿主細胞に対して非常に致命的である。

５ａｎｏ　ａｎｄ　Ｃａｎｔｏｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ、　８７，１４２−１４６（１９９０）参照。

リポイル化は、別の翻訳後修飾である。リポ酸は、リポ酸のカルボキシル基とタ ンパク質のりジン残基のε−アミノ基との共有アミド結合により、アクセプター タンパク質に結合される。５ｔｅｐｈｅｎｓｅｔ　ａｌ、　、　Ｂｕｒ、　Ｊ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１３３．４８１−８９（１９８３）。この共有結合は 、酵素リポエートリガーゼにより触媒される。

い（つかのりボイル化タンパク質のアミノ酸配列が知られており、これらのタン パク質のりボイル化部位のアミノ酸配列は極めて類似している（下記の第１表参 照）。一つのバクテリアからのりホエートリガーゼが関係のないバクテリアから のアクセプタータンパク質を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏの両方でリ ポイル化できることが示されている。

第１表二種々のりボイル化タンパク質のアミノ酸配列の比較リポイル化　酵素　 配列　Ｒｅｆ タンパク質源　十 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｅ２ｐ本　！ｉｐｌ　ＬＩＴＶＥＧＤＫＡＳＭＢＶＰ　ａ１ｉｐ ２　ＬＩＴＶＥＧＤＫＡＳＭＥＶＰ　ａ１ｉｐ３　ＬＩＴＶＥＧＤＫＡＳＭＥＶ Ｐ　ａＥ２ｏ＊ｔ　ＬｖＥＩＥＴＤＫＶＶＬＩＥＶＰ　ｂＢ、ｓｔｅａｒｏｔｈ ｅｒｍｏ−Ｅ２ｐ　ＬＣ）、ｖＱＮＤＫＡＶＶＥＩＰ　ｃｈｉｌｕｓ Ａ、ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ　Ｅ２ｐ　１ｉｐｌ　ＬＶＶＬＥＳＡＫＡＳＭＥＶＰ 　ｄ１ｉｐ２　ＬＩＶＬＥＳＤＫＡＳＭＥＩＰ　ｄ１ｉｐ３　ＬＩＶＬＥＳＤＫ ＡＳＭＥＩＰ　ｄＢ２ｏ　ＬＩＶＤＬＥＴＤＫＶＶＭＢｖＬ　ｅウシ　８２ｐ　 ＶＥＴＤＫＡＴＶＧＦ　ｆラット　Ｅ２ｐ　ＩＥＴＤＫＡＴＩＧＦＥ　ｇヒト　 Ｅ２ｐ　１ｉｐｌ　ＶＥＴＤＫＡＴｖＧＦＥ　ｈ１ｉｐ２　ＩＥＴＤＫＡＴＩＧ ＦＥ　ｈ＝　’７　）　’Ｊ　り’）　シンＬＥＳＶＫＡＡＳＥＬ　ｉ開裂 ＋リボイルーリジン残基を示す。

ｔＥ２ｐ　＝ピルベートデヒドロゲナーゼからのジヒドロリポアミドアセチルト ランスフェラーゼ ネ本Ｅ２ｏ　＝α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼからのジヒドロリポアミ ドスクシニルトランスフェラーゼａ　５ｔｅｐｈｅｎｓ、　Ｄａｒｌｉｓｏｎ、 　Ｌｅｗｉｓ　ａｎｄ　Ｇｕｅｓｔ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、 　１３３．１T５ ｂ　５ｐｅｎｃｅｒ、Ｄａｒｌｉｓｏｎ、５ｔｅｐｈｅｎｓ、Ｄｕｃｋｅｎｆｉ ｅｌｄａｎｄＧｕｅｓｔ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１４１．３６１ −３７４（１９８４）ｃ　Ｐａｃｋｍａｎ、Ｂｏｒｇｅｓ　ａｎｄ　Ｐｅｒｈａ ｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２５２．７９−８６（１９８８）ｄ　Ｈａｎｅｍａ ａｉｊｅｒ、Ｊａｎｓｓｅｎ、Ｋｏｋ　ａｎｄ　Ｖｅｅｇｅｒ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、、　１７４゜ｅ　Ｗｅｓｔｐｈａｌ　ａｎｄ　Ｋｏｋ、　Ｅｕｒ 、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１８７，２３５−２３９（１９９０）ｆ　Ｂｒａｄ ｆｏｒｄ、Ｈｏｗｅｌｌ、Ａｉｔｋｅｎ、ＪａｍｅｓａｎｄＹｅａｍａｎ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２４５．９ｇ　Ｇｅｒｓｈｗｉｎ、Ｍａｃｋａｙ、Ｓｔｕｒ ｇｅｓｓａｎｄＣｏｐｐｅｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３８．３５２５−ｈ　 Ｃｏｐｐｅｌ、ＭｃＮｅｉｌａｇｅ、５ｕｒｔｈ、Ｖａｎｄｅｗａｔｅｒ、５ｐ ｉｔｈｉｌｌ、Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍａｎｄ　Ｇｅｒｓｈｗｉｎ、　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５．７３１７−７３２ １　（１９８８）。

ｉ　Ｆｕｊｉｗａｒａ、Ｏｋａｍｕｒａ−ｒｋｅｄａａｎｄＭｏｔｏｋａｗａ、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１．８８３６−８８４１．（１９８６） Ｅ、ｃｏｌｉのピルベートデヒドロゲナーゼ錯体のジヒドリポアミドアセチルト ランスフエラーゼ（Ｅ２ｐ）成分は、三つの非常に同一性の高い、縦に繰り返し 、ポリペプチド鎖のＮ−末端半分を形成する約１００アミノ酸の配列を含む。前 掲書、　；Ｇｕｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉａｌ、　、　１８ ５゜７４３−５４（１９８５）。これらの配列の三つ全ては、リポイル化のため の部位であるリジンを含み、各々折り畳まれた機能領域を形成する。前掲書。各 々繰り返す配列は、下記の不変の１８残基の配列中にリポイル化部位を含む：　 Ａ　１ａ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａ　ｉ Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（Ｌｉｐ）−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｍｅｔ− Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ　Ｑ前掲書、；５ｔｅｐｈｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕ ｒｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１３３．４８１−８９（１９８３）　。Ｅ２ｐの三つ の繰り返し配列は、さらに、約２０〜３０アミノ酸の、異常にアラニン、プロリ ン及び電荷アミノ酸に富む長いＣ末端領域を含み、この領域は構造的なフレキシ ビリティをポリペプチドに付与する。Ｒａｄｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、ｃｈｅｍ、　、　２６４．７６７−７５（１９８９）；Ｇｕｅｓｔ　ｅｔ 　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１８５．７４３−５S（１９ ８５）。

発明の概要 本発明は、新規な融合タンパク質を含む。この融合タンパク質は、融合タンパク 質の翻訳後修飾を可能にするアミノ酸配列をコードする、第一のＤＮＡ配列と、 該第−のＤＮＡ配列と同一の解読枠中にあり末端同志で結合した、選択されたタ ンパク質またはポリペプチドをコードする、第二のＤＮＡ配列とを含むハイブリ ッドＤＮＡ配列によりコードされる。このハイブリッドＤＮＡ配列は、さらに、 翻訳後修飾をコードするアミノ酸配列から選択されたタンパク質又はポリペプチ ドを開裂する手段を提供する開裂部位をコードする第三のＤＮＡ配列を含みうる 。第三のＤＮＡ配列は第−及び第二のＤＮＡ配列の間に位置し、全ての三つのＤ ＮＡ配列は同じ解読枠内にある。

好ましいのは、第一のＤＮＡ配列が融合タンパク質の翻訳後ビオチン化を可能に するアミノ酸配列、例えばＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａ ｎｉｉ　トランスカルボキシラーゼの１．３３サブユニツトのアミノ酸配列、又 は融合タンパク質の翻訳後ビオチン化を可能にするその断片をコードするハイブ リッドＤＮＡ配列である。特に、Ｐ、Ｓｈｅｒｍａｎｉｉ　トランスカルボキシ ラーゼの１．３３サブユニツトのカルボキシ末端の最終子５アミノ酸をコードす る配列はビオチン化されるのに対して、最終６１アミノ酸をコードする配列はビ オチン化されないことがわかった。

さらに好ましいのは、第一のＤＮＡ配列が、融合タンパク質の翻訳後リポイル化 を可能にするアミノ酸配列、例えばＥ、ｃｏｌｉピルベートデヒドロゲナーゼ複 合体、又は融合タンパク質の翻訳後リポイル化を可能にするその断片をコードす るハイブリッドＤＮＡ配列である。

本発明は、さらに、これらのハイブリッドＤＮＡ配列を含むベクター及び該ベク ターで形質転換された宿主細胞を提供する。これらのベクターは、さらに好まし くは、融合タンパク質の分泌を提供するシグナル又はシグナルリーダー配列又は その断片をコードするＤＮＡ配列を含む。

本発明は、さらに、形質転換された宿主を適当な条件下で培養して融合タンパク 質の発現を得る融合タンパク質の製造方法を含む。

好ましくは、この融合タンパク質は、ｉｎ　ｖｉｖｏで、翻訳後修飾により修飾 される。また、融合タンパク質の分泌は、シグナル又はシグナルリーダー配列を 含む場合に得られる。

修飾された融合タンパク質は、修飾された後に融合タンパク質に結合する結合パ ートナ−を用意し、修飾された融合タンパク質を結合を可能にする条件下で結合 パートナ−と接触させ、混合物中の非結合材料から結合パートナ−に結合した修 飾された融合タンパク質を分離し、修飾された融合タンパク質を溶離することを 含む方法により、細胞抽出物、又は形質転換された宿主を培養することにより得 られた培地のような材料の混合物から精製されつる。融合タンパク質か開裂部位 を含む場合には、まだ結合パートナ−に結合している間に又は結合パートナ−か ら溶離した後に開裂されうる。

結合パートナ−は、抗体、又は修飾された後にのみ融合タンパク質に結合するい かなる化合物でもありうる。例えば、融合タンパク質が、ビオチン化タンパク質 である場合は、結合パートナ−はビオチンに対する抗体でありうるが、好ましく はアビジン、ストレプトアビジン及び誘導体並びにその類似物から選ばれる。

図面の簡単な説明 第１図は、ビオチンリガーゼによるビオチンのタンパク質への付加を説明する。

第２図は、ビオチン化タンパク質のカルボキシ末端の配列を示す。

第３図は、ベクターｐＣＹ４６の製造を説明する。

第４図は、ベクターｐＣＹ４９Ｕの製造を説明する。

第５図は、ベクターｐＣＹ７４の製造を説明する。

第６図は、ベクターｐｃＹ９０の製造を説明する。

第７図は、ベクターｐＣＹ８４の製造を説明する。

第８図は、ベクターｐＣＹ７２の製造を説明する。

第９図は、ベクターｐＣＹ７３の製造を説明する。

第１０図は、ベクターりＣＹ１１９の製造を説明する。

第１１図は、ベクターｐＣＹ５６の製造を説明する。

第１２図は、ベクターｐＣＹ６６及びｐＣＹ６８の製造を説明する。

第１３図は、ベクターりＣＹ１２０の製造を説明する。

第１４図は、ビオチン化融合タンパク質及び対照の典型的なフルオログラフであ る。

第１５図は、ベクターｐＣＹ９４の製造を説明する。

第１６図は、ベクターｐｃｙｓ　の製造を説明する。

第１７図は、ベクターｐｃＹ１０５及びｐｃｙｘｏｅの製造を説明する。

第１８図は、ベクターｐｃＹｌ１８の製造を説明する。

第１９図は、ベクターｐｃＹ１１６及びｐｃＹ１１７の製造を説明する。

第２０図は、Ｅ、ｃｏｌｉ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅにより製造されたビオチン化されたＨＩＳ３−１．３３融合タンパク質の典 型的なフルオログラフである。

第２１図は、融合物Ａ−Ｍを説明し、これらの融合物により形質転換されたＥ、 ｃｏｌｉ株を培養した結果を示す。

第２２Ａ−Ｃ図は、モノマーアビジンカラムから溶離された材料のフラクション ナンバーに対するβ−ガラクトシダーゼ活性及びタンパク質濃度を示すグラフで ある。

第２３図は、モノマーアビジンから溶離されたビオチン化融合タンパク質及び対 照を電気泳動し、スティンしたポリアクリルアミドゲルを示す。

第２４図は、融合物Ｑ−Ｒを説明する。

第２５図は、ベクターｐＫＲ１４の製造を説明する。

第２６図は、ベクターｐＫＲ１０の製造を説明する。

第２７図は、ベクターｐＫＲ２２及びｐＫＲ２３の製造を説明する。

第２８図は、ベクターｐＫＲ２１の製造を説明する。

第２９図は、ベクターｐＫＲ２４及びｐＣＹ６８の製造を説明する。

第３０図は、３５３−標識方法を用いて製造したりボイル化タンパク質の典型的 なフルオログラフである。

第３１図は、３５３−標識方法を用いて製造したりボイル化タンパク質のフルオ ログラフである。

第３２図は、リポイル化タンパク質を電気泳動し、染色したポリアクリルアミド ゲルを示す。

第３３図は、ベクターｐＣＹＴ８Ｄの製造を説明する。

第３４図は、ベクター１）ＣＹ１５９の製造を説明する。

現在好ましいとされる実施態様の詳細な説明本発明のハイブリッドＤＮＡ配列は 、翻訳後修飾の部位をコードする第一のＤＮＡ配列を含む。翻訳後修飾は、通常 細胞内で起こる修飾であり、これによりｌ又はそれ以上の化学物質が、１又はそ れ以上の酵素反応により、翻訳後修飾部位内のアミノ酸に共有結合するものであ る。部位それ自体は、修飾されるアミノ酸だけでなく、翻訳後修飾が起こるのに 必要な他のアミノ酸を適切な配列で含んでいる。

“翻訳後”の用語が用いられるが、タンパク質合成の際にそのような修飾か起こ る正確な時点は、まだ知られていない。現在ある証拠は、完全にタンパク質が合 成され、リポソームから離れた後にこれらの修飾が起こることを示している。例 えば、Ｍｕｒｔｉｆ及びＳａｍｏｌｓは、終わりから２番目のアミノ酸が、ビオ チン化に必要であることを示している（上記の背景の欄を参照）。しかしながら 、タンパク質合成がまだ起こっている間に修飾が起こる可能性又は開始する可能 性を完全に否定することはできない。本明細書に示したように、“翻訳後”の用 語は、これらの可能性の全てをカバーする意図である。

融合タンパク質の修飾は、宿主細胞内で普通に起こる反応を用いて、好ましくは ｉｎ　ｖｉｖｏで行われる。修飾が宿主細胞によりｉｎ　ｖｉｖ。

で行われる場合には、以下に述べるように、融合タンパク質は、修飾が起こった 後にのみ融合タンパク質に結合する結合パートナ−を用いて、細胞抽出物から又 は細胞培養液から、直接に精製することができる。

しかしながら、融合タンパク質の修飾が宿主内で充分には起こらない場合には、 宿主により生産され、ｔｎ　ｖｉｖｏで修飾されなかった融合タンパク質の部分 を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで修飾することが必要となることもある。翻訳後修飾はｉ ｎ　ｖｉｔｒｏで、ｉｎ　ｖｉｖｏと実質的に同じように行われる。同じ翻訳後 修飾部位及びこの部位を認識する酵素が用いられる。例えば、タンパク質は、正 常リジン残基で、多くのもの由来のビオチンリガーゼを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏでビオチン化されつる。

このようにｉｎ　ｖｉｔｒｏで融合タンパク質を修飾する必要は極めて稀である と考えられ、また、はとんどすべての融合タンパク質は、１ｎｖｉｖｏで十分に 修飾されると考えられる。

本発明は、融合タンパク質のマーカーであって、これを直接又は間接的に使用し て、融合タンパク質を同定するか、細胞抽出物、又は宿主細胞を培養し、融合タ ンパク質を含む培地に見出されるような他の材料、例えば他の蛋白質の混合物か ら融合タンパク質を単離することができるような融合タンパク質のためのマーカ ーを提供する翻訳後修飾のあらゆるタイプを含む。本発明は、さらに、精製をさ らに単純にするために一つの融合タンパク質において二つの異なる翻訳後修飾部 位を使用することを含む。

好ましいのは、宿主細胞により、利用され、少数のタンパク質のみを修飾する翻 訳後修飾である。これは、融合タンパク質の同定及び単離を容易にするからであ る。細胞により利用され、共有結合により数種（１〜５）のタンパク質のみを修 飾する翻訳後修飾の例は、ビオチン化、４−ホスホパンテティンの結合、リポ酸 の結合、及びフラビンの結合である。

例えば、Ｅ、ｃｏｌｉは、唯一つのビオチン化タンパク質、アセチル−ＣｏＡカ ルボキシラーセのビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質（ＢＣＣＰ）成分 、二つのリポ化タンパク質及び４Ｉ−ホスホパンテティンを含む一つのタンパク 質を含むことが示されている。Ｆａｌ　ｌ、　Ｍｅｔ、ｈ。

ＥｎＺｙｍｏｌｏｇｙ、　６２．３９０（１９７９）；Ｐｅｒｈａｍ　ｅｔ　ａ ｌ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｓｙｍｐ、　、　T４．６７ （１９８７）；Ｒｏｃｋ　ａｎｄ　Ｃｒｏｎａｎ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、 、７１，３４１（１９８１）　ｏ他のバクテリアは、二つ又は三つのビオチン化 タンパク質を含む。Ｆａ、ｌｌ、Ｍｅｔｈ−Ｂｎｚｙｍｏｌ、、６２，３９０− ９８（１９７９）ａ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、 生育条件に依存して、３〜５のビオチン化タンパク質を含み、哺乳類及び植物は 、そのようなタンパク質を４つ含む。Ｃｈ、ａｎｄｌｅｒ　ａｎｄ　Ｂａ１．Ｉ ａｒｄ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、　Ｊ、　、　２５１．７４９（１９８８）；Ｌｉｍ 　ｅｔ　ａｌ、　、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ垂■凾刀A　。

２５８、２１９（１９８７）；Ｎ１ｋｏｌａｕ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ａｎａｌ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１４９．４４８−５３（１９８５j； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２ ５８．６６６０−６４（１９８３）。また、全ての微生物、哺乳類及び植物は、 少なくとも二つのリポ化タンパク質（Ｅ２ｏ及びＥ２ｐ　）と、おそらく三つの そのようなタンパク質（第三のタンパク質はグリシン開裂系に関与するリポ化タ ンパク質である）を含むと考えられている。

ビオチン、４−ホスホパンテティン及びリポ酸のタンパク質への付加の酵素学が 理解されており、これらの三つの修飾は全て、実質的に全ての細胞で起こる。こ れらの三つの化合物により修飾されるタンパク質の配列が知られており、従って 、翻訳後修飾部位をコードするＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーシヨンプローブ を用いて正確な配列がスクリーニングされるｃＤＮＡ又はｇＤＮＡライブラリー を製造するような慣用方法を用いて得られる。実際、そのようなタンパク質のい くつかをコードする遺伝子が、既にクローン化されている。さらに、これらの修 飾は、代謝において、修飾分子が修飾タンパク質の表面に存在し、これにより、 修飾を有するタンパク質の同定及び精製を助けるような役割を果たす。

これらの全ての修飾基は、また、有効なハプテンでもあり、この修飾基に特異的 な抗体を製造し、これを用いて修飾を有する融合タンパク質を精製することがで きる。また、ビオチン化タンパク質は、例えばビオチン化タンパク質に対する抗 体とは逆に比較的安価で容易に入手できる、アビジン、ストレプトアビジン及び これらの二つの化合物の誘導体及び類似物に対するビオチンの特異性及び強い親 和性を利用することにより、容易に同定し、単離することができる。

同様にリポ酸は、種々の金属化合物（例えばヒ素及びタリウム化合物）が特異的 且つ強固に結合することができるジオチールであり、金属化合物はモノチオール よりもジチオールをより強固に結合し、リポ酸で修飾された融合タンパク質を精 製する方法を提供する。本発明の融合タンパク質の精製方法を、下記により詳細 に説明する。

翻訳後修飾部位をコードするＤＮＡ配列は、通常目的とする翻訳後修飾を進行さ せるタンパク質をコードする完全な遺伝子の配列でありうる。翻訳後修飾が起こ るのを可能にするのに適当なアミノ酸配列をコードする断片であれば、このよう な遺伝子の断片であってもよい。さらに、そのような遺伝子のＤＮＡ配列又は断 片は、機能的な翻訳後修飾部位をコードする限り、改変してもよ（、完全に合成 した配列を使用してもよい。

本発明のハイブリッドＤＮＡ配列の第二のＤＮＡ配列は、選択された目的とする タンパク質又はポリペプチドをコードする。このタンパク質又はポリペプチドは 、宿主により通常生産されるもの（“同種”タンパク質又はポリペプチド）であ ってもよく、また宿主により通常生産されないもの（“異種”タンパク質又はポ リペプチド）であってもよい。このように、同種タンパク質又はポリペプチドで さえ、翻訳後修飾の手段により同定又は単離されうるように付加されうる。

第二のＤＮＡ配列として有用なりＮＡ配列のうち、下記のタンパク質又はポリペ プチドをコードするものが好ましいニブロチアーゼ、及びリパーゼのような酵素 ；ヒトインシュリン、種々のインターフェロン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホ ルモン、ブタ成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、バソプレ ッシン、及びプロラクチンのような動物及びヒトのホルモン：ファクターＶＩＩ 　、ファクターＶＩＩＩ、エリスロボイエチン及び組織プラスミノーゲン活性化 因子のような血液因子；リンフ才力イン；免疫グロブリンのようなグロブリン； アルブミン；β−エンドルフィン及びエンケファリンのようなエンドルフィン； ウィルス性又はバクテリア性抗原、例えば口蹄疫抗原、インフルエンザ抗原タン パク質及び肝炎コア及び表面抗原；レンニン；Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシン；並びに原核生物、真核生物又はウィルス起源の 他の有用なタンパク質及びポリペプチド。

融合タンパク質をコードするハイブリッドＤＮＡ配列は、当該技術分野の技術者 に知られている慣用技術を用いて製造し、ベクターに導入することができる。第 一に、翻訳後修飾部位及び目的のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮ Ａ配列が単離される。これは、ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡライブラリーを形成し、適 当なハイブリダイセーショり行われる。当然ながら、本発明の実施に有用な多く の遺伝子及びＤＮＡ配列が既に単離され、クローン化され、利用可能な状態にな っている。さらに、ＤＮＡ又はアミノ酸の配列が知られているときは、多くの望 ましいＤＮＡ配列が化学合成により製造される。

本発明のハイブリッドＤＮＡ配列は、翻訳後修飾部位をコードするＤＮＡ配列の 末端を、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の末端に、 それらが同じ解読枠に存在するように結合することにより製造される。翻訳後修 飾部位をコードするＤＮＡ配列は、目的のタンパク質又はポリペプチドをコード するＤＮＡ配列の上流側又は下流側に位置しうる。

好ましい実施態様において、ハイブリッドＤＮＡ配列は、さらに、翻訳後修飾部 位から選択されたタンパク質又はポリペプチドを分離するのに有用な、化学的又 は酵素的開裂部位をコードする第三のＤＮＡ配列を含む。そのような開裂部位は 、ハイブリッドＤＮＡ配列を、翻訳後修飾部位をコードするＤＮＡ配列と、目的 のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の間に位置する、その望 ましい開裂部位をコードする１又はそれ以上のコドンを有するように、そして全 てのＤＮＡ配列が同じ解読枠内にあるように構築することにより、融合タンパク 質内に構築しうる。

開裂部位は、タンパク分解開裂のための部位でありうる。また、選択された目的 のタンパク質又はポリペプチドがメチオニン残基を全く含んでいないばあいには 、開裂部位は、（ＡＴＧコドンによりコードされる）メチオニンでもよい。そし て、融合タンパク質は臭化シアンで処理することによりメチオニン残基で開裂し うる。Ｇｒｏｓｓ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＹ、１１，２３８−５５（１９６７ ）。

タンパク分解開裂部位に関して、この開裂部位は、ｉｎ　ｖｉｖｏで、すなわち 宿主が生産したプロテアーゼによる精製の際に開裂が起こらないように選択する 必要がある。また、開裂部位は融合タンパク質のみに存在し、翻訳後修飾により 修飾される宿主により生産される他のタンパク質には存在しないような、充分に 独特なものであることが好ましい。この点で、第三のＤＮＡ配列は、非常に特異 的なプロテアーゼ、例えば下記のペプチド結合ｉ１ｅ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ａｒｇ （Ｎａｇａｉ　ａｎｄＴｈｏｒｇｅｒｓｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ、１５３４６１−７９（１９８７））を開裂するファクターＸａ、 　フィブリンを開裂するトロンビン及びエラスチンを開裂するエラスターゼによ り認識される開裂部位をコードするようにデザインされうる。しかしながら、あ る種の源からのエラスターゼは、ＩｇＧを開裂するため、エラスターゼの使用は 、融合タンパク質が抗体カラム上で単離され、カラム上での開裂が望まれる場合 には望ましくないことに注意すべきである。

本発明はまた、適当な宿主内で融合タンパク質を発現しうるベクターを含む。こ のベクターは、適当な発現調節配列に機能的に結合した融合タンパク質をコード するハイブリッドＤＮＡ配列を含む。この機能的結合を、ハイブリッドＤＮＡ配 列をベクターに挿入する前又は後に、行う方法はよ（知られている。発現調節配 列は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサ−、オペレーター、リポソー ム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化 シグナル、並びに転写又は翻訳の調節に関する他のシグナルを含む。

ベクターは、両方ともハイブリッドＤＮＡ配列に機能的に結合したプロモーター 及び転写終了シグナルを含まなければならない。プロモーターは、宿主細胞内に おいて転写活性を示すいかなるＤＮＡ配列であってもよ（、同種又は異種タンパ ク質（好ましくは同種）、並びに細胞外又は細胞内タンパク質、例えばアミラー ゼ、グリコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及び解糖酵素をコ ードする遺伝子から誘導されてもよい。

プロモーターは、上流のアクチベーター及びエンハンサ−配列により先行されて もよい。オペレーター配列も、所望によりプロモーター配列の下流に含まれうる 。

ベクターは、ハイブリッドＤＮＡ配列がそれ自体は開始シグナルにより開始しな い場合は、ハイブリッドＤＮＡ配列の直前に翻訳開始シグナルを有しなければな らない。開始シグナルとハイブリッドＤＮＡ配列の末端との間には、終了シグナ ルがあるべきではない。

本発明に使用するのに適する発現調節配列は、よく知られている。

それらには、下記のものが含まれる：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ｌａｃ系、Ｅ、ｃｏｌｉ 　ｔｒｐ系、ＴＡＣ系及びＴＲＣ系のいずれか；バクテリオファージラムダの主 要なオペレーター及びプロモーター領域、繊維状１本鎖ＤＮＡファージの調節領 域；他のバクテリアの発現調節配列；　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ　ＴＰＩ、　ＡＤＨ，ＰＧＫ及びαファクターをコードする遺伝子 から誘導されるプロモーター；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＴＡＫ Ａアミラーゼ及びＡ、ｎｉｇｅｒグリコアミラーゼ、中性のα−アミラーゼ及び 酸安定α−アミラーゼをコードする遺伝子から誘導されるプロモーター；Ｒｈｉ ｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅ　ｉアスパルチンプロテイナーゼ及びリパーゼをコ ードする遺伝子から誘導されるプロモーター；並びに原核細胞、真核細胞、それ らのウィルス又はそれらの組み合わせの遺伝子の発現を調節する他の既知の配列 。

ベクターは、さらに宿主細胞内での複製を可能にする一つ又はそれ以上の複製シ ステムを含まなければならない。特に、宿主が酵母である場合は、ベクターは酵 母の２ｕ複製遺伝子ＲＥＰＩ−３及び複製の起点（ｏｒｉｇｉｎ）を含まなけれ ばならない。

ターに導入する少なくとも１個の制限酵素部位及びベクターが宿主細胞内に存在 する場合に表われる選択可能な又は同定可能なフェノタイプの特性をコードする ＤＮＡ配列（“選択マーカー”）を含まなければならない。

本発明に使用するのに適するベクターは、よ（知られている。それらには、ｐＵ Ｃ（例えばｐＵＣ８及びｐＵＣ４Ｋ）、ｐＢＲ（例えばｐＢＲ３２２及びｐＢＲ ３２８）　、’ｐＵＲ（例えばｐＵＲ２８８）　、ファージλ及びＹＥｐ（例え ばＹＥｐ２４　）プラスミド、下記の実施例に記載された他のベクター、並びに これらのベクターの誘導体が含まれる。

好ましい実施態様において、シグナル又はシグナルリーダー配列をコードするＤ ＮＡ配列又はそれらの機能性断片は、組み換えＤＮＡベクター内に、翻訳開始シ グナルと融合タンパク質をコードする／）イブリッドＤＮＡとの間に含まれる。

シグナル又はシグナルリーダー配列は、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ末 端にあるアミノ酸の配列であり、タンパク質又はポリペプチドの、それが生産さ れた細胞からの分泌を提供する。好ましくは、シグナル又はシグナルリーダーア ミノ酸配列は、その細胞からの分泌の間に融合タンパク質から開裂される。そう でない場合には、好ましくは、融合タンパク質は、融合タンパク質を単離した後 に、シグナル又はシグナルリーダーアミノ酸配列から開裂される。

本発明に使用するのに適するシグナル又はシグナルリーダー配列には、下記のも のが含まれる：ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　αファク ター（Ｕ、　Ｓ、特許Ｎｏ、　４．５４６．０８２及び４．８７０．００８参照 ）　、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅαファクターの断片、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ　αファクター（米国特許Ｎｏ、　４．５８８、６８４参照）、酵母のＢＡＲ Ｉ分泌系（米国特許Ｎｏ、　４．６１３．５７２参照）、合成シグナルリーダー 配列、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　Ｉａｃｔｉｓ　シグナルリーダー配列及び 通常タンパク質又はポリペプチドの前駆体、例えばインターフェロンの前駆体の 一部であるシグナル配列（米国特許Ｎｏ。

４、７７５．６２２）。

ビオチン、４−ホスホパンテティン又はリポ酸で修飾される公知の天然に存在す るタンパク質は分泌されない。これは、これら３種の化合物の一つを付加するこ とにより修飾されたタンパク質が細胞代謝に関与するためである、と予想される 。従って、翻訳後修飾がこれら３種の化合物の一つの融合タンパク質への付加を 含む場合には、分泌されるべき修飾されたタンパク質のみが融合タンパク質とな るので、融合タンパク質の部分としてシグナル又はシグナルリーダー配列を含む のが好ましい。

得られたハイブリッドＤＮＡ配列を含むベクターを、適当な宿主を形質転換する ために使用する。この形質転換は、当該技術分野でよく知られた方法を用いて行 うことができる。

多（の使用可能でよく知られた宿主細胞のいずれも本発明の実施に使用しうる。

宿主は、選択された翻訳後修飾を行うことができるものでなければならない。上 記で指摘したように、はとんど全ての細胞は、ビオチン、４−ホスホパンテティ ン及びリポ酸をタンパク質に付加することができる。

特定の宿主の選択は、そのほかに、当該技術において認識されている多数のファ クターに依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、 ハイブリッドＤＮＡ配列によりコードされる融合タンパク質のそれに対する毒性 、形質転換率、融合タンパク質の回収のしやすさ、発現される性質、生物学的安 全性及びコストが含まれる。全ての宿主が特定のハイブリッドＤＮＡ配列又は特 定の翻訳後修飾による融合タンパク質の修飾に対して等しく有効であるとは限ら ないことを理解した上で、これらのファクターのバランスをとる必要がある。

これらの一般的なガイドラインの範囲内で、有用な微生物宿主には、バクテリア （例えばＥ、ｃｏｉｉ種）、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種）、及 び他の菌、昆虫、植物、哺乳類（ヒトを含む）の培養細胞、又は当該技術分野で 知られる他の宿主が含まれる。

宿主は、好ましくは、融合タンパク質以外のタンパク質が選択された翻訳後修飾 により修飾されないように操作される。例えば、通常酵母によりビオチン化され るタンパク質は、成る種の添加培地上での酵母の生育には必要なく、それらをコ ードする遺伝子は、本発明の融合タンパク質をビオチン化できるが、いかなる他 のビオチン化タンパク質も生産しない酵母宿主を生産するために、欠失させるか 又は機能しないようにすることができる。Ｍｉｓｈｉｎａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕ ｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１１１．７９（１９８０）参照。同様に、８．ｃｏｌｉ により通常リポ化されるタンパク質は、適当に補充された培地上のバクテリアの 生育には、必要なく、それらをコードする遺伝子は、本発明のリポ化融合タンパ ク質を唯Ｔのリポ化タンパク質として生産することのできるバクテリア宿主を生 産するために欠失させることができる。また、脂肪酸の存在下で高温で成長する 、ＢＣＣＰ（Ｅ、ｃｏｌｉにより通常生産される唯一のビオチン化されたタンパ ク質）をほとんど生産しない温度感受性突然変異体Ｅ、ｃｏｌｉ株が開発されて いる。この突然変異体味は、ｆａｂＥと名付けられ、Ｃｏ１１　Ｇｅｎｅｔｉｃ 　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｎｅｗ　Ｈ ａｖｅｎ、　ＣＴから入手できる。

適当な宿主の操作は、本発明−の融合タンパク質の生産が、細胞代謝に必要な内 生タンパク質の翻訳後修飾の減少のために、細胞代謝に有害となりうる可能性を 考慮に入れなければならない。例えば、毒性は、細胞内ビオチンの減少の結果と して、又は利用可能なビオチンリガーゼ活性の滴定のため、又はその両者のため に起こりうる。

ビオチン減少の潜在的な問題は、ビオチンを成長培地に高濃度で供給することに より容易に克服できる。Ｅ、ｃｏｉｉ、　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ及び哺乳類の組織培養細胞のビオチン輸送システムは、ビオチン 減少を排除するのに充分高い割合でビオチンを輸送することができる。Ｂａｒｋ ｅｒ　＆　Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１４３． ７８９（１９８０）；Ｒａｇｅｒｓ　ａｎｄ　Ｌｉｃｈｓｔｅｉｎ、Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１００，５５６（１，９６９）；Ｄａｋｓｈｉｎａｍｕｒ ｔｉｅｔ　ａｌ、　、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　、　４ ４７．３８（１９８５）。高濃度のビオチンが、拡散によりＥ、ｃｏｌｉに入る ことができるという証拠もある。Ｂａｒｋｅｒ＆Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｊ、　Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１４３．７８９（１９８０）。

延長された高レベルのビオチン化融合タンパク質の発現は、内因性のビオチンタ ンパク質のビオチン化の欠失という結果をもたらす。

Ｅ、ｃｏｌｉにおいて、唯一の内因性のビオチン化タンパク質は脂肪酸合成に必 要な工程を触媒するＢＣＣＰである。いくつかの本発明の融合タンパク質の高レ ベルの発現が、ＢＣＣＰのビオチン化を減少させ、宿主しかしながら、Ｂ、ｃｏ ｌｉビオチンリガーゼをコードする遺伝子（ｂｉｒＡ）がクローン化され、ｂｉ ｒＡ　遺伝子を含むマルチコピープラスミドなプラスミドはビオチンリガーゼを 過剰に生産し、ビオチン化融合タンパク質の収量は増加させ、融合タンパク質生 産の可能な成長抑制効果を克服するために使用しうる。特に、Ｂｕｏｎｃｒｉｓ ｔｒａｎｉ　ａｎｄ　０ｔｓｕｋａ、　Ｊ、　Ｂ　ｉｏ　１．　Ｃｈｅｍ、　、 　２６３．ｊ　０１３（１９８８）は、Ｅ、ｃｏｌｉビオチンリガーゼが、細胞 成長に有害な効果を示すことなく、〉６００倍過剰に生産され得ることを報告し ている。同様のプラスミドを用いて、本発明者らは、非常に高度に発現した（約 ３Ｘ１０’分子／細胞）融合タンパク質（実施例８参照）の定量的ビオチン化を 得た。

リガーゼ欠損突然変異体が遺伝的補充によりクローン化を可能にしているにもか かわらず、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅリガーゼ遺伝子は、まだクローン化され ていない。Ｅ、ｃｏｌｉリガーゼは、酵母又は他の異種のシステムで発現し、増 加したりガーゼレベルを提供する。しかしながら、上記のように、酵母内のビオ チン化タンパク質は酵母の成長のために必要な（、それをコードする遺伝子は欠 損又は非機能化されうる。

今日まで、細胞代謝についての問題はりボイル化タンパク質の生産に関連しては 注目されていなかった。リポ酸欠損も、リポエートリガーゼの滴定も起こらない ようにみえる。

次に、形質転換された宿主は慣用の培養条件で、所望の融合タンパク質が発現す るように培養される。融合タンパク質は、また、１ｎｖｉｖｏで翻訳後修飾によ り修飾されるのが好ましい。

本発明は、また、修飾された後にのみ融合タンパク質に結合する結合パートナ− を用意し、結合を可能にする条件で修飾された融合タンパク質を結合パートナ− と接触させることを含む、混合物中の材料から修飾された融合タンパク質を、単 離する方法を提供する。

融合タンパク質を結合パートナ−に結合した後、結合した融合タンパク質を混合 物（例えば、細胞抽出物又は培地）中の他の材料から分離し、その後、融合タン パク質を結合パートナ−から溶離する。

翻訳後修飾部位は、融合タンパク質がまだ結合パートナ−に結合している間に、 又は溶離した後、選択されたタンパク質又はポリペプチドから除去してもよい。

翻訳後修飾部位は、種々の手段により除去しつるが、好ましくは上記の開裂部位 の手段により除去する。

結合パートナ−は抗体でもよい。例えば、ビオチン、４−ホスホパンテティン又 はリポ酸に対する抗体を使用して、これらの化合物の付加により修飾された融合 タンパク質を精製することができる。この抗体は、好ましくは固体支持体に固定 される。抗体を製造し、これをタンパク質の精製に使用する方法はよく知られて いる。

結合パートナ−は、修飾後に融合タンパク質に結合する他の化合物であってもよ い。前記のように、ビオチンは非常に強固に（ＫＤ　１０−”Ｍ）、アビジン及 びストレプトアビジンにより特異的に非共有結合で結合する。この特異的結合は 、立体障害のために結合親和性が、減少するにもかかわらず（Ｋ、約１０−”Ｍ ）、上記に論じたように、タンパク質に共有結合したビオチンまで伸びる。従っ て、ビオチン化された融合タンパク質は、結合パートナ−としてアビジン、スト レプトアビジン又はこれらの２種化合物の類似物又は誘導体を用いて精製しても よい。アビジン及びストレプトアビジンの類似物及び誘導体には、下記のものが 含まれる：アビジン及びストレプトアビジンのサブユニット及び断片；アミノ酸 が欠失、付加又は置換されたアビジン及びストレプトアビジン（フルサイズ、サ ブユニット又は断片）；化学的に修飾されたアビジン及びストレプトアビジン。

いずれの類似物又は誘導体も、特異的にビオチンを結合する能力を保持する限り 適している。

固定化アビジン又はストレプトアビジン又はその類似物又は誘導体のカラムを用 いるのは、抗体カラムを用いるときに時々遭遇する変性の危険が避けられるので 、本発明のビオチン化融合タンパク質を精製する好ましい手段である。そのよう なカラムは、また、抗体カラムより安価に使用できる。さらに、アビジン及びス トレプトアビジンは、タンパク分解及び変性に対して抗体より抵抗性であり、ア ビジン及びストレプトアビジンのカラムライフは、抗体カラムのそれより長い。

アビジン及びストレプトアビジンカラムは、抗体カラムのような他のアフィニテ ィーカラムと同様の方法により製造され、これらの方法はよく知られている。例 えば、アビジン又はストレプトアビジンは、臭化シアンで活性化されたセファロ ースに共有結合されつる。

本発明の方法の好ましい実施態様においては、開裂部位を有するビオチン化融合 タンパク質を含む細胞抽出物又は培地を、固定したアビジン及びストレプトアビ ジンのカラムに通す。抽出物又は培地中のビオチン化融合タンパク質及び他のビ オチン化タンパク質のみが、カラムに保持される。その後、融合タンパク質を開 裂部位で開裂すると、目的のタンパク質又はポリペプチドがカラムから溶離され 、ビオチン化部位を含むポリペプチドはカラムに保持される。開裂部位を、融合 タンパク質又は他のビオチン化タンパク質以外には存在しないように選択すると 、選択された目的のタンパク質又はボ、　リペプチドのみがカラムから溶離する 。アビジン及びストレプトアビジンは、通常、プロテアーゼに抵抗性であるが、 開裂部位はアビジン及びストレプＩ・アビジンに見出されないものが好ましい。

カラム上で融合タンパク質を開裂する場合には、それらの操作がより良好に耐え うると思われることから、通常の親和性のアビジン及びストレプトアビジンのカ ラムを用いるのが好ましいが、アビジン及びストレプトアビジンによるビオチン 部分の非常に強固な結合は、完全なビオチン化融合タンパク質の溶離が望まれる 場合には不利となりうる。アビジン及びストレプトアビジンによるビオチン化タ ンパク質の結合は、実質的に遊離のビオチンとの競合により不可逆的であり、そ のようなカラムからの溶離にはビオチン化タンパク質の変性を起こす著しく厳し い方法を使用しなければならない。

しかしながら、ビオチン及びビオチン化タンパク質に対する親和性が低いアビジ ンカラムは、その通常の四量体型からモノマー型へのアビジンの転化により、容 易に且つ再生可能に製造することができる。そのようなモノマーアビジンカラム は、固定したアビジンカラムをグアニジン溶液で処理することにより得られる。

この処理は、部分的に及び不可逆的に、アビジンを変性し、高い親和性のビオチ ン結合部位の殆どを低い親和性（Ｋ　、約１．０−　’　・〜１．０−’Ｍ）部 位に変える。

残った高い親和性部位は、ビオチンでブロックすることができ、これによりビオ チン含有非変性緩衝液を用いて、結合したビオチン化タンパク質を定量的に溶離 できるカラムが得られる。

低親和性モノマーアビジンカラムの製造及び性質に関する参考文ラムに使用する のに適する材料の製造は低親和性のモノマーアビジンカラムの製造における最初 の工程であるので間接的に記載している。

細胞抽出物又は細胞培地を低親和性モノマーアビジンカラムに通ず場合、ビオチ ン化融合タンパク質及び他のビオチン化タンパク質のみが結合する。結合したビ オチン化タンパク質は、ビオチン含有緩衝液を用いて溶離される。このように、 融合タンパク質は、変性されることな（溶離され、カラムは再利用しうる。

融合タンパク質は、大きさ、電荷又は抗原性をベースとする分離のような慣用の 分離方法により、溶離緩衝液中のビオチン及び他のビオチン化タンパク質のいず れからも分離されることができる。別法として、融合タンパク質は、開裂部位が 存在する場合には開裂部位で開裂されることができ、タンパク質とビオチンの混 合物はアビジン又はストレプトアビジン（通常の高親和性）カラムを通過し、他 のビオチン化タンパク質及びビオチンはカラムに結合する。さらに、開裂部位が 融合タンパク質のセグメント間の結合部に特有である場合、選択された目的のタ ンパク質又はポリペプチドのみがこのカラムから溶離される。

低親和性ストレプトアビジン力ラムを製造することも可能である。

背景のところに記載したように、ストレプトアビジン遺伝子は、クローン化され ている。また、結晶構造は最近解析され、低レゾル−ジョンアビジン構造をスト レプトアビジン構造に実質的に重ねつるパーソナルコミュニケーション。これら の構造は、モノマーアビジンの減少したビオチン結合親和性を説明する。四量体 アビジンにおいては、与えられたサブユニットの疏水性ビオチン結合部位を形成 する四つのトリプトファン残基の一つは、近接した（ｃｙｄａｄ関連）サブユニ ットから誘導され、モノマー化により、この残基がビオチン結合部位から除去さ れ、低親和性が得られる。従って、結晶構造により導かれる部位特異的突然変異 誘発と組み合わせてストレプトアビジン遺伝子を適当に発現させると、モノマー の親和性を有する（又は原理的に与えられたいかなる親和性をも示す）四量体ス トレグ１ヘアビジ２分子が生産される。そのような四量体分子は、プロテアーゼ 及び変性に対してモノマーより安定であり、より優れたカラム結合リガンドを提 供すると考えられる。

リボ化タンパク質上のｒ）ボイル残基は、分子内ジスルフィド結合を含む。リボ 化タンパク質を還元すると、リボイル残基は、チジオールジヒドロイポ酸を形成 し、リボ化融合タンパク質は、モノチオールよりジオールをはるかに強固に結合 する金属化合物を用いて精製されうる。

リボ化融合タンパク質は、ジスルフィド結合を還元してジチオールを生成させる 試薬により還元される。そのような試薬及びそれらを使用する方法はよく知られ ている。適当な還元剤には、水素化ホウ素、モノチオール、例えばメルカプトエ タノール及びチオグリコレート、並びに１，４−ジチオール、例えばジチオトレ イトールが含まれる。１．４−ジチオールが好ましい。

有機層ヒ酸塩は、チオール部分が隣接炭素原子にあるか又はメチレン基により分 離された炭素原子上にある場合（例えば１．２−ジチオール又は１．３−ジチオ ール）、モノチオールよりもジチオールに、さらに強固に結合する。ジヒドロリ ポ酸は、６，８−ジチオールであり、及び有機ヒ素化合物への強固な結合は、生 物学的システムの中で、この化合物に実質的に独特であり、従って、有機層ヒ酸 塩を本発明のリボ化融合タンパク質の精製に使用するように選択するのが好まし い。

適する有機ヒ素は、次式：ＲＡｓ・０（式中、Ａｓ・０は亜ヒ酸塩基（アルシン 酸化物）を表し、Ｒは置換又は未置換の直鎖、枝分かれ鎖又は環状（芳香環を含 む）炭化水素基及びヘテロ原子基を含むあらゆる有機基を表す。有機ヒ素は低分 子量化合物より揮発性が低いので、Ｒは、好ましくは高分子量（＞７５）の残基 である。有機層ヒ酸塩は、下記に記載されているように製造されるｏ　Ｊ、Ｌ、 Ｗｅｂｂ、Ｅｎｚ）＋ｍｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓ、　Ｖｏｌ、　ＩＩＩ、　ｐｐ、　５９５−７９３（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ盾窒■ １９６６）及びＲ，Ｍ、　Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ、“５ｕｌｆｈｙｄｒｙｌ　Ａｇ ｅｎｔｓ：Ａｒ５ｅｎｉｃａｌｓ、”ｉｎＭｅｔａｂｏＩ　ｉｃ　Ｉｎｈｉｂｉ 　ｔａｒｓ、　Ａ　Ｃｏｒｎｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔｊｓｅ、　Ｖｏ ｌ、　ＩＩ、　ｐｐ、@９９−９ ９−１１８（Ａｃａｄｅ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９６３）。

有機層ヒ酸塩は、高分子材料に結合して、有機亜ヒ酸塩カラムを形成する。その ような場合において、Ｒは、ＲＡｓ＝Ｏを高分子材料に結合するための機能性リ ガンド、例えばＮＨ，、ＳＨ及びＣ０ＯＨを含んでいなければならない。そのよ うなカラム及びカラムに使用するのに適する高分子材料の製造方法は、他のアフ ィニティーカラムを製造するのに使用されるものであり、よく知られている。

アガロースに結合した有機亜ヒ酸塩のカラムは、Ｈａｎｎｅｓｔａｄ　ｅｔ　ａ ｌ、　、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１２６．２０ ０（１９８２）に記載されているように製造されうる。細胞抽出物又は細胞培地 を還元し、その後該カラムに通す場合は、リボ化融合タンパク質及び他のリボ化 タンパク質のみが結合する。結合したリボ化タンパク質は、水酸化ナトリウム又 は１，２−又は１，３−ジチオールへ例えばジチオプロピルアミン、ジヒドロリ ポ酸、２，３−ジメルカプト−２−プロパツール又は２，３−ジメルカプト−２ −プロパンスルホン酸を用いてカラムから溶離されつる。このように、融合タン パク質は、変性されることなく溶離され、カラムは再利用できる。

融合タンパク質は、溶離緩衝液中、慣用の分離方法、例えば太き。

さ、電荷又は抗原性に基づく分離により、他のいかなるリポ化タンパク質からも 分離されつる。別法として、開裂部位が存在する場合には開裂部位で融合タンパ ク質を開裂することができ、タンパク質の混合物別を別の有機ヒ素カラムに通す と、融合タンパク質から開裂した他のリボ化タンパク質及びリボ化ポリペプチド がそこに結合する。開裂部位が、融合タンパ−り質または他のリポ化タンパク質 のどこにも存在しないように選択された場合、選択された目的のタンパク質又は ポリペプチドのみがこのカラムから溶離される。

別法として、リポ化融合タンパク質が、有機ヒ素カラムにまだ結合している間に 、開裂部位が存在する場合には開裂部位で融合タンパク質を開裂することができ 、リボ化部位を含むポリペプチドをカラムに保持し、目的のタンパク質又はポリ ペプチドをカラムから溶離しうる。さらに、開裂部位が融合タンパク質のセグメ ント間の結合に特有である場合、選択された目的のタンパク質又はポリペプチド のみがこのカラムから溶離される。

有機亜ヒ酸塩カラムの使用は、抗体カラムを用いる場合にしばしば問題となる変 性の危険が回避できることから、本発明のリポ化融合タンパク質を精製する好ま しい手段である。そのようなカラムはまた、抗体カラムを使用するより安価であ る（約１００〜１０００倍安価）。

さらに、有機ヒ素は抗体と異なりタンパク質分解及び変性に非感受性であり、有 機亜ヒ酸塩カラムのカラムライフは抗体カラムよりはるかに長い。

最後に、ある種のタンパク質（例えば不溶性タンパク質、例えば膜タンパク質） では、又はある条件下では（例えば組み換えＤＮＡ技術により製造されるタンパ ク質がしばしば凝集を生じる場合）、変性剤（例えば分散剤又は強いケイオトロ フイック剤）を使用して融合タンパク質を単離しうるように可溶化させる必要が ある。抗体カラムは、このような状況では使用できないことがしばしばある。

しかしながら、アビジン及びストレプトアビジンは変性剤の存在下でビオチン結 合能を保持するので、通常のアフィニティーアビジン及びストレプトアビジンは 、ビオチン化融合タンパク質の単離に、そのような場合に使用しうる。Ｓｗａｃ ｋ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　匪１１４（１９７８） 参照。この文献は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化したタンパク質 の粗混合物中に存在するビオチン化タンパク質が、アガロース上に固定したアビ ジンのカラムに定量的に結合し、汚染タンパク質を洗浄除去し、そして、ＳＤＳ 中でカラムマトリックスを沸騰することにより溶離されることを開示する。本発 明者らは、１１炭素のアームによりアガロースに結合したストレプトアビジンを 用いてビオチン化タンパク質を均質に精製するこの技術の変法を使用した。

同様に、有機ヒ素カラム及びリボ化部分はタンパク質変性剤により変化を受けな い。変性条件を使用しなければならない場合にこのカラムを用いて融合タンパク 質を精製することができる。実際、有機亜ヒ酸塩カラムは、有機亜ヒ酸塩がアビ ジン及びストレプトアビジンのようなタンパク質ではないことから、そのような 変性剤に対して、アビジン及びストレプトアビジンカラムに比べてはるかに抵抗 性が高い。さらに、有機ヒ素カラムは、アビジン及びストレプトアビジンカラム に比べて安価で、より安定である。従って、リボ化及び有機ヒ素カラムを使用す ることは、融合タンパク質の精製において変性条件を使用しなければならない場 合に、一般的に好ましく、他の適用のためにも経済的観点から好ましい。

しかしながら、リボ化システム又はビオチン化システムを使用するかどうかを決 定する場合に他に考慮すべきことがある。第一に、有機ヒ素は毒性であり、融合 タンパク質生成物に混入した場合（有機ヒ素はカラムに共有結合するため起こり にくいようにみえるカリ、有機ヒ素を他の精製工程に加えて透析を行うことによ り除去しなければならない。第二に、ビオチンのアビジン及びストレプトアビジ ンによる結合は、ジヒドロリポ酸の有機ヒ素への結合に比べて、より特異的であ る。第三に、リボ化タンパク質の還元に使用する試薬、及びそれらを溶離するた めに使用されるジチオールは、鏡開又は鎖内（ｉｎｔｒａ−ｏｒ−ｉｎｔｅｒ　 ｃｈａｉｎ）ジスルフィド結合を還元することによりいくつかのタンパク質を不 活性化しつる。多くのタンパク質はジスルフィド結合を含まず、またそのような 結合は、存在する場合には還元剤が進入できないタンパク胃内に通常埋もれてし まうため、この不利は、タンパク質に特異的である。ジスルフィド結合の還元に より不活化が起こる場合、これは一般的に可逆的であるが、別の工程を精製プロ トコールに加えなければならないであろう。

実施例 下記の実施例において使用される制限酵素及び他の酵素は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ又はＢｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌｓより得られた。ファージＴ４　ＤＮＡリガーゼは、全ての連結及び再 環化に使用された。これらの酵素を使用する際の緩衝液及び反応条件は、上記の 提供者により推奨されているも下記のものを含むハイブリッドＤＮＡ配列を製造 したコ■）　ビオチン付加部位をコードする配列を含む、Ｐｒｏｐｉｏ口ｉｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ　）ランスカルボキシラーゼの１，３Ｓサ ブユニツトの断片をコードするＤＮＡ配列；２）β−ガラクトシダーゼ構造遺伝 子の全部又は一部。二つのＤＮＡ配列は、融合タンパク質が、アミノ末端にβ− ガラクトシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ断片を有し、カルボキシル末端にビ オチンアクセプター配列を有するようにコードされるように融合される。これら のハイブリッドＤＮＡは、適当なベクター上にあり、適当な宿主の形質転換に使 用された。発現を可能にする条件下で培養すると、ビオチン化融合タンパク質が 生産された。

Ｐ、　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ　トランスカルボキシラーセの１．３Ｓサブユニツト のアミノ酸配列が知られており、それをコードする遺伝子がクローン化され、シ ーケンスされている。Ｍｕｒｔｉｆ、Ｂａｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓａｍｏｌｓ、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、［ＪＳＡ、８２．５６１７−２１（１ ９８５）　。カルボキシ末端は、ビオチンのサブユニットへの翻訳後付加に関与 する配列を含む。Ｍｕｒｔｉｆ　ａｎｄＳａｍｏｌｓ、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ 　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６２．１１８１３−１ ６（１９８７）。

１．３Ｓサブユニツトをコードする遺伝子は、ビオシチンリジンコドンの上流に あるＤＮＡ配列に、天然に存在する多数の制限部位を含む。

Ｍｕｒｔ　ｉｆ、　Ｂａｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓａｍｏｌｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２．５６１７|２１ （１９８５）参照。これらの部位を用いて、種々の長さの１，３Ｓサブユニ・ノ ドのカルボキシ末端を有する一連のβ−ガラクトシダーセ融合物を構築した。

これらの構築物の製造のための出発材料は、１．３８サブユニツトをコードする 構造遺伝子を含むプラスミドｐｔａｃ１．３ｔであった。このプラスミドは、Ｖ 、Ｍｕｒｔｉｆ及びり、’Ｓａｍｏｌｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

Ｃａ５ｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｒｅ５ｅｒｖｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃ１ｅｖ ｅｌａｎｄ、０ｈｉｏ　４４１０６から入手した。

別法として、プラスミドｐｔａｃ１．３ｔは、下記の方法により製造しつる。そ の工程の多くは、Ｍｕｒｔｉｆ、　Ｂａｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓａｍｏｌｓ、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｔｌ、　Ａｃこの参考文献に開示されていることは、本明細書 に挿入される。第一に、嫌気的に成長したＰ、　ｓｈｅｒｍａｎｉ　ｉ、　Ｗ５ ２株から抽出したゲノムＤＮＡをＰｓｔＩで完全に切断することにより、ゲノム ミニライブラリーを製造した。この菌株は、アメリカンタイプカルチャーコレク ション（ＡＴＣＣ）、ロックビル　メリーヂンド、寄託番号６２０７から得られ る。

精製されたＰｓＬｒ断片を、ｐＵＣ９（ＡＴＣＣから、寄託番号３７２５で得ら れる）のＰｓｔ１部位に挿入し、得られたプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｃｏｌｉＨＢｌｏｌ（ＡＴＣＣから寄託番号３３６９４で得られる）を形質転 換するのに使用した。陽性のコロニーを、標識したノへイブリダイゼーションプ ローブを用いて同定し、ｐＵＣ９のＰｓｔ１部位に１．３ｓサブユニツトをコー ドする遺伝子を含む１．７ｋｂのＰｓｔＩ断片を含むプラスミドｐＴｃ１．３を 単離した。

プラスミドｐＴｃ１．３ｔをプラスミドｐＴｃ１．３から次のようにして構築し た。

プラスミドｐＴｃ１．３を、Ｐｓｔｌ及び５ｆａＮｆで切断し、■、３Ｓサブユ ニツトをコードする短くなった断片を得た。この断片の５ｆａＮＩ末端をＴ４Ｄ ＮＡポリメラーゼで平滑にし、該断片をｐＵＣ９のＰｓｔｌ及びＳｍａ　Ｉ部位 に挿入した。プラスミドｐＴｃ１．３ｔの短（なった挿入物は０，４キロベース の長さで、４０塩基対の５１−フランキング配列及び３０塩基対の３′−フラン キング配列に加えて、１．３３サブユニツトの１２３残基をコードする配列から なる。

プラスミドｐｔａｃ１．３ｔにおいて、ｐＴｃｌ、３ｔの０．４キロベースの挿 入物は、発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）のｔ ａｃプロモーターの隣に位置している。プラスミドｐｔａｃ！、　３ｔを、プラ スミドｐＴｃ１．３ｔをＨｉｎｄｌｌＩ及びＥｃｏＲＩで切断することにより製 造した。末端を、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで満たし、該断片をプラスミドｐＫ Ｋ２２３−３のＳｍａＩ部位に連結して、プラスミドｐｔａｃ１．３ｔを形成し た。

さらに使用される方法、種々の材料性質並びに起源の詳細の記載は、上記で引用 したＭｕｒｔｉｆ　ａｎｄ　Ｓａｍｏｌｓ、　Ｍｕｒｔｉｆ、Ｂａｈｌｅｒ　ａ ｎｄ　Ｓａｍｏｌｓの記事に見出されるであろう。

第２１図の最後に、ハイブリッドＤＮＡに使用される１、　３Ｓ遺伝子の断片に よりコードされるアミノ酸配列が示されている。使用される四つの断片は、１． ３３サブユニツトのカルボキシル末端の１０６のアミノ酸、カルボキシル末端の ７５のアミノ酸、カルボキシル末端の６１のアミノ酸、及びカルボキシル末端の ３８のアミノ酸をコードする。これらの断片は、プラスミドｐｔａｃ１．３ｔの １．３Ｓサブユニツト構造遺伝子を、各々下記に記載する制限酵素５ａｌｌ、Ｎ ａｒ　Ｉ、Ｎａｅ　Ｉ及びＸｈｏＩで切断することにより誘導される。

ハイブリッドＤＮＡ配列は、これらの１．３３サブユニツトの部分をコードする 断片に加えて、下記のものの一つを含む：ｌ）発現時に活性酵素を生成するβ− ガラクトシダーゼをコードする全配列：２）最後の１６のアミノ酸（不活性酵素 ）を除いてβ−ガラクトシダーゼの全てをコードするＤＮＡ配列；３）タンパク 質（不活性酵素）の６５％のアミノ末端をコードするＤＮＡ配列、又は４）タン パク質（不活性酵素）の末端アミノ酸４個のみをコードするＤＮＡ配列。

１、融合物Ａの製造 融合物Ａは、正確な解読枠で１．３３サブユニツトのカルボキシル末端の１０６ のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列に連結したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の全 コード配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列である。

第２１図参照。

融合物Ａを含むプラスミドｐＣＹ４９Ｊを、第３図及び第４図に示すように製造 した。上記のように、プラスミドｐｔａｃ１．３ｔを、ＢａｍＨＩ及び５ａＩＩ で切断した。この断片を、プラスミドｐＢＲ３２８のＢａｍＨＩ及び５ａＩＩ部 位に挿入して、プラスミドｐＣＹ４６を製造した。プラスミドｐＢＲ３２８は、 ＡＴＣＣの寄託番号３７５１７から得られる。次にプラスミドｐＣＹ４６を５ａ ｌｌ及びＰｓｔｌで切断し、得られた断片をプラスミドｐＢＲ２８８のＳａ、Ｉ ｒ及びＰｓｔ１部位に連結して、融合物Ａを含むプラスミドｐＣＹ４９Ｊを製造 した。

プラスミドｐＵＲ２８８は、Ｓａ、１１．　ＢａｍＨＩ　、ＸｂａＩ及びＨｉｎ ｄＩ１１部位である３　′末端に特有のクローニング部位を有するＩａｃＺを含 む。プラスミドｐｌＪＲ２８８の製造及びその性質は、Ｒｕｔｈｅｒ及びＭｕｌ ｌ、ｅｒ−旧１１．Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　２．１７９１−９４（ １９８３）に記載されている。これは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ　ｚｕ　Ｋｏｌ ｎ、５０００　Ｋｏｌｎ　４１．ＦＲＧのＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉ　Ｉ　Ｉ教授から 得られる。

ｐＵＲ２８８の１ａｃＺ遺伝子の３′末端の特有なりローニング部位を製造する リンカ−の一部は、融合物Ａ構造に保持され、融合物Ａのβ−ガラクトシダーゼ 及び１．３３サブユニット断片をコードする配列の間に位置させる（第２１図に ソへＶ）で表す）。

２、融合物Ｂの製造 融合物Ｂは、正確な解読枠で１．３３サブユニツトのカルボキシル末端の７５の アミノ酸をコードするＤＮＡ配列に連結したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の全コ ード配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列である。

第２１図参照。

融合物Ｂを含むプラスミドｐｃＹ７４を、第５図、第１１図及び第１２図に示す ように製造した。第一に、融合物Ａを含むｐＣＹ４９Ｊを、ＥｃｏＲＶで線状化 し、カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＵｃ４ＫからのＨｉｎｄＩＩ断 片を、ｐＣＹ４９ＪのＥｃｏＲＶ部位に挿入して、プラスミドｐＣＹ５６を製造 した（第１１図参照）。

プラスミドｐＵＣ４には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ、Ｐｉｓｔａｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙから得られる。Ｖｉ ｅｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ、　１９．２１９（１９８２）参 照。

次に、プラスミドｐＣＹ５６をＮａｒ　！で切断する。プラスミドｐＴＺ１８Ｒ をＡｃｃＩで線状化し、そしてｐＣＹ５６から得られたＮａｒ　Ｉ断片をｐＴＺ １８ＲのＡｃｃ１部位に連結してプラスミドｐＣＹ６６を製造する（第１２図参 照）。Ａｃｃｌ切断により、Ｎａｒ　Ｉにより製造される末端に相補的な突出し た５　′末端を製造することができる。

プラスミドｐＴＺＩ８Ｒは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙから得られる。また、Ｍｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｔ、　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒ、　１．６７：（１９８６）参照。

最後に、プラスミドｐＣＹ６６をＸｂａＩ及びＸｍｎ　Ｋで切断し、得られた断 片をｐＵＲ２８８のＸｂａｌ及びＸｍｎ１部位に連結して、融合物Ｂを含むプラ スミドｐＣＹ７４を製造した（第５図参照）。

３、融合物Ｃの製造 融合物Ｃは、正確な解読枠で１．３Ｓサブユニツトのカルボキシル末端の６１の アミノ酸をコードするＤＮＡ配列に連結したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の全コ ード配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列である。

第２１図参照。

融合物Ｃを含むプラスミドｐｃＹ９０を、第６図及び第１２図に示すように製造 した。プラスミドｐＵＣ８をＡｃｃＩで線状化し、プラスミドｐＣＹ５６（第１ ．１図に示すように製造した）をＮａｒ　ｒで切断した。ｐｃｙｓａのＮａｒ　 Ｉ断片を、ｐＵＣ８のＡ　ｃ　ｃ、１部位に挿入してプラスミドｐｃｙａｓを製 造した。

（第１２図参照）。

その後、プラスミドｐｃＹ６８をＮａｅ　Ｉで切断した。プラスミドｐＵＲ２８ ９をＢａｍＨＩで切断し、末端をＤＮＡポリメラーゼ■及びｄＮＴＰ’　ｓを用 いて満たした。ｐｃｙｅａのＮａｅＩ断片を上記のように処理したｐＵＲ２８９ に連結し、融合物Ｃを含むプラスミドｐｃＹ９０を製造した。

プラスミドｐｔｌＲ２８９は、５ａｌｌ、　Ｂａｍ旧、　Ｘｂａｌ及びＨｉｎｄ １１１部位である３　ｌ末端に特有なりローニング部位を有する１ａｃＺ遺伝子 を含む。

ｐＵＲ２８９に特有なりローニング部位を製造するリンカ−の部分は、融合物Ｃ 構造に保持される（第２ｉ図に’ｖＶＶｖＶで表す）。

プラスミドｐＵＲ２８９の製造及びその性質は、Ｒｕｔｂｅｒ及びＭｕｌｌｅｒ −Ｈｉｔｌ、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　２．１７９１−９４（１９ ８３）に記載されている。プラスミドｐＵＲ２８９はＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉ　１１ 教授から−得られた。

プラスミドｐＵＣ８はよく知られたベクターである。これは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ及びＰｈａｒｍａｃｉａ　 ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙか融合物りは、１．３Ｓサブユニツトのカ ルボキシル末端の３８のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列に正確な解読枠で連結 したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の全コード配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列 である。

第２１図参照。

融合物りを含むプラスミドｐＣＹ８４を、第７図に示すように製造した。プラス ミドｐＣＹ８４は、ｐＣＹ４９Ｊを５ａｉｌ及びＸｈｏ　Ｉで切断し、再び環化 して製造される。

５、融合物Ｅの製造 融合物Ｅは、１．３３サブユニツトのカルボキシル末端の７５のアミノ酸をコー ドするＤＮＡ配列に正確な解読枠で連結したβ−ガラクトシダーゼの１００６個 のアミン末端アミノ酸をコードする配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列である。

第２１図参照。

融合物Ｅを含むプラスミドｐＣＹ７２を、第８図に示すように製造した。ここに 示すように、このプラスミドは、ｐＣＹ６６（第１２図に示すように製造される ）をＸｍｎ１及びＥｃｏＲＩで切断し、得られた断片をｐＵＲ２８８のＸｍｎ　 Ｉ及びＥｃｏＲＩ部位に連結してプラスミドｐＣＹ７２を形成することにより製 造される。

６、融合物Ｆの製造 融合物Ｆは、正確な解読枠で１．３３サブユニツトのカルボキシル末端の７５の アミノ酸をコードするＤＮＡ配列に連結したβ−ガラクトシダーゼの６５０個の アミノ末端アミノ酸をコードする配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列である。第 ２１図参照。

融合物Ｆを含むプラスミドｐＣＹ７３を、第９図に示すように製造した。ここに 示すように、プラスミドｐＣＹ７３は、ｐＣＹ６６（第１２図に示すように製造 される）をＸｍｎ１及び５ｓｔＩで切断し、得られた断片をｐＵＲ２８８のＸｍ ｎＩ及び５ｓｔＩ部位に連結してプラスミドｐＣＹ７３を形成することにより製 造される。

７、融合物Ｇの製造 融合物Ｇは、正確な解読枠で１．３Ｓサブユニツトのカルボキシル末端の１０６ のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列に連結したβ−ガラクトシダーゼの最初の４ 個のアミン末端アミノ酸をコードする配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列である 。第２１図参照。

融合物Ｇを含むプラスミドｐｃＹ１１９を、第１０図に示すように製造した。こ こに示すように、プラスミドｐｔａｃ１．３ｔは、ＨｉｎｄＨＩで切断され、そ の後、部分的に５ａｌｌで切断される。得られた断片をｐＵｃ８のＨｉｎｄＩＩ Ｉ及び５ａｉｌ部位に連結してプラスミドｐｃＹ１１９を形成した。

８、融合物Ｈの製造 融合物Ｈは、正確な解読枠で１．３３サブユニツトのカルボキシル末端の７５の アミノ酸をコードするＤＮＡ配列に連結したβ−ガラクトシダーゼの最初の４個 のアミノ末端アミノ酸をコードする配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列である。

第２１図参照。

融合物Ｈを含むプラスミドｐＣＹ６８を、第１２図に示すように製造した。プラ スミドｐＣＹ６８を製造するために、プラスミドｐｃＹ５ＢをＮａｒｌで切断し 、プラスミドｐＵＣ８をＡｃｃＩで切断した。これらを合わせ、再環化すること により、融合物Ｈを含むプラスミドｐＣＹ６８を製造した。

９、融合物Ｉの製造 融合物Ｉは、正確な解読枠で１，３Ｓサブユニツトのカルボキシル末端の３８の アミノ酸をコードするＤＮＡ配列に連結したβ−ガラクトシダーゼの最初の４個 のアミン末端アミノ酸をコードする配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列である。

第２１図参照。

融合物丁を含むプラスミドｐｃＹ１２０を、第１３図に示すように製造した。こ こに示すように、プラスミドｐｔａ、ｃ１．３ｔは、ＨｉｎｄｌＩＩ及びＸｈｏ ｌで切断される。得られた断片をｐＵＣ８のＨｉｎｄＩＩＩ及び５ａｉｌ部位に 挿入して融合物Ｉを含むプラスミドｐｃＹ１２０を形成した。Ｘｈｏ　Ｉ消化に より、５ａｌｌにより製造された断片に相補的な突出した５“末端を有する断片 を得た。

いくつかのＥ、ｃｏｌｉ株を上記で製造した融合物Ａ−Ｉを含むベクターで形質 転換した。形質転換は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｐｐ、４０３−４３３（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｃ！　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ 　１９８２）に記載されているように、Ｈａｎａｈａｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉａｓ、　、　１６６゜５５７（１９８３）により推奨されるように全ての緩衝 液中に２０＋ｎＭのＭｇＣ１□を含むことにより修飾して行った。

使用したＥ、ｃｏｌｉ株は、ＮＭ５２２及びその制限陽性親ＢＭＨ７１−１８， Ｆ　’　１１ｒｅｃＡ；ＤＨ５ａ　；Ｆ　’　Ｍ１５ｒｅｃＡ；及びＭＣ１０６ １である。株ＢＭＨ７１，−１８並びにＦ１］１ｒｅｃＡは、Ｂ、　Ｍｕｌｌｅ ｒ−Ｈｉｌｌ教授より贈られ、Ｒｕｔｈｅｒ及びＭｕｌｌｅｒ−１（ｉｔｌ、Ｔ ｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　２．１７９１−９４（１９８３）に記載され ている。ＤＨ５ａ株は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓから得られる。ＮＭ５２２株、Ｆ′Ｍ１５ｒｅｃＡ株及びＭＣ１０６ １株は、ＡＴＣＣから、各々４７０００．３３９０４．及び５３３３８の寄託番 号で得られる。５つの株全ての主な特性は高い形質転換頻度であった。

ＤＨ５ａ株、Ｆ’　Ｍ１５ｒｅｃＡ株、ＮＭ５２２株及びＢＭＨ７１−１８株は 、不活性β−ガラクトシダーゼを生産する１ａｃＺ遺伝子（Ｍｌ、５と呼ばれる ）の小さな欠失を有し、その活性はｐＵｃ８及びｐＴＺ１８Ｒのようなベクター によりコードされる第二の不活性β−ガラクトシダーゼ断片の存在により回復し うる。この二つの不活性タンパク質からの活性β−ガラクトシダーゼの製造方法 は、α−コンプリメンテ−ジョンと呼ばれ、ｐＵＣ８、ｐＴＺ１８Ｒ及び同様の ベクターの１ａｃＺ配列に置かれるポリリンカー配列内のＤＮＡ断片の挿入が、 β−ガラクトシダーゼ活性の損失に帰するので、一般的に使用されている。この 活性の損失は、５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−ガラクトシダーゼ（ Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から購入しうる）を下記のように製造さ れる培地に含有させることにより明らかにされる。

Ｆ’　１１ｒｅｃＡ株は、完全な染色体のラクトースオペロンの欠損を有するが 、ラクトースオペロンリプレッサータンパク質を過剰に生産するＩａｃｌＱ領域 を含むＦ°ファクターを含む。ＢＭＨ７１−１８株及びＮＭ５２２株も、Ｆ’　 １ａｃｌＱフアクターを含む。ラクトースリプレッサーは、ラクトースオペロン 誘導融合タンパク質の発現を調節する。

形質転換方法に使用される培地は、１％のバタト　トリプトン（ＤｉｆｃｏＬａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入）、０．１％のバクト　イースト　エキストラク ト（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入）、及び０．５％のＮａＣ １からなるブロスである。固体の培地は、１．５％のアガロースを含む。

形質転換体を選択するために、所望により抗生物質を添加する。

それらは、アンピシリンナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）　、硫酸カナマイシン （５０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ　）の最終濃度 が得られるように添加される。抗生物質は、液体培地又は溶融させた５５℃の寒 天培地に、ペトリ皿に注ぐ直前に添加される。全ての抗生物質は、３ｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から購入される。

２、放射線標識したビオチン化タンパク質の分析融合物Ａ−１で上記のように形 質転換したＥ、ｃｏｌｉ株を、トリチウム化したビオチンを用いて培養して融合 タンパク質を標識した。バクテリアを３７℃で、０．４％のグリセロール、０． １％のビタミンフリーカゼイン加水分解物、４１ｎＭのドーリチウム化ビオチン （ＩμＣｉの３Ｈビオチン／ｍｌ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ、ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ ｒ　ｏｒ　Ａｍｅｒｓｈａｍより購入）及びプラスミドメインテナンスを選択す るのに適する抗生物質を含む最小培地Ｅ中、１．−２　Ｘｌ０ｇ細胞／ｍｌにな るまで培養した。

−晩培養した後、Ｉ−２ＸＩＯ＠の細胞を含む０．１ｍｌの培養液を、１ｍＭの イソプロピル−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇ＋ｎａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ。

から購入）を添加した同じ培地１．０ｍｌを含む試験管の中に入れた。

細胞を２時間培養し、融合タンパク質の発現を得、その後、細胞を回収し、８Ｍ の尿素及び１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）を含むｐＨ６，８のＴｒｉ ｓ−ＨＣｌ　１２．５ｍＭの溶液内で溶解した。細胞抽出物を、ＳＯ３の存在下 、非連続的モードで作動する７、５％のポリアクリルアミドゲル上で分離した。

ゲルを、Ｅｎｈａｎｃｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから購入） に浸漬することによりフルオログラフ化し、その後プレフラッシュドフィルムに 露光した。結果を第２１図に示す。

ビオチン化タンパク質の製造は、ビオチンのストレプトアビジン又はアビジンに よる結合をベースとする技術を用いて検出すること１８４、印刷中参照。

３、バイオオペロン抑制解除の検定 ビオチン（ｂｉｏ）オペロン抑制解除を、融合物の各々について検定した。ｂｉ ｏオペロンは、ビオチンを合成する酵素をコードする遺伝子を含む。ビオチン生 合成酵素の合成速度は、リプレッサーにより調節され、その活性は、ビオチンの 外部からの供給に依存し、Ｅ、　ｃ。

ｌｉ中、ビオチンアクセプタータンパク質の細胞レベルに感受性であしかしなが ら、このオペロンの調節は、二つの新規な性質の通常の酵素抑制システムとは異 なる。第一に、リプレッサータンパク質及びビオチンリガーゼは同じタンパク質 である。これは、タンパク質がビオチンオペレーター特異ＤＮＡ結合領域とりガ ーゼ活性部位の両方を含むことである。第二の新規な性質は、ＤＮＡ結合を活性 化するコリプレッサーがビオチンではなく、ビオチノイル＝ＡＭＰであり、これ は、ビオチンリガーゼ活性の最初の半分の反応の生成物である。

前掲書。ビオチノイル−ＡＭＰは、アクセプタービオチンタンパク質のビオチン 化に消費されるまで酵素結合を残す。

ｂｉｏオペロン転写（抑制解除）の最大速度は、ビオチン供給が深刻に制限され た場合に起こる（例えばｂｉｏ栄養要求体のビオチン枯渇）。合成されたいかな るビオチノイルＡＭＰも、アクセプタータンパク質のビオチン化において急速に 消費されるので、リプレッサーリガーゼビオチノイル−ＡＭＰコンプレックスは 検知し得る量で蓄積されれることなく、ｂｉｏオペレーターは非常にまれに供給 され、転写が最大になる。従って、ビオチン化は、ビオチノイル−ＡＭＰを消費 し、ｂｉｏオペロンの抑制解除に帰する。

ｂｉｏオペロンの抑制解除は、インディケータ−プレート上で観察することがで き、β−ガラクトシダー・セ活性により下記のように定量され、これにより、Ｅ 、ｃｏｌｉ内のビオチン化タンパク質融合物の合成の検定手段が提供される。こ のシステムは、ビオチン化されるが、分解される融合物を、ビオチン化されなか ったものから区別するこ（１９８８）に記載されたように、融合物Ａ−１を含む ベクターを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉのＢＭ２６６１株を形質転換することにより行 った。株ＢＭ２６６１は、Ｅ、ｃｏｌｉのｂｉｏ　ＢＣＤＦオペロンのプロモー ターに融合した切りつめたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。ビオチン生合成 が抑制解除された場合、β−ガラクトシダーゼが生産され、一方、外来ビオチン が高濃度で培地中に存在する場合には、非常に低い発現が見られる。

株ＢＭ２６６１は、スタッフォード大学のＤｒ、　Ｃａｍｐｂｅ　１．　Ｉより 得られた。

使用したインディケータ−培地は、４１ｎＭ又は５μＭのビオチンが添加された ＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトース（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購 入）である。この培地上で、抑制コロニーは白いが、抑制解除コロニーは抑制解 除の程度に依存してピンク又は赤である。結果を第２１図に示す。

いるように、細胞を破壊し、β−ガラクトシダーゼを０−ニトロフェニルガラク トシダーゼの加水分解により分析することにより行った。

４、結果 上記の二つの分析の結果を第２１図に示す。ビオチン化タンパク質カラム中の“ ＋”は、期待された大きさ及び量のトリチウム化融合タンパク質が検出されたこ とを示す。抑制解除カラム中の“＋”は、ビオチンオペロンの転写が、４１ｎＭ のビオチン（野性種の細胞に最大の抑制解除を与える最小濃度）の存在下で、少 なくとも１０倍増加したことを示し、“＋＋”は、５μＭのビオチンで少な（と も１０倍の抑制解除が見られたことを示す。

第２１図に示すように、１．３３サブユニツトのカルボキシル末端の３８アミノ 酸のみをコードする融合物りにより生産され、ビオシチンリジン残基からカルボ キシル末端までのアミノ酸残基であるタンパク質は、ビオチン化されなかった。

このことは、ビオシチンリジンの上流の配列が、ビオチンリガーゼによるタンパ ク質の認識に必要であることを示す。

必要とされる配列は１．’３Ｓサブユニット（推定β−ターン）ｐｒｏ−ａｌａ −ｐｒｏ配列（残基５８−６０）であると思われる。というのは、このセグメン トを欠く、融合物Ｃ及びＤにより製造されたタンパク質はビオチン化されず（第 ２１図参照）、一方、このセグメントを含む融合物Ａ。

Ｂ、及びＥ−Ｈは、ビオチンを結合したからである（第２１図参照）。しかしな がら、リガーゼ認識のために重要なこの領域には、より多くの微妙な構造があり うる。

特に興味があるものは、１．３Ｓサブユニツトの最後の７５カルボキン末端アミ ノ酸からなるビオチン化部位を有する融合物Ｂ、　Ｅ、　Ｆ、及びＨである。こ れは、ビオチン化を与えるこれまでに見出された最小のアミノ酸配列である。

ビオチン融合物のい（つかは、細胞内プロテアーゼにより分解されることに注意 すべきである。融合物Ｅは予想された、マイグレーション位置に非常に弱いビオ チン化タンパク質結合を生成した。この結果は、β−ガラクトシダーセとビオチ ン結合配列の間の結合のタンパク分解クリッピングのためであると信じられてい る。ＤＮＡセグメントの結合は、β−ガラクトシダーゼ１ａｃＺ遺伝子のＥｃｏ Ｒ１部位である。この部位は、λｇｔｌｌシステムにおいて使用されてきており 、融合部のタンパク分解クリッピングが、多くの融合物において観察されている 。Ｃａｒｒｏｌｌ及びＬａｕｆｈｏｎ、　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｖｏｌ、 　３．　ｐｐ、　８９−１ｌｌ（Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｄ、　、　ＩＲＥ、　Ｐｒｅ ｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｕ、　Ｋ、　１９８７　）このタンパク分解開裂の問 題は、プロテアーゼ欠損Ｅ、ｃｏｌｉ宿主を用いることにより、又は融合タンパ ク質の二つのセグメントの結合の配列を変えるこにより解決すべきである。

しかしながら、融合物の分解は、非機能性アクセプター配列を有する融合物では なく、分解した融合物により与えられるビオチンオペロンの抑制解除により、非 機能性アクセプター配列から区別されうる。第２１図に示されるよう−に、アク セプター配列が機能的であることを示す高レベルの融合物Ｅの抑制解除があった 。

第１４図は、上記のトリチウム化標識方法を用いることにより得られる典型的な フルオログラフを示す。第１４図において、欄１は、融合物Ａにより製造された タンパク質を含み、欄２は、融合タンパク質を含まず、欄３は、融合物Ａにより 製造されたが誘導されなかったタンパク質を含み、欄４は、融合物Ｂにより製造 されたタンパク質を含み、欄５は、融合物Ｅにより製造されたタンパク質を含み （ぼんやりしたバンドが過剰露光の際に観察された）、欄６は、融合物Ｆにより 製造されたタンパク質を含む。全ての欄において、より低いバンドは、内因性Ｅ 、ｃｏｌｉビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質を示す。

融合物Ｊは、Ｔｎ９クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアミノ 末端の２０９のアミノ酸をコートするハイブリッドＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ 配列は１，３Ｓサブユニツトのカルボキシル末端の７５のアミノ酸をコードする 。第２１図参照。

融合物Ｊを含むプラスミドｐＣＹ９４を、第１５図に示すように製造した。ここ に示したように、プラスミドｐＣＹ、６６（第１２図に示すように製造される） をＳｍａＩ及びＳｐｈ　ｒで切断した。得られた断片を、ｐＨ３Ｇ３９７の５ｅ ａｌ及びｓｐｈ　Ｉ部位に挿入して融合物Ｊを含むプラスミドｐＣＹ９４を形成 した。

プラスミドｐＨ５Ｇ３９７は、東京の日本ガンリサーチリソースバンクから得ら れた。Ｔａ１ｅｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、６１．６３（１９８７） 参照。

プラスミドｐＣＹ９４をＥ、　ｃｏｌ　ｉのＤＨ５ａ株及び８Ｍ２６６１株の形 質転換に使用した。株ＤＨ５αを、実施例１に記載したように、トリチウム化ビ オチンとインキュベートして、株ＢＭ２６６１を、ラクトースオペロンインデュ ーサーを添加しないこと以外は、実施例１に記載したように抑制解除について試 験した。

結果を第２１図に示す。ここに示したように、ビオチン化融合タンパク質は株Ｄ Ｈ５αに製造され、ｐＣＹ８４を株ＢＭ２６６１に導入した場合に、抑制解除が 見られた。

コードするＤＮＡ配列の製造及び発現 融合物には、Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ末端の４４ のアミノ酸をコードするハイブリッドＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列は１．３ ３サブユニツトのカルボキシル末端の７５のアミノ酸をコードする。第２１図参 照。

融合物Ｋを含むプラスミドｐｃＹ１１８を、第１６図及び第１８図に示すように 製造した。まず、トランスポゾンＴｎ５を含むファージラムダｂ２２１からのＤ ＮＡを単離し、Ｂａｍ旧及びＨｉｎｄｌＩＩで切断した。末端をＥ。

ｃｏ　ｌ　ｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ断片）及びｄＮＴＰ’　ｓで満 たした。その後、該断片をｐＵＣ８のＳｍａ　１部位に挿入してプラスミドｐＣ Ｙ５を製造した。次にｐＣＹ５をＮａｒＴとＢｇｌｌで消化し、得られた断片を ｐｔａ、ｃｌ、３ｔのＮａｒｌ及びＢｇ１１部位に挿入して、融合物Ｋを含むプ ラスミドｐｃＹ１１８を製造した。

トランスポゾンＴｎ５はり、Ｂｅｒｇ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。

Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、から得られた。その製法はＢｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７２．３６２８−３２（ １９７５）に記載されている。Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを コードする類似のＤＮＡセグメントは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙから得られる。

プラスミドｐＣＹ１１８は株ＢＭＨ７１−１８を形質転換するのに使用された。

この形質転換は、上記実施例１に記載したように行われた。

形質転換されたバクテリアを、実施例Ｉに記載したように、トリチェラム化ビオ チンと共に培養し、実施例２に記載したように抑制解除を分析した。結果を第２ １図に示す。ここに示したように、ビオチン化融合タンパク質が製造され、抑制 解除が見られた。

融合物Ｍは、Ｔ口９０３ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのアミノ末端の ４１のアミノ酸をコードするハイブリッドＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列は１ ．３３サブユニツトのカルボキシル末端の７５のアミノ酸をコードする。第２１ 図参照。

融合物Ｍを含むプラスミドｐｃＹ１１．７を、第１９図に示すように製造した。

まず、プラスミドｐＣＹ６６（第１２図に示すように製造される）をＰｓＵで線 状化し、再環化してプラスミドｐｃＹ１１．５を形成した。プラスミドｐＵＣ４ ＫをＥｃｏＲＩで切断し、得られた断片をｐｃＹ１１５のＥｃｏＲ１部位に連結 し、プラスミドｐｃＹｌ１６を形成した。最後に、プラスミドｐｃＹ１．１６を Ｃ１ａｌ及びＸｍａ　Ｉで切断した。末端をＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ■ （フレノウ断片）及びｄＮＴＰ’　ｓで満たし、プラスミドを再環化し、融合物 Ｍを含むプラスミドｐＣＹ１１７を形成した。

プラスミドｐｃＹ１１７を、Ｅ、ｃｏｌｉのＭＣ１０６１株の形質転換に使用し た。

この形質転換は、上記の実施例１に記載したように行った。形質転換されたバク テリアは、実施例１に記載したようにトリチウム化ビオチンとともにインキュベ ートし、実施例２に記載したように抑制解除を分析した。結果を第２１図に示す 。ここに示したように、ビオチン化融合タンパク質が製造され、抑制解除が見ら れた。

酵母のＨＩＳ３タンパク質をコードする遺伝子を、Ｅ、ｃｏｌｉ内で発現させた （プロモーター及びリポソーム結合機能を提供する外来の配列の存在による）。

ここではそれが、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｈｉｓＢ突然変異体を補完する。５ｔｒｕｈｌ 　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１３６．３０９− ３３２（１９８０）。最後の六つのアミノ酸を除いて、完全なＨＩＳ３タンパク 質をコードするハイブリッドＤＮＡ配列を、１，３Ｓサブユニツトのカルボキシ ル末端の７５アミノ酸をコードする配列に融合したものを、製造し、Ｅ、　ｃｏ ｌ　ｉとＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの両方で発現させ、ビオチン化した。この ハイブリッドＤＮＡ配列は、第２１図に示される融合物Ｉ７である。

融合物りを含むプラスミドｐｃＹ１０６を、第１７図に示すように製造した。ま ず、プラスミドｐＷＪ７９をＢａｍＨＩで切断し、得られた断片をプラスミドＹ Ｅｐ２４のＢａｍＨ１部位に連結し、プラスミドｐｃｙｔｏｓを形成した。

プラスミドＹＥｐ２４は、Ｅ、ｃｏｌｉ及びＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの両方 で複製できるシャトルベクターである。これは、ワシントン、シアトルのワシン トン大学のＤｒ、　Ｔ、　Ｎ、　Ｄａｖｉｓから得られたが、ＡＴＣＣからｐＲ Ｂ５．寄託番号３７０５１としても得られる。Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｇｅｎｅ、　８．１７（１９７９）参照。

プラスミドｐＷＪ７９は、ワシントン、シアトルのワシントン大学の叶、　Ｔ、 　Ｎ、　Ｄａｖｉｓから得られた。これは、５ｔｒｕｈｌ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ の旧Ｓ３−含有ＢａｍＨＩ断片からなり（Ｓｔｒｕｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍ ｏ１．Ｂｉｏｌ、、１３６，３０９−３２０＜１９８０）に記載）　、ｐＢＲ３ ２２のＢａｍＨＩ部位にクローン化されている（Ｔ、　Ｎ。

Ｄａｖｉｓ、パーソナルコミュニケーション）。プラスミドｐＢＲ３２２は、ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから得られ、またＡＴＣＣから寄託番号３１３４ ４として得られる。旧Ｓ３　ＤＮＡ断片はＡＴＣＣからｐＲＢ］、４．寄託番号 ３７０６３として得られる。

次に、プラスミドｐＣＹ６６をＫｐｎ　ｒ及びｓｐｈ　Ｉで切断し、得られた断 片をプラスミドｐｃＹ１０５の対応する部位に挿入し、融合物りを含むプラスミ ドｐＣＹ１０６を製造した。

プラスミドｐｃＹ１０６は、ε、ｃｏｌｉ株ＤＩＩ５αでは、抗生物質耐性の選 択により、またＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＴＹ１８６ではウラシル独立の 選択により維持された。株ＣＴＹ１８６は、ＬＹＳローカスに染色体のＵＲＡ３ 及びＩ（ＩＳ３の欠損並びにナンセンス領域を含む。株ＣＴＹ１８６は、Ｓ、　 Ｅｍｒ、　Ｃａｌ　１ｆｏｒｎｉａＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙから得られた。もともとは、イリノイ大学のＤｒ、　Ｂ、　Ｂａｎｋａ　 ｉｔ　ｔｓにより製造された。実質的にＣＴＹ１８６と同じ株である５ＨＹＩが 、ＡＴＣＣから寄託番号４４７６９として得られる。他の実質的に同じ株は、Ｙ ｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５ｔｏｃｋ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕ ｎｔｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　Ｃａ １ｉｆｏｒｎｉａから得られる。

酵母株の形質転換は、Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ ｇｙ、　１５３．１６３−１６８（１９８３）により記載されたように行われた 。

ビオチン化タンパク質を標識するために、酵母を、グルコース（０，６％）　、 ３０μｇ／ｍｌのリジン及びビオチン２０ｎＭ（１ｕ　Ｃｉ／ｍｌ　）を添加し た最小培地で生育させた。ヒスチジン−ＨＣｌを２．５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ ／ｍ１添加した。低量のヒスチジン濃度では、ＨＩＳ３転写の抑制解除が起こっ た。５ｔｒｕｈ１．　Ｎａｔｕｒｅ、　３００．２８４−２８７（１９８２）。

酵母細胞をフレンチプレッシャーセルで粉砕し、不溶の夾雑物を遠心分離により 除去した。タンパク質をトリクロロ酢酸沈澱により上澄みから回収し、酸を洗浄 して除き、ＳＤＳ緩衝液（実施例りに記載）に溶解し、１２．５％のポリアクリ ルアミドゲル上で電気泳動を行った。ゲルを、実施例１に記載したようにフルオ ログラフにかけた。

ｐｃＹ１０６を含むＥ、ｃｏｌｉ株ＤＨ５αを、実施例１に記載したように標識 し、電気泳動にかけた。

バクテリア及び酵母細胞のいずれにおいても、期待された分子量（３２ｋＤａ） の新しいビオチン化タンパク質が見出された。第２０及び２１図参照。酵母細胞 中、この３２ｋＤａのビオチン化タンパク質の合成は、通常の旧Ｓ３タンパク質 のように調節された。ヒスチジン制限条件下では、合成が抑制解除され、抑制解 除の下では、旧Ｓ３融合タンパク質は酵母細胞の主要なビオチン化タンパク質と なった。第２０図参照。

第２０図において、欄１は融合物Ｌ（ｐＣＹｌ−０６）を含むＬｃｏｌｉ株ＤＩ （５αにより製造されたタンパク質を含み、欄２は、完全なＨｒＳ３遺伝子（ｐ ｃＹ１０５）を有するＹＥｐ２４Ｃ誘導体を含むＥ、ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａにより 製造されたタンパク質を含み、欄３及び４は融合物Ｌ（ｐｃＹＩ０６）を含むＳ 、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＴＹ１８６により製造されたタンパク質を含み、 欄５は完全なＨＩＳ３プラスミド（１）ＣＹｉ０５）を含む酵母株ＣＴＹＩ８６ により製造されたタンパク質を含み、欄６はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入される１４Ｃ−標識分子量標準（オバル ブミンー４３ｋＤａ、カルボニックアンヒドラーセ２９ｋＤａ、β−ラクトグロ ブリン−１８，４ｋＤａ）を含む。欄７及び欄８は、欄ｌ及び欄２の、長い暴露 時間のものである。欄５において、標識バンドは、移動度が増加する順に、アセ チル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（２０５ｋＤａ）、ピルベートカルボキシラーゼ （１３０ｋＤａ）及びＬｉｍ　ｅｔ　ａｌ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２５８，２５９−６４（１９８７））によって も観察された未知の４４ｋＤａのタンパク質である。欄２及び欄８のバンドは、 Ｅ、ｃｏｌｉビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質（ＢＣＣＰ）である。

Ｂｉｏオペロン抑制解除は、酵母においてはこのようなシステムが知られていな いので、酵母においては試験されなかった。第２１図に示したｂｉｏオペロン抑 制解除の結果は、実施例２に記載されたように抑制解除について分析されたＥ、 ｃｏｌｉについてのものである。

実施例７．ビオチン化タンパク質の精製親和性の低い“モノマーアビジン”カラ ムをＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

から購入した。それらの材料を製造するために用いたグアニジン処理は、アビジ ンを部分的に且つ非可逆的に変成させ、より親和性の高いビオチン結合部位の大 部分を上記のようにより親和性の低い部位に変える。残った親和性の高い部分は 、ビオチンでブロックして、結合したビオチン化タンパク質が、５ｈｅｎｏｙ　 ｅｔ　ａｌ、、ＦＡｓＥＢ　Ｊ、、２．２５０５−１１（１９８ｇ）に記載した ビオチン含有非変性緩衝液により、定量的に溶離されるカラムを提供する。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１−１８を、融合物Ａ又は融合物Ｂを含むベクターで形 質転換し、培養して上記実施例１のようにビオチン化タンパク質を発現させた。

細胞抽出物を細胞をＦｒｅｎ（Ｈｈ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｃｅｌｌで破壊するこ とにより製造した。無傷の細胞及び不溶の夾雑物を遠心分離により除去した。上 澄みをモノマーアビジンカラムにかけ、これをビオチンを除いた５ｈｅｎｏｙ　 ｅｔ　ａｔ、、緩衝液で洗浄し、非結合材料を除去した。ビオチン化タンパク質 を５ｈｅｎｏｙ　ｅｔ　ａｌ、のビオチン含有緩衝液を用いてカラムから溶離し た。

ビオチン化融合タンパク質を、内因性Ｅ、ｃｏｌｉビオチンカルボキシキャリヤ ータンパク質（ＢＣＣＰ）とともに溶離した。ＢＣＣＰは、ビオチン化融合タン パク質から５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した）上、ゲル濾過により、ネイティブ分子 の分子量の大きな差により（β−ガラクトシダーゼ約５００．０００ダルトン対 ＢＣＣＰ４４．０００ダルトン）容易に分離された。

実施例８：ビオチン化タンパク質の精製融合物ＢをコードするｐＣＹ７４又はβ −ガラクトシダーゼをコードするベクターｐＵＲ２８８を含むＥ、ｃｏｌｉ　Ｆ ’ｌｌ　ｒｅｃＡの１００ｍ１培養液を、ブロス培地で早期エキスポネンシャル 相まで成長させ、ＩｍＭの［ＰＴＧで３時間誘導し、実施例１に記載したように 回収した。Ｆ’　１１　ｒｅｃＡはまた、ビオチンリガーゼを約１００倍過剰生 産するコンパチブルプラスミドであるｐＢＡｌｌを含む。Ｂａｒｋｅｒ及びＣａ ｍｐｂｅｌｌ、　、１．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

１４６、４６９（１９８１）。

細胞を回収し、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｇｅｎｅｔｔｃｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７２）　Ｇニー記載されるように製造したＺ緩衝液中で 破壊した。得られたリゼートを４８．０００　Ｘ　ｇで１時間遠心分離し、上澄 み（約２ｍｇのタンパク質を各々含む）をセファロース（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏ ｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　９４．３６６（１ ９７９）に記載したように製造した）に結合したモノマーアビジンのカラムであ って、３５ｎｍｏｌ／ｍｌセファロースの交換可能なビオチン結合能を有する０ 、　５ｍｌのカラムにかけた。カラムはＺ緩衝液又は２０ｍＭのビオチンを含む ２緩衝液で溶離した。約２５０μｌのフラクションを集め、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓに記載さ れたようにβ−ガラクトシダーゼ活性について分析し、かつタンパク質濃度につ いて分析した（２０倍希釈液の２８０ｎｍでの吸収）。

結果を第２２Ａ−Ｃ図に示す。第２２Ａ図は、融合物Ｂをコードするプラスミド ｐｃＹ７４を含む細胞がら回収した上澄みのフラクションナンバーに対するβ− ガラクトシダーゼ活性及びタンパク質濃度のグラフを示す。第２２Ｃ図は、上澄 みをカラムにかける前に、カラムを、２０ｍＭのビオチンを含むＺ緩衝液で洗浄 することのほかは、第２２Ａ図と同様のグラフを示す。第２２Ｂ図は、β−ガラ クトシダーゼを生産するが、融合タンパク質は生産しないｐＵＲ２８８を含む細 胞から回収した上澄みの溶離プロファイルを示す。これよりわがるように、融合 タンパク質はカラムに保持され、続いて２０ｍＭのビオチンの添加により溶離さ れる。

モノマーアビジンカラムから溶離した精製した融合タンパク質を８％のポリアク リルアミドゲル上、ＳＯ３の存在下で電気泳動にかけた。ゲルはＫｕｍａｓｓｉ ｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒで染色した。

プラスミドｐｃＹ１００、及びプラスミドｐＣＹ７４又はｐＵＲ２８８を含むＥ 、　ｃ。

１ｉ　Ｆ’ｌｌ　ｒｅｃＡを、培養し、タンパク質を上記の本実施例のように回 収した。得られた上澄みをモノマーアビジンカラムに適用し、溶出液を上記のよ うに、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。

プラスミドｐｃＹ１００を、ｐＭＢＲｌｏのＢａｍＨＩ−Ｓｃａ！断片をＭａｎ ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８２）　に記載されたようにｐＡｃＹｃ１８４の大きい 方のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片に連結することにより製造した。Ｂａｒｋｅｒ 　ａｎｄ　Ｃａｍｐｂｅｌｌ。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１４６．４６９（１９８１）参照。プラスミ ドｐＭＢＲＩＯはＡ、　０ｔｓｕｋａがら贈られ、その製法は、Ｂｕｏｎｃｒｉ ｓｔｒａｎｉ　ａｎｄ　０ｔｓｕｋａ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２６３、１０１３（１９８８）に記載されている。プラスミドｐＡｃＹｃ１８４ は、ＡＴＣＣから寄託番号３７０３３として得られる。

電気泳動の結果を第２３図に示す。欄１−５は、２．５ｍｌのアビジンカラム上 、融合物ＢをコードするｐＣＹ７４を含む細胞から抽出された総量約２０ｍｇの タンパク質のクロマトグラフィーに関する材料を含む。

カラムに適用したもともとの上澄みのサンプルをｆｕｌｌで電気泳動にかけた。

非結合タンパク質（フロースルー）のサンプルを欄２で電気泳動にかけ、２０ｍ Ｍのビオチンで溶離することにより得られた溶出物のサンプルを欄３で電気泳動 にかけた。欄４において、サンプルをモノクローナル抗−β−ガラクトシダーゼ （Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄ　１ｓｏｎ、　ＷＥから）で処理した後、続いてタ ンパク質Ａ−アガロースで吸収し、遠心分離にかけることを除いては、欄３のも のと同じサンプルを、電気泳動にかけた。得られた上澄みはゲル上にのせた材料 であった。

欄のより低い方の半分に見られるぼやけたバンドは、非吸収免疫グロブリン鎖で ある。欄５は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓから購入した分子量スタンダード（ホスホリラーゼＢ−９７ｋＤａ、ウシ血清 アルブミン−６８ｋＤａ、オバルブミンー４３ｋＤａ、カルボニックアンヒドラ ーゼ−２９ｋＤａ、及びβ−ラクトグロブリン−１８，４ｋＤａ）を含む。

欄６−１０は、１．６ｍｌのモノマーアビジンカラム上、融合物Ｂをコードする ｐＣＹ７４を含む細胞から抽出した約５ｍｇの総タンパク質のクロマトグラフィ ーに関する材料を含む。オリジナル上澄みのサンプル及び非結合タンパク質は各 々欄６及び欄７で電気泳動にかけられた。

２０ｍＭのビオチン溶離液のピーク領域のサンプルを欄８で電気泳動にかけ、溶 離ピークのティリング領域のサンプルを欄９及びｌＯで電気泳動にかけた。欄８ −１０のマイナーバンドを、ＢＣＣＰのプロテアーゼ−開裂型である最も移動度 の大きいバンド以外を、抗−β−ガラクトシダーゼ（データは示さない）で吸収 することにより除去した。Ｆａｌｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　 ６２．３９０（１９７９）参照。

上記のように、いくつかの宿主細胞は、ｐＣＹ７４及び２つのｂｉｒＡ（ビオチ ンリガーゼ過剰生産）プラスミドの両方を含む。欄１−５で電気泳動にかけられ た材料を生産するのに使用した株は、ｂｉｒＡタンパク質を１００倍以上過剰生 産するプラスミドｐｃＹ１００を含み、欄６−ＩＯで電気泳動にかけられた材料 を生産するのに使用した株は、約１０倍以上のりガーゼ活性を過剰生産するｐＢ Ａｌｌを含んでいた。

第２３図に示されるように、ビオチンによる溶離物は、シングルバンド（欄３） を生産し、このバンドは、モノクローナル抗−β−ガラクトシダーゼ（欄４）で 処理した後、消失し、このことは該バンドがビオチン化融合タンパク質を含んで いたことを示す。欄３と、欄８−１０を比較することにより、宿主細胞がｐｃＹ ｌｏｏを含む場合は、ｐＢＡｌｌと比べて、生産されたビオチン化融合タンパク 質の量が実質的に増加することがわかる。

第２図に示すトマトｃ　ＤＮＡビオチンタンパク質配列配列Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ ａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　オキサルアセテートデカルボキシラーゼのαサブユ ニットをコードするＤＮＡに、正しい解読枠で連結されたβ−ガラクトシダーゼ の断片をコードするＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列を製造した。これらの 二つの前者のＤＮＡ配列の各々は、ビオチン化部位を含むポリペプチドをコード する。二つのＤＮＡ配列は、融合タンパク質が、β−がう？トシダーゼ断片をア ミノ末端に有し、ビオチンアクセプター配列をカルボキシ末端に有するようにコ ードされるように、融合された。

これらのハイブリッドＤＮＡ配列をコードする適するベクターは、下記のように 製造した。ベクターを、Ｅ、ｃｏｌｉの種々の株の形質転換に使用した（使用し た株及び方法は、実施例１に記載した。）。実施例１に記載されたように、トリ チウム化ビオチンの存在下で発現を可能にする条件下で培養すると、ビオチン化 融合タンパク質が生産された。さらに、ｂｉｏオペロンの抑制解除を実施例１の ように試験すると、抑制解除が見られた。

Ａ、β−ガラクトシダーゼ及びビオチン化トマトタンパク質をコードするハイブ リッドＤＮＡを含むベクターの製造ビオチントマトタンパク質をコードするｃ　 ＤＮＡセグメントを、叶。

Ｎｅ１ｌ　Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌ ｆｈｉａ、Ｐａ、からの未命名のプラスミドとして得た。プラスミドは、Ｈｏｆ ｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、１５．　３ ９２８（１９８７）記載のオリジナルラムダシャロン１６フアージの５ｓｔｌ切 断により誘導した。ファージを、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ 、旦、　７９−８９（１９８４）に記載されたトマトｃ　ＤＮＡバンクから単離 した。

叶、Ｈｏｆｆｍａｎから得られたプラスミドを、５ｓｔＩ及び５ａｌＩで切断し 、得られた断片を５ｓｔｌ−３ａｌｌで切断したｐＵＲ２７８（１ａｃＺ遺伝子 を含む）に連結して、融合物ＮをコードするプラスミドｐＫＲ２を製造した。融 合物Ｎは、第２図に示したトマト配列に融合したβ−ガラクトシダーゼのＮ−末 端の６５１アミノ酸をコードするＤＮＡを含む。融合結合部は、１ａｃＺ配列と 第２図のトマト配列の間のＰＰＰＰＰＰＰＧＴＶを有するＩａｃＺ残基６５１で ある。プラスミドｐＵＲ２７８は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ　Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌ ｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ　ｚｕ　Ｋｇｌｎ、５０００　ｋ？ｊｌｎ　４１． 　ＦＲＧから得た。その製法及び性質はＲｕｔｈｅｒ　ａｎｄ　Ｍｕｌｌｅｒ− Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　２．１７９１−９４（１９８３ ）に記載されている。

Ｂ、β−ガラクトシダーゼ及びオキサルアセテートデカルボキシラー−の製造 プラスミドｐＳＣ３を、Ｄｒ、Ｅ、Ｓｃｈｗａｒｚ、１Ｊａｘ−Ｐｌａｎｃｋ　 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　ｆｕｒ　Ｂｉ。

ｃｈｅＩＩＩｉｅ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ、Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙから得 た。その製法は：　ＬａｕｓｓｅドｐＳＣ３は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅ ｕｍｏｎｉａｅオキサルアセテートデカルボキシラーゼのγ、α及びβの一部の サブユニットをコードする。Ｌａｕｓｓｅｒｍａｉｒ　ｅｔ　ａｌ、とＳｃｈｗ ａｒｚ　ｅｔ　ａｌ、は、共に、α、γ及びβ遺伝子のＤＮＡ配列を開示する。

プラスミドｐＳＣ３を、５ａｌＩで切断し、得られたαサブユニットをコードす る３、２に、ｂの断片をＳａ、１１で切断されたＩ）Ｈ３Ｇ３９８に連結してｐ ＫＲ５を形成した。その後、αサブユニットをコードする配列を、さらにｐＫＲ ５のＳａｌ　Ｉ及びＢａｍＨＩによる切断及び得られた１、　７Ｋｂの断片の、 同じ酵素で切断されたｐＭＴＬ２１への連結によりサブクローン化して、ｐＫＲ ｌ、１を得た。次に、プラスミドｐＫＲ１１をＰｓｔｒ及びＢｓ５ＨＩＩテ切断 し、得られた断片をＰｓｔｌ及びＭｌｕＩで切断したｐＭＴＬ２０に連結して、 ｐＫＲ２８を得た。最後に、プラスミドｐＫＲ２８をＡａｔＬｒで切断し、Ａａ ｔｌＩで切断したｐＵＲ２７８に連結し、融合物０を含むｐＫＲ３０を得た。

融合物Ｏは、Ｋｌｅｂｓｊｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅオキサルアセテート デカルボキシラーゼのαサブユニットの１００残基をコードするＤＮＡ及びβ− ガラクトシダーゼのＮ−末端２１０残基をコードするＤＮＡを含む。

αサブユニットの１００残基のアミノ酸配列を下記に示すＤＶＳＱＬＴＡＡＡＰ Ａ　ＰＡ　ＰＡＰＡＰＡ　ＳＡ　ＰＡＡ　Ａ　ＡＰＡＧＡＧＴＰＶＴＡ　ＰＬ　 ＡＧＦ　Ｉ　ＷＫＶＬＡＳ　ＥＧＱＴＶＡＡＧＥＶＬＬ　hＬ　ＥＡＭＫＭＥＴ ＥＩＲ，ＡＡＱＡＧＴｖＲＧＩＡＶＫＡＧＤＡＶＡＶＧＤＴＬＭＴＬＡ　。

プラスミドｐＨ３Ｇ３９８は、東京の日本ガンリサーチリソースバンクから得ら れた。また、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　６１．６３（１９ ８７）参照。

プラスミドｐＭＴＬ２０及びｐＭＴＬ２１を、Ｄｒ、Ｓ、Ｐ、Ｃｈａｍｂｅｒｓ 、ＰＨＬＣＣｅｎｔｒｅ　ｆｏｒＡｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｍｉ　ｃｒｏｂｉｏｌｏｇ ｙ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ、　Ｗｉ　１ｔｓｈｉｒｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄから得 た。それらの製法はＣｈａｍｂｅｒｓ、Ｐｒ１ｏｒ、Ｂａｒｓｔｏｗ　ａｎｄ　 Ｍｉｎｔｏｎ、Ｇｅｎｅ、６８１３９−１４９（１９８８）に記載されている。

Ｅ、　ｃｏｌｉＢｃｃＰをコードするＤＮＡ配列を、５ｕｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ 、ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　、　２５２．３９３４−３９４０（１９７７）に 報告されたＢＣＣＰのアミノ酸配列の残基１７＝８２に対応する合成オリゴヌク レオチド配列を含むプローブを用いて、クローンバンクをスクリーニングするこ とにより得た。クローンバンクは、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ 、　、Ｇｅｎｅ、　３３．１０３−１１９（１９８５）に記載されたように、フ ァージＭ１３ｍｐｉｌの旧ｎｄＩＩＩとＰｓｔ１部位の間に挿入されたＥ、ｃｏ ｌｉ染色体の１．６Ｋｂの旧ｎｄＩＩｒ−Ｐｓｔｉ断片からなる。このクローン バンクは、叶、Ｊｏｈｎ　Ｅ、Ｃｒｏｎａｎｊｒ、、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏ ｆ　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、　Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、　ＩＩ　１ｉｎｏｉｓからも得 られる。ＨｉｎｄＩＩＩ部位はＢＣＣＰのコード配列の中に位置している。単離 されたクローンのＤＮＡ配列は、Ｓυｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、に報告されたよう に、Ｎの替わりに残基３９がＤであること以外は、正確に５ｕｔｔｏｎ　ｅｔ　 ａｌ、配列に合わせた演鐸されたアミノ酸配列を与えた。

ＢＣＣＰＣＣ−ンの二本鎖の複製可能な型を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで切 断して、ＢＣＣＰをコードする断片をとり出し、該断片を同じ酵素で切断された ｐＴＺ１８Ｕ（アンピシリン抵抗性遺伝子を含む）に連結した。

得られたプラスミド、　ｐＬＳ　１をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＴＩ 消化ｐＣＹ８２から放出された断片に連結した。この旧ｎｄｌｌｌ断片は、クロ ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする。

得られた混合物を、Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換に使用し、アンピシリン及びクロラ ムフェニコールの両方に耐性の形質転換体を選択した。ＢＣＣＰに、ＢＣＣＰと 同じ配向で融合したＣＡＴ遺伝子を有するこれらの組み換えプラスミドの一つを 、Ｎｃｏｌで切断し、ｐＬＳ２を形成するように再連結した。この処理の効果は 、ＣＡＴ遺伝子のＣ末端の一部及びＢＣＣＰ遺伝子のＮ末端の一部を除去し、そ れらの間に新しい融合結合を形成することにある。得られた組み換えプラスミド ｐＬＳ２は、ＢＣＣＰのＣ末端９３アミノ酸に融合したＣＡＴ遺伝子のＮ−末端 １２７３アミノ酸からなる融合タンパク質をコードする（融合物Ｐ）。ＢＣＣＰ 配列は、第２図に与えられるもの及びＣＡＴ配列と第２図のＢＣＣＰ配列との間 の、付加的なりＣＣＰ配列：ＥＡＰＡＡＡＧＩＳＧ［（ｒＶＲ，ｓＰＭＶＧＴ　 テある。マタ、得うレタ配列ハ、上記のようにＢＣＣＰ残基３９のＮの代わりに 、Ｄを含む。

プラスミドｐ’ｒｚ　１８Ｌｌは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙから得られる。また、Ｍｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｔ、 　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ、　１．６７（１９８６）参照。ｐＣＹ８２のＣＡＴ遺伝子 は、トランスポゾンＴｎ９のものであり、市販品として例えば、Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｂｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｖｖ 　Ｊｅｒｓｅｙ、Ｃ１ａｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａ１ｏ　Ａ Ｉｔｏ、ＣＡ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、丁ｎｃ　ＬＡ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ　から 得られるクローニングベクターの共通の成分である。また、プラスミドｐＣＹ８ ２は、Ｄｒ、Ｊｏｈｎ　Ｅ、Ｃｒｏｎａｎ、Ｊｒ、、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏ ｆ　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ。

Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓから得られる。

プラスミドｐＬｓ２を、Ｂ、ｃｏｌｉの種々の株の形質転換に使用した（使用し た株及び方法は、実施例１に記載した。）。実施例１に記載されたように、Ｉ・ リチウム化ビオチンの存在下で発現を可能にする条件下で培養すると、ビオチン 化融合タンパク質が生産された。さらに、ｂｉｏオペロンの抑制解除を実施例１ のように試験すると、抑制解除が見られた。

実施例ＩＩ：　リボ酸付加のための部位を有する融合タンパク質をコードするＤ ＮＡ配列の製造及び発現 ■又はそれ以上のりボイル付加部位をコードするＥ、ｃｏｌｉ　ａｃｅＦ遺伝子 の断片及びβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子の最初の８のアミノ酸を除く全ての アミノ酸をコートするＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列を製造した。二つの ＤＮＡ配列を、アミノ末端にリポイルアクセプター配列及びカルボキシル末端に β−ガラクトシダーゼ配列を有する融合タンパク質がコードされるように融合し た。

Ａ、　ａｃｅＦ遺伝子及びＩａｃＺ構造遺伝子の断片を含むベクターの製造Ｅ、 　ｃｏｌｉピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ２ｐサブユニットをコードするａｃ ｅＦ遺伝子をクローン化し、その配列を決定した。５ｔｅｐｈｅｎｓ、　Ｄａｒ ｌｉｓｏｎ、　Ｌｅｗｉｓ　ａｎｄ　Ｇｕｅｓｔ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　、　１３３．４８１−４８９（１９８３）参■B 背景の部分で論じたように、このアミノ酸配列は、Ｅ２ｐポリペプチド鎖のＮ末 端の半分で縦に繰り返す約１００のアミノ酸残基、からなる三つの同種のセグメ ントを示し、各々の繰り返しかりボイル化部位を含む領域を形成する。Ｅ２ｐポ リペプチド鎖及びａ、ｃｅＦ遺伝子の繰り返しセグメントを、各々１ｉｐｌ〜ｌ 　ｉｐ３、及び１ｉｔ）Ｉ−１ｉｐ３と命名した。

ａｃｅＦ遺伝子は、β−ガラクトシダーゼへの融合物を形成するのに使用しうる いくつかの天然に存在する制限部位を含む。ｌ又は２のドメイン（第２４図参照 ）と等価なインフレーム欠失を発生させるのに使用されうるコード配列の類似の 位置に三つのＢｃｌ、１部位がある。

そのような融合物を構築するための出発材料は、Ｇｕｅｓｔ、　Ｉ、ｅｗｉｓ、 　Ｇｒａｈａｍ、　Ｐａｃｋｍａｎ　ａｎｄ　Ｐｅｒｈａｍ、　Ｊ、ＭＯＬ、　 Ｂｉｏｌ、　、　１８５．７４３−７５４（１９８５）に記載されているように 製造される、ａｃｅＦ遺伝子の３′末端を含むプラスミドｐＧｓ　１０１である 。このプラスミドは、イギリス、シェフイールド５ＩＯＺＴＮのシェフイールド 大学の微生物学科のＪ、　Ｇｕｅｓｔ教授から得た。

プラスミドｐＧｓ１０１は、ａｃｅＥＦコード領域は、ベクターのｔｅｔプロモ ーターから転写されるが、それ自身の転写開始領域を有する。

ｐＧｓ　１０１の旦Ｌコード領域は、ｐｃｓ　１０１からの精製した１、　２Ｋ ｂＣ圏／５ｐｈｒ断片をｐＭＴＬ２３のＣ１ａｌ及びＳｐｈ　ｒ部位に連結して ｐＫＲｌ、２（第２５図参照）を製造することにより、ｐＭＴＬ２３にサブクロ ーン化された。この工程は、旦Ｌコード領域をＩ　ａｃＺプロモーターに隣接し て位置づけること、及び上流のａｃｅＥコード領域の１０コドン以外の全てを除 去するものである。

プラスミドｐＭＴＬ２３は、叶、Ｓ、Ｐ、Ｃｈａｍｂｅｒｓ、ＰＨＬＣＣｅｎｔ ｒｅ　ｆｏｒ　ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｓａｌ　１ｓｂｕ ｒｙ、　ｉＶｉ　１ｔｓｈｉｒｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄがら贈られた。その製法は 、Ｃｈａｍｂｅｒｓ、　Ｐｒ１ｏｒ、　Ｂａｒｓｔｏｗ　ａｎｄ　Ｍｉｎｔｏｎ 、　Ｇｅｎｅ、　６８１３９刊４９（１９８８）に記載されている。

全ての三つのりボイル領域を含むプラスミド１）ＫＲ１２は、三つのりボイル領 域のサブセットを含む追加の構造物のだめの出発材料を提供する。最初の８アミ ノ酸（活性酵素）以外の全てのβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ配列を 含むカセットを、種々の構築物の各旦Ｌコードセグメントの３′末端で枠に挿入 した。これらの追加のハイブリッドＤＮＡ配列の製法を下記に示す。

１、融合物Ｑの製造 融合物Ｑは、正しい解読枠で、最初の８アミン末端アミノ酸を除く全β−ガラク トシダーゼをコードするＤＮＡに結合したＥ２ｐの三つのｌｉｐ領域全てをコー ドするＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列である。（第２４図）。

融合物Ｑを含むプラスミドｐＫＲＩ４を、第２５図に示すように製造した。プラ スミドｐＭｃ１８７１を、Ｐｓｔｌで切断し、得られた３Ｋｂの断片を、ｐＫＲ ｌ２（上記で製造した）のＰｓＬｒ部位に挿入した。プラスミドｐＭＣ１８７１ は、プロモーターの調節領域、オペレーター、及び翻訳開始領域を含まない１ａ ｃＺカートリツジを含む。Ｃａ５ａｄａｂａｎ、　Ｍａｒｔ　１ｎｅｚ−Ａｒｉ ａｓ、　５ｈａｐｉｒａ　ａｎｄ　Ｃｈｏｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ、、　１ ００，２９３−３０８（１９８３）参照。プラスミドｐＭｃ１８７１は、Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、 Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙから得られる。

２、融合物Ｒの製造 融合物Ｒは、正しい解読枠で、最初の８アミノ末端アミノ酸を除くすべてのβ− ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡに結合したＥ２ｐの最初の二つのりボイル 領域（ｌｔｐｌ及びｌ１ｐ２）並びに第三のりボイル領域（ｌｉｐ３）をコード するＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列である。

（第２４図）。

融合物Ｒを含むプラＶミドｐＫＲＩＯを、第２６図に示すように製造した。旦射 、旦匹及び且〔を含むプラスミドｐＫＲ１，２を、Ｈｉｎｄ川で切断し、再連結 した。これにより、ｐＫＲｌ２からの４５０ｂｐ断片を除去して、プラスミドｐ ＫＲ７（第２４及び第２６図参照）を製造した。プラスミドｐＭｃ１８７１を、 Ｐｓｔｉで切断し、得られた３Ｋｂの断片を、ｐＫＲ７のＰｓｔＩ部位に挿入し てｐＫＲｌｏを製造した。

３、融合物Ｓ及びＴの製造 融合物Ｓ及びＴは、正しい解読枠で、最初の８アミノ末端アミノ酸を除くすべて のβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡに結合したＢ２ｐのハイブリッド１ ｉｐ領域をコードするＤＮＡを含む。融合物Ｓはハイブリッド１ｉｐｌ−２領域 及び１ｉｐ３からなる二つの１ｉｐ領域をコードするＤＮＡを含む。ｌ　ｉｐ２ 領域をコードするＤＮＡは、正しい解読枠で、１ｉｐ２のカルボキシル末端領域 をコードするＤＮＡに１ｉｐｌのアミノ末端領域をコードするＤＮＡを融合する ことにより形成した。第２４図参照。

融合物Ｔは、１ｉｐｌ及びハイブリッド１ｉｐ２−３領域からなる二つの１ｉｐ 領域をコードするＤＮＡを含む。１ｉｐ２−３領域をコードするＤＮＡを、正確 な解読枠で、ｌ　ｉｐ２のアミノ末端領域をコードするＤＮＡを］ｉｐ３のカル ボキシル末端領域をコードするＤＮＡに融合することにより形成した。第２４図 参照。

融合物Ｓを含むプラスミドｐＫＲ２３及び融合物Ｔを含むプラスミドｐＫＲ２２ を、第２７図に示すように製造した。まず、プラスミドｐＫＲ１２を、Ｂａ１ｌ で部分的に切断した。Ｂｅｌｉｔ　（即ち、旦以のＢｃｌ１部位）からＢｅ１１ −２への欠失、又はＢｃｌｌ−２からＢｃｌＩ−３ヘの欠失（Ｇｕｅｓｔ　ｅｔ 　ａ、１．。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１８５．７４３−５４（１９８５）及び第２ ４図参照）を表す、得られた３、　４Ｋｂの断片を、精製し、再連結して、ｐＫ Ｒｌ６及びｐＫＲ１７を製造した。得られたものを、ＡｃｃＩで切断することに より各々区別した。これは、Ｂｃｌｌ−２とＢｅ１１−３の間にはＡｃｃｒ部位 があるが、Ｂｅ１ｌ−１とＢｃｌｒ−２の間にはないことによる。次に、プラス ミドｐＭｃ１８７１をＰｓｔＩで切断し、得られた３Ｋｂの断片を、ｐＫＲｌ６ 及びｐＫＲＩ　７のＰｓｔ１部位に挿入して各々ｐＫＲ２２及びｐＫＲ２３を製 造した。

４、融合物Ｕの製造 融合物Ｕは、正しい解読枠で、最初の８７ミノ末端アミノ酸を除（すべてのβ− ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡに融合したＥ２ｐのハイブリッド１ｉｐｌ −３領域をコードするＤＮＡを含む。１ｉｐｌ−３領域をコードするＤＮＡは、 正しい解読枠で、１ｉｐｌのアミノ末端領域をコードするＤＮＡをｌ１ｐ３のカ ルボキシル末端領域をコードするＤＮＡに融合することにより形成した。第２４ 図参照。

融合物Ｕを含むプラスミドｐＫＲ２１を、第２８図に示すように製造した。まず プラスミドｐＫＲ］、２を、Ｐ’ｓｔＩで完全に切断し、その後再連結して、プ ラスミドｐＫＲ１，８を形成した。その後、プラスミドｐＭｃＩ８７１をＰｓｔ ｌで完全に切断し、得られた３Ｋｂの断片を、ｐＫＲｌ８のＰｓｔＩ部位に挿入 してｐＫＲ２１を形成した。

５、融合物Ｒ′の製造 融合物Ｒ′は、正しい解読枠で、最初の８７ミノ末端アミノ酸を除くすべてのβ −ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡに結合したＥ２ｐの最初の二つのりボイ ル領域及び第三の一部をコードするＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列である 。第２４図参照。融合物Ｒ′のコード配列は融合物Ｒのものと同一である。差は 、融合物Ｒ′のコード配列に隣接した翻訳調節領域が、融合物Ｒの発現を増加さ せようとして変化されていることである。

ネイティブのａｃｅＥＦオペロンにおいて、ａｃｅＥの翻訳終結部位は、ａｃｅ Ｆの翻訳開始部位の上流の約５個のコドンである。プラスミドｐＫＲＩＯ、ｐＫ Ｒｌ、４　、ｐＫＲ２１、ｐＫＲ２２及びｐＫＲ２３において、小さなハイブリ ッドペプチドは、翻訳後リボイル化のための部位を有する大きな融合タンパク質 に加えて形成される。この小さなペプチドは、ｐＭＴＬ２３ベクタープラスミド にコードされたβ−ガラクトシダーゼのαペプチドの最初の１４コドン、及びク ローン化挿入物からの最初の三つのコドンの翻訳の結果として形成される。この ペプチドは、ａｃｅＦ翻訳開始部位より前の１３コドンで終結する。

融合物Ｒ′を含むプラスミドｐＫＲ２４を、第２９図に示すように製造した。ま ず、プラスミドｐＫＲ１０を、χｈｏｌ及びＮｒｕｌで切断した。粘着末端を完 全にｄＮＴＰｓとＤＮＡポリメラーゼＴ　（Ｋｌｅｎｏｗ断片）とのインキュベ ーションにより満たし、プラスミドを再連結した。この方法により、ベクタープ ラスミドのβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチドの範囲内で＋２フレームシフト が形成された。このフレームシフトは、α−ペプチドの最初の１４のコドンを、 ａｃｅＥの最後の１０のコドンを伴う枠内に置いた。これは、融合物Ｒ゛の翻訳 開始部位を、小さなハイブリッドペプチドの翻訳終結部位の５コドン下流に位置 づける。これは、天然のオペロンのａｃｅＥとａｃｅＦの間の結合に見られる翻 訳調節領域と同じである。この操作により、融合物Ｒに対し融合物Ｒ′のβ−ガ ラクトシダーゼ活性が５倍増加した。

Ｂ、宿主の形質転換及びリボイル化タンパク質の発現及び検出１、形質転換 いくつかのＥ、　ｃｏ　Ｉ　ｉ株を、上記のように製造した融合物Ｑ刊を含むベ クターで形質転換した。使用した菌株は、Ｄｌ（５α、ＣＹ４８７及びＣＹ５６ ５である。形質転換は、実施例１に記載したように行った。

ＤＨ５α株は、実施例１に記載した。ＣＹ４８７株は、Ｊｕ１０３株を、ＧＭ２ １９９株で成長したＰＩ　ｖｉｒを用いて、Ｍａｒｉｎｕｓ、　Ｃａｒｒｗａｙ 、　Ｆｒｅｙ、　Ｂｒｏｗｎａｎｄ　Ａｒｒａｊ、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ、　１９２，２８８−２８９（１９８３）に記載されたように、形質導入 してクロラムフェニコール耐性にすることにより製造した。ＣＹ４８７株は、プ ラスミドをＢａ１ｌで切断することを可能にするｄｃｍフェノタイプを有する。

ＣＹ５６５株は、Ｆ’　ＩａｃｌＱＬ８　ｐｒｏＡＢ！ビソームのＮＫ５８３０ 株をキユアリングすることにより得られた。

ＪＭ１０３　、ＧＭ２１９９及びＮＫ５８３６株は、Ｃｏ１１　Ｇｅｎｅｔｉｃ 　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、ＹａＩｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｎｅｗ　Ｈ ａｖｅｎ、　ＣＴから得られた。

２．３５Ｓ　リポ酸の合成 ３５３−リポ酸は、Ｅｌｌｉｏｔｔ、５ｔｅｅｌｅ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　ＬＥＴＴＥＲ３，２肋３５３５−３８（１９８３）に より、非放射性化合物について記載されたように合成した。公表された合成の副 生成物である（６Ｓ）−イソプロピル−６，８−ジヒドロキシオクタノエートの ジー（第三ブチルジメチルシリル）誘導体は、Ｗ、Ｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｄｅｐ ａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｊｖｅｒｓｊｔｙ、　５ｔａｎｆｏｒｄ、　ＣＡから得 た。第三ブチルジメチルシリル部分を、Ｄｏｗｅｘ　５０Ｘ−８イオン交換樹脂 （Ｈ＋型）で、Ｃｏｒｅｙ、　Ｐ。

ｎｄｅｒ　ａｎｄ　Ｕｈｒｉｃｈ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　 ２１．１３７−１４０（１９８０）に記載されているように処理することことよ り除去して、イソプロピル−６，８−ジヒドロキシオクタノエートを生成させた 。合成の残りは、非放射性硫黄の一部を３１＋３元素硫黄（Ａｍｅｒｓｈａｍ　 Ｃｏｐ、、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）に置換したほかは 、前掲Ｅｌｌｉｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、に記載されているとおりである。最終生成 物は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＲＧ２６株を用いて、Ｈｅｒｂｅｒｔａｎｄ　Ｇｕｅｓ ｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１８．２６９−２７２（ １９７０）に記載されているように、バイオアッセイで定量した場合に０．８Ｃ ｉ／ｍｍｏｌの比活性を有する。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＲＧ２６（Ｗ１４８５１ｉｐ −２と呼ばれる）は、Ｃｏ１１　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、 Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、ＣＴから得た。

３、放射標識リボイル化タンパク質の分析プラスミドｐＫＲ１０、ｐＫＲ１４、 ｐＫＲ２１、ｐＫＲ２２、ｐＫＲ２３及びｐＫＲ２４で形質転換したＥ、ｃｏｌ ｉのＤＨ５α、ＣＹ４８７及びＣＹ５６５株を、３１１３　リポ酸と培養し、融 合タンパク質を標識した。バクテリアを、３７℃で、０．４％のグリセロール、 ｌμｇ／ｍｌのチアミン、１ｍＭのシスティン、０．４％のビタミンフリーカゼ イン加水分解物、８Ｋｇの３５Ｓリポ酸及びプラスミドメンテナンスを選択する のに適当な抗生物質を含む最小培地Ｅ中、ｌ−２ＸＩＯ’細胞／ｖｎｌまで培養 した。

−晩培養した後、１２　ＸＩＯ’の細胞を含むＯ，１Ｋ［＋の培養液を、１ｍＭ のイソプロピルチオガラクトサイドを加えた同じ培地１．０ｍＭを含む試験管に 入れた。細胞を２−３時間培養し、融合タンパク質の発現を得た。細胞を回収し 、８Ｍの尿素および１％のＳＤＳを含む、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ ７，５の溶液中で溶菌した。細胞抽出物を、不連続モードで、ＳＤＳの存在下で ７．５％のポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルをＢｎｌｉｇｈｔｅｎｉ ｎｇ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡから購入 した）中に浸漬することによりフルオログラフし、プレグラフシュドフィルムへ の露光に用いた。

第３０図は、上記のような！５８−標識方法を用いて得られた典型的なフルオロ グラフを示す。欄Ｉは、融合タンパク質を含まず、欄２は、融合物Ｒを含む細胞 からの抽出物を含み、欄３は、融合物Ｒ′を含む細胞からの抽出物を含み、欄４ は、融合物Ｑを運ぶ細胞からの抽出物を含み、欄５は、融合物Ｓを含む細胞から の抽出物を含み、欄６は、融合物Ｔを含む細胞からの抽出物を含み、欄７は、融 合物Ｕを含む細胞からの抽出物を含む。

第３０図の全ての欄において、バンドは、３０ｋＤａ　、５６ｋＤａ及び８０ｋ Ｄａに見出された。５６ｋＤａ及び８０ｋＤａのバンドは、各々ピルベートデヒ ドロゲナーゼ及びα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼのジヒドロリポイルト ランスアセチラーセサブユニット（Ｂ２）として陽性に同定された。３０ｋＤａ のバンドは、グリシン開裂システムに含まれるリボイル化タンパク質として同定 された。

欄１以外の全ての欄の約１５０ｋＤａに現れるかすかなバンドは、リボイル化融 合タンパク質を表す。融合物Ｒ′は、融合物Ｒより暗く、融合物Ｒと比べて、融 合物Ｒ“の発現が増加していることを示している（欄２と欄３の比較） 融合タンパク質のさらに有効な標識は、融合物を、グリシン開裂システムに含ま れるａｃｅＦ、　５ｕｃＢ及びリボイル化タンパク質をコードする遺伝子を欠失 した菌中においた場合に期待される。そのような欠失を含む菌に、アセテート及 びスクシネートを加えることにより、該菌に導入される融合物が存在するりボイ ル化タンパク質のみとなるようにすることができる。

第３１図において、欄１は、リボエート栄養要求体（ｌｉｐｏａｔｅ　ａｕｘｏ ｔｒｏｐｈ　）であるＥ、ｃｏｌｉ　ＪＲＧ２６株の抽出物を含む；欄２は５ｕ ｃＢに広がる欠失を有するＴＤ３ＫＯＩの抽出物を含む；そして欄３は、ａｃｅ Ｆに広がる欠失を有するＥ、ｃｏｌｉ　ＣＹ２６５の抽出物を含む。遺伝子ａｃ ｅＦ及び５ｕｃＢは、各々ピルベートデヒドロゲナーゼ及びα−ケトグルタレー トデヒドロゲナーゼのＢ２サブユニットをコードする。

ＣＹ２６５株は、Ｃｏ１１　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａ ｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｔｔｙ、ＮｅｗＨａｖｅｎ、　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔか ら得られ、ＴＤａＫＯ１株は、Ｄｒ、　ＪＯＨＮ　ＧＵＥＳＴ、　Ｄｅｐｔ、Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＬυｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　５ｈｅｆｆｉｅｌｄ、５ ｈｅｆｆｉｅｌｄ　５ＩＯＺＴＮ、Ｅｎｇｌａｎｄから得られた。全ての菌は上 記のように培養されたが、適当な添加がなされた。

第３１図に示すように、ＣＹ２６５株は、Ｅ２Ｐを生産せず、ＴＤ３に０１はＢ ２゜を生産しない。これらのタンパク質の製造がないと、そのようなバクテリア を用いて、より大量のりボエート化融合タンパク質を得るのが可能になるであろ う。

実施例１２：　リボイル化タンパク質の精製パラアミノフェニルアルシンオキサ イド（ＰＡ、ＰＡＯ）を、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ｍｉｌｗ ａｕｋｅｅ　Ｗｌから購入した。ＰＡＰＡＯ−セファロースを、Ｈａｎｎｅｓｔ ａｄ、　Ｌｕｎｄｇｖｉｓｔ　ａｎｄ　５ｏｒｂｏ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｎ＋、　、　３２６．２００−２０４（１９８Q） に記載されているように製造した。ＰＡＰＡＯセファロースは、Ｈａｎｎｅｓｔ ａｄ等により、１．２−ジチオール（例えば２，３−ジメルカプト−■−プロパ ツール（ＤＭＰ））及び１．３−ジチオール（例えばジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ ））に対して、モノチオール（例えばシスティン）及び１．４−ジチオール（例 えばジチオスレイトール（ＤＴＴ））に対してよりも高い親和性を有することが 示されている。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＣＹ５６５株は（実施例１１に記載した）、融合物Ｒを含むｐＫ Ｒｌｏで形質転換され、実施例１１に記載したように、リボイル化タンパク質を 発現するよう培養された。細胞抽出物を細胞をフレンチプレッシャーセルで粉砕 することにより製造した。無傷の細胞及び細胞夾雑物を遠心分離により除去した 。

上澄みフラクションをＯ，１ｍのリン酸ナトリウム中の５０μＭのＤＴＴ。

ｐＨ７，０で還元した。還元した上澄みフラクションを、ＰＡＰＡＯセファ０− ス力ラムにかけ、４℃で１時間吸収させた。その後、カラムを約２０カラム容量 のＯ，ＯＩＭのシスティン及び０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１ＭＩＪン酸ナト リウム緩衝液、　ｐ）Ｉｓ、　５で洗浄した。システィンは、全ての弱（結合し たモノチオール又はジチオールをカラムから除去した。

リボイル化タンパク質を、Ｏ，ＩＭのリン酸ナトリウム緩衝液、　ｐＨ８，０中 の５０μＭのＤＴＴ　、　ＤＨＬＡ、２，３−ジメルカプト−２−プロパツール （ＤＭＰ）又は２，３−ジメルカプト−２−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳＯｚ 　）を用いて、カラムから溶離した。リポ酸をホウ化水素ナトリウムを用いて、 Ｈａｎｎｅｓｔａｄ等に記載されているように還元することによりＤ）ＩＬＡを 製造した。

ＤＭＰ、リポ酸及びＤＭＰＳＯ，は、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、、ＭｉｌｗａｕｋｅｅＪＩから購入した。セファロース６Ｂ、システィン及び ＤＴＴは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯか ら得られた。

カラムから溶離されたりボイル化タンパク質を７．５％ポリアクリルアミドゲル 上、ＳＯ３の存在下で電気泳動にがけた。第３２図は、Ｆａｓｔ　５ｔａｉｎ（ Ｚｏｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、、Ａｌ５ｔｏｎ、ＭＡから購入）で染 色した、ＰＡＰＡＯ−セファロースから溶離したりボイル化タンパク質の、５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲルを示す。第３２図において、欄１は、ＩａｃＺの染 色体コピーを含むプロトトロフィック株の抽出物を載せたカラムから溶離したタ ンパク質を含み、欄２−４は、融合物Ｒ（ｐＫＲｌＯ）を含むＣＹ５６５株の抽 出物を載せたカラムがらの溶離物を含む。欄２は、ＤＴＴで溶離したタンパク質 を含み、欄３は、ＤＨＬＡで溶離したタンパク質を含み、欄４は、ＤＭＰＳＯ， で溶離したタンパク質を含む。全ての欄において、５６ｋＤａ及び８２ｋＤａに 現れるバンドは、各々Ｅ２ｏ及びＥ２ｐである。欄ｌの１１６ｋＤａのバンドは 、ネイティブβ−ガラクトシダーゼである。欄３及び欄４の１５５ｋＤａに現れ るバンドは、融合物Ｒにより製造された融合タンパク質である。

融合タンパク質のカラムからの溶離は、β−ガラクトシダーゼ活性によりモニタ ーされた（実施例８に記載した分析）。結果を第１１表に示す。第１１表のデー タかられかるように、ＤＭＰＳＯｓは、試験された最良の溶離液である。

第１１表：種々のジチオールにょるＰＡＰＡＯ−セファロースからの融合物Ｂの 溶離 ジチオール　溶離された融合タンパク質（％）ＤＨＬＡ　５０ ＤＭＰ　５５ ＤＭＰ３０．　９８ 実施例１３：　ビオチン化融合タンパク質の分泌プレーβ−ラクタマーゼの断片 をコードするＤＮＡに正しい読み取り枠で連結されたＥ、ｃｏｌｉ　ＢＣＣＰの 断片をコードするＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列を製造した。ＢＣＣＰ　 ＤＮＡ配列は、ビオチン化部位を有するポリペプチドをコードし、プレーβ−ラ クタマーゼＤＮＡは、β−ラクタマーゼの分泌を提供するシグナル配列を有する ポリペプチドをコードする。二つのＤＮＡ配列は、融合タンパク質がカミノ末端 にプレーβ−ラクタマーゼを有し、カルボキシル末端にＢＣＣＰ断片を有するよ うにコードされるように融合された。

プラスミドｐＬｓ１及びｐＭＴＩ、２１を、ＰｓｔＩ及びＮｃｏＩで切断し、連 結して、第３３図に示すようにｐＣＹＴ８Ｄを製造した。プラスミドｐｔ、ｓｔ の製造は、実施例１０に記載され、プラスミドｐＭＴＬ２１は、実施例９で述べ たように、Ｄｒ、　Ｓ、　Ｐ、　Ｃｈａｍｂｅｒｓから得られた。

プラスミドｐｃＹ１５１を、プラスミドｐＣＹＴ８ＤのＫｐｎＩ−ＰｓｔＩセグ メントを、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＣＣＰのＣ末端の２３アミノ酸をコードする合成り ＮＡのセグメントに置き換えることにより、製造した。この操作は、遺伝子コー ドの縮重により、ＢＣＣＰコード配列の下流に位置する約１．３Ｋｂｐの未知の 配列のＤＮＡを除去し、二つの新しい６塩基制限部位をＢＣＣＰ遺伝子（Ｃｆｒ ｌｏｌ及びＢｃｏＲＩ）に、翻訳終止コドン及び終止コドンのすぐ下流に位置す るＳａｌ１部位にまたがるＢｅ１１部位と共に、導入した。

合成りＮＡ断片を、４１．３３．３７、及び４５塩基の四つの合成オリゴヌクレ オチド（それぞれオリゴＡ−Ｄ）から、Ｃｒｏｎａｎ、　Ｎａｒａｓ　ｉｍｈａ ｎ、　ａｎｄＲａｗｌ　ｉｎｇｓ、　Ｇｅｎｅ、　７０．１６１−１６９（１９ ８８）に記載されているようニアセンプルした。四つのオリゴヌクレオチドは下 記の配列を有する。

（Ａ　）ＣＧＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＣＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣ ＡＧＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴ（Ｂ　）ＴＣＧＡＣＧＡＡＣＣＧＣＴＴＧＴＴＧＴＴ ＡＴＣＧＡＡＴＧＡＴＣＡＧ（Ｃ）ＣＡＴＧＧＣＡＡＴＴＴＣＧＡＴＡＧＧＡＡ ＣＡＡＣＴＴＡＧＡＣＣＡＧＴＣＧＧ（Ｄ　）ＣＣＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＧＣＴ ＴＧＧＣＧＡＡＣＡＡＣＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＴＢＣＣＰのア ミノ酸配列については第２図参照。アセンブルされた合成りＮＡを、Ｋｐｎｌの ３°の突出した一本鎖末端及び５ａｉｌの５′の突出した末端を与え、ＢＣＣＰ コード配列内にＫｐｎｌ末端があるようにデザインした。

アセンブルした合成りＮＡを第３４図に示すようにＫｐｎ　Ｉ及びＳａｌ、Ｉで 切断したプラスミドｐＣＹ３７に連結した。得られた形質転換体を、予想した制 限部位を含むプラスミオドについてスクリーニングした。このうちの一つがｐＣ ＹＳ５４であり、ＤＮＡ配列分析により予想された配列を含むことが示された。

プラスミドｐＣＹ３７は、ｐＣＹ５のＫａｎ　ｌ遺伝子をｐＴＺ１８Ｒに第３４ 図に示すように挿入することにより構築された。プラスミドｐＣＹ５は、実施例 ３に記載したように製造した。プラスミドｐＴＺ１７８Ｒは、Ｐｈａｒｍａｃｉ ａＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、、Ｊ、か ら得た。

プラスミドｐｃＹ１５１は、ｐＣＹＴ８ＤをＨｉｎｄｌｌｌ及びＫｐｎ　Ｉで消 化し、ｐｃｙｓ５４をＫｐｎｒ及び５ａｉｌで消化することにより製造した。こ れらの消化物を合わせて、ＨｉｎｄｎＩ及び５ａｌＩで消化したｐＨ５Ｇ３９５ に連結し、第３４図に示すようにｐｃＹ１５１を得た。従って、プラスミドｐｃ ＹＩ５１は、天然ＢＣＣＰ遺伝子のＮｃｏ　Ｉ−Ｋｐｎ　Ｔセグメント及び合成 りＮＡからのＫｐｎ　Ｉ−Ｓａ　ｌ　ｌセグメントからなるＢＣＣＰ遺伝子断片 を含む。プラスミドｐＨ３Ｇ３９５は、東京の日本ガンリサーチリソースバンク から得た。

β−ラクタマーゼ配列をＢＣＣＰ配列に融合するために、ｐＫＴ２５４Ω−マー ゼ遺伝子をＨｉｎｄＩｒｒで切断し、旧ｎｄＴＩＩ切断ｐｃＹ１５１に連結して 、ｐｃＹ１５８を得た（第３４図参照）。その後、プラスミドｐｃＹ１５８を、 Ｐｓｔｌで切断し、連結により再環化して、ｐｃＹＩ５９を得た。プラスミドｐ ｃｙｔ５９は、ＢＣＣＰのＣ−末端の８７アミノ酸にプレーβ−ラクタマーゼの Ｎ−末端１８２アミノ酸を融合させた融合タンパク質をコードする。ｐＭＴＬ２ １ポリリンカー配列によりコードされた三つのアミノ酸（Ｌ、　Ｇ、　Ｔ）は、 二つのポリペプチドの結合部に存在する。

使用したβ−ラクタマーゼ遺伝子は、ＡＴＣＣ，寄託番号３１３４４で得られる ｐＢＲ３２２中に見出されるものと同じであることに注目すべきである。プラス ミドｐＫＴ２５４Ω−Ａｐは、叶、Ｊ、Ｆｒｅｙ、　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ 　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ＣＨ３０１２，スイスか ら得られた。

プラスミドｐｃＹ１５９で、Ｄｒ、　Ｋ、　５ｔｒａｕｃｈとＰｒｏｆｅｓｓｏ ｒ　Ｊ、　Ｂｅｃｋｗｉｔｈ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ、Ｈａｒｂａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌから得られた四つ の異なるＥ、　ｃｏｌｉＫ−１２株を形質転換した。これらの株の二つ（ＫＳ４ ７４とＫＳ４７６）はべりプラスミック空間に普通は存在する多量のプロテアー ゼ（ＤｅｇＰ）を欠いている。二つ（ＫＳ３０３及びＫＳ４７４）は、主な外部 膜リポタンパク質を欠いている。そのような１ｐｐ−株は、変化した外膜を有し 、これによりペリプラズムタンパク質は細胞外環境に逃れうる（Ｓｕｚｕｋｉ、 　Ｎｉ　ｓｈｉｍｕｒａ、　Ｙａｓｕｄａ、　ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ、　Ｙａｍａ ｄａ、　ａｎｄ　Ｈｉｒｏｔａ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１６７． １−９　。

使用した株及び関連する遺伝子型を下記に示す：株　遺伝子型　ｐｃＹ１５９を 含む誘導体の名称ＫＳ２７２　野性型　ＣＹ７４２ ＫＳ３０３　１ｐｐ−５５０８ＣＹ７４３ＫＳ４７４　ｄｅｇＰ４１　ＣＹ７４ ４ＫＳ４７６　１ｐｐ−５５０８，ｄｅｇＰ４１　ＣＹ７４５株ＫＳ２７２．　 ＫＳ３０３及びＫＳ４７４は、５ｔｒａｕｃｈ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｂｅｃｋ ｗｉｔｈ、　Ｊ、　Ｂａｃは、ＫＳ４７４及びＫＳ３０３から、Ｋ、　５ｔｒａ ｕｃｈにより構築された。

株ＣＹ７４２〜７４５は、実施例１に記載したように生育され、３Ｈ−ビオチン で標識された。細胞を遠心分離（］、、２．０００　Ｘ　ｇ、　１０分から）に より集め、ペレットを１．ｏｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０で洗浄し、Ｓ ＤＳポリアクリルアミド電気泳動のために調製した。遠心分離工程からの培養上 澄みを保持し、存在する全てのタンパク質をトリクロロ酢酸で沈澱さえることに より集め、ゲル電気泳動で分析した。

ゲル電気泳動の結果は、ｄｅｇＰ＋株（ＫＳ２７２及びＫＳ３０３）からの培養 上澄み液は、β−ラクタマーゼーＢＣＣＰ融合タンパク質に期待される分子ｆｆ １（約３０．０００）のビオチン化タンパク質を含まないことを示す。

その代わり、約１．４．、０００Ｄａのビオチン標識タンパク質が見られた。反 対に、ＤｅｇＰプロテアーゼを欠＜　ｄｅｐＰ−株（ＫＳ４．７４及びＫＳ４７ ６）からの上澄みは両方とも融合タンパク質の期待されたサイズのビオチン化タ ンパク質を含んでいた。

これらのデータから、β−ラクタマーゼーＢＣＣＰ融合物がＤｅｇＰプロテアー ゼの基質であることが明らかである。ＤｅｇＰプロテアーゼを含む細胞内では、 融合タンパク質が融合結合部付近で開裂し、ＤｅｇＰプロテアーゼを欠く細胞内 では、開裂生成物は見られなかった。ＤｅｇＰプロテアーゼはべりプラズム内の みで機能し、及びこのプロテアーゼがない場合は、細胞質内に存在する融合タン パク質の安定化することができない（Ｓｔｒａｕｃｈ　ａｎｄ　Ｂｅｃｋｗｉ　 ｔｈ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５゜１ ５７６−１５８０（１９８８））。従って、β−ラクタマゼーＢＣＣＰ融合物は 、Ｅ、　ｃ。

１ｉ内部膜を通してＤｅｇＰプロテアーゼが存在するペリプラズム中へ分泌され なければならないことがわかる。この解釈に沿うように、１ｐｐ−ｄｅｇＰ−株 に４７６の培養上澄みは、かなりの量のビオチン化融合タンパク質を含み、ｌｐ ｐ＋株（ＫＳ２７２．　ＫＳ４７４　）の培養上澄み液には融合タンパク質が見 られなかった。従って、ｌｐｐ変異の性質から期待されるように、ビオチン化融 合タンパク質は株ＫＳ４７６から培地へ流れたものである。ＫＳ４７６株の総ビ オチン化融合タンパク質の約半分が培地中に見出され、残りは細胞に結合してい た。さらに、３０．０００Ｄａのビオチン化タンパク質が株ＫＳ３０３の細胞ペ レットに全く見られなかったが、このタンパク質のいくらかは、培地中に見出さ れた（ＫＳ４７６培地に見られる量の約２０％）。従って、１ｐｐ−株において 、融合タンパク質の一部は、ペリプラズムから培地へ流れる結果、ＤｅｇＰプロ テアーゼを明らかに逃れるることができる。ｄｅｇＰプロテアーゼが最近精製さ れ、エンドプロテアーゼであることが見出されたことはタンパク質 ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、１０ Ｑ ＦＩＧ、１７ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　２６ ＩＩＩ＋計−１ｔｏ＋ｔ＋ｄＡｅｓ＆１ｓｅｐＮａＰＣＴ／ＬＩＳＱＯ１０２Ｆ ＩＳフｌＣ１ａｔｍｇＬ−１’＞ａｒｕ＋Ｊｒａｗｎｒｒ＞ＯＮ：Ｓｑｎｃｏｄ ｌｎｇｆｕｓｉ＋＋ｎｐｒｎ「＠ｉｎｓｉｇｌ（１＋ｐｎｓｒ−ｒｒ；ｖｎ！１ １．ｎｔｎｎａｌ　＊＋ｕｄｉｆｉ＋：ａｔｉｏｎ　＋＋１ｒｅｓ、　Ｃ１ａｐ ｓ［ｔｕ＋Ｉ　１ｎＣ３ａｓｓ　Ｊ３５．　ｐ）由ｃｌａｓｐ＋　６’１．７゜ ｒｌ＋ｍ　＋ｎｖｏ１１Ｆｉすｎ　ｎｒ　’Ｊｒｔ）＋１１１　Ｉ　ａｎｄ　リ ｒｎｕｐ　ＴＴ　ａｒｒａ　１ｎｄｐｐｐｒ＋＋Ｊａ＋ｒ　|５ｎｄ ｒｌｉｒｒｌｌｒｌ！Ｉｌｌ　ｌ＋ｆ！ｅａｌ１ＭＩ！！　１．１１１’　ｐｒ Ｃ１ｔＬ’１ｌｌｆｌ　＋ｌｆ　ｌＪｒ’（ｌｌｌｐ　ＨＩF（ｌＬｌｌｄ　ｔ ｈｅ　ｐｒｅｐｓｒｅｄｓｙｎｔｈ−１ｉｅａｌｌｙ、＝ｌ＋ｉｘ＋＝ｂ　ｗｏ ｕｌｄ　ｕｕｊ　ｒｅｑｕｉｒｅ　ｊｈｅ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｇｒすｕｐ　Ｘ。

７）＋ｅｉハｖｅｎｔｊ？＋ｏｒ＋（＋＋ｒｒ＋ｕｐＩＨｉｐｉｎｄｅｐｅｎｄ ｅ＋ｕ（１Ｅ９ｒ（ＩＬｌｐｌＪｌｓｒｕｌＩＴＩｎ　ｒｈｌｒ　ｉｔ　ｅａｎ 　ｂｕ　１１３１！１１　１１＋＋　１ｕｉｒ１４％　【北１＋ｑｒ　ｐｒすｒ ｅｉｎｎ　ｊｂａｎ　ｔｌ＋窒凾■■ Ｐｎｒｔづｐｄ　ｆｃ−ｒ　ｊｊｔ　ｇｒｏｕｐ　１　ｏｒ　ｃｌａｉｍｅｔｌ 　ｊｎ　Ｂｕｕｐ　１１゜

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. （１）融合タンパク質をコードするハイブリッドＤＮＡ配列であって；融合タン パク質の翻訳後修飾を可能にするアミノ酸配列をコードする第一のＤＮＡ配列、 及び 末端か第一のＤＮＡ配列の末端に結合し、同じ読み取り枠内にあり、選択された タンパク質又はポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列を含む上記ハイブリ ッドＤＮＡ配列。
2. （２）さらに、開裂部位をコードする第三のＤＮＡ配列を含み、該第三の配列か 第一のＤＮＡ配列と第二のＤＮＡ配列の間に位置し、三つのＤＮＡ配列の全てが 、同じ読み取り枠内にある請求の範囲第１項記載のハイブリッドＤＮＡ配列。
3. （３）第一のＤＮＡ配列が、融合タンパク質の翻訳後ビオチン化を可能にするア ミノ酸配列をコードする請求の範囲第１項記載のハイブリッドＤＮＡ配列。
4. （４）第一のＤＮＡ配列が、Ｐｒｏｐｊｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｈｅｒｍ ａｎｉｉトランスカルボキシラーゼの１．３Ｓサブユニット、トマトビオチンタ ンパク質、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅオキサルアセテートデ カルボキシラーゼのα−サブユニットＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉビオチ ンカルボキシルキャリアータンパク質、又は融合タンパク質の翻訳後ビオチン化 を可能にするこれらのタンパク質の断片を、コードする請求の範囲第３項記載の ハイブリッドＤＮＡ配列。
5. （５）第一のＤＮＡ配列が、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｏｔｅｒｉｕｍ　Ｓｈｅｒｍ ａｎｉｉトランスカルボキシラーゼの１．３Ｓサブユニットのカルボキシ末端の 最後の７５アミノ酸、又はその類似物をコードする請求の範囲第１項記載のハイ ブリッドＤＮＡ配列。
6. （６）第一のＤＮＡ配列が、融合タンパク質の翻訳後リポイル化を可能にするア ミノ酸配列をコードする請求の範囲第１項記載のハイブリッドＤＮＡ配列。
7. （７）第一のＤＮＡ配列が、Ｅ．ｃｏｌｉピルベートデヒドロゲナーゼコンプレ ックスのジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼサブユニット、又は融 合タンパク質の翻訳後リポイル化を可能にするそれらの断片をコードする請求の 範囲第６項記載のハイブリッドＤＮＡ配列。
8. （８）発現調節配列に機能的に結合した請求項１、２、３、４、５、６又は７記 載のハイブリッドＤＮＡ配列を含むベクター。
9. （９）融合タンパク質を分泌させるシグナル又はシグナルリーダー配列をコード するＤＮＡ配列又はその断片を含む請求の範囲第８項記載のベクター。
10. （１０）請求の範囲第８項記載のベクターにより形質転換された宿主。
11. （１１）請求の範囲第９項記載のベクターにより形質転換された宿主。
12. （１２）融合タンパク質の発現を許容する条件下で、請求の範囲第１０項記載の 形質転換された宿主を培養することを含む融合タンパク質の製造方法。
13. （１３）融合タンパク質が、翻訳後修飾によりｉｎ　ｖｉｖｏで修飾される請求 の範囲第１４項記載の方法。
14. （１４）融合タンパク質の発現及び分泌を許容する条件下で、請求の範囲第１１ 項記載の形質転換された宿主を培養する工程を含む融合タンパク質の製造方法。
15. （１５）融合タンパク質か、翻訳後修飾によりｉｎ　ｖｉｖｏで修飾される請求 の範囲第１４項記載の方法。
16. （１６）融合タンパク質の翻訳後修飾を可能にするアミノ酸配列に結合した選択 されたタンパク質又はポリペプチドを含む融合タンパク質。
17. （１７）選択されたタンパク質又はポリペプチドと融合タンパク質の翻訳後修飾 を可能にするアミノ酸配列との間に開裂部位を含む請求の範囲第１６項記載の融 合タンパク質。
18. （１８）翻訳後修飾により修飾された請求の範囲第１６項又は１７項記載の融合 タンパク質。
19. （１９）アミノ酸配列が融合タンパク質の翻訳後ビオチン化を可能にする請求の 範囲第１６項又は１７項記載の融合タンパク質。
20. （２０）アミノ酸配列か融合タンパク質の翻訳後リポイル化を可能にする請求の 範囲第１６項又は１７項記載の融合タンパク質。
21. （２１）材料混合物から請求の範囲第１８項記載の融合タンパク質を単離する方 法であって； 修飾された後にのみ融合タンパク質に結合する結合パートナーを提供し、 修飾された融合タンパク質を、結合パートナーと結合を可能にする条件下で接触 させ、 混合物中の非結合材料から結合パートナーに結合した修飾された融合タンパク質 を分離し、そして 修飾された融合タンパク質を溶離する工程を含む融合タンパク質を単離する方法 。
22. （２２）前記融合タンパク質が開裂部位を有し、そして、結合パートナーと結合 している間、又は結合パートナーから溶離された後に、開裂部位で開裂される請 求の範囲第２１項記載の方法。
23. （２３）融合タンパク質が、ビオチン化タンパク質である請求の範囲第２１項記 載の方法。
24. （２４）結合パートナーが、アビジン、ストレプトアビジン及びそれらの誘導体 及び類似物からなる群から選択される請求の範囲第２３項記載の方法。
25. （２５）融合タンパク質か、開裂部位を有し、そして、結合パートナーと結合し ている間、又は結合パートナーから溶離された後に、開裂部位で開裂される請求 の範囲第２３項記載の方法。
26. （２６）結合パートナーが、アビジン、ストレプトアビジン及びそれらの誘導体 及び類似物からなる群から選択される請求の範囲第２５項記載の方法。
27. （２７）結合パートナーが、アビジン又はストレプトアビジンであり、ビオチン 化融合タンパク質が結合パートナーに結合している間に開裂部位で開裂される請 求の範囲第２６項記載の方法。
28. （２８）結合パートナーが、固定された親和性の低いモノマーアビジンであり、 ビオチン化融合タンパク質が、結合パートナーから溶離された後に開裂部位で開 裂される請求の範囲第２６項記載の方法。
29. （２９）さらに、選択されたタンパク質又はポリペプチド並びに他の材料をアビ ジン又はストレプトアビジンと接触させ、選択されたタンパク質又はポリペプチ ドを、アビジン又はストレプトアビジンに結合した材料から分離することにより 、溶離及び開裂後に残る全ての材料から、選択されたタンパク質又はポリペプチ ドを分離することを含む請求の範囲第２８項記載の方法。
30. （３０）融合タンパク質がリポ化タンパク質である請求の範囲第２１項記載の方 法。
31. （３１）結合パートナーが、モノチオールよりもジチオールに強固に結合する金 属化合物である請求の範囲第３０項記載の方法。
32. （３２）金属化合物が有機亜ヒ酸塩である請求の範囲第３１項記載の方法。
33. （３３）融合タンパク質が開裂部位を有し、結合パートナーにまだ結合している うちに、又は結合パートナーから溶離した後に、開裂部位で開裂される請求の範 囲第３０、３１又は３２項記載の方法。