JPH04507400A - 脊椎動物のｍｈｃクラス２遺伝子の発現を調節するタンパク，それらをコードするｄｎａ配列および薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 を推動物のＭＨＣクラス■遺伝子の発現を調節するタンパク。

それらをコードするＤＮＡ配列および薬剤組成物本発明は、を推動物のＭＨＣク ラス■遺伝子の発現を調節するタンパクおよびそのタンパクをコードするＤＮＡ 配列に関する。さらに９本発明は、対応する組換え体ＤＮＡ分子、形質転換微生 物および前記タンパクを製造するためのそれらの用途に関する。さらに９本発明 は、　ＭＩＩＣクラス■遺伝子の異常な発現によって起こる疾患の治療に用いる 薬剤組成物に関する。

クラス■主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原は、ヘテロダイマーのトランスメンプラ ン糖タンパクである。抗原提示細胞の表面における上記遺伝子の発現は、Ｔ細胞 受容体による外来遺伝子の認識には必須のものである。Ｔ細胞の活性化と抗原の 提示は１個体の細胞でのクラス■抗原の発現レベルによって決まる。それ故に、 クラス■遺伝子の発現を調節することは。

正常および異常の免疫応答の両方を制御するのに重要である。

ヒトにおいて、　ＩＩＬＡ−叶、　ＩＩＬＡ−ロｑ、およびＨＬＡ−ＯＲのクラ ス■分子のａ鎮およびｂ鎖をコードする遺伝子は、染色体６のＭｌＩＣＯＤ領域 に密集している。これらの遺伝子は９強固で複雑な調節制御を受けている。これ ら遺伝子の発現は、一般に。

Ｂリンパ球、活性Ｔリンパ球、マクロファージ、樹枝状細胞のような免疫系細胞 と、タッパ−細胞およびランゲルハンス細胞のようないくつかの特殊細胞に主に 同調および制限されている。いくつかのクラス■陰性細胞では９発現は、インタ ーフェロンｙもしくはインターロイキン４などのリンフ才力インによる刺激によ って誘発することができる。

インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リュウマチ、エリテマトー デスのようないくつかの自己免疫疾患は、少なくとも一部は、常態では旺Ａクラ ス■抗原を発現すべきではない細胞でのこの抗原の異常な発現が原因であると考 えられている。次に異常なＴ細胞が活性化して自己免疫プロセスに入るに至る。

Ｍ肛りラス■分子に対する抗体による。

自己免疫性疾患にかかっている動物の治療は、すでに有望な結果を提供している 。従って、自己免疫疾患を防止もしくは治療するために１例えばクラス■遺伝子 の発現を制御することができるスイッチ機構に作用させることによって、　ＩＩ ＬＡクラス■遺伝子の発現を低減化調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕ　ｌａ　ｔｅ）が できることが非常に望ましいことである。

クラス■遺伝子調節の正確な機構はまだ明確に理解されていない。クラス■遺伝 子の上流のＤＮＡ配列がこのプロセスに関与していることは充分に確認されてい る。生化学的に充分に特性が決定されていないが、いくつかの因子が、この領域 のＤＮＡに結合し、その結果機能に関与することができる。ＩＩＬＡ□クラス■ 遺伝子の発現を欠いている調節突然変異体由来の細胞（１）において、　ＤＮＡ に結合するパターンが異なることが観察されたが、これは所定の因子のＤＮＡと の結合の欠陥を示唆している（２）。これらの突然変異細胞では、すべてのクラ ス■遺伝子の発現が影響を受けるので、このようなりＮＡ結合性の欠陥は、恐ら くすべてのクラス■遺伝子の発現に影響するであろう。この因子を、単離し、精 製しまたは特性を決定することができなかったので、その正確な生化学的性質は 決定できなかった。ＤＮＡにおけるその結合部位はクラス■プロモーターのＸボ ックスであり、結局この因子はＲＦ−Ｘと命名された（２）。

しかし、ＲＦ−Ｘ因子の化学的性質は不明であった。その調節突然変異体に欠け ているこのＤＮＡ結合因子がタンパクであれば、それはクラス■遺伝子発現の必 須のレギュレーターを提示するであろう。このような場合、かようなタンパク、 もしくは実質的に同じ活性を有する類縁タンパクおよび／またはその遺伝子に到 達すれば、　）ＩＬＡクラス■遺伝子の発現を調節するという、前記の重要な自 己免疫性疾患を治療する真に望ましい目的に対する方法を提供することができる であろう。

したがって９本発明の基礎になっている技術的問題は、　ＲＦ−Ｘ因子を単離・ 同定し、純品の形態で提供することである。

さらに本発明の基礎になっている技術的問題はＲＩ’−Ｘ因子の生物学的性質を 有するタンパク、前記ＲＰ−Ｘ因子および／または類縁タンパクをコードするＤ ＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列を含有する組換え体ＤＮＡ分子および前記組換え 体ＤＮＡ分子で形質転換された微生物を提供することである。さらにまた、形質 転換された微生物を用いて前記タンパクを製造する組換え体ＤＮＡプロセスを提 供することである。その上に、前記タンパクもしくは対応するＤＮＡ配列を含有 する薬剤組成物を提供することが技術的問題である。

上記の問題は１本願の請求の範囲に特定されている本発明の実施態様を提供する ことによって解決される。

したがって、　ＭＨＣＨＣクラス■子を発現するを推動物の細胞内に通常発生し 、を推動物のＭＨＣＨＣクラス■子の発現を調節し、および前記Ｍ肛りラス■遺 伝子の発現を制御するＤＮＡ配列に結合する精製タンパクが提供される。

前記タンパクを提供するために克服しなければならない特別な障害は、（２）に 記載されている。依然として同定されていない不純物を含有するＲＦ−Ｘ因子が 、他のＤＮＡ結合因子と異なり、２０〜２５塩基対の短いＤＮＡセグメントと結 合しないことである。その結果、かような結合の実験に標的配列として通常採用 されている短いＤＮＡセグメント（２０〜２５塩基対）を用いても、　Ｒ１−Ｘ 因子の性質を有するタンパクをコードする遺伝子は同定もしくは単離をすること はできなかった。

前記タンパクを提供するために克服しなければならないその他の障害は、ヒトの ＨＬＡ−ＤＱＡもしくはマウスのＩＥαのようないくつかのＭＩＩＣクラス■遺 伝子がＲＦ−Ｘ因子と効率よく結合できないことである。それ故に、上記のいく つかの他のＭＩＩＣクラス■遺伝子以外のＨＬＡ−ＤＲＡを利用することが、　 ＲＦ−Ｘとその遺伝子の同定に成功する必須のステップであった。

「調節」という用語は９本発明の精製タンパクがを推動物のＭＨＣＨＣクラス■ 子の発現を制御することを意味する。「結合」という用語は、前記タンパクが、 前記ＭＨＣＨＣクラス■子の発現を制御するＩ）ＮＡ遺伝子と相互に作用するこ とを意味する。

すべてのを推動物が、特定の細胞コンパートメントの表面にＭＨＣクラス■様分 子分子っているので１本発明のタンパクがすべてのを推動物中に天然に依存する という仮定から出発することができる。その例は、マウスもしくはニワトリの８ ９２８球もしくはマクロファージである。

本発明の好ましい実施態様において、精製タンパクは、哺乳類、特にヒト中に天 然に依存するタンパクである。

さらに好ましい実施態様は、　Ｍ）Ｉｃクラス■遺伝子を発現するヒト細胞中に 天然に存在するＲＦ−Ｘタンパクの生物学的活性を有する。上記性質を示すタン パクである。これについて。

ｒ　ＲＦ−Ｘタンパクの生物学的活性を有する」という用語は、　ＭＩＩＣ’ク ラス■遺伝子の制御領域（「プロモーター」）に結合できるタンパクもしくはＭ ＩＩＣクラス■遺伝子の発現に必須のタンパクを意味する。

本発明の特に好ましい実施態様は、ヒＩ−ＲＦ−Ｘタンパクである。このタンパ クは９例えばヒ）８９２８球およびヒト繊維芽細胞中に天然に存在する。またこ のタンパクは、第９図（９４〜３０３０の位置）に示すＤＮＡ配列によってコー ドされている。

さらに、ヒトＲＦ−Ｘタンパクの端を切り取った形態のものが本発明の好ましい 実施態様である。「端を切り取った（ｔｒｕｎ（ａｔｅｄ）　Ｊという用語は、 そのタンパクが、そのアミノ酸配列のある種のセグメントを欠いていることを意 味する。遺伝子の活性化に関与するＩＪＮＡ鯖台タンパクは、Ｚ″′Ｊの共はΦ 郡りＪすなわち「ドメイン」を持っている。ＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡとの相 互作用に関与し、活性ドメインは関連遺伝子の活性化に関係する。Ｕ端を切り取 ったＪ　ＩＩＮＡ結合タンパクは、その活性ドメインが部分的にもしくは全部が 削除されているが。

依然として特定のＤＮＡ標的配列と結合する。しがし、この結合は遺伝子の活性 化をもたらさない。さらに、かような「端を切り取った」不活性なタンパクは、 結合部位を占有し、ブロックするので、正常な活性ＲＦ−Ｘタンパクの結合を防 止し。

結局、　ＭＩＩＣクラス■遺伝子発現の阻害剤として作用する。ＭＩＩＣクラス ■遺伝子の発現を阻害もしくは減少させることができる薬剤は、クラス■分子の レベルを下げなければならない自己免疫性疾患などの症状の治療に価値があるで あろう。ＲＦ−Ｘ遺伝子が入手できれば、正常なＲＰ−ＸタンパクがＤＮＡに結 合するのを防止する能力、つまりＭＨＣＨＣクラス■子阻害活性を有する。「端 を切り取った」形態のＲＦ−Ｘタンパクを製造する手段が提供される。

端を切り取った形態の特に好ましいヒｌ−Ｒ１−Ｘタンパクは。

第１図に示すアミノ酸配列を有する。完全なヒトＲＦ−Ｘタンパクと比べて、こ の端を切り取った形態のものは、そのタンパクのＣ０ＯＨの部分全体を欠いてい るが、　ＤＮＡとの結合に関与する領域は持っている。端を切り取った形態の他 の好ましいヒ）　ＲＦ−Ｘタンパクは、　ＤＮＡ結合に関係する１２２個のアミ ノ酸からなる小さな配列（第１図の下線を施した部分）である。こＳＶ４０ウィ ルスの大きなＴ抗原の核標的シグナル）にも連結されるが、　ＭＨＣＨＣクラス ■子の発現を阻害できる。より小さい「端を切り取った」形態のＲＦ−Ｘを構成 している。核標的シグナルは、細胞の核にタンパクを向けるこきができる約８個 のアミノ酸からなる小さなセグメントである。このような端を切り取った形態の ＲＦ−Ｘタンパクは薬剤として使用することができる。第２図は、正常なタンパ クの結合に競合し、その結果ＭＩＣクラス■遺伝子の発現を阻害する。端を切り 取った形態のＲＦ−ＸなどのＤＮＡ結合調節タンパクを用いる原理を示す。

本発明のさらに好ましい実施態様は、天然に存在するタンパクのＤＮＡ結合特性 を実質的にもっているが、　ＭＩＩＣクラス■遺伝子の発現を活性化することが できないタンパクである。

またこのタンパクは、　ＲＦ−ＸがＭＨＣＨＣクラス■子のプロモーターに結合 するのを防止し、　Ｍｌ−ＩＣクラス■遺伝子の発現の阻害剤として作用する。

またこれらのタンパクは、上記の目的の薬剤として使用できるであろう。

本発明のさらに好ましい実施態様は、　Ｉ（Ｆ−Ｘタンパクに由来するかしない かにかかわらず、正常な活性ＲＦ−ＸタンパクがＨＣクラス■プロモーター配列 に結合するのを阻害できるタンパクと、同じ特性を有する他の非タンパク分子で ある。これらの分子は、　ＲＦ−ＸがＩＡＨＣクラス■プロモーターと結合する のを阻害する性質をもっているので、　ＭＨＣＨＣクラス■子の発現の阻害剤と して転写介在過程で機能し、薬剤として有用である。組換え体ＲＦ−Ｘタンパク が入手できると、　ＲＦ−ＸがＭＨＣクラス■遺伝子のプロモーターに結合する のを防止する同じ性能を有し、転写介在過程で一肛りラス■遺伝子発現の阻害剤 のような薬剤として利用できる。小さな分子を含む分子を検定し、試験し、そし て同定する手段が提供されるであろう。

さらに１本発明は１組換えＤＮＡ技術の産物としての上記タンパクに関する。

さらに１本発明は１本発明のタンパクをコードするＤＮＡ配列に関する。かよう なりＮＡ配列は４例えば、そのｃＤＮＡ挿入断片がそれぞれのタンパクの形態で 発現される方式で構築された。λｇｔｌｌのような組換え体バクテリオファージ のｃＤＮＡライブラリー（−「発現Ｊライブラリー）から単離することができる 。所定のＤＮＡ結合タンパクを発現するバタテリオファージのクローンを同定す る方策は、かような「発現」ライブラリーを、放射能標識をつけてプローブとし て用いられる関連ＤＮＡ標的でスクリーニングすることにある。ＲＦ−Ｘ因子の 場合。

１１ＬＡ−ＤＲＡ　Ｘボックスを含有し、天然のＸ因子き結合することが知られ ているＤＮＡ配列が、　ＲＰ−ＸのＤＮＡ結合ドメインを発現する組換え体バタ テリオファージのクローンを同定するプローブとして用いられた。この組換え体 クローンの挿入断片は。

大部分のタンパクＲＦ−ＸをコードするＤＮＡ配列である。

（以下余白） この発明の好ましいＤＮＡ配列は、第３図もしくは第９図に示すＤＮＡ配列であ る。これらの［］ＮＡ配列はそれぞれ、ヒ１−ＲＦ−Ｘタンパクの上記の部分も くしは完全なヒトＲＦタンパクをコードする。第９図のＤＮＡ配列のコード領域 は、この発明の特に好ましいＤＮＡ配列である。第３図または第９図のＤＮＡ配 列を提供された当業者が、＠乳類のようなを椎動物のゲノムもしくはｃＤＮＡラ イブラリーもしくは他のヒト個体から関連するＤＮＡ配列を単離するために、こ れらのＤＮＡ配列、その断片もしくは対応するオリゴヌクレオチドを使用できる ことは理解されるであろう。関連するＤＮＡ配列は９例えば対立ヒ）　ＤＮＡ配 列である。

他方、この発明のスクリーニング法を提供された当業者は。

哺乳類のような他のを椎動物または他のヒト個体から対応するＤＮＡ配列を単離 することができる。

さらに、第３図もしくは第９図に示すＤＮＡ配列またはそれらに類縁のＤＮＡ配 列は化学合成法で得ることができる。

上記の［ＤＮＡ配列はすべてこの発明の範囲内にある。したがって、この発明は また。好ましくは通常のハイブリダイゼーション条件下で、第３図および／また は第９図のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列に関する。通常のハイブ リダイゼーション条件は、　Ｔｍ値が約Ｔｍ−２０とＴｎ＋−２７との間の場合 の条件である。

さらに、この発明は、遺伝コードの縮重による上記ＤＮＡ配列に関する。

別の実施態様において、この発明は、上記ＤＮＡ配列のコード鎖に相補的なヌク レオチド配列（すなわち、　ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列）に関する。また、 これらの相補的ヌクレオチド配列は、　［アンチセンスＪ　ＲＮＡもしくはＤＮ Ａとも呼ばれ。

関連する遺伝子によってコードされているタンパクの合成を阻害することができ ることが知られている。上記のＤＮＡ配列を提供された当業者は、対応するＵア ンチセンスＪ　ＲＮＡおよびＤＮＡを製造して利用し、これらを、　ＲＦ−Ｘタ ンパクおよび類縁タンパクの合成を阻害するのに用いることができるであろう。

ＲＦ−Ｘタンパクおよび類縁タンパクの合成を、　Ｍ肛りラス■遺伝子の発現を 側御する類似の活性で阻害すると、　Ｍｉｌｄ：クラス■遺伝子の発現を阻害す ることになる。実際に、　ＲＦ−Ｘが欠損していると、ＭＩＩＣクラス■遺伝子 が発現しないということは、突然変異細胞の研究から知られている（２）。上記 のような［アンチセンスＪ　ＲＮＡ′Ｊ６よびＤＮＡの分子をＭＩＩＣクラス■ 遺伝子の発現の阻害剤として用いることは、自己免疫性疾患の場合と同様に、Ｍ ＨＣクラスＨ分子の減少が望ましい場合には。

医学的症状にとって重要である。

また、この発明は、前記ヌクレオチド配列の断片、好ましくは相補的なもしくは ［アンチセンスＪ　ＲＮＡおよびＤＮＡの断片を含む、前記ヌクレオチド配列の コード領域の断片に関する。上記配列を提供された当業者は、対応する短い「ア ンチセンス」オリゴヌクレオチドを製造し、それを利用してＲＦ−Ｘ合成の阻害 、従ってＭＦＣクラス■遺伝子の発現を阻害することができる。当業者はまた９ 文献に記載されているように。

より長い半減期と動物の細胞に一層よく浸透する性能とを有する上記配列由来の 化学的に修飾した「アンチセンス」分子を製造することができる。

さらに、この発明は、この発明のＤＮＡおよびヌクレオチドの配列を有する組換 え体ＤＮＡ分子に関する。

好ましい組換え体［ＩＮＡ分子は、そのユニークなＥｃｏＲ１部位に挿入された 。ヒトＲＦ−Ｘタンパクをコードするほとんど全長のｃＤＮＡで（第３図参照） （λ９と命名）を含有するλｇｔｌｌバクテリオファージである。前記ｃＤＮＡ は、　ＲＦ−Ｘ因子を発現することが知られているヒトＢリンパ球由来のポリＡ ＋　ＲＮＡがら合成した。他の好ましい組換え体ＤＮＡ分子は、前記のＲＦ−Ｘ 　ｃｌ）ＮＡが、そのユニークなＥｃｏＲ１部位に挿入されたｐＵｃプラスミド であり、これはｐ［Ｉｃ１λ９と命名した。このプラスミドは、ブタペスト条約 の要件に基づいて、　１９８９年４月１３日付で、西独。

Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（７）Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｗｏｎ 　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託番号ＤＳ１５３０３号で寄託された。

他の好ましい組換え体ＤＮＡ分子は、全長のＲＰ−Ｘ　ｃＤＮＡで（第９図参照 ）が、ユニークなＥｃｏＲ１部位と旧ｎｄｌｌＩ部位との間に挿入されたブルー スクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　ＫＳプラスミドであり、これをｐＲＦ− Ｘｃと命名する。この全長のＲＦ−Ｘ　ｃＤＮＡでは、上記のライブラリーに類 似のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られ、同じｍＲ ＮＡ調製物から作成された。しかし、第１鎖のＤＮＡを調製する際に、　ｐＵｃ ／λ９の５゛末端の近くに位置する配列（０３Ｍ５３０３　：３０１〜３４１の ヌクレオチド）に相補的なオリゴヌクレオチドブライマーを用いた。標準のハイ ブリダイゼーション法を用いて、　ｐＵｃ／λ９の配列と重複し、完全ＲＦ−Ｘ 　［ｌｌＲＮＡの残りの５゛末端に対応するｃＤＮＡクローンＲＦ−Ｘ５°を単 離した。ＲＦ−Ｘの完全ヌクレオチド配列（および対応するアミノ酸配列）は、 クローンｐｌＪｃ／λ９およびＲＦ−Ｘ５′の重複から誘導した。完全ＲＦ−Ｘ 　ｃＤＮＡは、クローンｐｕｃ　／λ９由来のＫｐｎｌ−１１ｉｎｄＩＩＩ断片 に対してクローンＲＦ−Ｘ５’由来のＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ　ｌ断片によって再構 築され、その結果、全長のＲＦ−ＸクローンｐＲＦ−ＸＣが生成した。そのプラ スミドを有し。

ｐＲＦ−ＸＣと呼ばれるイー・３９８８１０１株は、ブタペスト条約の要件に基 づいて、　１９９０年４月１７日付けで、西独、　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇの Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ ｎに寄託番号０３Ｍ５８７６号で寄託された。

また、この発明は、この発明の組換え体ＤＮＡ分子で形質転換される宿主微生物 に関する。かような宿主微生物としては。

イー・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）またはバシラス・サチリス（３ａｃｉｌｌｕｓｓ ｕｂｔ　ｉ　Ｉ　ｉｓ）のような細菌、サツカロミセス属の種もしくは菌ｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　］　、および昆虫もしくは咄乳類 の細胞のような他の真核宿主細胞である。

さらに、この発明は、以下のような工程を包含する。この発明のタンパクの製造 法に関する。ずなわち、その製造法とは、この発明の形質転換宿主微生物を、適 切な条件下、培地中で培養し、得られた発現生成物を培地から回収することから なる製造法である。回収された発現生成物は、任意に１通常の方法９例えばイオ ン交換樹脂を用いるか、あるいはマトリックスに結合させたモノクローナル抗体 もしくはポリクローナル抗体のようなアフィニテイクロマトグラフイーの材料を 用いるクロマトグラフィーによって精製することができる。

さらに、この発明は、この発明のタンパクの少なくとも一つまたはこの発明のヌ クレオチド配列の少なくとも１つを。

適切な投与量で含有する薬剤組成物に関する。これらの薬剤組成物は、任意に、 薬剤として許容される担体および／または添加物を含有していてもよい。

投与量は、患者の症状と、疾患の徴候とによって決まる。

特に、この発明のタンパクを含むこの発明の組成物はく天然に存在するタンパク のＤＮＡ結合特性を実質的にもっているが、　ＭＨＣクラス■遺伝子の発現を活 性化できないタンパクを除く）は、　ＭＨｚ：クラス■遺伝子の発現の増大が望 ましい疾患の治療に使用することができる。Ｍ）ＩＣクラス■調節因子ＲＰ−Ｘ の欠陥による免疫欠損症は、かような臨床症状に相当する。

その有益な効果の機構は、患者の欠陥ＲＦ−Ｘタンパクの取り換えによるもので ある。

天然に存在するタンパクのＤＮＡ結合特性を実質的に持っているが、　ＭＨＣク ラス■遺伝子の発現を活性化することができないタンパクを含有する。この発明 の薬剤組成物は、ＭＩＩＣクラス■遺伝子の発現のレベルを減少させることが望 ましい疾患を治療するのに用いることができる。

とりわけ、これらの疾患には、ある種の細胞の表面における１化Ａクラス■分子 の異常で過度の発現が自己免疫性病理プロセスに関係している考えられる自己免 疫性疾患が含まれる。

これらの疾患としては、インシュリン依存性糖尿病（１００）、多発性硬化症（ ＭＳ）　、紅斑性狼ｆ　（ＬＥ）および慢性関節リウウマチ（ＲＡ）が挙げられ る。−肛クラスＨの遺伝子およびタンパクの異常発現は、これらの疾患を有する ある種の動物モデルで報告されている。さらに、これら自己免疫性疾患のいくつ かの動物モデルの、Ｍ）ＩＣクラス■分子に対する抗体を用いた治療に成功して おり、自己免疫性疾患においてＭＩＩＣクラス■遺伝子の発現を減少させる調節 を行うことが望ましいことを示している。

「端を切り取った」形態のＲＦ−Ｘもしくは類縁のタンパクがＭＩＩＣクラス■ 遺伝子を阻害する機構は、天然に存在する活性Ｒ１−Ｘタンパクと競合する「端 を切り取った」タンパクのＤＮＡ結合ドメインに基づいていてる。これについて は上で詳細に考案しである（第２図も参照のこと）。

上記のヌクレオチド配列もくしはその断片を含有するこの発明の薬剤組成物は、 ＭｔｌＣクラス■遺伝子発現のレベルを減少させることが望ましい上記疾患を治 療するのにも使用できる。上で詳細に考案したように、相補的もしくは「アンチ センＪ　ＲＮＡもしくはＤＮＡの配列は、　Ｒ１−Ｘタンパクもしくは類縁タン パクの合成を阻害するので結局、ＭＩＩＣクラス■遺伝子の発現を阻害する。患 者においてこの阻害を達成する好ましい方法は、　「アンチセンス」オリゴヌク レオチドによる方法であり、これらの「アンチセンス」オリゴヌクレオチドを投 与するある可能な方法はリポソームによる方法である。

この発明は、さらに、ＭＩＩＣクラス■遺伝子の発現を阻害できる物質をスクリ ーニングおよび同定するのに用いる上記タンパクの用途間する。上記タンパクは ９組換え体タン）＜りとして得られるが、当業者ならば、タンパクＲＰ−ＸがＭ ＩＩＣクラス■遺伝子のプロモーターのＸボックスに結合すること、または他の 類縁タンパクが同じプロモーターの他の標的に結合することを防止できる物質を 同定するのに利用することができる。このことは、このタンパクのＤＮＡ結合ド メインもしくは標的ＤＮＡ配列を阻害する物質かまたはこれらに似た物質で達成 することができる。この検定は、上記特性を有する物質を試験する大規模なスク リーニングで行うことができる。かような検定において、　ＲＦ−Ｘの結合を防 止できるとして同定される物質は、ＭＨＣクラス■遺伝子の発現を阻害できる。

それらの効果は、細胞培養法および動物の生体内で試験することができる。

各図面は以下のことを示す。

第１図は１ｊＬＡクラス■プロモーターと結合できる。端を切り取った形態のタ ンパクＲＦ−Ｘを示す。Ｃ００８部分が削除された形態のＲＦ−Ｘタンパクのア ミノ酸配列である。下線を施した領域はＤＮＡ結合ドメインに相当し、またその 下線を施した配列だけで構成されたポリペプチドはＨＬＡクラス■プロモーター のＸボックスに結合する。

第２図は、端を切り取った形態のタンパクＲＰ−ＸでＭ肛りラス■遺伝子の発現 を阻害する原理の説明図である。完全なＲＦ−Ｘは、ＭＩＣクラス■遺伝子と結 合して活性化する（上図）。

端を切り取った形態のＲＦ−Ｘは、正常のＲＰ−Ｘと結合するＤＮＡと競合する （下図）ので、遺伝子の発現を阻害する。

第３図は、　ＲＰ−Ｘをコードする組換え体クローン９のｃＤＮＡ挿入断片のコ ード領域の完全ＤＮＡ配列と、その対応するアミノ酸配列を示す。ＨＬＡプロモ ーターのＸボックスに結合できる最小のアミノ酸配列には下線をつけである。

第４図は、ＡがＤＮＡ結合因子に対する標的配列を有するＩ佳Ａクラス■プロモ ーターを、Ｘボックスを含めて示す地図を示し、ＢがＤＮＡ結合と９組換え体ク ローンをコードするＲＦ−Ｘのスクリーニングとに用いられるＸ＋′Ｊ６よびｘ ３のヌクレオチドの構造を示す（ヌクレオチド配列および配位位置は引用文献１ ０からのものである）。

第５図は９組換え体発現プラスミドｐＴ７／λ９を含有するイー・コリ株が産生 ずるタンパクの電気泳動分析結果を示す。

９０ｋｄ付近の主要なバンドが組換え体Ｒ１’−Ｘに相当する。

第６図は、ベクターｐＴ？／λ９のコード部分のヌクレオチド配列と、その対応 するアミノ酸配列を示す。矢印は、　ＲＦ−Ｘアミノ酸配列の第１アミノ酸を示 す。

第７図は、　ＲＰ−ＸのＤＮＡ結合ドメインの位置を決定するのに用いられる。

　ＲＰ−Ｘ挿入断片の様々な３゛側欠失体および５゛側欠失体を示す地図である 。ＤＮＡ結合が可能なＲＦ−Ｘの１２２個のアミノ酸セグメントを箱印で囲んで ある。

第８図は、　ＩＦＮ−ｒで誘発された。アンチセンスＲ１−ＸによるＨＬＡ−Ｏ Ｒ発現の低減化調節を示す。ＲＰ−Ｘアンチセンスプラスミド（上図）とともに 、またはこのプラスミドなしく下図）で得た１４３Ｂの安定なトランスフエクタ ントクローン（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ　ｃｌｏｎｅ）の螢光活性化細胞ソー ター（ＦＡＣＳ）による分析結果である。トランスフェクションおよび６４１８ 耐性の選択に続いて、細胞はＩＮＦ−ｒとともに４８時間培養した。次いで細胞 をＬ２４３．すなわち特異的モノクローナル抗ＤＲ抗体で染色し。

微量螢光定量法によって細胞表面における肛Ａ−ＯＲ発現について分析した。対 照の細胞（下図）は正常の量のＩＩＬＡ−ＯＲ分子を発現しているが、　ＲＦ− ＸアンチセンストランスフェクタントはＨＬＡ−ＯＲ発現が阻害されている。

第９図は、ヒトＲＦ−ｘタンパクの全アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示 す。そのコード領域は９４位から始まり３０３０位まで延びている。したがって 、　ＲＰ−Ｘタンパクは、９７９個のアミノ酸の位置を有している。ＤＮＡ結合 ドメインは約４０６〜５２７のアミノ酸位置で示され、他方、活性ドメインは約 １〜４０５のアミノ酸位置で示される。アミノ酸は一文字のコードで示しである 。

第１０図は、第９図のＤＮＡ配列でコードされる全ＲＦ−Ｘタンパクのアミノ酸 配列を示す。さらに９分子量およびアミノ酸組成を示す。

実施例はこの発明を例示するものである。実施例に記載されている実験を繰り返 すために適用できる分子生物学の方法の概要は、　ＭａｎｉａｔｉｓらＭｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２年） と同第２版（１９８９年）に記載されている。

実施例１：因子ＲＰ−Ｘは、オリゴヌクレオチドｘ１とｘ３とに結合することが できる。

ＤＲＡ遺伝子のプロモーターはいくつかの保存配列モチーフをもっている。すな わち、−２４〜−２８位置のＴＡＴＡボックス。

−４５〜−５２位置のオクタマーモチーフ、および−９５〜−１０８と−６３〜 −７４の位置それぞれにおけるクラス■のＸとＹのボックスと呼ばれる２つの配 列要素である（第４図参照）。５つの異なる核因子がＤＲ八へロモーターに結合 していることがわかる。これらの因子には、Ｘボックスに結合する因子（ＲＦ− Ｘ）　、　Ｙボックスに結合する因子（ＲＰ−Ｙ）、オクタマー配列に結合する 因子（ＯＢＰ）、およびＸとＹのボックスの間のスペーサー領域（ＮＦ−Ｓ）と Ｘボックスの５′側に位置するーボックス（第４図）とに弱く結合する２つの因 子である。

ＲＦ−Ｘはクラス■遺伝子の転写を調節するのに特に重要である。というのは、 　ＲＦ−Ｘは遺伝性複合型免疫欠損症（ＣＩＤ）には存在しないか欠陥があるか らである（２）。この疾患は、クラス■遺伝子の発現を制御するトランス作用性 調節因子の欠陥を研究に通常用いられる短いオリゴヌクレオチドには結合できな いが、　ＤＲＡプロモーターの−７０〜−１４４（ＸＩオリゴ）または−７０〜 −１２４（Ｘ３オリゴ）の配列を含有するオリゴヌクレオチドに結合することを 示すことができる。これらのオリゴヌクレオチドの構造は第４図に示す。

ＲＦ−Ｘの上記の結合を例証するために、以下の条件を使用した。すなわち、結 合に用いたＤＮＡオリゴヌクレオチドのプローブは、＜　７　”）ＡＴＰと１４ ポリヌクレオチドキナーゼで標識をつけた。末端に標識を付けたＤＮＡ０．２〜 ０．５ｎｇとタンパク抽出物１０μｇ　（文献２３に記載されているのと同様に して作製）との結合を、１２％グリセリン、　１２ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７ ，９）、　６０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　 ０．３ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、　０．３ｍＭジチオトレイト ール、５０μｇ／ｍ１．のポリ　（ｄｌｄｃ）　−ポリ　（ｄｌｄＣ）　（１’ ｈａｒｍａｃｉａ社）　、　２５μｇ／ｄの音波で変性したイー・コリＤＮＡか らなる２０　１１中で３０分間Ｏ℃で行った。結合に続いて、因子−ＤＮＡ　ｆ ｆ１合体を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を（２）に記載しであると おりに行って、未結合のＤＮＡから分割した。

１１ＬＡ−ＯＱ＾と肛Ａ−叶ＡのＸボックスオリゴヌクレオチドは。

長さとＸボックスの位置についてはｘ３と同じであるが、　ＩＩＬＡ−Ｄ（ＩＡ とＨＬＡ−ＤＰＡプローブそれぞれの配列−１１９〜−１７３と−１４３〜−１ ９７をカバーしている。

実施例２：ヒ）　ＲＦ−Ｘをコードするｃ［ｌＮＡを含有するλ９のクローン化 と、そのｃｌｌＮＡ挿入断片のサブクローン化。

（以下余白） 配列特異的ＤＮＡ結合タンパクをコードするｃＤＮＡクローンを直接クローン化 させる方法が最近開発された〔（３）と（４）参照〕。

この方法では１問題のタンパクに対する結合部位を有する３３Ｐで標識をつけた 二重鎖ＤＮＡプローブで、λｇｔｌｌ　ｃＤＮ八発へライブラリーのスクリーニ ングが行われる。この方法は、λｇｔ１１に挿入された。所定のＤＮＡ結合タン パクをコードするｃＤＮ八が、そのタンパクもしくはその一部を発現するバクテ リオファージに相当し、かつかようなりローンが放射性プローブとして用いられ る標的ＤＮＡ配列によって同定できる。という事実に基づいている。多数のバク テリオファージのクローンからのタンパクは、濾過膜に移され、その濾過膜は、 放射性の特異的ＩＩＮＡ断片でプローブされるが、この実施例では、　ＤＲＡの Ｘボックス（すなわち第１図に示すオリゴヌクレオチドＸ１）を含有するＤＮＡ 断片を使用する。オリジナルの方法（３）の感度は９次の２つの改変によって著 しく改善された。すなわち結合の安定性を増大するためのプローブのカテネーシ ョンと。

フィルターを塩酸グアニジンで処理するスクリーニング前の変性／復元工程（４ ）である。Ｂ細胞の核抽出物を塩酸グアニジンで処理すると、　ＲＰ−Ｘがこの 変性／復元サイクルに対して耐性であることを示した。それ故に発明者はこれら の改変を採用することを選んだ。

全ＲＮＡは凍結細胞ペレットから抽出したがこのベレットは。

（５）に記載しであるのと全く同様にしてグアニジウムイソチオシアナートを用 いて培地中で増殖させたヒ）　Ｂ　ＩＪンパ球細胞系［Ｍａｎｎ、（２）参照］ から製造され、ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマ トグラフィーで精製した。二本鎖ｃＤＮＡは、標準の方法（６）で合成し、　Ｂ ＣＯ旧リンカ−を用いてｋｇｔｌｌ中でクローン化した（７）。４Ｘ１０’のク ローンを有するｃＤＮＡライブラリーが得られた。ブレーティング、誘発、ニト ロセルロースフィルターへの転移、および３２Ｐで標識をつけたプローブによる スクリーニングを、（４）に記載しであるのと全く同じに行った。−次スクリー ニング中に用いたｘ１プローブを製造するために、ｘ１オリゴヌクレオチド（第 ４図参照）を、平均数１０で連結することによってカテナ化し、ニックトランス レーション法で標識をつけた。非特異的なρＢＲ３２２プローブを製造するため に、　ｐＢＲ３２２の７５ｂｐ　Ｈｉｎｆｌ断片をクレノーポリメラーゼで処理 して平滑末端を生成させ次にカテナ化してｘ１プローブの場合に記載したのと同 様に標識を付けた。ｘ３とＸｒのプローブ（第４図参照）は、それぞれのオリゴ ヌクレオチドを、（７３２Ｐ）　ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識 を付は次いで平均数１０の連結によるカテナ化を行うことによって調製した。

７５０、０００の組換え体を、カテナ化しニックトランスレーションを行ったｘ １オリゴヌクレオチドからなるプローブでスクリーニングした。第２ラウンドの スクリーニングを行うために選択した２０のファージの内、４個だけがｘ１プロ ーブに対し陽性で、　ｐＢＲ３２２のカテナ化してニックトランスレーションを 行った断片からなる非特異的プローブに対して陰性であった。

この種のスクリーニング法では、タンパクの、−重鎖ＤＮＡもしくはプローブの 末端への結合のような人為構造が生じがちである。さらに本願発明者らは、　Ｒ Ｆ−Ｘとは異なる少なくとも１つのタンパク（ＮＦ−３）が、　ＤＲＡのＸボッ クスのすぐ３°側の配列に弱く結合することを知っている。このような人為構造 を除くために、第３ラウンドのスクリーニングを次のような２つのプローブで行 った。すなわちＸボックスの中央に配置した特異的な５４ｂｐ長のオリゴヌクレ オチド（第４図のＸ３．　ＤＲＡプロモーターの−７０〜−１２４位）と、ラン ダムの１６ｂｐの配列でＸボックスが取り替えられていることを除いて×３と同 一の非特異的オリゴヌクレオチドである。Ｘｒオリゴスクレオチ）’　Ｃｉ、　 Ｘ　ホックス（ＣＣＣＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧ）がランダム配列（ＡＴＧＴ ＧＴＣＴＣＧＡＡＣＧＣＡ）で取り替えられていることを除いて×３と同じであ る。４つの組換え体ファージの中の１つのλ９は、　Ｘ３に対して強い陽性であ ったが、　Ｘｒに対しては全く陰性であった。

それ故にクローンλ９は、Ｘボックスに特異的に結合するタンパクをコードして いる。興味深いことであるが、スクリーニング処理中に用いた塩酸グアニジンに よる変性／復元工程は、λ９の同定には必須であることが分かった。というのは 。

この工程を省くと、クローンが特異的なｘ３プローブでもはや検出できなかった からである。

クローンλ９の３．７ｋｂの挿入断片は、　Ｅｃｏ　Ｒｒによる消化によって切 除され、プラスミドベクターｐＵｃ１８にサブクローン化された。この組換え体 プラスミドｐｔｌ（：　／λ９と命名した。

この組換え体プラスミドｐｕｃ　／λ９は、西独、　１３ｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ ｇのＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｒｎｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉ ｓｍｅｎ　（ＤＳＭ）に寄託番号ＤＳＭ　５３０３で寄託した。

実施例３：λ９がコードする組換え体タンパクの特性決定。

λｇｔｌｌとλ９の溶原菌の単離と誘発（４）と細菌抽出物の調製（３）を文献 に記載されているのと同様にして行った。λｇａｌｌとλ９の溶原菌を単離し誘 発してそれぞれのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現した。タンパク抽出物を両 溶原菌および未感染の宿主細菌から調製した。次に、その抽出物を、ゲル遅延検 定法（２）によってＸボックス結合活性について分析した。

λ９の抽出物については、オリゴヌクレオチドｘ１とで、１つの大きなタンパク −ＤＮＡ複合体が形成させる。この現象は。

λｇｔｌｌ溶原菌もしくは宿主細菌菌株由来の抽出物については観察されないの で、λ９抽出物に対して特異的なことである。

また９でコードされるタンパクは、より小さい×３オリゴヌクレオチドと結合す るが対照のＸｒプローブ吉は結合せず、λ９が真のＸボックス結合タンパクをコ ードすることを確証している。

組換え体タンパクの結合部位と接触点をさらにメチル化干渉分析法で分析した。

Ｘ１オリゴヌクレメチドをｐｔｌｃ１２のＳｍａ　１部位にサブクローン化し、 　ＥｃｏＲｌと旧ｎｄＩＩ［とで切断し、コード順に対しては（α”Ｐ）　ＡＴ ＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、または非コード鎖に対しては（α ”Ｐ）ｄＡＴＰとクレノーポリメラーゼを用いて、　ＥｃｏＲ１部位に標識を付 けた。プローブのメチル化、クローンλ９由来のタンパク抽出物との結合、遊離 の結合ＤＮＡの精製、ならびに配列のゲル電気泳動を（２）に記載されているよ うにして行った。ｘ１オリゴをコード鎖もしくは非コード如上で末端に、特に硫 酸ジメチルでメチル化した標識を付けて、λ９溶原閑の抽出物とともに培養した 。遊離の複合断片をゲルで精製した後、　ＤＮＡを、メチル化したＧ残基で切断 して、配列決定ゲル電気泳動法で分析した。

遊離の結合ＤＮＡで得た切断プロフィルを比較した結果、未変性のＲＦ−Ｘで観 察したのと全く同じメチル化干渉パターン（２）が現れる。メチル化によって結 合が促進されるＧ残基を含む５個の接触点がすべて、　ＲＦ−Ｘと組換えタンパ クとの両方によって共有されている。

実施例４：クローンλ９は単一コピー遺伝子に相当する。

ヒＩ−Ｂ細胞系由来のゲノムＤＮＡを、標準手順にしたが、ってサザンプロット 法で分析した。２つの通常のＢ細胞系がら抽出したＤＮＡを３種の制限酵素で消 化し、ゲル電気泳動法で分画し、フィルターに転移させ２次いでクローンλ９の ３．７ｋｂの挿入断片全体、またはその３゛側末端由来の６００１１　ｐのＳａ ｍｌ−ＥｃｏＲＩ断片からなる３叩標識プローブでハイブリダイズさせた。

２つのＤＮＡで得たハイブリダイゼーションパターンは同一であり、全ｃＤＮＡ 挿入断片をプローブとして用いた時に目立つたバンドをほとんど示さない。各酵 素に対して、　６００ｂｐのサブ断片がゲノム断片の１つとだけハイブリダイズ する。最後に２つのゲノム１ｌｉｎｄＩＩＩ断片だけが検出されるのでそのＲＦ −ＸｃＤＮＡは１ＩｉｎｄＩＩＩ部位を含有している。これらの結果は９発明者 らが単離したｃＤＮＡが単一コピー遺伝子に相当することを示している。

ＲＰ−Ｘ遺伝子は、マウスＤＮＡに高レベルで保持されており。

マウスＲＦ−Ｘ同族体の制限パターンは、最近報告された他の遺伝子（８）のそ れとは明らかに異なり、　ＤＮＡ結合タンパクをコードすると考えられる。それ 故にＲＦ−Ｘはこれらの他のタンパクとは異なる。

実施例５　：　ＲＦ−Ｘ　ｍＲＮＡはまれであり９通常、調節突然変異体に発現 される。

発明者らは、これらの突然変異体中のＲＦ−Ｘ　ｍＲＮＡの存在をノーインプロ ット法とＲＮアーゼ保護法で研究した。ノーザンブロットハイプリダイゼーショ ン法によってポリ　（Ａ）＋ＲＮＡの分析を（３）報告されているとおりに行っ た。フィルターハイブリダイゼーション法に用いたプローブは、ランダムプライ ム化合成法によって（α”Ｐ）ｄ［：ＴＰで標識をつけた。通常の２つのＣＩＤ 　Ｂ細胞由来のポＩＪ　（Ａ）”　ＲＮＡを、ゲル電気泳動法で分画し、ニトロ セルロースフィルターに転移させ、λ９の３゜７ｋｂ挿入断片とハイブリダイズ させた。４．１ｋｂ　ｍＲＮＡが通常の細胞と突然変異体の細胞の両者に検出さ れる。

ＲＦ−Ｘ　ｍＲＮＡの存在を、　ＲＮアーゼ保護実験によってさらに分析した。

λ９のｃＤＮＡ挿入段をブルースクリプトベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中 にサブクローン化した。そのプラスミドをＦｎｕ４１１１で消化し、　（α”Ｐ ）　ＵＴＰの存在下、　Ｔ３　ＲＮＡポリメラーゼで転写した。これは、λ９に 対応するｍＲＮＡの３′側末端に位置する７１個のヌクレオチドに相同の１３９ 個のヌクレオチドのプローブを生成する。そのプローブとポ！Ｊ　（Ａ）”　Ｒ ＮＡとのハイブリダイゼーション、　ＲＮアーゼＡとＴ１による消化および変性 ゲル電気泳動法を（９）に記載しであるとおりにして行った。要した暴露時間は 、　ＲＦ−Ｘ　ｍＲＮＡが非常に低い定常常態のレベルで存在することを示して いる。そのプローブは９通常のＣＩＯＢ細胞由来のＲＮＡによって同程度に保護 されている。したがってＲＦ−Ｘ　ｍＲＮＡは、大きさと４突然変異体の細胞中 の存在率がともに通常のものである。

実施例６　：　ＲＦ−Ｘ４−！、　ＩＩＬＡ−ＤＲＡ　、　ＨＬＡ−ＤＱＡ　＃ 、！ＦＨＬＡ−ＤＦ’Ａ　（７）フロモーター配列に対して異なる結合親和性を もっている。

未変性のＲＦ−Ｘは９分析されたクラス■遺伝子全部のＸボックスに結合するこ とができる。これらには、ヒトＤＲＡ　、　ＤＲＢＩ。

ＤＲＢ３．　ＤＰＡおよびＤＱＡの遺伝子ならびにマウスのＨａとＥｂの遺伝子 が含まれる。異なるＨＬＡクラス■遺伝子のＸボックスモｆ　−７ｉ、１：　対 ｔ　７）　ＲＰ−Ｘノ結合性を比較シタ。ＨＬＡ−ＤＲＡ　、　ＩＩＬＡ−［］ ＱＡおよび肛Ａ−ＤＰＡに特異的で、長さが第４図の×３に類似（５４塩基対） で、かつすべてＭＩＩＣクラス■のＸボックスの中央に位置するオリゴヌクレオ チドを用いれば、天然のＲＰ−Ｘ　（核抽出物由来）が、　ＤＲＡとは強く結合 し、　ＰＡとは結合が弱く、そしてＤＱＡとの結合が非常に弱いということが分 かる。それ故ニＲ１−Ｘハ、　ＨＬＡ−ＩＩＲＡ、）ｉＬＡ−ＤＰＡおよびＩＩ Ｌ八−ＤＱＡ　（Ｄ遺伝子（７）Ｘボックスに対して全く異なる親和性を有する 。それ故、その組換え体タンパクのこれら３つの遺伝子のＸボックスに対する相 対的な結合親和性を競合実験法で分析した。Ｒ９の抽出物をＢ細胞の核抽出物を 、標識をつけていないＤＲＡ　、　ＤＱＡもしくは叶への競合体オリゴヌクレオ チドの異なる量の存在下。

３２ｐで標識を付けたｘ１オリゴヌクレオチドとともに培養し競合の程度をゲル 電気泳動法によって分析した。ＲＦ−Ｘと、Ｒ９によってコードされるタンパク とは、３つのＸボックスに対して同じ相対的結合親和性をもっている。両方の場 合、結合は、競合者が低モル過剰の時でさえもＤＲＡによって有効に競合され、 競合者が非常に高モル過剰の時でさえＤＱＡによる競合は非常に劣り、　ＤＰＡ による競合は中間の効率である。Ｘ「との競合は、　ＲＦ−Ｘもしくは組換え体 タンパクの競合に対して全く影響がない。このことは、クローンλ９がＲＦ−Ｘ をコードするということの追加の証拠である。これらの異なる親和性を実証する のに用いられるＤＮＡ結合検定法は実施例１に記載の検定法である。

実施例７：ｃＤＮＡクローンλ９の３．７ｋｂ挿入断片のＤＮＡ配列の決定と、 そのコード領域の同定。

クローンλ９の挿入断片をＥｃｏＲＩで消化することによって回収して、閘１３ バクテリオファージ中にサブクローン化した。

そのコード領域の完全ＩＩＮＡ配列を、ジデオキシ配列決定法とマキシム−ギル バート法（第３図参照）で決定した。その配列中に含まれている最長の読み取り 枠は、８２８のアミノ酸をコードし、１つの終止コドンで終わっている。３．７ ｋｂの挿入断片は、８２８のアミノ酸をコードする２５４０のヌクレオチドと。

これに続く、３”側の未翻訳領域の約１２６０のヌクレオチドで構成されている 。この３．７ｋｂの挿入断片は、開始コドンＡ［ＪＧと５°側の未翻訳領域をも っていない。

実施例８：Ｒ９挿入断片の発現と、イー・コリ中での組換え体タンパクの産生。

３．７ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入断片を、イー−１］り発現ベクターｐＴ７／７中の 位相でサブクローン化した。この発現ベクターは、プラスミドｐＢＲ３２２から 誘導され、　Ｑｌ）に記載のＴ７フアージプロモーターと、これに続＜　ＡＵＧ コドンと、いくつかの制限部位を有する短いＤＮＡ配列とをもっている。挿入断 片とベクター配列との両方の配列と読み取り枠が分かっているので、正しい読み 取り枠にサブクローン化することができた。得られた組換え体発現ベクターをｐ Ｔ７／λ９と命名した。完全コード領域のＤＮＡ配列を第６図に示す。組換え体 発現プラスミドｐＴ７／λ９を有する組換え体細菌を培養した後、細菌のベレッ トを６Ｍ塩酸グアニジンで抽出し、塩酸グアニジンでザイジングカラム（Ｓｅｐ ｈａｃｙ　１）によって分画し、そしてその一部をＰＡＧＥゲルで分析した。

第５図−１これらのゲルのタンパクの染色結果を示す。発現されたタンパクは、 Ｒ９挿入断片の８２８のアミノ酸読み取り枠から予想される大きさに一致してい る。

すでに述べたように、第６図は、ベクターｐＴ７／λ９のコード部分のＤＮＡ配 列と１発現された組換え体ＲＩ”Ｘタン／Ｘ＋’りのアミノ酸配列とを示す。最 初の６個のアミノ酸はｐＴ７／７ベクター由来のもので、アミノ酸７は使用した 「位相内（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）　」連結由来のものであり（Ｓｒｎａ　Ｉと平滑 末端ＥｃｏＲＩ）、そしてアミノ酸８はＲＰ−Ｘ配列の開始部分である。

実施例９：端を切り取った形態のＲＦ−Ｘ組立体タン）＜りの発現。

この実施例の目的はＲＰ−ＸのＤＮＡ結合ドメインの位置を同定することと、小 型のＲＦ−Ｘタンパクの、その標的配列すなわち１＋ＬＡ−ＤＲＡのＸボックス をとらえる性能を試験することにある。

ベクターｐＴ７／λ９のＲ９挿入断片が、生体外で、　ＲＮＡ中にＴ７ポリメラ ーゼで転写され７次いでキャッピングを行い、標準試薬を用いて、　ＲＮＡ転写 体を、網状赤血球溶解物系中に翻訳する。生体外で作ったタンパクを、実施例１ に記載した条件下で、Ｘ３オリゴに対するその特異的な結合性について試験した 。端を切り取った形態のＲ１−Ｘを生成させるために、まず第１に、クローンλ ９の３．７ｋｂ挿入断片を各種の制限酵素で切断して、挿入断片の３′側末端の 各種の部分を除去する。

次に、得られた断片を、前記のようにしてｐＴ７−７ベクター中の位相内にサブ クローン化する。ＲＮＡを生体外で合成し、生体外で作製されたＲＮＡから合成 された異なるタンパクは、　ＲＦ−ＸのＣ００Ｈ末端を順次欠失していることに 相当する。これらの端を切り取った形態のＲＦ−Ｘを作製して、　ＨＬＡ−ＤＲ ＡプロモーターのＸボックスとの結合性について試験すると、　ＲＰ−ＸのＮＨ 。

の１／２が依然としてＤＮＡと結合することが観察される。さらに、　ＲＦ−Ｘ のコード領域の５°側部分のみならず３°側部分（第７図参照）が欠失すると、 １２２のアミノ酸長のセグメント　（第１図と第６図において下線をほどこした ）が現れるが、これはＤＮＡ結合に関与し、それ自体、正しいＩＩＬＡプロモー ターのＸボックス［］ＮＡ標的オリゴヌクレオチドに依然として結合することが できる。

このことは、タンパクＲＦ−Ｘの非常に短いセグメントを製造することができ、 しかもこのセグメントは依然として１化Ａクラス■プロモーターに結合できるこ とを実証している。かような小型のＲＦ−Ｘは、　ＤＮＡと結合できるがクラス ■遺伝子の活性化には不活性なので優性のレプレッサー分子として挙動し。

）ＩＬＡクラス■遺伝子の発現を阻害するはずである。上記のことから、かよう な分子は、　ＩＩＬＡクラスＨの遺伝子発現の阻害剤として作用すると考えられ る。

実施例１０：組換え体ＲＦ−Ｘは、　ＲＦ−Ｘ結合性の阻害剤をスクリーニング するのに使うことができる。

ＲＦ−Ｘがその標的ＤＮＡ配列に結合するのを阻害する化合物を同定することは 望ましいことである。このような分子は、　ＨＬＡクラス■遺伝子発現の阻害剤 として挙動するであろう。本願で示す一方法は、　ＤＮＡ結合の基質として組換 え体ＲＰ−Ｘを用いるＤＮＡ結合検定法（実施例１参照）を利用することである 。

その方法によってかような化合物を同定する例として、各種のオリゴヌクレオチ ド製剤を、それらのＲＦ−Ｘ結合を阻害する性能について試験をする場合、　Ｘ ＩもしくはＸ３　（前記事項参照）のようなオリゴヌクレオチドが有効な阻害剤 である。それ故に９組換え体ＲＦ−Ｘを利用する同じ検定法は、当業者がＲＦ− Ｘ結合の阻害剤として他の物質を組織的に試験しスクリーニングするのに適用で きる。

実施例１１：アンチセンスＲＮＡによる。　ＲＦ−Ｘ合成の阻害。

ＨＬＡクラスＵＫｓ伝子の発現を調節する一方法はＲＦ−Ｘタンパクの生合成を 阻害することである。この実施例では、　ＲＦ−Ｘが。

さきに実施例９で述べたようにして、生体外で合成されたＲＦ−Ｘ　ＲＮＡを鋳 型として用いて、生体外でウサギの網状赤血球溶解物系中で合成される。その上 に、アンチセンス形のＲＦ−ＸＲＮＡが、　ＲＦ−Ｘ挿入断片が逆の方向にサブ クローン化されたｐＴ７プラスミドから、　Ｔ７ポリメラーゼを使って生体外で 製造される。そのＲＦ−ＸアンチセンスＲＮＡを、　Ｒ１−Ｘ　ＲＮＡの鋳型と ともに細胞の遊離系に添加すると、　ＲＩ”Ｘタンパクの合成が阻害される。こ の現象は、　ＲＦ−ＸアンチセンスＲＮＡがＲＦ−Ｘタンパクの合成を有効に阻 害することができることを示し、かつアンチセンスＩＩＮＡが類似の効果をもっ ているだろうということを示唆している。それ故に、アンチセンスＲＰ−ＸのＲ ＮＡもしくはＤＮＡは、無傷の細胞に適用される場合、内因性ＲＦ−Ｘタンパク の合成を阻害し、結局、　ＭＩＩＣクラス■遺伝子の発現を低下させる調節を行 うことになるにちがいない。

実施例１２：無傷の細胞中での、　ＲＦ−ＸアンチセンスによるＩＩＬＡクラス ■遺伝子の発現の阻害。

プラスミドを、プロモーターの制御下で挿入されたし但し逆方向に（３”側から ５′側へ）　］　ＲＰ−Ｘ　ｃＤＮＡの各種セグメントで構築した。これは、一 般に入手できるベクターを使って。

切断と連結の標準法で達成できた。ヒト繊維芽細胞系（１４，３Ｂ）を、　ＲＰ −Ｘアンチセンスプラスミドを用いるかもしくは用いずに、薬剤６４１８に対す る耐性をコードするプラスミド（「ネオマイシン耐性」遺伝子）でトランスフェ クトした。６４１８耐性で安定なトンスフェクタントを、インターフェロンγに よる刺激に応答してＨＬＡクラス■遺伝子を発現する性能について。

選択し分析した。

上記の細胞を、　ＨＬＡ−ＯＲの特異的モノクローナル抗体で分析して得た蛍光 プロフィルを図に示す。対照のトランスフエクタント　（ネオマイシン耐性のみ を有する）は、予想どおりによく応答してＩＩＬＡ−ＤＲを発現する。ＲＦ−Ｘ アンチセンスプラスミドを含有するトランスフエクタントは、そのＩＩＬＡクラ ス■応答が強く阻害される。この阻害性は、　ＩＩＬＡ−ＯＲｍＲＮＡのレベル で、ハイブリダイゼーション実験によって確認された。発明者らは、無傷細胞内 のＩＩＬＡクラス■の遺伝子と分子の発現を阻害できる薬剤としてのＲＦ−Ｘア ンチセンスの用途を証明したと結論することができる。

実施例１３　：　ＲＦ−Ｘ　ｃＤＮＡの５′側部分の配列の決定。

ＲＦ−Ｘ　ｃＤＮＡクローンｐＵ［：／λ９はその５゛側末端が不完全であった ので、Ｂ細胞ｍＲＮＡの上記製剤を、　ＲＦ−Ｘ　ｃＤＮＡの残っている５゛側 の部分を得るために再度用いた。ＲＦ−Ｘ　ＣＤＮＡの５”側部分を、不完全な ｐＵｃ／λ９　ＲＦ−Ｘ　ｃＤＮＡの配列の５゛側領域由来のオリゴヌクレオチ ドをプライマーとして用い、８細胞ｍＲ）ＪＡから、逆転写酵素で合成した。そ のオリゴヌクレオチドは、第３図に示すｐＵｃ／λ９　ｃＤＮＡの配列の３０１ 〜３２１の位置に相補的である。そのｃＤＮＡを合成し、λｇｔｌｌファージの アームに連結し、パッケージし、そして正確に実施例２に記載しであるとおりに して標準の培養プレート上に流延した。ニトロセルロースメンプランへの転移、 予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを標準法で行った（ 前記のＭａｎｉａｔｌｓらの文献参照）。第３図における１〜１４１の位置に相 当する［ＥｃｏＲｒ−Ｋｐｎｌ断片に、ランダムプライミングで３２ｐによって 標品をつけたものを、プローブとして用いた。このようにして、その３°部分に 不完全なＲＦ−Ｘ　ｐＵＣ／λ９　ＣＤＮＡにＤ５’　ｇＩｓ分カ重複し、かつ それ故、完全ＲＦ−Ｘ　ｃＤＮＡの失われている５°部分に相当する。　ＤＮＡ 配列を承るクローン（ＲＦ−Ｘ５°と呼ぶ）を得た。両方の重複クローン由来の 全ＲＦ−Ｘ　ｃＤＮＡの配列を第９図に示す。３′側の未翻訳領域を含むＲＦ− Ｘ　ｃＤＮＡの３′側末端が。

３０８６の位置に明確に測定された。

全長のＲＦ−Ｘ　ｃＤＮＡを再構成するために、標準の連結を行った。すなわち 、　ＲＦ−Ｘ５’とｐＵｃ／λ９　ｃＤＮＡのクローン中に存在するユニークな Ｋｐｎ１部位を用いて、クローンｐＵ［：／λ９の配列の１４１の位置に配置し た。Ｒ、Ｆ　−Ｘ　５°由来のＥｃｏＲｌ　−Ｋｐｎ　Ｉ断片をクローンｐ［］ ｃ／λ９由来のＫｐｎ　Ｉ−旧ｎｄＩＩＩ断片に連結し、得られた全長のＲＦ− Ｘ　ｃＤＮＡを次に標準のプラスミドベクターのブルースクリプトＫＳにサブク ローン化してプラスミドｐＲＦ−ＸＣを得た。

このＲＦ−Ｘ全長プラスミド（ｐＲＦ−ＸＣ）をもっているイー・コリ菌株は、 西独、　ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖ ｏｎ　Ｍｉｋｒｏ。

ｒｇａｎ　ｉｓｍｅｎに１９９０年４月１７日付で寄託番号ＤＳＭ　５８７６号 で寄託された。

実施例１４　：　ＲＦ−Ｘ結合とＭＨＣクラス■発現の阻害剤を同定するスクリ ーニング検定法への１組換え体ＲＰ−Ｘタンパクの用途。

組換え体ＲＦ−Ｘ、またはそのＤＮＡ結合ドメインを有する端を切り取った形態 の組換え体ＲＦ−Ｘを用いて、標準の結合検定法を、潜在している阻害分子を得 るための試験法として構築することができる。その結合検定法は、「ゲル遅延検 定法」すなわち「バンドシフト」検定法）、または抗ＲＦＸ抗体によるＲＦ−Ｘ ／ＤＮＡ複合体の免疫沈澱法である。したがって、　ＲＦ−Ｘの結合性を阻害す る性能と結局Ｍｌ（Ｃクラス■遺伝子の発現を阻害する性能について、多数の異 なる分子をスクリーニングすることができる。

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Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現する脊椎動物の細胞中に天然に存在し、脊椎 動物のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現を調節し、該ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発 現を制御するＤＮＡ配列に結合する、精製タンパク。
2. ２．哺乳類、好ましくはヒト中に天然に存在する、請求項１に記載のタンパク。
3. ３．ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現するヒト細胞中に天然に存在するＲＦ−Ｘタ ンパクの生物学的活性を有する、請求項１もしくは２に記載のタンパク。
4. ４．ヒトＲＦ−Ｘタンパクである、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク。
5. ５．端を切り取った形態のヒトＲＦ−Ｘタンパクである、請求項３に記載のタン パク。
6. ６．下記のアミノ酸配列を有する、請求項３もしくは５に記載のタンパク： 【配列があります】 または： 【配列があります】 （ここで，９７９個の位置を有するアミノ酸配列は全ヒトＲＦ−Ｘタンパクを示 す）。
7. ７．天然に存在するタンパクのＤＮＡ結合特性を実質的に持っているが、ＭＨＣ クラスＩＩ遺伝子の発現を活性化できない、請求項１〜６のいずれかに記載のタ ンパク。
8. ８．組換え体タンパクである、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク。
9. ９．請求項１〜８のいずれかに記載のタンパクをコードするＤＮＡ配列。
10. １０．下記のヌクレオチド位置を含む不完全形ヒトＲＦ−Ｘタンパクをコードす る、請求項９に記載のＤＮＡ配列：【配列があります】 【配列があります】
11. １１．下記のヌクレオチド位置を含む全ヒトＲＦ−Ｘタンパクをコードする、請 求項９に記載のＤＮＡ配列：【配列があります】（ここで、該全ヒトＲＦ−Ｘタ ンパクのコード領域は９４の位置から始まり３０３０の位置で終わる）。
12. １２．請求項３〜８のいずれかに記載のタンパクをコードし、かつ従来の条件下 で請求項１０または１１に記載のＤＮＡ配列とハイブリダイズする、ＤＮＡ配列 。
13. １３．請求項９〜１２のいずれかに記載のＤＮＡ配列のコード鎖に相補的である 、ヌクレオチド配列。
14. １４．請求項１２に記載のヌクレオチド配列の断片。
15. １５．請求項１１のＤＮＡ配列のコード領域であるか、あるいはそのＤＮＡ配列 に由来する、請求項１４に記載の断片。
16. １６．請求項９〜１５のいずれかに記載のＤＮＡ配列もしくはヌクレオチド配列 を有する、組換え体ＤＮＡ分子。
17. １７．ＰＵＣ／λ９（ＤＭＳ５３０３号）またはｐＲＦ−ＸＣ（ＤＳＭ５８７６ 号）である、請求項１６に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
18. １８．発現ベクターｐＴ７／λ９である、請求項１６に記載の組換え体ＤＮＡ分 子。
19. １９．請求項１６〜１８のいずれかに記載の組換え体ＤＮＡ分子で形質転換され ている宿主微生物。
20. ２０．請求項１〜８のいずれかに記載のタンパクを製造する方法であって、請求 項１９に記載の形質転換宿主微生物を、培地中で適切な条件下で培養する工程と 、生成した発明産生物を培養物から回収する工程とを包含する製造方法。
21. ２１．請求項１〜８のいずれかに記載のタンパクを含有する、薬剤組成物。
22. ２２．請求項１３に記載のヌクレオチド配列を含有するか、あるいは請求項１４ もしくは１５に記載の上記ヌクレオチド配列の断片を含有する、薬剤組成物。
23. ２３．ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現レベルを増大させることが望ましい疾患を 治療するための、請求項１〜６のいずれかまたは請求項８に記載のタンパクを含 有する、薬剤組成物。
24. ２４．ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現レベルを減少させることが望ましい疾患を 治療するための、請求項７に記載のタンパクを含有するか、あるいは請求項８に 記載の対応する組換え体タンパクを含有する、薬剤組成物。
25. ２５．ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現レベルを減少させることが望ましい疾患を 治療するための、請求項１３に記載のヌクレオチド配列を含有あるか、あるいは 請求項１４もしくは１５に記載の上記ヌクレオチド配列の断片を含有する、薬剤 組成物。
26. ２６．ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現を阻害できる物質のスクリーニングおよび 同定を行うための、請求項１〜８のいずれかに記載のタンパクの使用。
27. ２７．免疫疾患を治療する方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載のタン パク、または請求項１３に記載のヌクレオチド配列、または請求項１４もしくは １５に記載の上記ヌクレオチド配列の断片、または請求項２６に従って同定され た、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現を阻害する物質の薬剤として活性な量を、こ れらを必要とする患者に投与することを包含する、治療方法。