JPH08502653A

JPH08502653A - 形質転換内皮細胞

Info

Publication number: JPH08502653A
Application number: JP6510706A
Authority: JP
Inventors: バッハ、フリッツ・エイチ; デ・マルティーン、ライナー
Original assignee: サンド・リミテッド
Priority date: 1992-11-02
Filing date: 1993-10-29
Publication date: 1996-03-26
Also published as: ES2146235T3; FI952088L; KR950704477A; FI952088A7; NO951628L; EP0669977B1; ATE192492T1; NO951628D0; FI952088A0; GR3033600T3; AU680636B2; GB9222931D0; NZ257539A; EP0669977A1; WO1994010305A1; RU2164415C2; DK0669977T3; PT669977E; AU5440494A; CA2143489A1

Abstract

(57)【要約】細胞のＮＦκＢ活性化が実質的に阻害されるようなＩκＢ活性を有するタンパク質を発現する内皮細胞が、ＩκＢが連続してタンパク質が内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外部刺激の反応の要求に応じて発現されるように細胞の遺伝物質を改造して、例えば異種ＩκＢコード化配列またはプロモーターを細胞内へ挿入することにより、調製し得る。このような内皮細胞を含む器官および組織は、有利に拒絶反応に感受性が低いため、移植、例えば異種移植に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】形質転換内皮細胞本発明は異種移植および特に、それらを含む組織が異種移植受容体による拒絶を余り受けないように改造されている内皮細胞に関する。更に具体的には、本発明は、転写因子ＮＦκＢの活性を抑制する因子、および内皮細胞の活性化を阻害および炎症進行を抑制するためのその使用を含む。一致しない種の間の移植の成功の重要な間題は器官の超急性拒絶である。超急性拒絶の発症に含まれる２つの主要要素：異種細胞に特異的な抗体の存在および続く固定並びに受容体の補体系の活性化がある。この問題の解決法は、受容体の補体制限因子を発現するトランスジェニック動物を記載したＷＯ９１／０５８５５に提案されている。この方法では、トランスジェニック動物由米の器官が受容体に移植された時、受容体の補体経路び活性化が制限因子により阻止される。しかしながら、供与体器官の細胞は、受容体の凝固の促進および供与体器官の内皮細胞の変化によりまた拒絶される。炎症の間、多くの異なった遺伝子の発現は内皮細胞内で上向調節（up-regulated）されており、インターロイキン、転写因子、接着分子および凝固系の成分のものを含む。多くのこれらの遺伝子の転写は、転写因子ＮＦκＢを含む。転写因子ＮＦκＢは細胞の細胞質に構成的に発現する。ＮＦκＢ様タンパク質による遺伝子転写の開始は、働いている転写因子の細胞質から核への転移を含む翻訳後修飾の結果であると提案されている。この転位はＩκＢと呼ばれる阻害タンパク質の修飾により制御されており、それはＮＦκＢと結合し、複合体を作り、それによりそれを細胞質内に保つ。適当な信号による細胞の刺激は、ＩκＢの修飾を導き、次にそのＮＦκＢからの分離をもたらす。ＩκＢタンパク質のＮＦκＢへの結合が、ＮＦκＢの核局限信号（ＮＬＳ）をマスクすると信じられている。細胞の、細胞型および細胞発達段階に依存する特異的薬剤による刺激を受けて、ＩκＢはＮＦκＢへの結合をできなるするような方法で修飾され、ＮＦκＢのＩκＢからの分離を導く。この修飾を導く信号は、酸素ラジカルの発生を含み、ＩκＢの特異的部位でのリン酸化を導くと信じられている。結果として、ＮＬＳのマスクが外され、ＮＦκＢは核に転移し、そこでＮＦκＢ部位に結合する。結局遺伝子の転写を導くことは、炎症進行に含まれる。転写因子ＮＦκＢは、元々成熟Ｂ細胞から単離され、そこでそれらはκ軽鎖促進剤中１０量体（decameric）配列モチーフに結合する。ＮＦκＢはその細胞系および細胞発達のその段階に特異的であると最初は信じられていたが、ＮＦκＢ様タンパク質が、上記のように多数の細胞型から単離されて以来、遺伝子転写の誘発に一般的に含まれることが示されている。幾つかの誘導遺伝子の機能的に活性なＮＦκＢ結合部位の同定により更に支持される（ビューエーレ、Ｐ．；１９９１；ＢＢＡ、１０７２、６３−８０頁。）。ＮＦκＢは５０kDサブユニット（ｐ５０）および６５kDサブユニット（ｐ６５）からなる異種２量体タンパク質である。ｐ５０およびｐ６５のｃＤＮＡはクローン化され、３００アミノ酸の領域にわたって相同性を示す。ｐ５０サブユニットは哺乳類および鳥類から単離されたｃ−ｒｅｌ原癌遺伝子生産物および背のショウジョウバエ（Drosophila）遺伝子生産物と著しい相同性を示す。最近更なるＮＦκＢ群の仲間、ｒｅｌＢが血清刺激線維芽細胞由来の即時初期反応遺伝子としてクローン化されている。ｐ５０およびｐ６５の両方は、別の特性を有するが、同種２量体を形成できる：ｐ５０同種２量体は強力なＤＮＡ結合親和性を有するが、トランス作用性転写はできず、一方ｐ６５同種２量体はＤＮＡに弱い結合しかできないが、トランス活性化できる。ｐ５０は、ＤＮＡ結合および２量体化活性を有しない１１０kD前駆体（ｐ１１０）のアミノ末端部分として合成される。カルボキシ末端部分は、細胞サイクル制御および分化に含まれる数個のタンパク質に発見されたモチーフ、８個のアンキリン繰り返しを含む。４kb ｐ５０前駆体ＲＮＡと平衡して誘発される短い（２．６kb）ＲＮＡ種のクローニングは、別の結合または特異的プロモーター使用のいずれでも、１１０kDタンパク質のＣ−末端部分はまた独立して発現できることを明らかにする。３種のＩκＢα様タンパク質がクローン化されている：形質転換鶏リンパ球中のｒｅｌ−関連リンタンパク質として同定されたｐｐ４０（デービスら、Scienc e ２５３（１９９１）、１２６８−１２７１）；再生肝阻害因子１であるＲＬ／ＩＦ−１（テワールら、Mol．Cell．Biol．１２（６）（１９９２）、２８９８ −２９０８）およびプラスチック表面への接着で、ヒトマクロファージにおいて誘発される遺伝子の産物であるＭＡＤ−３（ハスキルら、Cell ６５（１９９１）、１２８１−１２８９）。これら３種のＩκＢα様タンパク質は全て５個のアンキリン繰り返しを含む。ＲＬ／ＩＦ−１はクローン化され、肝切除後３０分以内に再生肝内に発現することが示されている。欠損変異誘発研究は、ｐｐ４０の５個のアンキリン繰り返しのうち４個が、ＤＮＡ結合活性の阻害およびｃ−ｒｅｌとの結合に必須であり、またＣ−末端領域も必要であることを明らかにしている。１１０kD ｐ５０前駆体で処理したモノ特異的抗体での研究は、Ｃ−末端都分（ＩκＢ活性部位）は、ｐ５０のアミノ末端領域に位置する核局限信号（ＮＬＳ）をマスクすることを証明している。驚くべきことに、我々は、ＩκＢ発現が内皮細胞（ＥＣ）内で、ＥＣ活性化と同じ刺激で、ＮＦκＢの急速翻訳後活性と比較して動態は遅いが、誘発されることを発見した。ＩκＢの発現は、したがってＥＣ活性化を阻害する自然に発生するフィードバック機構の存在を示すように思える。我々は、この発見を用い、移植拒絶の予防の更なる方法の開発をしている。従って、最初の態様において、本発明は細胞のＮＦκＢ活性化が実質的に完全に阻害されるようなＩκＢ活性を有するタンパク質を発現する内皮細胞を提供する。本明細書の目的のために、“ＩκＢ活性を有するタンパク質”は、ＮＦκＢに結合でき、ＮＦκＢの核への移動を予防しおよび／または細胞の遺伝物質のＮＦ κＢ結合部位に結合し、それにより遺伝子転写のＮＦκＢ媒介誘発を予防するタンパク質である。このようなタンパク質は、いずれもこのＮＦκＢ結合および遺伝子転写誘発阻害活性を有する、天然に発生するＩκＢ様タンパク質、その一部またはその同族体またはこれらの変異体であり得る。好ましい態様において、本タンパク質は、直接本タンパク質を細胞の核のような特異的細胞成分に適合させる、１個またはそれ以上の信号配列を含み得る。好ましくは本発明の内皮細胞は、内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外部刺激の反応の要求に応じて、構成的に（即ち、連続しておよびＮＦκＢ発現と比較して動態の遅延がなく）ＩκＢ活性を有するタンパク質を発現する。典型的に、本発明の内皮細胞は細胞の遺伝物質の修飾の結果得られる。この修飾はＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする異種ＤＮＡの導入および天然ＩκＢコード配列の発現制御信号の改造または置換を含む。したがって、一つの態様において、本発明の内皮細胞は、細胞により構造的に発現され、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする異種ＤＮＡ配列を含む。ＩκＢ活性タンパク質コード配列は、典型的に細胞にはまた異種であるプロモーター配列と、タンパク質が構造的に発現されるように使用可能に連結している。別の態様において、本発明の内皮細胞は、タンパク質が内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外部刺激の反応の要求に応じて発現されるように、Ｉ κＢ活性を有するタンパク質の構造的発現をコードするＤＮＡ配列と使用可能に連結している異種誘導プロモーターＤＮＡ配列を含む。異種誘導プロモーター配列と使用可能に連結しているタンパク質コード配列は、天然ＩκＢコード配列または異種ＩκＢコード配列であり得、好適な信号配列、例えば核特異的信号配列をコードする配列を含み得る。内皮細胞活性化刺激は供与体組織または器官内の内皮の変化をもたらし、受容体内の凝固を刺激し、拒絶反応に導く任意の刺激であり得る。予め決定された刺激は医薬、サイトカインまたは誘導プロモーター由来の発現を刺激する他の誘発剤の存在であり得る。例えば、移植患者は医薬のような誘発剤で移植に続いて処置し、ＩκＢ発現を誘発し、それにより供与体器官の内皮細胞の活性化および続く器官の拒絶を阻害し得る。任意の好適な誘導プロモーターを使用し得る。例えば、ゴセンおよびブジャード［ＰＮＡＳ（１９９２）、８９、５５４７−５５５１］により記載されたような誘導プロモーターを使用し得る。更なる態様において、本発明は、細胞により構造的に発現され、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする異種ＤＮＡ配列を内皮細胞に形質導入することを含む、本発明の内皮細胞調整法を提供する。更に別の態様において、本発明は、タンパク質が内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外部刺激の反応の要求に応じて発現されるように、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする天然ＤＮＡ配列を、異種誘導プロモーターＤＮＡ配列と使用可能に連結することを含む本発明の内皮細胞の調整法を含む。好ましくは異種ＤＮＡ配列は細胞のゲノムに包含されている。別法として、異種配列は安定してまたは限定された期間、細胞内に染色体外的に維持され得る。本発明により、最初は未知のＩκＢ様タンパク質（以後ＥＣＩ−６と呼ぶ）をＴＮＦαおよびＩＬ−１αのような炎症性剤で刺激したブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）中に同定した。本タンパク質およびＩκＢ活性を有するその一部および同族体は本発明の範囲内に含まれる。ＥＣＩ−６のアミノ酸配列およびそれをコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号１に記載する。ＩκＢ活性を有するタンパク質はＥＣＩ−６またはそれらの活性部分または活性同族体またはこれらの変異体を含む。したがって、好ましい態様において、ＩκＢ活性を有するタンパク質をコードする異種配列は、配列番号１または２の１位から２８０位のタンパク質配列、またはＩκＢ活性を有するその一部と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％および更に好ましくは少なくとも９０％の相同性である配列を含むタンパク質をコードする。特に好ましい態様において、異種配列は、１個またはそれ以上のリン酸化部位（配列番号１のアミノ酸３０から３６、アミノ酸３ｇから４７およびアミノ酸２６０から２６４）をなくすために改造されたタンパク質配列をコードする。この改造は最初および３番目の配列の中心ＳｅｒをＧｌｙに、２番目の配列のＴｙｒをＰｈｅに変えることを含み得る。ＩκＢ様活性を有するタンパク質はＮＦκＢの核への移動を妨げおよび／または細胞の遺伝物質のＮＦκＢ結合部位へのＮＦκＢの結合を阻害する。ＮＦκＢ結合の阻害は標準バイオアッセイ法を使用して測定し得る。例えば電気泳動運動性移動測定が内皮細胞内のＮＦκＢ結合の阻害の検出に使用し得る。このような測定の具体的な例は下記の通りである：ブタ動脈内皮細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ修飾イーグル培地を含む培養培地で成育させる。細菌性リポポリサッカライド１００ngを２時間細胞を刺激するのに使用し、次いで核タンパク質をディグナムら；１９８３；Nucl ．Acids Res.；１１、１４７５−１４８９に記載のように抽出する。次いでＲＮＡを、図１に示すｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌフラグメント（１２６から１６０５塩基）を含むプラスミド（ストラタジーン（Stratagene）から得たブルースクリプトII（Bluescript II））からインビトロで転写する。転写反応は０．２５nM ｍ⁷Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ベーリンガー（Boehringer））を加える以外、製造者のプロトコールに従って行う。得られたＲＮＡを、次いで小麦胚抽出物またはウサギ網状赤血球溶解物中のインビトロ転写に使用する；両方とも製造者のプロトコールに従って、アメリカ合衆国、ウィスコンシン州、マジソンのプロメガ・コーポレーション（Promega Co rporation）から得た。次いで、ＥＭＳＡを、ＮＦκＢ結合部位である標識１６量体ＢＳ−２オリゴヌクレオチド（以下の配列番号３に記載）を調整することにより行う。結合反応を２０℃で、ｐＨ７．９で１５分、１２％グリセロール、１２ｍＭＨＥＰＥＳ、４ｍＭＴｒｉｓ、６０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、２００μg／mlポリ（ｄｌ−ｄＣ）、３００μg／mlウシ血清アルブミン、０．２ng標識ＢＳ−２（１００，０００cpm）、５μｇ核タンパク質および種々の量の翻訳タンパク質からなる全量１５μl中で行う。ＮＦκＢのＢＳ−２オリゴヌクレオチドへの結合の阻害は、対照小麦胚またはウサギ網状赤血球溶解物と比較することにより測定できる。更なる態様において、本発明は内皮細胞を含む供与体組織または供与体器官を提供する。供与体材料は、受容体にとって異種であり得、または同種であり得る。好ましくは供与体材料はブタから得る。供与体動物はトランスジェニック動物由来であり得る。別法として、異種ＤＮＡは既知の遺伝子治療技術により供与体器官の内皮細胞に形質導入し得る。好適な技術はミラー、Ａ．Ｄ．；１９９２；Nature、３５７、４５５−４６０に記載されている。他の態様において、本発明は上記で定義のような内皮細胞を有するトランスジェニック非ヒト哺乳類を提供する。異種ＤＮＡは、動物または動物の先祖に単個細胞段階または初期桑実胚段階で導入し得る。工程は２から８個細胞段階の間で行い得るが、好ましい段階は単個細胞段階である。配列を既知ように顕微鏡注射し得るか、レトロウィスルまたは類似の系を使用し得る（ミラー、Ａ．Ｄ．およびロスマン、Ｇ．Ｔ．；１９８９；Biotechniques、７、Ｎｏ．９、９８０−９９０）。好ましい哺乳類はブタである。本発明はトランスジェニック哺乳類から得た供与体器官をまた提供する。供与体器官および組織の提供に加えて、本発明は、上記のようなおよび例えば発現のＮＦκＢ媒介誘発の阻害の利益を得るであろう内皮細胞の障害に関する本明細書の別の場所の記載のようにＩκＢを発現する遺伝子的改造内皮細胞の提供に通常また使用し得る。更に別の態様において、本発明は、形質導入内皮細胞内で使用するための、Ｉ κＢ活性を有し、１位アミノ酸で開始し、２８０位アミノ酸で終了する配列番号１に記載のアミノ酸配列；または実質的に、すなわち少なくとも９５％それらと相同のアミノ酸配列；を含むタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を提供する。形質導入内皮細胞は、移植または平滑筋細胞内の制御発現のために使用し得る。ヌクレオチド配列は、更に図１に記載の配列のアミノ酸２８１から３１４をコードするコドンを含み得る。好ましくはヌクレオチド配列は、配列が１個またはそれ以上のリン酸化（アミノ酸３０から３６、アミノ酸３９から４７およびアミノ酸２６０から２６４）をなくすために改造されているタンパク質をコード化する。改造は好ましくは最初および３番目の配列の中心ＳｅｒのＧｌｙへの変化および２番目の配列のＴｙｒのＰｈｅへの変化をもたらす。更なる態様において、本発明は異種信号配列を含むＩκＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。信号配列は、典型的にはタンパク質を特異的細胞性成分へ向けさせるように適応させる信号配列、好ましくは核特異的信号配列である。更なる態様において、本発明はまたＩκＢ活性を有し、１）誘導プロモーターまたは２）内皮細胞特異的プロモーター（ここでプロモーターは該ＩκＢ活性タンパク質コード化ＤＮＡ配列に天然のプロモーターではない）と使用可能に連結したタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む組換ＤＮＡ構築物を提供する。好ましくはプロモーターは誘導および内皮細胞特異的の両方である。通常ＩκＢ活性タンパク質コード化配列は異種配列であり、信号配列を含むかまたは配列番号１に関連した上記のような配列であり得る。本発明は更に上記のヌクレオチド配列または組換ＤＮＡ構築物を含む発現ベクターを提供する。好ましくはベクターはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ヌクレオチド配列とトランスフェリン−ポリカチオン結合体の複合体およびリポソーム内で形成されたプラスミドから選択される。好適なレトロウィルスベクターは、ＷＯ９２／０７５７３に記載されている。好適なアデノウィルスベクターはローゼンフェルド、Ｍ．Ａ．ら；１９９１；Sc ience；２５２、４３２に記載されている。好適なトランスフェリン−ポリカチオン複合体はワグナー、Ｅ．ら；１９９１；Proc．Natl．Acad．Sci．USA；８８、４２５５−４２５９に記載されている。リポソーム複合体はスチュワート、Ｍ．ら；１９９２；Human Gene Therapy、３、２６７−２７５に記載されている。他の態様において、本発明はＩκＢ様活性を有し、アミノ酸第１位で始まり、アミノ酸第２８０位で終了する、図１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。タンパク質は更に配列番号１のアミノ酸２８１から３１４を含み得る。これらのアミノ酸は、他のタンパク質においてタンパク質不安定性を担うものとして報告されている（ロジャーズら；１９８６；Science、２３４、３６４−３６８）、ＰＥＳＴ配列を含む。好ましくはこれらのアミノ酸はタンパク質中に存在せず、これは停止コドンをアミノ酸２８０のコドンの後に導入することによりなし得る。これはアミノ酸第２８１位のプロリンのコドンを、ポリメラーゼ連鎖反応により変異させることによりなし得る。好ましくは本タンパク質のアミノ酸配列は１個またはそれ以上のリン酸化部位（アミノ酸３０から３６、アミノ酸３９から４７およびアミノ酸２６０から２６４）をなくすように改造される。この改造は最初および３番目の配列の中心ＳｅｒのＧｌｙへの変化および２番目の配列のＴｙｒのＰｈｅへの変化を含み得る。更なる態様において、本発明は異種信号配列、例えば核特異的信号配列を含むＩκＢ活性を有するタンパク質を提供する。一次拒絶が超急性拒絶であるため、上記で定義の内皮細胞および供与体器官が、異種移植の移植拒絶の予防における補助的機能を有することは認識されるであろう。従って、供与体器官の細胞の遺伝物質は、典型的にはまた受容体の補体経路の活性が妨げられるように変える。ＷＯ９１／０５８５５に記載のように、これは受容種の補体制限因子を発現するトランスジェニック動物の提供によりなし得る。このような動物由来の供与体器官の内皮細胞は上記で定義の内皮細胞を提供するために、遺伝子治療技術により修飾できる。別法として、上記で定義のベクターを単個細胞段階または初期桑実胚段階で、トランスジェニック動物に導入できる。この方法において、得られるトランスジェニック動物は補体制限因子を発現し、上記で定義の内皮細胞を有するであろう。従って、更なる態様において、本発明はまた１個またはそれ以上のヒト補体制限因子を発現する上記で定義の非ヒト内皮細胞、組織、供与体器官およびトランスジェニック動物を提供する。タンパク質ＥＣＩ−６をコードするＲＮＡは、炎症性剤ＴＮＦαおよびＩＬ− １αで刺激されるブタ動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）から単離された。ＥＣＩ−６ＲＮＡは炎症性剤で刺激した後２時間以内に誘発され、４時間後に減少することが分かった。少量が“未刺激”細胞中にまた検出された。ＬＰＳを伴ったシクロヘキシミドの添加は、信号の増強をもたらし、初期タンパク質合成が導入に必要ではないことを示唆する。ＲＮＡは、活性化対未活性化内皮細胞を使用した差異スクリーニング研究を使用して同定した。ＥＣＩ−６のＩκＢ活性を、インビトロＤＮＡ結合測定で試験し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激ＰＡＥＣの核フラクションに存在するＮＦκＢ結合活性を特異的に、用量依存的に阻害した。同様にウサギ網状赤血球溶解物に存在する内因性ＮＦκＢは、溶解物をＥＣＩ−６で感作することにより阻害されたが、対照溶解物ではされなかった。ＮＦκＢ結合部位を示す未標識オリゴヌクレオチドと競合的であるが、変異ＮＦκＢ結合部位または未関係オリゴヌクレオチドとは競合しないため、ＮＦκＢの結合は特異的であった。タンパク質ＥＣＩ−６はＩκＢタンパク質ＭＡＤ−３と強い相同性（９０％以上）を示し、タンパク質ｐｐ４０およびＲＬ／ＩＦ−１と高い相同性を示す。本発明の態様を実施例のみの方法で、図面を参考にしてここに記載し、この中で、図面は：図１は小麦胚抽出物中でインビトロ翻訳ＥＣＩ−６の存在下核タンパク質のＮＦκＢ部位への結合の阻害を説明するポリアクリルアミドゲルを示し、および図２はウサギ網状赤血球溶解物中で内因性ＮＦκＢのＩκＢ−２結合部位への結合の阻害を説明するポリアクリルアミドゲルを示す。実施例実施例１：誘発遺伝子のクローニングａ）刺激ブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）のｃＤＮＡライブラリーの調整融合後のＰＡＥＣをヒト組換ＴＦＮαおよびＩＬ−１α（ゲンザイム（Genzym e）から入手）の組み合わせで、それぞれ１００Ｕ／mlの濃度で４および９時間処理する。細胞を両方の時点で回収し、各々の時点の全細胞ＲＮＡを抽出し、マニアティスら；１９８９；分子クローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー、７−１０頁に記載の方法を使用して単離する。次いで、両方の時点由来のＲＮＡを集める。ポリＡ＋ＲＮＡ５μgを製造者のプロトコールに従ってオリゴｄＴセルロース（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannhei m））と調整する。ファージλZap II中のｃＤＮＡライブラリーを製造者のプロトコールに従ってｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン（Stratagene）、ラ・ジョラ、カリフォルニアを使用して調整する。次いでベクターの包装をギガパック・ゴールド・システム（Gigapack Gold System）（ストラタジーン、ラ・ジョラ、カリフォルニア）を使用して行う。約２２０万の一次クローンを得る。約５０００プラークをスクリーニングする。ｂ）プローブの調整およびスクリーニング２個のプローブを調整する：１個は誘発されていないＰＡＥＣ由来のＲＮＡであり、他方はａ）に記載のように誘発したＰＡＥＣ由米である。未誘発プローブは、ＲＮＡ１μgを逆転写酵素（ギブコ−ＢＲＬ）により、製造者のプロトコールに従って逆転写して製造する。³²Ｐ−ＣＴＰ５０μCiを本反応に使用する。誘発プローブは同様の方法で調整するが、次いでビオチニル化未誘発ＲＮＡで２回サブトラクションする。ビオチニル化およびサブトラクションは、製造者のプロトコールに従って、サブトラクタ−Ｉ（Subtractor I）（インビトロジェン（In Vitrogen）、サン・ディエゴ、カリフォルニア）を使用して行う。ＰＡＥＣライブラリー由来の２個のレプリカを、一つは未誘発プローブおよび他方は誘発プローブと共に、６５℃で標準ハイブリッド形成条件下でスクリーニングする（マニアティスら）。未誘発プローブと比較して強い信号を誘発プローブに与えるファージを、ストラタジーンプロトコールを使用してインビボ除去によりサブクローニングする。全ての場合、標準法によりノーザン分析を行う（マニアティスら）。製造者のプロトコールに従ってオリゴ・ランダム・プライミング・キット（oligo random priming kit）（ストラタジーン）で標識した誘発クローンの１．５kb ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌフラグメントをプローブとして使用する。ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を、次いで製造者のプロトコールに従ってシークエンス・キット（ユーエス・バイオケミカルズ（US Biochemicals）、クリーブランド、オハイオ）を使用して、ジデオキシ鎖停止法により測定する。ヌクレオチド配列および予言されるアミノ酸配列を配列番号１に記載する。５回のアンキリン繰り返しは、アミノ酸残基７３から９９、１１０から１３６、１４３から１６９、１８２から２０８および２１６から２４２であり、３個の有効なＣＫ−１１ＴＹＲおよびＰＫＣリン酸化部位はそれぞれアミノ酸残基３０から３６、３９から４７および２６０から２６４である。配列の５’部位（１−２７０位）はゲノムクローンから得られ、Ｘｈｏｌ部位（２８５位）でｃＤＮＡとライゲーションし、インビトロ翻訳に機能的なクローンを得る。次いで、タンパク質配列をＭＡＤ−３、ＲＬ／ＩＦ−１およびｐｐ４０とＵＷＧＣＧソフトウェアのＰＩＬＥＵＰプログラムを使用して比較し、これらのタンパク質の高い相同性を有していることが分かる。タンパク質をＥＣＩ−６と名付ける。実施例２：インビトロ翻訳配列番号１の１２６から１６０５位に対応するヌクレオチド配列を含む挿入を含む線状化ベクター（１０μg；ブルースクリプト（Bluescript））を、製造者が推薦するように、全量１００μlであるが、０．２５mM ｍ⁷Ｇ（ｇ’）ｐｐｐ（５’）Ｇをまた含む中で、Ｔ７ポリメラーゼ（ストラタジーン）を使用してＲＮＡに転写する。次いで、キャッピングしたＲＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿する。生産物の１／５０を、製造者（プロメガ）により推薦されるように、小麦胚抽出物またはウサギ網状赤血球溶解物のインビトロ翻訳に使用する。５、１、０．２および０．４μlのインビトロ翻訳に対応する異なった濃度を、電気泳動運動性移動分析（ＥＭＳＡ）に使用した。実施例３：ＥＭＳＡ使用するＥＭＳＡプロトコールはオースベル、Ｉおよびフレデリック、Ｍ（編）；１９８７；“カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー”、Ｊ．ウィリー＆サンズ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１２−２欄に記載されているものである。内皮細胞（ＥＣ’ｓ）を１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ修飾イーグル培地で培養する。内皮細胞を細菌性リポポリサッカライド（ＬＰＳ）１００ng／mlで２時間刺激し、次いで核タンパク質をディグナム、Ｊ．Ｄ．、レボビッツ、Ｒ．Ｍ．およびレーダー、Ｒ．Ｇ．；１９８３；Nucl．Acids Res.；１１，１４７５−１４８９に記載のように抽出する。２重鎖２６量体ＢＳ−２オリゴヌクレオチド（その配列は以後の配列番号４に記載；１００，０００cpm）を、突出部分を放射活性三リン酸の存在下ＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノー断片で満たすことにより標識する。次いで、オリゴメクレオチドを１２％グリセロール、１２mM ＨＥＰＥＳ、４mM Ｔｒｉｓ、６０mM ＫＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、２００μg／mlポリ（ｄｌ−ｄＣ）および３００μg／mlウシ血清アルブミンを含む１５μl結合用緩衝液中でインキュベーションする。核タンパク質１５μgおよび翻訳ＥＣＩ−６タンパク質５、１、０．２または０．０４ μlを次いで加える。結合反応を３０℃でｐＨ７．９で１５分続ける。ＢＳ−２オリゴヌクレオチドへのＮＦκＢ結合の阻害は、対照小麦胚抽出物またはウサギ網状赤血球溶解物と比較することにより測定できる。方法をＥＣＩ−６ＲＮＡ存在下または不存在下で、核抽出物なしでウサギ網状赤血球溶解物で繰り返す。結合を冷ＢＳ−２、ＢＳ−１（配列は以後の配列番号５に記載）、ＥＬκＢ（以後の配列番号６に記載のような配列を有するブタＥＬＡＭ−１プロモーターの結合部位）またはＩｇκＢ（以後の配列番号７に記載のような配列を有するヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖エンハンサーのＮＦκＢ結合部位）と競合するが、以後の配列番号８に記載のような配列を有する変異ＮＦκＢ部位とは競合しない。５００倍モル過剰の未標識オリゴヌクレオチドを競合測定に使用する。得られる複合体をディグナムらに記載のように５％ポリアクリルアミドゲルで分離する。結果は図３ａおよび図３ｂに記載する。タンパク質ＥＣＩ−６がＮＦκＢのＩκ Ｂ−２結合部位への結合を阻害することが見られる。実施例４：一過性発現実験最少ＮＦκＢ反応プロモーターを、標準分子生物技術を使用してルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクターＵＢＴ．Ｌｕｃ（デ・マーティンら、１９９３：ジーン１２４、１３７−１３８）中に構築する。簡単に、５’および３’末端でそれぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ粘着を有するチミジンキナーゼプロモーター３７ｂｐを表す２本鎖オリゴヌクレオチドをｐＫＳＭ１３（ストラタジーン）中にクローン化し、ベクターｐＫＳＭ１３−ＴＫをもたらす。ＮＦκＢ結合部位を表すＥｃｏＲＩ粘着を有する二本鎖オリゴヌクレオチドの２つのコピーをｐｋＳＭ１３−ＴＫ中にクローン化し、ベクターｐＫＳＭ１３−２ｘＩｇκＢ−ＴＫをもたらす。構築物の正確さはＤＮＡ配列決定により確認する。２ｘＩｇκＢ −ＴＫフラグメントをＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＮｏｔＩＶはＥｃｏＲＩ部位の上流（５’）に位置する）で消化させることにより切除する。得られるフラグメントを対応する制限酵素で切断したＵＢＴ．Ｌｕｃ中にライゲーションし、ベクター２ｘＩｇκＢＴＫ．Ｌｕｃをもたらす。２ｘＩｇκＢ−ＴＫフラグメントの配列は下記および配列番号９に示す：本ベクターをリポフェクチン（ＢＲＬ、添付のプロトコール参照）を使用してＮＩＨ３Ｔ３中に形質導入する。ルシフェラーゼ測定は記載（デ・ウェットら、１９８７：Mol．Cell．Biol．７、７２５−７３７）のように行う。背景以上のルシフェラーゼ発現は検出されない。２ｘＩｇκＢＴＫ．ＬｕｃをＮＦκＢのｐ６５サブユニット（ＣＭＶ．ｐ６５）の発現ベクターと共に共形質導入した場合、高濃度のルシフェラーゼが検出される。２ｘＩｇκＢＴＫ．ＬｕｃおよびＣＭＶ．ｐ６５に加えて、ＥＣＩ−６／ＩκＢａの発現ベクターを共形質導入した場合、ルシフェラーゼの濃度は背景まで減少する。すべての形質導入はＲＳＶ．β −ガラクトシダーゼ発現ベクターを内部対照として含有する。ＰＥＳＴ領域欠損変異体はアミノ酸ルシン２８０の後に停止コドンを導入することにより、ＰＣＲにより産生する。実施例５：初期ＰＡＥＣへのＥＣＩ−６／ＩκＢｃＤＮＡの安定形質導入のための組換レトロウィルスの構築５種のレトロウィルスのパネルをヒトスロンボモジュリン（thrombomodulin）分子のＰＡＥＣｓ（ブタ動脈内皮細胞）への高能率的形質導入が可能な組換レトロウィルスの産生について評価する。ｐＮＴＫ−２ベクターは、遺伝子が５’ウィルスＬＴＲにより動かされるベクターと同じくらい高く保存感染ＰＡＥＣｓ内で最も高い力価の組換ウィルスを産生し、発現することが分かった。本研究の基本として、ｐＮＴＫ−２はＰＡＥＣにおけるＥＣＩ−６／ＩκＢｃＤＮＡの発現のための組換レトロウィルスの構築に対して選択される。組換プロウィルスは、ｐＮＴＫ−２プロウィルス内のｔｋプロモーターの下流の独特のＸｈｏｌ部位内にＥＣＩ−６ｃＤＮＡを含む約１ｋｂ部分的Ｘｈｏｌ−Ｓａｌｌフラグメントの挿入により構築される。ｔｋプロモーターに関してセンスおよびアンチセンス配向の両方を有し、ＢａｍＨＩ消化により識別されるｃＤＮＡを含む純粋組換体はＥ．ｃｏｌｉＸＬ−１ブルー内に回収される。アンチセンス構築物を対照の目的で取る。ＰＡ３１７包装細胞系形質導入の能率を最大にするために、非常に純粋なプラスミドをキアジェン（Qiagen）の細菌培養から単離する。ウィルス生産物との不適合性同化の発生を最少にするために、センスおよびアンチセンス構築物（１０μg）を、プロウィルスの外部を開裂するＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼで線状化する。消化ＤＮＡを連続フェノール−クロロホルムおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈殿で精製し、電気泳動緩衝液（ＰＢＳＡ＋２０mMＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０）１００μl内に一晩４℃で溶解する。再可溶化は、形質導入前のアガロースゲル電気泳動で確認する。ＰＡ３１７包装細胞を、１３．７ミリ秒の時間定数を産生するバイオラッド（Biorad）エレクトロポレーターセットを使用して、０．２５kVおよび５００ミクロファラッドで形質導入または疑似−形質導入（−ＤＮＡ）する。生存細胞を新鮮培養培地２０ml に再懸濁し、選択の適応（０．８mg／ml Ｇ４１８）前に一晩インキュベーションする。７日の選択後、医薬耐性コロニーをセンスおよびアンチセンス形質転換細胞から得るが、一方対照（−ＤＮＡ）細胞は完全に死滅する。コロニーを保存し、Ｇ４１８含有培地中のＴ−７５フラスコに植える。フラスコ上の融合以下対数相細胞のアリコートをＬＮ₂中に凍結する（親保存細胞）。ウィルスを回収するための細胞を融合まで成育させ、ウィルスを完全培地２０ml に２４時間にわたって回収する。ウィルス含有培地を、次いで懸濁液中のプロデューサー細胞を殺すためおよび保存のために−８０℃に急凍結する。２種の別のウィルスの回収を次いで行う。細胞をＩκＢ発現に対して試験し、発現のＮＦκ Ｂ関連誘発の阻害についてもまた測定する。配列表（1）一般的情報（i）出願人：（A）名称：サンド・リミテッド（B）通り：ピー・ボックス（C）都市：バーゼル（D）州：ビー・エス（E）国：スイス（F）郵便コード（ZIP）：ツェーハー４００２（G）電話：０６１３２４１１１１（H）ファックス：０６１３２４７５７２（I）テレックス：９６５０５０５５（A）名称：サンド・パテント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツンク（B）通り：フンボルト・シュトラーセ（C）都市：レラッハ（D）州：ドイツ（E）国：ドイツ（F）郵便コード（ZIP）：２３４０（G）電話：０７６２１／４８０１４（A）名称：サンド・エルフィンデュンゲン・フェルバルツングスゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツンク（B）通り：ブルンナー・シュトラーセ５９（C）都市：ウィーン（D）州：オーストリア（E）国：オーストリア（F）郵便コード（ZIP）：アー−１２３５ウィーン（ii）発明の名称：形質転換内皮細胞（iii）配列の数：９（iv）コンピューター読み取り可能形式（A）媒介形式：フロッピー・ディスク（B）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換可能（C）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（D）ソフトウェアー：Patentln Release #1.0、バージョン#1.25 （ＥＰＯ）（v）現出願データ：出願番号：ＷＯＰＣＴ／ＥＰ９３／（vi）優先権出願データ：（A）出願番号：ＧＢ９２２２９３１．９（B）出願日：１９９２年１１月２日（2）配列番号１の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：1604塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （v）フラグメント型：中間部フラグメント（vi）起源：（A）生物名：サス・スクロファ（Sus scrofa）（vii）直接の起源：（B）クローン名：ECI-6 （ix）配列の特徴：（A）特徴を表す記号：CDS （B）存在位置：126..1070 （xi）配列の記載：配列番号１：（2）配列番号２の情報：（i）配列の特徴（A）配列の長さ：314アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号２：（2）配列番号３の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：16塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （xi）配列の記載：配列番号３：（2）配列番号４の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：26塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （xi）配列の記載：配列番号４：（2）配列番号５の情報：（i）配列の特性：（A）配列の長さ：27塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （xi）配列の記載：配列番号５：（2）配列番号６の情報：（i）配列の特性：（A）配列の長さ：30塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （xi）配列の記載：配列番号６：（2）配列番号７の情報：（i）配列の特性：（A）配列の長さ：24塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （xi）配列の記載：配列番号７：（2）配列番号８の情報：（i）配列の特性：（A）配列の長さ：26塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （xi）配列の記載：配列番号８：（2）配列番号９の情報：（i）配列の特性：（A）配列の長さ：105塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （xi）配列の記載：配列番号９：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１０月１７日【補正内容】請求の範囲１．細胞のＮＦκＢ活性化が実質的に完全に阻害されるようなＩκＢ活性を有するタンパク質を発現する内皮細胞。２．内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外都刺激の反応の要求に応じて、構成的にＩκＢ活性を有するタンパク質を発現する内皮細胞。３．細胞により構造的に発現され、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする異種ＤＮＡを含む、請求項２記載の内皮細胞。４．タンパク質が内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外部刺激の反応の要求に応じて発現されるように、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列と使用可能に連結している異種誘導プロモーターＤＮＡ配列を含む、請求項２記載の内皮細胞。５．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列がまた異種配列である、請求項４記載の内皮細胞。６．ＩκＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、配列番号１または２の１位から２８０位のタンパク質配列、またはＩκＢ活性を有するその一部と少なくとも７０％である配列を含むタンパク質をコードする、請求項２から５のいずれかに記載の内皮細胞。７．ＩκＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、１個またはそれ以上のリン酸化部位をなくすために改造された、請求項６記載の内皮細胞。８．請求項１から７のいずれかに記載の内皮細胞を含む組織または供与体器官。９．受容体にとって異種である、請求項８記載の組織または供与体器官。１０．請求項１から７のいずれかに記載の内皮細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳類。１１．ブタである、請求項１０記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類。１２．請求項１０または１１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類から得られる組織または供与体器官。１３．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードし、アミノ酸１位で開始し、アミノ酸２８０位で終了する配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ配列。１４．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列が１個またはそれ以上のリン酸化部位をなくすために改造された、請求項１３記載のＤＮＡ配列。１５．異種信号配列を含むＩκＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。１６．信号配列が核特異的信号配列である、請求項１５記載のＤＮＡ配列。１７．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列と使用可能に連結している誘導プロモーターを含み、上記プロモーターが上記ＤＮＡ配列に天然のプロモーター以外である、組換ＤＮＡ構築物。１８．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列と使用可能に連結している内皮細胞特異的プロモーターを含み、上記プロモーターが上記ＤＮＡ配列に天然のプロモーター以外である、組換ＤＮＡ構築物。１９．プロモーターが誘導プロモーターである、請求項１８記載の組換ＤＮＡ構築物。２０．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列が請求項１３記載のＤＮＡ配列である、請求項１７、１８または１９記載の組換ＤＮＡ構築物。２１．請求項１７から２０のいずれかに記載の組換ＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。２２．レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、内皮細胞特異的ウィルスベクター、組換ＤＮＡ構築物とトランスフェリン−ポリカチオン結合体の複合体およびリポソーム内で形成されたプラスミドから選択される、請求項２１記載のベクター。２３．細胞により構造的に発現され、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする異種ＤＮＡ配列を内皮細胞に形質導入することを含む、請求項３記載の内皮細胞の調製法。２４．タンパク質が内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外部刺激の反応の要求に応じて発現されるように、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする天然ＤＮＡ配列と異種誘導プロモーターＤＮＡ配列を使用可能に連結させることを含む、請求項４記載の内皮細胞の調製法。２５．動物またはその先祖に単個細胞段階または初期桑実胚段階で、請求項２１記載のベクターを導入することを含む、請求項１０記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類の調製法。２６．非ヒト動物を請求項２２記載のベクターで感染させることを含み、上記ベクターが内皮細胞特異的ウィルスベクターである、請求項８記載の供与体器官の調製法。２７．アミノ酸１位で開始し、アミノ酸２８０位で終了する、配列番号１記載のアミノ酸配列を含む、ＩκＢ活性を有するタンパク質。２８．アミノ酸配列が、１個またはそれ以上のリン酸化部位をなくすために改造されている、請求項２７記載のタンパク質。２９．異種信号配列を含む、ＩκＢ活性を有するタンパク質。３０．異種核特異的信号配列を含む、請求項２９記載のタンパク質。３１．１個またはそれ以上のヒト補体制限因子を発現する、請求項１−７のいずれかに記載の非ヒト内皮細胞、請求項８、９または１２記載の組織または供与体器官または請求項１０または１１記載のトランスジェニック動物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 // Ａ６１Ｋ 35/12 7431−4Ｃ 38/00 ＡＢＣ 48/00 8314−4Ｃ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞のＮＦκＢ活性化が実質的に完全に阻害されるようなＩκＢ活性を有するタンパク質を発現する内皮細胞。２．内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外部刺激の反応の要求に応じて、構成的にＩκＢ活性を有するタンパク質を発現する内皮細胞。３．細胞により構造的に発現され、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする異種ＤＮＡを含む、請求項２記載の内皮細胞。４．タンパク質が内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外部刺激の反応の要求に応じて発現されるように、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列と使用可能に連結している異種誘導プロモーターＤＮＡ配列を含む、請求項２記載の内皮細胞。５．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列がまた異種配列である、請求項４記載の内皮細胞。６．ＩκＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、配列番号１または２の１位から２８０位のタンパク質配列、またはＩκＢ活性を有するその一部と少なくとも７０％である配列を含むタンパク質をコードする、請求項２から５のいずれかに記載の内皮細胞。７．ＩκＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、１個またはそれ以上のリン酸化部位をなくすために改造された、請求項６記載の内皮細胞。８．請求項１から７のいずれかに記載の内皮細胞を含む組織または供与体器官。９．受容体にとって異種である、請求項８記載の組織または供与体器官。１０．請求項１から７のいずれかに記載の内皮細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳類。１１．ブタである、請求項１０記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類。１２．請求項１０または１１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類から得られる組織または供与体器官。１３．配列番号１の１位から２８０位の配列と少なくとも９５％の相同性である配列を含む、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列。１４．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列が１個またはそれ以上のリン酸化部位をなくすために改造された、請求項１３記載のＤＮＡ配列。１５．異種信号配列を含むＩκＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。１６．信号配列が核特異的信号配列である、請求項１５記載のＤＮＡ配列。１７．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列と使用可能に連結している誘導プロモーターを含み、上記プロモーターが上記ＤＮＡ配列に天然のプロモーター以外である、組換ＤＮＡ構築物。１８．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列と使用可能に連結している内皮細胞特異的プロモーターを含み、上記プロモーターが上記ＤＮＡ配列に天然のプロモーター以外である、組換ＤＮＡ構築物。１９．プロモーターが誘導プロモーターである、請求項１８記載の組換ＤＮＡ構築物。２０．ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列が請求項１３記載のＤＮＡ配列である、請求項１７、１８または１９記載の組換ＤＮＡ構築物。２１．請求項１７から２０のいずれかに記載の組換ＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。２２．レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、内皮細胞特異的ウィルスベクター、組換ＤＮＡ構築物とトランスフェリン−ポリカチオン結合体の複合体およびリポソーム内で形成されたプラスミドから選択される、請求項２１記載のベクター。２３．細胞により構造的に発現され、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする異種ＤＮＡ配列を内皮細胞に形質導入することを含む、請求項３記載の内皮細胞の調製法。２４．タンパク質が内皮細胞活性化刺激の直後または予め決定された外部刺激の反応の要求に応じて発現されるように、ＩκＢ活性を有するタンパク質の発現をコードする天然ＤＮＡ配列と異種誘導プロモーターＤＮＡ配列を使用可能に連結させることを含む、請求項４記載の内皮細胞の調製法。２５．動物またはその先祖に単個細胞段階または初期桑実胚段階で、請求項２１記載のベクターを導入することを含む、請求項１０記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類の調製法。２６．非ヒト動物を請求項２２記載のベクターで感染させることを含み、上記ベクターが内皮細胞特異的ウィルスベクターである、請求項８記載の供与体器官の調製法。２７．配列番号１の１位から２８０位の配列またはその活性部分または類似体を含む、ＩκＢ活性を有するタンパク質。２８．アミノ酸配列が、１個またはそれ以上のリン酸化部位をなくすために改造されている、請求項２７記載のタンパク質。２９．異種信号配列を含む、ＩκＢ活性を有するタンパク質。３０．異種核特異的信号配列を含む、請求項２９記載のタンパク質。３１．１個またはそれ以上のヒト補体制限因子を発現する、請求項１−７のいずれかに記載の非ヒト内皮細胞、請求項８、９または１２記載の組織または供与体器官または請求項１０または１１記載のトランスジェニック動物。