JPH04507403A - チアジン染料またはキサンテン染料を用いた薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 チアジン　・およびキサンチン　・を　いた　ウィルス　゛Ｒ朋ΔソＬｔ 本発明の権利は、国立衛生研究所Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｆｔｕｔｅ　ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの助成金Ｎｏ、　ＣＡ４２８５４の効力に基づき、合衆国政府が有 する。

本発明は、一般的にはウィルス疾患の処置方法の分野に関わり、そしてさらに詳 細には、チアジン染料あるいはキサンチン染料のいずれかを用いたｉＤＳの処置 に関する。

メチレンブルー、すなわち３．７−Ｂｔｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈ ｅｎｏｔｈｉａｚｉｎ−５−ｆｕｎ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｃｔｄ＋５ＣＩＮ３Ｓ 、は暗緑色または青色のチアジン染料で、１８７６年に最初に単離された。ＦＤ Ａが経口投与を認可しており、防腐剤、殺菌剤、そしてシアン化物および硝酸化 物中毒の解毒剤としての、有効性が知られている。

５０年以上も昔から、メチレンブルーはミトコンドリアにより還元されて、ロイ コ染料となり、さらに酸素により自動酸化され、Ｈ２Ｏ２を生成し、メチレンブ ルーに戻ることが知られていた。これは体重１　ｋｇ当り１　ｍｇの投与量で静 脈注射したメチレンブルーが、血液中の１％より多いヘモグロビンがＦｅ”に酸 化されて起きるメトヘモグロビン性貧血の治療に、有効であるのと同じ機構によ ると考えられる。ＫｅｌｎｅｒおよびＡｌｅｘａｎｄｅｒは、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅ＋ｍ、、２６０（２８）、１５１６８−１５１７１　（１９８５）で、メチ レンブルーは、ＮＡＤＰＨにより還元される場合、グルタチオンをＨ２Ｏ２を介 してではなく直接酸化することを報告した。

光の存在下で、メチレンブルーは、恐らくグアニン残基の位置でＤＮＡを破壊ま たは開裂することにより、ＤＮＡを損傷することが、報告されている。Ｓ　ｉｍ ｏｎおよびＶａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓは、紅殖、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ 　ｓ、１０５．１９７−２０６　（１９６４）の中で、いくつかの光活性の染料 および光の効果は、染料の濃度および光の波長および強度に依存しており、そし て、グアニン誘導体による酸素の摂取および紫外吸光の減少に相関し得ると報告 した。Ｋｏｒｎｈａｕｓｅｒらは、ｌ’ｈｏｔｏｃｈｅｍ、Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ 、、１８．　６３−６９　（１９７３）で、薄層クロマトグラフィー分析技術を 用いて、メチレンブルーと光に曝された後のグアノシンの変化を特徴付けようと 試みた。

メチレンブルーと光がＤＮＡに与える影響の実際の機構を分析する試みがその他 にも為されたが、成功していない。

ＦｒｉｅｃｉｍａｎｎおよびＢｒｏｗｎは、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、、５．　８１５−６２２（１９７１１）で、メチレンブルーと光により、Ｄ ＮＡ中のデオキシグアノシン部位に損傷が起こること、そしてさらにピペリジン に曝すと鎖の断裂が起こることを示した。彼らは、プリン環の種々の部位で環状 付加が起き、他のヌクレオシド塩基の修飾の後にＤＮＡが塩基触媒開裂を受け易 くなるためであると仮定した。

Ｗａｓｋｅｌｌらは、Ｂｔｏｅｈｆｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔ、、１１２９． 　４９＝５３　（１９８６）で、メチレンブルー存在下でポリヌクレオチドを長 時間光照射すると、グアノシンは広範に破壊され、リボース、グアニシン、リボ シル化尿素、および遊離の尿素が生成されることを報告した。彼らは、このグア ノシン残基の破壊は、５ａｓｔｒｙらの、Ｂｉｏｃｈｉ＋ｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ 、　Ａｃｔａ　１２９．４２　（１９６６）に記された既存の観察と同じ機構で あるとした。これは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏではメチレンブルーおよび光照射がタバ コモザイクウィルス（ＴＭＹ）のＲＮＡを不活性化し、ウィルスを非感染性に変 えるというものである。　ＳｉｎｇｅｒおよびＦｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ もまた、Ｂｉｏｃｈｅｍ、−、４，２４４６−２４５０（１９６６）で、異なっ たタイプの染料であるチオピロニン（環上のＮが、　ＣＨに置き換えられている ）、およびプロフラビンは、光の存在下でＴＭＶ　ＩＩＮＡの不活性化を引き起 こすことを報告している。これは、口とお工」泣用旦旦コｙ１江扛り−１１ＬＬ Ｌ免立、９２：００　Ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａ ｇｅｎｔｓ、ｐａｇｅ２１７６　ｅｄｉｔｏｒ、　Ｇｅｒａｌｄ　Ｋ、　ＭｃＥ ｖｏｙ　（Ａｍｅｒｆｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｈ。

５ｐｉｔａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ、Ｉｎｃ、、　１９８１　ｒｅｖｔｓｅ ｄ　１９８ｇ）に引用されている様に、０．１％のメチレンブルー溶液の局所的 投与と多色性の光照射とを組み合わせると、単純水泡性ヘルペスの様なウィルス を、先革活性化できるという観察と恐らく同じ機構による。光、メチレンブルー および電気を用いた、ウィルスの不活性化をｉｎ　ｖｉｔｒｏで示子観察が、（ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｆｅｓ　ｖｉｒｕｓに関して）ＢａｄｙｌａｋらのＪ、　Ｃ １１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、、　１７　（２）、　３７４−３７６（１９８ ３）に、そして（単純水泡性ヘルペスに関して）ＳｖａｒｔｚらのＰｒｏｃ、Ｓ ｏｃ、二Ｅｘ　ｅｒ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、、１６１．　２０４−２０９　（１９ ７９）に、報告されている。

牛サンテン染料は、下図の化学構造を有する牛サンテン化合物の誘導体である。

： キサンテン染料は３つの主要な種類に分類される：フルオレンあるいはアミノキ サンチン類、ロドールあるいはアミノヒレキサンテン類である。Ｌｉ１ｌｉｅ、 　Ｈ，Ｊ、　Ｃｏｎｎ・ｓ　Ｂｉｏｌｏ　ｔｅａｌＳｔａｉｎｓ　３２６　（Ｗ ｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｆｎｓ、　９ｔｈ　ｅｄ、　１９７７）ｏ　ロー ズベンガルおよびエオシンＹの二つの染料は、フルオロンの種類に属し、これは 牛サンテン構造の中央炭素原子に結合した第三のアリール基を有している。

ローズベンガル、すなわち４．５．６．７＝Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−３・、　 ６・−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２°、　４　Ｈ，５ｌ、　７−−ｔｅｔｒａ　１ｏ ｄｏｓｐｔｒｏ　［ｆ　５ｏｂｅｒｔｚｏｆｕｒａｎ−１（３Ｈ）、　９・−［ ９Ｈ］ｘａｎｔｈｅｎ］−３−ｏｎｅのニカリウム塩あるいは二ナトリウム塩、 つまりＣ２ａＨ２Ｃ１ａ１４ｈＯｓ、は下図の化学構造を有していこの染料は、 角質性ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ　ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）のマーカーとして用いら れていた。さらに同文献の３５１ページによると、この染料は、土壌懸濁液中の バクテリア染色に、バクテリアのネガティブ染色のために、そして血液中のスピ ロヘータの染色の・ために用いられてきた。さらに同文献よると、この染料は、 肝臓の光走査用の１３１１と組み合わせて、肝機能検査用のＤｅｌｐｒａｔ　ａ ｎｄ　５ｔｏｖｅ−ｓ試験（１９３１）に、また紫外線照射下で脂肪を観察する 際に有用な蛍光染料として使用される。ざら１こ同文献によると、Ｓ＋ｅｉｔｈ とＤａｖｓｏｎ　（１９４４）は、土壌中の菌類の成長を許容し細菌の成長を抑 制する細菌発育阻止剤として、この染料を使用している。

エオシンＹ１　すなわち２・、　４・、　５・、　’ｌ−ｔｅｔｒａｂｒｏｍｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの二ナトリウム塩、Ｃ２ａＨａＯｓＢｒａＮａ２、は、 下図の構造を有している： 同文献の３４３ページによると、この染料は、酸性染料に特別の親和性を有する 顆粒である、細胞の好酸素性顆粒の染色に用いられる。さらに同文献によると、 ヘマトキシリンの対比染色層に用い、そして緑色あるいは青色の塩基性染料であ る。

同文献によると、エオシンＹはメチレンブルーと組み合わせて、Ｒｏｍａｎｏｖ ｓｋｙの技術による血液細胞の染色、および、神経細胞、ネグリ体、前下垂体、 コラーゲンおよび赤血球を染色するＭａｎｎ’　ｓ染色に用いられる。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒ）Ｔ−リンパ球つィルスＩＩＩ型（Ｈ ＴＬＶ−ｒ　Ｉ　＋）、リンハ節疾患関連つイ／ｌ／　ｘ　（ＬＡＹ）、Ａ　Ｉ ＤＳ関連レトロウィルス（ＡＲＭ）、あるいはヒト免疫不全ウィルス（旧Ｖ−り 等、種々に命名されたレトロウィルスに感染した結果であると現在では一般的に 認められている。ＡＩＤＳ発症の危険性を診断することには、相当の困難がある 。ヒト免疫不全ウィルス（旧Ｖ）に感染した人の少なくとも５０％が、ＡＩＤＳ を発症することがわかっている。もっともこのパーセンテージはもっと高いので はないかと疑われている。

以前は完全な免疫系を持った健康な成人が、後天的にＴ−細胞の免疫能が損なわ れた場合に、患者はＡＩＤＳを有すると一般的に診断される。通常は１８ケ月か ら３年の期間の間に免疫能の欠損が現れる。この免疫能の欠損の結果として、患 者は、日和見感染、カポシ肉腫の様な種々のタイプの癌、および免疫系機能の減 少に関連した他の疾患に感染し易くなる。

現時点では、）ＩＩＶ感染を予防するかあるいは治療することのできる処置法は 存在しないが、ＨＰＡ−２３、インターフェロン、リバビリン、フォスフォノ蟻 酸塩＜ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ）、アンサマイシン、スラミン、イム チオール、ペニシラミン、リファブチン、ＡＬ−７２１，３・−アジド−３・− デオキシチミジ７　（ＡＺＴ）、および他の２・、３・−ジデオキシヌクレオシ ドを含む幾つかの化合物が、ｉｌ　ｖｉｔｒｏでウィルスに対し抗ウィルス活性 を示す。

ＡＺＴは、ＨＩＶに感染した患者の生存期間を延長できることを示した唯一の薬 剤である。しかしながら、ＡＺＴは、数カ月にも及ぶ期間用いた場合には非常に 毒性が高く、そしてこの薬剤は重度の貧血を引き起こす為に、たとえ当初はこの 薬剤に耐性を示した患者でも投与を中断しなくてはならない。Ｙａｒｃｈｏａｎ らのＬａｎｃｅｔ、　５７５−５８０　（１９８６）を参照のこと。さらに、Ａ ＺＴで治療中の患者中にＡＺＴ耐性の１７株が存在することも、Ｌａｒｄｅｒ。

Ｂ、Ａ、、Ｄａｒｂｙ、Ｇ、、Ｒｉｃｈｍａｎ、Ｄ、Ｄ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４３．　１７３１−１７３４　（１９１１９）に報告されている。

ＡＺＴの様な多くの細胞内プロセスの阻害剤は、ウィルスの複製を制限するが、 同時に宿主に対しても非常に毒性である。

現在までに発見された抗ウイルス性の薬剤のほとんどが、その毒性のために長期 間にわたっては処方できない。そのため、特に正常細胞に対して毒性の低い、新 しい抗ウイルス性薬剤に対する強い要求があるのは明白である。さらには詳しく は、ＡＩＤＳの高い致死率およびこの疾病に対する有効な治療法の欠如のために 、予防的な使用およびＡＩＤＳ患者の長期間治療への使用のための新しい低毒性 薬剤の開発に対する強い要求かある。

そのため本発明の目的は、ウィルス感染の治療用あるいは予防用の方法および組 成物を提供することである。

さらに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの両方で、ＨＩＶを選択的に不 活性化する方法および組成物を提供することも本発明の目的である。

Ｒ１ヱと１１ 特にメチレンブルーである牛サンテン染料、または特にフルオロンあるいはヒド ロキシキサンチンであるチアジン染料、のいづれかを活性薬剤として含有する組 成物を、特にヒト免疫不全ウィルスである特定のウィルスの細胞内複製を選択的 に不活性化あるいは阻害するために使用する。チアジン染料の好適な実施態様で 、メチレンブルーは活性のある抗ウイルス薬剤である。その他の有用なチアジン 染料には、アズールＡ１アズールＣ，トルイジンおよびチオニンが含まれる。牛 サンテン染料の最も好適な実施態様では、牛サンテン染料がローズベンガルおよ びエオシンＹであり、経口的に患部へ到達する。選択的到達は、例えば、マクロ ファージや他の貧食細胞への到達用にはリポソームの様なシステムを用いること によって、あるいは、生分解性で放出制御可能なインブラントを用いて達成し得 る。実施例では、メチレンブルー、ローズベンガルおよびエオシンＹによるヒト 免疫不全ウィルスの不活性化を示した。これらの化合物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで は、正常なＰＢＭ細胞およびベロ細胞に対し非毒性であることが示された。

図面の簡単な説明 図ＩＡおよびＩＢは、光の中および暗所での、ヒ）　２８Ｍ細胞中の■！■−１ の複製に対する、メチレンブルーの影響を示した、阻止率（駕）対メチレンブル ー濃度、Ｍ、のグラフであり、図ＩＡは棒グラフで、図ＩＢは折れ線グラフであ る。

良悪！」」Ｌ！礼服 チアジン染料メチレンブループラス光が、グアノシンおよびデオキシグアノシン の両者をヒドロキシル化して、それぞれ、８−０Ｈ−グアノシン（８−Ｏｆ（− Ｇ）および８−０Ｈ−デオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）を生成することは 知られていた。キサンチン染料も、グアノシンおよびデオキシグアノシンを同様 にヒドロキシル化し、そして非イオン化性の放射は、染料の抗ウィルス活性を増 強する。８−０■−デオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）あるいは８〜ＯＨ− グアノシン（８−ＯＨ−Ｇ）に変換される核酸鎖中のグアノシンの数は、染料濃 度、ｐａｌおよびバッファー強度を操作することにより制御され得る。この処理 法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび細胞内の両方で、ウィルスのＤＮＡおよびＨＭＡ 中のグアニン塩基を、選択的且つ制御された方法で修飾するのに用いられ得る。

本明細書では、８−０Ｒ−Ｇという用語は、他に断りがない限り、８−０Ｈ−Ｇ および８−０Ｈ−ｄＧの両方を指すのに用いる。

８−ＯＨ−Ｇの生成は、変化していないグアノシンの様には塩基対を形成しない ために、そして複製、転写および翻訳の間、８−０１’ｌ−Ｇに隣接した塩基の 読み間違いが起きるために、核酸の変異をもたらす。ウィルスは、自身の遺伝物 質にフードされた酵素および宿主細胞の「機構」を用いて、宿主細胞中で複製を 行う。複製は、新しいウィルスの産生に含まれる多（の転写および翻訳を伴い、 普通速い速度で起こる。染料は、光の中で、暗中で、あるいは低レベルの光中で も、転写および翻訳を阻害することが現在で（よ分力）って（する。さら１こ、 ある種類のウィルスは染料に対して特に感受性であることが分かっている。この 様なウィルスの例としては、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、およびその度合 は低いが、単純水泡性ヘルペスウィルス（ＨＳｖ）が挙げられる。従って染料は 、宿主細胞中でのウィルスの複製に関する転写お、よび翻訳を阻害することによ り、これらのウィルスによる感染をｉｎ　ｖｔｖｏで、治療するのに用いられ得 る。このことは、少なくとも一部は、染料がグアノシンあるいはデオキシグアノ シンをヒドロキシル化して、それぞれ８−０Ｈ−グアノシン（８−ＯＨ−Ｇ）あ るいは８−０Ｈ−デオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）を生成する機構による 。宿主細胞に対する影響は、恐らく複製速度がより低いために、最小となる。染 料は、他の既知の抗生物質、抗炎症剤、抗真菌剤および抗ウィルス剤との組み合 わせで提供され得る。

発明の背景の項で記述したように、チアジン染料および牛サンテン染料は種々の 応用に使用されてきた。しかしながら、本明細書に記述する方法は、全ての遺伝 物質の完全な破壊ではなく、この化合物の選択的および制御された使用法に基づ いている。この完全な破壊は、宿主細胞の保持および宿主細胞への毒性効果を最 小化することを目的とする如何なる方法にも全く応用することができない。さら に、本明細書に記述した方法は、普通に皮膚を透過して（る光に加えて別の光に 曝すことにより増強されることがあるにせよ、付加的な光照射を必要とはしない 。

有用な牛サンテン染料の例は、ローズベンガルおよびエオシンＹである。これら の染料は、多くの異なる供給元から市販されている。ローズベンガルは、Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅ＋ａｆｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｔｓ、Ｍｏ、から、エオシンＹは、にｏｄａｋ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｎ、 　Ｙ、から購入し得る０これらの染料は、ｉｎ　ｖｔｖｏでの使用に際し、局所 的あるいは全身的に用いられ得る。メチレンブルーについては連邦医薬品食品量 （Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｄｒｕｇ　ａｉｄ　Ｆｏｏｄ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏ ｎ）が両方法による投与を認可しているが、メチレンブルーは現時点ではまだ、 如何なる局所的あるいはｉｎ　ｖｔｖｏでのウィルス感染の治療目的での使用に ついても、ＦＤＡに認可されていない。メチレンブルーは暗青緑色の結晶の外観 のチアジン染料で、水に可溶で、アルコールに難溶性で、深い青色の溶液を生成 する。

注射可能なメチレンブルーは、ｐＨが３から４．５である。ｐＫ、、値は、０か ら−１の間である。

Ｄｒｕ　Ｆａｃｔｓ　ａｎｄ　Ｃｏｙｍ　ａｒｉｓｏｎｓ、　ｐａｇｅ　１８５ ５　（Ｊ、　Ｂ、　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　 ＭＯ１９８９）には、メチレンブルーは、膀胱炎および尿道炎の際の温和な泌尿 生殖器用の殺菌剤として、また、原発性および薬剤誘起のメトヘモグロビン性貧 血に、さらに、シアン中毒の解毒剤として、有用であると報告されている。推奨 される投薬量は、経口で５５　＋ｉｇから１３０　＋ｉｇで、−日３回である。

口腔経由吸収は、５３％から９７％、平均で７４％であることが、ＤｉＳａｎｔ ＯおよびＷａｇｎｅｒによりＪ、　Ｐｈａｒ＋ｇ、　Ｓｅｔ、、　８１（７）、 　１０８６−１０９０　（１９７２＞に記されている。薬局方には推奨投薬量は 、経口では５０ＩＩ１ｇから３００ｍｇ：静脈注射では体重１　ｋｇ当り１　ｍ ｇから４　ｍｇであると記されている。副作用には、前原、時折の吐き気、貧血 および発熱がある。Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｈａｓ　１ｔａｌ　Ｆ。

匡虹虹しシニ遣ｅ−Ｄｒｔ工山山江肚■匹」［には、子供用の静脈注射投薬量は 、体重１　ｋｇ当り１　ｍｇから２　ｍｇで、数分間かけてゆっくり注入し、一 時間後に再度繰り返す、と記されている。

５５　ｍｇの錠剤が、Ｋｅｎｎｅｔｈ、　Ｍａｎｎｅから市販されている。６５ 　ｍｇの錠剤は、５ｔａｒ　Ｐｈａｒｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓから市販されてい る０　メチレンブルー注射液（１０Ｂ／ｍｌ）は、Ａｍｅｒｔｃａｎ　Ｒｅａｇ ｅｎｔ、　Ｈａｒｖｅｙ。

Ｋｉｓｓｉｍｍｅｅ、　Ｐａ５ａｄｅｎａ、から市販されている口Ｎａｒｓａｐ ｕｒとＮａｙｌｏｒは、Ｊ、Ａｆｆｅｃｔｔｖｅ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、５．　 １５５−１６１　（１９８３）で、経口的に１００　ｍｇを一日二回あるいは一 日三回の投薬量で投与された、あるいは静脈注射で１００　Ｂを１０分間で注入 された、メチレンブルーが、ヒトのある種の精神疾患の治療に効果的であること を報告し、染料が血液一層間の障壁を通り抜けることを示し、そのため脳および 中枢神経系のウィルス感染の治療に特別の応用能力を有していると示唆した。

メチレンブルーは、１週間から１９ケ月の期間ヒト成人に投与され、副作用は最 小であった。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｈｏｓ　１ｔａｌ　Ｆｏｒ＋ｇｕｌａｒ　５ｅｒｖｉｃｅ　 −Ｄｒｕ　Ｉｎｆｏｒ＋ｇａｔｆ。

ｎ　１１８”には、メチレンブルーは胃腸管から良く吸収され、約７５％が尿中 へまたは胆汁経由で、主として安定化され無色のロイコメチレンブルーとして排 出される、という報告がある。

Ｇ、Ｅ、Ｂｕｒｒｏｗｓにより、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｔｈｅｒ ａ　、７．　２２５−２３１　（１９８４）に報告されている様に、羊では、メ チレンブルーに対する総体的排除速度定数（ｏｖｅｒａｌｌ　ｅｌｉｍｔｎａｔ ｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｃ。

ｎ５ｔａｎｔ）は、０．００７６±０．００１６　ｗｉｎ”であり、５０　＋ｍ ｇ／ｋｇもの高投与量に於いても最小のメトヘモグロビン産生を示し、全体で３ ０　ｍｇ／ｋｇの量のメチレンブルー投与の４週間後まででは、血液学的変化は 全く見られなかった。３％の溶液として静脈注射投与したメチレンブルーの２４ 時間ＬＤｓａは、、　４２．３　ｍｇ／ｋｇで、９５％信頼限界区間は３７．３ から４７．９　Ｂ／ｋｇであり、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ迄の投薬量ならば、 安全に投与し得ることが示された。

ＺｉｖおよびＨｅａｖｎｅｒが、Ｊ、　Ｙｅｔ、Ｐｈａｒｍａｅｏｌ、　Ｔｈｅ ｒａ　、７．　５５−５９　（１９８４）に報告した様に、メチレンブルーは、 血液−乳汁の障壁は簡単に通り抜ける。

本明細書に記述したｉｎ　ｖｉｖｏでのＨＩＶ感染の阻止のための方法は、約２ ０μＭから２００　μＭあるいは７．５　ｍｇ／Ｉから７５　＋ｍｇ／ｌの血中 濃度になる範囲の投薬量の必要がある。血液量は普通、乳児で約２．５Ｌであり 、ヒト成人では約１ＯＬである。７４％の経口吸収率および一定の時間中におい ての排出率が、吸収されたものの７５％であることを考慮し、さらに光中よりも 暗中での治療効果指数が低いと仮定すると、上記濃度は、１８時間の間で５．７ ６　Ｂ／ｋＨに匹敵する。

特定の細胞型を標的とし、あるいは染料の活性を増強亭、・せるために、当業者 に公知の技術を用いてチアジン染料を患部へ到達させ得る。例えば、癌の治療用 に光活性な薬剤や注射を用いた方法が、Ｅｄｅｌｓｏｎらの、Ｎｅｗ　Ｅｎ　１ ａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１６゜２９７−３０３　（１９８７）に記載され ている。チアジン染料は特に、ＡＩＤＳ患者において旧Ｖ濃度が高い部位である マクロファージへリポソーム輸送の様な技術を用いて到達させ得る。リポソーム に関しては、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓの、Ｄｒｕ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｂ ｉｏｌ。

ａｎｄ　Ｍｅｄｔｃｉｎｅ　Ｃｈ、　１４．２８７−３４１　（Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　１９７９）に全般的な記載がされている。光感受性 のリポソームの製造方法については、Ｐｉｄｇｅｏｎらの、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ 、　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、、　３７、４９１−４９４　（１９８３）に記載され ている。リポソーム組成物は、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、 、　Ｐｒｆｎｃｅｔｏｎ、　ＮＪ、の様な会社から市販されている。マクロファ ージに貧食されたリポソームからの化合物の放出については、５ｔｏｒ＋ｓらの 、Ｂｔｏｅｈｉｍ、　Ｂｔｏ　ｈ　ｓ。

」！組、　９６５．１３６−１４５　（１９８８）に記載されている。

あるいは、放出制御ポリマー性インブラントを用いて、長期間にわたって患者に 連続的に染料を到達させ得る。ポリマー性のインブラントは一般的に、ｉｎ　ｖ ｉｖｏで既知の一定期間の間に分解するポリマーから製造される。有用なポリマ ーの例は、ポリ酸無水物、ポリ乳酸、ポリオルジエステル、およびビニル酢酸エ チレンが含まれる。これらの素子も市販されている。Ａｌｚａ　Ｃｏｒｐｏｒａ ｔｉｏｎ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔａ、　ＣＡ、およびＮｏｖａ　Ｐｈａｒ＋５ａｃ ｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｂａ１ｔｆｉｏｒｅ、　ＭＤ、の両社は、生分解性で放出 制御ポリマー性素子の、製造および販売を行っている。

有用な牛サンテン染料の例は、ローズベンガルおよびエオシンＹである。これら の染料は、多くの異なる供給元から市販されている０　″−ズ″′ガルは−Ｓｉ ｇ＊ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｏ、から、一方、エオシンＹは、［ｏｄａｋ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、 　Ｎ、　Ｙ、から購入し得る。

これらの組成物およびその使用方法は、以下の制限されることのない実施例を参 考としてさらに深く理解される。

（以下余白） ｍ：メチレンブルーと光を用いたＲＮＡウィルスＲ１７の不活性化 ＲＮＡウィルスＲ１７を、０．０２Ｍのメチレンブルーと１５分間の光照射（１ ００ワツト、白熱光バルブ、距Ｍｌ１ｃｍ）に曝し、Ｉ？１７を不活性化した。

不活性化は、バクテリアローン上でのプラーク形成能で評価した。ウィルスの感 染性は、０．０５　Ｍのメチレンブルーの存在下で４５秒間光を照射することに より５０％不活性化された。

２０μｌのＲ１７フアージの保存溶液を、２．０ｍｌの希釈バ、２ファーに加え 、チューブＡからＦに各０．３ｍｌずつ分注する。次に、メチレンブルーを次の 表１に示した濃度になるように添加する。光処理に供するために、２７０μｍの 試料を、ピペットを用い、９６ウエルのマイクロタイターの、ＡからＨの文字ラ ベルに対応する＃１のウェルの中へ分注する。マイクロタイタープレート中の試 料は、ペトリ皿の中にｌ／４　ａｍの深さにいれた水を透して５分間光照射に曝 した。次に、光処理しない各試料の２７０μｍをプレートのウェルに分注した。

処理の後、マイクロタイタープレート中に１０倍希釈系列を作り、０．１ｍｌの 選択された希釈液を、０．２ｍｌの対数増殖期の、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌ ａ　Ｊｏｙａ、　ＣＡ、から購入した、Ｅ、　ｃｏｌｔのＸＬ−Ｂｌｕｅ株細胞 （約１０７細胞／ｍ１）に加え、そして０．１ｍｌを蒔くことによって生存して いるＲ１．７フアージを計数した。

（以下余白） ＬＬ：メチレンブルーおよび光のＲＮＡウィルスＲ１７の感染性に対する影響 Ｏ゛　なし　７．２０　Ｘ　１０” ０．０２　有り　５．０４　ｘ　１０”０．０４　有り　１．ＬＩ　Ｘ　１０” ０．２　有り　３．２５　ｘ　ＬＯ’ ２．０　なし　４．８Ｑ　ｘ　１０” ２．０　有り　３−００　ｘ　１０” ２０．０　なし　３．００　ｘ　１０９２０．０　有り　４゜２０　ｘ　１０’ メチレンブルーは、Ｒ１７の不活性化および計数に使用した濃度では、バクテリ アローンの成長を阻止しなかった。

！Ｊｕ２！Ｌｉ：　Ｒ１７ウイルスの不活性化に及ぼす光照射時間の影響Ｒ１７ ウイルスは、ウィルスを不活性化するために必要な光照射時間を決定するために さらに試験された。方法は、ＭＥ濃度を０．０５μＭと一定にし、照射時間を変 化させた以外は、先に記述した実施例１に用いたのと同様である。照射の長さは 、以下のように変化させた： ０．３　ｍｌをウェルＨ２に添加し、０分間から５分間光処理。

０．３ｍｌをウェルＧ２に添加し、５分間から７．５分間光処理。

０．３ｎ＋ＬをウェルＦ２に添加し、７．５分間から９．０分間光処理。

０．３ｎｕをウェルＥ２に添加し、９．０分間から９．５分間光処理。

０．３　ｍｌをウェルＤ２に添加し、９．５分間から９．９分間光処理。

０．３ｍｌをウェルＣ２に添加し、９，９分間から１０．０分間光処理。

０．３＋ｍｌをウェルＢに添加し、光なし。ＱＪ＋＊１をウェルＡに添加し、光 なし。結果を表２に示した。

１主：　ＭＢで処理されたＲ１７ウイルスの感染能に及ぼす光照射時間の影響 日　Ｍｔｎ、　ＰＦ［ なし　２．７６　ｘ　１０”　／ｍｌ Ｏ，１３，３ｘ　１０９／ｍｌ Ｏ，５５，０Ｘ　１０’　／＋ｍ１ １．０　１．Ｏｘ、　１０’　／ｍ１ ２．５　９．１　ｘ　１０７／ｍ１ ５．０　６．９３　ｘ　１０Ｔ１０１１１０．０　４．３５　ｘ　１０’　／ｍ ｌこれらの結果は、Ｊｚ２　；０．８−１．０分となる様な速度の条件下でメチ レンブルーおよび光が、Ｒ１７を不活性化することを示している。

大Ｊ１賎」−：　ＡＺＴと比較した、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に対する メチレンブルーの抗ウイルス効果 メチレンブルーは、上に述べたように調製した。ＡＺＴは、ＬｉｎおよびＰｒｕ ｓｏｆｆの方法（Ｌｉｎ、　Ｔ、　−Ｓ、　ａｎｄ　Ｗ、　Ｈ，Ｐｒｕｓｏｆｆ 、　Ｌ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　２１．１０９−１１２　（１９７ｇ））を改 変した方法で、合成および精製を行った。Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ　（ＡＣＶ）は、 Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ−１ｅｌ　Ｉｃ。

ｒａｅ　Ｃｏ、より入手した。

ＩＨＶ　ウィルスの　７ ｉｎ：健康な［１１’／−１陰性血清およびＢ盟肝炎つィルス陰性血清の供血者 由来のヒト末檎血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌ、０００　ｘ　ｇで３０分間、Ｆ 　ｔｅａ　ｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅを用いた不連続密度勾配遠心分離で単離し、 リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，２：　ＰＢＳ）で二回洗浄し、そして３００　ｘ　 ｇで１０分間遠心し沈澱とした。感染の前に細胞は、１６．７　ｇ／＋１のフィ トヘマグルチニン（ＰＨＡ）および４　ｍＭの炭酸水素ナトリウムバッファーで 刺激した。

レトロウィルス：　Ｈ１’／−１（ＬＡＹ−１株）は、Ｄｒ、　ｐ、　ｐ６ｏｒ ｉｎｏ　（Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　Ａｔ １ａｎｔａ、　ＧＡ）から得た。ウィルスは、ＭｅＤｏｕｇａｌらが以前に記載 （−１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　 ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｔ ｒｏｖｉｒｕｓ。

１ｙ＋ｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ　（Ｌ ＡＹ）どＪ、　Ｉ＋ｎ５ｕｎ、　Ｎｅ上、　７６、１７１−１８３　（１９８５ ））してあるように、ＲＰＭ＋　１６４０培地を用いてヒトＰＢＭＣ中で増殖さ せた。この時培地は、ＰＨＡあるいは抗真菌剤（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）を抜き、 そして、７％（ｖ／ｖ）のインターロイキン−２（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　５ｆｌｖｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇ、　ＭＤ）、７　ｇ／ ＋ＩのＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　５ ｖｅｄｅｎ）、および３７０　Ｕ／ｍｌの抗ヒト白血球（α−）インターフェロ ン（ｒｃＮ。

Ｌｉ５ｌｅ、　ＩＬ）を添加したものである。細胞が含まれない培養上清から得 たウィルスは、計数し、使用するまでアリコートとして一７０℃で保存した。

ヒトＰＢＭＣでのウィルス　１の　：未感染のＰＨＡ−刺激１ニドＰＢＭＣを、 ２５　ａｍ２フラスコに均一に分配させ、約２　Ｘ　１０’細胞／ｍｌを含む懸 濁液５　ｍｌとした。培養物を感染させるために、適切に希釈したウィルスを添 加した。接種された逆転写酵素（ＲＴ）の平均活性は５０，０００　ｄｐｍ／ｍ ｌであり、Ｇｒｏｏｐ＋ｍａｎらの、−ｃｈａｒａｃｔｅｒｔｚａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　Ｓｅｒｕｍ　Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｔ ｈｅＨｕｍａｎ　ｒｖ＋＊ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　’／１ｒｕｓ　（Ｈｔ Ｖ）、−ＩＤＳ　Ｒｅｓ、　Ｈｕ＋ｗａｎ　Ｒｅｔｒｏ、　３．７ｌ−８５（１ ９８７）によって決められた約１００７ＣＩＤｓθに相当する。５　ｍｌの（上 記と同じものを添加した）ＲＰＭ１１６４０培地中で最終濃度の二倍の濃度にし たこの薬剤を培養物に加えた。未感染で未処理の同じ細胞濃度のＰ　ＢＭＣを、 対照として同時に培養した。培養物は感染後、加湿した５％の００２と９５％の 空気のインキニベーター中３７℃で６日間培養し、この時点で、すべての培養物 を上清のＲＴ活性を調べるためにサンプリングした。

以前の研究によると、最大ＲＴレベルはこの時点で得られる。

暉ｊロ１１−二！ゴー：各培養物からの上清の６　ｍｌを、３００　ｘ　ｇで１ ０分間で清澄にした。５ｍｌの試料を、Ｂｅｃｌｖａｎ　７０．Ｉ　Ｔｉ　ロー ターを用いて４０．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心し、ウィルス粒子をベレットと した。そして２００μｌのウィルス破砕バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ Ｉ、ｐＨ７，８，８００＋ｏＭのＮａＣ１，２０％のグリセリン、０．５ｍＭの フェニルメチルスルフォニルフルオライドおよヒ０゜５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ− １００）に懸濁したＯＲＴアッセイは、５ｐｆｒａら＜１９８７）の、　”Ｍｉ ｃｒｏｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ａｓｓａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔ ｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ｏｆ　ＬＡＹ−■ＴＬＶ−１１１／Ｌｙｍｐｈａｄ ｅｎｏｐａｔｈｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｖｉｒｕｓ、−Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　 Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、、　２５゜９７−９９．に記述した方法で、９６穴のマイ クロタイタープレート中で行った。５０　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７， ８，９ｍＭのＭｇＣｈ、５　ｍＭのジチオスレイトール、４．７　μｇ／＋１の （ｒＡ）ｎ　・（ｄＴ）ｔ２−ｔｓ、１４０ｇＭのｄＡＴＰおよび０．２２μＭ の［３Ｅｌｌ　ＴＴＰ　（比活性？８．ＯＣｉ／ｇｍｏＬ１７．３００　ｃｐｍ ／ｐ＋ｏｏｌに相当する；ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｂ ｏｓｔ。

ｎ、　ＭＡ）を含む反応混合物を各ウェルに加えた。試料（２０μｌ）を反応混 合物に加え、３７℃で２時間インキュベートした。０゜４５ｍＭ１：’ロリン酸 ナトリウムを含む１０％のトリクロル酢酸（ＴＣＡ）１００μｍを加えることに より反応を停止させた。沈澱した酸性−不溶の核酸は、５ｋａｔｒｏｎの半自動 ハーベスタ−を用いてガラスフィルター上に回収した。フィルターは、５％のＴ ＣＡおよび７０％のエタノールで洗浄し、乾燥後、シンチレーシコンバイアルに 入れた。４ｍｌのシンチレーシゴン液（Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒ、　ＭＥＮ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）を加え、そしてＰ ａｃｋａｒｄ　Ｔｒｆ−Ｃａｒｂ液体シンチレーシロン分析機（モデル２，０Ｏ ＯＣＡ）を用い、各試料の放射活性の量を測定した。この結果は、元の清澄化し た上清１　ｍｌに対するｄｐ＋ｅ／ｍ　１で表しである。以上記述したＰＢＭＣ 中の抗旧ｖ−１アッセイの方法が、最近発表された（ＳｃｈｉｎａｚｔらのＡｎ ｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａ　ｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、、　３２．１７１１ ４−１７８９．　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１９８８を参照）。

□：ローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ、　８５０　ｃ＋ｍ２）中の融合性のＢＥｐ −２細胞を、０．０１　ＰＰＵ／ｃｅｌｌの多重度で（不完全なウィルスの産生 を最小化するため）感染させた。２時間の吸収期間の間、吸収バッファー（１％ の新生仔牛血清および０．１％のグルコースを含む１０　ｍｌのＰＢＳ）で希釈 したウィルス接種物に細胞を曝した。

次にウィルス接種物を取り出し、２％の不活性化した新生仔牛血清、ペニシリン （ｔｏｏ　Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍ１）（Ｐおよ びＳ）、炭酸水素ナトリウム（２ｇ／ｌ）、および、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）を 含む、Ｈａｎｋｓ　・の最小必須培地（ＭＥＭ）　（保持培地）に移した。この 感染細胞は、３７℃で、細胞がカルチャーボトルのプラスチック表面から簡単に 振り落とせる様になるまで、３日から４日間培養した。細胞を遠心分離により回 収し、少量の使用済みの培養液に懸濁（２ｘ　１０’細胞につき５＋ｍ１）Ｌ、 氷上で１分間、３回超音波処理した。破砕された細胞は、遠心し、（４℃で２， ０００　ｇ、　１５分間）、ざらに上清は、同量の無菌のスキムミルク（安定化 剤として）で希釈し、この液を一７０°Ｃで凍結した。

＋（ＳＶプラーク°１１アッセイ：６穴プレート中の融合直前のベロ（アフリカ ミドリザル）細胞を、ｌウェル当り１００から２００のプラークができる様に、 吸収バッファーで希釈した１００μｍウィルスで感染させた。次にプレードパを ３７℃で、１５分毎に間欠的に揺すりながら１時間インキュベートした。接種物 を吸引し、複製用のウェル中へ、異なる濃度の（保持培地に溶解した）化合物を 加えた。これらのアッセイのために、０．１％のプールしたヒトガンマグロブリ ンを培地に含ませた。このプレートを、５％のＣＯ２と９５％の空気のインキュ ベーターに入れ、プラークを４８時間成長させ、固定（緩衝化した１０％のホル マリン、酢酸）、染色（２０％のＥｔＯＨ／Ｈ２０に溶解した０、５％クリスタ ルバイオレット）および計数を行った。阻害の程度（対照のプラークに対する％ ）は、異なる薬剤希釈でのプラークカウント数の平均として計算した。薬剤の抗 ウイルス能力は、ウィルスの対照培養に比ベブラーク数が５０％減少するのに必 要な薬剤濃度である、ＥＤｊ、を測定することにより決定した。抗ウイルス薬剤 のルーチンのスクリーニング用には、我々は、ＥＩＳＶ（のＦ株およびｌ５Ｖ− ２のＧ株を用いた（Ｅｊｅｒｃｔｔｏ、ら−Ｃｈａｒａｃｔｅｒｆｚａｔｉｏｎ 　ｏｆ　Ｈａｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕｓ　５ｔｒａｉｎｓ　Ｄｉｆ ｆｅｒｉｎｇ　ｉｎ　Ｔｈｅｉｒ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎＳｏｃｉａｌ　Ｂｅｈａ ｖｉｏｒ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｅｄ　Ｃｅ１１ｇ、”Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏ ｌ、２．３５７−３６４　（１９５８）を参照）。ＨＳＶノブラーク形成用には 、（線維芽細胞の様なヒト細胞株よりもむしろ）ベロ細胞が用いられた。

これらの細胞は、インターフェロンを誘導しないためである。

Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＡＣＶ）は、ＨＳＶ研究用の陽性対照として用いられた。

１胞ｍλ旌豆 ベロ　アフリカミドリザル　に・ける　：成長培地（２，５ｍ１）中のＶｅｒｏ 細胞を、細胞融合の１７１０に相当する濃度で、試験条件下の各化合物と共に、 ２５　ｃ＋ａ２のフラスコ（Ｆａｌｃａｎ）二つに加えた。３７°Ｃで、５％の ＣＯ２と９５％の空気中で２４時間インキュベートした後、２．５　ｍｌの成長 培地に溶かした試験化合物（最終の２倍濃度）を加え、そして二つのフラスコの 培地を傾斜法により素早く除くことにより収穫し、３　ｍｌのＰＢＳで一回洗浄 し、次に３ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ（０，１２５％１０．０２％）と共に３ ７℃で５分間インキュベートした。フラスコから移した細胞は、一般的に凝集し ており、懸濁液をフラスコの表面に対して繰り返し力強くピペッティングするこ とにより、分散させた。良（分散された細胞懸濁液１　ｍｌに対して、０．２ｍ ｌのトリバンブルー溶液を加え、そして血球計数機を用い細胞数を計数した。引 き続く３日間毎日、上述した細胞の計数のための方法と同様にして残ったフラス コの内の二つを回収した。３Ｓ目のデータのみを示す。この方法は、以前に５ｃ ｈｉｎａｚｉらの、“Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ ｃｙｃｌｏｖｆｒ、　ａｎｄ　Ｖｉｄａｒａｂｔｎｅ　ｏｒ　！ｔｓ　５Ｈ−ｍ ｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｏｎ　Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕｓ ｅｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｎ　Ｍｉｃｅ、Ａｎｔｉｍｉ ｃｒｏｂ、　Ａ　ｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　２２、４９９−５０７　（ １９８２）に記述されている。

ＰＢＭ　およびＣＥＭ　の　アッセイ：未感染でＰＨＡ刺激したヒトＰＢＭ細胞 およびＣＥＭ細胞に対する、薬剤の潜在的毒性効果を評価した。これらの細胞は 、薬剤と共におよび薬剤なしに、６日間培養し、上述したのと同様に、一部を計 数し細胞の生存能を調べた。

１１ニエエエ：酵素の調製法および使用したアッセイ条件は、最近５ｃｈｉｎａ ｚｔらのＡｎｔｔｍｉｃｒｏｂ、　Ａ　ｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　３３ ゜１１５−１１７　（１９８９＞ｌｉ：記述された。　ＨＩＭ−Ｉ　ＲＴおよび 細胞１７）ＤＮＡポリメラーゼαは、常法（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ、　Ｂ、、らのＡ ｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａ　ｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、、　３１．６００ −６０４．　（１９８７）；Ｆｕｒｍａｎ、らの、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３．８３３３−８３３７．　（ １９８６）；Ａｂｒｅｌｌ、らの、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１２．４３１−４３ ９．　（１９７３））により感染させた、および未感染の、Ｐ）ＩＡ−刺激した ヒｌ−ＰＢＭ細胞から単離した。

アッセイ：反応混合液（１００μｍ）は以下のものを含む：ＲＴ　ＤＮＡ肚り工 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，０１００ｍＭ　１００　＋＊ＭＫＣ１５０ｍＭ　 −− ＭｇＣ１２２ｍＭ　６　ｍＭ ＤＴＴ　５　ｍＭ　５　ｍＭ ＢＳＡ　４００　ｇ／＋１　４００　ｇ／■１［３旧ｄＴＴＰ （Ｓｐ、ａｃｔ、８２．３　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）　１　μＭ　１　ｕＭｄＡＴＰ、 　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ　１０ＧμＭポリ（ｒＡ）−オリゴ（ｄＴ）＋２−＋ｓ 　３　μｇ／ｍｌ　＋＋活性化ＤＮＡ　２００μｇｅｍ　１ 反応は、１０μｍの精製した酵素の添加により開始され、表示した時間、３７℃ でインキコベートし、ＥｒｆｋｓｓｏｎらのＡｎｔｉｍ１ｃｒｏｂ、　Ａ　ｅｎ ｔｓ　Ｃｈｅ＋ａｏｔｈｅｒ、、　３１．６００−６０４　（１９８７）に記述 しである様に処理した。

５０％　Ｂ　Ｍｅｄｉａｎ−Ｅｆｆｅｃｔ　Ｍｅｔｈｏｄ　：５０％効果式（Ｃ ｈｏｕ、　Ｔ、。

らの＋Ｑｕａｎｔｔｔａｔｉｖｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｄｏｓｅ−Ｅｆｆ ｅｃｔ　Ｒｅ１ａｔｉｏｎｓｈｆｐｓ：　Ｔｈｅ　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　Ｅｆｆｅ ｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｄｒｕｇｓ　ｏｒ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｈｉ ｔ＋ｆｔｏｒｓ、”　Ａｄｖ、　Ｅｎｚ、　Ｒｅ　ｕｌ、、　２２．２７−５５ 　（１９８４））を用いてデータを解析することにより、ＥＣ５ａ値およびＩＣ ５ａ値を得た。

葭！ チアジン染料メチレンブルーの、細胞の成長および増殖に及ぼす効果を、Ｐ　Ｂ Ｍ、ベロ細胞およびＣＥＭ細胞の培養物を用いて試験した。光が有る場合とない 場合の両方について、ＭＢの細胞障害性をＡＺＴの細胞障害性と比較した。ＭＢ の抗ウイルス効果も、旧Ｖ−Ｌ、ＵＳ　Ｖ−１およびｌｌ５Ｖ−２を用いて調べ た。細胞障害性および抗ウイルス性に関する試験の結果を組み合わせて、表３に 示す。

（以下余白） 表立：チアジン染料：メチレンブルー、トルイジンブルー０１アズールＡ１　ア ズールＢおよびチオニンとＡＺＴおよびＡＣＶを比較したｌ（［ＶおよびＨＳ’ ／に対する抗ウイルス性および細胞障害性の一覧 処理　抗ウイルス効果　細胞障害性 ＡＺＴ　０．０００２２　＞ｌｏｏ　＞１００　７４．１５　３９．５　５６． １ａ、ＰＢＭＣは、６日間薬剤に曝した後、トリパンブルー排除試験を行い計数 した。未処理の培養物は、２．０６　ｘ　１０５細胞／ｍｌであった。

ｂ、　ベロ細胞は、薬剤に４日間曝した後に計数した。

未処理の培養は、３．３２　ｘ　１０５細胞／ｍｌであった。

ｃ、ＣＥＭ細胞は、薬剤に４日間曝した後に計数した。

未処理の培養物は、１．４９　ｘ　１０５細胞／ｍｌであった。

大Ｊｌ舛」−：メチレンブルーによるＨ１’／の不活性化を定量すルタめのＰ２ ４の測定 抗ウイルス薬剤としてのメチレンブルーの有効性を、別のアッセイ方法を用いて 、さらに示した。以前の実施例が、ＲＴ活性を測定したのに対して、本実施例は 、抗ウイルス有効性の指標として、ウィルスのタンパク質（Ｐ２４）の直接定量 を利用するＯ 末梢血単核細胞（ＰＢＭ）を、ＨＩＶに感染させ、前述のようにメチレンブルー で処理した。ウィルスの被覆タンパク質Ｐ２４の酵素免疫測定アッセイからＥＣ ５ｅのレベルを計算した。Ｐ２４特異ＥＩＡキットは、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｓ 、から購入した。実施例３の様に、メチレンブルーの有効性をＡＺＴと比較し、 結果を表４に示す。

紅：　ＥＩＡ（Ａｂｂｏｔｔ　Ａｇ　Ｋｆｔ）によるＰ２４レベルの測定に基づ （ヒトＰＢＭＣ中）ｔｌｌＶ（ＬＡＹ−１）に対するＭＢの効果未感染対照　− ０，１ 感染対照　３３６．０ 、Ｑｆｉｉ：単離されたＤＮＡポリメラーゼαおよび旧Ｖ逆転写酵素に対するメ チレンブルーの効果 二つのＤＮＡ合成酵素、ＨＩ’／の逆転写酵素（ＲＴ）および仔牛胸腺のＤＮＡ ポリメラーゼα（ＣＴ　ａ　ｐａｌ＞に対するメチレンブルーの効果も調べた。

その結果は、逆転写酵素を介するＤＮＡ合成の阻害にＭＢが効果的であることを 明瞭に示している。表５に示したように、ＤＮＡポリメラーゼαが行うＤＮＡ合 成を阻害するためには、さらに１０倍のＭＢを必要とする。

！Ｌｉ：光の存在下および非存在下での旧’／−１の逆転写酵素（ＲＴ）および 子牛胸腺のＤＮＡポリメラーゼに対するＭＢの効果酵素　ＩＣｓ日（Ｍ） ＨＩＶ−Ｉ　ＲＴ　９．２　１０．０ ＣＴαｐｏｌ　１２５　１０５．　Ｌ 支敷匠立：　ローズベンガルおよびエオシンＹの抗ウイルス活性キサンチン染料 の抗ウィルス活性を、メチレンブルーおよび他のチアジン染料の場合と同じ試薬 およびアッセイ法を用いて試験した。

！＝光存在下でのローズベンガルのＥＣ５ｓは１．４１μＭで、光の非存在下で はＥＣｓθは２．３８μＭであった。光存在下でのエオシンＹのＥＣ５ｓは１０ ０μＭ以上で、先非存在下でのＥＣ５ｅは１０μＭ以上であった。

及血−二：　ローズベンガルおよびエオシンＹのベロ（アフリカミドリザル）細 胞に対する細胞障害性 牛サンテン染料の細胞障害性を、チアジン染料に用いたのと同じ試薬とアッセイ でペロアフリカミドリザル細胞について調べた。

柾困：培養物の中の未感染のベロ細胞の成長に対する化合物の影響を、正常な生 存能力のある細胞に対する試験化合物の細胞障害性の指標として用いた。ＩＣ５ ａとは、正常な未感染の細胞の成長を５０％阻害する化合物濃度である。ローズ ベンガルは、ｒｃｓ＠が１５８μＭで、エオシンＹはＩＣ５ａが２００μＭより 多いと測定された。

、！ｎｕ−：末梢血単核細胞に対するローズベンガルおよびエオシンＹの細胞障 害性 ローズベンガルおよびエオシンＹの、未感染のマイトケン刺激した末梢血単核細 胞（ＰＢＭ）（３，８ｘ　１０５細胞／＋ｇｌ）に対する潜在的な毒性効果を、 チアジン染料について記述したのと同じ方法で評価した。

■：ベロ細胞のアツセイでは、ローズベンガルおよびエオシンＹの１ｃｓｅは、 培養されたＰＢＭ細胞中で測定された。ローズベンガルのＩＣｓのは２００μＭ より多く、エオシンＹのｒｃｓｓは１００μＭより多かった。

′ＭＪＬＩ！ＬＬ：薬剤組成物の調製 本願に記載のｉｎ　ｖｉｖｏにおけるｔｉｌＶ感染を阻害するための方法では、 約２０から２００μＭの血中濃度をつくりだす範囲での投与を必要とする。この 濃度にするために、染料は、当業者に既知の薬剤運搬方法を使用して運搬され得 、特定細胞型に標的付けられるかまたはその活性が向上する。

染料の好ましい運搬経路は、経口投与である。薬剤組成物中の活性化合物の濃度 は、活性化合物の吸収率、不活性化率、排出率および当業者に既知の他の要因に 依存し得る。投与値はまた、緩和させる症状の程度に応じて変化し得ることに留 意するべきである。さらに、特定の被検体に対しては、個体の必要性および組成 物の投与を行うかまたは管理する人の専門的な判断に応じて、特定の投与形態が 時間をかけて調節されなければならず、本願に記載の濃度範囲は、例示的なもの で、請求の範囲にある組成物の範囲または実施を限定するものではないことが理 解されなければならない。活性成分は、一度に投与されても、または時間間隔を 変化させながら少量ずつ分割して投与されてもよい。

経口組成物は、一般に、不活性希釈物または可食性担体を含み得る。これらは、 ゼラチンカプセルに封入され得るかまたは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の 目的で、活性化合物は、賦形剤と併用され、錠剤、トローチ剤またはカプセルの 形態で使用され得る。薬学的適合性のある結合剤および／または補助物質も組成 物の一部として含有され得る。

錠剤、欠削、カプセル、トローチ剤等は、以下の成分または同様の性質を持った 化合物であればいずれのものでも含有し得る：微結晶セルロース、トラガカント ゴムまたはゼラチン等の結合剤、デンプンまたはラクトース等の賦形剤、アルギ ン酸、ブリモゲル（Ｐｒｆｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ等の崩壊剤、ス テアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）等の潤滑剤、コ ロイド状の二酸化珪素等のすべり剤、スクロースまたはサッカリン等の甘味剤、 あるいはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料等の香味剤。

投与単位形態がカプセルである場合には、上記のタイプの物質の他に、脂肪油等 の液体キャリアが含有され得る。さらに、投与単位形態は、投与単位の物理的形 態を改変するその他の様々な物質、例えば、砂糖、セラックまたは他の腸溶性剤 のコーティングも含み得る。化合物はまた、エリキシル、懸濁液、シロップ、カ シ二剤、チューイングガム等の成分としても投与され得る。シロップは、活性化 合物の他に、甘味剤としてのスクロース、特定の防腐剤、染料、着色剤および香 味剤を含み得る。

活性物質はまた、望ましい作用を損なわせない他の活性物質、あるいは抗生物質 、抗真菌薬、抗炎症剤または他の抗ウィルス性スクレオシド化合物または抗がん 性化合物を含む、他の抗ウイルス物質等の、望ましい作用を補う物質と混合され 得る。

経口投与は、好ましい運搬経路であるが、その他に、特異的な標的に染料を運搬 させる有効な方法がある。例えば、染料は％Ｅｄｅｌｓｏｎら、Ｎｅｗ　Ｅｎ　 １ａｎｄ−ムニＭｅｄ、３１６．２９７−３０３　（１９８７）に記載のかん治 療のための光活性薬剤の投与を使用する方法等の、当業者に既知の方法を使用し て静脈投与され得る。

染料は、ＡＩＤＳ患者におけるＨＩＶ濃度が高い部位である、マクロファージに 特異的に投与され得る。リポソーム運搬等の方法は、約０．１から１０μＭの牛 サンテン染料の有効な細胞内濃度をつ（るために使用され得る。リポソームにつ いては、一般に、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｄｒｕ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｉｎ 　Ｂｉｏｌｏ　ａｎｄ　Ｍｅｌｃｔｎｅ　Ｃｈ、１４．２８７−３４１．　（Ａ ｃａｄｅｍｆｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　１９７９）に記載されている。光感受 性リポソームを製造する方法については、Ｐｉｄｇｅ。

ｎら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｔ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ　３７．４９１−４９４　（１ ９８３）に記載されている。リポソーム組成物は、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ、Ｉｎｃ、、　Ｐｒｆｎｃｅｔｏｎ、　ＮＪ等の会社から市販されている 。マクロファージに摂取されたリポソームからの化合物の放出については、Ｓｔ ａｒｍら、Ｂｉｏｃｈｊｍ、　Ｂｔｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ　９６５．１３６− １４５　（１９８ｇ）に記載されている。

あるいは、染料は、放出制御ポリマー性インブラントを使用して、長時間かけて 、患者に連続して投与され得る。ポリマー性インブラントは、一般に、既知の期 間で、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて分解する重合体から製造され得る。有用な重合体 としては、ポリ酸無水物、ポリ乳酸、ポリオルジエステルおよびビニル酢酸エチ レンがある。これらの素子もまた、市販されているｏ　Ａｌｚａ　ｃｏｒｐｏｒ ａｔｔｏｎ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔａ、　ＣＡおよびＮｏｖａ　Ｐｈａｒｍａｃｅ ｕｔｆｃａｌｓ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　ＭＤは、生分解性で、放出制御ポリ マー性素子を製造および販売している。

Ｋ１五工０　：　ｉｎ　ｖｔｔｒｏにおける抗ウィルス剤の適用本願に記載のＨ ｒＶ複製を阻害するための組成物は、実験室および研究目的で使用されている血 液製剤からウィルスを精製し除去するために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて適用さ れ得る。この適用によって、実験作業者が、致命的なウィルス感染にさらされる 潜在的な危険が減少する。

染料はまた、２００ｇＭより多くの濃度で、洗浄剤および殺菌剤溶液にも取入れ られ得る。

キサンチン染料を含有する組成物を使用して旧Ｖのような特異的ウィルスを選択 的に、制御された様式で阻害するための組成物およびその使用方法の改変および 変更は、上記の詳細な説明から当業者により自明であろう。このような改変およ び変更は、添付の請求の範囲内にあるものとする。

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞中のウイルスの複製を阻止する方法であって、キサンチン染料およびチ アジン染料からなる群より選択される染料を、薬学的に許容される担体中に保持 し、細胞内のウイルスの複製を阻止するのに有効な量提供する工程、を含む、方 法。
2. ２．前記キサンチン染料が、フルオロンまたはヒドロキシキサンテン化合物であ る、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記キサンテン染料が、ローズベンガルおよびエオシンＹ、およびこれら組 み合わせ、およびこれらの誘導体からなる群より選択される、請求項２に記載の 方法。
4. ４．前記チアジン染料が、メチレンブルー、トルイジンブル−０、アズールＡ、 アズールＢ、アズールＣ、およびこれらの組み合わせ、およびこれらの誘導体か らなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
5. ５．前記染料が、エオシンＹおよびローズベンガルからなる群される請求項１に 記載の方法であって、さらに、約０．１から１０μＭの間の細胞内濃度となるよ うな量の染料を含む溶液を、ウイルスに感染した細胞に提供する工程を含む、方 法。
6. ６．前記染料が、メチレンブルー、エオシンＹおよびローズベンガルからなる群 より選択される請求項１に記載の方法であって、 さらに、約２０から２００μＭの間の血中濃度となるような量の染料を、患者に 投与する工程を含む、方法。
7. ７．さらに、前記染料を非イオン化性の放射との組み合わせで提供する工程を含 む、請求項１に記載の方法。
8. ８．前記染料が経口的に投与される、請求項１に記載の方法。
9. ９．前記染料が静脈注射により投与される、請求項１に記載の方法。
10. １０．さらに、前記染料を放出制御ポリマー性インプラントに内含させて提供す る工程を含む、請求項１に記載の方法。
11. １１．さらに、前記染料をリボソームとの組み合わせで提供する工程を含む、請 求項１に記載の方法。
12. １２．さらに、前記染料を、抗生物質、抗炎症剤、抗菌剤、および抗ウイルス剤 からなる群より選択される化合物との組み合わせで提供する工程を含む、請求項 １に記載の方法。
13. １３．前記染料が、メチレンブルー、エオシンＹおよびローズベンガルからなる 群より選択される、請求項１に記載の方法であって、 さらに、ｉｎｖｉｔｒｏで使用する目的で２００μＭより多い濃度の染料を溶液 として提供する工程を含む、方法。
14. １４．患者の処置のための抗ウイルス組成物であって、チアジン染料およびフル オロンキサンテンまたはヒドロキシキサンテンおよびこれらの組み合わせおよび これらの誘導体からなる群から選択される染料を提供する、桑学的に許容される 担体を含み、約２０から２００μＭの間の血中濃度にさせる、組成物。
15. １５．前記キサンチン染料が、ローズベンガルおよびエオシンＹおよびこれら組 み合わせおよびこれらの誘導体からなる群より選択される、請求項１４に記載の 組成物。
16. １６．前記チアジン染料が、メチレンブルー、トルイジンブルー０、アズールＡ 、アズールＢ、アズールＣ、およびこれらの組み合わせ、およびこれらの誘導体 からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
17. １７．前記担体システムが放出を制御するポリマー性のインプラントである、請 求項１４に記載の組成物。
18. １８．前記染料が経口的に投与するための担体中に存在する、請求項１４に記載 の組成物。
19. １９．さらに、抗生物質、抗炎症剤、抗菌剤、および抗ウイルス剤からなる群よ り選択される化合物を含む、請求項１４に記載の組成物。
20. ２０．ウイルス感染細胞のための抗ウイルス組成物であって、 チアジン染料およびキサンチン染料およびこれらの組み合わせおよびこれらの誘 導体からなる群から選択される染料を提供する、薬学的に許容される担体を含み 、約０．１から１０μＭの間の細胞内濃度にさせる、組成物。
21. ２１．前記前記チアジン染料が、メチレンブルー、トルイジンブルー０、アズー ルＡ、アズールＢ、アズールＣ、およびこれらの組み合わせ、およびこれらの誘 導体からなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
22. ２２．前記キサンチン染料が、ローズベンガルおよびエオシンＹからなる群より 選択される、請求項２０に記載の組成物。
23. ２３．抗ウイルス組成物であって、 キサンチン染料およびチアジン染料からなる群から選択される染料を、清浄液、 抗バクテリア溶液、抗菌溶液、および生物学的溶液からなる群から選択される溶 液と組み合わせて含有する、組成物。
24. ２４．前記生物学的溶液が、血液由来である、請求項２３に記載の抗ウイルス組 成物。