JPH045226A - 表面修飾可能なリポソームおよび表面修飾されたリポソームの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野］ 本発明に、薬物運搬体、免疫分析試薬などに用いられる
表面修飾可能なリポソームと表面修飾されたリポソーム
の製造方法に関する。

（従来の技術） 近年、医学・薬学分野において正常な細胞や組織には影
響を与えず、患部となついてる細胞や組織に選択的に薬
物全運搬し、薬効を発現させる手法（ドラッグデリバリ
−システム、ＤＤＳ　）が検討されている。

これを達成する方法として、リポソームに親水性あるい
は脂溶性の薬効を担持させ、表面にたんばく質、抗原、
抗体、糖（多糖金倉む）等を固定化した表面修飾リポソ
ームが検討されている。

〔キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ、Ｒｅｓ、）第≠
３巻、１３λ１頁、ｌり１３年、同誌、見！、亨ダ７／
（／り１７）、リポソーム　リサ・−チ（Ｌｉｐｏｓｏ
ｍｅ　Ｒｅｓ、）、　＠／巻、ｉｓ頁（ｌりｒｔ−ｔり
年）〕 一万、リポソームは不安定であり、特に生体内投与にお
ける網内皮糸に存在する貧食細胞による貧食あるいは、
血中からの消失が非常に速いことが問題である。これら
の解決法として、特開昭６Ｊ−Ｊ／３７コ弘号には多糖
誘導体によってリポソーム表面を修飾する方法が開示さ
れている。

さらに臨床検査や免疫学の分野において、生理活性物質
、免疫活性物質（抗体、抗原を含む］等をリポソーム表
面に固定化した表面修飾リポソームを用いる種々の分析
法が開示されている〔特開昭４７−２１０１！ｒ号、特
開昭４７−１≦２６Ｊ号、特開昭４０−／３１≠４を号
〕。

リポソームの表面を修飾する方法としては、代表的な方
法として、Ｎ−Ｊ−（２−ジチオピリジルコプロピオニ
ル　ホス７アチジルエタノールアミン（ＤＴＰ−ＰＥ）
にＮ−スクシンイミジルー３−（λ−ピリジルジチオ）
プロピオネート（８ＰＤＰ）で活性化したたんば（質等
を結合する方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、＄２１
１巻、４０２頁、／　Ｐ１０年〕や、架橋剤を用いる方
法（架橋剤としてμＮ−スクシンイミジルー＋　−（ｐ
−マレイミドフェニル）ブチレート（８ＭＰＢ）、Ｎ−
スクシンイミジル−≠−（ｐ−マレイミドフェニル）ア
セテート（８ＭＰＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−４’−
（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート（８ＭＰＰ
　）等が知られている）〔ジャーナル　オブ　バイオロ
ジカル　ケミストリー（Ｊ、　　　Ｂｉｏｌ、　　　Ｃ
ｈｅｍ、　　ン、　＠Ｊ　　７　７　巻、　−２１４頁
、ｌりｒλ年等〕が挙げられる。

リポソーム表面への基質の固定化の他の方法としては、
リポソーム調製時に予め楯脂質等を混合しておき、その
糖を酸化することによりアルデヒド基金生成させこれと
たんばく質等のアミノ基とを反応させシッフ塩基金形成
させる方法〔バイオヒミカ　アト　バイオフイジヵ　ア
クタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ−Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ、）
、第ｔＵＯ巻、ぶ４頁、／９１／年等〕やたんばく質等
に疎水性基を導入して、別途調製したリポソームに組み
込む方法〔バイオ辷ミカ　アト　バイオフイジヵ　アク
タ（Ｂｉｏｃｈｊｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ａｃｔａ）。

第ｒｉｘ巻、１１４頁、７９！！年等〕がある。

しかしながら、これらの方法は段階数が多く、複雑であ
り、容易にリポソーム表面に基質を固定化し修飾する方
法の確立が本分野において必要性の高い課題となってい
る。

一万、有機合成化学の分野において３−アシルチアゾリ
ジン−コーチオンを用いた、カルボン酸誘導体を還元し
て収率よくアルデヒドを製造する方法〔特開昭７４Ｌ−
７２２７１、ケミストリーレターズ、（Ｃｈｅｍ、Ｌｅ
ｔｔ、）、１ａａ３頁、ｌり７７年〕や、選択的にアミ
ドを製造する方法〔テトラヘトｏｙ　　レターズ（Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ−）、第２１巻、１１０１
頁、１ｙｔｏ年、ヘテロサイクルズ（Ｈｅｔｅｒｏ　　
ｃｙｃｌｅｓ）、第７７巻、！３７頁、／りｔ２年〕お
よびチオエステル金製造する方法〔ジャーナル　オプ　
ケミカルリサーチ（Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（
Ｓ）、／２１３年、２０頁〕が開示されている。しかし
３−アシルチアゾリジン−コーチオンがリポソームの表
面修飾試薬として用いられた例はない。

また、高分子化学の分野において、コ（３Ｈ）−ベンゾ
オキサシロン、２（ＪＨ）−ベンゾチアゾロンを脱離基
にもち、化学選択的にアミドを形成する活性化剤〔有機
合成化生協会誌、第≠を巻。

ハリ頁、／りｔり年、ブリティン　オブ　サケミカル　
ンナイアテイ　シャラミン　Ｂｕｌｌ。

Ｃｈｅｍ−８ｏｃ、　　Ｊｐｎ、、第ｚｔ巻、３２り１
頁、／　ｆ　Ｉ　７年、マクロモレキュルズＭａｃｒｏ
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　、第１１巻、２３１３頁１ｙｔｚ
年〕が開示されている。

しかし、これらの脱離基ヲ有したアミド化合物がリポソ
ームの表面修飾試薬として用いられた例にない。

（発明が解決しようとする課題〉 従って１本発明の目的に従来法の問題点を解決し、リポ
ソーム表面にはプチド（アミノＩ１２を含ｔｒ　）、た
んば（質（抗原、抗体を含む）、糖（多糖を含む）等の
種々の基質を固定化した表面修飾リポソームを容易に製
造する方法を提供すること、および穫々の基質を固定化
した表面修飾リポソームを提供することである。

（課題を解決するための手段） 本発明の目的に、 （１）下記、一般式ＣＩ）で示される化合物とリポソー
ム形成可能な脂質から構成されること′ｆＩ：特徴とす
る表面修飾可能なリポソーム （Ｒ１に疎水性基を示す、Ｒ，２、Ｒ３は有機基（Ｈｔ
−含む）を示す＠　”２　ｓ　”３に互いに連結して環
又は二重結合を形成してもよい。Ｘ、Ｙに酸素原子また
に硫黄原子を示す； （２１（１）記載の表面修飾可能７ｒ　リポソームとア
ミノ基及び／又にチオール基金有する基質を混合するこ
とを特徴とする表面修飾されたリポソームの製造方法； （３）　　（１）記載の一般式１”Ｉ）で表される化合
物の少なくとも７株とアミノ基及び／又にチオール基ｔ
−Ｗする基質を結合させて得られた化合物とリポソーム
形成可能な脂質を混合することを特徴とする表面修飾さ
れたリポソームの製造方法；によって連成された。

本発明に言いかえれば、リボンームニ分子膜中に一般式
ＣＩ）で示される長鎖活性アミド、を埋め込んだリポソ
ームを用いて、アミノ基あるいにチオール基を有した基
質をリポソーム表面に固定化すること、および一般式Ｃ
Ｉ）に示される長鎖活性アミドとアミノ基あるいにチオ
ール基ｔ−Ｗした基質を反応させ長鎖基ｔＶした基質誘
導体とし、これｆ　リポソーム形成脂質と混合してリポ
ソームを形成することを骨子とするものである。

本発明の表面修飾リポソームの形成法について説明する
。

第一の方法はリポソーム構成素材に一般式〔Ｉ〕で示さ
れる長鎖活性アミドを混合してリポソームを調製する。

本発明第一の方法に係るリポソームの構成素材としては
ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリ
ンを除く既存のリポソームの製造法において用いられる
脂質が挙げられる。（例えば、卵黄レシチンや大豆レシ
チン等の天然レシチン、ジ／ξルミトイルホスファチジ
ルコリン（ＤＰＰＣ）、　　シミリストイルホス７アチ
ジルコリン（１）ＭＰＣ）、ジステアロイルホス７アテ
ジルコリン（］）８ＰＣ）、ジオレイルホス７アチジル
コリン（ＤＯＰＣ）、　　ジパルミトイルホス７アチジ
ルグリセロール（ＤＰＰＧ）、シミリストイルホスファ
チジン酸（ＤＭＰＡ）等が挙げられる。） 尚、用いられる脂質に一種類でも二穫類以上でもよい。

また、コレステロール類等との混合系でもよい。また、
脂質、コレステロール類以外のものを混合してもよい。

本発明第一の方法において、一般式ＣＩ）で示される長
鎖活性アミドの全リポソーム構成素材に対するモル比は
、リポソームが構成可能な範囲ならば自由に選択できる
が好ましくは！ＯＳ以下、さらに好ましくはＪ！チ以下
がよい。

本発明第一の方法に係るリポソーム調製法としてはポル
チックスイング法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相
蒸発法ＣＲＥＶ法）、エタノール注入法、エーテル注入
法、プレーベシクル法（Ｐｒｅ−Ｖｅｓｉｃｌｅ法）、
フレンチプレス押出法、エクストルージョンＣＥｘｔｒ
ｕｓｉｏｎ法）、アニーリング法（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
法）、凍結融解法、Ｗ１０／ＷエマルジＨ７法、さらに
８ｔａｂｌｅＰｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ　　ｒｅｓｉ
ｃｌｅ法（５ＰＬＶ法）〔バイオケミストリー（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２！巻、２Ｉｌ１頁、ｌりｉ
ｓ年〕、等の通常の方法がすべて挙げられる。

これらのリポソーム調製法に関しては、Ｐａｐａｈａｄ
ｊｏｐｏｕｌｓらによる総貌［Ａｎｎ。

Ｒｅｖ−Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇ、、第２巻、４
１７頁、１ｙｒｏ年〕、野島、抄本、弁上らによる底置
〔リポソーム、ｐｐ、２／−参〇、南江堂（ｌりｒｔ）
）に記数されている。

本発明第一の方法、に係るリポソームに内包可＃：な化
合物とじては各種薬剤、抗生物質１色素、螢光性物質等
が挙げられる。

以上のように調製した表面修飾可能７Ｚ　Ｑボソーム分
散液にアミノ基あるいはチオール基ｔＷする基質、また
は基質溶液を加え静置あるいに振とうすることにより基
質をリポソームに固定化した表面修飾リポソームを製造
できる。

本発明第一の方法に係る固定化する基質としてはアミノ
基あるいにチオール基ｔ−有していればよい、好ましく
に、アミノ基含有した基質がよい。

これらの基質としては例えばオキシトシン、バンプレシ
ン、甲状腺刺激ホルモン分泌ホルモン（ＴＲＨ）等の生
理活性はプチド、ホルモン等のはブチド（アミノ酸を含
む）、例えば、ＩｇＱ。

ＩｇＥ、ＩｇＭ等の免疫グロブリン等の抗原、ガン胎児
性抗原（ＣＥＡ）、膵ガン胎児性抗原（ＰＯＡ）、　α
−７エトプロテインモ７クローナル抗体、免疫グロブリ
ンモノクローナル抗体、牛血清アルブミン（Ｂ８Ａ）等
のたんばく質、例えばグルコサミン、ガラクトサミン等
の糖（多Ｓｔ−含む）等が挙けられる。

本発明第一〇方法における表面修飾可能なあるいに表面
修飾されたリポソームの精製に通常の方法により行なう
ことができる。例えばセファデックス、セファローズカ
ラムによるゲルろか法、遠心分離法、透析法が挙げられ
る。

第二の方法は、本発明第一の方法で述べたアミン基ある
いにチオール基含有した基質と一般式ＣＩ）で示される
長鎖、活性アミドを有機溶媒中あるいは水、緩衝液中に
て、混合して長鎖基ヲ有した基質誘導体とする。これを
精製した後にリポソーム構成素材に混合してリポソーム
を調製する。

本発明第二の方法において、リポソーム構成素材として
は、本発明第一の方法で示した他に、ホス７アチジルエ
タノールアミンやホス７アチジルセリン等を用いてもよ
い。本発明第二の方法において長鎖基を臂する基質誘導
体に対するリポソーム構成素材の比にリポソーム構成可
能な範囲で自由に撰択できるが、好ましくは！Ｏ−以下
、さらに好ましくは３！チ以下がよい。

本発明第二の方法に係るリポソーム調製法、リポソーム
に内包可能な化合物、リポソームに固定化する基質、リ
ポソームの精製に本発明第一の方法と同様である。

さらに本発明第二の方法において、リポソーム調製法に
よっては長鎖基を有した基質誘導体を精製することなし
に用いてもよい。また、基質誘導体を含んだ水、緩衝液
？　＋）ボンーム分散液としてもよい。

本発明で用いる一般式ＣＩ）で示される長鎖活性アミド
のＲ１に疎水性基を示す。Ｒ１に一本鎖でも二本鎖でも
よい。−重鎖を有する凡ｌに直鎖でも分岐でもよく、ま
た飽和でも不飽和でもよい。

さらに置換基を有していてもよい。Ｒｔｔ！疎水性基と
してコレステロール類を有していてもよい。

二本鎖ｔ−有する几ｌとしては、例えば、Ｒ５−０−Ｃ
Ｈ２ （Ｒ４、Ｒ５は炭素数ｌ−ココまでのアルキル基金示す
、凡４、Ｒ５に直鎖でも分岐でもよく、また飽和でも不
飽和でもよい、さらに置換基金有していてもよい。ｎ　
ｕ　／〜３を示す、キラル炭素に関しては光学活性体で
もラセミ体でもよい、゛）が差げられる。

一本鎖を有するＲ１に、炭素数１以上の直鎖アルキル基
が好ましく、炭素数７−以上の直鎖アルキル基がさらに
好ましい。

二本鎖を有するＲ、とじては、Ｒ４、凡５が共に炭素数
１以上の直鎖アルキル基が好ましく、更には炭素数１２
以上の直鎖アルキル基が好ましい。

一般式〔Ｉ〕で示される長鎖活性アミドの、Ｒ２，８３
は有機基（Ｈｌ−含む、）を示す。Ｒ２，Ｒ３は互いに
連結して、環（飽和炭化水素環、飽和へテロ環、芳香環
（ヘテロｆｆｉを含む）など）を形成してもよい、さら
に、二重結合を形成してもよい。

Ｒ２、Ｒ３としては、例えば、Ｈ，−ＣＨ３、−ＣＨ２
ＣＨ３，−ＱＨ，−ＣＯＯＨ，−ＣＯＯＣＨ３、−ＣＨ
２−ＯＨ，−ＣＨ２−Ｃ０ＯＨ。

Φ　　　　　Φ −ＣＨ２−ＣＯＯＣＨ３、−ＮＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）３
、Φ も、Ｈあるいに一０Ｈ１−ＣＯＯＨｌ−Ｎ（ＣＨ３）３
、−ＳＯ４基を有するものが好ましい。

Ｘ、ＹはＯまたは８を示す。好ましくはＸ＝Ｙ＝８であ
る。

長鎖活性アミドの合成に関しては、特開昭１４Ｉ−７り
２７！号；テトラヘドロン　レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、　第コ　ｌ　巻、　ｔ
４！／頁、ｌりｔｏ年；シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ）、／りｔコ年、９３３頁；マクａモレキュルズ（Ｍ
ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、第一２７巻、ｌり頁、
ｌりｔｒ年等に記載されている方法を用いて合成できる
。

以下に本発明の一般式〔Ｉ〕で表わされる長鎖活性アミ
ドの好ましい員体例を示す。しかし、本発明はこれらに
限定されるものでニナい。

−ｊ Ｉ−タ 以下に本発明の合成例及び実施例を示すが、本発明はこ
れらに限定されるものでにない。

〔合成例〕

合成例１．〈長鎖活性アミドＩ−／の合成〉（一般式（
１〕においてＲＩＣ１７Ｈ３５、Ｒ＋２＝Ｒ３＝）（％
ｘ＝ｙ＝ｓ　） ステアリンｆｌに、’＃ｔジクロロメタンｊｏＯｄに溶
解し、ジシクロへキシルカルｉジイミド（ＤＣＣ）を≠
、ｏｇＭＪえ攪拌した。３０分後に２＝メルカプトーコ
−チアゾリンコ、コｙ、ジメチルアミノゼ・、す、ジン
（ＤＭＡＰ）０．コ、ｐｔ−加えた。−昼夜放置して、
沖過し、ｐ液に水を加え有機階音ぼう硝乾燥した後ジク
ロロメタンを減圧留去した。残留物をシリカゲルクロマ
ト（＃！離液ヘキサン／ａ酸エチルー４７２　）を経て
ヘキサンによる再結晶全行ない精製して、長鎖活性アミ
ドｔ−ｉ＜一般式（１）　ＫオイテＲ１＝　Ｃｌ７Ｈ３
５、Ｒ２”’Ｒ３＝Ｈ％Ｘ冨Ｙ＝８　）　ｉ　、−ｇを
得た。

合成例２．＜長鎖活性アミドｌ−ｊの合成〉（一般式（
Ｉ）においてｈｘ＝Ｃ１３Ｈ２７、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ％Ｘ
＝Ｙ＝Ｏ） ミリスチン酸≠、ｔ９、ジクロロメタン！ｏ。

１、コーオキサゾリドン／−７ｊ９．ＤＣＣ≠。

０１、ＤＭＡＰＯ，２ｇ奮用いて合成例１．と同様にし
て長鎖活性アミドＩ−ｊ（一般式Ｃ１）において几１　
＝Ｃ１３Ｈ２７、Ｒ２＝Ｂ　３＝Ｈ，Ｘ＝Ｙ＝０）コ、
りｇを得た。

合成例３．〈長鎖活性アミドＩ−ｔの合成〉ＣＨ２ Ｒ２−−Ｃ−０−ＣＨ３（８体）、Ｒ３＝Ｈ１Ｘ＝Ｙ工
Ｓ） カルボベンゾキシ−！−グルタミン酸−０ｊ９、全テト
ラヒドロフラン３００ｎｌに溶解しＤＣＣ４Ｃ。

−Ｉを力Ｕえた。次にセチルアミン≠、ｒｐ、トリエチ
ルアミン＜ＴＥＡ）コ、／ｇｔ加え一昼夜放置した。溶
媒留去後残留物をクロロホルムに溶解し有機層を、水で
洗った後はう硝乾燥をしてクロロホルムを減圧留去した
。シリカゲルクロマト（ｆｇ離液　ヘキサン／酢酸エチ
ル＝ｒ７ａ　）により精製して、ジアルキルアミド体４
’、Ｊ＃ｔ−得た。

これ全酢酸エチルに溶解しｊ％パラジウムカーボン／、
０９ｔ−用いて加水素分解を行った。（５時間）反応液
に、セライト’を用いて、ろ過し、ろ液の酢酸エチルを
減圧留去してアミン体［１１）Ｊ。

りを得ゞ・　８体 次に、グルタル酸無水物／　、　０１１１ｋＴＨＦＩＩ
Ｃ溶解した。これに、アミン体〔■〕３．４Ｌ９、ＴＥ
Ａｏ、ｔｇクロロホルム液１００ｙｄｆ滴下した。２時
間後溶媒を減圧留去し、クロロホルムを加え。

有機層を希塩酸で洗い（水層ｐＨ＝ｊ〜ｌ）有機層をぼ
う硝乾燥して、クロロホルム全減圧留去した。残留物を
ジクロロメタン＝００ｘｌに溶解しＤＣＣ／、ｊｇを加
えて３０分攪拌した。

≠（Ｒ）−メトキシカルボニルーコーメル力ブトーーー
チアゾリｙ／　、Ｏｊｉ、ＤＭＡＰＯ、／９ｆ加えて、
−晩装置した。反応液をろ過し、ろ液を水で洗い、π機
階音ぼう硝乾燥してジクロロメタンを減圧留去した。残
留物全シリカゲルクロマト（溶離液　ヘキサン／酢酸エ
チル＝４／４’）Ｋて精製して長鎖活性アミドＩ（（一
般式ＣＩ）において Ｉ　　Ｍ ８体 Ｃ）１２ Ｒ２＝−ＣＯＣＨａ　ＣＲ体）、Ｘ＝Ｙ＝Ｓ）２．３ｇ
を得た。

〔実施例〕

実施例ｉ、＜表面修飾可能なリポソームの製造法〉１）
ＰＰＣ／ｊ■、長鎖活性アミドｌ−／（一般式ＣＩ）に
おいて、Ｒ１＝　Ｃ１０Ｈ３！ｉ、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ％Ｘ
＝Ｙ　＝８　）　２　、　ＪＭｆｋ　１ｍ１（Ｄ／　ａ
　ａ＊ルムに溶解した後ロータリーエバポレーターニヨ
リ溶媒留去し薄膜を形成させた。これを減圧で乾燥した
後に、Ｒ２０、ｊＷＬｌを加えｔｏ　０ｃの水浴に／分
間静置、ポルテックスミキシングで１分間振とうを交互
に３回行った後プローブ型ンニケーターを用いて超音波
照射を行った。（コｊＷ、３分間）次にセファローズ弘
Ｂカラムを用いてゲルろかを行い表面修飾可能なリポソ
ーム金得た。（Ｔｃ４ｔ１０Ｃ１平均粒径ｊｊ０ｎｍ） 実施例２．＜表面修飾可能ｆｉ　ＩＪボンームの内包試
験〉実施例１と同様に分散液金２００ｍＭ　　！、（４
）−カルポキンフルオロセイン（ｊ　、　（Ａ　）−Ｃ
Ｆ）ｐＨＩｒ　、！ホウ酸緩衝液を用いて、リポソーム
を調製して、ｊ、（４）−ＣＦ内包リすンーム會得た。

（平均粒径ｊ　００　ｎ　ｍ　） 実施例１〈表面修飾可能なリポソームの製造法とその内
包試験〉 ＤＰＰＣＪＯｍｇ、長鎖活性アミド■−３（一般式（Ｉ
）においてＲ１＝Ｃ１３Ｈ２７、Ｒ２＝凡３＝）１．Ｘ
＝Ｙ＝０　）２Ｗｋ、／　！　Ｉｌｌ　（ｒ）　りｏ　
ｃｒ　ホルムに溶解し、実施例１０方法と同様にして表
面修飾可能なリポソーム（Ｔｃ４ｃ／’Ｃ１平均粒径コ
λＯｎｍ　）　ｔ”得た。さらに２００ｍＭ　　ｊ　、
（≦）−ＣＦ　　ｐＨ７，≠リン酸緩衝液を用いて、同
様にリポソームを調製してｊ、（４）−ＣＦ内包リすン
ーム（平均粒径コ／　Ｏｎ　ｍ　）’を得た。

実施例４．＜表面修飾可能なリポソームの製造法とその
内包試験〉 Ｅｇｇ　　ＰＣＪｏａｇ、長鎖活性７ミ）−（−ｒＨ２ ？ Ｒ２＝−Ｃ−ＯＣＨ３（Ｒ体）、Ｘ＝Ｙ＝８）λ■５ｉ
ｚｘｔのクロロホルムに溶解して、実施例１の方法と同
様にして表面修飾可能なリポソーム（平均粒径／　２０
　ｎ　ｍ　）　’に得た。実施例３と同様にして、ｔ、
（４）　−ＣＦ内包リすンームを得た。

実施例ｉ〈表面修飾可能なリポソームとその内包試験〉 ＤＰＰＣＪＯダ、長鎖活性アミドエータ（一般式ＣＩ）
において Ｒ２＝Ｈ３＝Ｈ，Ｘ＝Ｙ＝８　） ３〜′ｔ″２ｊｄのクロロホルムに溶解して、実施例１
の方法と同様にして表面修飾可能なリポソーム（平均粒
径／！０ｎｒｎ）Ｉｒ得た。

実施例３と同様にしてｊ、（ｊ）−ＣＦ内包リポソーム
を得た。

実施例６．＜ベンジルアミン固定表面飾修すボンームの
製造〉 実施例１．と同様にリン酸緩衝液（ｐＨ７，ｊ）を用い
て調製した表面修飾可能なリポソームリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，ｊ）分散液０，４ｔｍ（長鎖活性アミドＩ−／　
（一般式ＣＩ’ＪにおいてＲ１＝Ｃｌ７Ｈ３５、′＆２
＝３ｓ＝Ｈ，Ｘ＝Ｙ＝ｉＳ　）、濃度＄Ｘ１０−’Ｍ）
ｉｃ参Ｘ１０−２Ｍベンジルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ
７，ｊ）ａ、／ｍｌを加えｌ−時間、２！０Ｃで静置し
た。その結果、リボン−ム膜中の長鎖活性アミド（一般
式（１）においてＲ１＝ｃｔｙＨａｓ、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
，Ｘ＝Ｙ＝８　）の！Ｏｓに対してベンジルアミンが固
定化されたベンジルアミン固定表面修飾リポソームラ得
り。

実施例７．〈ペプチド固定表面修飾リポソームの製造〉 実施例６．と同様にｗ４製した表面修飾可能なリポソー
ムリン酸緩衝Ｎ（ｐＨ７−ｊ）分散液０．４！１（長鎖
活性アミドＩ−／（一般式（１）においてＲ１＝Ｃ１７
）（ａｓ・３２　＝Ｒ３＝Ｈ，Ｘ＝Ｙ＝８７濃度４ＡＸ
／−０”−’Ｍ）ｌＣ４Ａ×ＩＯ−２Ｍｋ−）’ｆド（
Ｇｌｙ−８ｅｒ−β−Ａｌａ）リン酸緩衝液（ｐＨ７−
１）０．１Ｗｌｔ加え７２時間、コｔ’ｃで静置した。

その結果、リポソーム膜中の長鎖活性アミドＩ−／、（
一般式（Ｉ）において几１　＝Ｃ１７Ｈ３５、Ｒ２＝Ｒ
３＝Ｈ１Ｘ−Ｙ−８１）ＪｔＴｏに対し−Ｃペプチド（
Ｇｌｙ−８ｅｒ−β−Ａｌａ）が固定化されたペプチド
固定表面修飾リポソームを得た。

実施例８．〈たんばく質固定表面修飾リポソームの製造
〉 実施例１．と同様にして、ＤＰＰＣ／　ｊ■、長鎖活性
アミド■−コ（一般式（１）においてＲ１＝ｃｉｓＨａ
１％Ｒ２＝Ｒａ　＝Ｈ，Ｘ＝Ｙ＝８　）／　、。

■、分散液にＰＢ８溶液を用いて表面修飾可能なＩＪ　
ホソームを得たつこれｆＯ，−μｍのミクロボアフィル
ターを用いてエクストノ）−ダーでｚ　ｏｏｃにおいて
サイジンブレだ。これを超遠心分離機を用いてリポソー
ムを沈降させた。（１万回転、ｌ１分間） このリポソーム沈査に３１のリン酸緩衝液ｔｍえた。そ
のうち、１ｍにヒト−ＩｇＧ　　／■／１ＰＢＳ浴液１
１會加え、７２時間、コｊ’Ｃで静置した。これを超遠
心分離機を用いて、ＰＢ８溶液で精製して、たんぽ（質
（ヒト−ＩｇＧ）が固定化されたたんばく質固定表面修
飾リポソームを得た。

実施例９．〈ペプチド固定表面修飾リポソームの製造〉 実施例４．と同様に調製した長鎖活性アミドＩ−ｊ（一
般式（１）において ８体 Ｈ２ Ｒ２−ＣＯＣＨａ　（Ｒ体）、Ｘ＝Ｙ＝８）を埋め込ん
だ表面修飾可能なリポソーム分散液ｌｄにペプチド（Ｇ
ｌｙ−８ｅｒ−β−Ａｌａ）水溶液’ｉ／―加え７２時
間、コｊ　’Ｃで静置した。ゲル濾過によりリポソーム
分画をとりペプチド（Ｇｌｙ−ｓｅｔ−β−Ａｌａ）が
固定化されたリポソームを得た。

実施例１０．＜糖固定修飾リポソームの製造〉長地らの
方法〔テトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ　Ｌｅｔｔ、）、、第一２１巻１４／Ｌ／頁、ｌり１
０年〕を用いて、Ｎ−テトラデカノイルグルコサミン（
ＩＩＩ　）　！ｉり。

１３Ｈ２７ Ｎ−テトラデカノイルグルコサミンｌ■、ＤＰＰＣｌｊ
■ヲメタノール／クロロホルム＝ｌ／ｌ溶液ｊ１に溶解
した後ロータリーエバポレーターにより溶媒留去し薄膜
を形成させた。減圧乾燥後にＰＢＳ溶液を３１加えて、
ｔｏ　０ｃ水浴に１分間静置、ボルテツクスミキンング
１分間振とりを交互に３回行った後、プローブ型ンニケ
ーターを用いて超音波照射を行った。（２１Ｗ、１０分
間）セファａ−ズ参Ｂを用いたゲルろかによりこれを精
製して、糖（グルコサミン）が固定化された修飾リポソ
ームを得た。

実施例１１．＜表面修飾可能なリポソームの加水分解と
アミド形成挙動の観察〉 実施例１．と同様に調製した長鎖活性アミドＩ−／（一
般式〔Ｉ〕において几１　＝Ｃ１７Ｈ３５、Ｒ２＝Ｒ３
＝Ｈ，Ｘ＝Ｙ＝８　）を埋め込んだ表面修飾可能なリボ
ソーム０　、４Ａｘｌにホウ酸緩衝液（ｐＨ／／、Ｉ＝
／、０）０．Ｉｄ金加えて系中の長鎖活性アミドｌ−／
の減少ｙＨＰＬｃ（Ｃｓカラム資生堂裏、ＣＨ３ＣＮ＃
離液ンによ離液跡した。

同様にμ、０ｘ１０　　　Ｍヘンシルアミンリン酸緩衝
液（ｐＨ７，７、Ｉ＝／、０）０．ｌｄを加えてアミド
形成を調べた。結果全第１図に示す。

この結果より長鎖活性アミドＩ−／（一般式（Ｉ）にお
いてＲ１＝Ｃｌ７Ｈ３５、ａ２＝Ｒ３＝Ｈ，Ｘ＝Ｙ＝８
）ｔ！ＩＪボンーム系においてｐＨ／Ｉでほとんど加水
分解は進行しないが、アミンとにｐＨ７゜ｊにおいても
アミドを形成することを見い出した。

比較例１．＜安息香酸活性アミドあるいにエステルの加
水分解速度およびアミド形成速度 の測定〉 表１に示す安息香酸活性アミドあるいにエステル、Ｊ、
ＪＪＸｌｏ−３Ｍジオキサン液１．！１と０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７、≠）Ｊ、ｊｌｌｌを混合ＬＨＰＬＣ
（ＯＤＳ力７ム、ＣＨａＣＮ−Ｈ２ｏ（Ｏ，コｌＩ　Ａ
　ｃ　ＯＨ−Ｅ　ｔ　ｓ　Ｎ　　）溶離液）により安息
香酸活性アミドあるいにエステルの減少を追跡して加水
分解速度の測定を行った。同様に／３ＪＸ１０−２Ｍ、
グリシンメチルエステル塩酸塩リン酸緩衝液（ｐＨ７−
３）Ｊ、！−を用いてアミド形成速度を測定した。結果
を表／に示す。

この結果より、チアゾリジン−コーチオンを脱離基に持
つ長鎖活性アミドは従来固定化やアミド形成に多用され
るＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルより水中にお
いて安定であり、さらにアミノ基とは選択的に反応する
ことが認められた・（発明の効果） 以上のように本発明を用いることにより、非常に穏和な
条件において、非常に簡単な操作によってリボンーム表
面に種々の基質を固定化して表面修飾リポソームを製造
することができる。また、本発明で用いられる長鎖活性
アミドは、リポソームへ基質を固定化するためによく用
いられるｈ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例え
ば５ＰＤＰ法）と比べ水中での安定性がよく操作性が高
い。

【図面の簡単な説明】

第１図はリボンーム膜中に埋め込んだ長鎖活性アミドＩ
　−／　（一般式（１）においてＲ１＝Ｃ１７Ｈ３５、
Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ，Ｘ＝Ｙ＝８　）の！ｎＣ／Ｃｏ＝／ｎ
濃度／初濃度を時間に対してプロットしたものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記、一般式〔 I 〕で示される化合物とリポソ
   ーム形成可能な脂質から構成されることを特徴とする表
   面修飾可能なリポソーム。 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （Ｒ＿１は疎水性基を示す。Ｒ＿２、Ｒ＿３は有機基（
   Ｈを含む）を示す。Ｒ＿２、Ｒ＿３は互いに連結して環
   又に二重結合を形成してもよい。Ｘ、Ｙは酸素原子また
   硫黄原子を示す。
2. （２）請求項（１）記載の表面修飾可能なリポソームと
   アミノ基及び／又はチオール基を有する基質を混合する
   ことを特徴とする表面修飾されたリポソームの製造方法
   。
3. （３）請求項（１）記載の一般式〔 I 〕で表わされる
   化合物の少なくとも１種とアミノ基及び／又はチオール
   基を有する基質を結合させて得られた化合物とリポソー
   ム形成可能な脂質を混合することを特徴とする表面修飾
   されたリポソームの製造方法。