JPH0452893B2 - - Google Patents

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JPH0452893B2
JPH0452893B2 JP59030543A JP3054384A JPH0452893B2 JP H0452893 B2 JPH0452893 B2 JP H0452893B2 JP 59030543 A JP59030543 A JP 59030543A JP 3054384 A JP3054384 A JP 3054384A JP H0452893 B2 JPH0452893 B2 JP H0452893B2
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electrode
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blood
filtration layer
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Shiro Nankai
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Matsushita Electric Industrial Co Ltd
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001Enzyme electrodes

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • Wood Science & Technology (AREA)
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  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は種々の生体試料中の特定成分を迅速、
かつ容易に定量することのできるバイオセンサに
関するものである。
従来例の構成とその問題点 近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した
種々のバイオセンサが開発され、特に臨床検査分
野への応用が試みられている。検査項目及び検体
数が増加している現在、迅速に精度よく測定でき
るバイオセツサが望まれている。
グルコースセンサに例をとると、糖尿病の増加
が激しい今日、血液中の血糖値を測定し管理する
には、以前のように血球等の有形成分を遠心分離
し血液中の血漿分を取り出して測定するのでは非
常に時間がかかるため、全血で測定できるセンサ
が要求されている。簡易型としては、尿検査の時
に使用されている検査紙と同様に、ステイツク状
の支持体に糖(グルコース)にのみ反応する酵素
および酵素反応時又は酵素反応の生成物により変
化する色素を含有する担体を設置したものがら
う。この担体に血液を添加し、一定時間後の色素
の変化を目又は光により測定する方式であるが、
血液中の色素による妨害が大きく精度は低い。
そこで、第1図のような多層式の分析担体が開
発されている。透明な支持体1の上に試薬層2、
展開層3、防水層4、濾過層5が順に積層した構
造となつている。血液サンプルを上部から滴下す
ると、まず濾過層5により血液中の赤血球、血小
板などの固形成分が除去され、防水層4にある小
孔4aから展開層3へ均一に浸透し、試薬層2に
おいて反応が進行する。反応終了後、透明な支持
体1を通して矢印の方向から光をあて、分光分析
により基質濃度を測定する方式である。従来の簡
易なステイツク状の担体にくらべ、複雑な構造で
あるが、血球除去などにより精度は向上した。し
かし、血液の浸透および反応に時間がかかるた
め、サンプルの乾燥を防ぐ防水層4が必要となつ
たり、反応を速めるために高温でインキユベート
する必要があり、装置および担体が複雑化すると
いう問題がある。
最近、酵素反応と電極反応を結びつけて基質濃
度を測定するバイオセンサが開発されている。グ
ルコースセンサに例をとると、第2図のように、
グルコースオキシダーゼ固定化電極6を容器7に
入れ、緩衝液8で満たし、スターラ9で攪拌して
いる中に試料液を添加する。グルコースオキシダ
ーゼ固定化電極6には定電圧が印加されており、
試料中のグルコースと反応して生成した過酸化水
素を検知して電流が流れグルコース濃度が測定で
きる。この方式を用いれば、血液中の色素などに
妨害されず迅速に測定できる。しかし、攪拌装置
が不可欠なためアワが発生したり液の乱れが精度
に影響するという問題があつた。又希釈している
ため、緩衝液の量や試料の添加量に精度が要求さ
れ操作が複雑化する不都合があつた。
発明の目的 本発明は、上記の問題点を克服し、生体試料中
の特定成分を簡易に、迅速かつ精度よく測定でき
るバイオセンサを得ることを目的とする。
発明の構成 本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板上に少
なくとも測定極と対極からなる電極系を有し、前
記電極系を少なくとも酸化還元酵素および酸化還
元酵素と共役する酸化型色素を含有してなる反応
層と3μm以下の孔径を有するメンブランフイル
ターよりなる濾過層とで積層被覆したことを特徴
とする。
本発明のバイオセンサを用いることにより、生
体試料の測定を簡易に、精度よく測定することが
できる。
実施例の説明 本発明のバイオセンサの1つとして、グルコー
スセンサを例に説明する。第3図にグルコースセ
ンサの一実施例の模式図を示す。塩化ビニル樹脂
からなる絶縁性の基板10に白金を埋め込み、測
定極11と対極12とする。前記電極系を覆うよ
うに、ナイロン不織布13を設置する。このナイ
ロン不織布13の網目間隔はかなり粗く直径6〜
7μmの血球は容易に通過するが、酸化還元酵素
としてグルコースオキシダーゼ14と酸化還元酵
素と共役する酸化型色素としてフエリシアン化カ
リウム15を、溶解含浸後乾燥状態で担持してい
る。このナイロン不織布13の上部に、多孔性
(孔径1μm)のポリカーボネートからなる濾過層
16を設置する。
このセンサに血液を添加すると、濾過層により
赤血球などの大きな分子が過され、ナイロン不
織布13からなる反応層において血液中のグルコ
ースがグルコースオキシダーゼ14により酸化さ
れる際、フエリシアン化カリウム15が共役して
還元されフエロシアン化カリウムが生成する。こ
のフエロシアン化カリウムを、対極12を基準に
測定極11の電位を0Vから+0.5Vまで0.1V/秒
の速度で掃引することにより酸化する。この時得
られる酸化電流は、フエロシアン化カリウムの濃
度に比例し、フエロシアン化カリウムは基質濃度
に比例して生成するため、酸化電流を測定するこ
とにより基質であるグルコースの濃度が検知でき
る。得られた電流値は、グルコースの標準液で測
定したところ、800mg/dlまでグルコースの濃度
とよい直線性を示した。酵素と酸化型色素からな
る反応層および濾過層は、測定毎に交換したが、
標準液および血液のサンプル両方において再現性
は良好であつた。又、血液の添加量を20〜140μ
の範囲で変化させたが、酸化型色素及び酵素量
が充分なため、添加量に関係なく一定の値を示し
た。
濾過層16として、孔径3μm以下の多数の微
細な孔を有するポリカーボネートの多孔体を用い
ることにより、血液中の血球や粘性の物質があら
かじめ過でき、電極の汚れを少なくすることが
できた。白金は非常に安定な材料なので電極には
最適である。しかし、血液中の液体成分を通過さ
せ血球等の有形成分の通過を阻止する濾過層がな
いと、長期間使用しているうちに電極上に血球が
付着し、得られる電流値が低下するため、電極を
アルコールで洗浄する必要があつたが、濾過層に
より電極を水洗だけで応答が再現性よく保持でき
るようになつた。又、ポリカーボネートの多孔体
を界面活性剤として例えばポリエチレングリコー
ルアルキルフエニルエーテル(商品名:トリトン
X)の1%溶液中に浸漬後乾燥して使用すると、
血液の濾過がすみやかになり、再現性がさらに向
上した。血液はかなり粘度があるため、濾過速度
が遅いという問題点があつたが、界面活性剤で処
理した濾過層を用いることにより、濾過がすみや
かになり、すばやく均一に酵素および色素と反応
でき、サンプル添加後1分程度という短時間に反
応が完結した。界面活性剤を使用しない場合は、
反応が完結するまで血液添加後1分30秒程度必要
とするので、測定の迅速化に大きな効果があつ
た。
測定極および対極に白金を用いて2電極系で測
定する場合は、対極の面積を測定極のそれより十
分大きくした方が、対極の分極が少なくなり、良
好な応答が得られた。又、対極を銀塩化銀にする
と、電位は安定し、対極の面積も小さくできるた
め小型化が可能になつた。
第4図のように、塩化ビニル樹脂の基板10に
それぞれ白金を埋め込み、測定極11、対極12
および参照極17からなる3電極で電極系を構成
した。参照極を用いた3電極とすることにより、
電位が安定して、応答再現性が向上した。また、
上記に述べた様に対極面積を大きくする必要もな
くなり小型化できた。電極系を形成するには上記
のように白金を樹脂に埋めこんでもよいが、基板
上に蒸着法あるいはスパツタ法により白金層を形
成して電極系を構成することもできる。
酸化型色素及び酵素よりなる反応層は、試料液
をすみやかに吸収し酵素反応をおこなわせること
ができるように、親水性の多孔体膜であることが
望ましい。たとえば、ろ紙やパルプの不織布、セ
ラミツクの多孔体、ガラスの多孔体などを用いる
と、試料液が均一にすばやく浸透し再現性も良好
であつた。さらに、ナイロン不織布において、前
記の界面活性剤で処理したのは、処理しなかつた
ものより試料液の浸透がすみやかであり、測定の
迅速化に効果があつた。
酵素と酸化型色素を細かく粉砕混合後、加圧し
た生計体を反応層とすると、血液の液体成分によ
り酵素および酸化型色素がすみやかに溶け均一に
混合するため、反応の迅速化に大きく貢献した。
また、酸化型色素と酵素を加圧成形する際、結着
剤として、SiO2などを少量混合すると、成形体
の強度が増すので取り扱いが簡易となる。結着剤
としては、酵素反応及び電極反応に無関係で親水
性のものが適している。
酸化型色素および酵素は、なるべく血液の液体
成分に速く溶ける状態におくことが望ましい。そ
こで、酸化型色素の水溶液をナイロン不織布に含
浸後、熱風乾燥すると真空乾燥したものより非常
に細かい結晶となり、液体にとけやすくなつた。
又、酸化型色素の水溶液を浸漬したナイロン不織
布を、エタノールのような水に対する溶解度の大
きい有機溶媒中に浸漬後真空乾燥すると、さらに
細かい結晶を担持することができた。酵素は熱な
どに弱いため、含浸後真空乾燥を行なつた。
そこで、第5図の構成からなるセンサを試み
た。電極系は第4図と同様で、その上にポリカー
ボネート多孔体膜からなる濾過層16、次にグル
コースオキシダーゼ14を担持したナイロン不織
布18、その上部にフエリシアン化カリウム15
を含浸後エタノールに浸漬し乾燥して担持したナ
イロン不織布19を設置する。なお、ポリカーボ
ネート多孔体膜およびナイロン不織布は、あらか
じめ前記の界面活性剤で処理した。
このセンサに血液を添加すると、すみやかにナ
イロン不織布の層に浸透し、フエリシアン化カリ
ウム15とグルコースオキシダーゼ14が溶解し
て反応が進みながら、血液の液体成分のみ濾過層
16を通過し電極系に至る。フエリシアン化カリ
ウムを細かい結晶状態で担持してあるので、すみ
やかに溶解し酵素と共役して反応でき、反応時間
が約1分間以内と短縮できた。濾過層は、第5図
のように電極上においても、反応層の上部におい
てもよい。又、色素担持層19と酵素担持層18
ではさんでもよい。液の浸透は、濾過層が反応層
の下に設置した時が一番早く反応時間が短かかつ
た。しかし、反応層の上部に濾過層を設置する
と、先に血液中の固体成分が濾過できるので、反
応層において血球などにより妨害がないため、ス
ムーズに反応が進むという利点があり、高精度で
あつた。濾過層としては、不織布、化学繊維、紙
(過)、ガラスの多孔体などが考えられるが、血
球の有形成分を濾別するには3μm以下の孔径を
有するメンブランフイルターが必要となる。そこ
で、メンブランフイルター一層又は、それに前記
の不織布、化学繊維、紙などを積層してもよい。
界面活性剤としては、前記の例の他に、ポリオ
キシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオ
キシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレング
リコール脂肪酸エステルなども使用できる。界面
活性剤により、濾過層だけでなく色素及び酵素も
処理しておくことにより、濾過および浸漬速度が
ますます速くなり、反応も速くできる。
色素としては、上記に用いたフエリシアン化カ
リウムが安定に反応するので適しているが、P−
ベンゾキノンを使えば、反応速度が早いので高速
化に適している。又、2,6−ジクロロフエノー
ル、インドフエノール、メチレンブルー、フエナ
ジンメトサルフエート、β−ナフトキノン4−ス
ルホン酸カリウムなども使用できる。
なお、上記実施例におけるセンサはグルコース
に限らず、アルコールセンサやコレステロールセ
ンサなど、酸化還元酵素の関与する系に用いるこ
とができる。又、酵素は固定化した状態で担持す
ることにより長期保存においても安定に活性を維
持することができる。
発明の効果 本発明のセンサによれば、直接試料液を含浸さ
せて微量の特性成分を簡易に、しかも迅速に精度
よく測定することができる。また、濾過層によ
り、電極を長期間安定に保持できる。さらに、界
面活性剤により浸透が速くなり反応時間が短縮で
きる。
【図面の簡単な説明】
第1図及び第2図は従来のグルコースセンサの
構成を示す略図、第3図、第4図及び第5図は本
発明の実施例であるグルコースセンサの模式図で
ある。 10……基板、11……測定極、12……対
極、13……多孔体(反応層)、14……酵素、
15……色素、16……濾過層、17……参照
極。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 絶縁性の基板上に少なくとも測定極と対極か
    らなる電極系を設け、この電極系を酸化還元酵素
    および酸化還元酵素と共役する酸化型色素を含有
    する反応層と濾過層とで積層被覆したバイオセン
    サ。 2 濾過層が界面活性材により処理されている特
    許請求の範囲第1項記載のバイオセンサ。 3 測定局が白金である特許請求の範囲第1項記
    載のバイオセンサ。 4 対極が白金または銀塩化銀である特許請求の
    範囲第1項記載のバイオセンサ。 5 反応層および濾過層が親水性の多孔体膜であ
    る特許請求の範囲第1項記載のバイオセンサ。 6 酸化還元酵素および酸化型色素が親水性の多
    孔体膜に乾燥状態で保持されている特許請求の範
    囲第5項記載のバイオセンサ。
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