JPH0453489A - プロウロキナーゼの遺伝子工学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、プロウロキナーゼの遺伝子工学的製造法に関
する。更に詳細には、ヒト血管内皮細胞由来のプロウロ
キナーゼをコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクター
で宿主細胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養す
ることによるプロウロキナーゼの遺伝子工学的製造法、
および組換えＤＮＡ発現用宿主細胞として用いることの
できるヒト血管内皮細胞由来株化細胞に関する。

〈従来の技術〉 心筋梗塞や脳梗塞などの治療に有効な血栓溶解剤として
、ヒトの尿、ヒト細胞などから得ることのできるプラス
ミノーゲン・アクチベーター及びその前駆体が知られて
いる。即ち、例えば、ヒト尿から調製されたウロキナー
ゼ（Ｗｉｌｌｉａ■ｓ　　Ｊ。

Ｒ，Ｂ、、　　Ｂｒ、　　Ｊ、　　ＥＸＤ、　　Ｐａｔ
ｈｏｌ、、３２．　５３０）、ヒト腎細胞または癌細胞
から産生されるプロウロキナーゼ［Ｔ、　Ｓｕｙａｇｉ
ａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ２６
０　（２２）、１２３７７　（１９８５）：ＤＣ３ｔｕ
ｍｐ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ
ｌ、、　　２６１　（３）　。

１２７４　（１９８６）］あるいは組織ブラスミノーゲ
＞−７クチベーター［０，Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔａｌ
、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ、　２５６　（１３
）　（１９８１）］などがある。

ウロキナーゼや組織プラスミノーゲン・アクチベーター
は、実際に臨床用に用いる場合には大量投与が必要であ
り、そのために循環血液中のフィブリノーゲンをも分解
し出血傾向を招き易いという副作用が指摘されている。

これに対してプロウロキナーぜは、血液中のフィブリノ
ーゲンを分解せず、一方フイブリンに対して親和性が強
いために血栓に限定されてその作用を発揮する。更に、
血中のプラスミノーゲン・アクチベーター・インヒビタ
ーにより阻害を受けにくい。従ってプロウロキナーゼは
出血傾向を示さない血栓溶解剤として期待されており、
その開発が内外で活発に行なわれている。

一方、前記の如〈従来のプロウロキナーゼなどのヒトプ
ラスミノーゲン・アクチベータ〜あるいはその前駆体は
ヒト尿、ヒト腎ＩＢ胞またはヒト癌細胞由来のものであ
る。これに対してとトプラスミノーゲン・アクチベータ
ーは本来血管内で作用するものである所から、ヒト血管
内皮細胞由来のプラスミノーゲン・アクチベーターある
いはその前駆体が求められていた。

従来のプラスミノーゲン・アクチベーターあるいはその
前駆体の製造法に関しては、材料収集が容易でなかった
り、プラスミノーゲン・アクチベーターあるいはその前
駆体の産生細胞の増殖効率を上げる為、栄養条件の守宮
な培地を使用する必要があり、夾雑蛋白等の産生も多く
、単離・精製を行なう際問題も多（、大量生産すること
が困難であった。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明の目的は、新しいタイプのプロウロキナーゼであ
るヒト血管内皮細胞由来のプロウロキナーゼの大量生産
を可能にする遺伝子工学的製造法を提供することにある
。

本発明の他の目的は、ヒト血管内皮細胞由来株化細胞か
らなる組換えＤＮＡ発現用宿主細胞を提供することにあ
る。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者らは、ヒト血管内皮細胞の培養物について鋭意
探索した結果、新しいタイプのプロウロキナーゼが得ら
れることを見出し、次いでこのプロウロキナーゼをコー
ドするＣＤＮＡのクローニングに成功した。このＣＤＮ
Ａを用いた新しいタイプのプロウロキナーゼを組換えＤ
ＮＡ技術により大量に生産する方法を確立し、またヒト
血管内皮細胞由来株化細胞が組換えＤＮＡ発現用の宿主
細胞として広く使用できることを見出し本発明を完成し
た。

本発明は、 ヒト血管内皮細胞由来のプロウロキナーゼをコードする
ｃＤＮＡを含有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換
し、得られる形質転換体を培養することを特徴とするプ
ロウロキナーゼの製造法；および、ヒト血管内皮細胞由
来株化細胞からなる組換えＤＮＡ発現用宿主細胞に関す
る。

本発明で対象とするプロウロキナーゼは、ヒト血管内皮
細胞由来のプロウロキナーゼであり、例えばヒト談帯静
脈などから得られるヒト血管内皮細胞の株化細胞を培養
しその培養上清から得ることができるものである。

ヒト血管内皮細胞由来のプロウロキナーゼをコードする
ｃＤＮＡは例えば次のようにして得ることができる。ヒ
ト鯛帯静脈より血管内皮細胞を得、この継代培養細胞よ
り全ｍＲＮＡを抽出する。

全ｍＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムに吸着させ、
次いでｍＲＮＡを溶出させて、例えば既知のヒト賢細胞
由来のプロウロキナーゼのｃＤＮＡの塩基配列［８，Ｎ
ａｇａｉ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ、３６　、１８３
−１８８　（１９８５）］の一部と相補的な配列を持つ
オリゴヌクレオチドをプローブとし、このプローブとハ
イブリダイズするｍＲＮＡを採取する。このｍＲＮＡを
用いてＧｕｂｌｅｒらの方法［０，Ｇｕｂｌｅｒ　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　　２５．２６３　（１９８３
）］によりＣＤＮＡライブラリーを作成し、上記プロー
ブを用いて目的とするプロウロキナーゼをコードするＣ
ＤＮＡを含有するりＯ−ンを単離する。このクローンよ
りｃＤＮＡを抽出することによって本発明で用いるヒト
血管内皮細胞由来のプロウロキナーゼをコードするＣＤ
ＮＡを得ることができる。ヒト調帯静脈から得た血管内
皮細胞由来のプロウロキナーゼをコードするＣＤＮＡの
塩基配列は第１図に示されている。第１図には塩基配列
から決定されるアミノ酸配列も同時に示されている。第
１図で示されるプロウロキナーゼのアミノ酸配列におい
て、そのＮ末端より１２）位のアミノ酸残基はロイシン
であり、これに対してヒト腎細胞、ヒト咽頭癌細胞、ヒ
ト線維芽細胞及びヒト肝由来の公知のプロウロキナーゼ
の１２）位のアミノ酸残基はプロリンである ［８．　Ｎａｇａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、３６
．１８３−１８８（１９８５）　１ｉｌｌｉａｉ　Ｅ、
　Ｈｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　８＋。

／Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　３．　Ｏｃｔ、９
２３−９２９　（１９８５）ニジｅｒｄｅ、　Ｐ６．ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　ＭａｔＡｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ、　８１．４７２７　（１９８１）　：Ｒｉ
ｃｃｉｏ　Ａ、　　ｅｔ　ａｔ、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　。

エユ（８）、２７５９　（１９８５）］。第１図の１９
４位のアミノ酸残基はイソロイシンであるのに対し、ヒ
ト線雑芽細胞及びヒト肝由来のプロウロキナーゼの対応
するアミノ酸残基はメチオニンである。

第１図で示されるプロウロキナーゼのｃＤＮＡ塩基配列
については、その１２）及び３１３位のアミノ酸残基に
対応するコドンが、ヒト腎細胞由来のプロウロキナーゼ
をコードするｃＤＮＡ塩基配列と相違しており、１２）
．１９４．３１３．３４０．３４５及び３４６位のアミ
ノ酸残基に対応するコドンが、ヒト線雑芽細胞由来のプ
ロウロキナーゼをコードするｃＤＮＡ塩基配列と相違し
ている。また、１２）．３４０．３４５及び３４６位の
アミノ酸残基に対応するコドンが、ヒト咽頭癌細胞由来
のプロウロキナーゼをコードするｃＤＮＡｊｍ基配列と
相違している。加えて、１２）及び１９４位のアミノ酸
残基に対するコドンがヒト肝由来のプロウロキナーゼを
コードするｃＤＮ△塩基配列と相違している。

本発明で用いるＣＤＮＡの塩基配列は第１図に示したも
のに限定されない。

第１図に示したｃＤＮＡ塩基配列と実質的に等価なもの
、即ち遺伝暗号の縮重、塩基配列の欠失もしくは付加な
どに基づ＜ＣＤＮＡ塩基配列変異体であっても、第１図
に示すアミノ酸配列で表わされるプロウロキナーゼと生
理学的に同等の特性を有するポリペプチドをコードする
ＣＤＮＡも第１図に示したｃＤＮＡと同様に使用するこ
とができる。

本発明のヒト血管内皮細胞由来のプロウロキナーゼをコ
ードするｃＤＮＡを導入するために用いる発現ベクター
はいずれでもよく特に限定されない。例えば宿主細胞と
して大腸菌を用いる場合には、１）ＢＲ３２２［Ｂｏｌ
ｉｖａｒ、　Ｆ、　Ｇｅｎｅ、　２゜９５　（１９７７
）　］、ｐｖｃｓ　［Ｖｉｅｒｉｒａ　　Ｊａｎｄ　Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、　　Ｇｅｎｅ　　上９．２５９
　（１９８２）　］　、ｐＫＫ２２３−３　［ｄｅＢｏ
ｅｒ、Ｈ，ＡＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．２）（１９８３）］などが挙
げられる。宿主細胞として枯草菌を用いる場合には例え
ばｐＵＢｌｌｏ［にｅｇｇｉｎｓ、　　に、　　Ｈ，、
ＬＯＶｅｔｔ、　　Ｐ、　　Ｓ、　　＆　　Ｄｕｖａｌ
ｌ　　　ＥＪ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７５．１４２３　（１９７８
）］、ｐｃ１９４　［Ｂｙｅｏｎ、ｙ。

Ｊ、Ｂａｃ、、１５８．５４３−５５０　（１９８４）
］などが挙げられる。宿主細胞として動物細胞を用いる
場合にはＳＶ４０、ウシパピローマウィルスなどが挙げ
られ、またこれらのＤＮＡ配列を利用したＤＳＶＬ　［
Ｔｅ１ｐｌｅｔｏｎ、Ｄ　ｅｔ　ａｌ、　　ＨＱｌ、　
Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．．４　、８１７（１９８４）　］　
、ｐＢ　ＰＶ　［５ａｒｖｅｒ、　Ｎｅｔ　ａｌ、、　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ａｓ
ｐｅｃｔｓｐ、　５１５．　　Ｈｏｗｌｅｙ、　Ｐ、Ｈ
，ａｎｄ　Ｂｒｏｋｅｒ　Ｔ、Ｒ，編］などが挙げられ
る。

これらのベクター中にプロウロキナーゼをコードするｃ
ＤＮＡを導入するには、適当な制限酵素部位を利用して
通常の方法により導入することができる。宿主ＩＩ胞と
して動物細胞を用いる場合には、発現ベクターのコピー
数を増幅させてプロウロキナーゼの発現量を上げるため
にジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列を発現ベクター中に含有させてもよい
。

ｄｈｆｒタンパク貢をコードするＤＮＡ配列は、例えば
ＤｓＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）などのプラ
スミドから得ることができる。また特開平１−２８５１
９０号公報に記載されたＬ因子及びｄｈｆｒタンパク質
をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドベクター
中にプロ１クロキナーゼを］−ドするｃＤＮＡを導入し
てもよい。

発現ベクター中には、上記したＤＮＡ配列以外にも、目
的とするタンパク質を発現させるために必要なプロモー
ター配列、シャイン・ダルガノ配列、シグナルペプチド
をコードする配列などを含有せしめる。これらのＤＮＡ
配列は公知であり、用いる宿主−ベクター系などに応じ
て任意に選択することができる。

本発明で用いる宿主細胞はいずれでもよく特に限定され
ず、発現ベクターの種類に応じて任意に選択することが
できる。例えばベクターとしてｐＢＲ３２２を用いた場
合には宿主細胞としてＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１な
どが用いられる。動物細胞用のベクターを用いた場合に
は、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞、ＢＨＫ細
胞、ナマルバ細胞などを用いることができる。発現ベク
ター中にｄｈｆｒタンパク質をコードするＤＮＡ配列を
含有させた場合には、例えばＣＨＯ−Ｋｌ細胞由来ｄｈ
ｆｒタンパク質遺伝子欠損細胞［ＬｌｒｌａｂＧ、　ａ
ｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ　Ｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　５ｃｉＵＳＡ、７ユ、４２）６　（１９
８０）コなどが用いられる。この場合にはｄｈｆｒタン
パク質遺伝子を本来有するＣＨＯ−に１細胞も勿論使用
できる。

本発明で対象とするプロウロキナーゼはヒト血管内皮細
胞由来のプロウロキナーゼであり、従つて宿主細胞とし
てヒト血管内皮細胞由来株化細胞を用いるのが適してい
る。この株化細胞は、例えばヒト鱗帯静脈から酵素剥離
法［ＪａＮｅｅ、　Ｅ、　ＡＪ、　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　Ｖｏｌ、５２　、２７
４５　（１９７３）］により初代培養細胞を調製し、次
いで継代培養を重ね、ることによって得ることができる
。株化細胞は、無血清培地で培養可能なヒト血管内皮細
胞由来株化細胞が特に適しており、このような株化細胞
を用いることによりプロウロキナーゼの工業的に有利な
製造法が達成される。

無血清培地で培養可能な株化細胞は、上記した方法によ
って得られる株化細胞を用いて、血清濃度を徐々に減少
させた培地で継代培養を繰返し、最終的にタンパク質成
分としてアルブミンのみを含む基礎培地で増幅する細胞
を得ることにより調製することができる。

かくして調製されるヒト血管内皮細胞由来株化細胞は、
プロウロキナーゼを発現させる以外にも他の通常の有用
タンパク質を発現させるために広く使用することが可能
である。この株化細胞は、ヒトの正常細胞由来であるた
め、これを宿主ａｍとして製造されるタンパク質への有
害なタンパク質の混入を避けることができ、またヒトに
対して抗原性の低いタンパク質を得ることが可能となり
、多くの利点を有している。

本発明のプロウロキナーゼをコードするｃＤＮＡを含有
する発現ベクターで宿主細胞を形質転換するには、コン
ピテントセル法 ［Ｊ、　５ｐｉｚｉｚｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　
　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳ　Ａ　。

４４．１０７２　（１９５８）］、プロトプラスト法［
３，Ｃｈａｎｇ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、
、　１６８　、１１１（１９７９）］、リン酸カルシウ
ム法［Ｇ７ａｈａｓ、　Ｆ、Ｌ、　ｅｔ、　ａｌ、、　
Ｖｉｒｏｌｏａｙ、　５２　、４５６（１９７３）］、
エレクトロポレーション沫［Ｗｏｎｇ、　Ｔ、に、　ａ
ｎｄ　Ｎｅｕｍａｎｎ　　Ｅ、　　ＢｉｏｃｈｅｔＢｉ
ｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、、１　０
７．　５８４　　（１９８２）コなどの通常の方法によ
り実施することができる。発現ベクターが組込まれた形
質転換体の選択は、発現ベクター中に含有する選択マー
カーに基いて通常の方法により行うことができる。また
発現ベクターとともに例えば薬剤耐性マーカーをコード
する遺伝子をコ・トランスフェクションしこの薬剤耐性
により形質転換体を選択することができる。

かくして得られる形質転換体を適当な培地中で適当な培
養条件下で培養することにより目的とするプロウロキナ
ーゼが発現される。発現ベクター中にｄｈｆｒタンパク
質をコードするＤＮＡ配列を含有せしめた場合には、培
地中にメトトレキセート、ホモ葉酸などのｄｈｆ　ｒタ
ンパク質阻害剤を含有させて培養することにより発現ベ
クターコピー数が増幅され、プロウロキナーゼの発現量
が上昇する。

培養細胞あるいは培養上清より、通常の方法によってプ
ロウロキナーゼを回収することにより、目的とするヒト
血管内皮細胞由来のプロウロキナ−ゼが得られる。

〈発明の効果〉 ヒト血管内皮細胞由来のプロウロキナーゼをコードする
ｃＤＮＡを含有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換
し、形質転換体を培養することにより、新しいタイプの
プロウロキナーゼの大量生産が可能となる。また宿主細
胞としてヒト血管内皮細胞由来株化細胞を用いることに
より、プロウロキナーゼを効率良く製造することができ
、この株化細胞は他の有用タンパク質を発現させるため
の組換えＤＮＡ発現用宿主細胞として広く用いることが
可能である。

〈実施例〉 以下に参考例および実施例を用いて本発明を更に詳細に
説明する。

実施例１ ヒト血管内皮細胞由来株化細胞の調製 （１）細胞株の調製 ヒト鱗帯静脈から酵素的剥離法［Ｊａｆｆｅｅ、　ＥＡ
、、　Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ
ｉｏｎ、　Ｖｏｌ、５２　、２７４５　（１９７３）］
で初代培養細胞は調製した。

なお、細胞は以下の項目を検討し［１永蔵、実験医学、
４　（７）、５７９　（１９８６）コ血管内皮細胞と同
定した。

ａ、　形態ニー層の敷石状構造 す、　　Ｗｅｉｂｅｌ　Ｐａ１ａｄｅ−ｂｏｄｙの有無
：有りＣ，ｃｏｎｔａｃｔ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎの有
無：有りｄ、　アンギオテンシン変換酵素の有無：有り
ｅ、　レクチン結合性：有り ｔ、　ケラチンの存在：無し く２）継代培養 細胞ヲ１Ｘ１０　〜２０ｘ１０’　　Ｃｅ１ｌＳ／ａｄ
！（り数で植え込み、３日間はど培養を続け、細胞数が
３日間で約４倍になった時点でトリプシン−ＥＤＴＡ混
液を添加し、単層の幼若な細胞を回収してヒト血管内皮
細胞由来株化細胞を得た。この株化細胞の培地としては
例えば熱不活性化牛脂児血清を１０％添加した口ｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄＭＥＭ等を用いる。培
養は５％ＣＯ２を含む３７℃の条件下で行なうのが望ま
しい。

実施例２ １０％から５％に減少させ、培養を続けた。増殖能が極
めて低下したが、増殖能が回復するまで約２０日間培養
を続け、コンフルエントになった時点で継代した。次に
、血清濃度を５％から１％に減少させ、培養を続けた。

増殖能が極めて低下したが、増殖能が回復するまで約２
０日間培養を続け、２回継代した。更に血清濃度を１％
から０％に減少さ往、代わりに３ａｙ／ｄとなるように
血清代替培地であるウルトＯサーＧ（ＩＢＦバイオテク
ニクス社製）を添加し、培養を続けた。増殖能が低下し
たが、増殖能が回復するまで約２０日間培養を続け、２
回継代し、最終的に安定した細胞系（ＥＣｓｆ１５）が
得られた。

参考例１ （１）　　ヒト血管内皮細胞からのＰｒｏ−ＵＫ産生実
施例１で得られたヒト血管内皮細胞をＩ×１０　〜２０
ｘ１０’　　ｃｅｌｌｓ／ａｅ（７）数で直径１０実施
例１で得られた株化細胞を用い血清濃度を１のプラスチ
ックシャーレ（ファルコン社製）にまき、１０％熱不活
性化ウシつ児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地を加え３〜５日培養を続【
プた。細胞がＣｏｎｆｌｕｅｎｔになった時点で培地を
０．０３％ウシ血清アルブミンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ
’ｓ　ｇ＋ｏｄｉｆｉｅｄ　Ｍ　Ｅ　Ｎ無血清培地に交
換した。４〜５日培養後、上清を１０〆プラスチツクビ
ベツト（ファルコン社製）で全て採取する。この後、上
記と同様の無血清培地１０〆を加え、同様に培養する。

培養シャーレを５０枚使用し、本操作を８回繰り返すと
上清約４リツトルが得られる。

なお、上記の操作は全て無菌的に行なった。また、培養
は全て５％Ｃｏ　　、３７℃にセットした炭酸ガスイン
キ１ベーター（手沢社製）内で行なった。

（２）Ｓ−セフ７０−スカラムによるＰｒｏ−ＵＫの濃
縮 ヒト血管内皮細胞培養物上清的４．０ＯＯｄに１Ｎ塩酸
約３０Ｍ１を加えｐＨを５．５に調製した。

次いでＳ−セファロースカラム（ＩＤ５０ｍＸ１００履
）（ファルマシア社製）に流速ｌａｄ！／Ｗｉｎで吸着
せしめ、ｌ０ＫＩＵアプロチニンを含む０．１６Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ５，５及びｐＨ６，５）各３００〆でカ
ラムを洗浄した後、同！ｓ衝液（ｐＨ７，５）で吸着し
ていたプロウロキナーゼＡを溶出させた。フラクション
を１５ｄずつ集め、フィブリン平板法（Ｓｔａｌ）ｈＶ
ＩＯｃＯｃｃｉ　ａｎｄＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ
　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、　Ｅｄ、　ｂｙ　ＪＪｅｌｊ
ａＳＺｅｗｉＣＺ、　Ｂａ５ｅｌ、　Ｓ、にａｒｇｅｒ
、１９７３　、　ｐ４０６−４１２）によりプラスミノ
ーゲン・アクチベーター活性（ＰＡ活性）をモニターし
、２０〜２５本目に本Ｐｒｏ−ＵＫを含む活性成分が溶
出された（第２図参照）。

（３１Ｚｎ−キレートトヨパールカラムによるＰｒｏ−
ＵＫの分画 ０．５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０
を含む０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平
衡化したＺｎ−キレートトヨバール（ＩＤ５０ｍＸ１０
０履、東ソー社製）に上記溶出液の全社を流速１ｄ／Ｉ
ｉｎで吸着させ、同緩衝液で洗浄後、０．５Ｍ塩化ナト
リウム及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０含有０．０５Ｍ
トリス酢酸緩衝液（ｐＨ７，５〜５．５）で３０分間の
ｌ）Ｈ勾配溶出を行なった（第３図参照）。

活性成分は１）Ｈ６，５から５．５に幅の広いピークと
して溶出された。

ｆ４）Ｚｎ−キレート再クロマトグラフィーによる本ｐ
ｒｏ−ＵＫの精製 ０．５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１％■ｗｅｅｎ８０
を含む５ｍＨトリス酢ｍｖｔ衝液（ｐＨ７，５）で平衡
化したＺｎ−キレート−５ＰＷ（ＩＤ７．５ａｍ＋Ｘ７
５ａｍ、東ソー社報）に本Ｐｒｏ−ＵＫ約１■を含む５
ｄの上記分画サンプルを流速０．２５５ｄｊ！／ｌｌｎ
で吸着させ、同緩衝液で洗浄後、０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム及びｏ、ｏｉ％Ｔｗｅｅｎ　８０含有５ＩＨトリス酢
酸緩衝液により流速１ａｅ／ｍｉｎで溶出した。溶出は
ｐＨ７，５〜ｐＨ５，５の３０分間のｐＨ勾配により行
なった（第４図参照）。

本Ｐｒｏ−ＵＫはＩ）Ｈ約６にシャープなピークとして
溶出された。脱塩後凍結乾燥すると約０．９■の白色粉
末が得られた。

かくして、高純度に単離・精製された本Ｐｒｏ−ＵＫが
得られた。

（５）　　本Ｐｒｏ−ＬＩＫの、Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動 本Ｐｒｏ−ＵＫを１００℃で５分間、１％ＳＤＳ、１％
２−メルカプトエタノールにより還元処理を行った後に
、分子量既知の蛋白（ヒト尿由来のウロキナーゼ、（Ｌ
ＪＫ）アメリカン・ダイアクツステック社製：ヒト尿由
来のプロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＬＩＫ）　、アメリカ
ン・ダイアクツステック社製）とともに５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付した。また本Ｐｒｏ−Ｌ
ＩＫの精製度を見るため上記（２）で得られるＳ−セフ
ァ０一ス画分も同時に電気泳動に付したく第５図参照）
。尚、前処理を行なわないで５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に付した場合にも同様の結果を得た。

上記結果より、本Ｐｒｏ−ＬＩＫの分子量は約５万ダル
トンであり一本鎖構造を有し、また上記（４）のＺｎ−
キレート再クロマトにより本Ｐｒｏ−ＵＫは高純度に精
製されていることが確認された。

（６）プラスミン処理によるウロキナーゼ活性の発現 本Ｐｒｏ−ＵＫを約５０１Ｌｌ／ｄとなるように０．０
１％ｒｗｅｅｎ　８０を含むＰＢＳで希釈しその４０μ
ｍを分取した。ここに１８０１ｃ（１／ｄのプラスミン
を５μ！添加し、３７℃にインキュベートし０，１０，
２０，４０，６０分後にアプロチニンで反応を止め、反
応液のウロキナーゼ活性を、ウロキナーゼの基質である
合成基質Ｓ−２４４４と上記処理液とを反応せしめ生じ
る発色を比色法により測定して求めたく第６図参照）。

ヒト尿由来の公知のプロウロキナーゼを用いて同様の実
験を行なった（第７図参照）。上記結果から本Ｐ　ｒ　
ｏ　−ＬＩ　Ｋは公知のプロウロキナーゼと同様に、プ
ラスミン処理により経時的に活性化が起こり、本Ｐｒｏ
−ＵＫがウロキナーゼ前駆体（プロウロキナーゼ）であ
ることが確認された。

実施例３ 本Ｐｒｏ−ｔＪＫをコードするｃＤＮＡ塩基配列（１）
　　ヒト血管内皮細胞よりｍＲＮＡの抽出参考例１の（
１）に示した方払で直径１０ｃＩＩのプラスチックシャ
ーレ（ファルコン社製）５０枚に継代培養細胞をまき、
Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔとなった時点で培地を無血清にかえ
、１９日１にセルスフレイバーで細胞を集めた。この細
胞からグアニジンチオシアネート／ＣｓＣ１超遠心法で
全ＲＮＡを抽出した。

（２）　　オリゴヌクレオチドプローブを用いたノーザ
ンハイブリダイゼーション 既知のヒト腎細胞由来のプロウロキナーゼＣＤＮＡの塩
基配列［８，Ｎａｇａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ３
６．１８３−１８８　（１９８５）］の一部と相補的な
配列を持つオリゴヌクレオチドを６種類（第８図参照）
合成し、細胞から抽出したＲＮＡとハイブリダイズする
かどうかノーサンハイブリダイゼーション法で講へた。

第８図に示したオリゴヌクレオチドを合成し、３２Ｐで
５′末端をラベルし、これらをプローブとして用いた。

上記ＲＮＡを１．４％アガロースゲル電気泳動で分画し
た後、ニトロセルロースフィルターにトランスファーし
、ハイブリダイズさせたところ、これらのプローブとハ
イブリダイズすることが確認された。

ｆ３１ｍＲＮＡの精製 全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムに吸着させ、カ
ラムを洗浄後、ｍＲＮＡを溶出し、上記オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズするｍＲＮＡを採取した。

全ＲＮＡ３．５９より１６０μ９のｍＲＮＡが得られた
。

（４）ｃＤＮＡの合成 ＣＤＮＡの合成キット（アマジャム社製）を用い、精製
したｍＲＮＡ１５μ９よりオリゴｄＴをプライマーとし
てｃＤＮＡを合成した。

ｆ５）ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ヘのＥＣ０Ｒ１リンカ−の結合
ｃＤＮＡクローニングキット（アマジャム社製）を利用
した。まず、ＣＤＮＡ内部のＥＣｏＲ１サイトをメチル
化し、ＣＤＮＡの両端にＥｃｏＲ１リンカ−を結合した
後、ＥＣ０ＲＩで切断し、ゲル濾過によってｃＤＮＡを
精製した。

（６）　　本Ｐｒｏ−ＬＩＫのＣＤＮＡライブラリーの
作成 ＣＤＮＡをλＧｔ１１ＥｃｏＲ１アームと結合し、Ｉｎ
　ＶｌｔｒＯパッケージングによりファージ粒子を形成
させ、ＣＤＮＡライブラリーを作成した。

（７）本Ｐｒｏ−ＵＫのｃＤＮＡを有する組換え体のラ
イブラリ・−からの単離 本Ｐｒｏ−ＵＫのｃＤＮＡを含むλａｔ１１組換え体を
大腸菌に１２株ＬＥ３９２に吸着させてブレーティング
し、プラークを形成させた。ニトロセルロースフィルタ
ーにプラークをトランスファーした後、このフィルター
をアルカリ変性、中和、ベーキングして組換え体のｃＤ
ＮＡをフィルター上に固定した。

第８図に示したオリゴヌクレオチドの５′末端を３２Ｐ
−ＡＴＰを用いて標識し、上記フィルター上に固定した
ＤＮＡとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーショ
ン及びその後の洗浄は、第８図に示したＴｄから５℃低
い温度で行なった。

ＴｄはＡ及びＴが２℃、Ｇ及びＣが４℃寄与するとして
計算した。

これらのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプラ
ークを純化した。その結果、７個のクローンを取得する
ことができ、そのうち一つをλｔＪＫ−Ｌと命名した。

＋８１Ｍ１３ベクターを用いたサブクローニングλＵＫ
−１を大量に調製して、ＣＤＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ部
分の制限酵素切断点地図を作成した（第９図）。

ｃＤＮＡを２種類の制限酵素で切断してＭ１３−Ｏ１８
或いはＭ１３ｍｐ１９をベクターとしてサブクローニン
グした。

（９）　　塩基配列の解析 Ｄｉｄｅｏｘｙ　　ｃｈａｉｎ　　ｔｅｒｍｉｎａｔｏ
ｒ法　［Ｓａｎｇｅｒ、　　ｒ、　　ｅｔａｔ、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾
、、７４．５４６３−５４６７　（１９７７）］により
、ＣＤＮＡの塩基配列を第９図に示す矢印の方向にそっ
て決定した。Ｐｒｏ−ＵＫをコードするｃＤＮＡの塩基
配列およびそれから決定されるアミノ酸配列を第１図に
示した。

実施例４ （１）　　発現ベクターの調製 第１０図に示した構築スキームに従って発現ベクターを
構築した。

（ｉｌ　　Ｐ　ｒ　Ｏ−Ｕ　Ｋ　ＣＤ　Ｎ　Ａの増幅実
施例３の（７）で得られたＰｒｏ−ＬＩＫｃＤＮＡをも
つλｏｔ１１の組換体であるλＵＫＬ　　ＤＮＡを鋳型
とし、ｏｔｌ　１のブライマー及びリバースブライマー
を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｇ＋ｅｒａｓｅ　　Ｃｈａｉ
ｎ　　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　　）　　　［５ａｉｋｉ　　
Ｒにｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．　　１３５
０（１９８５）］法でｃＤＮＡ部分を増幅した。

これを、ＡｃｃＩ［、Ｓｔｕ工で分解し、第１０図の（
ロ）で示される１、４５ｋｂのバンドを分取した。

第１０図のＯにおいて、格子状の部分はＰ″ｒｏ−ＵＫ
をコードする構造遺伝子を示し、斜線部分は３′非翻訳
部分を示す。

！ｉｉｌ　　Ｐ　ｒ　Ｏ−Ｕ　Ｋ　ＣＤ　Ｎ　Ａに連結
するためのＤＮＡの合成 Ｐｒｏ−ＬＩＫｃＤＮＡの５′側および３′側に連結す
るための以下に示すＤＮＡをＤＮＡシンセサイサ−［Ａ
ｔ）Ｅ）Ｉｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ−社製、３８０Ｂ
型］により合成し、ＯＰＣカラム（ＡＢ　１社製）を用
いて精製した。

５°Ｇ＾ＴＣＡＡＧＣＴＴ　　ＧＣＣＡＣＣＡＴＧ　Ａ
ＧＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣ３’　　・・・
（ハ）３ゴＴＣＧＡＡ　　ＣＧＧＴＧＧ　ＴＡＣＴＣＣ
ＣＧＡ　ＧＡＣＧＡＣＣＧＧ　５’　　・・中（へ）上
記のＤＮＡでは、ＡＴＧコドンのすぐ上流に翻訳の効率
よい開始に必要なにｏｚａｋの配列［Ｈ，Ｋｏｚａｋ、
　Ｎａｔｕｒｅ、　　３０８．　２４１　　（１９８４
）］　（点線部分）を挿入した。Ｐｒ０−ＵＫｃＤＮＡ
の翻訳領域を、後で切り出せるように＠　ｉ　ｎｄｌｌ
［部位（下線部分）を導入した。

具体的には、−重鎖ＤＮＡｅ　（３０ｍｅｒ　）の５′
末端をリン酸化し、−重鎖ＤＮＡ（ハ）（３４ｍｅｒ　
）を等モル加え、１００℃、５分間加熱後、室温で放置
し、ＤＮＡ（ハ）とＤＮＡＯ１９をアニーリングさせて
二本鎖ＤＮＡ　（第１０図の（Ｇｌ　）を合成した。

（ｉ）　　プラスミドＩ）ＳＶＬＵＫの構築上記（ｉ）
で得られたＤＮＡ（ｔ）ｌに上記（ｉｉｌで得られたＤ
　Ｎ　Ａ　（０を添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりラ
イゲイジョンを行った。６８℃、１０分間のりガーゼ失
活の後、５′末端をリン酸化し、セファロース　ＣＬ−
６ＢスピンカラムによりＤＮＡを精製し、１．４５ｋｂ
のＤＮＡ（ロ）の５′側および３′側にＤ　Ｎ　Ａ　（
０が連結されたＤＮＡ　＜第１０図の０）を得た。

プラスミドｐＳＶＬ　［ファルマシア社製；Ｔｅｉ＋ｐ
ｌｅｔｏｎ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｏｔ、　Ｃｅ
１１．　Ｂｉｏｌ、、　４゜８１７　（１９８４）］を
ＢａｍＨ■で切断゛し、Ｔ４ポリメラーゼ処理し、ＣＩ
Ｐ処理により５′末端を脱リン酸化して、開環状２本鎖
ＤＮＡ　（第１０図の０）を得た。このプラスミドｐｓ
ＶＬは適当な位置にｆ３　ａｍＨＩおよび５ａｌＩ部位
を有しており、また−８　Ｖ　４０後期プロモーター、
ＳＶ４０後期ポリアゾニレ−ジョンシグナルを含有し、
ＳＶ４０およびｐＢＲ３２２から構築されるものである
。

開環状２本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｆ＞に、上記のＤＮＡ（Ｅ
）を添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりライゲイジョン
を行い、得られる連結体を用いて大腸菌ＨＢＩＯ１を形
質転換し、プラスミドｐｓＶＬＵＫを取得した。組込み
方向を確認の上、形質転換した大腸菌を大量培養し、ア
ルカリ法［Ｂｉｒｎｂｏｉｓ、　Ｈ，Ｃａｎｄ　Ｊ、　
Ｄｏｌｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、
ヱ、１５１３　（１９７９）］でププラストを入社調製
した。

（Ｍ　　プラスミド１）ＳＶＬＵＫｄｈｆｒの構築ｄｈ
ｆｒを含むプラスミドＤＤＨＦＲ（特開平１−２８５１
９０）をＢａｍＨＩで分解し、にｌｅｎｏｗフラグメン
ト処理により、末端を平滑化した後、アガロースゲル電
気泳動で、ｄｈｆｒを含むＤＮＡ断片を分取した。

ＤＳＶＬを５ａｌＩで分解し、に１ｅｉｎＯＷ７ラクメ
ント処理により末端を平滑化した。得られるＤＮＡの５
′末端を脱リン酸化し、ｄｈｆｒを含むＤＮＡ断片と結
合した後、大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換した。得られ
たアンピシリン耐性株からＤＮＡを調製し、その構造を
確認し、Ｐｒｏ−ＬＩＫをコードするＤＮＡおよびｄｔ
ｌｆｒタンパク質をコードするＤＮＡを含む目的とする
発現ベクターｐＳＶＬＵＫｄ　ｈ　ｆ　ｒを得た。

＋２）　　ＣＨＯ−Ｋ　１細胞の形質転換（ｉｌＤＮＡ
溶液の調製 ネオマイシン耐性マーカーを含有するプラスミドｐＮＥ
ｏ　　［Ｊｏｒｏｅｎｓｅｎ、　Ｒ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｈｏ１ｅｃＧｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１７７、
６５　（１９７９）　］　５０ｏｎａをｌ：ｃｏＲ１Ｆ
切断し、６５℃１０分間の熱処理をした。そこへ、上記
（１）で調製したｐｓＶＬＬＪＫｄ　ｈｆ　ｒ−ＤＮＡ
３０ｕ９を添加し、０．３Ｍとなるよう酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５，２）を加え、更に２倍量のエタノール
を加えて一８０℃で２０分間放置した後、１５０００ｒ
ｐｍ　、１０分間遠心分離し、沈澱を７０％エタノール
に懸濁した。再度遠心分離後、エタノールを完全に除去
し、４５０μｌの滅菌水に無菌的に懸濁した。なお、こ
れ以降の操作は、全て無菌的に行った。

１ｉｉ）　　Ｄ　Ｎ　Ａ−リン酸カルシウム沈澱の生成
５０ｄ滅菌済コニカルチユーブにオートクレーブ済５０
０μＪＨＮＰ　（５０ｍＨＨｅｐｅｓ緩衝液（１）８７
．１　）／２８０＋ｎＨ塩化ナトリウム／１．５１Ｎ　
　リン酸二ナトリウム）を入れ、そこへ（ｉ）で用意し
たＤＮＡ及び濾過滅菌済２．５Ｍ塩化カルシウム５０μ
ｌ混合液をバブリングしながら滴下し、滴下終了後も１
分間バブリングを続け、その後３０分間放置し、ＤＮＡ
−リン酸カルシウム沈澱を得た。

（ｉｌ　　ＣＨＯ−に１細胞へのコ・トランスフェクシ
ョン ＣＨＯ−Ｋｌ細胞を予めＩ　Ｘ　１０”及び２×１０５
となるよう直径６αプラスチツクシヤーレ（ファルコン
社製）に１０％ウシ胎児血清を含むＦ１２培地で培養し
ておいた。また、トランスフェクションの５時間前に培
地を新鮮なものと交換しておいた。

ＤＮＡ−リン酸カルシウムの沈澱をシャーレ１枚当り１
ｄとなるよう培養細胞に添加し、１６時間後、培地を新
鮮なものと交換した。その２４時間後、細胞を３倍に希
釈し、更に２４時間後に、培地を４００μ９／ｄのＧ４
１８を含む選択培地に交換した。

２日間培養後、各シャーレを６倍に希釈し、上記選択培
地で継代培養を行った。培養４日目に上記細胞を３倍に
希釈して継代培養し、更に、３〜４日毎に培地交換を行
い、培養を約４０日間続けた。

（Ｍ　形質転換体の選択 コ・トランスフェクション後３臼目から細胞に形態変化
が認められ、７日目にはかなりの細胞が死に、１０日頃
コロニーが観察された。

約１５日後にシリンダー法でクローニングを行った。出
現したコロニーに顕微鏡下で印を付け、それぞれのコロ
ニーをクローニング用ステンレス製シリンダーで囲い、
ＰＢＳ　（−）にて洗浄後、０．０２％ＥＤＴＡを含む
０．２５％トリプシン溶液１００μｌを添加した。約５
分間３７℃でインキュベート後、同量の上記選択培地に
てトリプシンを中和し、ピペッティングにより細胞を剥
し、９６ウエルプレートに播種し、更に、上記選択培地
１００μノを添加した。

各ウェルがコンフルエン１〜になった時点で４８ウエル
プレートに継代し、更にコンフルエントになる度に、２
４ウエル、１２ウエルへと継代を続けた。

１２ウエルプレートがコンフルエントになった時点で、
１２ウ工ルプレート２枚に各々のウェルを継代し、更に
コンフルエントになった時点で１枚は、直径６αシヤー
レに継代した。他の１枚は０．０３％ウシ血清アルブミ
ンを含むＦ−１２培地に培地交換し、４日経過した時点
で、培養上清中のＰｒｏ−ＵＫ活性をフィブリン平板法
［５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ　　ａｎｄ　５ｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃａｌ夏ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、　　Ｅｄ、
　　ｂｙ　　Ｊ、Ｊｅｌｊａｓｚｅｗｉｃｚ、　　Ｂａ
５ｅｌＳ、にａｒｇｅｒ、　　ｐ、４０６−４１２（１
９７３）］により測定した。

４８クローン中、３クローンに特に高い活性が認められ
た（第１表参照）。

第１表 クローン番号　Ｐｒｏ−ＵＫ活性（ＩＵ／ｄ）ＣＨＯ−
ＬＪＫ８　　　　　３２．０ ＣＨＯ−ｔＪＫｌｏ　　　　　３９．５ＣＨＯ−ＵＫ１
９　　　　４９．５ ｆ３）　　Ｅ　Ｃｓ　ｆ　１５細胞の形質転換（ｉ）　
　細胞の培養 本操作に用いた細胞培養用培地は特に断わりの無い限り
、滅菌済みの、１０％ウシ胎児血清を含むダルベツコ改
変ＭＥＭ（以後ＤＭＥＭと略）培地であり、培養操作は
すべて無菌的に行った。トランスフェクションの前日に
ＥＣ５ｆ１５細胞を直Ｗ６ｔｘ＞ｖ−レ当り２Ｘ１０　
．５ｘ１０５となるように播種し、更に、トランスフェ
クションの５時間前に培地を、３〆の新鮮培地に交換し
た。

１ｉｉＩ　　Ｄ　Ｎ　Ａ溶液の調製 上記（１）で構築したｐｓＶＬＬＩＫｄ　ｈ　ｆ　ｒ−
ＤＮＡ３μ９を含む溶液に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５，５＞及び２．５倍量の一２０℃エ
タノールを加え、−７０℃で１５分間放置し、１５００
０ｒｐ■、１０分間遠心分離した。

得られた沈澱を９５％エタノールに懸濁し、再度同条件
で遠心分離してＤＮＡを回収した。真空乾燥後、１２０
μｌの蒸留水に無菌的に懸濁し、トランスフェクション
に用いた。なお、これ以降、器具及び試薬類は滅菌済の
ものを用い、操作は全て無菌的に行った。

（２）　トランスフェクション トランスフェクションはリン酸カルシウム法で行ったが
、試薬はセルフェクト・トランスフェクション・キット
（ファルマシア社製）を用いた。

上記（ｉｉ）で調整したＤＮＡ溶液に０．５Ｍ塩化カル
シウム０．０５Ｍ　　Ｒｅｐｅｓ緩衝液を含むｂｕＨｅ
ｒＡ、１２０μオを加え、ポルテックスミキサーで充分
混合した。室温に１０分間放置後、０．２８Ｍ塩化ナト
リウム、０．０５Ｍ　　Ｈｅｏｅｓ緩衝液、０．７５１
Ｍリン酸−ナトリウム及び０、’７５ｉ＋Ｈリンニナト
リウムを含むｂｕｙｅｒ　　Ｂ。

２４０μｍを加え、再びポルテックスミキサーで数秒間
混合し、室温に１５分間放置後、上記（ｉ）で調整した
培養細胞上に滴下した。

トランスフェクションの４．５時間後に培地を全て吸引
除去し、グリセロールを１５％含むＰＢＳ　（−）（フ
ロー　ラボラトリ−社製）を１．５ｄを加え１分間放置
した。続いて無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、細胞培
養用培地を５〆加え、培養を行った。２日間培養後、各
シャーレを６倍に希釈して継代培養し、この時点で培地
を２０ｎｔ４　　メトトレキセートを含む選択培地に交
換し培養を行った。培養４日目に上記細胞を３倍に希釈
して継代培養し、更に、３〜４日毎に培地交換を行い、
培養を約４０日間続けた。

（Ｍ　形質転換体の選択 トランスフェクション後９臼目から細胞に形態変化が認
められ、１６日目にはがなりの細胞が死に、３０日頃コ
ロニーが観察された。

約４０日後にリング法でクローニングを行った。

出現したコロニーに顕微鏡下で印を付け、それぞれのコ
ロニーをクローニング用ステンレス製リングで囲い、Ｐ
ＢＳ　（−）にて洗浄後、０．０２％ＥＤＴＡを含む０
．２５％トリプシン溶液１００μｌを添加した。約５分
間３７℃でインキュベート後、同量の上記培養培地にて
トリプシンを中和し、ピペッティングにより細胞を剥し
、９６ウエルプレートに播種し、更に、上記選択培地１
００μｌを添加した。

各ウェルがコンフルエントになった時点で４８ウエルプ
レートに継代し、更にコンフルエントになる度に、２４
ウエル、１２ウエルへと継代を続けた。

１２ウエルプレートがコンフルーエンドになった時点で
、１２ウ工ルプレート２枚に各々のウェルを継代し、更
にコンフルーエンドになった時点で１枚は、直径６ＣＩ
Ｒシヤーレに継代した。他の１枚は０．０３％ウシ血清
アルブミンを含むＤＭＥＭ培地に培地交換し、４日経過
した時点で、培養上清中のＰｒｏ−ＬＩＫ活性をフィブ
リン平板法により測定した。

６３クローン中、３クローンに特に高い活性が認められ
た（第２表参照）。

第２表 ヒト血管内皮細胞形質転換細胞の クローン番号　ｐｒｏ−ＬＩＫ活性（Ｉ　Ｕ／ｄ）ＥＣ
５ｆ１５−２５　　　８３．０ ＥＣｓｆ１５−３１　　　７９．２ ＥＣｓｆ１５−３３　　　８２．０ （ｖ）　　Ｐ　ｒ　Ｏ−ＬＩ　Ｋ産生量の経時的増加培
養上溝のＰｒｏ−ＬＪＫ活性の特に高いＥＣ５ｆ１５−
２５を上記無血清培地で培養した。

４　ｘ　１０’　〜８　Ｘ　１０’　　ｃｅｌｌｓ／ｄ
（７）数で１２ウエルプレートに播種し、０．０３％ウ
シｍ清アルブミンおよび１０　１ＫＬＩ／ｉｄアプロチ
ニンを含むＤＭＥＭ培地を用い４４日間培養した。４日
毎に新鮮培地と交換し、活性の上昇を調べたく第３表参
照）。

第３表 ヒト血管内皮細胞形質転換細胞の ４日目　　　４４日目 ＥＣ５ｆ　　　　　　　　　　　　８３．０　　　２０
７．６（４）遺伝子組換体の生産物の確認 （ｉｔ　　培養上清の調整 培養上清のｐｒｏ−ＵＫ活性の特に高いＥＣ５ｆ１５−
２５を上記無血清培地で培養した。

４Ｘ　１０　〜８Ｘ　１０’　　ｃｅｌｌｓ／ａｄ！の
数で直径１０１のシャーレ２０枚に播種し、０．０３％
ウシ血清アルブミンおよび１０　　ＩＫＵ／ｄアプロチ
ニンを含むＤＭＥＭ培地を用い２８日間培養した。

４日毎に新鮮培地と交換し、コンデイションメディウム
は４℃にて保存した。

Ｓ−セファロうス力ラムおよび ７ｎ−キレート−５ＰＷを用いて参考例１と同様にして
Ｐｒｏ−ＵＫを精製した。

（ｉｉ）　　ＰＡの５ＤＳ−ＰＡＧＥ 精製したＰｒｏ−ＬＪＫを５ＤＳ−ＰＡＧＥｒ分析した
。本Ｐｒｏ−ＵＫ、分子醋既知のタンパク、ヒト尿由来
のウロキナーゼ（アメリカン・ダイアグツステイカ社製
）及びヒト尿由来の Ｐｒｏ−ＬＩＫ　（アメリカン・ダイアグツステイカ社
製）をそれぞれ１００℃で５分間、１％ＳＯ８゜１％２
−メルカプトエタノールにより還元処理を行った後に、
５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。泳動は第−化学薬品−５Ｏ
３−ＰＡＧＥ装置および同社製４／２０％グラジェント
ゲルを用いた。結果は第１１図に示した。

上記結果より、本形質転換細胞の産生ずるＰｒｏ−ＵＫ
は、プロウロキナーゼタイプであることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト血管内皮細胞由来のプロウロキナーゼ（
Ｐｒｏ−ＵＫ）をコードするｃＤＮＡの塩基配列および
それから決定されるアミノ酸配列を示す。 第２図は、ヒト血管内皮細胞培養物の上清をＳ−セファ
０−ス力ラムクロマトグラフイーに付し、溶出した時の
プロファイルを示す。 第３図は、Ｚｎ−キレートトヨバールクロマトグラフィ
ーによるＰｒｏ−ＵＫの分画のプロファイルを示す。 第４図は、ｚｎ−キレート−５ＰＷクロマトグラフイー
によるＰｒｏ−ＬＪＫの精製を示す。 第５図は、本Ｐｒｏ−ＵＫを分子量既知の他の蛋白と共
に電気泳動に付した時の結果を示す。 第６図は、プラスミン処理後の本Ｐｒｏ−ＵＫのウロキ
ナーゼ活性を示すグラフである。 第７図は、プラスミン処理後のヒト尿由来のプロウロキ
ナーゼのウロキナーゼ活性を示すグラフである。 第８図は、Ｐｒｏ−ＵＫをコードするｍＲＮＡを検出し
単離するために用いた合成オリゴヌクレオチドプローブ
を示す。 第９図は、Ｐｒｏ−ＵＫをコードするｃＤＮＡの制限酵
素地図及びＤｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒ１ｎａ
ｔｉｏｎ法によるシークエンジングの方向を示す。 第１０図は、発坦ベクター ｐＳＶＬＵＫｄ　ｈ　ｆ　ｒの構築スキームを示す図で
ある。 第１１図は、ｐｓＶＬＵＫｄ　ｈｆ　ｒｔ’形質転ｓさ
れたヒト血管内皮細胞の培養上清を精製し、電気泳動に
付した時の結果を示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト血管内皮細胞由来のプロウロキナーゼをコー
   ドするｃＤＮＡを含有する発現ベクターで宿主細胞を形
   質転換し、得られる形質転換体を培養することを特徴と
   するプロウロキナーゼの製造法。
2. （２）ヒト血管内皮細胞由来のプロウロキナーゼをコー
   ドするｃＤＮＡが第１図に示されるＤＮＡ塩基配列を有
   するものである請求項第１項記載のプロウロキナーゼの
   製造法。
3. （３）宿主細胞がヒト血管内皮細胞由来株化細胞である
   請求項第１項または第２項記載のプロウロキナーゼの製
   造法。
4. （４）宿主細胞が、無血清培地で培養可能なヒト血管内
   皮細胞由来株化細胞である請求項第１項または第２項記
   載のプロウロキナーゼの製造法。
5. （５）発現ベクターが、ジヒドロ葉酸還元酵素タンパク
   質をコードするＤＮＡ配列を含む請求項第１項から第４
   項のいずれか１項記載のプロウロキナーゼの製造法。
6. （６）ヒト血管内皮細胞由来株化細胞からなる組換えＤ
   ＮＡ発現用宿主細胞。
7. （７）ヒト血管内皮細胞由来株化細胞が無血清培地で培
   養可能なヒト血管内皮細胞由来株化細胞である請求項第
   ６項記載の宿主細胞。